DE2949065A1 - 7 alpha -methoxycephalosporinderivate und verfahren zu deren herstellung - Google Patents

Description

Patentanwalt eirfiwweg 43,2000 Hamburg 65

Ftmruf: 604165

^•-Methoxycephalosporinderivate und Verfahre, su deren Herstellung

Iamancuchi Pharmaceutical Cc, Md., Tokyo (Japan)

auf neue 7 ' -Methoxycephalosporin-

rivate können als Antibiotika aui_ö
ien Aktivitäten verwendet werden. Weiterhin sind sie als Zwi_ len Aktivitäten _anderer ?.<--Methoxycephalosporm

schenprodukte zur Herstellung anderer / derivate geeignet.

der

4-Oartoxytmtyramidogruppe in der ^-Position un

liiiliii'

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besseren ausgezeichneten antibakteriellen Aktivitäten hat weiterhin ein Bedürfnis bestanden.

Als Ergebnis von verschiedenen Untersuchungen haben die Erfinder gefunden, daß die neuen 7 -Methoxyceplialosporinderivate der allgemeinen Formel I

R₁-(CH₂)₅-comi—

COOH

worin R.. eine Carboxygruppe oder eine '.-Aminocarboxymethylgruppe bedeutet und Rp ein Wasserstof^atom oder eine Sulfogruppe bedeutet, ausgezeichnete antibakterielle Aktivitäten aufweisen, insbesondere antibakterielle Aktivitäten gegen gramnegative Bakterien, wodurch eine Aufgabe dieser Erfindung gelöst worden ist. Die Verbindungen der Formel I besitzen eine charakteristische Eigenschaft in Bezug darauf, daß sie eine SuIfοoxy- oder Hydroxycinnamoyloxymethylgruppe in der 3-Position aufweisen und· als Antibiotika verwendbar sind. Auch sind die Verbindungen der Formel I in völlig unerwarteter Weise stabil im Vergleich mit der zuvor beschriebenen bekannten Verbindung 81OA mit einer K -Methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethylgruppe oder einer et-Methoxy-p-hydroxycinnamoyloxymethylgruppe in der 3-Position. Deshalb kann die Isolierung der Verbindungen der Formel I aus der Fermentationsbrühe und die Reinigung dieser Verbindungen leicht ohne Auftreten einer Herabsetzung in der Ausbeute ausgeführt werden, die durch Zersetzung der Produkte während der Stufen ihrer Isolierung und Reinigung auftreten könnten.

Weiterhin haben die Verbindungen der Formel I den unerwarteten Vorteil, daß die Stabilität der Cinnamoyloxymethylgruppe in der 3-Position während den Arbeitsstufen ihrer Isolierung und Reinigung dennoch nicht die Überführung der genannten Gruppe in eine substituierte Thiomcthylgruppc in der 3-Pcsition durch Umsetzen

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-G-

der Verbindungen mit einer Thiolverbindung behindert. Als Thiol ist z.B. ein heterocyclisches Thiol, wie Methyltetrazol-5-thiol, 5-Methyl-1,3,4-thiadiazol-2-thiol etc, geeignet. Dadurch können verschiedene neue oder bekannte Arten von 7⁰^-Methoxycephalosporinen in großen Mengen hergestellt werden, indem zuerst 7 methoxycephalospoiinderivate der Formel I durch das Verfahren dieser Erfindung, wie noch später beschrieben wird, hergestellt werden, dann wird die Cinnamoyloxymethy!gruppe in der 3-Position in eine substituierte-Thiomethylgruppe überführt und weiter wird eine andere Acylaminogruppe in deren 7ß-Position eingeführt.

Die 7 ⁱ -Methoxycephalosporinderivate mit einer heterocyclischen Thiomethy1gruppe in der 3-Position können durch das in der DE-OS

2 657 599 beschriebene Verfahren erhalten werden, jedoch benötigt die dort beschriebene Methode die Untersuchung unu Modifizierung der Fermentationsbedingungen gemäß den Eigenschaften der Thiolverbindung, die bei der Fermentation benutzt wird. Andererseits können 7«6· -Methoxycephalosporinverbindungen mit verschiedenartig 3-substituierten-Thiomethylgruppen leicht in grossen Mengen aus den 7-^Methoxycephalosporinderivaten der Formel I hergestellt werden, die labiler sind als die in der U.S.-PS

3 314 157 beschriebenen Verbindung durch Überführung der Cinnamoyloxymethylgruppe in der ^-Position in eine gewünschte substituierte Thiomethylgrupp;-,· durch ein chemisches Verfahren.

Es ist bemerkenswert und von speziellem Interesse,daß solche Zwischenprodukte, bei denen Substituenten der Verbindungen der Formel I in der 3-Position und 7ß-Position des Cephalosporinringes sind, leicht in andere verschiedene Substituenten durch übliche Methoden überführt werden können. Als Verbindungen, die durch Einführen in Verbindungen der Formel I hergestellt werden, werden Serien von Cephalosporinderivaten mit einer 1-Methyltetrazol-5-ylthiornethylgruppe in der 3-Position und eine 1,3,4-Thiadiazol-2-ylthioacetamidogruppe, eine Cyanomethylthioacetamidogruppe, eine Trifluormethylthioacetamidogruppe, eine i4-(Carbamoylcarboxymetbylen)-1, 3-dithietan-2-:_/rlj-carboxamidogruppe, eine 4-Carboxy-3-hydroxyisothiazol-5-ylthioacetamidogruppe etc., in der

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I NAOHCEREIOHT

7ß-Position genannt. Der Austausch der Substituenten in der 3-Position und der 7ß-Position kann in jeder gewünschten Reihenfolge durchgeführt werden.

Der Austausch des Substituenten in der 3-Position wird durchgeführt durch Umsetzen der Verbindung der Formel I oder deren Salz oder ihrer 7ß-substituierten Verbindung mit i-Methyltetrazol-5-thiol oder deren Alkalimetallsalz in Wasser oder einem organischen Lösungsmittel^ z.B. Aceton, Dimethylformamid, Acetonitril, Methanol, Äthanol etc. oder ihrer-Mischung bei etwa neutraler Bedingung oder alternativ in einem wasserfreien organischen Lösungsmittelj in Gegenwart von Bortrifluorid oder deren Komplexverbindung. Auch kann der Austausch des Substituenten der 7ß-Position durch Umsetzen der Verbindung der Formel I oder deren 3-substituerten Verbindung zuerst mit einem Halogenierungsmittel, wie z.B. Phosphorpentachlorid,und dann mit einem niederen Alkohol, z.B. Methanol, bei -50° C bis -20° C in Gegenwart einer Base in einer Menge von 2,5 bis 3,5 Molen pro Mol des Halogenierungsmittels erfolgen, um eine entsprechende Iminoätherverbindung zu bilden und dann durch Reaktion des Produktes mit 1,3_f4-Thiadiazol-2-ylthioessigsäure, Cyanomethylthioessigsäure, Trifluormethylthioessigsäure, ^Carboxy^-hydroxyisothiazol^-ylthioessigsäure, 4-(Carbamoyl-carboxymethylen)-1,3-dithietan-2-carbonsäure oder deren reaktivem Derivat ausgeführt werden.

Gemäß dieser Erfindung werden die Verbindungen der Formel I durch

die folgenden Verfahren hergestellt.

(a) Die Verbindung der Formel I, worin R.. eine uL-Aminocarboxjrmethylgruppe (HOOCCH-) ist, (nachfolgend als Verbindung I₁ be-

NH₂ '

zeichnet), wird hergestellt durch Züchten von 7<</-Methoxycephalosporin-Antibiotika herstellenden Stämmen, gehörig zum Genus Streptomyces, in einem Kulturmedium mit oder ohne Zugabe von

Hydroxyzimtsäure /τ-&/®^ ¹^ Abtrennen der her-

(HOOCCH=CH-^J )

gestellten Verbindung I.. aus der Kulturbrühe.

Als in dieser Erfindung benutzter Stamm· ist der Actinomyces,

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Streplomyoes oganonensis Saito und Osono Y-G19Z Stamm zuvor als 3¹ERM-P No. 2725, ATCC No. 31167 isoliert und durch die Erfirder hinterlegt worden. Wenn die Züchtung ohne Zugabe von Hydroxy?imtsäure unter· Verwendung das Stammes durchgeführt v/ird, wird die gt"v;Unsehte Verbindung I., worin Rg eine Sulfogruppe darstellt, erhalten, aber wenn die Züchtung unter Zugabe von Hydroxyzimtpäur-f; aufgeführt wi.rd, wird die Verbindung, die dae Additiv enthält, erhalten. Bei dec· Züchtung unter Zugabe von Hyd.ro xysimtr.äi;rr_; körnen andere Ik, -Methoy^cephalosporin herstellende Stämme vom Genus Streptomyces verwerdet werden. Typische Beispiele für so]ehe Stärnnio ein:: Strrptoniyees gri neu:!, Streptomycin? virjdonhrcjiiogenes, Streptomyces fiinbriatus, Strertoroyce!? halstedii, Streptomyces roche.i., Streptomyoes cinnamoner.-siß, Streptomyces chartreusis und Streptomyces laotaindurano (EE-OS 2 109 S54, BE-PS 764,160 in Bezug auf diese Stämme), Streptomyces lipmanii (TJ S PS 3,719,563), Streptomyces clavuligerus (DE-OS 2 040 141), Streptomyces wadayamensis (DE-OS 2 332 065), Streptomyces jumonjinensis (DE-OS 2 344 020), Streptomyces heteromorphus, Streptomyces panayensis (DE-OS 2 444 110) und Streptomyces chartreusis SF-1623 (DE-OS 2 455 992 und U S -PS 3,974,035). NRRL 3534

Jedoch sind die in dieser Erfindung verwendeten Stämme nicht auf die vorstehend beschriebenen Stämme beschränkt und alle Stämme, die zum Genus Streptomyces gehören und 7^f3^-Methoxycephalosporin-Antibiotika herstellen, können bei dieser Erfindung benutzt werden*

Die Züchtung wird nach den herkömmlichen Züchtungsverfahren für Mikroorganismen ausgeführt, aber submerse Züchtung in einem flüssigen Kulturmedium wird gewöhnlich vorzugsweise angewendet. Jedes Kulturmedium, welches Nährstoffe für 7«*-Methoxycephalosporin-Antibiotika herstellende Stämme, gehörend zum Genus Streptomyces, enthält, kann verwendet werden. Synthetische Kulturmedien, semi-synthetische Kulturmedien oder natürliche Kulturmedien werden verwendet. Als Komponente für das Kulturmedium sind Glukose, Sucrose, Mannitol, Glycerin, Dextrin, Stärke, vegetabiles öl etc, als Kohlenstoffquelle geeignet. Fleischextrakt, Pepton, Glutenmehl, Baumwollsaatmehl, Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Fischmehl, Korneinweichflüssigkeit, Trockenhefe, Hefeextrakt,

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Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Harnstoff und andere organische oder anorganische Stickstoffquellen sind als Stickstoffquellen geeignet. Auch, falls erforderlich, v/erden Metallsalze, z.B. Sulfate, Nitrate, Chloride, Carbonate, Phosphate etc. von Na, K, Mg, Ca, Zn, Fe e^J;c. zu dem Kulturmedium zugegeben, weiterhin kann, falls erforderlich, ein Material zur Begünstigung der Produktion von Antibiotika und Entschäumungsmittel, z.B. . Methionin, Cystein, Cystin, Methyloleat, Schmalzöl, Silikonöl, ein oberflächenaktives Mittel etc., in geeigneter Weise verwendet werden.

Unter Bezug auf die Züchtungsbedingungen ist es allgemein wünschenswert, unter aeroben Bedingungen zu züchten. Die Züchtungstemperatur liegt vorzugsweise bei etwa 18° C bis etwa 35° C, bevorzugter bei etwa 30° C, und gute Resultate werden erhalten, wenn das pH des Kulturmediums bei etwa 5 bis 10, vorzugsweise etwa 6 bis 8 gehalten wird. Die Züchtungsperiode der Zeit hängt von der Zusammensetzung des Kulturmediums und der Kultivierungstemperatur ab, aber sie beträgt im allgemeinen etwa 3 bis 10 Tage.

Zur selektiven Erhöhung der Produktionsmenge an der Verbindung

ist es wirksam, z.B. 4-Hydroxyzdmtsäure y—_Λ

(HOOCCH=CH-^V-OH,

die auch p-Cumarinsäure genannt wird), zu dem Kulturmedium zuzugeben. Das Additiv wird zu dem Kulturmedium als solches oder als dessen Salz in einer Menge von 0,1-5 mg/ml, vorzugsweise 0,5-2 mg/ml, als Einzelgabe vor der Kultivierung oder zu verschiedenen Zeiten bei Beginn der Kultivierung hinzugegeben.

Zur Isolierung des gewünschten Produktes dieser Erfindung aus der Kulturbrühe werden die üblichen Verfahren zur Isolierung von Antibiotika aus Ku?turbrühen der verwendeten Mikroorganismen angewendet. Verbindung I.. dieser Erfindung ist hauptsächlich in der Kulturbrühe enthalten. Nach Entfernen des Mycels aus der Kulturbrühe durch zentrifugale Abtrennung oder Filtration wird die gewünschte Verbindung aus dem Filtrat extrahiert. Das gewünschte Produkt wird abgetrennt, gesammelt und nach den für das

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Isolieren und Gewinnen von Antibiotika üblichen Verfahren gereinigt, w.ie z.B. durch Ausnützen der Differenzen in der Auflösung oder Löslichkeit in geeigneten Lösungsmitteln, Differenzen in den Abscheidungseigenschaften oder Abscheidegeschwindigkeiten aus Lösungen, Differenzen in adsorptiven Affininäten gegenüber verschiedenen Adsorbentien oder- Differenzen in der Verteilung zwischen zwei-flüssigen Phasen. Diese Methoden können, falls erforderlich, einzeln oder in geeigneter Kombination verwendet werden oder sie können wiederholt angewendet werden.

Die so isolierte Verbindung I^ ist ausschließlich eine Verbindung mit einer Sulfooxycinnamoylgruppe

(-OCGH=CH—vv ν

in der Seitenkette der 3-Position des Cephalosporinringes. Um die entsprechende Verbindung I.. mit einer Hydroxygruppe von dieser Verbindung zu erhalten, kann der Schwefelsäureester durch Behandeln der Verbindung mit Wasser enthaltendem Aceton (Wassergehalt von 1-10%) mit oder ohne Zugabe einer Säure in bekannter Weise hydrolysiert werden.

(b) Die Verbindung der Formel I₁, worin R^ eine Carboxygruppe (HOOC-Gruppe), (nachfolgend als Verbindung I₉ bezeichnet), darstellt, wird durch Einwirkung des Mycels des D-Aminosäure oxidierenden Enzym herstellenden Stammes, der zu dem Genus Trigonopsis oder dessen behandeltem Mycel gehört, auf die Verbindung Ja unter aeroben Bedingungen erhalten, wobei eine oxidative Deaminationsreaktion abläuft, um die Verbindung I₂ zu bilden.

Die zum Genus Trigonopsis gehörenden Stämme, die bei dieser Reaktion benutzt werden, können selektiv von den Typkulturen verwendet werden, die in Stämme-Hinterlegungsstellen aufbewahrt werden oder sie können aus der natürlichen Umwelt gewonnen werden. Ebenso können zur Erhöhung der Produktionsaktivität der Verbindung Ip Mutanten der vorstehend beschriebenen Stämme nach bekannten Verfahren erhalten werden und vorteilhaft verwendet werden. Als Mikroorganismus mit der vorstehend genannten D-Aminosäure oxidierenden Enzymaktivität wird zur Verdeutlichung Trigonopsis variabilis genannt. Dieser Stamm ist vom Institut für

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Fermentation, Osaka, Japan als Stamn-Nr. IFO-0755 oder IFO-0671 erhältlich.

Zur Herstellung der Verbindung Ip unter Verwendung des Mikroorganismus mit solcher Α-Aminosäure oxidierenden Enzymaktivität wird es gewöhnlich bevorzugt, zuerst diese Mikroorganismen zu züchten und dann das erhaltene Mycel oder dessen behandeltes Mycel auf die Verbindung I.. unter geeigneten Bedingungen einwirken zu lasoen. Als Züchtungs- oder Kulturverfahren zur Herstellung des Mycels wird die aerobe Kultivierung bevorzugt. Eine Kulturflüssigkeit mit Rühren unter Belüftung gehört zur bevorzugteren Ausführungsform. Bekannte Kulturmedien v/erden bei Verfahren für den verwendeten Mikroorganismus in diesem Verfahren eingesetzt.

Genauer angegeben können synthetische Kulturmedien, halbsynthetische Kulturmedien oder natürliche Kulturmedien verwendet werden. Als Komponente für das Kulturmedium können Glukose, Sucrose, Mannitol, Glycerin, Dextrin, Stärke, vegetabiles Öl etc. als Kohlenstoffquelle verwendet werden. Fleischextrakt, Pepton, GIutenmehl, Baumwollsaatcl, Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Fischmehl, Korneinweichflüssigkeit, Trockgnhefe, Hefeextrakt, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Harnstoff und andere organische oder anorganische Stickstoffquellen werden als Stickstoffquelle verwendet. Falls erforderlich, kann ein Metallsalz, wie ein Sulfat, Nitrat, Chlorid, Carbonat, Phosphat etc. von Na, K, Mg, Ca, Zn, Fe etc. zu dem Kulturmedium zugefügt werden. Weiterhin kann, falls erforderlich, ein Promotor zur Herstellung von Antibiotika und ein Entschäumungsmittel, wie z.B. Methionin, Cystein, Cystin, Methyloleat, Schmalzöl, Silikonöl, ein oberflächenaktives Mittel etc. in geeigneter Weise verwendet werden.

Gewünschte Resultate werden erhalten, wenn das pH des Kulturmediums bei etwa 3-10, vorzugsweise 4-6 gehalten wird. Insbesondere, wenn das Kulturmedium D-(oder DL-) Aminosäure, wie z.B. D-(oder JjJj-) Methionin, D- (oder DL-) Alanin, D- (oder DL-) Valin etc., enthält, wird eine ausgezeichnete L-Aminosäure oxidierende Enzyrr;-aktivität erhalten. Die Kultivierungstemperatur beträgt gewöhn-

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lieh 18-37° C, vorzugsweise etwa 30° C. Die Kultivierungsperiode an Zeit hängt von den Kultivierungsbedingungen ab, insbesondere der Kultivierungsapparatur, der Zusammensetzung des Kulturmediums, der Kultivierungstemperatur etc. Es wird bevorzugt, die Kultivierung zu beenden, wenn die D-Aminosäure oxidierende Enzymaktivität das Maximum besitzt, und gewöhnlich ist die Kultivierung in ?-iO Tagen richtig ausgeführt.

Das so erhaltene Myeel oder dessen behandeltes Mycel wird für die D-Aminosäure oxidierende Reaktion der Verbindung I.. verwendet. In diesem Falle bedeutet das behandelte Mycel (i) das Mycel, welches in eine nützliche Form durch eine geeignete Behandlung überführt wurde, um die Verbindung Ip durch Erhöhung der D-Aminosäure oxidierenden Enzymaktivität des Mycels herzustellen, (ii) D-Aminosäure oxidierendes Enzym oder (iii) das Mycel, welches mit einer Fixationsstufe behandelt wurde, um den Abfluß des Enzyms zu vermeiden, z.B. das D-Aminosäure oxidierende Enzym, welches in dieser Erfindung verwendet wird, ist im Mycel anwesend. Das behandelte Mycel bedeutet a) das aktivierte Mycel, erhalten durch die Aktivierungsbehandlung des Mycels, b) den zellfreien Extrakt, erhalten durch.Sammeln der D-Aminosäure oxidierenden Enzym herstellenden Stämme aus einem Kulturmedium, Waschen derselben und Anwendung physikalischer oder chemischer Mittel auf die Stämme, c) das partiell gereinigte oder vollständig gereinigte lösliche D-Aminosäure oxidierende Enzym, erhalten durch ein bekanntes Enzymabtrennungs- und Reinigungsverfahren auf den zellfreien Extrakt oder d) solche, erhalten durch Kombinieren des löslichen Enzyms an ein wasserunlösliches Polymeres oder einen anorganischen Träger mittels physikalischer oder chemischer Mittel.

In dieser Erfindung besitzt das vorstehend beschriebene lösliche Enzym Schwierigkeiten bei der Herstellung und bei dessen Wiedervereinigung, und es ist dadurch beschränkt für den praktischen Gebrauch, während das aktivierte Mycel wirtschaftlich abgetrennt und wiederverwendet v/erden kann, da der Verlust an Enzym durch Abfluß gering ist.

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Die Aktiviervngsbehandlung des Fyeelp kann durch Erteilen -im gwissen nildeu Beschädigung des Mycels in solchem Ausmaß erfolgen, daß das V^eel keinen Kollaps erleidet. Beispiele für eine

■behandlung sind ein Verfahren, bei dem das Myeel bei ■ v:jt.'-r -10' C UTid bei sauren: pH, z.B. pll von etwa 3-4 eingefroren .."'.n oo.vjT! aufgetaut wird, wobei, das Mjeel in wässeriger T;ö;3ur,g p'.-V ι¹-!,].;, v/iri, die ein oder mehrere organische Lösungsmittel, wie Acc-tor., n-Euta.nol, 2-Fhenyläthanol, Diäthyläther, Cyclone· ^va·';, V,en;.ol, Toluol etc ., er: thalt. Ein Verfahren, bei dem das Mv eel mit 0,1—109-» oberflächenaktivem Mittel behandelt wird, ist z.B. ein kationisches oberflächenaktives Mittel wie Cetyltrimethylar/'n'oniujLhalogenid , OetyIpyridiniumhalogenid, CetyldimethylberzylammoniumhalogeMid etc., ein anionisches oberflächenaktives Mittel wie Lodecylsulf a ί, ein Alkalimetallalkylarylsnlf onat, Natriuradeoxycholat etc., urd ein nichtionisches oberfiächenakti.ves Mittel wie Sorbitanmcnolaurat, Triton X-IOC etc., wobei in einer wässerigen Lösung gearbeitet wird. Bei einem v/eiteren Verfahren wird das Mycel mit verdünnter wässeriger Kaliumhydroxid- oder Natriumhydroxid-Lösung behandelt. Bei einem anderen Verfahren wird das Mycel in einer unter hohem osmotischen Druck stehenden Lösung suspendiert, z.B. in einer 2 M Rohrzuckerlösung, und dann die Suspension schnell mit Wasser verdünnt. Liese Aktivierungsbehandlungen, werden durch verschiedene Faktoren beeinflußt v/ie Temperatur, Be^andlungspericde der Zeit, pH, Reagenzkonzentration etc., so daß es erforderlich ist, das Optimum der Aktivierungsbedingungen auszuwählen. Das so erhaltene aktivierte Mycel kann weiterhin einer Fixierbehandlung unterworfen werden, um den Abfluß des Enzyms aus dem Mycel herabzusetzen. Diese Behandlung v/ird gewöhnlich durch Kontaktieren des aktivierten Mycelr. mit 0,01-0,5% Glutaraldehyd ausgeführt.

Auch wenn die Wirkung von Katalase, die gewöhnlich in einem Mycel anv/esend ist, nicht inhibiert wird, wird die oxidative Decarboxylierung zur Verbindung Ip unvollständig, um zusammen die 7ß-(5-Carboxy-5-oxovaleramido)-7'-'C'-methoxycephalosporinderivate der allgemeinen Formel II zu bilden,

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ORIGINAL INSPECTED

HOOC-CO-(CH₂),CONPi

COOH

worin Rp ein V/asser:-: toff atom oder eine S ulfo gruppe bedeutet. Um sicher stiele civ die Verbindung Ip zu erhalten, i^t es wünschenswert, die F.atalaseaktivit.ät zu inhibieren. Beispiele für geeignete Katalaseinhibitoren sind Ascorbinsäure, 3-Axino-1,2,4-triazol, Alkalimetallazid etc., insbesondere Natriur.azid wird bevorzugt. Der Inhibitor kann zu darn Reaktionsgenir-ch während der Umwandlung der Verbindung I₁ zur Verbindung I~ "hinzugefügt werden. Es kann auch das Mycel davor vorbehandelt v.erden. Die Menge an Natriumazid, die für diesen Zweck verwendet v.'ird, beträgt etwa 1-100 mM. Weiterhin kann die Katalase in eiern vorstehend genannten Mycel inaktiviert werden durch Hitzebehandlung des Mycels vor der Verwendung für die genannte Umwandlungsstufe. Für eine solche Hitzebehandlung wird das vorstehend genannte Mycel für mindestens 3 Stunden bei 40-60° C, Vorzugs*.·.-= iε-e bei etwa 50° Cj gehalten, wodurch die Katalaseaktivität bemerkenswert herabgesetzt wird, jedoch die D-Aminosäure oxidierende Enzymaktivität darin verbleibt. Die Hit'zebehandlung des Xycels kann einfach in wässeriger oder Puffer-Suspension durchgeführt werden. Es ist besonders zufriedenstellend, das Mycel gleichzeitig der vorstehend erläuterten Hitzebehandlung und einer Aktivierungs-Reagenzbehandlung zu unterwerfen z.B. durch Anwenden der Aktivierungsbehandlung auf das Mycel für 4 Stunden bei 50° C unter Verwendiing eines Lösungemittels wie Toluol. Die Inhibition der Katalaseaktivität und die Aktivierung des Mycels kann gleichzeitig bewirkt werden.

Die Reaktion des En^ymsystems des vorstehend beschriebenen aktivierten Mycels mit Verbindung I₁ wird gewöhnlich bei einem pH von 6-8 ausgeführt. Es ist wünschenswert, die Reaktion bei Reaktionstemperaturen bei 30-40° C auszuführen. Die Rea>tionsperiode an Zeit hängt hauptsächlich von der Potenz des Ei-zyr-s ab, wobei gewöhnlich 1-5 Stunden erforderlich sind. Da die -.-erstehende Enzymreaktion unter aeroben Bedingungen ausgeführt v.'ird, wird es be-

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ORIGINAL INSPECTED

vorzugt, die Reaktion unter Belüftung mit. Luft oder Sauerstoff auszuführen. V/onn eine klei.ne Menge Wasserstoffperoxid zu örüi Reaktionssysteia hinzugefügt wird, wird Ve rl) in dung Ip in guter Ausbeute in einer "kurzen Zeitperiode erhalten und ein Nebenprodukt der Formel IJ tritt rioceJ. nicht auf.

Die gebildete verb ί^αα -.r: Tp kann leicht durch eine Lösungsmittelextraktion oder Adsorption an Ionenaustauscherharz abgetrennt werden- So kann "Verbindung L aus einem Reaktionsgemisch bei einem pH von z.B. 2,5 oder niedriger unter Verwendung eines geeigneten organischen Lösungsiui ttels, wie Äthylacetat, n-But&nol etc., extrahiert werden. Auch v/erden durch Kombination einer Abtrennung durch Ionenaustauscherharz und einer Lösungsmittelextraktion gute Ergebnisse erhalten. Bevorzugtes Ionenaustauscherharz ist flüssiges Aminanionaustauscherharz und bevorzugte Lösungsmittel sind Äthylacdtat, Butylacetat, n-Butanol etc. Weiterhin kann die Verbindung unter Verwendung eines festen Ionenaustauscherharzes abgetrennt v/erden. Ein geeignetes Lösungsmittel für diesen Zweck kann leicht durch eine Voruntersuchung ermittelt werden.

Uf. die reine Verbindung zu erhalten, wird das Produkt gereinigt. Eo kann hierbei mit einem Verfahren g-ereinigt werden, das gewöhnlich für die Reinigung von Antibiotika verwendet wird.

Verbindung Ip kann nicht nur als freie Säure, sondern auch als ihr Alkalimetallsalz, Frdalkaliiretallsalz, organisches Aminsalz etc. abgetrennt werden.

Wenn die Seitenkette der 3-Position des Cephelosporinringes der Verbindung Ip, die so erhalten wurde, eine mit Schwefelsäure veresterte Cinnamoylgruppe ist, kann die Verbindung in die entsprechende Verbindung mit einer Hydroxygruppe überführt v/erden durch Behandeln der Verbindung mit einem organischen Lösungsmittel, mit oder ohne einen Zusatz an Säure, um deren Esterteil zu hydrolysieren .

Die Herstellungsverfahren der Verbindungen der Formel I dieser Erfindur.g wurden vorstehend erläutert. Nachstehend v/erden die yhysiko-chemisehen Ei gen-cheften und die antibakterielle Aktivität

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ORIGINAL INSPECTED

der neuen 7oG'-Methoxyceplialosporinverbindu:igen, die durch das Verfahren erhalten wurden, beschrieben.

(A) 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyva.leramido)-7«S^ -methoxy-3-(p-sulfo-

-7,

oxycinnamoyloxymethyl)- /i^-oephem-4-carbonsäure (Verbindung A);

r r 3- x- r ?^CH3 _o

HOOC-CIIOIUCH-GiU GCNH ^°

ⁿⁱⁱp ^; J Jf 1 ⁰^ ^ß

CH₀OOCCH-CH COOH

wobei die Ziffern in den Seitenketten zur Erläuterung eingetragen sind.

Die physiko-chemischen Eigenschaften des Natriurosalzes der Verbindung (A) sind die folgenden:

(1) Weißes Pulver.

(2) Besitzt keinen definierten Schmelzpunkt und es wird braun bei 138-140° C.

(3) Leicht löslich in Wasser, jedoch schwer löslich in Methanol, Äthanol, Ä'thylacetat, Butylacetat, Butanol und anderen organischen Lösungsmitteln.

(4) Amphoteres Material mit positiver Ninhydrinreaktion.

(5) Ergibt das in Fig. 1 gezeigte Ultraviolettabsorptionsspektrum bei der Messung in einer 1/100 M Phosphorsäurepufferlösung bei pH 6,5, wobei das Absorptionsmaximum bei 282 nm liegt.

(6) Ergibt das in Pig. 2 gezeigte Infrarotabsorptionsspektrum bei der Messung als Kaliumbromid-Tablette mit Absorptionen bei 3050, 1760, 1500, 1215, 1165, 1050, 870 und 845 cm"¹.

(7) Ergibt das in Fig. 3 gezeigte kernmagnetische Resonanzspektrum bei der Messung unter Verwendung von Natrium-3-trimethylsilylpropionat, (nachstehend als TSP bezeichnet), als inneren Standard in schwerem Wasser. Es wurden folgende Signale erhalten:

C-Wert (ppm):

1,90 (4H, Multiplett), 2,49 (2H, Multiplett), 3,34-3,67 (2H, Quartett, J = 18 Hz), 3,53 (3H, Singlett), 3,76 (1H, Multiplett, J = 5,0 Hz),

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,OC (2H, Quartett, J = 13 Ils) , 5,16 (111, Singlett), 6,4 5 (IiI, Poublett, J = 16 Uz), 7,32 (?H, Doublett, J - »,5 iiv:), 7,61 (2I-I, Doublett, J = 8,5 Ha), . 7,66 (1 ■. Doublett, J = 16 Hk )·

(8) Pie Ti¹·:.· " ■'τ ι·-!·;, no.! y ;.·ο noch de:,; trocknen im VaKUum für \ S ούτι ei ι. Ui 50^ C für C _9/ Ii₉ -N_r O ^ S₀ Na. 2 Hp O :

■ C Ii N S

Bureci.i: I: 4'1,co/ 4 »36;.? 6,11% 9,31% OefuijOcii: 42,06/, 4,41/ 6,08/ 9,51%"

(9) Wenn Ver-ij >.-ourg (A) 16 Stunden bei 100° C mit 6n-Cblorwassers^:/oxf säure hydrolysiert v/urde und sie darn mit einem Hitachi 835 'L¹V]) Hoc'.igcschwindigkei tsaminosäure-Ana-lysenapparat analysiert wurde, wurde die Anwesenheit von ,Vv-Aminoadipinsäure bestätigt.

(10) Wenn Verbindung(A) mit Dowex 5OW (H⁺TyP, Handelsname) in Methanol hydi/olysi er t und lniLtels Hochgeschwindigkeitsflüasigkeitschromatographie(uiiter Verwendung einer 6000A Pumps, Hersteller-.Waters Co., UT Detector ?80 nm, UVIDECK 100 II, Hersteller: Nippon Bunko K.K., Lichrosolve Rp 18 (Handelsname, Hersteller: Merck & Co., Inc.) einer Säule aus rostfreiem Stahl 4 mm χ 150 nun, Lösungsmittel: Mischung aus Methanol, Essigsäure und Wasser (20 : 0,1 : 80 im Volumenverhältnis)) untersucht wurde, wurde die Anwesenheit von Cumarinsäure _t —» bestätigt.

(HOOC-CH=CH (fj% OH)

Wenn das hydrolysierte Produkt silyliert v/urde nach Einengung unter vermindertem Druck mittels ESA N,N-Bis(trimethylsilyl)-acetamid und einer gasmassenspektrographisohen Analyse unterworfen wurde, v/urde die Anwesenheit des Fragments von Trimethylsilyl-p-trimethylsilyloxycinnamat

(CH-)^Si-COC-C}I=CH \y—0-Si(CEz),- mit 308 m/e bestätigt.

Aus den vorstehenden Ergebnissen wurde die Struktur der Verbindung (A) bestimmt. Die Anwesenheit des 7·/-Methoxycephalosporin» gerüstes ergibt sich aus dem Wert 1760 cm" (cyclisches Lac.tav.i) in den Inirarotabsorpiionospektra und den Werten 3,53 ρρΰ) (3ΙΙ, Singlett, 7-0GIl₇), 5,16 ppm (HI, Singlett, 6-CH), 3,34-3,67 ρ pn

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ORlGiNAL INSPECTED

(211, Quartett, J^1S Hz, 2-CH₂), und 5,00 ppm (2H, Quartett, J =-- 13 Hz, 3-ClI₂) im kernrüagnetischen Reaorian^speiitrum; die Existenz eines -./.-Aminoadipinsäurerestes in der 7-Position ergibt sich aus den Ergebnissen der /a'iinosäureatialyse und weiter aus den Werten der Signale lei ^Λ ,VO ppm (4H, Multiplett, 3", 4"-CH₉), 2,49 rpm (2H, KuI tipin ί:'- , Ρ'¹—ClJ-.) ,u-id 3,76 ppm (1Η, Multiple tt, 5"-CH) im kerrunagm-vfci schön ilesortanzspcktrum;die Existenz des p-Sulf ooxy^iiütsäurerestes in der 3-Position ergibt sich aus (i) den Werten 7,32 ppm (2K, Doufcleti;, J=8,5 Hz, 3',5'-CH), 7,61 ppm (2H, DuUbIeVt₁J= 8,5 Hz, 2',6'-2H), 6,43 ppm (111, Doublott, J=16 Hz,,-"<·-CH) und 7,66 ppm (1H, Double tt, J- 16 Ha, ß-CH)im kernmagnetischen Resonanzspelrtrum, (ii) der Wert des Fragmentes mit 308 n/e ergibt sich aus der. Massenspektrum des s.ilylierten Produktes der Verbindung (A),hydrolysiert mit Dowex 50W (H⁺TyP, Handelsname) in Methanol, (iii) die Existenz von swei S Atomen ergibt sich aus dem Resultat der Elementaranalyse und (iv) den Absorptionen bei 870 cm (Spannungsvibration von S-O), 1050 cm (Spannungsvibration von S=O) und etwa 1215 cm (Spannungsvibration von SO₂) in den Infrarotabsorptionsspektren .

(3) 7ß-(4-Carboxybutyram.i do)-7<\ -methoxy-3-(p-sulfooxycinnarriOyloxymethyl)-^ -cephem-4-carbonsäure (Verbindung B):

OCH,

tv" 3" Z- ''' j * R HOOGCH₂CH₂Ch₂COMH ^

Elementar analyse der Verbindung (B) für C2^H₂'2N2S20^Na.22 H₂O:

CHNS

Berechnet: 41,38% 4,23% 4,20% 9,60% Gefunden: 41,34% 4,10°% 4,09% 9,46%

Die physiko-ohemisehen Eigenschaften des Natriumsalzes der Verbindung (B) sind die folgenden:

(1) Weißes Pulver.

(?) Besitzt keiner, definierten Schmelzpunkt und es wird braun

bei 150-160° C.
(3) Leicht löslich in Wasser, jedoch schwer löslich in MethanoJ,

030045/0570

* ORIGINAL INSPECTEb

Äthanol, A'tlrylacetat, Butylacetat, n-Butanol und anderen organischen Lösungsmitteln.

(4) Saures Material mit negativer NinhydrJnreaktion.

(5) Ergibt das in Fig. 4 dargestellte Ultraviolettabsorptioiuspektrum mit dem Abaorptionsmaxiiinuin bei 282 mn bei der Messung in 1/100 H Pho sphor säur e-Pufi'erlö sung von pH 6,5. ;

(6) Ergibt dan in Fig. 5 dargestellte Infrarotabsorptions-

ruBJ bei der Messung als Kaliumbromidtablette und

zeigt Absorptionen bei 3450, 1760, 1600 1405, 1220, 1050, 868 und 845 cm"¹.

(7) Ergibt das in Fig. 6 wiedergegebene kernmagnetische Resonanz spektriim bei der Messung in schwerern Wasser unter Verwendung von TSP als inneren Standard und zeigt die folgenden Signale:

<f-V/ert (ppm):

1,95 (2H, Multiplett), 2,44 (4H, Multiplett), 3,36-3,73 (2H, Quartett, J - 18 Hz), 3,55 (3H, Singlett), 4,93 (2H, Doublett, J = 13 Hz), 5,19 (1H, Singlett), 6,54 (1H, Doublett, J = 16 Hz), 7,35 (2K, Doublett, «T = 8,5 Hz), 7,71 (2H₁ Loublett, J ^ s,5 Hz) und'7,75 (1H, Doublett, J = 16 Hz). ^

(8) Wenn Verbindung (B) in 6n Chlorwasserstoffsäure 2,5 Stunden bei 100 C hydrolysiert, mit Äthyläth^r extrahiert, zur Trockne eingedampft, mit BSA silysiert und dann mittels Massenspektrograph analysiert wurfre, wurde bestätigt, daß das Fragment des Bis(trimethylsilyl)glutarats mit 276 m/e anwesend war und die Verbindung Glutarsäure enthielt.

(9) Wenn Verbindung (B) mittels Dowex 5OW (H⁺Typ, Handelsname) in Methanol hydrolysiert wurde, wurde die Existenz von p-Cumarinsäure wie im Falle der Verbindung (A) bestätigt.

Aus den vorstehenden Ergebnissen wurde die Struktur der Verbindung (B) bestimmt. Die Existenz des 7-C-Methox.ycephalosporingerüstes ergibt sich aus dem Wert 1760 cm" (cyclischen Lactam)

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in dem Infrarotabsorpti orisspektrum und die Werts 3,55 ppm (3H, Singlett, 7-OCH,,), b, 19 ppm (111, Singleti, 6-CiI)₁ 3,36-3,73 ppm (PIT, Quart at t, J - 18 Hz, 2-CH_?) und 4,93 ppm (?H, Quartett, J = 13 Hz, 3-CKo) if; don: kernmagnetischen Resorianzspe}-:trum; die Existenz de>' 4-Cs.rhtjxybutyramidogruppe in der 7-rositicn ergibt sich aus den l/orten 1,95 ppm (2H, Hultiplett, 3"-CHo) und 2,44 ppm (4H, I-Iult.iplett, 2",4"-CHo) in dem kernmagne\isehen Resonanζspektrum und den Fragment mit 276 m/e im Massenspektrum des isilylierten Produkten der Verbindung (B), hydrolysiert mittels Chlorwasserstoffsäure; vnd der Existenz des ρ-Culfooxyaimtsaurerestes in der 3-Position aus den V/erten 7,35 ppm (2H, Doublett, J = 8,5 Hz, 3'5'-CH), 7,71 ppm (213, Uoublett, J = 8,5 Hz, 2' ,6 '-CH), 6,54 ppm (111, Doublett, J = 16 Hz, K-CH) und 7,75 ppm (1H, Doublett, J = 16 Hz, ß-CH) im kernmagnetischen Resonanzspektruir,, des Fragmentes mit 308 m/e im Massenspektrum des silylierter.

Produktes des Verbindung (B), hydrolysiert mit Dowex 5OW (H Typ,

—1

Handelsname) in Methanol, und dann Absorptionen bei 868 crc

— 1 (Spannungsvibration von S-O), 1050 cm (Spannungsvibration von S=O) und etwa 1220 cm" (Spannungsvibration von SO₂) in dem Infrarotabsorption spectrum.

(C) 7ß-(]>-5-Ämino-5-carboxyvaleramido)-3-(p-hydroxycinnamoyloxy-

¹Z

methyl)—7^--IDethoxy-,Δ -cephem-4-carbonsäure (Verbindung C):

J* V 2" Z* 1*

HOOC-CHGH₀CH_nCH₀CONH

I ddc.

NH₀ 2

Elementaranalyse der Verbindung (C) für

	50	C	5	H	7	N	5	S
Berechnet:	49	,00%	5	,24%	7	,29%	5	,56%
Gefunden:	,79%	,13%	,15%	,42%

^ H_?0:

Die physiko-chemisehen Eigenschaften des Natriumsalzer; der Verbindung (C) sind die folgenden:

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(1 ) Weißes FuI/er.

(2) Besitzt keinen definierten Schmelzpunkt und es wird craur: bei 14 5-150° C.

(3) Lc."i.?ht IcJnIi ch i■·: V/asser, jedoch, schwer löslich in Mei.ll·. j.i öl, ;.". ::;.'!iG.l, Butylacetat, Äthylacetat und anderer

(4) Amphoter;:¹'. '-.^₁I ovial mit positiver \⁷inhydrinreaktion.

(5) Ergibt c¹?:: in Fig. 7 dargestellte ILltra.violettabsorptionssfjektru;.:i viii dor: AbsorptionsmaximuiJi bei 307,5 nin bei der Messung in 1/100 I-I Phosphorsäurapufferlösung bei pH 6,5.

(6) Ergibt das iu Fig- 8 v/i edergegebene Infrarotabsorptionsspektrum bei der T-lestu;ng als Kaliumbromidtablette und zeigt Absorptionen bei 3200, 1765, 1600, 1510, 1405, 125?, 1170 und 836 cm"¹.

(7) Ergibt; das in. Fig. 9 dargestellte kernmagnetische Resonanzspektrum bei der Messung in schwerem Wasser unter Verwendung von TSP als einen inneren Standard und besitzt die folgenden Signale:

ff-Wert (ppm):

1,88 (411, Kultipletti 2,50 (2H, Hultiplett), 3,35-3,73 (2H₁ Quartett, J = 18 Hz), 3,54 (3H, Singlett), 3,76 (1H, KuI-tiplett), 4,92 (211, Quartett, J = 13 Hz), 5,19 (1H, Singlett), 6,41 (1H₁ Doublett, J~= 16 Hz), 6,94 (2E, Doublett, J = 8,5 Hz), 7,59 (2H, Doublett, J = 8,5 Hz) und 7,71 (1H, Doublett, J = 16 Hz).

(8) Elementaranalyse der Verbindung nach dem Trocknen im Vakuum während 4 Stunden bei 50° C für ^C24^H26^N3°1o^SNa*

2H₂O:

CHNS

Berechnet: 47,45% 4,94% . 6,92% 5,27% Gefunden: 4 6,1596 4,81% 6,81% 5,42%

(9) Nach der Hydrolyse der Verbindung (C) mit 6n-Chlorwasserstoffsäure für 16 Stunden bei 100 C wurde die Anwesenheit von JL -Aminoadipinsäure, v/ie im Falle der Verbindung (A), bestätigt.

(iü) V/enn Verbindung (ü) mil. Fjov/ca LOW (H Typ, Handeisnarne) ir. Methanol hydrolysiert vn.-rde, v.'urde die Existenz von

030(HS/0670

ORIGINAL INSPECTED

p-Cumarinsäure (IiOOC-CU=CH Y_J/ OH), wie im Falle der verbindung (A) bestätigt.

Au ο den vors ί'/πenden Ergebnis sen wurde die Struktur· der Verbindung (C) bes Li m-"t. üi t; »ei st en ζ des 7 at -Mothoxyccphalosporinge-

— 1

rüstes ergit ^J; .;i?^;i aus dein Wert 1765 cm" (cyclisches Lactam) in dem Infrarotabr-orpti dnc Spektrum und ')'.e Werte von 3,54 ppm (3H, Singlett, 7-OCU₅), 5,19 ppn (1H, Singlett, 6-CH), 3,35-3,73 ppi:. (2E, Quartett, J = 18 Hz, 2-CH₂) uiid 4,92 ppm (2K, Quartett, J = 13 Hz, 3-CII₉); die Existenz des ."».' -Aminoadipinsaurerestes ir der 7-Position. ergibt sich aus der Aminosäureanalyse und den Werten der Signale bei 1,88 ppm (4H, Multiplett, 3",4"-CH₂), 2,50 ppm (211, Multiplett, 2"-CH_?) und 3,76 ppm (1H, Multiplett, 5"-CH); und der Abspaltung der Sulfogruppe (-SO-,Η) der Verbindung (A) aus (i) den V/erten von 6,94 pm (2H, Poublett, J = 8,5 Hz, 3',5'~ CH), 7,59 ppm (2H Doublett, J = 8,5 Hz, 2',6'-CH), 6,41 ppm (1H, Doublett, J = 16 Hz, J, -CH) und 7,71 ppm (1H, Donblett, J = 16 Hz, ß-CH) in dem kernmagnetischen Resonanz,Spektrum, (ii) den Fragment mit 308 m/e (entsprechend der Trimethylsilyl-p-trimethylsilyloxyziir.tsäure) in dem Massenspektrum des silylierten Produktes an Verbindung (C),hydrolysiert mit Dowex 5OW (H -Typ, Handelsname) in Methanol, (iiij der Existenz von einem S Atom a\is den Ergebnissen der Elementaranalyse und (iv) dem Verschwinden der Absorptionen bei 870 cm" (Spannungsvibration von S-O),

—1 —1

1045 cm (Spannungsvibration von S=O), und etwa 1215 cm

(Spannungsvibration von SOp) der Verbindung (A) in dem Infrarotabsorptionsspektrum.

(D) 7ß-(4-Carboxybutyramido)-3-(p-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7iX -methoxy- JS. -cephem-4-carbonsäijre (Verbindung D):

S'

COOH

C30046/0570

ORIGINAL INSPECTED

Elementa.rana.lyse der Verbindung (D) für C₉₇H₉ZN₉SO.,,..H₀C

	51	C	4	H	5	N	S
Berechnet:	51	,30%	4	,87%		,20%	5,95%
Gefunden:	, 33%	,79%	, 07%	6,01%

Die phy^iVo-ol^di.-elien Eigenschaften des Natriuar.salses der Verbind .!f:g ([;) .sirjd die folgenden:

(1 ) V/eiOos iulvej.·/

(2) Sehr hygros/opiRch und die Messung des Schmelzpunktes war β I

(3) Leicht löslich in V/asser, schwach löslich in Methanol und Äthanol, aber kaum löslich in Äthylacetat, Butylacetat, n-Butanol und anderen organischen Lösungsmitteln.

(4) Saures Material mit negativer ITinhydrinreaktion.

(5) Ergibt das in F:g. 10 dargestellte Ultraviolettabsorptionsspektrurn bei der Kessung in 1/100 M Phosphor säurepuff,er-Lösung bei pH 6,5 und besitzt das Absorpti onsniaximum bei 307 run.

(6) Ergibt das in Fig. 11 wiedergegebene Infrarotabsorptionsspektrum bei der Messung als Kaliumbromidtablette und besitzt die Absorptionen bei 3200, 1765, 1700, 1600, 1510, 1170 und 835 cnT¹.

(7) Ergibt das in Fig. 12 gezeigte kernmagnetische Resonanzspektrum bei der Messung in schwerem V/asser unter Verwendung von TSP als innerem Standard und zeigt folgende Signale:

O-Wert (ppm):

1,94 (2H, Multiplett), 2,44 (4H, Multiplett), 3,36-3,74 (2H, Quartett, J = 18 Hz), 3,54 (3H, Singlett), 4,9? (2H, Quartett, J = 13 Hz), 5,19 (1H, Singlett), 6,40 (1H, Doublett, .J = 16 Hz), 6,93 (2H, Doublett, J = 8,5 Hz), 7,58 (2H, Doublett, J = 8,5 Kz) und 7,71 (1H, Doublett, J = 16 Hz).

(8) vlann Verbindung (D) mit ,ön-Chlorwasserstoffsäure hydro-: lysiert -wurde, wurde die Existenz von Glutarsäure, wie im Falle der Verbindung (B) bestätigt.

(9) Wenn vernlr.idiinri' (jj) ί;ΰ I- Duwcä ΠOV/ ^H Tz»⁷P» Ji3iidc-2 5ii£.ni(:) in Methanol liydrolysi ert wurde, wurde die Existenz von

030045/0570

p-Cumarinsäure, wie im Falle der Verbindung (A) bestätigt.

Aus den vorstehenden Ergebnissen wurde die Struktur der verstehenden Verbindung (D) bestimmt. Die Existenz des 7 Λ-Methoxycephalospor:'nßerüatco ergibt .sich aus den V/erten 3,54 P pn (5H, Singlett, 7-OCR-.), 5,19 Ppm (IH, Singlett, 6-CH), 3,36-3,74 ppm (211, Quartett, J = 18 Kz, 2-CII₉) und 4,92 ppm (211, Quartett, J = 13 Hz, -CH₂ in der 3-Seitenlcette); die Existenz der 4-Carboxybutyramidogruppo in der 7-Position ergibt sich aus den Werten 1,94 ppm (211, Multiplett, 3"-UII₂) und 2,44 'ppm (411, Multipiett, 2",4"-CHp) iip kernrcagne ti sehen Resonansspektruui und des Fragmentes mit 276 m/e in dem Masse.nspektrum des silylierten Produktes der Verbindung (D), hydrolysiert mit Chlorwasserstoffsäure; und der Existenz der p-Cumarinsäu.re in der 3-Position aus den Werten 6,93 ppm (2H, Doublett, J = 8,5 Hz, 3',5'-CH), 7,58 ppm (2H, Doublett, J = 8,5 Hz, 2',6'-CH), 6,4 0 ppm (1H, Doublett, J = 16 Hz,dC-CH) und 7,71 ppm (1H, Doublett, J = 16 Hz, ß-CH) ur.d dein Fragment mit 308 m/e in dem Massenspektrum des silylierten Produktes der Verbindung (D), hydrolysiert mit Dowex 5OW (H⁺ Typ, Handelsname) in Methanol.

Fernem werden die Ergebnisse der Duinschichtchromatographie, Hochgeschv/indigkeitsflüssigkeitisclrromatographie und die antibakterielle Aktivität der Verbindungen (A), (B), (C) und (D) nachstehend angegeben:

1. Rf-Werte der Dünnschichtchromatographie unter Verwendung feiner kristalliner Cellulose (Avicel SF, Handelsname) sind in der Tabelle I wiedergegeben:

Tabelle I Dünnschichtchromatographie (Rf-Werte)

Verbindung (A) Verbindung (B) Verbindung (C) Verbindung (D) Y-G19Z-G Y-G19Z-GG

0300AS/0870

A+	B+"
0,39	0,55
0,64	0,84
0,65	0,64
0,89	0,93
0,38	0,37
0,74	0,79

(Bemerkung 1): Entwicklimgslösungsinittel (im Vclumenverhältnis) A⁺ : n-Butariol : Essigsäure : Wasser (4·: 1 : 2) B : Isopropanol : Wasser (7:3)

(Bemerkung 2): Der Nachweis erfolgte unter Verwendung von Ninhydrin oder UIteaviolettabsorption (Manasulu-Licht 253S S).

(Bemerkung 3): Kontrollsubstanz Y-G19Z-G ist 7-(5-Amino-5-carboxyvalerainido)-7-niethoxy-3-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)thiomethyl-A -cephem-4-carbonsäure, beschrieben in Japanischer Offenlegungschrift 79,081/'77 und Y-G19Z-GG ist ^r7-(4-CarboxybutyramiGo)-7-methoxy-3-(1-niethyl-iH-tetrazol-5-yl)thiomc-thyl-Δ' -cephera-4-carbonsäure. Sie ist beschrieben in Japanischer Offenlegungsschrift 15,494/'78.

2. Die Elutionszeiten bei der Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographie sind die folgenden:

Tabelle II
Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitachromatοgraphie

Elutionszeit

Verbindung (A) 2 Min. 46 Sek.

Verbindung (B) 5 Min. 42 Sek.

Verbindung (C) 30 Kin, OO Sek.

Verbindung (D) 89 Min. 18 Sek.

Y-G19Z-G 2 Min. 14 Sek.

Y-G19Z-GG 4 Min. 35 Sek.

Pumpe: 6000 A (Hersteller: Waters Co.)
Detector: UVIDEK 100 II UV Detector (Hersteller: Nippon Bunkc

K.K.) 280 mn.
Säule: Rostfreie Stahlsäule 4 mm χ 150 mm, gefüllt nit Lichro-

solve RP.18 (Merck & Co., Inc.). Entwicklungslösemittel: Acetonitril : Essigsäure : Wasser

(10 : 0,2 : 90 im Volumenverhältnis).
Flie ßrate: 1 ml/Min.
Druck: 1800 P.S.I.
Säulentemperatur: 30° C.

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Die antibakteriellen Aktivitäten gegenüber Proteus niirabilis und Salmonella gallinarura sind die folgenden: Tabelle III: Antibakterielle Aktivität

	Konzentration	Proteus	Salmonella
	{γ/ mi)	mirabilis	gallinarum
Verbindung (A)	100	22,3	17,0
	500	28,7	21,5
Verbindung (B)	100	17,6	H,2
	500	27,2	18,3
Verbindung (C)	100	22,0	■15,1
	500	27,8	20,0
Verbindung (D)	100	18,0	11,5
	500	27,7	16,2
Y-G19Z-G	100	21,6	18,5
	500	27,0	21,5
Y-G19Z-GG	100	+	-
	500	19,0	16,0
(Bemerkung): Pepton 1%, Hefeextrakt	0,190, Agar-Agar \%, pH
8,0, Plattenschalenmethode, die numerischen Werte sind die
Durchmesser der Inhibitionskreisflächen.

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Minimura-Inhibtions-Konzentration (^y-/ml)

Test Organismus Verbindung dieser Erfindung Bekannte Verbindung

Verbindung Verbindung Verbindung Verbindung Verbindung Verbindung

Bacillus subtilis ATCC 6633 12,5

Staphylococcus aureus ATCC 6538P 100

Escneria coli UIHJ 6,25

Klebsieila pneumoniae ATCC 10031 25

° Salmonella typhi H901W 3,13

^σ Salmonella enteridis 1891 6,25

.ρ- Shigella b'oydii II D 627 6,25

ί* Proteus mirabilis IMPOM 9 0,78

° Proteus vulgaris OXK US 0,39

-J Pseudomonas aeruginosa NCTC

° 10490 >1OO >100 >100 >100 *>100 >100

(B)	25	(C)
100		3,13
100		50
6,		3,13
25		3,13
50	5	12,5
50	25	1,56
25	6,25
12,	0,78
6,	0,78

(D)	a	b	I ro
100	50	6,25	-<l
50	>100	100	I
6,?5	?5	12,5
12,5	50	25
25	25	50
25	?5	12,5
12,5	25	50
6,25	6,25	6,25
3,13	1,56	6,25

Verbindung a⁺: 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(^eO-methoxy-p-'Sulfooxycinnamoyloxymethyl)-

7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure (Eine Verbindung von 810A in U.S.-PS 3,914,157). Verbindung b⁺: 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(oC -methoxy-p-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-metho::y-3-cephem-4-carbon3äure (Eine Verbindung von 810A in U.S.-PS 3,914,157). j»o

CD -P-CO O

Die Verbindungen dieser Erfindung können oral, rektal oder mittels Injektion, v/ie subkutan, intramuskulär oder intravenös in Mangen von 100 - 5000 ^rr.g pro Tag an Erwachsene verabreicht werden. Die Dosen können entsprechend der Art der Erkrankung, des:: Alter, Gewicht und dem Statue des Patienten angepaßt werden.

Nun soll die Herstellung der Verbindungen dieser Erfindung der Formel I im e insel ns?:¹ durch die folgenden Beispiele näher erläutert werden.

Beispiel 1

Ein Kulturmedium, enthaltend 1}6 Stärke, 1% Glucose, 1,5% Sojabohnenmehl, 0,5% Hefe extrakt, 0,1% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat und 0,3% Natriumchlorid wurde in 500 ral Sakaguchi-Flaschen mit je 100 ml eingefüllt und bei 120° C für 20 Minuten sterilisiert. Jedes Medium wurde dann mit Streptomyces oganonensis Y-G19Z Stamm beimpft und 48 Stunden bei 30° C gezüchtet, um eine Beimpfungs-Kulturbrübe zu erhalten. Gesondert von diesen wurde zu 5 Liter Kulturmedium, enthaltend 1% Stärke, 2% Glutenmehl, 2% Sojabohnenmehl, 0,8% Glycerin, 0,1 % Oaseinhydrolysat, 0,01% Ferrisulfat, 4,6 g Natriumhydroxid und 1 ml Adekanol (Handelsname) 500 ml einer Lösung hinzugefügt, die 10 g p-Cumarinsäure enthält. Das pK wurde auf 7,.5 mittels 4 η Natriumhydroxidicsung eingestellt, und das Gemisch wurde in einen 10 Liter Fernen··· ter gefüllt und sterilisiert für 30 Minuten bei 120° C. Das Kulturmedium wurde dann mit 100 ml der vorstehend hergestellten Beimpfungskultur beimpft und 120 Stunden bei 30° C kultiviert. Nach vollständiger Kultivierung wurde die Kulturbrühe auf pH 3,0 eingestellt und Radiolite (Handelsname) zugefügt und durchgerührt.

Das Gemisch wurde unter Absaugen filtriert. Der Rückstand wurde mit Wasser gewaschen, das Waschwasser wurde mit dem Filtrat vereinigt. Es wurden 5,6 Liter Filtrat erhalten. Nach Einstellen des pH des Filtrats auf 3,0 mit 4n-Chlorwasserstoffsäure wurde die Lösung durch eine Säule mit einer Packung von einem Liter Diaion IIP.20 (Handelsname) gegeben. Hach dem Waschen der Säule mit 5 Liter Wasser wurde das adsorbierte Material mit wässeriger 30%iger Aceton-Lösung eluiert. Die Fraktionen, die antibakterielle Aktivität gegen Proteus mirabilis zeigten, wurden gesammelt. Die

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aktive Fraktion wurde unter vermindertem Druck bei 50° C eingeengt. Das pH des Rückstandes wurde auf 3,5 mit verdünnter Chlorwasserstoff säure eingestellt. Die Fraktion wurde durch eine Säule mit einer Füllung von einem Liter Aniberlite IRA-68 (Cl"-Typ, Handelsname) gegeben, um daran das Produkt zu adsorbieren. Nach dem Waschen der Säule mit 5 Liter Wasser wurden die adsorbierten Materialien mit einer'wässerigen Lösung (pH 7,2), enthaltend 1 M Natriumnitrat und 0,1 M Natriumacetat, eluiert. Die Fraktionen mit antibakterieller Aktivität wurden gesammelt. Nach dem Einstellen des pH der so gesammelten Fraktion auf 3,0 wurde die Fraktion durch eine Säule mit einer Füllung aus einem Liter Diaion HP.20 (Handelsname) gegeben. Die Säule wurde mit 5 Liter Wasser gewaschen. Die adsorbierten Materialien wurden mit einer wässerigen 30%igen Acetonlösung eluiert. Die Fraktionen mit antibakterieller Aktivität wurden gesammelt. Es wurden etwa 500 ml Lösung erhalten. Die Lösung wurde unter vermindertem Druck bei 50 C eingeengt, um Aceton zu entfernen. Es wurde gefriergetrocknet. Es wurden etwa 11g pulvrige rohe Verbindung (A) erhalten.

Dann wurde 11g des Palvers einer Säulenchromatographie unter Verwendung feiner kristalliner Cellulose (Avicel, Handelsname) und eines Gemisches aus n-Butanol, Essigsäure und Wasser (4 : 1 2 im Volumenverhältnis) unterworfen.

Die Fraktionen, die die Verbindung (A) enthielten, wurden gesammelt unter Bestätigung der antibakteriellen Aktivität. Die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,55, mittels UV-Absorption (Manasulu Licht 2536 A⁵) und Ninhydrin-Anfärbung geprüft, wurden nach Auftragen auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel SF (Handelsname) und Entwicklung mit einem Gemisch aus Isopropanol und Wasser (7:3 im Volumenverhältnis) behandelt. Dadurch wurden etwa 150 ml Lösungsmittelgemisch, die Verbindung (A) enthaltend, erhalten. Zu dem Lösungsmittelgemisch wurden 150 ml Toluol zugefügt, durchgeschüttelt und nach dem Stehenlassen des Gemischs wurde die obere Schicht aus n-Butanol und Toluol entfernt. Die untere wässerige Schicht, die die Verbindung (A) enthält, wurde unter vermindertem Druck auf etwa 30 ml eingeengt. Es wurde gefriergetrocknet. Es wurden 1,35 g trockenes Pulver erhalten.

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Dann wurde das erhaltene Produkt einer Hochgeschwindigkeitsflüssigkeit sehroinatοgraphie ; Pumpe: 5000 A, Hersteller: Waters Co., Detector: UV-Detector, tJVIDEK 100 II 280 mn, Hersteller: Nippon Bunko K.K., Säule: Säule aus rostfreiem Stahl 8 mm χ 1 Meter, gefüllt mit Bondapak C^g Poracil (Handelsname), Lösungsmittel: Acetonitril : Essigsäure : Wasser (9 : 0,2 : 90,8 im,.

2 \ Volumenverhältnis), Eließrate: 9 ml/Min, und Druck: 35 kg/cm J

zur Reinigung unterworfen.

Dann wurde 1,36 g des vorstehend genannten Pulvers in 10 ml Wasser aufgelöst, 2 ml der Lösung wurde in die vorstehend genannte Säule gefüllt, und die Fraktionen, die die Verbindung (A) enthielten und die zwischen 24 "bis 44 Minuten nach Beginn der EIuierung austreten, wurden gesammelt. Dieses Verfahren wurde fünfmal wiederholt. Die Fraktionen wurden vereinigt und unter vermindertem Druck bei 50° C eingeengt und anschließend gefriergetrocknet. Es wurde 75 mg weißes Pulver erhalten.

Das Pulver wurde erneut in Wasser aufgelöst und an Sephadex G.10 (Handelsname) in einer Säule mit der Abmessung 1,5 cm χ 50 cm adsorbiert. Das Produkt wurde mit destilliertem Wasser entwickelt, Die Fraktionen, die die Verbindung (A)' enthielten, wurden unter Bestätigung der antibakteriellen Aktivität gesammelt. Diese Fraktionen besitzen den RF Wert 0,55 durch UV-Absorption und Ninhydrinanfärbung nach dem Auftragen der Fraktion auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel SF und Entwicklung mit einem Gemisch aus Isopropanol und Wasser (7 : 3 im Volumenverhältnis). Dann wurde gefriergetrocknet. Es wurde 66 mg weißes Pulver der reinen Verbindung (A) erhalten.

Beispiel 2

Ein Kulturmedium (pH 6,0), bestehend aus 20 g Glucose, 4 g Kaliumdihydrogenphosphat, 1 g Magnesiumsulfat, 2 g Ammoniumsulfat, 0,5 g Calciumchlorid, 0,1 g Borsäure, 0,04 g Ammoniummolybdat, 0,04 g Mangansulfat, 0,04 g Zinksulfat, 0,045 g Cuprisulfat, 0,025 Ferrosulfat, 20 meg Biotin, 2 mg Thiamin-Hydrochlcrid, 1 g Dl-Methionin und 1000 ml Wasser wurde in einen 500 ml Erlenmeyerkolben mit je 100 ml eingefüllt und 20 Minuten bei 120° C steri-

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lisiert, mit-einem Trigonopsis variabilis IFO-0755 Stamm beimpft. Dann wurde eine Schüttelkultur 72 Stunden bei 30° C durchgeführt. Nach beendeter Kultivierung wurden etwa 100 ml der Kulturbrühe gesammelt und einer Zentrifugentrennung bei 2000 Umdrehungen/ Minute für 50 Minuten bei 4° C unterworfen, um das Hycel zu sammeln. Das Mycel wurde in 500 ml 0,1 M Pyrophosphatpufferlosung von pH 8,1 suspendiert, um eine Mycelsuspension zu erhalten. Zu dieser wurden 5 ml Triton X-100 (Handelsname) hinzugefügt. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei 37° C geschüttelt, um das Mycel zu aktivieren. Das aktivierte Mycel wurde gesammelt. Das aktivierte Mycel wurde dann in 0,1 M Pyrophosphatpufferlosung pH 8,1 suspendiert, um eine aktivierte Mycel-Flüssigkeit (D-Aminosäure oxidierendes Enzym) zu erhalten.

Dann wurden 10 mg Verbindung (A), hergestellt gemäß Beispiel 1, in 10 ml 0,05 M Pyrophosphatpufferlosung mit pH 7,6 aufgelöst. Zu der Lösung wurden 2 mg Natriumazid, 0,1 ml 0,06% Wasserstoffperoxidlösung und 1 ml der vorstehend beschriebenen aktivierten Mycelflüssigkeit hinzugefügt. Das Gemisch wurde in einem Wasserbad bei 37° C durchgeschüttelt. Der Reaktionsfortschritt wurde alle 30 Minuten mittels Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschroma-. tographie (^Pumpet 6000 A, Hersteller: Waters Co., Detector: UV-Detector, UVIDECK 100 II 280 mn, Hersteller: Nippon Bunko K.K., Säule: Säule aus rostfreiem Stahl 4 mm χ 150 mm, gefüllt mit Lichrosolve RP.18 (Handelsname, Hersteller: Merck & Co., Inc.) geprüft, Lösungsmittel : Acetonitril : Essigsäure : Wasser (10 : 0,2 : 90 im Volumenverhältnis), um das Ende der Umsetzung festzustellen. Das Ausgangsmaterial Verbindung (A) besitzt eine EIuierzeit von 2 Minuten und 50 Sekunden; Verbindung (B), die durch das D¹Aminosäure oxidierende Enzym oxidativ deaminiert wurde, hat eine Eluierzeit von 5 Minuten und 52 Sekunden. Die Umsetzung war nach 3 Stunden beendet, und das aktivierte Mycel wurde aus dem Reaktionsgemisch durch Zentrifugieren bei 4° C abgetrennt. Nach Einstellen des pH im Überstehenden auf 4,0 mit 1 η Chlorwasserstoffsäure wurde die Lösung unter vermindertem Druck bei 50 C bis auf 2 ml eingeengt.

Dann wurde das Produkt unter Verwendung einer Hochgeschwindig-

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··►■

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keitsflüssigkeitschromatographie (Pumpe: 6000 A, Hersteller: Waters Co., Detector: UV-Detector, UVIDECK 100 II 280 nm, Hersteller: Nippon Bunko K.K., Säule: Säule aus rostfreiem Stahl 8 mm χ 1 Meter, gefüllt mit Bondapack C.g Poracil, Lösungsmittel: Acetonitril : Essigsäure : Wasser (10 : 0,2 : 90 im Volumenverhältnis), Fließrate: 9 ml/Hin., Druck: 35 kg/cm _J. Die vorstehend genannte Lösung 'wurde in die Säule gegeben, und die Fraktionen, die die Verbindung (3) enthielten und 18 Minuten nach Beginn des Eluierens bis 28 Minuten austraten, wurden gesammelt. Die Fraktion wurde unter verminderten Druck bei 50° C bis auf 10 ml eingeengt und gefriergetrocknet. Es wurde 5,5 mg weißes Pulver der reinen Verbindung (B) erhalten.

Beispiel 3

Nach dem Auflösen von 25 mg Verbindung (A), hergestellt gemäß Beispiel 1, in 0,5 ml Wasser wurde 45,4 ml Aceton zu der Lösung hinzugefügt. Dabei wurde die Lösung weiß trüb. Durch Zugabe von 0,2 ml 1n Chlorwasserstoffsäure zu der Lösvng wurde die Lösung sofort klar. Man ließ die Lösung 2 Stunden bei Zimmertemperatur (22-23° C) stehen. Wenn die Lösung auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel SF aufgetragen tind entwickelt wurde mit einem Gemisch aus n-Buianol, Essigsäure und Wasser (4:1 : 2 im Volumenverhältnis) und mittels UV-Absorption und Ninhydrinanfärbung geprüft wurde, wurde bestätigt, daß Verbindung (A) mit dem Rf-Wert 0,39 in die Verbindung (C) überführt worden war mit dem RF-Wert 0,65. Durch Entwickeln des Produktes mit einer Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographie £pumpe: 6000 A, Hersteller: Waters Co., Säule: Säule aus rostfreiem Stahl 4 mm χ 150 mm, gefüllt mit Lichro3olve RP 18, Detector: UV-Detector, UVIDECK 100 II 280 mn, Hersteller:Nippon Bunko K.K., Lösungsmittel: Acetonitril: Essigsäure : Wasser (15 : 0,5 : 90 im Volumenverhältnis), Fließrate: 1 ml/Min.}, wurde bestätigt, daß Verbindung (A) mit einer Eluierzeitvon 1 Minute und 38 Sekunden in Verbindung (C) überführt worden war mit einer Eluierzeit von 11 Minuten und 0 Sekunden. Nach beendeter Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch neutralisiert mit 0,2 ml 1n Natriumhydroxidlösung und dann unter vermindertem Druck bis auf ein Volumen von 2 ml eingeengt.

Die so erhaltene Verbindung (C)wurde mittels Hochgeschwindigkeits-

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flüssigkeitschromatographie^Pumpe:6000 A, Hersteller: Waters Co., Detector: UV-Detector, UVIDECK 100 II 280 nm, Hersteller: Nippon Bunko K.K., Säule: rostfreie Stahlsäule 8 nun χ 1 Meter, gefüllt mit Bondapack C,_Q Poracil (Handelsname, Hersteller Waters Co.), Lösungsmittel: Acetonitril : Essigsäure : Wasser (15 : 0,5 : 90 im Volumenverhültnis), Fließrate: 9 ml/Mir^ gereinigt.

Die Fraktionen mit der Verbindung (C) traten von 14- Minuten an, nach Beginn der Eluierung, Ms 19 Minuten aus und sie wurden gesammelt, unter vermindertem Druck eingeengt bei 50° C bis das Volumen etv/a 10 ml betrug. Nach dem Einstellen des pH auf 5 mit 1 η Natriumhydroxidlösung wurde das Konzentrat gefriergetrocknet. Das erhaltene Pulver wurde an einer Sephadex G-10 Säule 1,5 cm χ 50 cm adsorbiert und mit destilliertem Wasser eluiert. Die antibakteriell aktiven Fraktionen wurden auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel SF aufgetragen, entwickelt mit einem Gemisch aus n-Butanol, Essigsäure und Wasser (4:1 : 2 im Volumenverhältnis), und deren Rf-Wert wurde mittels UV Absorption und Ninhydrin-Anfärbung geprüft. Die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,65 wurden gesammelt und gefriergetrocknet. Es wurden 14- mg weißes Pulver der reinen Verbindung (C) erhalten.

Beispiel 4

In 5 ml 0,05 M Pyrophosphatpuff er lösung vo.i pH 7,6 wurde 6 mg Verbindung(C)£hergestellt gemäß Beispiel 3),aufgelöst. Nach Zugabe von 1 mg Natriumazid, 0,05 ml 0,06%iger Wasserstoffperoxidlösung und 0,5 ml der aktivierten Mycelsuspension (enthaltend D-Aminosäure oxidierendes Enzym) von Trigonopsis variabilis IFO-0755 Staiim, erhalten nach der im Beispiel 2 beschriebenen Methode, wurde das Gemisch auf einem Wasserbad bei 37° C durchgerührt.

Das Ende der Umsetzung wurde mittels Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographie £pumpe: 6000 A, Hersteller: Waters Co., Detector: UV-Detector, UVIDECK 100II 280 nm, Hersteller: Nippon 3unko K.K., Säule: rostfreie Stahlsäule 4 mm χ 150 mm, gefüllt mit Lichrosolve RP 18 (Handelsname, Hersteller: Merck & Co., Inc.), Lösungsmittel: Acetonitril : Essigsäure : Wasser (20 : 0,2 : 80 im Volumenverhältnis), Fließrate: 1 ml/Min/} bestätigt.

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Verbindung (C) besitzt eine Eluierzeit von 3 Minuten und 22 Sekunden, aber die Verbindung (D), oxidativ deaminiert durch das D-Aminosätire oxidierende Enzym, zeigte eine Eluierzeit von 4 Minuten und 48 Sekunden.

Wenn die Verbindung (D) auf eine Dünnschichtplatte Avicel SF aufgetragen wurde und rcit einem Gemisch aus n-Butanol, Essigsäure und Wasser (4 : 1 : 2 im Volumenverhältnis) entwickelt wurde und dann mittels ÜV-Absorption und Ninhydrin-Anfärbung bestimmt wurde, hatte der Fleck der Verbindung (C) den Rf-Wert 0,65, wobei ÜV-Absorption und Ninhydrin-Anfärbung nicht nachweisbar waren, und der Fleck der Verbindung (D) hatte den Rf-Wert 0,89, außerdem zeigte er UV-Absorption, jedoch wurde keine Ninhydrin-Anfärbung festgestellt.

Nach beendeter Reaktion wurde das Reaktionsgemisch auf pH 2,5 mit 1 η Chlorwasserstoffsäurelösung eingestellt und dreimal mit je 5 ml A'thylacetat extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde in einer kleinen Menge destilliertem Wasser aufgelöst, und nach Einstellen d'er Lösung auf pH 5 mit 1 η Natriumhydroxidlösung wurde die Lösung gefriergetrocknet. Es wurden 3,5 mg weißes Pulver der reinen Verbindung (D) erhalten.

Beispiel 5

Eine Kulturbrühe wurde in einem 20 Liter Fermenter nach der gleichen Züchtungsmethode, wie im Beispiel 1 beschrieben, jedoch ohne Zugabe von p-Cumarinsäure kultiviert. Nach beendeter Kultivierung wurde das pH der Kulturbrühe auf 3,0 eingestellt, Radiolite wurde zugefügt und dann durchgerührt. Das Gemisch wurde unter Absaugen filtriert, der Rückstand wurde mit Wasser gewaschen. Das Waschv.^ra3ser wurde mit dem Filtrat vereinigt, wodurch 23 Liter wässerige Lösung erhalten wurden. Nach dem Einstellen des pH der wässerigen Lösung auf 3,0 mit 4 η Chlorwasserstoffsäure wurde die Lösung durch eine Säule mit einer Füllung von 3 Liter Diaion HP. 20 gegeben. Nach dem Waschen der Säule mit 20 Liter Wasser wurde das adsorbierts Produkt mit einer v/ässerigen 30%igen Acetonlcsung eluiert. Dann wurde die Fraktion mit anti-

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bakterieller Aktivität gegen Proteus mirabilis gesammelt. Die aktive Fraktion wurde unter vermindertem Druck bei 50° C eingeengt. Nach dem Einstellen des pH auf 3,5 mit 4 η Chlorwasserstoff säure wurde die Lösung durch eine Säule, gefüllt mit 3 Liter Amberlite IRA-68 (Cl~-Typ), gegeben. Nach dem Waschen der Säule mit 10 Liter Wasser wurde das darin adsorbierte Produkt mit wässeriger Lösung (pH- 7,2), enthaltend 1 M Natriumnitrat und 0,1 η Natriumacetat, eluiert. Die Fraktion mit antibakterieller Aktivität wurde gesammelt. Nach dem Einstellen des pH auf 3,0 wurde die Fraktion durch eine Säule mit einer Füllung aus 1 Liter Diaion HP, 20 gegeben. Nach dem Waschen der Säule mit 10 Liter Wasser wurde das Produkt mit wässeriger 30%iger Acetonlcsung eluiert. Die Fraktionen mit antibakterieller Aktivität wurden gesammelt. Es wurden etwa 2,1 Liter wässerige Lösung erhalten. Die Lösung wurde unter vermindertem Druck bei 50 C eingeengt, um Aceton zu entfernen. Es wurde dann gefriergetrocknet. Es wurden etwa 32 g rohes Pulver erhalten.

10 g des Pulvers wurden dann einer Säulenchromatographie unterworfen unter Verwendung feiner kristalliner Cellulose-Säule mit einem Gemisch aus n-Butanol, Essigsäure und Wasser (4:1 : im Volumenverhältnis). Es wurde mit Lösungsgemisch mit der vorstehenden gleichen Zusammensetzung eluiert. Die Fraktionen wurden punktförmig auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel SF aufgetragen und mit einem Gemisch aus Isopropanol und Wasser (7 : 3 im Volumenverhältnis) entwickelt.

Die Fraktionen mit UV-Absorption, Ninhydrin-Anfärbung und antibakterieller Aktivität gegen Proteus mirabilis wurden gesammelt. Es wurden etwa 500 ml Lösungsmittelgemischlösung erhalten. Zu dsm Lösungsmittelgemisch wurde 500 ml Toluol hinzugefügt und durchgeschüttelt. Das Gemisch wurde stehen gelassen, n-ßutanol und Toluol als gebildete obere Schicht wurden entfernt. Die untere wässerige Schicht wurde unter vermindertem Druck bei 50° C auf etwa 70 ml eingeengt und gefriergetrocknet. Es wurden etwa 3,3 g trockenes Pulver erhalten.

Bei der Analyse des Produktes durch Hochgeschwindigkeitsflüssig-

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keitschromatographie wurde bestätigt, daß der Ausschlag (peak), der mit Verbindung (A) übereinstimmte, (erhalten gemäß Beispiel 1), vorhanden war, wenn das Produkt mittels Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographie [jPumpe: 6000 A, Hersteller: Waters Co., Detector: UV-Detector, UVIDECK 100 II, 280 mn, Hersteller: Nippon Bunko K.K., Säule: rostfreie Stahlsäule 8 mm χ 1 Meter, gefüllt mit Bondapack C.g Poracil, Lösungsmittel: Acetonitril : Essigsäure : Wasser (7 : 0,3 : 90 im Volumenverhältnis), Pließrate: 9 ml/Min., Säulentemperatur: 30° Cj gereinigt wurde.

Dann wurden 3,3 g des vorstehend erhaltenen Pulvers in 10 ml destilliertem Wasser aufgelöst, 2 ml der Lösung wurde in die vorstehend beschriebene Säule gefüllt. Die Fraktionen, enthaltend die Verbindung (A), die 66 bis 94 Minuten nach Beginn der EIuierung austraten, wurden gesammelt. Diese Arbeitsweise wurde fünfmal wiederholt und die Fraktionen vereinigt, unter vermindertem Druck bei 50° C eingeengt und gefriergetrocknet. Es wurden etwa 70 mg weißes Pulver erhalten. Das Pulver wurde erneut nit Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographie [ Pumpe: 6000 A, Hersteller: Waters Co., Detector: UV-Detector, UVIDECK 100 II 280 nm, Hersteller: Nippon Bunko K. K., Säule: rostfreie! Stahlsäule 8 mm χ 1 Meter, gefüllt mit Bondapack C,o Poracil, Lösungsmittel: Acetonitril : Essigsäure : Wasser (8 : 0,2 : im Volumenverhältnis), Fließrate: 9 ml/Min., Säulentemperatur: 10° CJ gereinigt.

Dann wurden 70 mg des vorstehend erhaltenen Pulvers in 2 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Die Lösung wurde in die vorstehend genannte Säule gegeben. Die Fraktionen, die die Verbindung (A) enthielten, traten von 22 Minuten bis 35 Minuten nach Beginn des Eluierens aus, wurden gesammelt, unter vermindertem Druck bei 50° C eingeengt und gefriergetrocknet. Es wurden 10 g weißes Pulver erhalten.

Das Pulver wurde einer Chromatographie unter Verwendung einer Säule 1,5 cm χ 50 cm, gefüllt mit Sephadex G-1O_; unterworfen. Eluiert wurde mit destilliertem Wasser. Die Fraktionen, die die Verbindung (A) enthielten, wurden gesammelt unter Bestätigung

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ihrer antibakteriellen Aktivität. Hierbei zeigten die Fraktionen den Rf-Wert 0,55 bei der UV-Absorption und Ninhydrin-Anfärbung nach dem Auftragen der Fraktionen auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel SF und Entwicklung mit einem Gemisch aus Isopropanol und Wasser (7 : 3 im Volumenverhältnis). Es wurde gefriergetrocknet. Es wurden 5,5 mg weißes Pulver der reinen Verbindung (A) erhalten»

Beispiel 6

Ein Kulturmedium, enthaltend 1% Stärke, 1% Glucose, 1,5% Sojabohnenmehl, 0,5% Hefeextrakt, 0,1% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat und 0,3% Natriumchlorid, wurde in eine 500 ml Sakaguchi-Flasche mit je 100 ml eingefüllt und 20 Minuten strilisiert bei 120° C. Die Kulturmedien wurden mit Streptomyces oganonensis Y-G19Z Stamm beimpft und 48 Stunden bei 30° C gezüchtet, um eine Kulturbrühe herzustellen.

Unabhängig davon wurde das vorstehend genannte Kulturmedium in zwei Liter Sakaguchi Flaschen mit je 400 ml gefüllt, 20 Minuten bei 120° C sterilisiert, mit 2-3% der vorstehend erhaltenen KuI-; turbrühe beimpft und 48 Stunden bei 30° C kultiviert, um eine Vermehrungskultur su erhalten.

Weiterhin wurden 90 Liter eines anderen Kulturmediums, enthaltend 7% Stärke, 2% Glutenmehl, 2% Sojabohnenmehl, 0,8% Glycerin, 0,1% Caseinhydrolysat, 0,01% Ferrisulfat,. 42 g Natriumhydroxid und 10 ml Adekanol (Handelsname) in einen 150 Liter Fermenter eingefüllt und 30 Minuten bei 120° C sterilisiert. Das Medium wurde mit 2 Liter der Vermehrungskultur beimpft und 24 Stunden bei 30⁰C kultiviert. Getrennt für sich wurden 200 g p-Cumarinsäure in 2 Liter Methanol aufgelöst. Die Lösung wurde mit 8 Liter einer äquimolaren Menge Natriumhydroxidlösung gemischt, nach dem Sterilisieren für 10 Minuten bei 120° C wurde die Lösung zu. dem vorstehend genannten Idedium nach Kultivierung für 24 Stunden hinzugefügt. Das Medium v/urde dann weiter für 12 Stunden kultiviert. Nach beendeter Kultivierung wurde das pH der Kulturbrühe auf 3,0 eingestellt und mittels einer Filterpresse filtriert. Es wurde mit Wasser gewaschen. Es wurden 120 Liter Filtrat erhalten.

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Das Filtrat wurde durch eine Säule mit einer Füllung von 22 Liter Diaion HP.20 gegeben. Nach dem Waschen mit Wasser wurde das Produkt mit einer wässerigen 30%igen Acetonlösung eluiert und mittels Hochgeschwindigkeitflüssigkeitschromatographie (HPLC) analysier"!; Die Fraktionen, die die Verbindung (A) enthielten, wurden gesammelt. Dann wurde die Fraktion durch eine Säule mit einer Füllung aus 6 Liter Amberlite IRA 68 (Cl~-Typ) gegeben. Nach dem Waschen mit Wasser wurde das Produkt mit einer Lösung (pH 7,2), die 1 M Natriumnitrat und 0,1 η Natriuraacetat enthielt, eluiert. Die Fraktionen wurden mittels HPLC analysiert; die Fraktionen der Verbindung (A) wurden gesammelt. Nach Einstellen des pH der Fraktion auf 3,0 wurde die Fraktion durch eine Säule mit einer Füllung aus 15 Liter Diaion HP.20 gegeben. Nach dem Waschen mit Wasser wurde das Produkt mit einer wässerigen 30%igen Acetonlösung eluiert. Die Fraktionen wurden mittels HPLC analysiert, und die Fraktionen der Verbindung (A) wurden gesammelt. Die Lösung wurde unter vermindertem Druck bei 50° C eingeengt. Es wurden 2,5 Liter Lösung mit einem Gehalt an 95 g Verbindung (A) erhalten.

Beispiel 7

Ein Kulturmedium (pH 6,0), bestehend aus 20 g Glucose, 4 g Kaliumhydrogenphosphat, 1 g Magnesiumsulfat, 2 g Ammoniumsulfat, 0,5 g Calciumchlorid, 0,1 g Borsäure, 0,04 g Ammoniummolybdat, 0,04 g Mangansulfat, 0,04 g Zinksulfat, 0,045 g Cuprisulfat, 0,025 g Ferrosulfat, 20 meg Biotin, 2 mg Thiamin-Hydrochlorid, 1 g DL-Methionin und 1000 ml Wasser, wurden in einen 500 ml Erlenmeyer-Kolben mit je 100 ml eingefüllt, 20 Minuten bei 120° C sterilisiert, mit Trigonopsis variabilis IFO-0755 beimpft. Dann wurde der Ansatz 72 Stunden bei 30° C als Schüttelkultur gehalten. Nach beendeter Kultivierung wurden etwa 100 ml der Kulturbrühe gesammelt, einer Zentrifugentrennung unterworfen bei 2000 Umdrehungen/ Min. für 30 Minuten bei 4° C, um das Mycel abzutrennen. Das Mycel wurde in 500 ml einer 0,1 M Pyrοphosphatpufferlösung von pH 8,1 suspendiert, um eine Suspension des Mycels herzustellen. Zu der Mycel-Suspension wurden 5 ml Triton X-100 (Handelsname) hinzugegeben. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei 37° C geschüttelt, ura das Mycel zu aktivieren. Das aktivierte Mycel v/urde gesammelt und

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i.-i einer O, T M T'yrophosphd.bpuf ferlösung von pll 8,1 suspendiert, um eine Flüssigkeit r.u erhalten, die aktivierten Mycel (O-A.viincsäure oxidierender: ErTy pi) enthält.

Darn wurde ['C _u P,\ rcv/■e-phorcKnre in 2,4 Lite?:¹ einer LOs¹ITj₁:, di-r die Veri;i-'<^;-.v\r (A) .,:i'.hi olt, hergestellt im Beispiel 6, aufgelöst« Nach cerer TvLv,.: 1 ;■"!'!■:■·:.;, des ρ Π auf ^Γ', 5 mit 4 η wässeriger Hatrii.nhydroxidlosung r/ui\u·;; GOO mg IJatriuinaKid und 5 Liter Flüssigkeit de:; aktiv "■ er c^r-n I-ly:·:]..; von Tri^oriopsis varia"bilis lFO-0755 Sta:^rr_; 2.υ dei- Leuu^ig ''-ii>i^u_t';ei.'ü^t. Dam? wurden 10 ml Wasserstoffperoxid hinzugegeben, ras Gom.ibch wurdf; bei 37'° C durchgerührt, um die Reaktion durchzuführen. Las Reaktiennprcdukt wurde mittels HPLC analysiert, ftach der Bestätigv.ng, daß Verbindung (A) in Verbindung (3) u:;igev;andelt war, wurde das pH des Real<tionsgemische3 auf 3,0 mit 4 η Chlorwasserstoffsäure eingestellt, dann wurde das Kycel abfiltriert. Das Filtrat wurde durch eine Säule mit einer Füllung aus 3 Liter Diaion HP.20 gegeben. Nach dem Waschen mit Wasser wurde das Produkt mit einer wässerigen 25%igen Ac?tonic" sung oluiert. Die Fraktionen wurden mittels HPLC analysiert, und die Fraktionen der Verbindung (B) wurden gesammelt. Dann wurde die Fraktion durch eine Säule_> mit einer Füllung von 3 Liter Dowex 5OW (ti Typ) gegeben. Der Ablauf wurde mit den Waschwasser kombiniert. Das Gemisch wurde unter vermindertem Druck bei 50° C eingeengt und gefriergetrocknet.

Das Produkt wurde weiter gereinigt unter Verwendung des Prep LC/ Systems 500, Hersteller: Waters Co., fSäule: Prepack-500/C^g, Lösungsmittel: Gemisch aus Methanol und 0,01M Natriumacetatpufferlösung von pH 4 (15 : 85 im Volumenverhältnis)J.

Die Fraktionen der Verbindung (B) wurden gesammelt, durch eine Säule mit einer Füllung aus 3 Liter Diaion HP.20 geleitet, und nach dem Waschen mit V/asser wurde das Produkt mit wässeriger 3O?oiger Acetonlösung eluiert. Die Fraktionen wurden analysiert mittels HPLO. Die Fraktionen, die die Verbindung (B) enthielten, wurden gesamne! t. Nach ieir Einenger unter vernindertem Druck bei 50° C wurde die Fraktion gefriergetrocknet_t Es warden 26 g PuHνer aus Verbindung (B) erhalten.

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ORIGINAL INSPECTED

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Dann wurden VOO irg des Pulvers der Verbindung (B) unter.- Verwendung von IiPLCM Säule: rostfreie Stahl s>iuü ο 5 rm χ 1 Met ex·, gefüllt mit Bondapack C-,ο Fcracil, Lösungsmittel: Acetonitril : Essigsäure : v/ar.prr (10 : 0,2 : 90 im Volurcen-verhältnis) J gereinigt.

Die Frakti cr.c.·;, die- öi.-i Verbindung (E) enthielten, wurden gesammelt und unter YerrindcrteiT Lruck bei 40 C eingeengt, um Acstonitril r;u entfernen, Dann wurde die Fraktion durch eine Säule rn.it einer .Füllung aut 10 ml jliaion HF.20 gegeben. Nach den: Waschen mit Wasser v/arde das Produkt mit wässeriger 30^f;ciger AcetonlÖGung eluiert. Die Fraktionen, die die Verbindung (B) enthielte:"., nachgev.'iesen durch J-IPLC, wurden gesandelt, xinter verminderte!). Druck bei 40 C eingeengt und gefriergetrocknet. Eac gefriergetrocknete Produkt v/ui'de 4 Stunden bei 55° C weiter im Vakuurj. getrocknet. Es wurden 55 mg weißes Pulver der reinen Verbindung (3) erhalten.

Beispiel 8

Aus 2,5 Liter der Lesung, die die Verbindung (A) enthielt und Im Beispiel 6 erhalten wurde, wurden 10 ml der Lösung abgetrennt und gefriergetrocknet. Dann vmrde das so' gebildete Pulver in 2 ml Wasser aufgelöst. 200 ml Aceton-Vurden zu der Lösung hinzugegeben. Dadurch wurde die Lösung weiß trüb. Die Lösung wurde jedoch durch Zugabe von 0,6 ml konzentrierter Chlorwasserstoffsäure klar. Kacii Bestätigung, daß Verbindung (A) in die Verbindung (C) umgewandelt worden war mittels Analyse mit HPLC, wurde das pH der Lösung auf 2 eingestellt durch Zugabe von 4 η Natriumhydroxidlösung und Filtrieren mit einen Glasfilter. Las Filtrat wurde unter vermindertem Druck bei 40° C eingeengt und gefriergetrocknet. Εε wurder. 300 mg Pulver erhalten.

Dann wurde das Produkt unter Verwendung von HPlC weiter gereinigt. fsäule: rostfreie Stahlsäule 8 mm χ 1 Meter, gefüllt mit Bondapack Cj₈ Poracil, Lösungsmittel: Methanol : Essigsäure : Wasser (23 : 0,1 : 77 im Volumenverhältnis), Säulentemperatur: 20°

Die Fraktionen, die die Verbindung (C) enthalten, wurden gesain-

dertem Druck bei 030045/0870

melt und unter vermindertem Druck bei 40° C eingeengt, um Methanol

ORIGINAL INSPECTED

zu entfernen, i-ifich Einstellen des ρB auf 5,0 mittels 4 η Onlorv;a£serstoff.-iiVure värde die Losung durch eine Säule mit einer I¹U]lung ans 7 ml Inaion EP.20 gegeber.. Nach dem War:el on mit Wasser wurde ö^s Yv^(-\:]- {. r,i t y.äsrcrriger 30#igcr Aoetcnlöiung eluiert. Die ?rak tlc:?on ;:ν.ι·.ί;- ι inlctelo HPLC annlyr.i er t. So wurden die Fraktionen, die d ■; r ^; ■·'..'Lv-v.-ng (C) enthielten, gesammelt, unter vermodertem I>-lu.': ' ;.i. ·;("/' (J eingeengt, gefriergetrocknet und im Vakuum 4 Stund .;-:·: hei 55 C getrocknet. Eh wurden 55 mg weißes Pulver aus reinur Verbindung (C) erhalten.

Beispiel 9

Ein g von 26 g des gefriergetrockneten Pulvers der v'erbindung (B), erhalten im Beispiel 7, wurde in 4,^ ml Wasser aufgelöst. Dann wurde 594 ml Aceton zu der Lösung hinzugefügt. Dadurch wurde die Lösung weiß trübe, jedoch wurde die Lösung durch Zugabe von 0,6 ml konzentrierter Chlorwasserstoffsäure klar. Kach der Bestätigung, daß die Verbindung (3) in die Verbindung (D) überführt worden war, durch JlPLC, wurde das pH der Lösung auf 2 mit 4 η NatriurrihydroxidlöGung eingestellt. Das Gemisch wurde cUirch ein Glar.filter filtriert. Das Piltrat wurde unter vermindertem Druck bei 40° C eingeengt, uir. .Aceton daraus zu entfernen. Dann wurde mit 100 ml Wasser und 10C ml Äthylacetat vermischt, anschließend wurde durchgeschüttelt. Die Athylacetatschicht wurde abgetrennt und mit 100 ml gesättigter liatriumchloridlöcung gewaschen. Es wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, dann unter vermindertem Druck bei 40° C eingeengt.

Dann wurde das produkt mittels Si]ikagelsäulenchrcraatographiß gereinigt.

Das vorstehend genannte Rilver wurde in einer kleinen Menge Methanol aufgelöst und in einer Säule, gefüllt mit 100 ml SiIikagel, präpariert mit einem Gemisch aus η-Hexan und Äthylacetat (1 : 3 im Volumenverhältnis) adsorbiert. Das so adsorbierte Produkt wurde mit einem Gemisch aus η-Hexan und Äthylacetat (1 : und dann 1 : 9 im Volurnenvor'nältni.s) eluiert. i-Iach der Analyse durch IiPLC wurden die Fraktionen, die die Verbindung (D) enthielten, gesammelt, unter vermindertem Druck eingeengt und durch Silikagelsäulenchromatographie unter verwendung des vorstehend

0300U/0B7Ö

ORIGINAL INSPECTED

genannten Lösungsmittelsystems gereinigt. Hierzu wurde das getrocknete Produkt in einer kleinen Menge Methanol aufgelöst, in eine Säule, gefüllt mit 75 ml Silikagel, präpariert mit einem Gemisch aus n-Kexan und Äthylacetat (1 : 3 im Volumenverhältnis), adsorbiert. Das Produkt wurde dann zeit einem Gemisch aus n-Iiexan und Äthylacetat (1 : 3,1 : 6 und dann 1 : 9 im Yolumenverhältnis) eluiert. Nach der Analyse durch HPLC wurden die reinen Fraktionen der Verbindung (D) gesammelt. Die Fraktion wurde unter vermindertem Druck bei 40° C bis auf 3 ml eingeengt. Nach Zugabe von etwa 5 ml Wasser zu der Fraktion wurde diese weiß trüb. Die Fraktion wurde weiter unter vermindertem Druck bei 40 C eingeengt, gefriergetrocknet, im Vakuum 4- Stunden bei 55° C nachgetrocknet. Es wurden 53 mg v/eißes Pulver aus reiner Verbindung (D) erhalten.

Beispiel 10

Unter Rühren eines Gemisches aus 0,35 ml destilliertem Wasser, 0,15 ml konzentrierter Chlorwasserstoffsäure und 49 ml Äthylacetat bei Zimmertemperatur wurden 200 mg der Verbindung (B) zu dem Gemisch hinzugefügt und über Nacht durchgerührt. Das Reaktionsgemisch wurde zweimal mit je 50 ml wässeriger gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, danach wurde unter vermindertem Druck eingeengt. Es wurden 147 mg (Ausbeute 88,0%) der rohen Verbindung (D) erhalten. Das Produkt wurde unter Verwendung von Silikagelsäulenchromatographie gereinigt und ein Gemisch von η-Hexan und Äthylacetat (1 : 9 im Volumenverhältnis) eingesetzt. Kernmagnetisches Resonanzspektrum (DMSO-D^) (f-Wert (ppm):

1,76 (2H, 3"-0H₂, Multiplett), 2,24 (4H, 2",4"-CH₂, Multiplett), 3,36 (3H, 7-OCH₃, Singlett), 3,52 (2H, 2-CH₂, Quartett), 4,88 (2H, 3-CH₂, Quartett), 5,12 (Hl, 6-CH, Singlett). 6,34
7,52
6,74
7,50

WXlQ f ^ IHCAJL l/t- V Uy j ^/ j I C- ^ I ü | \J \J Ii ψ LJ-L.J..

AE₉CL-CR, Doublett, j _{= 16>O H} \

\1H, ß-CH, Doublett, /

/2H, 3',5'-CII, Doublett, j _{= 8>0 fi} \

\2H, 2',6'-CK, Doublett, /

030045/0670

Beispiel 11

a) Zu 18 ml Acetonitril wurden 1,488 g der Verbindung (D), erhalten im Beispiel 10, zugefügt. Nach Zugabe von 0,4 g 5-Meroapto-1-inethyltetrazol wurde das Gemisch 22 Stunden "bei 80° C durchgerührt. Las Reaktionsgemisch wurde unter vermindertem Druck bis auf etwa 1 ml eingeengt, und 10 ml Äthylacetat wurden zu dem Rückstand hinzugefügt. Es wurde anschließend durchgerührt, um Kristalle aus 7ß-(4-Carboxybutyramido)-7°^-methoxy-3-(1-methyltetra7,ol-5-yl)thiomethyl~ Λ -cepheni-^-carbonsäure zu bilden, die durch Filtration abgetrennt, mit Äthylacetat gewaschen und getrocknet wurden. Die Ausbeute betrug 475 mg.

b) Das Filtrat wurde mit der Waschflüssigkeit vereinigt. Dann wurde unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde in 30 ml Methylenchlorid dispergiert. Dam: wurde 1,5 g Diphenyldiazomethan zu der Dispersion hinzugegeben und das Gemisch über Nacht bei Zimmertemperatur durchgerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter vermindertem Druck eingeengt und einer Silikagelsäulenchromatographie unterworfen. Das Produkt wurde unter Anwendung eines Gemisches aus n-Eexar; und Äthylacetat (1 : 1 im Volum^nverhältnis) eluiert. Die Eluate wurden vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt. Es wurden 581 mg 7ß-(4-Caiⁱboxybutyra3iido)-7oC-methoxy-3-(1-methyltetrazol-5-yl)thiomethyl- /\ -cephem-4-carbonsäurebiK(diphenylmetLyl)ester erhalten.

Beispiel 12

a) In 15 ml Acetonitril wurden 520 mg Verbindung (D), erhalten im Beispiel 10, aufgelöst. Nach Zugabe von 160 mg 2-Mercapto-5-methyl-1,3,4-thiadiazol wurde das Gemisch auf 80° C für 6 Stunden unter Rühren erhitzt. Nach beendeter Reaktion wurde das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck eingeengt bis das Volumen etwa 1 ml betrug. Dann wurde 20 ml Äthylacetat zu dem Rückstand gegeben. Die gebildete 7ß-(4-Carboxybütyramido)-7<?t methoxy-3-(5-methyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-A -cephem-4-carbonsäure wurde durch Filtration abgeschieden, mit Äthylacetat gewaschen und getrocknet. Es wurden 34 mg erhalten.

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Kernmagnetisches Resonanzspektrum g

Ü-Wert (ppm):

1,76 (2H, 3"-CH₂, Multiplett, 2,24 (4H, 2",4"-CH₂,Multiplett), 2,66 (3H, CH^ Thiadiazole Singlett), 3,36 (3H, 7-OCH₅, Singlett), 3,56 (2H, 2-CH₂, Quartett), 4,32 (2H, 3-CH₂, Quartett), 5,03 (1H, 6-CH, Singlett).

b) Das vorstehend genannte Filtrat wurde mit der Waschflüssigkeit vereinigt. Nach dem Einengen desselben unter vermindertem Druck wurde der Rückstand in 15 ml Methylenchlorid dispergiert. Nach Zugabe von 1,0 g Diphenyldiazomethan wurde das Gemisch über Nacht bei Zimmertemperatur durchgerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde mittels Silikagelsäulenchromatographie adsorbiei't. Das adsorbierte Produkt wurde unter Verwendung eines Gemisches aus η-Hexan und Äthylacetat (1 : 1 im Volumenverhältnis) eruiert. Die Eluate wurden vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt. Es wurden 172 mg 7ß-(4-Carboxybutyramido)-7<*' methoxy-3-(5-methyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl- Λ -cephem-4-carbonsäure-bis(diphenylmethyl)ester erhalten.

Fig. 1, 2 und 3 geben das Ultraviolettabsorptionsspektrum bsw. Infrarotabsorptionsspektrum und kernmagnetisches Resonanzspektrum der Verbindung (A) wieder.

Fig. 4, 5 und 6 stellen das Ultraviolettabsorptionsspektrum bzw. Infrarotabsorptionsspektrum und kernmagnetische Resonanzspektrum der Verbindung (B) dar.

Fig. 7, 8 und 9 zeigen das Ultraviolettabsorptionsspektrum bzw. Infrarotabsorptionsspektrum und kernmagnetische Resonanzspektrum der Verbindung (C).

Fig. 10, 11 und 12 verdeutlichen das Ultraviolettabsorptionsspektrum bzw. Infrarotabsorptionsspektrum und kernmagnetische Resonanzspektrum der Verbindung (D).

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- κ-

Leerseite

Claims (10)

1. Patentansprüche:

   R₁-(CH₂)^-Co:;;-:--—{—-

   OH₀OOGCH-GH

   ,0R,

   COOK

   worin R₁ eine Carboxygruppe oder eine ^-Aminocarboxymethylgruppe bedeutet und R₂ ein Wasserstoffatom oder eine Sulfogruppe darstellt oder deren Salze.
2. 2. 7et-Methoxycephalosporinderivate oder deren Salze nach Anspruch 1, wobei diese Derivate aus 7ß-(D-5-Amino-5-carboxy-

   valerarnido)-7°C-methoxy-3-(p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-^>' ^/l -cephem-4-carbonsäure bestehen.
3. 3. 7'■<-Methoxycephalosporinderivate oder deren Salze nach Anspruch 1, wobei diese Derivate aus 7ß-(D-5-Araino-5-carboxyvaleramido)-3-(p-hydroxycirinaraoyloxyraethyl)-7öi:-methoxy- ^ -cephem-4-carbonsäure bestehen.
4. 4. 7et-Methoxycephalosporinderivate oder deren Salze nach Anspruch 1, wobei diese Derivate aus 7ß-(4-Carboxybutyrarnido)-7 et- -methoxy-3-(p-sulf ooxycinnamoyloxymethyl)- A³-cephem-4-carbonsäure bestehen.
5. 5. 7<* -Methoxycephalosporinderivate oder deren Salze nach Anspruch 1, wobei diese Derivate aus 7ß-(4-Carboxybutyramido)-3-(p-hydroxycinrtaaoyloxymethyl)-7«< -methoxy-A³-cephem-4-carbonsäure bestehen.
6. 6. Verfahren zur Herstellung von 7<-Methoxycephalosporinierivaten der allgemeinen Formel

   030 CH 5/0570

   ORIGINAL INSPECTED

   R₁-CCHo)₃-COKH J—

   CH₂OOCCH=CH-

   COOIi

   worin R.. ein« Carboxygruppe oder eine σ^-Aminocarboxymethylgruppe bedeutet und Rp ein Wasserstoffatom oder eine Sulfogruppe darstellt, dadurch gekennzeichnet, daß Stämme vom Genus Streptomyces, die zur Herstellung von cephalosporinderivaten der Formel

   OCE-

   HOOC-CH-CCH₂),-COKH

   Kh₂

   COOH

   fähig sind, in Gegenwart oder in Abwesenheit von Hydroxyzimtsäure gezüchtet werden, gegebenenfalls die Reaktion mit dem Mycel eines D-Aminosäure oxidierenden Enzym herstellenden Stammes oder dessen behandelten Mycels durchgeführt wird und die Hydrolyse des Schwefelsäureesters in gewünschter Reihenfolge ausgeführt wird. ·*
7. 7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als zum Genus Streptomyces gehörenden Stämme Streptomyces organonensis Saito und Osono Y-G19Z Stämme eingesetrt werden.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als D-Aminosäure oxidierende Enzym herstellende Stämme Trigonopsis variabilis IFO-0755 oder IFO-0671 eingesetzt wird.
9. 9. Verfahren zur Herstellung von 7ß-(4-Carboxybutyramido)-3-(phydroxycinnamoyloxymethyl)-7 °(-methoxy-& -cephem-4-carbonsäure der Formel

   QCH,

   HOOC-C CH₂)--CCNH r

   '"^X ^CHoOOCCH =

   COOH

   0300U/OB70

   — '5 —

   dadurch gekennzeichnet, daß ein Stroptcmyces organonensir-Saito iind Osono Y-G 19 Z Stamm, der zum Genus Streptoinyces gehört, in Gegenwart von p-Hydroxyzimtsäure gezüchtet wird, um 7ß-(D-5-AFiino-5-earboxyvaleramido)-7 jC-methoxy-3-(p-£ulf ooxycinnamoyloxj ;:i3tV:yi)- A'°-cephem-4-carbonsäure der Formel

   HOOC-CK-(CH₂) ,-COi;H- ' ^

   COOH

   herzustellen und dann darauf ein D-Aminosäure oxidierendes Enzym einwirken läßt, hergestellt durch Trigonopsis variaMlis, und den Schwefelsäureester in einer gewünschten Reihenfolge hyuroly.siert.
   
10. 10. Arzneimittel, enthaltend eine Verbindung nach Anspruch 1.

    0300A5/0570