DE2422374A1 - Cephalosporine - Google Patents

Cephalosporine

Info

Publication number
DE2422374A1
DE2422374A1 DE2422374A DE2422374A DE2422374A1 DE 2422374 A1 DE2422374 A1 DE 2422374A1 DE 2422374 A DE2422374 A DE 2422374A DE 2422374 A DE2422374 A DE 2422374A DE 2422374 A1 DE2422374 A1 DE 2422374A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
enzyme
iron
solution
carboxylic acid
mmol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE2422374A
Other languages
English (en)
Inventor
Ian Dunlop Fleming
Eunice Jean Napier
Michael Keith Turner
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Glaxo Laboratories Ltd
Original Assignee
Glaxo Laboratories Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Glaxo Laboratories Ltd filed Critical Glaxo Laboratories Ltd
Publication of DE2422374A1 publication Critical patent/DE2422374A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
    • C12P35/02—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin by desacylation of the substituent in the 7 position
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/847—Erwinia

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Die Erfindung betrifft die Verbesserung von Methoden zur N-Entacylierung von 7ß-Acylamido-cephalosporinderivaten, unter Verwendung von Enzymen.
Die in der vorliegenden Beschreibung erwähnten Cephalosporinverbindungen werden unter Bezugnahme auf "CEPHAM" (vergl. J.Am.Chem. Soc. 1962, 84, 32K)O) bezeichnet. Der Ausdruck "CEPHEM" bezieht sich auf die Cepham-Grundstruktur mit einer einzigen Doppelbindung.
7ß-Acylamido~cephalosporinderivate können durch Fermentationsmethoden oder als Produkte der Ringexpansion von Penicillinderivaten erhalten werden, und die entsprechenden 7ß-Aminoderivate v/erden gewöhnlich durch N-Entacylierung der erhaltenen Cephalosporinderivate hergestellt. Es ist bekannt, dass die reine chemische N-Entacylierung hochspezifische Reagentien und Bedingungen erforderlich macht, die zum Teil auf der Instabilität des ß-Lactamrings und zum
409847/1 157
Teil auf der Natur der 7ß-'Acylamidogruppe beruhen. Chemische N-Entaeylierungsverfahren, die komerziell entwicklungsfähig sind, sind im allgemeinen vielstufige Verfahren, die die Verwendung einer Anzahl von Reagentien in einer Reaktionsfolge erfordern. Chemische Verfahren zur N-Entacylierung sind nicht allgemein geeignet zur Anwendung auf die Behandlung von Cephalosporinen mit ungeschützten ^-Carboxylgruppen, wohingegen Enzymmethoden für derartige Reaktionen verwendet werden können.
Enzyme, die die Acylamidoseitenketten von Penicillinen und anderen Amiden hydrolisieren, sind bekannt, und es wurden viele Organismen gefunden, die solche Enzyme produzieren. Diese Amidohydrolase Enzyme sind verbreitet klassifiziert durch- ihre Aeylamidospezifität, ihr pH-Optimum und ihre Quelle. Es wurde jedoch allgemein beobachtet, dass bakterielle Enzyme dieser Art am wirksamsten zur Katalyse der Hydrolyse von Phenylacetamidogruppen (optimal bei einem pH-Wert von etwa 7) geeignet sind, wohingegen fungale Enzyme dieser Art am wirksamsten zur Katalyse der Hydrolyse von Phenaxyacetamidogruppen (optimal bei einem pH-Wert von etwa 10) sind. Ein weiteres Charakteristikum der Enzyme dieser beiden Typen war der relativ hohe Produkt-Inhibitions-Grad, den sie entwickeln, eine Tatsache, die für ihre industrielle Anwendung nachteilhaft ist.
Vandamme et al, Ann. Inst. Pasteur (1971), 121, (4), 435-446 haben in jüngerer Zeit berichtet, dass Penicillin V (Phenoxymethylpenicillin) bei niedrigem pH-Wert durch ein bakterielles Enzym entacyliert werden kann. Bei ihren Untersuchungen zeigte es sich, dass Penicillin V durch eine Suspension von Erwinia aroideae Zellen bei einem pH-Wert von etwa 5 hydrolisiert wird, was mit einer Reacylierung der resultierenden 6-Aminopenicillansäure einher geht.
Es- wurde nun gefunden, dass die N-Entacylierung von 7&-Phenoxyacet-' amidocephalosporinen bei einem optimalen pH-Wert im leichtsauren Bereich ohne wesentliche Reacylierung des resultierenden-7ß-Aminocephalosporins, unter Verwendung von zellfreien bakteriellen Enzymen durchgeführt werden kann. Es wurde Jedoch gefunden, dass es zur Erzielung von zufriedenstellenden Ausbeuten mit zellfreiem
409847/1157
Material notwendig ist, das zellfreie Enzym in Lösung während der N-Entacylierung zu stabilisieren, um das Enzym in einem für die " erfolgreiche Entacylierung notwendigen Zeitraum ausreichend aktiv zu halten.
Es lässt sich erkennen, dass es allgemein ausgedrückt, ratsam ist, die N-Entacylierung von Tß-Phenoxyacetamidocephalosporinen bei einem neutralen oder leichtsauren pH-Wert durchzuführen, um die Zerstörung des ß-Lactamrings zu vermeiden, was im Gegensatz zu der Verwendung eines pH-Wertes von etwa 10 steht, der bei der ,- . Verwendung von fungalen Enzymen angewendet wird.
Gemäss der Erfindung wird daher ein Verfahren zur N-Entacylierung eines 7ß-Phenoxyacetamidocephalosporins geschaffen, welches darin besteht, das Cephalosporin der Einwirkung eines Amidohydrolase- . enzyms zu unterziehen, das sich von einer bakteriellen Quelle ableitet, das frei von Zellen und schädlichen Enzymen ist, das in Lösung durch die Abwesenheit von Eisen-II-Ionen stabilisiert ist, und das wirksam zur Bewirkung einer optimalen N-Entacylierung bei einem pH-Wert von 3*5 bis 6,5 ist. Das resultierende 7ß-Aminocephalosporin kann danach extrahiert und isoliert werden.
Ein Enzym, das besonders geeignet für das erfindungsgemässe Verfahren ist, leitet sich von Erwinia aroideae ab, obwohl Enzyme, die sich von anderen Bakterienspezies ableiten, und die bei einem pH-Wert von 5,5 bis 6,5 wirksam sind, auch mit Erfolg verwendet werden können.
Bei der Herstellung von zellfreien Extrakten des Organismus können die Zellen gelagert werden und Ailmpfungen (Inocula) auf übliche Weise hergestellt werden. Die Zellen können anschliessend in einem konventionellen Kulturmedium aufgezogen werden, das z.B. Quellen für Stickstoff, Kohlenstoff, Wasserstoff, S uerstoff, Phosphor, Schwefel und Mineralien in Walser umfasst, wobei der pH-Wert vor der Autoklaven Behandlung eingestellt wird. Die Kolben werden während einer geeignet langen Zeit unter Rotation inkubiert, und die Zellen werden z.B. durch Zentrifugieren aus der Kulturflüssigkeit gewonnen und vor·dem Aufbrechen-gewaschen. Die Zellen können
409847/1157
anschliessend in einem Puffer suspendiert und zerstört werden, z.B. durch Ultraschall oder durch Vermählen beispielsweise mit Glasperlen. Die Zellbruchstücke werden aus-dem resultierenden Material, beispielsweise durch Zentrifugieren, entfernt, wobei ein Extrakt zurückbleibt, der die Amidohydrolase enthält. Dieser kann, falls gewünscht, durch weitere übliche Methoden gereinigt werden. '
Es wurde gefunden, dass es wesentlich ist, das Enzym mit Eisen-II-Ionen zu stabilisieren. Das zellfreie Enzym verliert eine wesentliche Menge seiner Aktivität während der N-Entacylierung, wenn diese nicht vorhanden sind. Interessanterweise wurde festgestellt, dass Eisen-II-Ionen für diesen Zweck einzig möglich zu sein scheinen. .Darüberhinaus ist es nicht üblich, Amidohydrolasen mit Ferroionen zu stabilisieren. Sie können vor oder nach dem Brechen der Zellen wünschenswert in Form eines wasserlöslichen, nicht chelierten Eisen-II-Salzes, z.B. von Eisen-Il-Sulfat oder Eisen-II-Ammoniumr-Sulfat zugesetzt werden. Die Ei sen-II-Ionen werden vorzugsweise in einer Konzentration von 0,1 bis 1,0 mMol, z.B. etwa 0,2 mMol zugesetzt. Der optimale Punkt der Zugabe kann durch einfache Untersuchung festgestellt werden. Es 1st Jedoch wichtig, dass der pH-Wert der Lösung nach ihrer Zugabe unter etwa 6,5 gehalten wird, so dass die Erzeugung von Eisen-III-Ionen, die einen Inhibitoreffekt auf das Enzym ausüben, auf ein Minimum herabgesetzt wird.
Die Aktivität des Enzyms kann durch den Zusatz eines Aktivators zu der Enzymlösung verbessert werden, beispielsweise eines Thiols, z.B. Dithiothreit , Dithioerythrit , ß-Mercaptoäthanol, Cystein, Glutathion oder Lipo n.säure (wie z.B. Lithiumlipoat) oder Ascorbin säure.
Die Aktivität der Amidohydrolase kann durch Inkubieren einer quantitativ bekannten Menge von Substrat und Enzym bei dem pH-Wert der Reaktion, gefolgt von einem Ablöschen, bzw. Abschrecken, isolieren des gebildeten Cephalosporins und seiner Bestimmung,untersucht werden. Eine Aktivitätseinheit ist die Menge Enzym, die 1 Substrat pro Minute unter den definierten Bedingungen hydrolisiert. Es wurde gefunden, dass je ein ml Erwinia aroideae-Brühe etwa 5 Enzymeinheiten ergibt.
409847/1157
Gemäss einer Äusführungsform der Erfindung kann 3-Methyl-7ß-phenoxyacetamidoceph-3-em-4-carbonsäure mit der aus Erwinia aroideae abgeleiteten Amidohydrolase und Eisen-II-Ionen bei einem pH-V/ert von 4,5 bis 6,5, vorzugsweise von 5*0 bis 6,0, z.B. bei 37°C während zwei Stunden, inkubiert werden. Das Puffern der Reaktionslösung auf den genauen pH-Wert kann durch Verwendung von beispielsweise dem Alkalimetallsalz einer organischen Säure, wie Natriumacetat oder Kalium-3,3-dlnteithylglutarat erzielt werden. Die Reaktion kann in üblicher Weise abgeschreckt werden, beispielsweise durch Erwärmen auf 1000C während 5 Minuten und anschliessendes Kühlen der Mischung oder durch Kühlen im Eis. Coaguliertes Protein, kannabzentrifugiert und die überstehende Lösung konzentriert werden. Die Lösung wird vorzugsweise in eine Säule mit einem stark basischen quaternären Ammoniumanion-Austauscherharz, z.B. Dowex-1, vorzugsweise in der Acetatform eingebracht, von wo das Produkt mit einem Eluierrnittel, beispielsweise einer wässrigen Lösung von Ammoniumacetat, eluiert wird.
Dieses Eluat, das die 7ß-Amino-3-methylceph-3-em-4-carbonsäure enthält, kann zur Trockne verdampft und der Rückstand in Wasser gelöst werden. Durch Einstellen des pH-Wertes mit wässriger Säure, vorzugsweise HCl, auf etwa den isoelektrischen Punkt, d.h. 3*5* fällt die 7ß-Amino-3-methylceph-3-em-4-carbonsäure aus. Diese kann· anschliessend abfiltriert und gewaschen werden, z.B. mit Aceton. Alternativ kann die 7ß-Amino-3-methylceph-3-ei'n-4-carbonsäure direkt aus dem Eluat durch Einstellen des pH-Werts auf etwa den isoelektrischen Punkt ausgefällt werden. Es hat sich gezeigt, dass die 7ß-Amino-3-methyleeph-3-eni-4-carbonsäure keine Inhibitorwirkung auf das Erwinia aroideae-Enzym bei seinem optimalen pH-Wert in bedeutendem Ausmasse ausübt.
Das Enzym kann direkt als eine wässrige Lösung zu der zu'katalysierenden Reaktionslösung gefügt werden. Es kann auch in fester Form, die beispielsweise durch Gefriertrocknen erhalten wurde, zugesetzt werden. Darüberhinaus kann das Enzym in einer immobilisier-
in ·
ten· Fornfoder auf einer geeigneten Matrix verviendet werden. Diese kann eine, Vielzahl von Formen, annehmen, die beispielsweise den Einschluss bzw. die Occlusion oder Adsorbtion des Enzyms in eine
409847/1157
Matrix, beispielsweise ein Glas oder ein künstliches Polymeres, z.B. Cellulosetriacetat in Faserform, oder Unlöslichmachen auf einer Membrane umfassen. Solche immobilisierten Formen sind beispielsweise in der britischen Patentschrift 1 221J- 947 und der belgischen Patentschrift 782 646 beschrieben.
Obwohl mit dem Enzym unter üblichen wässrigen Bedingungen bei einem pH-Wert von 3*5 bis 6,5 gearbeitet v/erden kann, wurde ge-,funden, dass wenn das Enzym immobilisiert in oder auf einer geeigneten Matrix ist, das Reaktionsmedium einen leicht höheren pH-Wert, nämlich etwa pH 7 bis 8 haben kann.
Die folgende Methode kann zur Bestimmung der Amidohydrolaseakti-. vität verwendet werden. Das Verfahren gleicht im wesentlichen dem der Erfindung. Eine Aktivitätseinheit kann als die Menge Enzym definiert werden, die ein pMol 3-Methyl-7ß-phenoxyacetamidoeeph- -3-eni-4-carbonsäure pro Minute unter den folgenden Bedingungen hydrolisiert:
Ein System (Digest) enthält 20 μΜοΙ 3-Methyl-7ß~phenoxyacetamidoceph-3-em-4-carbonKäure, I5 liMol Essigsäure, mit Natriumhydroxyd auf den pH-Wert 5 eingestellt, 50 juMol Eisen-II-SuIfat,
o1 Dithiothreitol und Enzym in einem Gesamtvolumen von 0,25 ml.
Nach dem Inkubieren während 15 Minuten bei 37 C wird das System durch Erwärmen während 5 Minuten auf 1000C gestoppt, und der Niederschlag wird abfiltriert, 0,5 ml lm-Essigsäure wird zu der überstehenden Flüssigkeit gefügt und die Mischung wird in eine 2,5 χ 0,6 cm Säule mit Dowex- 1x8-Acetat 0,074-0,OJT ram (Korngrösse = 200-400 Mesh) gefüllt. Die während der Hydrolyse freigesetzte 7ß-Amino- -3-methylceph-3-em-4-carbonsäure wird mit 5 ml lm-Essigsäure eluiert. Das Gesamteluat wird mit lm-Essigsäure auf 6 ml aufgefüllt, und die Menge an 7ß-Amino-3-methylceph-3-em-4-carbonsäure durch ihre Absorbtion bei 260 nm ermittelt. Der Koeffizient der molaren Extinktion dieser Verbindung bei 260 nm in lm-Essigsäure wird als
■2 11
7,6 χ Kr Liter.Mol." .cm" angenommen.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung ohne sie zu beschränken:
409847/1157
Beispiel 1 Herstellung von 7ß-Amino-3-methylceph-3-em-4-carbonsäure
a) Erwinia aroideae IJRRL B-138, ATCC 25206 wurden in 250 ml Schüttelflaschen mit Scheidewänden, die 50 ml Kulturmedium enthielten, bei pH-Wert 7*3* unter Verwendung eines 1^-igen Inoculums, einer 24 stündigen Nährbrühen-Kultur grossgezogen. Jeder Liter des Produktionsmediums enthielt 5 g Pepton (Evans Medical Co. Ltd.), · 3 g Natriumchlorid,, 20 g Sucrose, 8 g Oxoid Jjab. Lernco und 5 g Oxoidhefeextrakt. Die Kolben wurden 40 Stunden bei 28° inkubiert, wobei sie mit 220 U/Min, geschüttelt wurden. Die Zellen aus 5 1 Medium wurden durch Zentrifugieren gesammelt und mit 0,05 m-Phosphatpuffer bei pH 6,8 gewaschen. Nach dem Suspendieren der Zellen in 600 ml 0,05 m-Phosphatpuffer vom pH 6,8, der 0,2mMol FeSO^ und 5 mMol ß-Mercaptoäthanol enthielt, wurden sie durch Schalleinwirkung gebrochen.
Die Zellrückstände wurden durch Zentrifugieren entfernt und Cetyltrimethylammoniumbromid wurde zu der überstehenden Lösung, unter Bildung einer Endkonzentration von 1 % gefügt. Der Niederschlag . wurde abzentrifugiert und ausreichend FeSOh wurde zugefügt, um der überstehenden Flüssigkeit eine Endkonzentration von 2 mMol zu verleihen. Der pH-Wert des Extrakts wurde anschliessend mit Essigsäure auf 4,5 gesenkt. Das Protein, das ausfiel, wurde abzentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wurde gegen 50 mMol Acetatpuffer vom pH-Wert 5, der 0,2 mMol FeSO^ und 5 mMol ß-Merr captoäthanol enthielt, dialysiert. Nach der Dialyse enthielt der Extrakt etwa 7 Einheiten Amidohydrolase pro ml.
b) 10 g (27 mMol) 3-Methyl-7ß-phenoxyacetamidoceph-3-em-4-carbonsäure wurden in 250 ml Wasser bei 37° hydrolysiert. Das Wasser enthielt auch 30 mMol mit NaOH auf den pH-Wert 4,5 eingestellte Essigsäure, 100 ^iMol FeSO1^, 1,4 mMol ß-Mercaptoäthanol und 1350 Einheiten der Amidohydrolase. Nach zwei Stunden wurde die Mischung während 5 Minuten auf 100°C erwärmt und anschliessend mit KOH auf den pH-Wert 7 eingestellt. Koaguliertes Protein wurde bei 800 g während 5 Minuten zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde auf 100 ml konzentriert und in eine Dowex-1-Acetatsäule
400847/1157
von 15 x 2,5 cm geleitet. Die Tß-Amino-J-methylceph-^-era-^-carbonsäure wurde mit Im-Ammoniumacetat eluiert.
Die Eluatfraktion, die die 7ß-Amino-3-methylceph-3-em-4-carbonsäure enthielt, wurde zur Trockne verdampft und das Ammoniumacetat im Vakuum entfernt. Die 7ß-Amino-3-methylceph-3-em-4-cart)onsäure wurde anschliessend in 100 ml Wasser vom pH-Wert 8 gelöst. Der pH-Wert dieser Lösung wurde mit 5n-HCl auf 3*5 gesenkt. Der Peststoff, der bei 0° ausfiel, wurde abfiltriert, mit kalter Im-molarer HCl, Aceton und Äther gewaschen und anschliessend getrocknet. 3*75 g Feststoff, die 16 mMol Tß-Amino-^-methylceph-J-em-^-carbon-• säure enthielten, wurden gewonnen (Ausbeute 59 %).
Das "Produkt wurde durch Papierchromatographie identifiziert. Whatman j5 MM Papier wurde mit 50 m-molarem Phosphat (5*9 g Kaliumdihydrogenphosphat, I85 g Dinatriumhydrogenphosphat pro Liter) auf den pH-Wert 6 gepuffert. Nachdem die organische Phase einer Butan-l-ol: Äthanol .-Wasser (4:1:5 Vol./Vol.) Mischung über Nacht das Papier herabgelaufen war, erscheint das Produkt als UV-Absorbtionsfleck. Dieser Fleck wird mit Ninhydrin braun gefärbt und hat den gleichen Rf-Wert wie authentische 7ß-Amino-3-methylceph- -3-em~4-carbonsäure. Ein Vergleich der UV-, IR- und NMR-Daten der isolierten und authentischen Verbindung bestätigt die Identität.
Beispiel 2
Herstellung von ^-Methyl-Tß-aminocephQ-em-^-carbonsäure, unter Verwendung von Cellulosetriacetatfasern, die eine Amidohydrolase, abgeleitet von Erwinia aroideae, enthalten.
a) Erwinia aroideae Zellen NRRL B-I38 ATCC 25206 werden aus I30-140 Litern einer Fermentations-Ernte-Brühe durch Zentrifugieren bei 63OO U/Min., unter Verwendung einer Westfalia K02006 Kammer-Schalentypventfernt. Die Zellen (etwa 4 kg) werden zu 10 % (Gew,-VoI.) in kaltem (5°C) 20 m-molarem Imidazol-HCl-Puffer vom pH-Wert 5,0, der 2 m-molares Eisen-II-Ammoniumsulfat (0,8 g/l) und 5 m-
4098Λ7/1157
molares ß-Mercaptoäthanol (0,35 ml/l) enthielt, unter Verwendung eines Silverson AX-Mischers, während 15 Minuten suspendiert.
Die Bakterienzellen werden anschliessend durch 3 maligen Durchs lauf durch einen A. P.V. Homogenisator vom Typ KF5 bei 492-562 kg/cirr (7500-8000 PSI-) gebrochen, wobei der Abstrom durch Hindurchleiten durch einen Wärmeaustauscher gekühlt wird. Zu der homogenisierten Suspansion weren 0,5 % Cetrimid (als 5 % Gew./Vol. Lösung) langsam gegügt, und die Suspension wird 16 Stunden zur Bildung ,. des Niederschlags stehengelassen, Polyäthylenglycol P2000 Antischaum (0,5 ml/l) werden zugesetzt, und die Zellrückstände und die ausgefällten Proteine werden anschliessend durch Zentrifugieren, unter erneuter Verwendung einer Westfalia KO2OO6 Zentrifuge, abgetrennt.
2 m-molares Eisen-II-Ammoniumsulfat und 5 m-molares ß-Mercaptoäthanol werden zu der Lösung zugesetzt und das Enzym wird unter Anwendung einer zweistufigen Zugabe von kaltem Isopropanol ausge-
_ , - isDprcpanoi
fällt. 40 fo (Vol./Vol. )vfgiit viel inaktives Material aus, weitere 100 % V0I-/V0I.) fällen die aktive Fraktion aus. Die Feststoffe werden nach Jeder Stufe, unter Anwendung der Westfalia K02006 Zentrifuge gewonnen.
Die Aktivität wird aus dem 140 % Isopropanolfeststoff zweimal unter Verwendung eines Vortex-Mischers (5 Minuten) und anschliessend eines magnetischen Rührers bei 40C (16 Stunden) in 20 m-mola» rem Imidazol-HCl-Puffer vom pH-Wert 5,0 extrahiert, der 2 m-molares Ei sen-II-Ammoniumsulf at und 5 m-rnolares ß-Mercaptoäthanol enthält. Die erste Extraktion beträgt etwa 10 <fo (Gew./Vol.) Feststoff und die zweite etwa 20 $ (Gew/Vol.). Das unlösliche Material wird durch Zentrifugieren bei 2100 g bei 4°C während bis zu 16 Stunden entfernt.
Kaltes Isopropanol (1/4 VoI,) wird langsam zu der massigen (bulked) Enzymlösung gefügt, und der Feststoff wird bei 2100 g bei 4°C während 10 Minuten gewonnen. Dieser Feststoff wird erneut wie vorher in 20 m-molaren Imidazol-HCl-Puffer extrahiert, der Eisen-II-Ammoniumsulfat und ß-Mercaptoäthanol biszu etwa einem Liter
409847/1157
enthält. Überschüssiges Isopropanol wird unter Anwendung eines Rotations-Filmverdampfers entfernt und die Lösung, die bis zu 16 Stunden bei 23000 g geklärt wurde, wird gefriergetrocknet.
b) Die gefriergetrocknete Amidohydrolase wurde in 50 m-molarem Acetatpuffer (mit Natriumhydroxyd auf den pH-Wert 5,0 eingestellt), der 0,2 m-molares Eisen-II-Ammoniumsulf at und 30. % (Vol./Vol.) Glycerin enthielt, gelöst. Eine Lösung, die 50 mg Protein pro ml enthielt, wurde in Cellulosetriacetatfasern, hergestellt wie in Beispiel 1 der belgischen Pateritschrift 782 646 beschrieben, immobilisiert.
S
Die Fasern (0,29 g Trockengewicht, Aktivität 70 Einheiten/mg) wurden in ein Rohr von 1,25 cm Durchmesser gepackt, durch das 50mmolarer Acetatpuffer vom pH-Wert 5*0 geleitet wurde, mit 0,2 mmolares Eisen-II-Ammoniumsulfat und 1 m-molares Dithiothreit zirkuliert wurden. 1 g 3-Methyl-7ß-phenoxyacetamido-ceph-3-em-4- carbonsäure wurde bei pH-Wert 5,5 in 60 ml V/asser gelöst, das 7,5 mg Dithiothreit. und 0,4 mg Eissen-II-Ammoniumsulfat enthielt. Diese Lösung wurde erwärmt und anstelle des Puffers über die Fasern zirkuliert. Die Lösung wurde auf 37 gehalten. Die freigesetzte Phenoxyessigsäure wurde mit 0,9 n-Ammoniumhydroxyd auf den pH-Wert 6,0 titriert. In 3 Stunden wurden 58 i> des Substrats, wie durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie bestimmt, hydrolisiert.
Die Zirkulationslösung wurde gesammelt und mit Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 1 eingestellt. Unverändertes Substrat wurde mit Methylisobutylketon extrahiert, worauf der pH-Wert mit Ammoniak auf 8 angehoben wurde. Die Lösung wurde auf 6 gekühlt und der pH-Wert mit Chlorviasser stoff säure auf 4,0 gesenkt. Nach 2 Stunden wurde 3-Methyl-7ß-aminoceph-3-em-4-c'arbonsäure abfiltriert, mit V/asser und Aceton gewaschen und bei 4o° getrocknet. Dieser Feststoff (0,23 g) wurde isoliert und erwies sich durch NMR und IR Spektren als gleich mit einer authentischen Probe von 3-Me^hyl-7ßaminoceph-3-em-4~carbonsäure. Der E/ -Wert bei 264 mn (X-max) betrug 329 und die durch Hochdruckflüssigchromatographie beurteilte Reinheit betrug 95 #.
409847/1157

Claims (18)

  1. Patentansprüche
  2. ill Verfahren zur N-Entacylierung von JB-Phenoxyacetamidocephalosporin, dadurch gekennzeichnet, dass man das Cephalosporin der Einwirkung eines-Amidohydrolase-Enzyms unterzieht, das von einer Bakterienquelle stammt, das frei von Zellen und schädlichen Enzymen ist, das in Lösung durch die Anwesenheit von Eisen-II-Ionen stabilisiert ist, und das eine optimale N-Sntacylierung bei einem pH-Viert von J5,5 bis 6,5 bewirken kann. " '
  3. • 2.
  4. Verfahren gernäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Bakterienquelle Erwinia aroideae dient.
  5. 5. Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, " dass die Eisen-II-Ionen in Konzentrationen von 0,1 bis 1,0 mMol vorhanden sind.
    4. Verfahren gemäss Anspruch J5> dadurch gekennzeichnet, dass die Eisen-II-Ionen in einer Konzentration von etwa 0,2 mMol vorhanden sind.
    5. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennroichnet, dass die Eisen-II-Ionen in Form eines wasserlöslichen nicht-chelierten Eisen-Il-Salzes vorliegen.
  6. 6. Verfahren gemäss Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, dass das Eisen-Il-Salz Eisen-II-Sulfat oder Eisen-II-Ammoniumsulfat ist.
  7. 7. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das 7ß-Phenoxyacetamidocephalosporin 3-Methyl-7ßphenoxyacetamidoeeph-3-em-4-carbonsäure ist.
  8. 8. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 7< dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivität des Enzyms durch Zusatz eines Aktivators verbessert wird.
  9. 9· Verfahren gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der
    409847/1157
    Aktivator ein TMoI ist·.
  10. 10. Verfahren gemäss Anspruch 9* dadurch gekennzeichnet, dass das -Thiol ß-Mercaptoäthanol, Dithiothreit , Dithioerythrit , Cystein, Glutathion oder Liponsäure oder ein Salz davon ist.
  11. 11. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym direkt als wässrige Lösung zu der zu katalysierenden Lösung zugesetzt wird.
  12. 12.· Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch ge- \ kennzeichnet, dass das Enzym direkt in fester Form zugesetzt wird»
  13. IJ. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym nach Immobilisieren in oder auf einer geeigneten Matrix verwendet wird.
  14. lh. Verfahren gemäss Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix ein künstliches Polymerisat ist.
  15. 15. Verfahren gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das künstliche Polymerisat Cellulosetriacetat ist.
  16. 16. Verfahren gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym bei einem pH-Wert von 4-, 5 bis 6,5 verwendet wird.
  17. 17. Verfahren·gemäss Anspruch l6, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym bei einem pH-V/ert von 5*0 bis 6,0 verwendet wird.
  18. 18. Ein 7-ß-Aminocephalosporin, dadurch gekennzeichnet, dass es gemäss dem Verfahren eines der Ansprüche 1 bis I7 hergestellt wurde.
    409847/1157
DE2422374A 1973-05-10 1974-05-09 Cephalosporine Withdrawn DE2422374A1 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB2238073A GB1473100A (de) 1973-05-10 1973-05-10

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE2422374A1 true DE2422374A1 (de) 1974-11-21

Family

ID=10178454

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE2422374A Withdrawn DE2422374A1 (de) 1973-05-10 1974-05-09 Cephalosporine

Country Status (13)

Country Link
US (1) US3880713A (de)
JP (1) JPS5721993B2 (de)
AT (1) AT341080B (de)
BE (1) BE814866A (de)
CH (1) CH602752A5 (de)
DE (1) DE2422374A1 (de)
DK (1) DK142373B (de)
FR (1) FR2228783B1 (de)
GB (1) GB1473100A (de)
HU (1) HU170269B (de)
IE (1) IE39256B1 (de)
NL (1) NL7406239A (de)
YU (1) YU127774A (de)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2355078A1 (de) * 1973-11-03 1975-05-07 Bayer Ag Verfahren zur herstellung von 7-amino-delta hoch 3-cephem-derivaten
CH590292A5 (de) * 1973-12-20 1977-07-29 Ciba Geigy Ag
JPS5419914U (de) * 1977-07-11 1979-02-08
JPH07102000B2 (ja) * 1985-11-14 1995-11-01 松下電器産業株式会社 電気掃除機のリモ−トコントロ−ル回路
US4981789A (en) * 1987-03-18 1991-01-01 Merck & Co., Inc. One-step enzymatic conversion of cephalosporin C and derivatives to 7-aminocephalosporanic acid and derivatives
IT1224252B (it) * 1988-04-08 1990-09-26 Sclavo Spa Metodo di protezione del gruppo carbossilico nella chimica dei composti beta lattamici
US5104800A (en) * 1989-06-27 1992-04-14 Merck & Co., Inc. One-step cephalosporin c amidase enzyme
US5229274A (en) * 1989-06-27 1993-07-20 Merck & Co., Inc. Gene encoding one step cephalosporin C amidase and expression thereof in recombinant bacillus
DE4030040A1 (de) * 1990-09-22 1992-03-26 Bayer Ag Enzymatische de-acylierung von acyl-aminosorbosen und dessen verwendung bei der herstellung von 1-desoxynojirimicin
ES2237840T3 (es) * 1997-04-22 2005-08-01 Dsm Ip Assets B.V. Proceso mejorado para la produccion fermentativa de cefalosporina.
AU8021398A (en) * 1997-06-10 1998-12-30 Gist-Brocades B.V. Application of reducing sulphur compounds during enzymatic preparation of beta-lactam compounds
US20040053912A1 (en) * 2000-08-28 2004-03-18 Van Der Does Thomas Process for the preparation of a beta -lactam nucleus and the application thereof

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3801464A (en) * 1972-02-09 1974-04-02 Lilly Co Eli Antibiotic a16886 and process for production thereof

Also Published As

Publication number Publication date
FR2228783A1 (de) 1974-12-06
GB1473100A (de) 1977-05-11
YU127774A (en) 1982-05-31
FR2228783B1 (de) 1977-10-21
DK142373C (de) 1981-03-02
CH602752A5 (de) 1978-07-31
ATA384374A (de) 1977-05-15
JPS5035394A (de) 1975-04-04
JPS5721993B2 (de) 1982-05-11
DK142373B (da) 1980-10-20
AT341080B (de) 1978-01-25
BE814866A (fr) 1974-11-12
IE39256L (en) 1974-11-10
NL7406239A (de) 1974-11-12
US3880713A (en) 1975-04-29
IE39256B1 (en) 1978-08-30
HU170269B (de) 1977-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE1944043C3 (de) Biotechnisches Verfahren zur Her stellung von L Asparaginase mit Anti tumor Aktivität
DE1803987A1 (de) Neues,physiologisch wirksames Peptidolipid und Verfahren zu seiner Herstellung
DE2422374A1 (de) Cephalosporine
DE2423058C2 (de) Verfahren zur Herstellung von 3-Hydroxymethyl-cephalosporinen
DE3018767C2 (de)
DE3048612C2 (de) &#34;Verfahren zur enzymatischen Trennung von L-2-Ami no-4-methylphosphinobuttersäure&#34;
DE2163791C2 (de) Verfahren zur Herstellung von 7-Amino-3-methyl-3-cephem-4-carbonsäure und ihrer Ester
DE2614114A1 (de) Kreatininamidohydrolase und kreatinamidinohydrolase und verfahren zu deren herstellung
DE2757980C2 (de)
DE2340005A1 (de) Beta-lactamaseinhibitoren und verfahren zu ihrer herstellung
DE2502706A1 (de) Verfahren zur herstellung von 7-amino-cephem-verbindungen
DE2527068A1 (de) Verfahren zur herstellung von cholesterinesterase
DE2811303C3 (de) Enzymatische Komplexe, die zur Umwandlung racemischer Hydantoine in optisch aktive Aminosäuren geeignet sind, sowie deren Anwendung
DE2637671C3 (de) Verfahren zur Herstellung von Kreatinin-Desimidase auf mikrobiologischem Wege
DE2120930B2 (de) Pepsin-Inhibitor und Verfahren zu dessen Herstellung
DE2512606A1 (de) Verfahren zur herstellung eines cholesterin-oxidase-enzyms
DE3247703C2 (de) Verfahren zur Gewinnung von L-Threonin
DE2600682C2 (de) Verfahren zur Herstellung von L(+)-Weinsäure
DE2645548C3 (de) Endonucleasen und Verfahren zu ihrer Herstellung
JP3076856B2 (ja) 細菌によるアルギン酸の分解法
DE2331295A1 (de) Verfahren zur herstellung von 7-aminodesacetoxy-cephalosporansaeure
DE3724722A1 (de) Verbessertes verfahren zur enzymatischen herstellung von l-2-amino-4-methylphosphinobuttersaeure
DE2318650C2 (de) Fermentative Herstellung von Deacetylcephalosporin C
DE69121870T2 (de) Mutanter Stamm von Xanthomonas Campestris, Verfahren zur Herstellung von Xanthan und nichtviskoser Xanthan
DE2517941A1 (de) Verfahren zur herstellung von d-weinsaeure

Legal Events

Date Code Title Description
8141 Disposal/no request for examination