CN101775425A - 一种用微波辅助环糊精葡萄糖基转移酶催化合成改性甜菊糖苷的方法 - Google Patents
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Abstract
一种用微波辅助环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)催化合成改性甜菊糖苷的方法,涉及有机化合物的生物合成技术领域。以甜菊糖水溶液和淀粉水解液为原料,在微波反应装置中经由微波辐射与CGTase催化的共同作用合成葡萄糖基取代的甜菊糖苷。在本发明提供的工艺条件内,不仅可以显著加快酶催化反应的进行,而且不会产生通常条件下水体系中微波使酶失活的现象。经品尝,合成的改性甜菊糖苷的苦涩味大大下降。
Description
技术领域
一种用微波辅助环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)催化合成改性甜菊糖苷的方法,具体地说是以甜菊糖水溶液和淀粉水解液为原料,在微波反应装置中经微波辐射与CGTase酶催化的共同作用,合成改性甜菊糖苷。涉及有机化合物的生物合成技术领域。
背景技术
甜菊糖是继甘蔗和甜菜糖之后,第三种有开发价值的天然蔗糖替代品,被国际上誉为“世界第三蔗糖”。它无毒副作用,无致癌物,食用安全,经常食用可预防高血压、糖尿病、肥胖症、心脏病、龋齿等病症,是一种可替代蔗糖的非常理想的甜味剂。但它有一个致命的弱点,即后苦涩味,导致其甜度与蔗糖仍有很大差距。从甜叶菊中提取到的两种主要甜味物质为甜菊甙(Stevioside)和莱包迪甙A(Rebaudiosides A),结构为:
其中Stevioside后苦涩味较重。利用酶例如CGTase催化转苷、在甜菊糖特别是Stevioside中引入新的糖基,可以温和地改善甜菊糖的甜味特性,反应过程见方程式1。
注:G=glucose(葡萄糖)残基,2G=2个glucose残基,3G=3个glucose残基,4G=4个glucose残基,5G=5个glucose残基。
微波辐射虽然在某些情况下特别是常规化学反应中可以加快反应速度,但是由于微波的热和非热效应以及酶催化合成的特殊性,同时由于水对微波的吸收远较底物的强,因此在水溶液中进行微波辅助下的酶催化反应很容易导致酶失活,故而一般在水溶液中进行的微波酶催化反应并不常见。实验发现在本发明所述的水溶液反应体系中,一定条件下微波不仅不会导致酶失活,反而能大幅加快反应速率。经过反复验证,本发明用微波辅助CGTase酶催化合成改性甜菊糖苷。
发明内容
本发明的目的是提供一种用微波辅助CGTase酶催化合成改性甜菊糖苷的方法,以甜菊糖水溶液和淀粉水解液为原料,微波辅助CGTase酶催化合成改性甜菊糖苷,应用本发明可以高效、快速地合成改性甜菊糖苷。
本发明的技术方案:一种用微波辅助环糊精葡萄糖基转移酶CGTase催化合成改性甜菊糖苷的方法,以CGTase酶为催化剂,以甜菊糖水溶液和淀粉水解液为原料,用微波辐射促进反应,合成改性甜菊糖苷;所用甜菊糖水溶液和淀粉水解液的体积相同,甜菊糖水溶液的质量浓度为2%,将底物甜菊糖∶淀粉按质量比为1∶0.3-1.5的比例混合,置于80mL微波反应器中,再加入10-40U/g甜菊糖的CGTase酶,将微波反应器移入微波反应装置,启动微波辐射,辐射功率选择范围为40-80W,设定反应温度为40-70℃间的某一温度,待反应温度达到设定值时开始计时,定时取样进行高压液相色谱分析(分析条件见参考文献[1]:中华人民共和国国家标准食品添加剂甜菊糖甙GB 8270-1999.),反应至反应化合物中原料甜菊甙的含量不变后停止微波加热,得到无色透明的改性甜菊糖苷粗产品;改性甜菊糖苷粗产品经干燥、乙醇重结晶后得到白色晶体改性甜菊糖苷。经品尝,其苦涩味大大下降。
所述的甜菊糖是从甜叶菊中提取的、甜菊甙质量含量为40%-90%的甜菊糖,由山东华仙甜菊股份有限公司购得,Stevioside含量的分析条件见参考文献[1]。
所述的CGTase酶来源于浸麻芽孢杆菌(Bacallus macerans),由日本天野酶制品株式会社购得,在本反应中的加入量为10-40U/g甜菊糖;CGTase酶的酶活测定方法见参考文献[2]:Lejeune,A.,Sakaguchi,K.,Imanaka,T.Aspectrophotometric assay for the cyclization activity of cyclomaltohexaose(α-cyclodextrin)glucanotransferase.Anal Biochem 1989,181(1):6-11.。
所述的淀粉水解液是用α-中温淀粉酶水解木薯淀粉或玉米淀粉的水解液,淀粉液化过程为:称取淀粉2g用水调成浆状物,在搅动下缓缓倾入70mL沸水中。然后以30mL水分几次冲洗装淀粉的烧杯,洗液并入其中,加热至完全透明,冷却,定容至100mL。加入2mL α-中温淀粉酶(4U/mL),在70℃水浴中液化30min,此时水解反应已经达到平衡。
所述的α-中温淀粉酶来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis),由无锡雪梅酶制剂科技有限公司购得,酶活测定方法见参考文献[3]:中华人民共和国轻工行业标准QB/T1803-1993.。
本发明的有益效果:本发明所提供的合成改性甜菊糖苷的方法能将酶催化与微波加热有效结合,综合利用酶催化和微波催化反应的诸多特点,能达到常规加热下酶催化反应所不具有的良好效果,同时加快反应的进行,不会产生通常条件下水体系中微波使酶失活的现象,从而提供了一种高效、快速的合成改性甜菊糖苷的方法。经品尝,合成的改性甜菊糖苷的苦涩味大大下降。
具体实施方式
实施例1
将10mL 2%的甜菊糖水溶液与10mL 2%的玉米淀粉水解液混合,移入80mL微波反应器,加入10U/g甜菊糖的CGTase酶液,在60℃、80W下搅拌反应1min。取样进行高压液相色谱分析。Stevioside的转化率为15.25%。改性甜菊糖苷粗产品经干燥、用乙醇重结晶后可以得到白色晶体产品,收率为71%。
对照例1(用常规加热替代微波辐射)
将10mL 2%的甜菊糖水溶液与10mL 2%的玉米淀粉水解液混合,移入50mL锥形瓶中,加入10U/g甜菊糖的CGTase酶液,在60℃水浴中反应30min,Stevioside的转化率达到16.45%。改性甜菊糖苷粗产品经干燥、用乙醇重结晶后可以得到白色晶体产品,收率为71%。
实施例2
将10mL 2%的甜菊糖水溶液与10mL 2%的玉米淀粉水解液混合,移入80mL微波反应器,加入10U/g甜菊糖的CGTase酶液,在60℃、80W下搅拌反应5min。取样进行高压液相色谱分析。Stevioside的转化率为36.25%。改性甜菊糖苷粗产品经干燥、用乙醇重结晶后可以得到白色晶体产品,收率为72%。
对照例2(用常规加热替代微波辐射)
将10mL 2%的甜菊糖水溶液与10mL 2%的玉米淀粉水解液混合,移入50mL锥形瓶中,加入10U/g甜菊糖的CGTase酶液,在60℃水浴中反应45min,Stevioside的转化率达到35.36%。改性甜菊糖苷粗产品经干燥、用乙醇重结晶后可以得到白色晶体产品,收率为71.5%。
实施例3
将10mL 2%的甜菊糖水溶液与10mL 2%的玉米淀粉水解液混合,移入80mL微波反应器,加入40U/g甜菊糖的CGTase酶液,在60℃、80W下搅拌反应1min。取样进行高压液相色谱分析。Stevioside的转化率为45.45%。改性甜菊糖苷粗产品经干燥、用乙醇重结晶后可以得到白色晶体产品,收率为77%。
对照例3(用常规加热替代微波辐射)
将10mL 2%的甜菊糖水溶液与10mL 2%的淀粉水解液混合,移入50mL锥形瓶中,加入40U/g甜菊糖的CGTase酶液,在60℃水浴中反应30min,Stevioside的转化率达到46.94%。改性甜菊糖苷粗产品经干燥、用乙醇重结晶后可以得到白色晶体产品,收率为76.5%。
实施例4
将10mL 2%的甜菊糖水溶液与10mL 2%的玉米淀粉水解液混合,移入80mL微波反应器,加入20U/g甜菊糖的CGTase酶液,在60℃、80W下搅拌反应1min。取样进行高压液相色谱分析。Stevioside的转化率为20.63%。改性甜菊糖苷粗产品经干燥、用乙醇重结晶后可以得到白色晶体产品,收率为70%。
实施例5
将10mL 2%的甜菊糖水溶液与10mL 2%的淀粉水解液混合,移入80mL微波反应器,加入10U/g甜菊糖的CGTase酶液,在60℃、40W条件下搅拌反应5min。取样进行高压液相色谱分析。Stevioside的转化率为10.35%。改性甜菊糖苷粗产品经干燥、用乙醇重结晶后可以得到白色晶体产品,收率为64%。
实施例6
将10mL 2%的甜菊糖水溶液与10mL 2%的淀粉水解液混合,移入80mL微波反应器,加入10U/g甜菊糖的CGTase酶液,在60℃、60W条件下搅拌反应5min。取样进行高压液相色谱分析。Stevioside的转化率为26.27%。改性甜菊糖苷粗产品经干燥、用乙醇重结晶后可以得到白色晶体产品,收率为70.4%。
实施例7
将10mL 2%的甜菊糖水溶液与10mL 2%的淀粉水解液混合,移入80mL微波反应器,加入10U/g甜菊糖的CGTase酶液,在40℃、80W条件下搅拌反应5min。取样进行高压液相色谱分析。Stevioside的转化率为11.61%。改性甜菊糖苷粗产品经干燥、用乙醇重结晶后可以得到白色晶体产品,收率为66%。
实施例8
将10mL 2%的甜菊糖水溶液与10mL 2%的淀粉水解液混合,移入80mL微波反应器,加入10U/g甜菊糖的CGTase酶液,在50℃、80W条件下搅拌反应5min。取样进行高压液相色谱分析。Stevioside的转化率为22.26%。改性甜菊糖苷粗产品经干燥、用乙醇重结晶后可以得到白色晶体产品,收率为70.1%。
实施例9
将10mL 2%的甜菊糖溶液与10mL 2%的淀粉水解液混合,移入80mL微波反应器,加入10U/g甜菊糖的CGTase酶液,在70℃、80W条件下搅拌反应5min。取样进行高压液相色谱分析。Stevioside的转化率为32.35%。改性甜菊糖苷粗产品经干燥、用乙醇重结晶后可以得到白色晶体产品,收率为71.2%。
实施例10
将10mL淀粉水解液与将10mL 2%的甜菊糖水溶液按底物淀粉∶甜菊糖为0.3∶1(w/w)混合,移入80mL微波反应器,加入10U/g甜菊糖的CGTase酶液,在60℃、80W条件下搅拌反应5min。取样进行高压液相色谱分析。Stevioside的转化率为15.58%。改性甜菊糖苷粗产品经干燥、用乙醇重结晶后可以得到白色晶体产品,收率为69%。
实施例11
将10mL淀粉水解液与将10mL 2%的甜菊糖水溶液按底物淀粉∶甜菊糖为为0.5∶1(w/w)混合,移入80mL微波反应器,加入10U/g甜菊糖的CGTase酶液,在60℃、80W条件下搅拌反应5min。取样进行高压液相色谱分析。Stevioside的转化率为23.57%。改性甜菊糖苷粗产品经干燥、用乙醇重结晶后可以得到白色晶体产品,收率为70.5%。
实施例12
将10mL淀粉水解液与将10mL 2%的甜菊糖水溶液按底物淀粉∶甜菊糖为为1.5∶1(w/w)混合,移入80mL微波反应器,加入10U/g甜菊糖的CGTase酶液,在60℃、80W条件下搅拌反应5min。取样进行高压液相色谱分析。Stevioside的转化率为20.46%。改性甜菊糖苷粗产品经干燥、用乙醇重结晶后可以得到白色晶体产品,收率为70.3%。
Claims (2)
1.一种用微波辅助环糊精葡萄糖基转移酶CGTase催化合成改性甜菊糖苷的方法,其特征是以CGTase酶为催化剂,以甜菊糖水溶液和淀粉水解液为原料,用微波辐射促进反应,合成改性甜菊糖苷;所用甜菊糖水溶液和淀粉水解液的体积相同,甜菊糖水溶液的质量浓度为2%,将底物甜菊糖∶淀粉按质量比为1∶0.3-1.5的比例混合,置于80mL微波反应器中,再加入10-40U/g甜菊糖的CGTase酶,将微波反应器移入微波反应装置,启动微波辐射,辐射功率选择范围为40-80W,设定反应温度为40-70℃间的某一温度,待反应温度达到设定值时开始计时,定时取样进行高压液相色谱分析,反应至反应化合物中原料甜菊甙的含量不变后停止微波加热,得到无色透明的改性甜菊糖苷粗产品;改性甜菊糖苷粗产品经干燥、乙醇重结晶后得到白色晶体改性甜菊糖苷。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征是所述的甜菊糖是从甜叶菊中提取的、甜菊甙质量含量为40%-90%的甜菊糖。
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