CN110564658A - 一株大肠杆菌工程菌及其全细胞催化生产甜菊醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株重组大肠杆菌工程菌pSE‑sbgl‑spbgl1及利用该菌株全细胞催化生产甜菊醇的方法，该菌株通过多顺反子形式共表达双β‑葡萄糖苷酶SPBGL1和SBGL，用全细胞催化的方法，以甜叶菊粗提物为底物，催化其中的甜菊苷和甜茶苷水解生产甜菊醇。本发明利用工程菌pSE‑sbgl‑spbgl1全细胞催化甜菊糖生产甜菊醇具有转化率高、产率高、产物单一、能耗较低、耗时短、操作简单、工业化潜力高等优点。

Description

一株大肠杆菌工程菌及其全细胞催化生产甜菊醇的方法
技术领域
本发明涉及涉及生物工程技术以及天然化合物的生物合成技术领域，特别涉及一株大肠杆菌工程菌及其全细胞催化生产甜菊醇的方法。
背景技术
甜叶菊是是原产于南美洲巴拉圭的多年生草本植物(LEWIS W H.Early Uses ofStevia rebaudiana(Asteraceae)Leaves as a Sweetener in Paraguay[J].EconomicBotany,1992,46(3):336-7)，在我国西南地区也有种植，其中一种俗称甜茶，大量存在与我国广西地区(LIU Z,SCHWIMER J,LIU D,et al.Gallic acid is partially responsiblefor the antiangiogenic activities of Rubus leaf extract[J].Phytother Res,2006,20(9):806-13)。甜菊糖是从甜叶菊叶子中提取出的一类低热量的甜味剂，据研究，其甜度是蔗糖甜度的200-350倍，但热量却只有蔗糖的1/300(ORGANIZATION W H.Safetyevaluation of certain food additives:WHO food additive series:42.In:Preparedby the Fifty-first Meeting of the Joint FAO/WHO Expert Committee on FoodAdditives(JECFA)[M].1999)，还可辅助治疗糖尿病、高血压、高血糖、预防动脉硬化等，被誉为“第三类糖源”。2005年，粮农组织/世卫组织食品添加剂联合专家委员会(JECFA)公布了对甜菊糖的毒理学研究(ORGANIZATION W H.Evaluation of certain food additives:sixty-third Meeting of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives(JECFA)[M].2005)，并批准甜菊糖作为食品添加剂使用。在此之后，日本、韩国、美国、欧盟等越来越多的国家相继将甜菊糖作为食品添加剂使用(HAJIHASHEMI S,GEUNS J M.Genetranscription and steviol glycoside accumulation in Stevia rebaudiana underpolyethylene glycol-induced drought stress in greenhouse cultivation[J].FEBSOpen Bio,2016,6(9):937-44)。甜菊糖也在我国的山东、福建、江苏、河南等20多个地区得到推广，现如今我国已成为甜叶菊种植大国及产品出口大国。
甜菊糖是一类混合物，包含不少于9种成份，包括甜菊苷、莱鲍迪苷A-C、E-F、甜菊双糖苷、甜茶苷、杜尔可苷等具有相同苷元的四环二萜类化合物，并将这类具有相同苷元的化合物统称为甜菊糖苷类物质。现鉴定出超过30种的甜菊糖苷类物质(WOLWER-RIECKU.The leaves of Stevia rebaudiana(Bertoni),their constituents and theanalyses thereof:a review[J].J Agric Food Chem,2012,60(4):886-95)。在提取到的甜菊糖混合物中，9种主要成份占甜菊糖总量的95％以上(ORGANIZATION W H.STEVIOLGLYCOSIDES:Prepared at the seventy-third Meeting of the Joint FAO/WHO ExpertCommittee on Food Additives(JECFA)[M].FAO JECFA Monographs 10 2010)，而这9种成份中又数甜菊苷和莱鲍迪苷A最多，二者的含量占甜菊糖总量的90％。甜菊糖苷类物质的区别仅在于C19位和C13位上连接有不同的糖基基团以及不同的基团数量，从而使得甜菊糖苷类物质拥有不同的理化性质。
甜菊醇是甜菊糖苷类物质的核心苷元，决定了甜菊糖苷类物质的基本性质和功能。甜菊醇自身拥有降血糖(MELIS M S,ROCHA S T,AUGUSTO A.Steviol effect,aglycoside of Stevia rebaudiana,on glucose clearances in rats[J].BrazilianJournal of Biology,2009,69(2):371-4)、抗高血压(YUAJIT,CHAOWALIT,MUANPRASAT,etal.Steviol an aglycone of natural sweetener stevioside,slows MDCK cystprogression by reducing activity and expression of CFTR chloride channels[J].Faseb Journal,2012,26(3):828-37)、抗肿瘤(TADAMASA T,HUIFENG R,GO M,etal.Mutagenicity of steviol and its oxidative derivatives in Salmonellatyphimurium TM677[J].Chemical&Pharmaceutical Bulletin,2002,50(7):1007-10)等药理活性。根据研究报道，甜菊醇可以通过抑制囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)和mTOR信号通路中的S6K蛋白的表达来改善多囊肾病的小鼠的肾脏功能(CHAOWALIT Y,CHATCHAIM,ANNA-RACHEL G,et al.Steviol retards renal cyst growth through reduction ofCFTR expression and inhibition of epithelial cell proliferation in a mousemodel of polycystic kidney disease[J].Biochemical Pharmacology,2014,88(3):412-21)，并且可以激活腺苷酸活化蛋白激酶。甜菊醇还具有抑制仓鼠肠道葡萄糖的吸收，降低线粒体酶的活性的作用(TOSKULKAO C,SUTHEERAWATTANANON M,PIYACHATURAWATP.Inhibitory effect of steviol,a metabolite of stevioside,on glucoseabsorption in everted hamster intestine in vitro[J].Toxicology Letters,1995,80(1–3):153-9)。早年研究还发现，fungusGibberellafujikuro LM-45-399可以将甜菊醇转化为13-OH Gas(GIANFAGNA T,ZEEVAART J A D,LUSK W J.Synthesis of[2H]gibberellins from steviol using the fungus Gibberellafujikuroi[J].Phytochemistry,1983,22(2):427-30)，fungusGibberellafujikuro的突变体B1-41a可以将甜菊醇代谢为13-OH GA12(BEARDER J R,MACMILLAN J,WELS C M,et al.Themetabolism of steviol to 13-hydroxylated ent-Gibberellanes and ent-kauranes[J].Phytochemistry,1975,14(8):1741-8)，表明甜菊醇具有转化生产植物常用激素赤霉素的可能性。同时，也有研究发现，甜菊醇本身和部分甜菊糖苷类物质对植物生长就具有调节作用，甜菊醇和异甜菊醇可以增加葡萄果实的大小和重量(OLIVEIRA B H D,STIIRMER JC,SOUZA FILHO J D D,et al.Plant growth regulation activity of steviol andderivatives[J].Phytochemistry,2008,69(7):1528-33)。甜菊醇除了与其他甜菊糖苷类物质一样有作为甜味剂的应用价值之外，还具有一定的药用和激素生产的潜力。
现有的制备生产甜菊醇的方法主要分为化学法和生物法两类，化学法主要通过酸解法制备甜菊醇。张宗英等报道了以盐酸或氨基磺酸催化斯替夫苷(同甜菊苷)制备甜菊醇，以0.04mol/L的盐酸能够在95℃下，催化400g/L的底物水解，28h内甜菊醇的产率为83.6％(张宗英,胡学一,夏咏梅.盐酸或氨基磺酸催化水解斯替夫苷制备甜菊醇[J].精细化工,2014,31(4))。申请CN104478706A介绍了分别利用三种路易斯酸氯化铝、氯化铁、氯化亚铜制备甜菊醇的方法，需要将底物在50-100℃下搅拌0.5h后，加入路易斯酸反应1-24h。作用于25mg/mL甜叶菊粗提物时，加入5mmol/g提取物的氯化铁水溶液，反应3h，甜菊醇产量为89％。由于甜菊醇在酸性条件下不稳定，易发生Wagner-Meerwein重排，生成异甜菊醇(胡艳秋,石浩.甜菊醇及其衍生物的研究进展[J].浙江化工,2011,42(1):10-4)，影响产物纯度。申请CN108707163A在重复张宗英等的方法在验证异甜菊醇生成的同时，发现通过盐酸或氨基磺酸水解还存在其他副产物，为改善包括异甜菊醇在内的其它副产物，通过酸解、硅基化、环氧化、还原4步制备甜菊醇，虽能够有效解决副产物的问题，但是过程中涉及多种有机试剂或其他化学试剂。
由于化学法的局限性，生物法受到青睐，申请CN102220274B是以巴氏微杆菌XJ的菌液或是菌粉催化甜菊糖苷混合物水解生产甜菊醇，作用底物浓度为3.2mg/mL、转化温度为28-37℃、pH为3.5-7.5，24h内甜菊苷的转化率达到95％、莱鲍迪苷A的转化率21％；30h后甜菊苷的转化率达到100％。申请CN103014076B是通过水和曲浸提棘孢曲霉孢子得到酶液，再作用甜菊糖生产甜菊醇。作用底物浓度为1％-15％、温度为30-60℃、作用时间为24-48h，这个申请是利用野生菌进行催化的本质是利用其产的酶催化甜菊苷水解。申请CN102827891A是利用了来源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶催化甜叶菊提取物水解生产甜菊醇，作用的底物浓度为150-300g/L、pH为4.0-6.0、在55℃下恒温0.5h后每克甜菊苷加入800U的纯酶，反应3h后再升温至70-75℃直至转化率不再升高；提取物中的甜菊苷的转化率能达到99％。申请CN102712940A是利用商业化的酶CYTOLASE PCL5制备甜菊醇，该酶受到产物葡萄糖的抑制显著，需配合酵母消耗葡萄糖，才能够保持甜菊醇的产率；同时还发现加入第二种酶制剂能够有效的促进甜菊苷的水解，反应pH为4.2，反应温度需要在30-55℃下进行，反应时间至少为4天。申请CN105861573A是利用两个纯化的重组酶水解甜菊苷生产甜菊醇，该方法分别构建了2个重组大肠杆菌菌株，表达、纯化获得了2个β-葡萄糖苷酶S-bgl4和Sbgl；先在50℃、pH为8.0的条件下加入80μg/mL的S-bgl4反应3h，将甜菊苷水解为甜茶苷，沸水浴终止反应并用浓盐酸调pH至5.0，再加入80μg/mL的Sbgl反应3h将甜茶苷水解为甜菊醇，煮沸终止反应，甜菊苷的转化率为84.7％、甜菊醇的产率为72.4％。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明针对现有技术中甜菊苷转化率不高、甜菊醇产量不高的问题，提供了一株大肠杆菌工程菌，以及该工程菌全细胞催化甜菊糖生产甜菊醇的方法，直接实现甜菊苷到甜菊醇的转化，并且具有较高的转化率。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一株大肠杆菌工程菌，以多顺反子形式共表达两个β-葡萄糖苷酶SPBGL1和SBGL。
利用共表达大肠杆菌工程菌pSE-sbgl-spbgl1全细胞催化甜菊糖生产甜菊醇的方法，操作步骤如下：
(1)构建共表达大肠杆菌工程菌pSE-sbgl-spbgl1，诱导培养共表达大肠杆菌工程菌pSE-sbgl-spbgl1，20℃诱导22h，诱导培养结束后，收集菌体，称量菌体湿重
(2)清洗菌体3次，再用缓冲液重悬菌体，获得共表达大肠杆菌工程菌pSE-sbgl-spbgl1全细胞催化液；
(3)向步骤(2)所得共表达大肠杆菌工程菌pSE-sbgl-spbgl1全细胞催化液中加入适当浓度的甜菊糖，反应4-8h；
(4)沸水浴后终止反应，获得产物，即甜菊醇。
作为优选，步骤(1)中所述的大肠杆菌工程菌pSE-sbgl-spbgl1为多顺反子形式，目的基因spbgl1位于目的基因sbgl的下游。
作为优选，步骤(1)中所述的诱导培养为20℃、0.5mM的IPTG诱导培养22h。
作为优选，步骤(2)中所述的清洗菌体为用0.9％的NaCl溶液重悬菌体。
作为优选，步骤(2)中所述的缓冲液为Na2HPO4-柠檬酸缓冲液。
作为优选，所述的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液中含有0.2M的Na2HPO4和和0.1M的柠檬酸，pH值为5.0-7.0。
作为优选，步骤(2)中所述的菌体浓度为0.25g/mL。
作为优选，步骤(3)中所述的甜菊糖为含有甜菊苷的甜叶菊粗提物。
作为优选，步骤(3)中所述的适当浓度的甜菊糖为100g/L的甜菊糖。
作为优选，步骤(4)中所述45℃沸水浴10min后终止反应。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明首次提供一种采用两种β-葡萄糖苷酶(β-葡萄糖苷酶sbgl、β-葡萄糖苷酶spbgl1)共表达全细胞催化生产甜菊醇的新方法，构建了一个含多顺反子的重组大肠杆菌菌株，采用全细胞催化的方法，直接实现甜菊苷到甜菊醇的转化，甜菊苷的转化率为98.95％，甜菊醇的产率为97.98％；
(2)本发明的方法中所涉及的两种酶理化性质明确，且性质相近，能够通过共表达协同作用；全细胞催化的方法，省去纯化酶的繁琐步骤，操作简单，在催化甜菊苷水解生产甜菊醇的过程中具有转化效率高、产率高、产物单一、经济、工业化潜力高等优点。
附图说明
图1为本发明大肠杆菌工程菌pSE-sbgl-spbgl1全细胞催化水解甜菊苷制备甜菊醇的HPLC图；其中，图1-a保留时间为6.298min为莱鲍迪苷A，保留时间为6.781min为甜菊苷，保留时间为8.713min为莱鲍迪苷C，保留时间为13.084min的为甜茶苷，保留时间为15.212min的为莱鲍迪苷B，保留时间为15.548min的为甜菊双糖苷，保留时间为21.398min的为杂质，保留时间为22.778min的甜菊醇。
图a为含有莱鲍迪苷a，甜菊苷，莱鲍迪苷C，甜茶苷，莱鲍迪苷B，甜菊双糖苷和甜菊醇的标准品；图b为工程菌pSE-sbgl-spbgl1全细胞催化甜菊苷水解制备甜菊醇的HPLC图。
具体实施方式
下面结合附图具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例1
从Sphingomonas elodea ATCC 3146中克隆具有水解甜菊苷活性的β-葡萄糖苷酶的SPBGL1(登录号为WP_029622673.1)，根据专利ZL201210387271.8报道，克隆目的基因sbgl(登录号为KC986399)。
一株大肠杆菌工程菌，其构建方法操作步骤如下：
(a)克隆目的基因sbgl，设计上游引物sbgl-F(包含NcoⅠ酶切位点)和下游引物sbgl-R(包含EcoRⅠ)，以pUC19-Ebgl1为模板，PCR扩增目的基因sbgl，用限制性内切酶NcoⅠ和EcoRⅠ目的基因sbgl后，与同样经过NcoⅠ和EcoRⅠ酶切的表达载体pSE380连接，获得重组质粒pSE-sbgl，转化至大肠杆菌JM109中；
sbgl-F：5′-AACACCATGGATATGCAGGAAGCCGGTGCCCCGC-3′
sbgl-R：5′-ATTGAATTCTCAATCCTTCCAGCTACGCGCCGG-3′
(b)克隆目的基因spbgl1，设计上游引物spbgl1-F(包含EcoRⅠ酶切位点和rbs序列)和下游引物spbgl1-R(包含HindⅢ酶切位点)，以Sphingomonas elodea ATCC 3146的总DNA为模板，PCR扩增目的基因spbgl1，用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ目的基因sbgl后，与同样经过EcoRⅠ和HindⅢ酶切的表达载体pSE-sbgl连接，获得重组质粒pSE-sbgl-spbgl1，转化至大肠杆菌JM109中，获得重组共表达大肠杆菌工程菌pSE-sbgl-spbgl1。
spbgl1-F：5′-ATAGAATTCAAGGAGATATACATATGCTGCTCCAGGCGGGTGCGCGG-3′
spbgl1-R：5′-AATAAGCTTGGCCAGTTCGAAGCTGCCGGACAC-3′
实施例2
利用实施例1构建所得共表达大肠杆菌工程菌pSE-sbgl-spbgl1催化甜菊糖生产甜菊醇的方法，操作步骤如下：
(1)20℃、0.5mM的IPTG诱导培养实施例1所得共表达大肠杆菌工程菌pSE-sbgl-spbgl1 22h，发酵结束后，收集菌体，称量菌体湿重；
(2)用0.9％的NaCl溶液清洗0.1g湿重的菌体3次，用Na2HPO4-柠檬酸缓冲液重悬菌体，获得0.02g/ml共表达大肠杆菌工程菌pSE-sbgl-spbgl1全细胞催化液；Na2HPO4-柠檬酸缓冲液中含有0.2M的Na2HPO4和0.1M的柠檬酸，pH值为6.0；
(3)向步骤(2)所得共表达大肠杆菌工程菌pSE-sbgl-spbgl1全细胞催化液中加入50g/L浓度的甜菊糖，反应8h；甜菊糖为含有甜菊苷的甜叶菊粗提物；
(4)45℃沸水浴10min后终止反应，获得产物，即甜菊醇。
实施例3
利用实施例1构建所得共表达大肠杆菌工程菌pSE-sbgl-spbgl1催化甜菊糖生产甜菊醇的方法，操作步骤如下：
(1)20℃、0.5mM的IPTG诱导培养实施例1所得共表达大肠杆菌工程菌pSE-sbgl-spbgl1 22h，发酵结束后，收集菌体，称量菌体湿重；
(2)用0.9％的NaCl溶液清洗0.1g湿重的菌体3次，用Na2HPO4-柠檬酸缓冲液重悬菌体，获得0.02g/mL共表达大肠杆菌工程菌pSE-sbgl-spbgl1全细胞催化液；Na2HPO4-柠檬酸缓冲液中含有0.2M的Na2HPO4和0.1M的柠檬酸，pH值为5.5；
(3)向步骤(2)所得共表达大肠杆菌工程菌pSE-sbgl-spbgl1全细胞催化液中加入100g/L浓度的甜菊糖，反应4h；甜菊糖为含有甜菊苷的甜叶菊粗提物；
(4)45℃沸水浴10min后终止反应，获得产物，即甜菊醇。
实施例4
利用实施例1构建所得共表达大肠杆菌工程菌pSE-sbgl-spbgl1催化甜菊糖生产甜菊醇的方法，操作步骤如下：
(1)20℃、0.5mM的IPTG诱导培养实施例1所得共表达大肠杆菌工程菌pSE-sbgl-spbgl1 22h，发酵结束后，收集菌体，称量菌体湿重；
(2)用0.9％的NaCl溶液清洗1.25g湿重的菌体3次，用Na2HPO4-柠檬酸缓冲液重悬菌体，获得0.25g/mL共表达大肠杆菌工程菌pSE-sbgl-spbgl1全细胞催化液；Na2HPO4-柠檬酸缓冲液中含有0.2M的Na2HPO4和0.1M的柠檬酸，pH值为5.5；
(3)向步骤(2)所得共表达大肠杆菌工程菌pSE-sbgl-spbgl1全细胞催化液中加入100g/L浓度的甜菊糖，反应4h；甜菊糖为含有甜菊苷的甜叶菊粗提物；
(4)45℃沸水浴10min后终止反应，获得产物，即甜菊醇。
检测分析
一、利用实施例1构建所得共表达大肠杆菌工程菌pSE-sbgl-spbgl1催化甜菊糖生产的甜菊醇的HPLC分析条件：
仪器设备：Agilent G1311C 1260 Quat Pump VL四元泵、Agilent G1329B 1260ALS自动进样器、CO-1000 column oven柱温箱、Agilent G1314F 1260 VWD紫外检测器。
色谱柱：C18柱(Alltima，250×4.6mm，5μm)
检测条件：检测波长210nm，柱温40℃，流速1mL/min。
流动相A：10mM NaH2PO4(用H3PO4调节pH至2.6)；流动相B：100％乙腈，梯度洗脱程序如下：
32％B 1-10min
32-80％B 10-20min
80％B 20-21min
80-32％B 21-28min
32％B 28-30min
二、结果：
使用HPLC对上述实施例得到的水解产物进行分析，大肠杆菌工程菌pSE-sbgl-spbgl1通过全细胞催化，将甜菊苷转化为甜茶苷，再由甜茶苷转化为甜菊醇。对实施例2-4中甜菊苷的转化率及甜菊醇的产率进行分析、统计，见表1：
表1.甜菊苷的转化率及甜菊醇的产率分析
实施例 甜菊苷转化率(％) 甜菊醇的产率(％)
2 91.28％ 39.56％
3 92.3％ 66.7％
4 98.95％ 97.98％
由表1可知，本发明所述的实施例2-4中共表达大肠杆菌工程菌pSE-sbgl-spbgl1制备甜菊醇的方法，对甜菊苷的转化率均在91.28％以上，甜菊醇的产率在39.56％以上。
综上，本发明首次提供一株大肠杆菌共表达工程菌，以多顺反子共表达两种β-葡萄糖苷酶协同作用甜菊苷制备甜菊醇，具有效率高、转化率高、产率高，经济、工业化潜力高等优点。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (2)

1.一株大肠杆菌工程菌，其特征在于，以多顺反子形式共表达两个β-葡萄糖苷酶SPBGL1和SBGL。
2.利用权利要求1所述的大肠杆菌工程菌在全细胞催化甜菊糖生产甜菊醇中的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111893109A (zh) * 2020-08-21 2020-11-06 山东大学 一种新型高效的β-葡萄糖苷酶CsBGL及其编码基因与应用
CN113930377A (zh) * 2021-10-14 2022-01-14 广西大学 一株全细胞催化提高莱鲍迪苷a含量的工程菌

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102827891A (zh) * 2012-09-21 2012-12-19 江南大学 用β-葡萄糖苷酶催化水解甜菊苷制备甜菊醇的方法
CN102888416A (zh) * 2012-10-12 2013-01-23 广西大学 编码糖基水解酶家族3的β-葡萄糖苷酶基因及其应用
CN103114099A (zh) * 2013-02-07 2013-05-22 广西大学 编码糖基水解酶家族1的β-葡萄糖苷酶基因及其应用
CN105861573A (zh) * 2016-06-02 2016-08-17 广西大学 一种双酶法制备甜菊醇的方法
WO2017198681A1 (en) * 2016-05-16 2017-11-23 Evolva Sa Production of steviol glycosides in recombinant hosts
CN107548417A (zh) * 2015-04-14 2018-01-05 康纳根有限公司 使用工程化全细胞催化剂生产无热量甜味剂
WO2019006244A1 (en) * 2017-06-30 2019-01-03 Conagen Inc. HYDROLYSIS OF STEVIOL GLYCOSIDES BY BETA-GLUCOSIDASE

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102827891A (zh) * 2012-09-21 2012-12-19 江南大学 用β-葡萄糖苷酶催化水解甜菊苷制备甜菊醇的方法
CN102888416A (zh) * 2012-10-12 2013-01-23 广西大学 编码糖基水解酶家族3的β-葡萄糖苷酶基因及其应用
CN103114099A (zh) * 2013-02-07 2013-05-22 广西大学 编码糖基水解酶家族1的β-葡萄糖苷酶基因及其应用
CN107548417A (zh) * 2015-04-14 2018-01-05 康纳根有限公司 使用工程化全细胞催化剂生产无热量甜味剂
WO2017198681A1 (en) * 2016-05-16 2017-11-23 Evolva Sa Production of steviol glycosides in recombinant hosts
CN105861573A (zh) * 2016-06-02 2016-08-17 广西大学 一种双酶法制备甜菊醇的方法
WO2019006244A1 (en) * 2017-06-30 2019-01-03 Conagen Inc. HYDROLYSIS OF STEVIOL GLYCOSIDES BY BETA-GLUCOSIDASE

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
QING LAN等: "Highly specific sophorose β-glucosidase from Sphingomonas elodea ATCC 31461 for the efficient conversion of stevioside to rubusoside", 《FOOD CHEMISTRY》 *
ZILONG WANG 等: "Selective production of rubusoside from stevioside by using the sophorose activity of β -glucosidase from Streptomyces sp. GXT6", 《APPL MICROBIOL BIOTECHNOL》 *
洪剑辉: "利用纤维二糖的酵母工程菌构建", 《应用与环境生物学报》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111893109A (zh) * 2020-08-21 2020-11-06 山东大学 一种新型高效的β-葡萄糖苷酶CsBGL及其编码基因与应用
CN111893109B (zh) * 2020-08-21 2022-06-07 山东大学 一种新型高效的β-葡萄糖苷酶CsBGL及其编码基因与应用
CN113930377A (zh) * 2021-10-14 2022-01-14 广西大学 一株全细胞催化提高莱鲍迪苷a含量的工程菌
CN113930377B (zh) * 2021-10-14 2023-12-26 广西大学 一株全细胞催化提高莱鲍迪苷a含量的工程菌

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