DK142373B - Fremgangsmåde til enzymatisk N-deacylering af 7beta-fenoxyacetamidocephalosporiner. - Google Patents

Description

(11) FR E M L/EGG ELS EGSKRIFT 1*1-2373 DANMARK (ευ int.ci.3 c 12 p 35/02 «(21) Ansøgning nr. 25^5/74 (22) Indleveret den 9· maj 1974 (24) Løbedag 9· maj 1974 (44) Ansøgningen fremlagt og oRn

fremlæggelsesskriftet offentliggjort den 2U . OKL · I yOU

Dl REKTORATET FOR

PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET (30) Prioritet begæret fra den

10. maj 1975, 22580/73# GB

(71) GLAXO LABORATORIES LIMITED, Greenf ord, Middlesex, GB.

<72) Opfinders I an Dunlop Fleming, Wheatly Way 24, Chalfont St. Peter, Buc= kinghamshire, GB: MicEael Keith Turner, The Dene 27, Wemhley, Middle= sex, GB: Eunice Jean Napier, Longthorpe House, Hound Green, Matting= ley, Hampshire, GB.

(74) Fuldmægtig under sagens behandling:

Kontor for Industriel Eneret v. Svend Schønning._ (54) Fremgangsmåde til enzymatisk N-deacylering af 7beta-fenoxyacetamido= cephalosporiner.

Den foreliggende opfindelse angår én fremgangsmåde til enzymatisk N-deacylering af 7f3-fenoxyacetamidocephalospo-riner ved indvirkning af et amidohydrolaseenzym stammende fra en bakteriekilde og frit for celler og skadelige enzymer.

Cephalosporinforbindelser, der omtales i nærværende beskrivelse, har fået navn ud fra stoffet cepham (se J.Am.Chem.

Soc. 1962, 84, 34oo). Benævnelsen cephem gælder den fundamentale cephamstruktur med en enkelt dobbeltbinding.

7β-acylamidocephalosporinderivater kan vindes ved gæringsmetoder eller som produkter af ringudvidelsen af penicillinderivater, og tilsvarende 7p-aminoderivater fremstilles som regel

.A

2 142373 ved N-deacylering af de vundne cephalosporinderivater. Det er velkendt at rent kemisk N-deacylering fordrer yderst specifikke reagenser og reaktionsbetingelser, til dels under henvisning til ustabiliteten af β-laktamringen og til dels under henvisning til arten af 7β-acylamidogruppen. Kemiske N-deacylerings-processer, der har vist sig kommercielt levedygtige, er som regel mangetrinsprocesser, der fordrer anvendelse af et antal reagenser i rækkefølge. Kemiske processer til N-deacylering egner sig i almindelighed ikke til anvendelse til behandling af cepha-1 o sp ori ner med ubeskyttede 4-karboxylgrupper, men der kan bruges enzymatiske metoder til sådanne reaktioner.

Der kendes enzymer, som hydrolyserer acylamidosidekæder fra penicilliner og andre amider, og man har fundet mange organismer, der danner sådanne enzymer. Disse amidohydrolaseenzymer klassificeres stort set med hensyn til deres acylamido-specifi-citet, pH-optimum og kilde. Det er imidlertid generelt iagtta- . get, at bakterielle enzymer af denne type har været mest effektive til at katalysere hydrolyse af fenylacetamidogrupper (optimalt ved en pH på ca. 7), medens svampeenzymer af denne type har været mest effektive til at katalysere hydrolyse af fenoxy-acetamidogrupper (optimalt ved en pH på ca. lo). En yderligere karakteristik af enzymer af begge disse typer har været den forholdsvis høje grad produktinhibering, de giver, en kendsgerning som er ufordelagtig ved industriel anvendelse af disse enzymer.

Vandamme et al, Ann.Inst.Pasteur (1971)» 12l(4), 435-446 har for nylig meddelt at penicillin V (fenoxymetylpenicillin) kan deacyleres ved lav pH ved hjælp af et bakterielt enzym.

Ved deres nævnte forsøg viste penicillin V sig at blive hydrolyseret ved en pH på ca. 5 af en suspension af celler af Erwinia aroideae, ledsaget af reacylering af den resulterende 6-amino-p eni c i 11 an syr e.

Det har nu vist sig at N-deacylering af 7β-fenoxy-acetamidocephalosporiner kan gennemføres ved optimalt pH på den svagt sure side uden væsentlig reacylering af det resulterende 7β-aminocephalosporin ved anvendelse af cellefrie bakterielle enzymer. Ved de indledende forsøg var udbytterne imidlertid små, og for at opnå tilfredsstillende udbytter med cellefrit materiale viste det sig overraskende at det cellefrie enzym kunne stabiliseres i opløsning hvis der indgik ferroioner i opløsningen, hvorved enzymet holdes i en tilstand der er tilstrækkelig aktiv 3 U2373 for den periode, der er nødvendig for at deacyleringen kan forløbe tilfredsstillende.

Det vil forstås at det alment er tilrådeligt at gennemføre N-deacylering af 7p-fenoxyacetamidocephalosporiner ved en neutral eller svagt sur pH-vøerdi for at undgå ødelæggelse af β-laktamringen, i modsætning til anvendelse af pH-værdier på ca. lo, der bruges når man bruger enzymer af svampeoprindelse.

I overensstemmelse med det anførte er fremgangsmåden ifølge opfindelsen ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte. Det resulterende 73-aminocephalosporirr-djan derefter ekstraheres og isoleres.

Fra dansk patentansøgning nr. 1137/72 er det kendt at bruge et kulturfiltrat fra dyrkning af stammen B-400 FERM-P nr.

748 af den til familien bacillaceae hørende bakterie Bacillus megatherium til deacylering af 7-fenylacetamino- eller 7-fenoxy-acetamido-3-metylcephalosporiner. Deacyleringen sker fortrinsvis ved pH 7-8, altså noget højere end den foreliggende fremgangsmådes pH-interval, og der sker ingen stabilisering med ferroio-ner.

Fra dansk patentansøgning nr. 6319/71 er det kendt at deacylere 5-fenylacetamido- og 7-fenoxyacetamidocephalosporiner med mikroorganismer eller ekstrakter deraf. Skriftet angiver som kilde til de virksomme enzymer et stort antal svampe og bakterier, ikke mindre end 65 til dels meget artsrige slægter er nævnt, heriblandt kun et enkelt medlem af tarmbakteriernes familie (Enterobacteriaceae), nemlig den i menneskers og pattedyrs tarme hyppigt forekommende Escherichia coli. Beskrivelsen siger intet om pH-området for dyrkningen eller om pH-optimum, så lidt som om stabilisering med ferroioner.

Så vidt det kan bedømmes ud fra de i de nævnte ansøgninger indeholdte oplysninger, giver de derfra kendte fremgangsmåder ringere udbytter end den foreliggende. Ifølge omstående eksempel 1 omdannes 10 g forbindelse (3-metyl-7f3-fenoxyacetamidoceph- 3-em-4-karboxylsyre) af 1350 enheder amidohydrolase; da 7 enheder hydrolase dannes af 50 ml medium, går der knap 1 liter medium til 1350 enheder hydrolase, altså til omdannelse af 10 g forbindelse. Ifølge eksempel 4 i dansk patentansøgning 1137/72 omdannes 2 g af natriumsaltet af samme forbindelse af 4 g råt enzym; ifølge den ældre ansøgnings eksempel 1-2 vindes godt 24 g råt enzym ud fra 20 1 dyrkningssubstrat, der følgelig giver enzym til U2373 4 omdannelse af ca. 12 g Na-salt af forbindelsen. Ifølge eksempel 6 i dansk patentansøgning nr. 6319/71 bruges enzym fra svampen Griphosphaeria nivalis dyrket i 1000 ml substrat til omdannelse af 3,7 g metyl-7-fenoxy-acetamido-3-metyl-3-cephem- 4-karboxylat, og ifølge eksempel 7 enzym fra 30 ml dyrkningssubstrat fra forskellige andre svampe til omdannelse af 100 mg af samme forbindelse, iøvrigt med ret dårligt udbytte af amino-forbindelsen, altså ligeledes ca. 3 1 substrat til omdannelse af 10 g fenoxyacetamidocephalosporin.

Ved fremstilling af cellefrie ekstrakter af organismen kan cellerne oplagres, og der kan fremstilles podekulturer på konventionel måde* Cellerne kan derefter dyrkes i et konventionelt dyrkningsmedium indeholdende f.eks. kilder til nitrogen, kulstof, hydrogen, oxygen, fosfor, svovl og mineraler i vand, idet pH-vaerdien reguleres før autoklavering. Kolberne inkuberes i et passende tidsrum under rotation og cellerne indhøstes, f.eks. ved centrifugering, fra dyrkningsvæsken og vaskes før de brydes. Cellerne kan derefter suspenderes i en puffer og brydes, f.eks. ad ultrasonisk vej eller ved formaling, f.eks. ved hjælp åf glasperler. Cellerester fjernes fra det resulterende materiale, f.eks. ved centrifugering, og efterlader en residual ekstrakt som indeholder amidohydrolase. Den kan om ønsket renses yderligere på konventionel måde.

Det har vist sig vigtigt at stabilisere enzymet med ferroioner. Det cellefrie enzym mister en væsentlig mængde af sin aktivitet under H-deacyleringen hvis disse ioner ikke er til stede. Det er Interessant at bemærke at ferroioner synes at være enestående til formålet. Det er desuden usædvanligt at stabilisere amidohydrolaser med ferroioner. De kan tilsættes før eller efter brydningen af cellerne, ifølge opfindelsen til opnåelse af bedst muligt udbytte hensigtsmæssigt i form af et vandopløseligt, ikke-chelateret ferrosalt, fortrinsvis ferrosulfat eller ferroammoniumsulfat. Ferroionerne bruges ifølge opfindelsen især i en koncentration på 0,1 til 1,0 mM, fortrinsvis ca. 0,2 mM, da der herved opnås bedst udbytte. Det optimale tidspunkt for tilsætningen kan bedømmes ved simple forsøg, men det er vigtigt at pH-værdien af_opløsningen efter tilsætning af ferroionerne holdes under 6,5, således at dannelsen af ferroioner, der har en 5 142373 inhiberende virkning på enzymet, nedbringes til et minimum.

Aktiviteten af enzymet kan ifølge opfindelsen forbedres ved tilsætning til enzymopløsningen af en aktivator, fortrinsvis en tiol; eksempler er dithiotreitol, dithioerythritol, β-merkaptoætanol, cystein, glutathion eller lipoinsyre (i form af f.eks. lithiumlipoat) eller ascorbinsyre.

Amidohydrolaseaktiviten kan bestemmes ved inkubering af en kvantitativt kendt mængde substrat og enzym ved reaktionens pH-værdi efterfulgt af standsning af reaktionen, isolering af det dannede 7P-aminocephalosporin og bestemmelse af dette.

En aktivitetsenhed er den mængde enzym som hydrolyserer 1 pmol substrat per minut under definerede betingelser. Det har vist sig at hver ml gæringsvæske fra dyrkning af Erwinia aroideae giver ca. 5 enheder enzym.

I en udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan 3-metyl-^-fenoxyacetamidoceph-3-em-4-karboxylsyre inkuberes med den fra Erwinia aroideae udvundne amidohydrolase samt fer-roioner ved en pH-værdi på 4,5 til 6,5, ifølge opfindelsen fortrinsvis 5,0-6,0, der giver bedst udbytte; og fx ved 37°C i to timer. Pufring af reaktionsopløsningen til den korrekte pH-værdi kan opnås fx ved hjælp af alkalisaltet af en organisk syre såsom natriumacetat eller kalium-3,3-dimetylglutarat. Reaktionen kan standses på hensigtsmæssig måde, fx ved opvarmning til 100°C i 5 minutter og derefter afkøling af blandingen eller ved afkøling i is. Koaguleret protein herfra centrifugeres og den ovenstående opløsning koncentreres. Opløsningen anbringes fortrinsvis på en stærkt basisk kvaternær ammonium-anionbytter-harpiks-kolonne, fx "Dowex" ^-1, fortrinsvis i acetatformen, hvorefter produktet elueres med et passende elueringsmiddel som fx en vandig opløsning af ammoniumacetat.

Dette eluat, der indeholder 7P~amino-3-metylceph-3-em- 4-karboxyisyre, kan inddampes til tørhed og remanensen opløses i vand. Ved regulering af pH-værdien med vandig syre, fortrinsvis HC1 til i nærheden af det isolelektriske punkt, dvs. 3,5, udfælder 7P-amino-3-metylceph-3-em-4-karboxylsyre sig. Denne kan derefter frafiltreres og vaskes, f.eks. med acetone. Man kan også udfælde 7P-amino-3-metylceph-3-em-4-karboxylsyre direkte fra eluatet ved regulering af pH-værdien til ca. det 6 142373 isoelektriske punkt„ 7P-amino-3-metylceph-3-em-4-karboxylsyre har vist sig ikke at inhibere enzymet fra Erwinia aroideae ved dets optimale pH-værdi i nogen væsentlig grado

Enzymet kan sættes direkte som en vandig opløsning til den reaktionsopløsning, der skal katalyseres. Det kan også tilsættes i fast form, vundet f.eks. ved frysetørring, ifølge opfindelsen kan enzymet bruges i immobiliseret form i.eller på en matrix, hvorved det er muligt at genvinde og genanvende enzymet efter brugen. Denne kan have mange forskellige former, fx olckludering af enzymet i en matrix, som f.eks. en glas eller en kunstig polymer, f.eks. cellulosetriacetat, i fibrøs form, eller uopløseliggørelse på en membran. Sådanne immobiliserede former er f.eks. beskrevet i britisk patent nr. 1.224.947 og belgisk patent nr. 782.646.

Selvom enzymet kan virke under konventionelle vandige betingelser med pH-værdier fra 3,5 til 6,5 har det vist sig, at når enzymet immobiliseres i eller på en passende matrix, kan reaktionsmediet have en noget højere pH-værdi, ca. pH 7-8.

Den nedenfor beskrevne metode kan bruges til at bestemme amidohydrolaseaktiviteten. Proceduren ligner i det væsentlige fremgangsmåden ifølge opfindelsen. En aktivitetsenhed kan defineres som den mængde enzym, der hydrolyserer et pmol af 3-metyl-7P-fenoxyacetamidoceph-3-em-4-karboxylsyre per minut under følgende betingelser:

Et til enzymatisk nedbrydning bestemt præparat indeholder 2o pmol 3-metyl-7β-fenoxyacetamidoceph-3-em-4-karboxylsyre, 15 pmol eddikesyre, reguleret til pH 5 med natriumhydroxyd, 5o nmol ferrosulfat, 3 pmol dithiothreitol og enzym i en samlet rumfangsmængde på 0,25 ml. Efter inlcubering ved 37°C i 15 minutter standses den enzymatiske nedbrydningsproces ved opvarmning til loo°C i 5 minutter, hvorefter bundfaldet fracentrifugeres, 0,5 ml 1M eddikesyre sættes til den ovenstående væske og blandingen anbringes på en 2,5 x 0,6 cm kolonne af "Dowex"-lx8 acetat (200-400 mesh).

Den 7β-amino-3-metylceph-3-em-4-karboxylsyre, der frigives under hydrolysen elueres med 5 ml 1M eddikesyre. Hele eluatmæng- 7 142373 den suppleres til 6 ml med 1M eddikesyre, og den tilstedeværende mængde 7f-amino-3-metylceph-3-em-4-karboxylsyre bestemmes ved dens absorption ved 26o nm. Molextinctionskoefficienten for denne forbindelse ved 26o nm i 1M eddikesyre anses at være 7,6 x lo3 liter mol-1 · cm-1.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen skal i det følgende belyses nærmere ved nogle eksempler.

Eksempel 1

Fremstilling af 78-amino-3-metylceph-3-em-4-karboxylsyre (a) Erwinia aroideae NRRL B-138, ATCC 252o6, dyrkedes i 25o ml store rysteflasker indeholdende 5o ml dyrkningsmedium ved pH 7,3 under anvendelse af 1% podekultur fra en 24 timer gammel næringssuppekultur. Hver liter produktionsmedium indeholdt 5 g pepton (Evans Medical Co., Ltd,), 3 g natriumklorid, 2o g saccarose, 8oo g Oxoid Lab. Lemco og 5 g Oxoid gærekstrakt. Kolberne inkuberedes ved 28°C i 4o timer under rystning ved 22o opm. Cellerne fra 5 liter medium indhøstedes ved centrifugering og vaskedes med o,o5 M fosfatpuffer ved pH 6,8. Efter suspendering af cellerne i βοο ml o,o5 M fosfatpuffer pH 6,8, indeholdende o,2 mM FeSO^ og 5 inM β-merkapto-ætanol, blev cellerne brudt ved ultralydbehandling.

Celleresterne fjernedes ved centrifugerina og der sattes cetyltrimetylammoniumbromid til den ovenstående væske for at give en koncentration på 1%. Bundfaldet fracentrifugeredes og der sattes tilstrækkelig meget FeSO^ til den ovenstående væske til at give en slutkoncentration på 2 mM. Ekstraktens pH-værdi nedsattes derefter til 4,5 med eddikesyre. Det derved udfældede protein fracentrifugeredes og den ovenstående væske dialyseredes med 5o mM acetatpuffer pH 5 indeholdende o,2 mM FeSO^ og 5 mM β-mercapto-ætanoi. Efter dialysen indeholder ekstrakten ca. 7 enheder amidohydroiase per ml.

(b) lo g (27 mmol) 3-metyl-7f-fenoxyacetamidoceph-3-em-4-lcarboxylsyre hydrolyseredes i 250 ml vand ved 37°C. Vandet indeholdt også 3o mmol eddikesyre reguleret til pH 4,5 med NaOH, loo μτηοΐ FeSO^, 1,4 mmol p-merkapto-ætanol og 135o enheder af amidohydrolasen. Efter 2 timer opvarmedes blandingen til loo°C i 5 minutter og reguleredes derefter til pH 7 med KOH.

8 142373

Koaguleret protein fracentrifugeredes ved 800 g i 5 minutter.

Den ovenstående væske koncentreredes til loo ml og overførtes til en 15 x 2,5 cm kolonne af "Dowex"-l-acetat„ Den dannede 7p-amino-3-metylceph-3-em-4-karboxylsyre elueredes med M ammoniumacetat .

Den fraktion af eluatet som indeholdt 78-amino-3-rnetyl-ceph-3~em-4-karboxylsyre inddampedes til tørhed og ammoniumacetatet fjernedes under vakuum. Derefter opløstes 78-amino- 3-metylceph-3-'em-4-lcarboxylsyren i loo ml vand ved pH 8. Denne opløsnings pH-værdi nedsattes til 3,5 med 5N HC1. Det faste stof som udfældedes ved 0°C frafiltreredes, vaskedes med kold 1 mM HC1, acetone og æter og tørredes derpå« Der udvandtes 3,73 g fast stof indeholdende 16 mmol 78-amino-3-metylceph-3-em-4-karboxylsyre svarende til et udbytte på 59%.

Produktet identificeredes ved papirkromatografi. Whatman 3 MM papir pufredes ved pH 6 med 50 mM fosfatpuffer (5,9 kalium-dihyrogenfosfat og 1,85 g dinatriumhydrogenfosfat per liter)«

Efter at en organisk fase af en blanding af butan-l-ol, ætanol og vand (rumfangsforhold 4:1:5) er løbet ned gennem papiret i løbet af en nat, viser det ønskede produkt sig som W-absor-berende plet. Denne plet farves brun med ninhydrin og har samme Rf-værdi som autentisk 7p-amino-3-*metylceph-3-em-4-karboxyl-syre. Sammenligning af UV-, IR- og NMR-data for den isolerede forbindelse og en autentisk prøve af forbindelsen bekræfter identiteten.

Eksempel 2

Fremstilling af 3-metyl-73-aminoceph-3-em-4-karboxylsyre under anvendelse af cellulosetriacetatfibre indeholdende en amidohydrolase stammende fra Erwinia aroideae.

a) Celler af Erwinia aroideae NRRL B-138, ATCC 252o6, fjernes fra 130-140 liter indhøstet gæringssuppe ved centrifugering ved 63oo omdr./min« under anvendelse af en Westfalia K02oo6 centrifuge af Icammertypen« Cellerne (ca. 4 kg) suspenderes til lofo v/r i kold (5°C) 2o mM imidazol HC1 puffer pH 5,o, indeholdende 2 mM ferroammoniumsulfat (0,8 g/liter) og 5 mM β-merkaptoætanol (o,35 ml/liter) under anvendelse af en Silverson AX mixer i 15 minutter.

Bakteriecellerne brydes derefter ved tre passager gennem en A.P.V.-homogenisator type KF3 ved 515 - 5So kg/cm , idet 142373 9 effluenten afkøles ved passage gennem en varmeveksler, Til den homogeniserede opløsning sættes der langsomt o,5% cetrimid (som en 5# v/r opløsning), og suspensionen henstår i op til 16 timer for at muliggøre et bundfald at danne sig. Der tilsættes polyætylenglykol P2ooo antiskumningsmiddel (o,5 ml/ liter), og cellerester og udfældede proteiner fraskilles derefter ved centrifugering, atter under anvendelse af en tfestfalia K02oo6 centrifuge.

Der sættes 2 mM ferroammoniumsulfat og 5 mM β-merkapto-ætanol til opløsningen, og enzymet udfældes ved to-trinstilsætning af kold isopropanol. 4o. rumfangs# isopropanol ud-r fælder meget inaktivt materiale og yderligere loo rumfangs# udfælder den virksomme fraktion. De .faste stoffer udvindes efter hvert trin under anvendelse af Westfåia K02oo6 centrifugen.

Aktiviteten ekstraheret fra de 14o# isopropanol-faststof to gange under anvendelse af en Vortex· .mixer (5 min.) og derefter en magnetisk omrører ved 4°C (16 timer) idet ekstraktionen sker til 2o mM pH 5,o imidazol HC1 puffer indeholdende 2 mM ferroammoniumsulfat og 5 mM β-merkaptoætanol. Den første ekstraktion er på ca. lo# v/r faststof og den anden på ca. 2o# v/r. Det uopløselige materiale fjernes ved centrifugering ved 21oo g ved 4°C i indtil 16 timer.

1 l/4 rumfang kold isopropanol sættes langsomt til de forenede enzymopløsninger og det faste stof udvindes ved 21oo g og 4°C i lo minutter. Det faste stof ekstraheres igen på den foran beskrevne måde i 2o mM imidazol HG1 puffer indeholdende ferroammoniumsulfat og β-merkaptoætanol til ca. 1 liter. Overskydende isopropanol fjernes under anvendelse af en roterende filmevaporator og opløsningen frysetørres efter klaring ved 23ooo g i indtil 16 timer.

b) Den frysetørrede amidohydrolase opløses i 50 mM acetatpuffer (reguleret til pH 5,o med natriumhydroxyd) indeholdende o,2 mM ferroammoniumsulfat og 3o. rumfangs# glycerol. En opløsning indeholdende 5o mg protein per ml immobiliseredes i cel-lulosetriacetatfibre fremstillet som beskrevet i eksempel l i belgisk patentskrift nr. 782646.

Fibrene (o,29 g tørvægt; aktivitet 70 enheder/mg) pakkes i et rør med en diameter på 1,25 cm, igennem hvilket der cirkuleredes 5o mM acetatpuffer pH 5>o indeholdende o,2 mM ferroammoniumsulfat og 1 mM dithiothreitol. 1 g 3-metyl-7β-fenoxy- 10 142373 acetamido-ceph-3-em-4~karboxylsyre opløstes ved pH 5,5 i 6o ml vand indeholdende 7,5 mg dithiothreitol og o,4 mg ferroammonium-sulfat» Denne opløsning opvarmedes og cirkuleredes over fibrene i stedet for pufferen. Opløsningen holdtes på 37°C. Den frigivne fenoxyeddikesyre titreredes til pH 6,o med o,9 N ammonium-hydroxyd. På 3 timer var 58% af substratet hydrolyseret, hvilket resultat man kom til ved højtryksvæskekromatografi.

Den cirkulerende opløsning opsamledes og reguleres til pH 1 med saltsyre. Uomdannet substrat elcstraheredes med metyl-isobutylketon, hvorefter pH hævedes til 8 med ammoniak. Opløsningen afkøledes til 6°C og pH værdien nedsattes til 4,0 med saltsyre. Efter to timer frafiltreredes 3-metyl-7p-aminoceph- 3-em-4-karboxylsyre, den vaskedes med vand og acetone og tørredes ved 4o°C. Dette faste stof (o,23 g) havde efter isolering lignende NMR og IR-spelctre som autentisk 3-metyl-7p-aminoceph- no/ 3--em-4—karboxylsyre. E^m ved 264 nm (kmax) var 329 og renheden som bedømt ved højtryksvæskekromatografi var 95%.