CN108103127A - 一种工业化快速生产制备葡萄糖基甜菊糖苷混合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种工业化快速生产制备葡萄糖基甜菊糖苷混合物的方法，所述方法包括以下步骤：步骤一，酶促反应：溶解氧化淀粉及甜菊糖苷，加入CGT酶进行酶促反应，酶促反应温度为40℃～55℃，酶促时间7～12h，灭酶活结束反应；步骤二，脱色除味；步骤三，过滤、浓缩、干燥得到产品。本发明用氧化淀粉作为糖基供体，减少工艺步骤，提升转糖基效果，工艺简单易操作；同时降低工业化对设备、能耗的要求，缩短了工时，降低成本，提升单位产能。

Description

一种工业化快速生产制备葡萄糖基甜菊糖苷混合物的方法
技术领域
本发明属于甜菊糖生产工艺技术领域，更具体地说是一种工业化快速生产制备葡萄糖基甜菊糖苷混合物的方法。
背景技术
随着甜菊糖的推广，人们发现其具有一种苦涩的后味，虽然甜菊糖具有众多的优点，但在人们多年来形成的口味习惯的影响下，其经济效益在某些地区受到了严重的冲击。近年来，关于甜菊糖味质改善的研究成为了继甜菊糖安全性研究之后的又一热点问题；可以预见，建立一种高效的专一性的改善甜菊糖味质的方法必然会使整个甜菊糖产业达到一个新的高度。
现有技术中采用葡萄糖基转移酶、呋喃果糖苷酶、半乳糖苷酶进行的酶法改性甜菊苷得到的产品总体产率低，单位产能低下；同时接枝2个以上葡萄基产物占比率低，产物的甜度提升效果不够理想。如：《高等学校化学学报》1996年第 11期发表的文章“α-葡萄糖基-甜菊糖的酶促合成反应研究”采用葡萄糖基转移酶对甜菊糖和淀粉溶液进行酶法改性，总产率达56.1％；《食品与发酵工业》2009 年第3期发表的文章“β-呋喃果糖苷酶的生产及对甜菊苷和莱鲍迪a苷的酶法改性研究”采用呋喃果糖苷酶对甜菊糖和蔗糖溶液进行酶法改性，甜菊苷的转化率 65％；《中国资源生物技术与糖工程学术研讨会论文集》2006年发表的文章“β- 半乳糖苷酶法改性甜菊糖的研究”采用半乳糖苷酶法对甜菊糖和乳糖溶液进行酶法改性，总产率达48.1％。
美国专利US8257948B2，谱赛科公司采用α-淀粉酶、CGT酶、β-淀粉酶联合使用对甜菊糖进行酶法改性，产率得到了一定的提升，其步骤如下：α-葡萄糖基甜菊糖的制备方法：将淀粉加入到水中以形成淀粉悬浮液；将α-淀粉酶和CGT 酶的混合物加入到淀粉悬浮液中并在约75-80℃下孵育约0.5至2小时，生成液化淀粉悬浮液通过低pH热处理将α-淀粉酶灭活，将甜菊糖苷加入到液化淀粉悬浮液中，生成反应混合物调节pH至5.5～7；添加甜菊糖苷及孵化好的β-淀粉酶，在35-55℃酶促12-24小时；其中，β-淀粉酶孵育条件：12到48个小时，55-75℃；酶促结束后热处理灭酶活；并进行脱色、大孔吸附树脂吸附；乙醇洗脱后经过离子交换树脂，浓缩和干燥得到成品。
但该技术方案存在一定局限，不适合工业化的生产：需要经过3次不同的酶处理，步骤繁琐，而且3次用不同的酶，酶用量及成本过高；其中有两次灭酶活需要经过高温处理，第一次需要在pH2.8酸度下的情况下高温煮沸灭酶活5min，这对含铁设备的损伤较大，或者需要更高质量价格更高昂的耐酸设备，而且对控温系统也有较高的要求，高温灭酶活需要耗费更多的能量，增加碳排放；3次酶处理，耗费总工时较长，3次酶处理时间总共超过37小时，效率低下。由于3次酶处理，引入的杂质较多，接枝效果不够理想，残留有较多的淀粉酶促产物还需经过大孔树脂除杂，离子交换树脂脱盐等步骤，又进一步延长了工时，增加了成本。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，本发明提供一种工业化快速生产制备葡萄糖基甜菊糖苷混合物的方法。所述方法不使用淀粉作为葡萄糖残基的供体，使用氧化淀粉作为葡萄糖残基的供体；减少酶的种类和处理次数，只用CGT酶一次酶转糖基化处理；优化酶处理的反应条件，缩短了工时，降低对设备的要求，降低成本，提高单位产能。
本发明人在研究中发现，淀粉在水溶液中的溶解性差，溶解不充分的淀粉，淀粉链未能充分被淀粉酶和CGT酶打开，造成水解下来的葡萄糖残基数量有限，从而转糖基效果差，转化率低。而不需经淀粉酶处理，稍微加热就已经呈现良好的水溶性，且溶解度高。氧化淀粉是在淀粉糊化后加入α-淀粉酶，随机切断淀粉中α-1,4葡萄糖苷键，得到糊精及低聚糖，从而降低溶液粘度和增加淀粉的溶解度。葡萄糖、麦芽糖等单糖二糖均不适合作为糖基供体，氧化淀粉为较优的糖基供体，兼顾成本，选择廉价的氧化淀粉作为本发明的糖基供体。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明提供一种工业化快速生产制备葡萄糖基甜菊糖苷混合物的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一，酶促反应：溶解氧化淀粉及甜菊糖苷，加入CGT酶进行酶促反应，酶促反应温度为40℃～55℃，酶促时间7～12h，灭酶活结束反应；
步骤二，脱色除味；
步骤三，过滤、浓缩、干燥得到产品。
在以不同的糖基供体应用CGT酶催化改性工业品甜菊糖时，氧化淀粉作为糖基供体甜菊糖苷的转化率高达93％以上，而其它的淀粉作为糖基供体时的转化率则较差，只有大约40％～60％的转化率；糊精类产品作为糖基供体时效果比淀粉类要好一些，甜菊糖苷的转化率明显提升了一个档次到70％～85％之间，环糊精效果是糊精类糖基供体中效果最好的，但是与氧化淀粉相比，还有明显的差距。
考虑热力学因素，温度过低，CGT酶酶活低，需加入更多的CGT酶，成本过高，在本发明工艺的优化中发现CGT酶在甜叶菊应用中，当温度在40℃以上酶活才会被激活；同时考虑热稳定性，当温度过高时，CGT酶会因为蛋白变性而失活，虽然CGT酶是可以耐高温的，供应商诺维信推荐反应温度为85℃，但本发明人在工艺优化的过程中发现：CGT酶在甜叶菊应用领域，较低的温度有益于甜菊糖苷的接枝糖基化，当温度超过55℃以后，甜菊糖苷的接枝糖基化的反应开始下降，这是本发明的另一重要发现。
优选的，所述步骤一的溶解溶剂为自来水或纯化水，本发明人发现选择纯化水作为反应介质时，引入杂离子较少，利于后续反应；用量为氧化淀粉与甜菊糖苷总质量的5～20倍；通过控制氧化淀粉的量，充分溶解氧化淀粉，若氧化淀粉溶解不充分，淀粉链未能被CGT酶打开，造成水解下来的葡萄糖残基数量有限，从而转糖基效果差，转化率低。
优选的，所述步骤一的溶解温度为55℃～100℃；本发明人发现夏天时微生物容易发酵，影响反应，夏天时微生物更易繁殖，引起原辅料溶液发酵，影响酶促反应，因此夏秋季节，溶解后煮沸到100℃，可以更好地杀灭微生物。
优选的，所述步骤一的氧化淀粉与甜菊糖苷的质量比为1～1.5:1；当增加底物质量比，即随着提高糖基供体的量，转化率增加，产率也有所增加，考虑到原料利用率和后续分离，氧化淀粉与甜菊糖苷的质量比为1～1.5:1为最佳底物比范围，在此范围内转化率和反应初速度随着加酶量的增加都显著增加。为使其充分溶解，可在搅拌条件下匀速加入氧化淀粉，待其充分溶解后再往溶解好的氧化淀粉溶液中，搅拌条件下匀速加入甜菊糖苷，得到溶解均匀的氧化淀粉和甜菊糖苷混合液。
优选的，所述步骤一CGT酶的用量为甜菊糖苷质量的5％～15％；当加酶量大于15％之后，产率增加不明显，兼顾酶的成本，选择5％～15％甜菊糖苷质量为最佳加酶量。
优选的，所述步骤一酶促反应PH为3.5～5。
优选的，所述步骤一灭酶活温度为95℃～100℃，时间为10～20min；
优选的，使用活性炭对所述步骤二进行脱色脱味；
优选的，所述步骤二活性炭的用量为0.03～0.15倍甜菊糖苷的重量。
优选的，所述步骤二脱色脱味的温度为85～100℃，时间为20～40min。
优选的，所述步骤三浓缩为减压浓缩，温度70～80℃，真空度-0.07～ -0.09MPa。
优选的，所述步骤三干燥为真空干燥，温度为70～80℃，真空度为-0.07～ -0.09MPa。
与现有技术比较，本发明的方法具有以下优点：
1.用商品化的氧化淀粉作为糖基供体，比用淀粉作为糖基供体可以减少工艺步骤，更为省事，省时，效率高，转糖基效果好，又降低了成本。
2.只用单一的CGT酶进行转糖基反应，省去了淀粉酶处理淀粉等一系列步骤，节省了酶的成本，也省去了低pH下高温灭活淀粉酶等工艺步骤，工艺简单易操作。
3.优化的酶促反应条件温和，甜菊糖苷的转糖基化达到85％～95％，转化率高，时间缩短至12小时以内。
4.由于步骤简单，未引入淀粉酶等其他更多的杂质，及其水解淀粉后未被充分利用的糊精类物质，也就省去了过大孔树脂及离子交换树脂等除非二萜类杂质及离子灰分等工艺步骤。从而更进一步降低了生产成本，提高了效率。
附图说明
图1糖基供体的筛选
图2四种酶的筛选结果
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
(1)将1000ml自来水加热到55℃，搅拌条件下匀速加入100克氧化淀粉，使之充分溶解呈透明状液体；再往该透明状液体中搅拌条件下匀速加入100克90％甜菊糖苷，生成均匀的氧化淀粉和甜菊糖苷透明混合液。
(2)将上述溶解均匀的氧化淀粉和甜菊糖苷混合液冷却至40℃。
(3)往上述溶解均匀的氧化淀粉和甜菊糖苷混合液中加入5克CGT酶(诺维信生产)，用盐酸调节PH值为3.5，搅拌状态下进行糖基化反应7小时。
(4)将上述糖基化反应产物加热至95℃，保持10分钟，灭CGT酶活，结束糖基化反应。
(5)加入3克活性炭粉末，85℃保温20分钟脱色除味；过滤除去活性炭粉以及CGT酶。
(6)将滤液进行减压浓缩得到浓缩液，减压浓缩条件为温度70℃，真空度 -0.07MPa；将浓缩液进行真空干燥，温度70℃，真空度-0.07MPa；最终得到成品，最终产品184.24克，甜菊糖苷含量为6.16％，甜菊苷转化率为：1-(184.24×6.16％) /(100×90％)＝87.4％。
实施例2
(1)将2000ml自来水加热到100℃，搅拌条件下匀速加入150克氧化淀粉，使之充分溶解呈透明状液体；再往该透明状液体中搅拌条件下匀速加入100克95％甜菊糖苷，生成均匀的氧化淀粉和甜菊糖苷透明混合液。
(2)将上述溶解均匀的氧化淀粉和甜菊糖苷混合液冷却至55℃。
(3)往上述溶解均匀的氧化淀粉和甜菊糖苷混合液中加入15克CGT酶(诺维信生产)，用盐酸调节PH值为5，搅拌状态下进行糖基化反应12小时。
(4)将上述糖基化反应产物加热至100℃，保持20分钟，灭CGT酶活，结束糖基化反应。
(5)加入15克活性炭粉末，100℃保温40分钟脱色除味；过滤除去活性炭粉以及CGT酶。
(6)将滤液进行减压浓缩得到浓缩液，减压浓缩条件为温度80℃，真空度 -0.09MPa；将浓缩液进行真空干燥，温度80℃，真空度-0.09MPa；最终得到成品 227.36克，甜菊糖苷含量为6.18％，甜菊苷转化率为：1-(227.36×6.18％)/(100 ×95％)＝85.2％。
实施例3
(1)将1600ml纯化水加热到60℃，搅拌条件下匀速加入130克氧化淀粉，使之充分溶解呈透明状液体；再往该透明状液体中搅拌条件下匀速加入100克95％甜菊糖苷，生成均匀的氧化淀粉和甜菊糖苷透明混合液。
(2)将上述溶解均匀的氧化淀粉和甜菊糖苷混合液冷却至45℃。
(3)往上述溶解均匀的氧化淀粉和甜菊糖苷混合液中加入10克CGT酶(诺维信生产)，用盐酸调节PH值为4，搅拌状态下进行糖基化反应11小时。
(4)将上述糖基化反应产物加热至98℃，保持13分钟，灭CGT酶活，结束糖基化反应。
(5)加入5克活性炭粉末，90℃保温30分钟脱色除味；过滤除去活性炭粉以及CGT酶。
(6)将滤液进行减压浓缩得到浓缩液，减压浓缩条件为温度75℃，真空度 -0.08MPa；将浓缩液进行真空干燥，温度75℃，真空度-0.08MPa；最终得到成品 210.11克，甜菊糖苷含量为4.25％，甜菊苷转化率为：1-(210.11×4.25％)/(100 ×95％)＝90.6％。
实施例4
(1)将2000ml纯化水加热到65℃，搅拌条件下匀速加入120克氧化淀粉，使之充分溶解呈透明状液体；再往该透明状液体中搅拌条件下匀速加入100克95％甜菊糖苷，生成均匀的氧化淀粉和甜菊糖苷透明混合液。
(2)将上述溶解均匀的氧化淀粉和甜菊糖苷混合液冷却至50℃。
(3)往上述溶解均匀的氧化淀粉和甜菊糖苷混合液中加入12克CGT酶(诺维信生产)，用盐酸调节PH值为4.5，搅拌状态下进行糖基化反应9小时。
(4)将上述糖基化反应产物加热至96℃，保持15分钟，灭CGT酶活，结束糖基化反应。
(5)加入8克活性炭粉末，90℃保温35分钟脱色除味；过滤除去活性炭粉以及CGT酶。
(6)将滤液进行减压浓缩得到浓缩液，减压浓缩条件为温度72℃，真空度 -0.08MPa；将浓缩液进行真空干燥，温度72℃，真空度-0.08MPa；最终得到成品 201.49克，甜菊糖苷含量为3.12％，甜菊苷转化率为：1-(201.49×3.12％)/(100 ×95％)＝93.4％
实施例5
(1)将1500ml纯化水加热到78℃，搅拌条件下匀速加入110克氧化淀粉，使之充分溶解呈透明状液体；再往该透明状液体中搅拌条件下匀速加入100克95％甜菊糖苷，生成均匀的氧化淀粉和甜菊糖苷透明混合液。
(2)将上述溶解均匀的氧化淀粉和甜菊糖苷混合液冷却至48℃。
(3)往上述溶解均匀的氧化淀粉和甜菊糖苷混合液中加入6克CGT酶(诺维信生产)，用盐酸调节PH值为4.3，搅拌状态下进行糖基化反应10小时。
(4)将上述糖基化反应产物加热至100℃，保持18分钟，灭CGT酶活，结束糖基化反应。
(5)加入8克活性炭粉末，98℃保温25分钟脱色除味；过滤除去活性炭粉以及CGT酶。
(6)将滤液进行减压浓缩得到浓缩液，减压浓缩条件为温度76℃，真空度 -0.09MPa；将浓缩液进行真空干燥，温度72℃，真空度-0.07MPa；最终得到成品 192.86克，甜菊糖苷含量为4.83％，甜菊苷转化率为：1-(192.86×4.83％)/(100 ×95％)＝90.2％。
实施例6
(1)将1400ml纯化水加热到95℃，搅拌条件下匀速加入145克氧化淀粉，使之充分溶解呈透明状液体；再往该透明状液体中搅拌条件下匀速加入100克95％的甜菊糖苷，生成均匀的氧化淀粉和甜菊糖苷透明混合液。
(2)将上述溶解均匀的氧化淀粉和甜菊糖苷混合液冷却至52℃。
(3)往上述溶解均匀的氧化淀粉和甜菊糖苷混合液中加入8克CGT酶(诺维信生产)，用盐酸调节PH值为4.8，搅拌状态下进行糖基化反应11小时。
(4)将上述糖基化反应产物加热至96℃，保持12分钟，灭CGT酶活，结束糖基化反应。
(5)加入13克活性炭粉末，88℃保温36分钟脱色除味；过滤除去活性炭粉以及 CGT酶。
(6)将滤液进行减压浓缩得到浓缩液，减压浓缩条件为温度78℃，真空度 -0.08MPa；将浓缩液进行真空干燥，温度73℃，真空度-0.09MPa；最终得到成品 223.05克，甜菊糖苷含量为5.41％，甜菊苷转化率为：1-(223.05×5.41％)/(100 ×95％)＝87.3％。
对比例1-2用于评价对比文件1，即美国专利US8257948B2使用淀粉作为葡萄糖残基的供体的技术方案与本发明技术方案取得的技术效果差异。
对比例1
(1)将100g木薯淀粉悬浮于300mL水，pH6.5中
(2)加入2g的α-淀粉酶和5g的CGT酶(诺维信生产)，并且在80℃下进行淀粉液化约一小时；
(3)通过盐酸将反应混合物的pH调节至pH 2.8，并且在5分钟的过程中将混合物在100℃下煮沸，使酶灭活。
(4)冷却至65℃后，用氢氧化钠溶液将pH调节至pH6.0，将通过的100g 95％甜菊糖苷加入液化淀粉中并搅拌直至获得均匀的溶液。
(5)将6g的CGT酶加入溶液中，并将混合物在65℃的温度下在持续搅拌下保持24小时。
(6)然后将温度降至45℃，并将8gβ-淀粉酶加入反应混合物中。将反应再继续12小时。
(7)将获得的反应混合物在95℃下加热15分钟，使酶灭活。
(8)加入20克活性炭，并将混合物加热至75℃，并保持30分钟。
(9)将混合物过滤并用水将滤液稀释至5％固体含量，并通过各自填充了 4000mLAmberliteXAD 7HP大孔吸附树脂的柱。用5体积的水和2体积的20％(v/v) 乙醇洗涤柱，用50％乙醇洗脱吸附的糖苷。
(10)将获得的洗脱液通过填充了Amberlite FPC23(H+)和Amberlite FPA51(OH-)离子交换树脂的柱。
(11)蒸发乙醇，并将脱盐和脱色的水溶液在72℃真空浓缩，然后使用实验室喷雾干燥器干燥成粉末形式，获得了151克产物，甜菊糖苷含量为9.69％，甜菊苷转化率为：1-(151×9.69％)/(100×95％)＝84.6％。
对比例2
(1)将100g木薯淀粉悬浮于300mL水(pH6.5)中。
(2)加入2g的α-淀粉酶和6g的CGT酶(诺维信生产)，并且在80℃下进行淀粉液化约1.5小时。
(3)通过盐酸将反应混合物的pH调节至pH 2.8，并且在5分钟的过程中将混合物在100℃下煮沸，使酶灭活。
(4)冷却至65℃后，用氢氧化钠溶液将pH调节至pH6.0。将加入100g 95％甜菊苷提取物加入液化淀粉中并搅拌直至获得均匀的溶液。
(5)将7g的CGT酶加入溶液中，并将混合物在65℃的温度下在持续搅拌下保持24小时。
(6)然后将温度降至45℃，并将12gβ-淀粉酶加入反应混合物中。将反应再继续12小时。
(7)将获得的反应混合物在95℃下加热15分钟，使酶灭酶活。
(8)加入20克活性炭，并将混合物加热至75℃，并保持30分钟。
(9)将混合物过滤并用水将滤液稀释至5％固体含量，并通过填充了 AmberliteFPC23(H+)和Amberlite FPA51(OH-)离子交换树脂的柱。
(12)将脱盐的溶液在72℃真空浓缩，并使用实验室喷雾干燥器干燥成粉末形式，获得了166克产物，甜菊糖苷含量为7.55％，甜菊苷转化率为：1-(166× 9.69％)/(100×95％)＝86.8％。
表1各工艺要求及技术效果对比表
对比例1、2需要经过3次不同的酶处理，步骤繁琐，而且3次用不同的酶，酶用量大及成本过高；其中有两次酶灭活需要经过高温处理，第一次需要在pH2.8 酸度下的情况下高温煮沸灭酶活5min，这对含铁设备的损伤较大，或者需要更高质量价格更高昂的耐酸设备，而且对控温系统也有较高的要求，高温灭酶活需要耗费更多的能量，增加碳排放；3次酶处理，耗费总工时较长，3次酶处理时间总共超过37小时，效率低下。由于3次酶处理，引入的杂质较多，接枝效果不够理想，残留有较多的淀粉酶促产物还需经过大孔树脂除杂，离子交换树脂脱盐等步骤，又进一步延长了工时，增加了成本。对比例1、2还存在转化率低，其转化率产率均没有超过90％，单位产能低下。
不同糖基供体对酶改性甜菊苷产物的影响
对比例3～8
对比例3～8用于评价非氧化淀粉作为糖基供体对酶改性甜菊苷产物的影响，采用玉米淀粉、红薯淀粉、木薯淀粉、麦芽糊精，糊精、环糊精等6种非氧化淀粉作为葡萄糖残基的供体的技术方案与本发明技术方案取得的技术效果差异。对比例3～8分别以玉米淀粉、红薯淀粉、木薯淀粉、麦芽糊精，糊精、环糊精取代氧化淀粉作为糖基供体，其他步骤同实施例4，所得产物各个指标含量如下表：
表2不同糖基供体对甜菊糖苷接枝转化率的影响
糖基供体 转化率(％) 总苷(％) RD(％) RA(％) STV(％) RF(％) RC(％) DA(％) 甜苷(％) RB(％) SB(％)
玉米淀粉 55.53 23.29 0.44 10.26 9.35 0.39 1.76 0.15 0.42 0.32 0.20
红薯淀粉 51.86 25.21 0.45 11.08 10.12 0.45 1.89 0.18 0.39 0.33 0.32
木薯淀粉 46.36 28.09 0.50 12.75 10.95 0.45 1.92 0.15 0.62 0.38 0.37
麦芽糊精 69.75 15.84 0.32 6.81 5.72 0.34 1.51 0.11 0.51 0.23 0.29
糊精 74.32 13.45 0.19 6.22 4.86 0.25 1.13 0.10 0.31 0.18 0.21
环糊精 84.53 8.10 0.11 3.46 2.89 0.18 0.97 0.08 0.14 0.11 0.16
氧化淀粉 93.39 3.46 - 1.56 1.50 - 0.40 - - - -
由上表可以得出以下结论：各个糖基供体对甜菊糖苷的接枝糖化差异非常明显，其中氧化淀粉的效果最好。
从转化率这一指标来看，氧化淀粉作为糖基供体时，甜菊糖苷的转化率高达 93％以上，而其它的淀粉作为糖基供体时的转化率则较差，只有大约40％～60％的转化率；糊精类产品作为糖基供体时效果比淀粉类要好一些，甜菊糖苷的转化率明显提升了一个档次到70％～85％之间，环糊精效果是糊精类糖基供体中效果最好的，但是与氧化淀粉相比，还有明显的差距。
从糖基化产物中残留的未参与反应的甜菊糖苷总苷以及各个甜菊糖苷含量来看，淀粉类作为糖基供体时残留的总苷较高，产物中总苷残留约20％～30％，说明淀粉类物质未充分参与反应，可能与其自身的分子大小以及水中的溶解性有关，由于淀粉类物质分子量较大，在水中溶解性不够好，未能充分展开供CGT酶水解并转糖基接枝，影响了CGT酶的工作效率；糊精类产品是淀粉类产品经过进一步加工而成的，分子量比淀粉要小，而且水溶性也有了较大的改善，因此其作为糖基供体时，CGT酶可以更容易更快地水解出更多的葡萄糖残基，并且进行接枝糖基化反应，从而提高了甜菊糖苷的转化率，未参与反应的甜菊糖苷总苷残留大大降低，产物中总苷残留8％～16％，尤其以环糊精作为糖基供体时效果最为明显，但是总体效果还是不如氧化淀粉，氧化淀粉作为糖基供体时产物中总苷残留可以低于4％，并且仅仅残留少量的RA,RC和STV这三种甜菊糖苷，苦涩味去除的比较彻底，味道比较纯正，接近蔗糖，不像其他糖基供体所得产物，成分比较多，口感较杂，带有苦涩味和草青味。
相对于玉米淀粉、红薯淀粉、木薯淀粉、麦芽糊精，糊精、环糊精等6种非氧化淀粉作为葡萄糖残基的供体时，氧化淀粉的转化率高，残留未反应的总苷低，残留未反应的辅料含量低，口感好，苦味去除较彻底。
对比例9～12
对比例9～12用于评价采用其他4种变性淀粉作为葡萄糖残基的供体的技术方案与本发明技术方案取得的技术效果差异。对比例9～12分别以酸解淀粉、酯化淀粉、交联淀粉、醚化淀粉取代氧化淀粉，其他步骤同实施例4。
由图1所示可知，其中有四种变性淀粉能够检测出有转苷产物生成。酸解淀粉、酯化淀粉、交联淀粉、醚化淀粉均作为后续实验的糖基供体。与其他变性淀粉作为葡萄糖残基的供体(对比例9、10、11、12)相比，氧化淀粉与甜菊苷的酶促反应体系中，甜菊苷转化率更高，约为对比例9-12的两倍，说明本发明技术方案采用氧化淀粉作为葡萄糖残基的供体的技术效果优于其它酸解淀粉等4种变性淀粉的效果。
而本发明的采用氧化淀粉作为糖基供体，St的转化率达到93.4％，得到单取代、二取代和多取代的转糖基产物；用CGT酶催化甜菊糖和氧化淀粉反应，得到单取代、二取代和三取代的转糖基产物共九种，单取代和二取代的转糖基产物的味质得到了很大程度的改善，而其它4种变性淀粉转糖基产物的种类相对较少。同时在对St-RA混合物与4种不同淀粉的催化反应，发现氧化淀粉作为糖基供体时，CGTase的转苷活性较高(对St和RA均高)，而高取代度产物也显著高于其它变性淀粉。在用酸解淀粉作为糖基供体，发现CGTase的歧化活性强于氧化淀粉，但其甜菊糖酶法改性的转化率在60％左右，低于氧化淀粉的甜菊苷的转化率。其原因可能是糖基供体中长短链、分子量的差异，影响底物结合后水解和歧化的平衡，最终造成甜菊苷的转化率差异。
不同酶对酶改性甜菊苷产物的影响
对比例13～15用于评价采用其他酶进行酶促糖基化的技术方案与本发明技术方案取得的技术效果差异。对比例7-9分别以葡萄糖基转移酶、呋喃果糖苷酶、半乳糖苷酶取代GGT酶，各反应体系的温度及PH值设计均采用各酶的最适的温度及PH值，其他步骤同实施例4。
对比例13
(1)将2000ml纯化水加热到58℃，搅拌条件下匀速加入120克氧化淀粉，使之充分溶解呈透明状液体；再往该透明状液体中搅拌条件下匀速加入100g 95％甜菊糖苷，生成均匀的氧化淀粉和甜菊糖苷透明混合液。
(2)将上述溶解均匀的氧化淀粉和甜菊糖苷混合液冷却至56℃。
(3)往上述溶解均匀的氧化淀粉和甜菊糖苷混合液中加入15克葡萄糖苷酶(诺维信生产)，用缓冲液调节PH值为6.5，搅拌状态下进行糖基化反应12小时。
(4)将上述糖基化反应产物加热至100℃，保持10分钟，灭葡萄糖苷酶酶活，结束糖基化反应。
(5)加入40mL乙醇，振荡5min后，放置2h，过滤除去不溶性的剩余淀粉、糊精等。
(6)加入8克活性炭粉末，90℃保温35分钟脱色除味；过滤除去活性炭粉以及葡萄糖苷酶。
(7)将滤液进行减压浓缩得到浓缩液，减压浓缩条件为温度72℃，真空度 -0.08MPa；将浓缩液进行真空干燥，温度72℃，真空度-0.08MPa；最终得到成品，浓缩干燥所得干燥产品200.69克，甜菊糖苷含量为31.62％，甜菊苷转化率为：1- (200.69×31.62％)/(100×95％)＝33.2％。
对比例14
(1)将2000ml纯化水加热到58℃，搅拌条件下匀速加入120克氧化淀粉，使之充分溶解呈透明状液体；再往该透明状液体中搅拌条件下匀速加入100g 95％甜菊糖苷，生成均匀的氧化淀粉和甜菊糖苷透明混合液。
(2)将上述溶解均匀的氧化淀粉和甜菊糖苷混合液冷却至40℃。
(3)往上述溶解均匀的氧化淀粉和甜菊糖苷混合液中加入15克呋喃果糖苷酶(诺维信生产)，用磷酸盐缓冲液调节PH值为7，搅拌状态下进行糖基化反应15小时。
(4)将上述糖基化反应产物加热至100℃，保持10分钟，灭呋喃果糖苷酶酶活，结束糖基化反应。
(5)加入8克活性炭粉末，90℃保温35分钟脱色除味；通过微孔滤膜后除去活性炭粉以及CGT酶。
(6)将滤液进行减压浓缩得到浓缩液，减压浓缩条件为温度72℃，真空度 -0.08MPa；将浓缩液进行真空干燥，温度72℃，真空度-0.08MPa；最终得到成品，浓缩干燥所得干燥产品199.52克，甜菊糖苷含量为17.38％，甜菊苷转化率为：1- (199.52×17.38％)/(100×95％)＝63.5％。
对比例15
(1)将2000ml纯化水加热到58℃，搅拌条件下匀速加入120克氧化淀粉，使之充分溶解呈透明状液体；再往该透明状液体中搅拌条件下匀速加入100g 95％甜菊糖苷，生成均匀的氧化淀粉和甜菊糖苷透明混合液。
(2)将上述溶解均匀的氧化淀粉和甜菊糖苷混合液冷却至50℃。
(3)往上述溶解均匀的氧化淀粉和甜菊糖苷混合液中加入20克半乳糖苷酶(诺维信生产)，用盐酸调节PH值为6.4，搅拌状态下进行糖基化反应48小时。
(4)将上述糖基化反应产物加热至100℃，保持10分钟，灭半乳糖苷酶酶活，结束糖基化反应。
(5)加入8克活性炭粉末，90℃保温35分钟脱色除味；通过过滤后除去活性炭粉以及半乳糖苷酶。
(6)将滤液进行减压浓缩得到浓缩液，减压浓缩条件为温度72℃，真空度 -0.08MPa；将浓缩液进行真空干燥，温度72℃，真空度-0.08MPa；最终得到成品，最后浓缩干燥所得干燥产品200.43克，甜菊糖苷含量为35.79％，甜菊苷转化率为： 1-(200.43×35.79％)/(100×95％)＝24.5％。
由图2所示可知，与其他酶：葡萄糖基转移酶、呋喃果糖苷酶、半乳糖苷酶进行酶促糖基化的技术方案对比，采用GGT酶的本发明技术方案在糖基化反应中， GGT酶在实验所用糖基转移酶中的转苷活性最高，未转化甜菊糖苷的含量为 3.12％，而半乳糖苷酶中未转化的甜菊糖苷含量为35.79％，因此GGT酶作用的甜菊苷转化率均显著高于对比例7～9；由于对比例中酶反应体系均为各酶最佳的反应条件，已排除其他因素的干扰，说明本发明技术方案采用GGT酶的糖基化/接枝效果优于葡萄糖基转移酶等其它酶的糖基化/接枝效果。
本发明技术方案在提高甜菊苷转化率作用效果均优于对比文件1-4等现有技术。同时降低工业化对设备、能耗的要求，缩短了工时，降低成本，提升单位产能。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (12)

1.一种工业化快速生产制备葡萄糖基甜菊糖苷混合物的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一，酶促反应：溶解氧化淀粉及甜菊糖苷，加入CGT酶进行酶促反应，酶促反应温度为40℃～55℃，酶促时间7～12h，灭酶活结束反应；
步骤二，脱色除味；
步骤三，过滤、浓缩、干燥得到产品。
2.如权利要求1所述的一种工业化快速生产制备葡萄糖基甜菊糖苷混合物的方法，其特征在于，所述步骤一的溶解溶剂为自来水或纯化水。
3.如权利要求1所述的一种工业化快速生产制备葡萄糖基甜菊糖苷混合物的方法，其特征在于，所述步骤一的溶解温度为55℃～100℃。
4.如权利要求1所述的一种工业化快速生产制备葡萄糖基甜菊糖苷混合物的方法，其特征在于，所述步骤一的氧化淀粉与甜菊糖苷的质量比为1～1.5:1。
5.如权利要求1所述的一种工业化快速生产制备葡萄糖基甜菊糖苷混合物的方法，其特征在于，所述步骤一CGT酶的用量为甜菊糖苷质量的5％～15％。
6.如权利要求1所述的一种工业化快速生产制备葡萄糖基甜菊糖苷混合物的方法，其特征在于，所述步骤一酶促反应PH为3.5～5。
7.如权利要求1所述的一种工业化快速生产制备葡萄糖基甜菊糖苷混合物的方法，其特征在于，所述步骤一灭酶活温度为95℃～100℃，时间为10～20min。
8.如权利要求1所述的一种工业化快速生产制备葡萄糖基甜菊糖苷混合物的方法，其特征在于，使用活性炭对所述步骤二进行脱色脱味。
9.如权利要求8所述的一种工业化快速生产制备葡萄糖基甜菊糖苷混合物的方法，其特征在于，所述步骤二活性炭的用量为0.03～0.15倍甜菊糖苷的重量。
10.如权利要求8所述的一种工业化快速生产制备葡萄糖基甜菊糖苷混合物的方法，其特征在于，所述步骤二脱色脱味的温度为85～100℃，时间为20～40min。
11.如权利要求1所述的一种工业化快速生产制备葡萄糖基甜菊糖苷混合物的方法，其特征在于，所述步骤三浓缩为减压浓缩，温度70～80℃，真空度-0.07～-0.09MPa。
12.如权利要求1所述的一种工业化快速生产制备葡萄糖基甜菊糖苷混合物的方法，其特征在于，所述步骤三干燥为真空干燥，温度为70～80℃，真空度为-0.07～-0.09MPa。
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