WO2011108809A2 - 보존성이 향상된 프로테아제 및 그 제조방법 - Google Patents

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WO2011108809A2
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Inventor
박해성
Original Assignee
Park Hae-Sung
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus

Definitions

  • the present invention relates to an improved protease and a method for manufacturing the same, and more particularly, it is possible to reduce the manufacturing cost through the use of inexpensive raw materials and a simple and easy process, and has excellent preservation and decomposition efficiency even at high protein degradation. It relates to a high performance protease and a method of making the same.
  • Proteases or proteases, found in various animals, plants, or microorganisms, are enzymes that break down peptide bonds in proteins, mostly simple proteins of tens of thousands of molecular weight, and sometimes complex proteins with sugars or metal ions. .
  • Proteases are divided into exopeptidase and endopeptidase by two types of degradation.
  • Exopeptidase acts only at the terminal of the peptide chain to liberate amino acids in turn, and leucine aminopeptidase and carboxypeptidase are typical.
  • Endopeptidase acts internally rather than terminally to liberate peptides of various sizes, and there are numerous examples, such as pepsin, trypsin, chymotrypsin.
  • proteases are not only widely used as reagents for diagnosis or treatment, but are also often used in applications such as detergent additives, food processing processes and chemical synthesis using reverse reactions.
  • the existing liquid protease has a low preservation, so there is a problem that the titer disappears almost after 24 hours to 1 week, and the conventional powder protease has a high drying cost and time for powdering although it is a preservative.
  • the degradation efficiency is significantly lowered in the case of high protein decomposition such as blood or fish waste, so there is a limit to apply to various industrial fields.
  • the present inventors have devised a method for producing a high-performance protease having a very high decomposition efficiency even in high protein degradation by reducing the manufacturing cost using a low-cost medium and excellent preservation in a simple process.
  • an object of the present invention is to provide a protease production method that can reduce the manufacturing cost through the use of inexpensive raw materials and a simple and easy process in order to solve the problems of the prior art as described above.
  • the present invention is added by dissolving at least one or more of sugar, molasses and skim milk (skim milk) in water to dissolve and then cooled by sterilization, subtilisin in the cooled solution
  • It provides a method for producing a protease, characterized in that it comprises a stirring step of dissolving and adding any one.
  • At least one or more of sugar, molasses, and skim milk is added to water to dissolve, and then sterilized at 90 to 135 ° C. for 30 to 60 minutes to cool to 30 to 40 ° C.
  • the cooling step may be made by adding 1 to 6 parts by weight of molasses and 0.5 to 4 parts by weight of the skim milk to dissolve and sterilized by cooling to 100 parts by weight of water.
  • the fermentation step is inoculated with 0.5 to 5 parts by weight of subtilisin is preferably fermented for 20 to 40 hours at 25 to 40 °C in aerobic state.
  • the fermentation broth was centrifuged at 6000 to 8000 rpm for 10 to 40 minutes to obtain a filtrate, and the filtrate was filtered with a 0.1-0.4 ⁇ m filtration filter, and the filtrate was vacuumed to 5 to 35% of the initial volume. It can be made by concentration under reduced pressure.
  • any one of ammonium sulfate, ethanol, and methanol was added to the concentrate solution at 50 to 200% (v / v), dissolved at 80 to 120 rpm, and then stirred at 10 to 20 rpm at 3 to 15 ° C. for 30 to 60 minutes. It is desirable to.
  • the protease prepared through the stirring step is recovered and transferred to a precipitation tank, followed by a separation removal step of removing residual ammonium sulfate, ethanol or methanol by centrifugation, and diluting the recovered protease with glycerin.
  • a preservative treatment step of dissolving into a solution may be further included.
  • the present invention provides a protease, characterized in that the production method as described above.
  • the present invention provides a protease, characterized in that it is prepared using a glycerin dilution solution as a preservative.
  • a protease can be prepared by a simpler and easier process than before, and can be manufactured using inexpensive raw materials such as sugar, molasses, or skim milk, thereby significantly reducing manufacturing costs.
  • the protease produced according to the present invention shows excellent preservability since there is almost no change in titer even when stored for 3 months to 12 months at room temperature and 12 months to 3 years at a low temperature of -4 ° C, and an excipient material to increase the storage property. There is no need to mix the light and the like shows very high decomposition efficiency even at high protein degradation such as blood or fish waste.
  • FIG. 1 and 2 are photographs showing the results of measuring the titer (enzyme activity) of the protease according to Test Example 3 of the present invention (FIG. 1 is cultured at 32 ° C. for 2 hours, and FIG. 2 is cultured at 32 ° C. for 4 hours. that).
  • the present invention relates to a method for producing a protease with improved preservation (hereinafter referred to as 'the production method of the present invention') and a protease produced thereby, the method of the present invention comprises at least one of sugar, molasses and skim milk (skim milk) Cooling step of dissolving by adding one or more in water, sterilization and cooling, fermentation step of inoculating the cooled solution with subtilisin and fermentation in aerobic state to obtain fermentation broth, centrifugation of the fermentation broth to obtain a filtrate The filtrate is filtered and concentrated in vacuo to obtain a concentrate, and a concentration step of adding ammonium sulphate, ethanol and methanol to the concentrate is dissolved, characterized in that it comprises a stirring step of stirring.
  • the sugar may be any of white sugar, brown sugar, and brown sugar.
  • sterilization may be made for 30 to 60 minutes at 90 ⁇ 135 °C, preferably 95 ⁇ 125 °C and cooling may be made of 30 ⁇ 40 °C, preferably 30 ⁇ 35 °C.
  • the cooling step is preferably added molasses and skim milk to molasses 1 to 6 parts by weight, more preferably 2 to 5 parts by weight with respect to 100 parts by weight of water, and 0.5 to 4 parts by weight of the skim milk, more preferably 1 to 2 parts by weight may be added to dissolve and then sterilized and cooled.
  • Subtilisin used in the fermentation step of the present invention is an alkaline serin protease produced by various Bacillus species and other microorganisms, and is isolated from Bacillus amyloliquefaciens.
  • the subtilisin is inoculated at 0.5 to 5 parts by weight, in an aerobic state at 25 to 40 ° C, more preferably at 30 to 34 ° C for 20 to 40 hours, more preferably for 24 to 36 hours. It is good to ferment.
  • the fermentation step of the present invention may be preferably made in a strong aerobic state.
  • the fermentation broth is centrifuged at 6000 to 8000 rpm for 10 to 40 minutes, preferably for 15 to 30 minutes to obtain a filtrate, and the filtrate is 0.1 to 0.4 ⁇ m, preferably 0.2 to 0.3 ⁇ m as a filter.
  • the filtered filtrate can be made by vacuum vacuum concentration to 5 to 35%, preferably 10 to 30% of the initial volume.
  • the stirring step of the present invention may be achieved by completely dissolving and adding any one of ammonium sulfate, ethanol and methanol to the vacuum concentrated concentrate.
  • Ammonium sulfate is preferably added at least 50% (v / v), preferably 50-200% (v / v), and 200% (v / v) for ethanol or methanol. ), Preferably it is good to add 50-200% (v / v).
  • the stirring step of the present invention may be preferably made by dissolving the additives such as 80 ⁇ 120rpm and then slowly stirred for 30 to 60 minutes at 3 ⁇ 15 °C, more preferably 4 ⁇ 10 °C at 10 ⁇ 20rpm. .
  • the colloidal protease prepared through the stirring step is transferred to a precipitation tank for recovery, and then the remaining ammonium sulfate, ethanol or methanol is removed by centrifugation. It may further comprise a separation removal step.
  • the protease of the present invention when ammonium sulfate is added in the stirring step, the protease of the present invention is floated and recovered.
  • the protease of the present invention is preferably settled and recovered. .
  • the injury or spontaneous precipitation may be made for 24 hours or more, more preferably 24 to 30 hours.
  • the ammonium sulfate separated and removed through centrifugation may be precipitated as crystals again by evaporation in a concentration tank, and then separated by dehydration.
  • ethanol or methanol removed through centrifugation may be transferred to a vacuum concentration tank, followed by ethanol or It can be recovered by heating to a temperature above the boiling point of methanol, evaporating and condensing with a cooling condenser.
  • ammonium sulfate, ethanol or methanol used in the production method of the present invention can further reduce the manufacturing cost by recovering and reusing.
  • the preparation method of the present invention may further include a preservative treatment step of further improving the preservation by dissolving the protease recovered through the separation and removal step into a glycerin dilution solution.
  • glycerin By using a dilute solution of glycerin as a preservative, it is possible to maintain the titer of the protease without freezing even at low temperatures up to -30 ° C. Even if it falls below -30 ° C, it does not completely freeze and maintains a slush state. do.
  • glycerin has a very low cost and can significantly reduce the manufacturing cost, and since it is a natural substance, it becomes possible to manufacture environmentally friendly fertilizers during the production of amino acid fertilizers using the protease of the present invention.
  • the solution may be dissolved in a glycerin dilution solution and then adjusted to pH with citric acid solution.
  • the glycerin dilution solution is preferably added at 10 to 40% (v / v), pH adjustment using citric acid solution is preferably made of pH4.8 ⁇ 5.3.
  • Protease of the present invention can be prepared by the method of the present invention as described above.
  • protease 50% (v / v) of ammonium sulfate was added to the concentrate and dissolved at 100 rpm, followed by slow stirring at 15 ° C. at 7 ° C. for 45 minutes to prepare a protease.
  • the prepared protease was colloidal and transferred to a corn type sedimentation tank, which was then floated and recovered for 27 hours. The remaining ammonium sulfate was then centrifuged to remove the diluted glycerin solution at 10% (v / v).
  • Protease was prepared by adding and dissolving and adjusting the pH to 5.0 ⁇ 0.1 with citric acid solution.
  • proteases prepared in Examples 1 and 2 were stored at room temperature to measure the change in titer and the results are shown in Table 1 below.
  • Table 1 Item Change in titer according to storage period (room temperature) 10 days 15th 30 days 3 months Example 1 No change No change No change No change Example 2 No change No change No change No change Comparative Example 1 No change Lower potency Lower potency Almost no titer
  • the protease prepared in Examples 1 and 2 of the present invention was found to have no change in titer even after long term storage for 1 to 12 months at a low temperature of -4 ° C.
  • the protease prepared in Example 1 did not change the titer even when stored at a low temperature of ⁇ 4 ° C. for a very long period of up to three years, and thus it was found that the protease was particularly excellent at low temperatures.
  • proteases prepared in Examples 1 and 2 were stored at a low temperature of ⁇ 4 ° C. to measure the change in titer, and the results are shown in Table 2 below.
  • the protease prepared in Examples 1 and 2 of the present invention was found to have no change in titer even after long term storage for 1 to 12 months at a low temperature of -4 ° C.
  • the protease prepared in Example 1 did not change the titer even when stored at a low temperature of ⁇ 4 ° C. for a very long period of up to three years, and thus it was found that the protease was particularly excellent at low temperatures.
  • a sterile paper disk was placed on a flat medium containing skim milk 1% and a protease prepared in Example 1 of the present invention (paper disk number 1 of FIGS. 1 and 2) and prepared in Comparative Example 1 of the present invention.
  • Protease paper disc number 2 of FIGS. 1 and 2), Japanese protease (product name: Niquinase TM , paper disc number 3 of FIGS. 1 and 2), Dutch protease (product name: Pescarase TM , FIG. 1 and 2 of the paper disk number 4) each of the enzyme solution by the mucus 50 ul / disc and the reaction after incubation for 2 hours at 32 °C in Figure 1, the result of incubation for 4 hours is shown in Figure 2 Was measured.
  • the clear zone diameter around the paper disk to which the protease enzyme solution prepared in Example 1 of the present invention was reacted was larger or at least equal to that of the control group, so that the protease of the present invention Compared to the control products it was confirmed that the equivalent or more than the titer.
  • a protease can be prepared by a simpler and easier process than before, and can be manufactured using inexpensive raw materials such as sugar, molasses, or skim milk, thereby significantly reducing manufacturing costs.
  • the protease produced according to the present invention shows excellent preservability since there is almost no change in titer even when stored for 3 months to 12 months at room temperature and 12 months to 3 years at a low temperature of -4 ° C, and an excipient material to increase the storage property. There is no need to mix the light and the like shows very high decomposition efficiency even at high protein degradation such as blood or fish waste.

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Abstract

본 발명은 세균성 프로테아제를 이용한 프로테아제 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 설탕, 당밀 및 스킴밀크(skim milk) 중 적어도 어느 하나 이상을 물에 첨가하여 용해시킨 후 멸균하여 냉각하는 냉각단계, 상기 냉각된 용액에 서브틸리신을 접종한 후 호기성 상태에서 발효시켜 발효액을 얻는 발효단계, 상기 발효액을 원심분리하여 여액을 얻고, 상기 여액을 여과한 후 진공감압농축하여 농축액을 얻는 농축단계 및 상기 농축액에 암모늄설페이트, 에탄올 및 메탄올 중 어느 하나를 첨가하여 용해시킨 후 교반하는 교반단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로테아제 제조방법 및 이에 의하여 제조되는 프로테아제에 관한 것이다. 본 발명의 제조방법에 따라 저렴한 원료의 사용과 간단하고 용이한 공정을 통해 제조비용을 감소시킬 수 있으며, 제조된 프로테아제의 보존성을 현저히 향상시킬 수 있다.

Description

보존성이 향상된 프로테아제 및 그 제조방법
본 발명은 보존성이 향상된 프로테아제 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 저렴한 원료의 사용과 간단하고 용이한 공정을 통해 제조비용을 감소시킬 수 있고 보존성이 매우 뛰어나며 고단백 분해시에도 분해 효율이 매우 높은 고성능 프로테아제 및 그 제조방법에 관한 것이다.
다양한 동물, 식물 또는 미생물에서 발견되는 프로테아제(protease) 즉, 단백질 분해효소는 단백질의 펩타이드 결합을 분해하는 효소로서 대부분 분자량이 수만인 단순단백질인데, 당이나 금속이온을 수반하는 복합단백질인 경우도 있다.
프로테아제는 분해양식에 의하여 엑소펩티다아제(exopeptidase)와 엔도펩티다아제(endopeptidase)로 크게 둘로 나눈다. 엑소펩티다아제는 펩티드사슬의 말단에만 작용하여 아미노산을 차례로 유리시키는 것으로 로이신아미노펩티다아제나 카복시펩티다아제가 대표적이다. 엔도펩티다아제는 말단보다는 오히려 내부에 작용하여 여러 가지 크기의 펩티드를 유리시키며 펩신, 트립신, 키모트립신 등 수많은 예가 있다.
프로테아제의 용도와 관련하여서는 진단 또는 치료를 위한 시약으로 널리 이용될 뿐만 아니라, 세제의 첨가제, 식품가공 과정과 역반응을 이용한 화학적 합성 같은 응용분야에도 종종 이용되고 있다.
그런데 기존의 액상 프로테아제는 보존성이 낮아 24시간 내지 1주일 정도의 시간이 지나면 역가가 거의 없어지는 문제가 있었으며, 기존의 분말 프로테아제는 비록 보존성이 있기는 하나 분말화 하기 위한 건조 비용 및 시간이 많이 들고 부형재료를 혼합하는 것에 의해 특히 혈액 또는 생선 폐기물과 같은 고단백 분해시 분해 효율이 현저히 떨어지는 문제가 있으므로 다양한 산업분야에 적용하기에는 한계가 있었다.
이에 본 발명자는 저렴한 배지를 사용하여 제조비용을 절감하고 간단한 공정으로 보존성이 뛰어나며 특히 고단백 분해시에도 분해 효율이 매우 높은 고성능 프로테아제를 생산할 수 있는 방법을 고안하였다.
따라서 본 발명의 목적은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 저렴한 원료의 사용과 간단하고 용이한 공정을 통해 제조비용을 감소시킬 수 있는 프로테아제 제조방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기와 같은 제조방법을 통하여 제조된 보존성이 현저히 뛰어나고, 고단백에 대해서도 분해 효율이 매우 높은 프로테아제를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 설탕, 당밀 및 스킴밀크(skim milk) 중 적어도 어느 하나 이상을 물에 첨가하여 용해시킨 후 멸균하여 냉각하는 냉각단계, 상기 냉각된 용액에 서브틸리신을 접종한 후 호기성 상태에서 발효시켜 발효액을 얻는 발효단계, 상기 발효액을 원심분리하여 여액을 얻고, 상기 여액을 여과한 후 진공감압농축하여 농축액을 얻는 농축단계 및 상기 농축액에 암모늄설페이트, 에탄올 및 메탄올 중 어느 하나를 첨가하여 용해시킨 후 교반하는 교반단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로테아제 제조방법을 제공한다.
상기 냉각단계는 설탕, 당밀 및 스킴밀크(skim milk) 중 적어도 어느 하나 이상을 물에 첨가하여 용해시킨 후 90~135℃로 30~60분간 멸균하여 30~40℃로 냉각하는 것이 좋다.
또한 상기 냉각단계는 물 100 중량부에 대하여 당밀 1~6 중량부 및 스킴밀크 0.5~4 중량부를 첨가하여 용해시킨 후 멸균하여 냉각하는 것으로 이루어질 수 있다.
상기 발효단계는 서브틸리신을 0.5~5 중량부로 접종한 후 호기성 상태에서 25~40℃로 20~40시간 발효시키는 것이 좋다.
상기 농축단계는 상기 발효액을 6000~8000rpm으로 10~40분간 원심분리하여 여액을 얻고, 상기 여액을 0.1~0.4㎛의 여과필터로 여과한 후 여과된 여액을 최초 부피의 5~35%가 되도록 진공감압농축하여 이루어질 수 있다.
상기 교반단계는 상기 농축액에 암모늄설페이트, 에탄올 및 메탄올 중 어느 하나를 50~200%(v/v)로 첨가하여 80~120rpm으로 용해시킨 후 10~20rpm으로 3~15℃에서 30~60분간 교반하는 것이 바람직하다.
바람직하게는 상기 교반단계 이후에 상기 교반단계를 거쳐 제조된 프로테아제를 침전탱크로 이송하여 회수한 후 잔존하는 암모늄설페이트, 에탄올 또는 메탄올을 원심분리하여 제거하는 분리제거단계 및 상기 회수된 프로테아제를 글리세린 희석용액으로 용해하는 보존제 처리단계를 더 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 상기와 같은 제조방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 프로테아제를 제공한다.
또한 본 발명은 보존제로서 글리세린 희석용액을 사용하여 제조되는 것을 특징으로 하는 프로테아제를 제공한다.
본 발명에 따라 종래보다 더욱 간단하고 용이한 공정에 의하여 프로테아제를 제조할 수 있으며 설탕, 당밀 또는 스킴밀크와 같이 저렴한 원료를 사용하여 제조할 수 있어 제조비용을 현저히 절약할 수 있다.
또한 본 발명에 의해 제조된 프로테아제는 상온에서 3개월 내지 12개월 동안, -4℃의 저온에서는 12개월 내지 3년 동안 보관하여도 역가의 변화가 거의 없어 뛰어난 보존성을 나타내며, 보존성을 높이기 위해 부형재료 등을 혼합할 필요가 없어 혈액 또는 생선 폐기물과 같은 고단백 분해시에도 매우 높은 분해 효율을 나타낸다.
도 1 및 도 2는 본 발명의 시험예 3에 따른 프로테아제의 역가(효소 활성도) 측정 결과를 나타낸 사진이다(도 1은 32℃에서 2시간 배양한 것, 도 2는 32℃에서 4시간 배양한 것).
본 발명은 보존성이 향상된 프로테아제 제조방법(이하 '본 발명의 제조방법'이라 함) 및 이에 의하여 제조된 프로테아제에 관한 것으로서, 본 발명의 제조방법은 설탕, 당밀 및 스킴밀크(skim milk) 중 적어도 어느 하나 이상을 물에 첨가하여 용해시킨 후 멸균하여 냉각하는 냉각단계, 상기 냉각된 용액에 서브틸리신을 접종한 후 호기성 상태에서 발효시켜 발효액을 얻는 발효단계, 상기 발효액을 원심분리하여 여액을 얻고, 상기 여액을 여과한 후 진공감압농축하여 농축액을 얻는 농축단계 및 상기 농축액에 암모늄설페이트, 에탄올 및 메탄올 중 어느 하나를 첨가하여 용해시킨 후 교반하는 교반단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 프로테아제를 제조하기 위한 배지 소스로는 설탕, 당밀 및 스킴밀크(skim milk) 중 적어도 어느 하나 이상이 사용될 수 있으며 상기 설탕은 백설탕, 흑설탕, 황설탕 등 어떠한 것이든 무방하다. 이처럼 저렴한 원료를 사용함으로써 제조비용을 현저히 절감할 수 있다.
본 발명의 냉각단계에 있어서, 멸균은 90~135℃, 바람직하게는 95~125℃에서 30~60분간 이루어질 수 있으며 냉각은 30~40℃, 바람직하게는 30~35℃로 이루어질 수 있다.
또한 상기 냉각단계는 바람직하게는 물 100 중량부에 대하여 당밀과 스킴밀크를 각각 당밀 1~6 중량부, 더욱 바람직하게는 2~5 중량부로 첨가하고 스킴밀크를 0.5~4 중량부, 더욱 바람직하게는 1~2 중량부로 첨가하여 용해시킨 후 멸균하여 냉각하는 것으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 발효단계에서 사용되는 서브틸리신(subtilisin)은 다양한 바실러스(Bacillus) 종 및 기타의 미생물이 생산하는 알칼리성 세린프로테아제(alkali serin protease)로서, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)로부터 분리된 서브틸리신 BPN(subtilisin BPN), 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)로부터 분리된 서브틸리신 칼스버그(subtilisin Carlsberg) 등 어떠한 것이든 무방하다.
바람직하게는 상기 서브틸리신은 0.5~5 중량부로 접종하는 것이 좋으며, 호기성 상태에서 25~40℃로, 더욱 바람직하게는 30~34℃로 20~40시간 동안, 더욱 바람직하게는 24~36시간 동안 발효시키는 것이 좋다.
또한 본 발명의 발효단계는 바람직하게는 강한 호기성 상태에서 이루어질 수 있다.
본 발명의 농축단계는 발효액을 6000~8000rpm으로 10~40분, 바람직하게는 15~30분간 원심분리하여 여액을 얻고, 상기 여액을 0.1~0.4㎛, 바람직하게는 0.2~0.3㎛의 여과필터로 여과한 후 여과된 여액을 최초 부피의 5~35%, 바람직하게는 10~30%가 되도록 진공감압농축하여 이루어질 수 있다.
본 발명의 교반단계는 진공감압농축된 농축액에 암모늄설페이트, 에탄올 및 메탄올 중 어느 하나를 첨가하여 완전용해시킨 후 교반하여 이루어질 수 있다.
암모늄설페이트(Ammonium Sulfate)는 50%(v/v) 이상, 바람직하게는 50~200%(v/v)를 첨가하는 것이 좋고, 에탄올(ethanol) 또는 메탄올(methanol)은 200%(v/v) 이하, 바람직하게는 50~200%(v/v)를 첨가하는 것이 좋다.
또한 본 발명의 교반단계는 바람직하게는 상기와 같은 첨가물을 80~120rpm으로 용해시킨 후 10~20rpm으로 3~15℃, 더욱 바람직하게는 4~10℃에서 30~60분간 완속 교반하여 이루어질 수 있다.
본 발명의 제조방법은 교반단계를 거쳐 제조된 콜로이드 상태의 프로테아제를 침전탱크로 이송하여 회수한 후 잔존하는 암모늄설페이트, 에탄올 또는 메탄올을 원심분리하여 제거하는 분리제거단계를 더 포함할 수 있다.
상세하게는 상기 교반단계에서 암모늄설페이트를 첨가한 경우에는 본 발명의 프로테아제를 부상시켜 회수하게 되며, 상기 교반단계에서 에탄올 또는 메탄올을 첨가한 경우에는 본 발명의 프로테아제를 자연침전시켜 회수하는 것이 바람직하다.
상기 부상 또는 자연침전은 바람직하게는 24시간 이상, 더욱 바람직하게는 24~30시간 동안 이루어질 수 있다.
상기와 같이 원심분리를 통해 분리제거된 암모늄설페이트는 농축조에서 증발농축시키면 다시 결정으로 석출되어 간단히 탈수로 분리할 수 있으며, 마찬가지로 원심분리를 통해 제거된 에탄올 또는 메탄올은 감압 농축조로 이송한 후 에탄올 또는 메탄올의 끓는점 이상의 온도로 가온하여 증발시키고 냉각 컨덴서로 응축시켜 회수할 수 있다.
이와 같이, 본 발명의 제조방법에 사용되는 암모늄설페이트, 에탄올 또는 메탄올은 회수하여 재사용함으로써 제조비용을 더욱 절감할 수 있다.
본 발명의 제조방법은 또한 분리제거단계를 거쳐 회수된 프로테아제를 글리세린 희석용액으로 용해함으로써 보존성을 더욱 향상시키는 보존제 처리단계를 더 포함할 수 있다.
보존제로서 글리세린 희석용액을 사용함으로써 -30℃에 이르는 저온에서도 결빙되지 않고 프로테아제의 역가를 유지할 수 있으며, 설사 -30℃ 이하의 온도로 떨어지더라도 완전히 결빙되지 않고 슬러시 상태를 유지하는 등 뛰어난 보존성을 가지게 된다. 뿐만 아니라 글리세린은 원가가 매우 저렴하여 제조비용을 현저히 절감할 수 있으며, 천연물질이므로 본 발명의 프로테아제를 이용하여 아미노산 비료 등의 제조시에 친환경적인 비료의 제조가 가능해진다.
또한 바람직하게는 상술한 바와 같이 글리세린 희석용액으로 용해한 다음 구연산 용액으로 pH를 조정할 수 있다.
글리세린 희석용액은 바람직하게는 10~40%(v/v)로 첨가할 수 있으며, 구연산 용액을 이용한 pH 조정은 바람직하게는 pH4.8~5.3으로 이루어지는 것이 좋다.
본 발명의 프로테아제는 상기와 같은 본 발명의 제조방법에 의하여 제조될 수 있다.
이하 본 발명을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다. 다만 하기의 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
[실시예1]
당밀 3 중량부 및 스킴밀크 1.5 중량부를 물 100 중량부에 첨가하여 용해시킨 후 110℃에서 45분간 멸균하여 33℃로 냉각하였다. 냉각된 용액에 서브틸리신을 3 중량부로 접종한 후 호기성 상태에서 32℃로 30시간 동안 발효시켜 발효액을 얻었다. 발효액을 7000rpm으로 20분간 원심분리하여 여액을 얻고, 여액을 0.4㎛의 여과필터로 여과한 후 여과된 여액을 최초 부피의 20%가 되도록 진공감압농축하여 농축액을 얻었다. 농축액에 암모늄설페이트 50%(v/v)를 첨가하여 100rpm으로 용해시킨 후 15rpm으로 7℃에서 45분간 완속 교반하여 프로테아제를 제조하였다. 제조된 프로테아제는 콜로이드 상태로서 이를 콘타입(corn type)의 침전탱크로 이송하여 27시간 동안 부상시켜 회수한 후 잔존하는 암모늄설페이트를 원심분리하여 제거한 다음 글리세린 희석용액을 10%(v/v)로 첨가하여 용해하고, 구연산 용액으로 pH를 5.0±0.1로 조정하여 프로테아제를 제조하였다.
[실시예2]
당밀 3 중량부 및 스킴밀크 1.5 중량부를 물 100 중량부에 첨가하여 용해시킨 후 110℃에서 45분간 멸균하여 33℃로 냉각하였다. 냉각된 용액에 서브틸리신을 3 중량부로 접종한 후 호기성 상태에서 32℃로 30시간 동안 발효시켜 발효액을 얻었다. 발효액을 7000rpm으로 20분간 원심분리하여 여액을 얻고, 여액을 0.4㎛의 여과필터로 여과한 후 여과된 여액을 최초 부피의 20%가 되도록 진공감압농축하여 농축액을 얻었다. 농축액에 암모늄설페이트 50%(v/v)를 첨가하여 100rpm으로 용해시킨 후 15rpm으로 7℃에서 45분간 완속 교반하여 프로테아제를 제조하였다.
[비교예 1]
당밀 3 중량부 및 스킴밀크 1.5 중량부를 물 100 중량부에 첨가하여 용해시킨 후 110℃에서 45분간 멸균하여 33℃로 냉각하였다. 냉각된 용액에 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae)를 3 중량부로 접종한 후 호기성 상태에서 32℃로 30시간 동안 발효시켜 발효액을 얻었다. 발효액을 7000rpm으로 20분간 원심분리하여 여액을 얻고, 여액을 0.4㎛의 여과필터로 여과한 후 여과된 여액을 최초 부피의 20%가 되도록 진공감압농축하여 농축액을 얻었다. 농축액에 암모늄설페이트 50%(v/v)를 첨가하여 100rpm으로 용해시킨 후 15rpm으로 7℃에서 45분간 완속 교반하여 프로테아제를 제조하였다.
[시험예 1]
실시예 1 및 실시예 2에서 제조된 프로테아제를 상온에서 보관하여 역가 변화를 측정한 후 그 결과를 하기 표 1에 나타냈다.
표 1
항목 저장기간(상온)에 따른 역가 변화
10일 15일 30일 3개월
실시예 1 변화 없음 변화 없음 변화 없음 변화 없음
실시예 2 변화 없음 변화 없음 변화 없음 변화 없음
비교예 1 변화 없음 역가 저하 역가 저하 역가 거의 없음
<표 2. -4℃ 저온 보관시 프로테아제의 역가 변화>
상기 표 2에서 나타난 바와 같이 본 발명의 실시예 1, 2에서 제조된 프로테아제는 -4℃의 저온에서 1개월 내지 12개월 동안 장기간 보관하여도 역가의 변화가 없음을 알 수 있었다.
더욱이 실시예 1에서 제조된 프로테아제는 -4℃의 저온에서 3년에 이르는 매우 장기간에 걸쳐 보관한 경우에도 역가의 변화가 없어 저온에서 보존성이 특히 뛰어남을 알 수 있었다.
[시험예 2]
상기 실시예 1 및 실시예 2에서 제조된 프로테아제를 -4℃의 저온에서 보관하여 역가 변화를 측정한 후 그 결과를 하기 표 2에 나타냈다.
표 2
항목 저장기간(-4℃)에 따른 역가 변화
1개월 2개월 3개월 12개월
실시예 1 변화 없음 변화 없음 변화 없음 변화 없음
실시예 2 변화 없음 변화 없음 변화 없음 변화 없음
비교예 1 변화 없음 변화 없음 역가 저하 역가 거의 없음
<표 2. -4℃ 저온 보관시 프로테아제의 역가 변화>
상기 표 2에서 나타난 바와 같이 본 발명의 실시예 1, 2에서 제조된 프로테아제는 -4℃의 저온에서 1개월 내지 12개월 동안 장기간 보관하여도 역가의 변화가 없음을 알 수 있었다.
더욱이 실시예 1에서 제조된 프로테아제는 -4℃의 저온에서 3년에 이르는 매우 장기간에 걸쳐 보관한 경우에도 역가의 변화가 없어 저온에서 보존성이 특히 뛰어남을 알 수 있었다.
[시험예 3] - 프로테아제 역가(효소 활성도) 측정
스킴밀크 1%가 포함된 평판 배지에 멸균 페이퍼 디스크(paper disk)를 놓고 본 발명의 실시예 1에서 제조된 프로테아제(도 1 및 도 2의 페이퍼 디스크 번호 1)와 본 발명의 비교예 1에서 제조된 프로테아제(도 1 및 도 2의 페이퍼 디스크 번호 2), 일본의 프로테아제(제품명 : 니퀴나제TM, 도 1 및 도 2의 페이퍼 디스크 번호 3), 네덜란드의 프로테아제(제품명 : 페스카라제TM, 도 1 및 도 2의 페이퍼 디스크 번호 4) 각각의 효소액을 50㎕/디스크로 점액하여 반응시킨 다음 32℃에서 2시간 동안 배양한 결과를 도 1에, 4시간 동안 배양한 결과를 도 2에 나타내어 역가를 측정하였다.
도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 실시예 1에서 제조된 프로테아제 효소액이 반응된 페이퍼 디스크 주위의 저해환(clear zone) 지름이 대조군보다 크거나 적어도 동등하게 나타나, 본 발명의 프로테아제가 대조군 제품들과 비교하여 동등하거나 그 이상의 역가를 가지는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명에 따라 종래보다 더욱 간단하고 용이한 공정에 의하여 프로테아제를 제조할 수 있으며 설탕, 당밀 또는 스킴밀크와 같이 저렴한 원료를 사용하여 제조할 수 있어 제조비용을 현저히 절약할 수 있다.
또한 본 발명에 의해 제조된 프로테아제는 상온에서 3개월 내지 12개월 동안, -4℃의 저온에서는 12개월 내지 3년 동안 보관하여도 역가의 변화가 거의 없어 뛰어난 보존성을 나타내며, 보존성을 높이기 위해 부형재료 등을 혼합할 필요가 없어 혈액 또는 생선 폐기물과 같은 고단백 분해시에도 매우 높은 분해 효율을 나타낸다.

Claims (9)

  1. 설탕, 당밀 및 스킴밀크(skim milk) 중 적어도 어느 하나 이상을 물에 첨가하여 용해시킨 후 멸균하여 냉각하는 냉각단계;
    상기 냉각된 용액에 서브틸리신을 접종한 후 호기성 상태에서 발효시켜 발효액을 얻는 발효단계;
    상기 발효액을 원심분리하여 여액을 얻고, 상기 여액을 여과한 후 진공감압농축하여 농축액을 얻는 농축단계; 및
    상기 농축액에 암모늄설페이트, 에탄올 및 메탄올 중 어느 하나를 첨가하여 용해시킨 후 교반하는 교반단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로테아제 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 냉각단계는,
    설탕, 당밀 및 스킴밀크(skim milk) 중 적어도 어느 하나 이상을 물에 첨가하여 용해시킨 후 90~135℃로 30~60분간 멸균하여 30~40℃로 냉각하는 것을 특징으로 하는 프로테아제 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 냉각단계는,
    물 100 중량부에 대하여 당밀 1~6 중량부 및 스킴밀크 0.5~4 중량부를 첨가하여 용해시킨 후 멸균하여 냉각하는 것을 특징으로 하는 프로테아제 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 발효단계는,
    상기 서브틸리신을 0.5~5 중량부로 접종한 후 호기성 상태에서 25~40℃로 20~40시간 발효시키는 것을 특징으로 하는 프로테아제 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 농축단계는,
    상기 발효액을 6000~8000rpm으로 10~40분간 원심분리하여 여액을 얻고, 상기 여액을 0.1~0.4㎛의 여과필터로 여과한 후 여과된 여액을 최초 부피의 5~35%가 되도록 진공감압농축하는 것을 특징으로 하는 프로테아제 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 교반단계는,
    상기 농축액에 암모늄설페이트, 에탄올 및 메탄올 중 어느 하나를 50~200%(v/v)로 첨가하여 80~120rpm으로 용해시킨 후 10~20rpm으로 3~15℃에서 30~60분간 교반하는 것을 특징으로 하는 프로테아제 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 교반단계 이후에 상기 교반단계를 거쳐 제조된 프로테아제를 침전탱크로 이송하여 회수한 후 잔존하는 암모늄설페이트, 에탄올 또는 메탄올을 원심분리하여 제거하는 분리제거단계; 및
    상기 회수된 프로테아제를 글리세린 희석용액으로 용해하는 보존제 처리단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 프로테아제 제조방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 의한 제조방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 프로테아제.
  9. 보존제로서 글리세린 희석용액을 사용하여 제조되는 것을 특징으로 하는 프로테아제.
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