Cyclische Nonapeptϊdamide
Die Erfindung betrifft cyclische Nonapeptidamide und Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten, insbesondere bakteriellen Infektionskrankheiten.
Die bakterielle Zellwand wird durch eine Reihe von Enzymen synthetisiert (Zellwandbiosynthese) und ist essentiell für das Überleben bzw. die Vermehrung von Mikroorganismen. Die Struktur dieses Makromoleküls ebenso wie die an ihrer Synthese beteiligten Proteine sind innerhalb der Bakterien stark konserviert. Aufgrund ihrer essentiellen Natur und Einheitlichkeit ist die Zellwandbiosynthese ein idealer Angriffspunkt) für neue Antibiotika (D.W.Green, The bacterial cell wall as a source of antibacterial targets, Expert Opin. Ther. Targets, 2002, 6, 1-19).
Vancomycin und Penicilline sind Inhibitoren der bakteriellen Zellwandbiosynthese und stellen erfolgreiche Beispiele für die antibiotische Potenz dieses Wirkprinzips dar. Sie werden seit mehreren Jahrzehnten in der Klinik zur Behandlung von bakteriellen Infektionen, vor allem mit Gram-positiven Erregern eingesetzt. Durch das wachsende Auftreten von resistenten Keimen, z.B. Methicillin-resistenten Staphylokokken, Penicillin-resistenten Pneumokokken und Vancomycin- resistenten Enterokokken (F. Baquero, Gram-positive resistance: challenge for the development of new antibiotics, J. Antimicrob. Chemother., 1997, 39, Suppl A: 1-6; A.P. Johnson, D.M. Livermore, G. S. Tillotson, Antimicrobial susceptibility of Gram-positive bacteria: what's current, what's anticipated ?, J. Hosp. Infect., 2001, (49), Suppl A: 3-11) sowie jüngst auch erstmals Vancomycin-resistenten Staphylokokken (B. Goldrick, First reported case of VRSA in the United States, Am. J. Nurs., 2002, 102, 17) verlieren diese Substanzen zunehmend ihre therapeutische Wirksamkeit.
Die vorliegende Erfindung beschreibt eine neue Klasse von Zellwandbiosynthese-Inhibitoren ohne Kreuzresistenzen zu bekannten Antibiotika-Klassen.
Der Naturstoff Lysobactin und einige Derivate sind als antibakteriell wirksam beschrieben in US 4,754,018. Die Isolierung und antibakterielle Wirksamkeit von Lysobactin ist auch in EP-A-196 042 und JP 01132600 beschrieben. WO04/099239 beschreibt Derivate des Lysobactins mit antibakterieller Wirksamkeit.
Die antibakterielle Wirkung von Lysobactin und Katanosin A wird weiterhin beschrieben in O'Sullivan, J. et ed., J. Antibiot. 1988, 41, 1740 - 1744, Bonner, D. P. et al, J. Antibiot. 1988, 41, 1745 - 1751, Shoji, J. et al, J. Antibiot. 1988, 41, 713 - 718 und Tymiak, A. A. et al, J. Org. Chem. 1989, 54, 1149 - 1157.
Die Stabilität eines Wirkstoffs ist ein wichtiger Paramet:er für dessen Eignung als Arzneimittel. Die Stabilität spielt u. a eine Rolle bei der Lagerung und der Darreichung von Arzneimitteln. Viele Naturstoffe zeigen eine für Arzneimittel unzureichende Stabilität.
Das antibakteriell wirksame Depsipeptid Lysobactin hydrolysiert im wässrigen neutralen bis basischen Milieu (pH > 7) innerhalb von Tagen. Hierbei entsteht das - antibakteriell unwirksame - am Lacton geöffnete „ope«-Lysobactin". Wünschenswert sind deshalb wirksame Analoga des Lysobactins mit einer höheren Ringstabilität.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, alternative Verbindungen zu Lysobactin mit vergleichbarer oder verbesserter antibakterieller Wirkung, besserer Verträglichkeit, z. B. geringerer Nephrotoxizität, und verbesserter Stabilität in wässrigem neutralen bis basischen Milieu zur Behandlung von bakteriellen Erkrankungen bei Menschen und Tieren zur Verfügung zu stellen.
Im Rahmen dieser Erfindung wurde überraschenderweise gefunden, daß Lysobactinamide (cyclische Nonapeptidamide) eine analoge antibakterielle Wirkung haben wie Lysobactin und hydrolysestabil in wässrigem neutralen bis basischen Milieu sind. Lysobactinamide sind bisher nicht beschriebene Aza-Analoga des Lysobactins, bei denen die zentrale Lactonfunktionalität durch eine Lactamfunktionalität ersetzt ist.
Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen der Formel
in welcher
R Wasserstoff oder Methyl bedeutet,
R7 für eine Gruppe der Formel
steht,
wobei
die Anknüpfstelle an das Amin bedeutet,
R1 Ci-Ce-Alkyl, C2-C6-Alkenyl, C3-C6-Cycloalkyl oder C6-C10-Aryl bedeutet,
wobei Alkyl, Alkenyl, Cycloalkyl und Aryl substituiert sein können mit 0, 1, 2 oder 3 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Hydroxy, Amino, Cyano, Trimethylsilyl, Ci-C6-Alkyl, C1-C6-AIkOXy, Benzyloxy, C3-C6-Cycloalkyl, C6-C10-Aryl, 5- bis 7-gliedriges Heterocyclyl, 5- bis 10-gliedriges Heteroaryl, Ci-Cö-Alkylamino, C6-C10- Arylamino, C1-C6- Alkylcarbonylamino, C6-C10-Arylcarbonyl-arnmo, Ci-Cβ-Alkylcarbonyl, Ci-C6- Alkoxycarbonyl, C6-Cio-Arylcarbonyl und Beαzyloxy-carbonylamino,
worin Cycloalkyl, Aryl, Heterocyclyl und Heteroaryl ihrerseits substituiert sein können mit 0, 1, 2 oder 3 Substituenten unabhängig voneinander aus¬ gewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Hydroxy, Amino, Cyano, Nitro, Trifluormethyl, C1-C6-AIlCyI, CrC6-Alkoxy, Phenyl und 5- bis 7- gliedriges Heterocyclyl,
R2 CrC6-Alkyl, C2-C6-Alkenyl, C3-C6-Cycloalkyl oder C6-Ci0-Aryl bedeutet,
wobei Alkyl, Alkenyl, Cycloalkyl und Aryl substituiert sein können mit 0, 1, 2 oder 3 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Hydroxy, Amino, Cyano, Trimethylsilyl, Ci-C6-Alkyl, CrC6-Alkoxy, Benzyloxy, C3-C6-Cycloalkyl, C6-Cio-Aryl, 5- bis 7-gliedriges Heterocyclyl, 5- bis 10-gliedriges Heteroaryl, Ci-C6-Alkylamino, C6-Ci0- Arylamino, CrC6- Alkylcarbonylamino, Cβ-Cio-Arylcarbonyl-amino, C)-C6-Alkylcarbonyl, Ci-C6-
Alkoxycarbonyl, Q-Cio-Arylcarbonyl und Benzyloxy-carbonylamino,
worin Cycloalkyl, Aryl, Heterocyclyl und Heteroaryl ihrerseits substituiert sein können mit 0, 1 , 2 oder 3 Substituenten unabhängig voneinander aus¬ gewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Hydroxy, Amino, Cyano, Nitro, Trifluormethyl, CrC6-Alkyl, CrC6-Alkoxy, Phenyl und 5- bis 7- gliedriges Heterocyclyl,
R4 C,-C6-Alkyl, C2-C6-Alkenyl, C3-C6-Cycloalkyl oder C6-C 10-Aryl bedeutet,
wobei Alkyl, Alkenyl, Cycloalkyl und Aryl substituiert sein können mit 0, 1, 2 oder 3 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Hydroxy, Amino, Cyano, Trimethylsilyl, C1-Ce-AIlCyI, Ci-C6-Alkoxy,
Benzyloxy, C3-C6-Cycloalkyl, C6-Ci0-Aryl, 5- bis 7-gliedriges Heterocyclyl, 5- bis 10-gliedriges Heteroaryl, CrCe- Alkylamino, C0-Ci0- Arylamino, C1-C6- Alkylcarbonylamino, Cö-Cio-Arylcarbonyl-amino, Q-Cö-Alkylcarbonyl, C1-C6- Alkoxycarbonyl, C6-Ci0-Arylcarbonyl und Benzyloxy-carbonylamino,
worin Cycloalkyl, Aryl, Heterocyclyl und Heteroaryl ihrerseits substituiert sein können mit 0, 1, 2 oder 3 Substituenten unabhängig voneinander aus¬ gewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Hydroxy, Amino, Cyano, Nitro, Trifluormethyl, CrC6-Alkyl, CrC6-Alkoxy, Phenyl und 5- bis 7- gliedriges Heterocyclyl,
R5 C,-C6-Alkyl, C2-C6-Alkenyl, C3-C6-Cycloalkyl oder C6-C10-Aryl bedeutet,
wobei Alkyl, Alkenyl, Cycloalkyl und Aryl substituiert sein können mit 0, 1, 2 oder 3 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Hydroxy, Amino, Cyano, Trimethylsilyl, Ci-Cβ-Alkyl, C1-C6-AIkOXy, Ben∑yloxy, C3-C6-Cycloalkyl, C6-Ci0-Aryl, 5- bis 7-gliedriges Heterocyclyl, 5- bis 10-gliedriges Heteroaryl, Ci-C6-Alkylamino, C6-Ci0-Arylamino, CrC6-
Alkylcarbonylamino, Cδ-Cio-Arylcarbonyl-amino, Cx-Qj-Alkylcarbonyl, C]-C6- Alkoxycarbonyl, Cβ-Cio-Arylcarbonyl und Benzyloxy-caxbonylamino,
worin Cycloalkyl, Aryl, Heterocyclyl und Heteroaryl ihrerseits substituiert sein können mit 0, 1, 2 oder 3 Substituenten unabhängig voneinander aus- gewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Hydroxy, Amino, Cyano,
Nitro, Trifluormethyl, Ci-C6-Alkyl, CrC6-Alkoxy, Phenyl und 5- bis 7- gliedriges Heterocyclyl,
und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.
Erfmdungsgemäße Verbindungen sind die Verbindungen der Formel (I), (Ia) und (Ib) und deren Salze, Solvate, Solvate der Salze und Prodrugs, die von Formel (I), (Ia) und (Ib) umfassten Verbindungen der nachfolgend genannten Formeln und deren Salze, Solvate, Solvate der Salze und Prodrugs sowie die von Formel (I), (Ia) und (Ib) umfassten, nachfolgend als Ausführungsbeispiele genannten Verbindungen und deren Salze, Solvate, Solvate der Salze und Prodrugs, soweit es sich bei den von Formel (I), (Ia) und (Ib) umfassten, nachfolgend genannten Verbindungen nicht bereits um Salze, Solvate, Solvate der Salze und Prodrugs handelt.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in Abhängigkeit von ihrer Struktur in stereoisomeren Formen (Enantiomere, Diastereomere) existieren. Die Erfindung betrifft deshalb die Enantiomeren oder Diastereomeren und ihre jeweiligen Mischungen. Aus solchen Mischungen von Enantiomeren und/oder Diastereomeren lassen sich die stereoisomer einheitlichen Bestandteile in bekannter Weise isolieren.
Sofern die erfindungsgemäßen Verbindungen in tautomeren Formen vorkommen können, umfasst die vorliegenden Erfindung sämtliche tautomere Formen.
Als Salze sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung physiologisch unbedenkliche Salze der erfin¬ dungsgemäßen Verbindungen bevorzugt. Umfasst sind aber auch Salze, die für pharmazeutische Anwendungen selbst nicht geeignet sind aber beispielsweise für die Isolierung oder Reinigung der erfmdungsgemäßen Verbindungen verwendet werden können oder Mischsalze. Unter Mischsalz wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Additionssalz verstanden, das zwei oder mehrere unterschiedliche Säuren bzw. Basen enthält, wie z. B. ein Trifluoracetat-Mesylat-Salz.
Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen Säure¬ additionssalze von Mineralsäuren, Carbonsäuren und Sulfonsäuren, z.B. Salze der Chlorwasser¬ stoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Ethan- sulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Naphthalindisulfonsäure, Essigsäure, Trifluor- essigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Maleinsäure und Benzoesäure.
Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen auch Salze üblicher Basen, wie beispielhaft und vorzugsweise Alkalimetallsalze (z.B. Natrium- und Kaliumsalze), Erdalkalisalze (z.B. Calcium- und Magnesiumsalze) und Ammoniumsalze, abgeleitet von Ammoniak oder organischen Aminen mit 1 bis 16 C-Atomen, wie beispielhaft und vorzugsweise Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Ethyldiisopropylamin, Monoethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Dicyclohexylamin, Dimethylaminoethanol, Prokain, Dibenzylamin, N-Methyl-
morpholin, Arginin, Lysin, Ethylendiamin und N-Methylpiperidin.
Als Solvate werden im Rahmen der Erfindung solche Formen der erfindungsgemäßen Verbindungen bezeichnet, welche in festem oder flüssigem Zustand durch Koordination mit Lösungsmittelmolekülen einen Komplex bilden. Hydrate sind eine spezielle Form der Solvate, bei denen die Koordination mit Wasser erfolgt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung haben die Substituenten, soweit nicht anders spezifiziert, die folgende Bedeutung:
Alkyl per se und "Alk" und "Alkyl" in Alkoxy, Alkylamino, Alkylcarbonyl, Alkoxycarbonyl und Alkylcarbonylamino steht für einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit in der Regel 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4, besonders bevorzugt 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, beispielhaft und vorzugsweise für Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, tert-Butyl, 2,2-Dimethylprop-l-yl, 2,2-Dimethylbut-l-yl, n- Pentyl und n-Hexyl.
Alkoxy steht beispielhaft und vorzugsweise für Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy, Isopropoxy, tert- Butoxy, n-Pentoxy und n-Hexoxy.
Alkenyl steht für einen geradkettigen oder verzweigten Alkenylrest mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen. Bevorzugt ist ein geradkettiger oder verzweigter Alkenylrest mit 2 bis 4, besonders bevorzugt mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen. Beispielsweise und vorzugsweise seien genannt: Vinyl, AUyI, n-Prop-1-en- 1-yl, n-But-2-en-l-yl, 2-Methylprop-l-en-l-yl und 2-Methylprop-2-en-l-yl.
Alkylamino steht für einen Alkylaminorest mit einem oder zwei (unabhängig voneinander gewählten) Alkylsubstituenten, beispielhaft und vorzugsweise für Methylamino, Ethylamino, n-
Propylamino, Isopropylamino, tert-Butylamino, n-Pentylamino, n-Hexylamino, N,N-Dimethylamino,
N,N-Diethylamino, N-Ethyl-N-methylamino, N-Methyl-N-n-propylamino, N-Isopropyl-N-n- propylamino, N-fert-Butyl-N-methylamino, N-Ethyl-N-ii-pentylarnino und N-n-Hexyl-N- methylamino. Ci-C3-Alkylamino steht beispielsweise für einen Monoalkylaminorest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder für einen Dialkylaminorest mit jeweils 1 bis 3 Kohlenstoffatomen pro
Alkylsubstituent.
Arylamino steht für einen über eine Aminogruppe gebundenen Arylsubstituenten, wobei an die Aminogruppe gegebenenfalls ein weiterer Substituenten, wie z.B. Aryl oder Alkyl, gebunden ist, beispielhaft und vorzugsweise für Phenylamino, Νaphthylamino, Phenylmethylamino oder Diphenyl- amino.
Alkylcarbonyl steht beispielhaft und vorzugsweise für Methylcarbonyl, Ethylcarbonyl, n-Propyl-
carbonyl, Isopropylcarbonyl, tert-Butylcarbonyl, n-Pentylcarbonyl und n-Hexylcarbonyl.
Alkoxycarbonyl steht beispielhaft und vorzugsweise für Methoxycarboiryl, Ethoxycarbonyl, n-Prop- oxycarbonyl, Isopropoxycarbonyl, terf-Butoxycarbonyl, n-Pentoxycarborryl und n-Hexoxycarbonyl.
Arylcarbonyl steht für einen über eine Carbonylgruppe gebundenen Arylsubstituenten, beispielhaft und vorzugsweise für Phenylcarbonyl, Naphthylcarbonyl und Phenanthrertylcarbonyl.
Alkylcarbonylamino steht beispielhaft und vorzugsweise für Methylcarbonylamino, Ethylcarbonyl- amino, n-Propylcarbonylamino, Isopropylcarbonylamino, tert-Butylcarbonylamino, n-Pentyl- carbonylamino und n-Hexylcarbonylamino.
Arylcarbonylamino steht beispielhaft und vorzugsweise für Phenylcarbonylamino, Naphthyl- carbonylamino und Phenanthrenylcarbonylamino.
Cycloalkyl steht für eine Cycloalkylgruppe mit in der Regel 3 bis 6 Kolilenstoffatomen, beispielhaft und vorzugsweise für Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl und Cyclohexyl.
Aryl steht für einen mono- bis tricyclischen aromatischen, carbocyclischen Rest mit in der Regel 6 bis 10 Kohlenstoffatomen; beispielhaft und vorzugsweise für Phenyl und Naphthyl.
Heterocyclyl steht für einen mono- oder polycyclischen, vorzugsweise mono- oder bicyclischen, heterocyclischen Rest mit in der Regel 5 bis 7 Ringatomen und bis zu 3, vorzugsweise bis zu 2 Heteroatomen und/oder Heterogruppen aus der Reihe N, O, S, SO, SO2. Die Heterocyclyl-Reste können gesättigt oder teilweise ungesättigt sein. Bevorzugt sind 5- bis 7-gliedrige, monocyclische gesättigte Heterocyclylreste mit bis zu zwei Heteroatomen aus der Reihe O, N und S, wie beispielhaft und vorzugsweise Tetrahydrofuranyl, Pyrrolidinyl, Pyrrolinyl, Piperidinyl, Tetrahydropyranyl, Piperazinyl, Morpholinyl und Perhydroazepinyl.
Heteroaryl steht für einen aromatischen, mono- oder bicyclischen Rest mit in der Regel 5 bis 10, vorzugsweise 5 bis 6 Ringatomen und bis zu 5, vorzugsweise bis zu 4 Heteroatomen aus der Reihe S, O und N, beispielhaft und vorzugsweise für Thienyl, Furyl, Pyrrolyl, Thiazolyl, Oxazolyl, Imidazolyl, Pyridyl, Pyrimidyl, Pyridazinyl, Indolyl, Indazolyl, Benzofuranyl, Benzothiophenyl, Chinolinyl und Isochinolinyl.
Halogen steht für Fluor, Chlor, Brom und Jod, bevorzugt Fluor und Chlor.
Beschreibung der Abbildungen:
Abb. 1: Einkristall-Röntgenstruktur von Beispiel 12A, Ortep-Plot (50 %).
Abb. 2: 1H-NMR (500 MHz, dj-Pyridin) von Beispiel 21A
Bevorzugt sind Verbindungen der Formel (Ib), in welcher
R6 Methyl bedeutet,
R7 für eine Gruppe der Formel
steht,
wobei
die Anknüpfstelle an das Amin bedeutet,
R1 2-Methylprop-l-yl, 2,2-Dimethylprop-l-yl, 2,2-Dimethylbut-l-yl,
Trimethylsilylmethyl, 1 -Hydroxy-2-methylprop- 1 -yl, 1 -Hydroxy-2,2-dimethylprop- 1-yl, l-Hydroxy-2,2-dimethyl-but-l-yl, l-Hydroxy-2-ethyl-2-inethylbut-l-yl, 1- Hy droxy-2,2-diethylbut- 1 -y 1, Phenyl-methyl, 1 -Hy droxy- 1 -pheny lmethy 1, 2- Pyridylmethyl oder 3 -Pyridy lmethy 1 bedeutet,
wobei 2-Pyridy lmethy 1 oder 3 -Pyridy lmethy 1 substituiert sein können mit 0, 1, 2 oder 3 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hy droxy, Amino, Trifluormethyl, Methyl, Methoxy und Morpholinyl,
R2 2-Methylprop-l-yl, 2,2-Dimethylprop-l-yl, 232-Dimethylbut-l-yl,
Trimethylsilylmethyl, 1 -Hydroxy-2-methylprop- 1 -yl, 1 -Hydrox;y-2,2-dimethy lprop- 1-yl, l-Hydroxy-2,2-dimethyl-but-l-yl, l-Hydroxy-2-ethyl-2-methylbut-l-yl, 1- Hydroxy-2,2-diethylbut-l-yl, Phenyl-methyl, 1-Hydroxy-l -pheny lmethy 1, 2- Pyridy lmethy 1 oder 3 -Pyridy lmethy 1 bedeutet,
wobei 2-Pyridylmethyl oder 3 -Pyridy lmethy 1 substituiert sein können mit 0, 1, 2 oder 3 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hydroxy, Amino, Trifluormethyl, Methyl, Methoxy und Morpholinyl,
R4 2-Methylprop-l-yl, 2,2-Dimethylprop-l-yl, 2,2-Dimethylbut-l-yl,
Trimethylsilylmethyl, 1 -Hydroxy-2-methylprop-l -yl, 1 -ECydroxy-2,2-dimethylprop-
1-yl, l-Hydroxy-2,2-dimethyl-but-l-yl, l-Hydroxy-2-ethyl-2-methylbut-l-yl, 1-
Hydroxy-2,2-diethylbut-l-yl, Phenyl-methyl, 1-Hydroxy-l-phenylmethyl, 2- Pyridylmethyl oder 3-Pyridylmethyl bedeutet,
wobei 2-Pyridylniethyl oder 3 -Pyridylmethyl su/bstituiert sein können mit 0, 1, 2 oder 3 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hydroxy, Amino, Trifluormethyl, Methyl, Methoxy und Morpholinyl,
R5 2-Methylprop-l-yl, 2,2-Dimethylprop-l-yl, 2,2-Dimethylbut-l-yl,
Trimethylsilylmethyl, l-Hydroxy-2-methylprop-l-yl, l-Hydroxy-2,2-dimethylprop- 1-yl, l-Hydroxy-2,2-dimethyl-but-l-yl, l-Hydroxy-2-ethyl-2-methylbut-l-yl, 1- Hydroxy-2,2-diethylbut-l-yl, Phenyl-methyl, 1-Hydroxy-l-phenylmethyl, 2- Pyridylmethyl oder 3-Pyridylmethyl bedeutet,
wobei 2-Pyridylmethyl oder 3-Pyridylmethyl substituiert sein können mit
0, 1, 2 oder 3 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hydroxy, Amino, Trifluormethyl, Methyl, Methoxy und Morpholinyl,
und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.
Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formel (Ib), in welcher
R6 Methyl bedeutet,
R7 für eine Gruppe der Formel
steht,
wobei
die Anknüpfstelle an das Amin bedeutet,
R1 2-Methylprop-l-yl, 2,2-Dimethylprop-l-yl, Trimethylsilylmethyl oder 3- Pyridylmethyl bedeutet,
wobei 3-Pyridylmethyl substituiert sein kann mit 0, 1 oder 2 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hydroxy, Amino, Trifluormethyl, Methyl, Methoxy und Morpholinyl,
R2 2-Methylprop-l-yl, 2,2-Dimethylprop-l-yl, Trimethylsilylmethyl oder 3- Pyridylmethyl bedeutet,
wobei 3-Pyridylmethyl substituiert sein kann mit 0, 1 oder 2 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hydroxy, Amino, Trifluormethyl, Methyl, Methoxy und Morpholinyl,
R4 2-Methylprop-l-yl, 2,2-Dimethylprop-l-yl, Trimethylsilylmethyl oder 3- Pyridylmethyl bedeutet,
wobei 3-Pyridylmethyl substituiert sein kann mit O, 1 oder 2 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hydroxy, Amino, Trifluormethyl, Methyl, Methoxy und Morpholinyl,
R5 2-Methylprop-l-yl, 2,2-Dimethylprop-l-yl, Trimethylsilylmethyl oder 3- Pyridylmethyl bedeutet,
wobei 3-Pyridylmethyl substituiert sein kann mit O, 1 oder 2 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hydroxy, Amino, Trifluormethyl, Methyl, Methox.y und Morpholinyl,
und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.
Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formel (Ib), in welcher
R6 Methyl bedeutet,
R7 für eine Gruppe der Formel
steht,
wobei
* die Anknüpfstelle an das Amin bedeutet,
und R1 und R2 die oben angegebene Bedeutung haben.
Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formel (Ib), in welcher
R5 Methyl bedeutet,
R7 für eine Gruppe der Formel
steht,
wobei
* die Anknüpfstelle an das Amin bedeutet,
und R4 und R5 die oben angegebene Bedeutung haben.
Gegenstand der Erfindung sind auch Verbindungen der Formel
in welcher
R1 CrC6-Alkyl, C2-C6-Alkenyl, C3-C6-Cycloalkyl oder C6-C,0-Aryl bedeutet,
wobei Alkyl, Alkenyl, Cycloalkyl und Aryl substituiert sein können, mit 0, 1, 2 oder 3 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen,
Hydroxy, Amino, Cyano, Trimethylsilyl, Ci-Cβ-Alkyl, Ci-C6-Alkoxy, Benzyloxy, C3-CO-
Cycloalkyl, Cβ-Cio-Aryl, 5- bis 7-gliedriges Heterocyclyl, 5- bis 10-gliedriges Heteroaryl,
Ci-C6-Alkylamino, Cβ-Cio-Arylamino, Ci-Cβ-Alkylcarbonylamino, C6-C10-Arylcarbonyl- amino, Ci-Cβ-Alkylcarbonyl, Ci-Cβ-Alkoxycarbonyl, Cβ-Cjo-Arylcarbonyl und Benzyloxy- carbonylamino,
worin Cycloalkyl, Aryl, Heterocyclyl und Heteroaryl ihrerseits substituiert sein können mit 0, 1, 2 oder 3 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Hydroxy, Amixio, Cyano, Nitro, Trifluormethyl, Ci-Cβ-Alkyl, C1-Ce-AIkOXy, Phenyl und 5- bis 7-gliedriges Heterocyclyl,
R2 Ci-C6-Alkyl, C2-C6-Alkenyl, C3-C6-Cycloalkyl oder C6-Ci0-Aryl bedeutet,
wobei Alkyl, Alkenyl, Cycloalkyl und Aryl substituiert sein können mit 0, 1, 2 oder 3 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Hydroxy, Amino, Cyano, Trimethylsilyl, Ci-Cβ-Alkyl, C]-C6-Alkox;y, Benzyloxy, C3-C6-
Cycloalkyl, C6-C10-Aryl, 5- bis 7-gliedriges Heterocyclyl, 5- bis 10-gliedriges Heteroaryl, Ci-Cö-Alkylammo, C6-Cio-Arylammo, Ci-Ce-Alkylcarbonylamino, Cβ-Cio-Arylcarbonyl- amino, Ci-C6-Alkylcarbonyl, Ci-C6-Alkoxycarbonyl, Cδ-Cio-Arylcarbonyl und Benzyloxy- carbonylamino,
worin Cycloalkyl, Aryl, Heterocyclyl und Heteroaryl ihrerseits substituiert sein können mit 0, 1, 2 oder 3 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Hydroxy, Amino, Cyano, Nitro, Trifluormethyl, Ci-C6-Alkyl, Ci-C6-Alkoxy, Phenyl und 5- bis 7-gliedriges Heterocyclyl,
und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.
Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher
R1 2-Methylprop-l-yl, 2,2-Dimethylprop-l-yl, 2,2-Dimethylbut-l-yl, Trimethyls ilylmethyl, 1- Hydroxy-2-methylprop-l -yl, 1 -Hydroxy-2,2-dimethylprop- 1 -yl, 1 -Hydroxy-2,2-dimethyl- but-l-yl, l-Hydroxy-2-ethyl-2-methylbut-l-yl, l-Hydroxy-2,2-diethylbut-l-yl, Phenyl- methyl, 1 -Hydroxy- 1-phenylmethyl, 2-Pyridylmethyl oder 3-Pyridylmethyl bedeutet,
wobei 2-Pyridylmethyl oder 3-Pyridylmethyl substituiert sein können mit 0, 1, 2 oder 3 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hydroxy, Amino, Trifluormethyl, Methyl, Methoxy und Morpholinyl,
R2 2-Methylprop-l-yl, 2,2-Dimethylprop-l-yl, 2,2-Dimethylbut-l-yl, Trimethylsilylmethyl, 1- Hydroxy-2-methy lprop- 1 -y 1, 1 -Hy droxy-2,2-dimethylprop- 1 -yl, 1 -Hy droxy-2,2-dimethy 1- but-l-yl, l-Hydroxy-2-ethyl-2-methylbut-l-yl, l-Hydroxy-2,2-diethylbut- l-yl, Phenyl- methyl, 1 -Hydroxy- 1-phenylmethyl, 2-Pyridylmethyl oder 3-Pyridylmethyl bedeutet,
wobei 2-Pyridylmethyl oder 3-Pyridylmethyl substituiert sein können mit 0, 1, 2 oder 3 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hydroxy, Amino, Trifluormethyl, Methyl, Methoxy und Morpholinyl,
und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.
Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher
R1 2-Methylprop-l-yl, 2,2-Dimethylprop-l-yl, Trimethylsilylmethyl oder 3-Pyridylmethyl
bedeutet,
wobei 3-Pyridylmethyl substituiert sein kann mit 0, 1 oder 2 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hydroxy, Amino, Trifluoπnethyl, Methyl, Methoxy und Morpholinyl,
R2 2-Methylprop-l-yl, 2,2-Dimethylprop-l-yl, Trimethylsilylmethyl oder 3-Pyridylmethyl bedeutet,
wobei 3-Pyridylrnethyl substituiert sein kann mit 0, 1 oder 2 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hydroxy, Amino, Trifluoπnethyl, Methyl, Methoxy und Morpholinyl,
und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.
Gegenstand der Erfindung sind auch Verbindungen der Formel
in welcher
R1 Ci-C6-Alkyl, C2-C6-Alkenyl, C3-C6-Cycloalkyl oder C6-Ci0-Aryl bedeutet,
wobei Alkyl, Alkenyl, Cycloalkyl und Aryl substituiert sein können mit 0, 1, 2 oder 3 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Hydroxy, Amino, Cyano, Trimethylsilyl, CrC6-Alkyl, CrC6-Alkoxy, Benzyloxy, C3-C6-
Cycloalkyl, C6-Ci0-Aryl, 5- bis 7-gliedriges Heterocyclyl, 5- bis 10-gliedriges Heteroaryl, Ci-C6-Alkylamino, Cβ-Cio-Arylamino, Ci-Cö-Alkylcarbonylamino, C6-Cio-Arylcarbonyl- amino, Ci-Cβ-Alkylcarbonyl, Ci-Cö-Alkoxycarbonyl, C6-C10-Arylcarbonyl und Benzryloxy- carbonylamino,
worin Cycloalkyl, Aryl, Heterocyclyl und Heteroaryl ihrerseits substituiert sein können mit 0, 1, 2 oder 3 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Hydroxy, Amino, Cyano, Nitro, Trifluormethyl, Ci-Cβ-AJkyl, Ci-Cό-Alkoxy, Phenyl und 5- bis 7-gliedriges Heterocyclyl,
IC Ci-Ce-Alkyl, C2-C6-Alkenyl, C3-C6-Cycloalkyl oder C6-Ci0-Aryl bedeutet,
wobei Alkyl, Alkenyl, Cycloalkyl und Aryl substituiert sein können mit 0, 1, 2 oder 3 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Hydroxy, Amino, Cyano, Trimethylsilyl, Cj-Cβ-Alkyl, Ci-Cβ-Alkoxy, Benzyloxy, C3-C6- Cycloalkyl, Cö-Cio-Aryl, 5- bis 7-gliedriges Heterocyclyl, 5- bis 10-gliedriges Heteroaryl, Ci-Cβ-Alkylamino, Cö-Cio-Arylamino, Ci-Cβ-Alkylcarbonylamino, C6-Cio-Arylcaτbonyl- amino, Ci-Cβ-Alkylcarbonyl, Ci-Cβ-Alkoxycarbonyl, Cβ-Cio-Arylcarbonyl und Benzyloxy- carbonylamino,
worin Cycloalkyl, Aryl, Heterocyclyl und Heteroaryl ihrerseits substituiert sein können mit 0, 1, 2 oder 3 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Hydroxy, Amino, Cyano, Nitro,
Trifluormethyl, Ci-Cό-Alkyl, Ci-Cβ-Alkoxy, Phenyl und 5- bis 7-glϊedriges Heterocyclyl,
und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formeln (Ib), wobei
[A] die Verbindungen der Formel
in welcher
R6 die oben angegebene Bedeutung hat,
zunächst mit Verbindungen der Formel
in welcher
R 5 R 5 R und R die oben angegebene Bedeutung haben,
R3 fert-Butoxycarbonyl oder Benzyloxycarbonyl bedeutet, und
X1 Halogen, bevorzugt Brom, Chlor oder Fluor, oder Hydroxy bedeutet,
und anschließend mit einer Säure und/oder durch Hydrogenolyse umgesetzt werden,
oder
[B] die Verbindungen der Formel
in welcher
R6 die oben angegebene Bedeutung hat,
zunächst mit Verbindungen der Formel
in welcher
R , R , R und R die oben angegebene Bedeutung haben,
und anschließend in einer 4-stufigen Synthese
a) mit einem Fluorid-Reagenz wie Tetrabutylammoniumfluorid,
b) mit einer Säure,
c) mit einem Dehydratisierungsreagenz, gege~benenfalls in Gegenwart einer Base, und
d) durch Hydrogenolyse
umgesetzt werden.
Verfahren [A]:
Falls X1 für Halogen steht, erfolgt die Umsetzung der ersten Stufe im .Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, gegebenenfalls in Gegenwart einer Base, bevorzugt in einem Temperaturbereich von -30°C bis 500C bei Normaldruck.
Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Tetrahydrofuran, Methylenchlorid, Pyridin, Dioxan, Dimethylacetamid, N-Methylpyrrolidin oder Dimethylformamid, bevorzugt ist Pyridin oder Dimethylformamid.
Basen sind beispielsweise Triethylamin, Diisopropylethylamin oder N-Methylmorpholin, bevorzugt ist Diisopropylethylamin.
Falls X1 für Hydroxy steht, erfolgt die Umsetzung der ersten Stufe im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, in Gegenwart eines Dehydratisierungsreagenzes, gegebenenfalls in Gegenwart einer Base, bevorzugt in einem Temperaturbereich von -300C bis 5O0C bei Normaldruck.
Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Dichlormethan oder Trichlormethan, Kohlenwasserstoff wie Benzol, Nitromethan, Dioxan, Dimethylformamid oder Acetonitril. Ebenso ist es möglich, Gemische der Lösemittel einzusetzen. Besonders bevorzugt ist Dichlormethan oder Dimethylformamid.
Als Dehydratisierungsreagenzien eignen sich hierbei beispielsweise Carbodiimide wie z.B. N1N'- Diethyl-, N1N1 -Dipropyl-, N,N'-Diisopropyl-, NN'-Dicyclohexylcarbodiimid, N-(3-Di~ methylaminoisopropyty-N'-ethylcarbodiimid-hydrochlorid (EDC), N-Cyclohexylcarbodiimid-N'- propyloxymethyl-Polystyrol (PS-Carbodiimid) oder Carbonylverbindungen wie Carbonyldiimida- zol, oder 1,2-Oxazoliumverbindungen wie 2-Ethyl-5-phenyl-l,2-oxazolϊum-3-sulfat oder 2-tert- Butyl-5-methyl-isoxazolium-perchlorat, oder Acylaminoverbindungen wie 2-Ethoxy-l-ethoxy- carbonyl-l,2-dihydrochinolin, oder Propanphosphonsäureanhydrid, oder Isobutylchloroformat, oder Bis-(2-oxo-3-oxazolidinyl)-phosphorylchlorid oder Benzotriazolyloxy-tri(dimethylamino)- phosphoniumhexafluorophosphat, oder O-(Benzotriazol- 1 -y\)-N,N,17~', N -tetra-methyluronium- hexafluorophosphat (HBTU), 2-(2-Oxo- 1 -(2H)-pyridy I)- 1,1,3,3 -tetramethyluroniumtetrafluoro- borat (TPTU) oder 0-(7-Azabenzotriazol-l-yl)-N,N,N',N'-tetramethyl-uroniumhexafluorophosphat (HATU), oder 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt), oder Benzotriazol-l-3/loxytris(dimethylamino)- phosphoniumhexafluorophosphat (BOP), oder Benzotriazol-l-yloxytris(pyrrolidino)-phospho- niumhexafluorophosphat (PyBOP)3 oder N-Hydroxysuccinimid, oder Mischungen aus diesen, mit Basen.
Basen sind beispielsweise Alkalicarbonate, wie z.B. Natrium- oder Kaliumcarbonat, oder -hy- drogencarbonat, oder organische Basen wie Trialkylamine z.B. Triethylamin, N'-Methylmorpholin, N-Methylpiperidin, 4-Dimethylaminopyridin oder Diisopropylethylamin.
Vorzugsweise wird die Kondensation mit HATU oder mit EDC in Gegenwart von HOBt durchgeführt.
Die Umsetzung mit einer Säure in der zweiten Stufe des Verfahrens erfolgt bevorzugt in einem Temperaturbereich von O0C bis 4O0C bei Normaldruck.
Als Säuren eignen sich hierbei Chlorwasserstoff in Dioxan, Bromwasserstoff in Essigsäure oder Trifluoressigsäure in Methylenchlorid.
Die Hydrogenolyse in der zweiten Stufe des Verfahrens erfolgt im Allgemeinen in einem Lösungsmittel in Gegenwart von Wasserstoff und Palladium auf Aktivkohle, bevorzugt in einem Temperaturbereich von O0C bis 40°C bei Normaldruck.
Lösungsmittel sind beispielsweise Alkohole wie Methanol, Ethanol, n-Propanol oder iso-Propanol, in einem Gemisch mit Wasser und Essigsäure oder wässriger Salzsäure, bevorzπugt ist ein Gemisch aus Ethanol, Wasser und Essigsäure oder ein Gemisch aus iso-Propanol und wässriger Salzsäure.
Verfahren [B]:
Die Umsetzung der Verbindungen der Formel (IV) mit Verbindungen der Formel (V) oder (VII) erfolgt im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, in Gegenwart eines Dehydratisierungsreagenzes, gegebenenfalls in Gegenwart einer Base, bevorzugt in einem Temperaturbereich von -3O0C bis 500C bei Normaldruck.
Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Dichlormethan oder Trichlormethan, Kohlenwasserstoff wie Benzol, Nitromethan, Dioxan, Dimethylformamid oder Acetonitril. Ebenso ist es möglich, Gemische der Lösemittel einzusetzen. Besonders bevorzugt ist Dichlormethan oder Dimethylformamid.
Als Dehydratisierungsreagenzien eignen sich hierbei beispielsweise Carbodiϊmide wie z.B. N,N'- Diethyl-, N,N -Dipropyl-, NN'-Diisopropyl-, N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid, N-(3-Di- methylaminoisopropy l)-N'-ethylcarbodiimid-hydrochlorid (EDC), N-Cyclohexylcarbodiimid-N '- propyloxymethyl-Polystyrol (PS-Carbodiimid) oder Carbonylverbindungen wie Carbonyldiimida- zol, oder 1 ,2-Oxazoliumverbindungen wie 2-Ethyl-5-phenyl-l,2-oxazolium-3-sulfat oder 2-tert- Butyl-5-methyl-isoxazoliurn-perchlorat, oder Acylaminoverbindungen wie 2-Ethoxy-l-ethoxy- carbonyl-l,2-dihydrochinolin, oder Propanphosphonsäureanhydrid, oder Isobutylchloroformat,
oder Bis-(2-oxo-3-oxazolidinyl)-phosphorylchlorid oder Benzotriazolyloxy-tri(dimethylamino)- phosphoniumhexafluorophosphat, oder O-(Benzotriazol-l -yl)-N,N,N',N'-tetra-methyluronium- hexafluorophosphat (HBTU), 2-(2-Oxo-l-(2H)-pyridyl)-l,l,3,3-tetramethyluroniumtetrafluoro- borat (TPTU) oder ^-(y-Azaberizotriazol-l-yO-N.NN'.N'-tetramethyl-uroniumhexafluorophosphat (HATU), oder 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt), oder Benzotriazol-l-yloxytris(dimethylamino)- phosphoniumhexafluorophosphat (BOP), oder Benzotriazol-l-yloxytris(pyrrolidino)-phospho- niumhexafluorophosphat (PyBOP), oder N-Hydroxysuccinimid, oder Mischungen aus diesen, mit Basen.
Basen sind beispielsweise Alkalicarbonate, wie z.B. Natrium- oder Kaliumcarbonat, oder -hy- drogencarbonat, oder organische Basen wie Trialkylamine z.B. Triethylamin, N-Methylmorpholin, N-Methylpiperidin, 4-Dimethylarninopyridin oder Diisopropylethylamin.
Vorzugsweise wird die Kondensation mit HATU oder mit einer Mischung aus EDC und HOBt durchgeführt.
Die Umsetzung mit Tetrabutylaxnmoniumfluorid in der ersten Stufe (a) des weiteren Verfahrens erfolgt im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, bevorzugt in einem Temperaturbereich von O0C bis 400C bei Normaldruck.
Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Dichlormethan oder Trichlormethan, oder Ether Λvie Tetrahydrofuran oder Dioxan. Besonders bevorzugt ist Tetrahydrofuran.
Die Umsetzung mit einer Säure in der zweiten Stufe (b) des Verfahrens erfolgt bevorzugt in einem Temperaturbereich von 00C bis 400C bei Normaldruck.
Als Säuren eignen sich hierbei Chlorwasserstoff in Dioxan, Bromwasserstoff in Essigsäure oder Trifluoressigsäure in Methylenchlorid.
Die Umsetzung in der dritten Stufe (c) des Verfahrens erfolgt analog zu der Umsetzung von Verbindungen der Formel (IV) mit Verbindungen der Formel (V) oder (VII).
Die Hydrogenolyse in der vierten Stufe (d) des Verfahrens erfolgt im Allgemeinen in einem Lösungsmittel in Gegenwart von Wasserstoff und Palladium auf Aktivkohle, bevorzugt in einem Temperaturbereich von O0C bis 400C bei Normaldruck.
Lösungsmittel sind beispielsweise Alkohole wie Methanol, Ethanol, n-Propanol oder iso-Propanol, in einem Gemisch mit Wasser und Essigsäure oder wässriger Salzsäure, bevorzugt ist ein Gemisch aus Ethanol, Wasser und Essigsäure oder ein Gemisch aus iso-Propanol und wässriger Salzsäure.
Die Verbindung der Formel (H) läßt sich durch Hydrierung, enzymatische Spaltung und erneute Zyklisierung aus Lysobactin (Beispiel IA) oder Katanosin A. synthetisieren, wie im experimentellen Teil unter Beispiel 2A, 3A und 2OA bis 26A beschrieben. Die Verbindung der Formel (FV) ist eine Zwischenstufe bei dieser Synthesesequenz.
Die Verbindungen der Formeln (IH), (V), (VI) und (VE) sind bekannt oder lassen sich nach bekannten oder nach dem unten beschriebenen Verfahren aus den entsprechenden Edukten synthetisieren.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann durch folgende Syntheseschemata verdeutlicht werden.
Syntheseschema 1:
H
(1 ) Chymotrypsin-Spaltung (2) Schutzgruppeneinführung
Syntheseschema 2:
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel 2-(Trimethylsilyl)ethyl-(3i?)-3-amino-N2-[(benzyloxy)carbonyl]-L-phenyl- alaninat-trifluoroacetat (Beispiel 1 9A)
dadurch gekennzeichnet, dass in einer 6-stufigen Synthese die Verbindung der Formel (rac)-3- [(t erf-Butoxycarbony l)amino] -3 -pheny lpropansäuremethy lester
a) in Gegenwart einer Base, bevorzugt Lithiumhexamethyldisilazid, mit Dibenzylazadicarboxylat,
b) mit N,N,N,N,-Tetramethylguanidin,
c) mit Wasserstoff in Gegenwart von Raney-Νickel,
d) mit N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimidester in Gegenwart einer Base, bevorzugt N- Methylmorpholin,
e) mit einer Base, bevorzugt Lithiumhydroxid, und anschließender chromatographischer Enantionmerentrennung,
und
f) mit Trifluoressigsäure in Dichlormethan oder Chlorwasserstoff in Dioxan
umgesetzt wird.
Die detaillierte Synthese ist im experimentellen Teil unter Beispiel 12A bis Beispiel 19A
beschrieben.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verbindung der Formel
oder
oder
oder
oder
oder
36A)
oder
oder
2-(Trimethylsilyl)ethyl-(35)-3-amino-N2-[(benzyloxy)carbon3'l]-D-phenylalaninat-trifluoracetat (Beispiel 38A)
Die erfϊndungsgemäßen Verbindungen zeigen ein nicht vorhersehbares, wertvolles pharmakologisches Wirkspektrum. Sie zeigen eine antibakterielle Wirkung.
Sie eignen sich daher zur Verwendung als Arzneimittel zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten bei Menschen und Tieren.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeichnen sich durch eine geringere Nephrotoxizität gegenüber Lysobactin aus.
Die erfϊndungsgemäßen Verbindungen zeichnen sich durch eine verbesserte Stabilität in wässrigem neutralen bis basischen Milieu aus. Diese Eigenschaft verbessert die Lagerung der erfindungsgemäßen Verbindungen und die Darreichung als Arzneimittel.
Die beschriebenen Nonadepsipeptide wirken als Inhibitoren der bakteriellen Zellwandbiosynthese.
Besonders wirksam sind die erfindungsgemäßen Zubereitungen gegen Bakterien und bakterienähnliche Mikroorganismen. Sie sind daher besonders gut zur Prophylaxe und Chemotherapie von lokalen und systemischen Infektionen in der Human- und Tiermedizin geeignet, die durch diese Erreger hervorgerufen werden.
Grundsätzlich können die erfindungsgemäßen Zubereitungen gegen alle Bakterien und bakterienähnlichen Mikroorganismen verwendet werden, die im Besitz einer bakteriellen Zellwand (Murein sacculus) bzw. den dazugehörigen Enzymsystemen sind, beispielsweise durch die folgenden Erreger oder durch Mischungen der folgenden Erreger:
Gram-negative Kokken (Neisseria gonorrhoeae) sowie Gram-negative Stäbchen wie Enterobakteriaceen, z.B. Escherichia coli, Hämophilus influenzae, Pseudomonas, Klebsiella, Citrobacter (C. freundii, C. divernis), Salmonella und Shigella; ferner Enterobacter (E. aerogenes, E. agglomerans), Hafnia, Serratia (S. marcescens), Providencia, Yersinia, sowie die Gattung Acinetobacter, Branhamella und Chlamydia. Darüber hinaus umfasst das antibakterielle Spektrum strikt anaerobe Bakterien wie z.B. Bacteroides fragilis, Vertreter der Gattung Peptococcus, Peptostreptococcus sowie die Gattung Clostridium; ferner Mykobakterien, z.B. M. tuberculosus. Besonders ausgeprägte Wirkung zeigen die erfindungsgemäßen Verbindungen gegen Gram-positive Kokken, z.B. Staphylokokken (S. aureus, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. carnosus), Enterokokken (E. faecalis, E. faecium) und Streptokokken (S. agalactiae, S. pneumoniae, S. pyogenes).
Die obige Aufzählung von Erregern ist lediglich beispielhaft und keinesΛvegs beschränkend aufzufassen. Als Krankheiten, die durch die genannten Erreger oder Mischinfektionen verursacht und durch die erfindungsgemäßen Zubereitungen verhindert, gebessert oder geheilt werden können, seien beispielsweise genannt:
Infektionskrankheiten beim Menschen wie z.B. unkomplizierte und komplizierte Harnwegsinfekte, unkomplizierte Haut- und Oberflächeninfektionen, komplizierte Haut- und Weichteilinfektionen, im Hospital und ambulant erworbene Lungenentzündung, nosokomiale Pneumonien, akute Exazerbationen und sekundäre bakterielle Infektionen der chronischen Bronchitis, akute Otitis media, akute Sinusitis, streptokokkale Pharyngitis, bakterielle Meningitis, unkomplizierte gonokokkale und nicht-gonokokkale Urethritis/Cervizitis, akute Prostatitis, Endocarditis, unkomplizierte und komplizierte intra-abdominale Infektionen, gynäkologische Infektionen, pelvische Entzündungskrankheit, bakterielle Vaginose, akute und chronische Osteomyelitis, akute bakterielle Arthritis, empirische Therapie in febrilen neutropenischen Patienten, desweiteren
Bakterämien, MRSA Infektionen, akute infektiöse Diarrhoe, Helicobacter pylori Infektionen, postoperative Infektionen, odontogene Infektionen, ophthalmologische Infektionen, postoperative Infektionen (inkl. periproktaler Abszess, Wundinfektionen, Galleninfektionen, Mastitis und akute Appendizitis), zystische Fibrose und Bronchiectasis.
Außer beim Menschen können bakterielle Infektionen auch bei anderen Spezies behandelt werden. Beispielhaft seien genannt:
Schwein: Diarrhoe, Enterotoxamie, Sepsis, Dysenterie, Salmonellose, Metritis-Mastitis- Agalaktiae-Syndrom, Mastitis;
Wiederkäuer (Rind, Schaf, Ziege): Diarrhoe, Sepsis, Bronchopneumonie, Salmonellose, Pasteurellose, Genitalinfektionen;
Pferd: Bronchopneumonien, Fohlenlähme, puerperale und postpuerperale Infektionen, Salmonellose;
Hund und Katze: Bronchopneumonie, Diarrhoe, Dermatitis, Otitis, Harnwegsinfekte, Prostatitis;
Geflügel (Huhn, Pute, Wachtel, Taube, Ziervögel und andere): E. co/z-Infektionen, chronische Luftwegserkrankungen, Salmonellose, Pasteurellose, Psittakose.
Ebenso können bakterielle Erkrankungen bei der Aufzucht und Haltung von Nutz- und Zierfischen behandelt werden, wobei sich das antibakterielle Spektrum über die vorher genannten Erreger hinaus auf weitere Erreger wie z.B. Pasteurella, Brucella, Campylobacter, Listeria, Erysipelothris, Corynebakterien, Borellia, Treponema, Nocardia, Rikettsia, Yersinia, erweitert.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist der Einsatz der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere von bakteriellen Infektionskrankheiten.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.
Bevorzugt werden die erfϊndungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung von Arzneimitteln ver- wendet, die zur Prophylaxe und/oder Behandlung von bakteriellen Erkrankungen geeignet sind.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen, unter Verwendung einer antibakteriell wirksamen Menge der erfmdungsgemäßen Verbindungen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, enthaltend mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung und mindestens einen oder mehrere weitere Wirkstoffe, insbesondere zur Behandlung und/oder Prophylaxe der zuvor genannten Erkrankungen. Bevorzugte Kombinationswirkstoffe sind antibakteriell wirkende Verbindungen, die ein anderes Wirkspektrum, insbesondere ergänzendes Wirkspektrum, haben und/oder synergistisch zu den erfindungsgemäßen Verbindungen sind.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck können sie auf geeignete Weise appliziert werden, wie z.B. oral, parenteral, pulmonal, nasal, sublingual, lingual, buccal, rectal, dermal, transdermal, conjunctival, otisch oder als Implantat bzw. Stent.
Für diese Applikationswege können die erfindungsgemäßen Verbindungen in geeigneten Applikationsformen verabreicht werden.
Für die orale Applikation eignen sich nach dem Stand der Technik funktionierende schnell und/oder modifiziert die erfindungsgemäßen Verbindungen abgebende Applikationsformen, die die erfindungsgemäßen Verbindungen in kristalliner und/ oder amorphisierter und/oder gelöster Form enthalten, wie z.B. Tabletten (nichtüberzogene oder überzogene Tabletten, beispielsweise mit magensaftresistenten oder sich verzögert auflösenden oder unlöslichen Überzügen, die die Freisetzung der erfindungsgemäßen Verbindung kontrollieren), in der Mundhöhle schnell zerfallende Tabletten oder Filme/Oblaten, Filme/Lyophylisate, Kapseln (beispielsweise Hart- oder Weichgelatinekapseln), Dragees, Granulate, Pellets, Pulver, Emulsionen, Suspensionen, Aerosole oder Lösungen.
Die parenterale Applikation kann unter Umgehung eines Resorptionsschrittes geschehen (z.B. intravenös, intraarteriell, intrakardial, intraspinal oder intralumbal) oder unter Einschaltung einer Resorption (z.B. intramuskulär, subcutan, intracutan, percutan odeτ intraperitoneal). Für die
parenterale Applikation eignen sich als Applikationsformen, u.a. Injektions- und Infusionszubereitungen in Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Lyophilisaten oder sterilen Pulvern.
Für die sonstigen Applikationswege eignen sich z.B. Inhalationsarzneiformen (u.a. Pulverinhalatoren, Nebulizer), Nasentropfen, -lösungen, -sprays; lingual, sublingual oder buccal zu applizierende Tabletten, Filme/Oblaten oder Kapseln, Suppositorien, Ohren- oder Augenpräparationen, Vaginalkapseln, wäßrige Suspensionen (Lotionen, Schüttelmixturen), lipophile Suspensionen, Salben, Cremes, transdermale therapeutische Systeme (wie beispielsweise Pflaster), Milch, Pasten, Schäume, Streupuder, Implantate oder Stents.
Die erfϊndungsgemäßen Verbindungen können in die angeführten Applikationsformen überfuhrt werden. Dies kann in an sich bekannter Weise durch Mischen mit inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen geschehen. Zu diesen Hilfssto ffen zählen u.a. Trägerstoffe (beispielsweise mikrokristalline Cellulose, Laktose, Mannitol), Lösungsmittel (z.B. flüssige Polyethylenglycole), Emulgatoren und Dispergier- oder Netzmittel (beispielsweise Natriumdodecylsulfat, Polyoxysorbitanoleat), Bindemittel (beispielsweise Polyvinylpyrrolidon), synthetische und natürliche Polymere (beispielsweise Albumin), Stabilisatoren (z.B. Antioxidantien wie beispielsweise Ascorbinsäure), Farbstoffe (z.B. anorganische Pigmente wie beispielsweise Eisenoxide) und Geschmacks- und / oder Geruchskorrigentien.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, die mindestens eine erfmdungsgemäße Verbindung, üblicherweise zusammen mit einem oder mehreren inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen enthalten, sowie deren Verwendung zu den zuvor genannten Zwecken.
Im Allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, bei intravenöser Applikation Mengen von etwa 0.001 bis 100 mg/kg, vorzugsweise etwa 0.1 bis 10 mg/kg Körpergewicht zur Erzielung wirksamer Ergebnisse zu verabreichen, und bei oraler Applikation beträgt die Dosierung etwa 0.01 bis 50 mg/kg, vorzugsweise 0.5 bis 10 mg/kg Körpergewicht.
Trotzdem kann es gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit von Körpergewicht, Applikationsweg, individuellem Verhalten gegenüber dem Wirkstoff, Art der Zubereitung und Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchem die Applikation erfolgt. So kann es in einigen Fällen ausreichend sein, mit weniger als der vorgenannten Mindestmenge auszukommen, während in anderen Fällen die genannte obere Grenze überschritten werden muss. Im Falle der Applikation größerer Mengen kann es empfehlenswert sein, diese in mehreren Einzelgaben über den Tag zu verteilen.
Die Prozentangaben in den folgenden Tests und Beispielen sind, sofern nicht anders angegeben, Gewichtsprozente; Teile sind Gewichtsteile. Lösungsmittelverhältnisse, Verdünnungsverhältnisse und Konzentrationsangaben von flüssig/flüssig-Lösungen beziehen sich jeweils auf das Volumen.
A. Beispiele
Abkürzungen
AlIg. Allgemein(e)
Area (Peak)fläche ber. berechnet
BHI Brain Heart Infusion
Boc ter£-Butoxycarbonyl br. breites Signal (bei NMR-Spektren)
Bsp. Beispiel d Dublett (bei NMR-Spektren)
DC Dünnschichtchromatographie
DCC Dicyclohexylcarbodiimid
DCI direkte chemische Ionisation (bei MS)
DCM Dichlormethan
DIEA NN-Diisopropylethylamin
DMAP 4-N,N-DimethyIaminopyridin
DMSO Dimethylsulfoxid
DMF NN-Dimethylformamid d. Th. der Theorie
EDC l-Ethyl-3-(3-dimethylaminoprop3'l)carbodiimide (auch EDCI)
EDCxHCl 1 -Ethyl-3 -(3 -dimethylaminopropyl)carbodiimide-hy drochlorid
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure (Ethylene Diamine Tetraacetic Acid)
EE Ethylacetat (Essigsäureethylester)
EI Elektronenstoß-Ionisation (bei MS)
ESI Elektrospray-Ionisation (bei MS)
Fa. Firma
Fp. Schmelzpunkt gef. gefunden ges. gesättigt h Stunde
HATU (^-(V-Azabenzotriazol-l-yO-A/'^N^N'-tetramethyluronium-hexa- fluorphosphat
HOBt 1 -Hydroxybenzotriazol
HPLC Hochdruck-, Hochleistungsflüss igchromatographie
HR High Resolution (Hochauflösung)
i. V. im Vakuum konz. Konzentriert
LC-MS Flüssigchromatographie-gekoppelte Massenspektroskopie
LDA Lithium-Diisopropylamid
LLA(3 -cyclohexyl) D-Leu-Leu-(3 -cyclohexy I)AIa
LLF D-Leu-Leu-Phe m middle (mittel) (bei UV- und IR-Spektren) m Multiple« (bei NMR-Spektren)
MALDI Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization
MHK Minimale Hemmkonzentration min Minute/Minuten
MRSA Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus
MS Massenspektroskopie
NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards neg. negativ
NMM N-Methylmorpholin
NMR Kernresonanzspektroskopie (nuclear magnetic resonance) p.a. pro analysi
Pd Palladium
Pd-C Palladium auf Kohle pos. positiv proz. Prozentig
PTFE Polytetrafluorethylen quant. quantitativ
RP-HPLC Reverse Phase HPLC
RT Raumtemperatur
Rt Retentionszeit (bei HPLC)
S strong (stark) (bei UV- und IR-Spektren)
S Singulett (bei ΝMR-Spektren)
TBAF Tetrabutylammoniumfluorid
TBTU O-(Benzotriazol- 1 -yl)-NN,N' N'-tetramethyluronium-
Tetrafluoroborat
TCTU 0-(lH-6-Chlorbenzotriazol-l-yl)-l,l,3,3-tetramethyluronium
Tetrafluoroborat
TFA Trifluoressigsäure
TFE 2,2,2-Trifluorethanol
THF Tetrahydrofuran
TMG N,N,N,N-Tetramethylguanidin
TMSE 2-(Trimethylsilyl)ethyl
TOF Flugzeit (time of flight)
UV Ultraviolett
Vis sichtbar (visible)
VRSA Vancomycin-resistenter Stapylococcus aureus
W weak (schwach) (bei UV- und IR-Spektren) wäßr. wäßrig(e)
Z, Cbz Benzyloxycarbonyl
Literatur
Zur Nomenklatur der Peptide und Cyclodepsipeptide vergleiche:
1. A Guide to IUPAC Nomenclature of Organic Compounds (Recommendations 1993), 1993, Blackwell Scientifϊc publications.
2. Nomenclature and symbolism for amino acids and peptides. Recommendations 1983. IUPAC- IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature, UK. Biochemical Journal 1984, 219, 345-373. Sowie zitierte Literatur.
Allgemeine Methoden GC-MS, LC-MS, HR-MS, HPLC und Gelchromatographie
Methode 1 (TOF-HR-MS): TOF-HR-MS-ESI+ Spektren werden mit einem Micromass LCT Gerät (Kapillarspannung: 3.2 KV, Cone-Spanmmg: 42 V, Quellentemperatur: 1200C, Desolvations-Temperatur: 2800C) aufgenommen. Hierzu wird eine Spritzenpumpe (Fa. Harvard Apparatus) für die Probenzuführung verwendet. Als Standart dient Leucin-Enkephalin (Tyr-Gly- Gly-Phe-Leu).
Methode 2 (Analytische HPLC; Synergi): Gerätetyp HPLC: HP 1100 Series; UV DAD; S-äule: Phenomenex Synergi 2μ Hydro-RP Mercury 20 mm x 4 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + l_0 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril; Gradient: 0.0 min 90%A -> 2.5 min 30%A -E^ 3.0 min 5%A -> 4.5 min 5%A; Fluss: 0.0 min 1 ml/min, 2.5 min/3.0 min/4.5 min. 2 ml/min; Ofen: 5O0C; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 3 (Analytische HPLC; Synergi): Gerätetyp HPLC: HP 1050 Series; UV DAD; Säule: Phenomenex Synergi 2μ Max-RP Mercury 20 mm x 4 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + O.05%
Trifluoressigsäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril; Gradient: 0.0 min 90%A -> 2.5 min 30%A -» 3.0 min 5%A -> 4.5 min 5%A; Fluss: 0.0 min 1 ml/min, 2.5 min/3.0 min/4.5 min. 2 ml/min; Ofen: 5O0C; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 4 (Analytische HPLC): Gerätetyp HPLC: HP 1050 Series; UV DAD 1100 Series; Säule: Kromasil C]8, 6O x 2 mm, 3.-5 μm; Eluent A: Wasser/0.5% Perchlorsäure, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0-0.5 min 2%B, 0.5-4.5 min 2-90%B, 4.5-6.5 min 90%B, 6.5-6.7 min 90- 2%B, 6.7-7.5 min 2%B; Fluss: 0.75 ml/min, Ofen: 3O0C, UV-Detektion 210 nm.
Methode 5 (LC-MS): Gerätetyp MS: Micromass LCT (ESI pos./neg.); Gerätetyp HPLC: HP 1100 Series; UV DAD 1100 Series; Säule SymmetryPrep™Ci8, Fa. Waters, 50 x 2.1 mm, 3.5 μm; Eluent A: Wasser/0.1% Ameisensäure, Eluent B: Acetonitril/0.1% Ameisensäure; Gradient: 0- 1 min 0%B, 1-6 min 0-90%B, 6-8 min 90-100%B, 8-10 min 100%B, 10-10.1 min 100-0%B, 10.1-12 min 0%B, anschließend Regeneration der Chromatographiesäule. Ofen: 4O0C, Fluss: 0.5 ml/min (bei 10.1 min kurzfristig auf 1 ml/min), UV-Detektion: 210 nm.
Methode 6 (Präparative HPLC; Xterra, C18, 0.1% TFA): Gerät: Gilson Abimed HPLC; binäres Pumpensystem; Säule: Xterra, Fa. Waters, 5 μm; 150 x 10 mm; Eluent A: Wasser/0.1% Trifluor- essigsäure, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0-7 min 5%B, 7-9 min 5-40%B, 9-11 min 40%B, 11- 18 min 40-90%B, anschließend Regeneration der Chromatographiesäule; Fluss: 8 ml/min; UV Detektor 210 nm.
Methode 7 (LC-MS): Gerätetyp MS: Micromass ZQ; Gerätetyp HPLC: Waters Alliance 2795; Säule: Phenomenex Synergi 2μ Hydro-RP Mercury 20 mm x 4 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90%A -> 2.5 min 30%A -> 3.0 min 5%A -> 4.5 min 5%A; Fluss: 0.0 min 1 ml/min, 2.5 min/3.0 min/4.5 min 2 ml/min; Ofen: 5O0C; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 8 (LC-MS): Instrument: Micromass Quattro LCZ mit HPLC Agilent Serie 1100; Säule: Phenomenex Synergi 2μ Hydro-RP Mercury 20 mm x 4 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90%A -> 2.5 min 30%A ■» 3.0 min 5%A -> 4.5 min 5%A; Fluss: 0.0 min 1 ml/min, 2.5 min/3.0 min/4.5 min 2 ml/min; Ofen: 5O0C; UV-Detektion: 208- 400 nm.
Methode 9 (Aminosäureanalyse): Die Aminosäureanalysen werden mit einem Aminosäureanalysator LC3000 von Eppendorf/Biotronik durchgeführt. Ein leicht modifiziertes Standardtrennprogramm von Eppendorf/Biotronik wird benutzt. Die Trennprogramme und die Funktion des Analysators sind ausführlich im Handbuch des Gerätes beschrieben (Handbuch des Aminosäureanalysators LC 3000, Wissenschaftliche Geräte GmbH Biotronik, Maintal, 1996).
Methode 10 (Präparative HPLC, Nucleodur, TF A>: Gerät: Gilson Abimed HPLC; binäres Pumpensystem; Säule: Nucleodur Ci8 Gravity, Fa. Macherey-Nagel, 5 μm; 250 x 21 mm; Eluent A: Wasser/0.1% Trifluoressigsäure, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0-8 min 5%B, 8-40 min 5-60%B, 40-60 min 60%B, 60-75 min 60-100%B, 75-80 min 100%B, anschließend Regeneration der Chromatographiesäule; Fluss: 7-15 ml/min; UV Detektox 210 nm.
Methode 11 (Präparative HPLC, Nucleodur, Essigsäure): Gerät: Gilson Abimed HPLC; binäres Pumpensystem; Säule: Nucleodur Ci8 Gravity, Fa. Macherey-Nagel, 5 μm; 250 x 40 mm; Eluent A: Wasser/0.2% Essigsäure, Eluent B: Acetonitril/0.2%Essigsäure; Gradient: 0-10 min 10%B, 10-24 min 10-30%B, 24-28 min 30-50%B, 28—35 min 50%B, 35-45 min 50-60%B, 45- 53 min 60-70%B, 53-60 min 60-90%B, 60-70 min 100%B, anschließend Regeneration der Chromatographiesäule; Fluss: 15-45 ml/min; UV Detettor 210 nm.
Methode 12 (Präparative HPLC, Symmetry, Essigsäure): Gerät: Gilson Abimed HPLC; binäres Pumpensystem; Säule: SymmetryPrep™C]8, Fa. Waters, 7 μm; 300 x 19 mm; Eluent A: Wasser/0.5-0.25% Essigsäure, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0-2 min 5%B, 2-60 min 5-90%B, 60-80 min 100%B, anschließend Regeneration der Clnromatographiesäule; Fluss: 7 ml/min; UV Detektor 210 nm.
Methode 13 (Präparative HPLC; Kromasil, Essigsäure): Gerät: Gilson Abimed HPLC; binäres Pumpensystem; Säule: Kromasil-IOOA Ci8, 5 μm; 250 x 30 mm; Eluent A: Wasser/0.25% Essig¬ säure, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0-3 min 5%B, 3-30 min 5-100%B, 30-38 min 100%B, anschließend Regeneration der Chromatographiesäule; Tluss: 25 ml/min; UV Detektor 210 nm.
Methode 14 (Gelchromatographie an Sephadex LH— 20): Gelchromatographie wird ohne Druck an Sephadex LH-20 (Fa. Pharmacia) durchgeführt. Es wird nach UV-Aktivität (UV Detektor für 254 nm, Fa. Knauer) fraktioniert (Fraktionssammler ISCO Foxy 200). Säulendimensionen: 32 x 7 cm (1000-100 μmol Maßstab); 30 x 4 cm (100—10 μmol Maßstab); 25 x 2 cm (10-1 μmol Maßstab). Als Eluent wird Methanol oder Methanol/0.2% Essigsäure verwendet.
Methode 15 (Chirale präparative HPLC): Säule (StaJhtlsäule, Dimension 250x30 mm); stationäre Phase (chirales Kieselsäure/Polyamid Komposit KBD 5326, basierend auf dem Selektor PoIy(N- methacryolyl-L-leucin-dicyclopropylmethylamid); Eluent Essigsäureethylester, isokratisch; Fluss: 25 ml/min; Temperatur: 240C; UV-Detektion: 225 nm; Probe: Repetitive Injektion von 2000 μl.
Methode 16 (Bestimmung der Enantiomerenreinraeit): Säule (Stahlsäule, Dimension 250 x 4.6 mm); stationäre Phase (chirales Kieselsäure/Polyamid Komposit KBD 5326, basierend auf dem Selektor Poly(N-methacryolyl-L-leucin-dicyclopropylxnethylamid); Eluent Essigsäure-ethylester,
isokratisch; Fluss: 1 ml/min; Temperatur: 250C; UV-Detektion: 220 nm; Probe: Injektion von 10 μl.
Methode 17 (Analytische HPLC): Gerätetyp HPLC: HP 1100 Series; UV DAD Säule: Zorbax Eclipse XBD-C8 (Agilent), 150 mm x 4.6 mm, 5 μm; Eluent A: 5 ml HC1O4/1 Wasser, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0-1 min 10%B, 1-4 min 10-90%B, 4-5 min 90%B; Fluss: 2.0 ml/min; Ofen: 3O0C; UV-Detektion: 210 und 254 nm.
Methode 18 (Analytische HPLC): Säule: Kromasil RP-18, 60 mm x 2 mm, 3.5 μm; Eluent A: 5 ml HCIO4/I Wasser, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0 min 2%B, 0.5 min 2%B, 4.5 min 90%B, 9 min 90%B; Fluss: 0.75 ml/min; Ofen: 300C; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 19 (Analytische HPLC): Säule: Kromasil RP-18, 250 mm x 4 mm, 5 μm; Eluent A: 5 ml HCIO4/I Wasser, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0 min 5%B, 10 min 95%B; Fluss: 1 ml/min; Ofen: 400C; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 20 (Analytische HPLC): Säule: Kromasil RP-18, 250 mm x 4 mm, 5 μm; Eluent A: 2 ml HCIO4/I Wasser, Eluent B: Acetonitril; Isokratisch: 45%B, 55%A; Fluss: 1 ml/min; Ofen: 400C; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 21 (Präparative HPLC; Nucleodur, 0.05-0.1%TF A): Gerät: Gilson Abimed HPLC; binäres Pumpensystem; Säule: Nucleodur Qg Gravity, Fa. Macherey-Nagel, 5 μm, 250 x 21 mm; Eluent A: Wasser/0.05-0.1% TFA, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0-8 min 5%B, 8-40 min 5- 60%B, 40-60 min 60%B, 60-75 rnin 60-100%B, 75-80 min 100%B, anschließend Regeneration der Chromatographiesäule; Fluss: 7-15 ml/min; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 22 (Analytische HPLC): Gerätetyp HPLC: HP 1050 Series; UV DAD 1100 Series; Säule: Kromasil C18, 60 mm x 2 mm, 3.5 μm; Eluent A: Wasser/0.5% Perchlorsäure, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0-0.5 min 2% B, 0.5-4.5 min 2-90% B, 4.5-9.0 min 90% B, 9.0-9.2 mia 90-2% B, 9.2-10.0 min 2% B; Fluss: 0.75 ml/min, Ofen: 300C, UV-Detektion 210 nm. .
Methode 23 (Analytische HPLC): Agilent 1100 mit DAD (G1315B), Binary Pump (G1312A), Autosampier (G1313A), Entgaser (G1379A) und Säulenthermostat (G1316A); Säule: Synergi 4 μ. Hydro-RP 80A, 4.6 x 150 x 5 nun; Eluens A: Wasser + 0.05% 70%ige Perchlorsäure; Eluens Br Acetonitril; Gradient: 0-1 min 10% B, Rampe, 4-5 min 90% B, Rampe, 5.5 min 10% B; Fluss z 2.00 ml/min; Ofentemperatur: 3 O0C.
Methode 24 (Analytische HPLC): Gerät: Agilent 1100 mit DAD (G1315B), binärer Pumpe (Gl 312A), Autosampier (Gl 313A), Lösemittel-Entgaser (Gl 379A) und Säulenthermostat:
(G1316A); Säule: Agilent Eclipse XDB-C8 4.6 x 150 x 5 mm; Eluent A: 0.05% 70%ige Perchlorsäure in Wasser; Eluent B: Methanol; Isokratisch: 0-7 min 55% B; Fluss: 2.00 ml/min; Säulentemperatur: 4O0C.
Methode 25 (Analytische HPLC): Gerätetyp HPLC: HP 1050 Series; LW BAD; Säule: Zorbax 300 mSB-C18 3.5 μ, 4.6 mm x 150 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.1% Trifluoressigsäure, Eluent B: 400 ml Acetonitril/600 ml Wasser + 0.1% Trifluoressigsäure; Gradient: 0.0 rnin 100%A, 1.3 min 10%B, 18.0 min 80%B, 20.0 min 80%B, 21.0 min 100%B, 25.0 min 100«%B, 26.0 min 0%B, 30.0 min 0%B. Fluss: 1 ml/min; Ofen: 400C; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 26 (Chirale HPLC): Gilson Abimed HPLC; Säule: Daicel Chiralpak AD-H 5 um; 250 mm x 20 mm; Eluent A: /so-Hexan, Eluent B: 0.2% Essigsäure/1% Wasser/2-Propanol; isokratisch; Fluss: 15 ml/min; UV-Detektor 212 nm.
Methode 27 (Bestimmung der Enantiomerenreinheit): Stahlsäule: Dimension 250 mm x 4.6 mm; stationäre Phase: Daicel Chirapak AD-H, 5 μm; Eluent: Ethanol/Wasser/Essigsäure 1000:10:2, isokratisch; Fluss: 0.7 ml/min; Temperatur: 450C; UV-Detektϊon: 215 nm; Probe: Injektion von 5 μl.
Methode 28 (Bestimmung der Enantiomerenreinheit): Säule (Stahlsäule, Dimension 250 mm x 4.6 mm); stationäre Phase (Chirapak IA); Eluent iso-Hexan/iso-Propanol 4:1, isokratisch; Fluss: 1 ml/min; Temperatur: 250C; UV-Detektion: 254 nm; Probe: Injektion "von 10 μl.
Methode 29 (LC-MS): UV-Detektion: 210 nm. Gerätetyp MS: Micromass ZQ; Gerätetyp HPLC: Waters Alliance 2795; Säule: Phenomenex Synergi 2μ Hydro-RP Mercury 20 mm x 4mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90%A -> 2.5 min 30%A -> 3.0 min 5°/όA -> 4.5 min 5%A; Fluss: 0.0 min 1 ml/min, 2.5 min/3.0 min/4.5 min 2 ml/min; Ofen: 5O0C; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 30 (LC-MS): Instrument: Micromass Platform LCZ mit HPLC Agilent Serie 1100; Säule: Phenomenex Synergi 2μ Hydro-RP Mercury 20 mm x 4 mm; Eluent A.: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäxire; Gradient: 0.0 min 90%A -> 2.5 min 30%A -> 3.0 min 5%A -> 4.5 min 5%A; Fluss: 0.0 min 1 ml/min, 2.5 min/3.0 min/4.5 min 2 ml/min; Ofen: 500C; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 31 (MALDI-MS): Die MALDI-MS/MS-Untersuchungen werden auf einem 4700 Proteomics Analyzer (Applied Biosystems, Framingham, MA, USA) durchgeführt, der mit
TOF/TOF Ionenoptik und 200 Hz Nd:YAG Laser (355 nm) ausgestattet ist. Die Quasimolekül- ionen werden in der Ionenquelle mit 8 kV beschleunigt, mit einem elektrischen Deflektor selektiert
(MSl), und in einer Stoßzelle, die zwischen MSl und MS2 angeordnet ist, mit Argonatomen gestoßen. Die entstehenden Fragmentionen werden mit 15 kV nachbeschleunigt und mit dem zweiten Flugzeit-Massenanalysator (MS2) charakterisiert.
Methode 32 (Chirale präparative HPLC): Stahlsäule: Dimension 420 mm x 75 mm; stationäre Phase: Kieselgelphase mit dem Sektor Poly(N-methacryloyl-D-leucin-dicyclopropylmethylamid); Eluent A: te/t-Butylmethylether, Eluent B: Methanol; Gradient: 0-22.17 min 100% A, 22.18- 27.24 min 100% B, 27.25-40.30 min 100% A; Fluss: 100 ml/min; Temperatur: 240C; UV- Detektion: 260 nm; Probe: Repetitive Injektion von 50000 μl.
Methode 33 (Präparative HPLC, Νucleodur, 0.05-0.1% TFA): Gerät: Gilson Abimed HPLC; binäres Pumpensystem; Säule: Νucleodur Qs Gravity, Fa. Macherey-Νagel, 5 μm; 250 mm x 40 mm; Eluent A: Wasser/0.05-0.1% Trifluoressigsäure, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0- 10 min 10%B, 10-24 min 10-30%B, 24-28 min 30-50%B, 28-35 min 50°/oB, 35-45 min 50- 60%B, 45-53 min 60-70%B, 53-60 min 60-90%B, 60-70 min 10O%B, anschließend Regeneration der Chromatographiesäule; Fluss: 15-45 ml/min; UV Detektor ZlO nm.
Methode 34 (Präparative HPLC Kromasil 0.05% TFA): Gerät: Gilson Abimed HPLC; UV- Detektor 210 nm; binäres Pumpensystem; Säule: Kromasil C]8, 5 μm, 100 Ä, 250 mm x 20 mm; Eluent A: 0.05% Trifluoressigsäure in Wasser, Eluent B: 0.05% Trifluoressigsäure in Acetonitril: Flussrate: 20 ml/min; 0-3 min 10% B, Rampe, 30-38 min 90% B, 38-45 min 1 0% B.
Methode 35 (Präparative HPLC, Νucleodur C18 Gravity, 0.05-0.1% TFA): Gerät: Gilson Abimed HPLC; binäres Pumpensystem; Säule: Νucleodur Ci8 Gravity, 5 μm; 250 mm x 40 mm; Eluent A: Wasser/0.05-0.1% Trifluoressigsäure, Eluent B: Acetonitril; 0-10 min 10%B, Rampe, 10.01-55 min 100% B; Fluss: 10-60 ml/min; UV Detektor 210 nm.
Methode 36 (Präparative HPLC, Kromasil, 0.05% TFA): Gerät: Gilson Abimed HPLC; binäres Pumpensystem; Säule: Kromasil-IOOA Ci8, 5 μm; 250 mm x. 30 mm; Eluent A: Wasser/0.05% Trifluoressigsäure, Eluent B: Acetonitril; 0-10 min 10%B, Rampe, 10.01-55 min 100% B; Fluss: 30 ml/min; UV Detektor 210 nm.
Methode 37 (Präparative HPLC, Kromasil, 0.05% TFA): Gerät: Gilson Abimed HPLC; binäres Pumpensystem; Säule: Kromasil-100A C]8, 5 μm; 250 mm JC 21 mm; Eluent A: Wasser/0.05% Trifluoressigsäure, Eluent B: Acetonitril; 0-10 min 10%B, Rampe, 10.01-55 min 100% B; Fluss: 20 ml/min; UV Detektor 210 nm.
Methode 38 (Präparative HPLC, Kromasil, 0.05% TFA): Gerät: Gilson Abimed HPLC; binäres Pumpensystem; Säule: Kromasil-100A Ci8, 5 μm; 250 mm x 21 mm; Eluent A:
Wasser/0.05% Trifluoressigsäure, Eluent B: Acetonitril/Wasser 50/50; 0-10 min 10%B, Rampe, 10.01-55 min 100% B; Fluss: 20 ml/min; UV Detektor 210 um.
Methode 39 (Präparative HPLC, Kromasil, 0.05% TFA): Gerät: Gilson Abimed HPLC; binäres Pumpensystem; Säule: Kromasil- 100A Ci8, 5 μrn; 250 mm x 30 mm; Eluent A: Wasser/0.05% Trifluoressigsäure, Eluent B: Acetonitril; 0-10 min 10%B, Rampe, 10.01-55 min 100% B; Fluss: 10-60 ml/min; UV Detektor 210 nm.
Methode 40 (Präparative HPLC): Gerät: Gilson Abimed HPLC; UV-Detektor 210 nm; binäres Pumpensystem; Säule: Waters Symmetry-Prep™ Ci8, 7 μm, 300 mm x 19 mm; Eluent A: 0.05% Trifluoressigsäure in Wasser, Eluent B: 0.05% Trifluoressigsäure in Acetonitril: Flussrate: 20 ml/min; 0-3 min 10% B, Rampe, 30-38 min 90% B, 38-45 min 10% B.
Methode 41 (Präparative HPLC, Grom-Sil, 0.1% TFA) : Gerät: Gilson Abimed HPLC; UV- Detektor 210 nm; binäres Pumpensystem; Säule: Grom-Sil SNr.4051 120 ODS-4HE, 10 μm, 250 mm x 40 mm; Eluent A: 0.1% Trifluoressigsäure in Wasser, Eluent B: 0.1% Trifluoressigsäure in Acetonitril; Flussrate: 50 ml/min; 0-3 min 10% B, 3-27 min Gradient Rampe, 27-35 min 95% B, 35-40 min 10% B.
Methode 42 (Chirale präparative HPLC): Säule (Stahlsäule, Dimension 500 mm x 50 mm); stationäre Phase (Chirapak AD, 20 μm); Eluent A: iso-Hexan, Eluent B: iso-Propanol; Gradient: 0- 11.74 min 15%B, 11.74-11.75 min 100%B, 15.74 min 1 00%B, 15.75 min 15%B, 21.25 min 15%B; Probenvorbereitung: in 50 ml iso-Propanol/200 ml iso-Hexan lösen; Injektionsvolumen: 30 ml, Temperatur: 240C; UV-Detektion: 220 nm.
Methode 43 (Präparative HPLC): Gerät: Gilson Abimed HPLC; UV Detektor 254 nm; binäres Pumpensystem; Säule: Nucleosil RP-18, 7 μm; 250 x 5 O mm; Fluss: 30 ml/min; Eluent A: Wasser/0.1% Trifluoressigsäure, Eluent B: Acetonitril/O.1 % Trifluoressigsäure; Gradient: 0-40 min 20-25% B, 40-60 min 25% B, 60-110 min 25-50% B, 110-120 min 50% B, 120-130 min 50- 100% B, 130- 160 min 100% B, anschließend Regeneration der Chromatographiesäule.
Methode 44 (Präparative HPLC): Gerät: Gilson Abimed HPLC; UV Detektor 254 nm; binäres Pumpensystem; Säule: Nucleosil RP-18, 7 μm; 250 x 50 mm; Fluss: 40 ml/min; Eluent A: Wasser/0.05% Trifluoressigsäure, Eluent B: Acetonitril/0.05% Trifluoressigsäure; Gradient: 0-105 min 20-25% B, 105-111 min 25% B, 111-131 min 25-27°/£> B, 131-157 min 27-35% B, 157-192 min 35-40% B, 192-207 min 40-45% B, anschließend Regeneration der Chromatographiesäule.
Allgemeine Arbeitsvorschriften
Arbeitsvorschrift 1 (Abspaltung von Boc-Schutzgnxppen mit TFA)
Die Boc-geschützte Verbindung wird in Dichlormethan suspendiert (1/5-1/10 der Reaktions¬ lösung) und anschließend unter Argon-Schutzgasatmosphäre mit Trifluoressigsäure in Dichlor- 5 methan (30%ig; ca 1 ml/10 mg Edukt im 100-1 Millimol-Maßstab, ca. 1 ml/l mg im 100- 1 Mikromol-Maßstab) versetzt und so lange bei Raumtemperatur gerührt bis das HPLC- Chromatogramm vollständigen Umsatz zeigt (Methode 2). Dann wird das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert, wobei die Badtemperatur 3O0C nicht übersteigen soll. Das Rohprodukt wird in Toluol suspendiert, erneut am Rotationsverdampfer eingeengt und im Hochvakuum getrocknet. 0 Diese Prozedur wird mehrfach mit Toluol oder mit Dichlormethan wiederholt (zwei- bis fünfmal).
Arbeitsvorschrift 2 (Abspaltung der N-fer^-Butoxycarbonyl-Schutzgruppe, Dioxan, 4 Ν Chlor¬ wasserstoff)
Die N-(tert-Butoxycarbonyl)-geschützte Verbindung (1 mmol) wird in Dioxan (2-3 ml) unter Argon-Schutzgasatmosphäre vorgelegt. Bei RT und unter starkem Rühren wird 4 Ν Salzsäure in 5 Dioxan (30 ml) zugetropft. Man rührt, bis die analytische HPLC (Methode 2) vollständigen Umsatz anzeigt (ca. 2 h). Das Reaktionsgemisch wird bei RT im Vakuum eingedampft. Das Rohprodukt wird in wenig Dichlormethan aufgenommen und erneut im Vakuum von Lösungsmittel befreit. Dieser Vorgang wird mehrfach mit Toluol (zweimal) und mit Dichlor¬ methan (zweimal) wiederholt. Abschließend wird das Rohprodukt lyophilisiert oder nach O Hochvakuumtrocknung direkt weiter umgesetzt.
Arbeitsvorschrift 3 (Hydrogenolvtische Esterspaltung, Abspaltung der Cbz-Schutzgruppe)
Der peptidische Benzylester oder das peptidische N-Cbz-geschützte Amin (1.2 mmol) wird in Methanol (60 ml) gelöst und unter Argonschutzgasatmosphäre mit 1 Oproz. Palladium-Kohle (100 mg) versetzt. Bei RT und Normaldruck wird so lange hydriert bis die analytische HPLC 5 (Methode 2) vollständigen Umsatz anzeigt. Das Reaktionsgemisch wird filtriert (z. B. über Kieselgur, Celite®), im Vakuum eingeengt und am Hochvakuum getrocknet.
Arbeitsvorschrift 4 (Hydrolytische Esterspaltung, Yerseifung)
Der Carbonsäureester (3 mmol) wird unter Argonschutzgasatmosphäre in THF/Wasser/DMF
200/100/2.5 (20 ml) vorgelegt. Bei 00C wird unter strikter Temperaturkontrolle gepulvertes O Lithiumhydroxid (3.6 mmol, 1.2 Äquivalente) portionsweise in die stark gerührte Lösung gegeben.
Wird nach 2 h mittels analytischer HPLC kein vollständiger Umsatz beobachtet, so wird erneut
festes Lithiumhydroxid zugesetzt (3.3 mmol, 1.1 Äquivalente). Dieser Vorgang wird bis zu voll¬ ständigem Umsatz wiederholt, woraufhin man das Reaktionsgemisch bei O0C mit 0.1 N wässriger Salzsäure auf pH 3-4 einstellt im Vakuum einengt und anschließend gefϊiertrocknet. Das Rohprodukt kann nun gelchromatographiert werden (Methode 14) und/oder mittels präparativer HPLC (Methode 13) feingereinigt werden.
Arbeitsvorschrift 5 (Amidkupplung)
Zu einer Lösung des aminischen Cy clopeptids (1.0 Äquivalente), der Dipeptidsäure (1.5 - 1.8 Äquivalente und NMM (1.0-2.0 Äquivalente) in trockenem DMF wird bei -2.00C unter Argon- Schutzgasatmosphäre zunächst HATU (1.5-1.8 Äquivalente) gegeben. Das Reaktionsgemisch wird gerührt (ca. 15 min) und erneut mit NMM (2.5-3.0 Äquivalente) versetzt. Das IReaktionsgemisch wird langsam von -1O0C bis RT erwärmt und wird bei dieser Temperatur nachgerührt, bis sich ein vollständiger Umsatz der Amin-Komponente zeigt. Das Reaktionsgemisch wird mit festem Kaliumdihydrogenphosphat (10 Äquivalente, 500 μmol) versetzt und dann im Hochvakuum einge¬ dampft und chromatographisch aufgereinigt.
Alternativ kann die Reaktion nach erfolgter Umsetzung mit Wasser und Methan«! versetzt werden und anschließend nach der Reinigung über die präparative RP-HPLC oder Gelchromatographie wird das Produkt erhalten.
Ausgangsverbindungen
Beispiel IA
Fermentation:
Kultur Medium:
YM: Hefe-Malz Agar: D-Glucose (4 g/l), Hefe Extrakt (4 g/l), Malz Extrakt (10 g/l), 1 Liter Lewatit Wasser. Vor dem Sterilisieren (20 Minuten bei 121°C) wird der pH auf 7.2 eingestellt.
HPM: Mannit (5.4 g/l), Hefe Extrakt (5 g/l), Fleischpepton (3 g/l).
Arbeitskonserve: Der lyophilisierte Stamm (ATCC 53042) wird in 50 ml YM Medium angezogen.
Kolbenfermentation: 150 ml YM Medium oder 100 ml HPM Medium in einem 1 1 Erlenmeyerkolben werden mit 2 ml der Arbeitskonserve beimpft und für 30-48 Stunden bei 28°C auf einem Schüttler bei 240 Upm wachsen gelassen.
30 1 Fermentation: 300 ml der Kolbenfermentation (HPM Medium) werden zum Animpfen einer sterilen 30 1 Nährmedienlösung verwandt (1 ml Antifoam SAG 5693/1). Diese Kultur wird für 21 Stunden bei 280C, 300 Upm und einer Belüftung mit steriler Luft von 0.3 wm wachsen gelassen. Der pH wird mit 1 M Salzsäure auf pH = 7.2 konstant gehalten. Insgesamt werden während der Kultivierungszeit 880 ml 1 M Salzsäure zugeführt.
Hauptkultur (200 1): 15 x 150 ml YM Medium in 1 1 Erlenmeyerkolben werden mit 2 ml der Arbeitskonserve beimpft und bei 28°C für 48 Stunden und 240 Upm auf dem Schüttler wachsen gelassen. 2250 ml dieser Kultur werden zum Beimpfen einer sterilen 200 1 Nährmedienlösung (YM) verwandt (1 ml Antifoam SAG 5693/1) und für 18.5 Stunden bei 28°C, 150 Upm und einer Belüftung mit steriler Luft von 0.3 wm wachsen gelassen.
Zur Kontrolle des Fermentationsverlaufs werden stündlich Proben (50 ml) entnommen. 2 ml dieser Kulturbrühe werden mit 1 ml Methanol (0.5% Trifluoressigsäure) versetzt und über einen 0.45 μm Filter filtriert. 30 μl dieser Suspension werden mittels HPLC analysiert (Methode 17 und Methode 18).
Nach 18.5 Stunden wird die KLulturbrühe der Hauptkultur bei 17000 Upm in Überstand und Sediment getrennt.
Isolierung:
Der Überstand (183 1) wird mit konzentrierter Trifluoressigsäure bzw. Natronlauge auf pH 6.5-7 eingestellt und auf eine Lewapolsäule (OC 1064, 60 1 Inhalt) aufgetragen. Anschließend wird mit reinem Wasser, Wasser/Methanol 1:1 und anschließend mit reinem Methanol (mit 0.1% Trifluoressigsäure) eluiert. Diese organische Phase wird im Vakuum bis zu einem verbleibenden wässrigen Rest von 11.5 1 eingeengt.
Die verbleibende wässrige Phase wird an Kieselgel Cis gebunden und aufgetrennt (MPLC, Biotage Flash 75, 75 x 30 cm, KP-Cl 8-WP, 15-20 μm, Fluss: 30 ml; Eluent: Acetonitril/ Wasser mit 0.1% Trifluoressigsäure; Gradient: 10%, 15% and 40% Acetonitril). Die 40% Acetonitril Phase, die die Hauptmenge von Beispiel IA enthält, wird im Vakuum eingeengt und anschließend lyophilisiert (ca. 13 g). Dieses Feststoffgemisch wird in 1.2 g Portionen zunächst an einer präparativen HPLC (Methode 43), anschließend durch Gelfiltration an Sephadex LH-20 (5 x 70 cm, Acetonitril/Wasser 1:1, jeweils mit 0.05% Trifluoressigsäure) und einer weiteren präparativen HPLC (Methode 44) getrennt.
Dieser Prozess liefert 2250 mg Beispiel IA.
Das Sediment wird in 4 1 Aceton/Wasser 4:1 aufgenommen, mit 2 kg Celite versetzt, mit Trifluoressigsäure auf pH = 6 eingestellt, ausgerührt und zentrifugiert. Das Lösungsmittel wird im Vakuum eingeengt und der Rückstand gefriergetrocknet. Das erhaltene Lyophilisat (89.9 g) wird in Methanol aufgenommen, abfiltriert, eingeengt und getrennt (Methode 20). Beispiel IA wird danach per Gelfiltration (Sephadex LH-20, 5 x 68 cm, Wasser/Acetonitril 9:1 (mit 0.05% Trifluoressigsäure), Fluss: 2.7 ml/min, Fraktionsgröße 13.5 ml) zur Reinsubstanz aufgereinigt.
Dieser Prozess liefert 447 mg Beispiel IA.
HPLC (Methode 17): R4 = 6.19 rnin MS (ESIpos): m/z = 1277 (M+H)+ 1U NMR (500.13 MHz, ^-DMSO): δ = 0.75 (d, 3H), 0.78 (d, 6H), 0.80 (t, 3H), 0.82 (d, 3H), 0.90 (d, 3H), 0.91 (d, 3H), 0.92 (d, 3H), 0.95 (d, 3H), 0.96 (d, 3H), 1.05 (m, IH), 1.19 (d, 3H), 1.25 (m, 2H), 1.50 (m, 4H), 1.51 (m, 2H), 1.55 (m, IH), 1.61 (m, IH), 1.65 (m, IH), 1.84 (m, IH), 1.85 (m, IH), 1.86 (m, IH), 1.89 (m, IH), 1.95 (m, IH), 2.75 (m, 2H), 3.40 (m, IH), 3.52 (m, 2H), 3.53 (dd, IH), 3.64 (m, 2H), 3.66 (m, IH), 3.68 (dd, IH), 3.73 (m, 2H), 4.00 (dd, IH), 4.02 (br., IH), 4.13 (br., IH), 4.32 (dd, IH), 4.39 (t, IH), 4.55 (m, IH), 4.75 (dd, IH), 5.19 (t, IH), 5.29 (d, IH), 5.30 (br., IH), 5.58 (m, 2H), 6.68 (m, 3H), 6.89 (d, IH), 6.93 (m, 3H), 6.94 (br., IH), 6.98 (d, IH), 7.12 (br., IH), 7.20 (br., 2H), 7.23 (m, 2H), 7.42 (m, 2H), 7.54 (d, IH), 7.58 (d, IH), 8.32 (br., IH), 9.18 (br., IH), 9.20 (m, 2H), 9.50 (br., IH). 13C NMR (125.77 MHz, J0-DMSO): δ = 10.3, 15.3, 19.0, 19.2, 19.6, 20.0, 20.9, 22.0, 22.4, 23.0, 23;2, 24.3, 24.4, 25.0, 25.4, 26.0, 27.8, 30.9, 35.4, 39.5, 40.8, 40.9, 41.6, 44.1, 51.5, 52.7, 55.9, 56.2, 56.4, 57.9, 58.8, 60.2, 61 .1, 62.6, 70.1, 71.6, 71.7, 75.5, 128.1, 128.6, 136.7, 156.8, 168.2, 170.1, 170.4, 171.2, 171.5, 171 .9, 172.2, 172.4, 173.7.
Die Zuordnung der Signale erfolgte nach der in der Literatur beschriebenen Zuordnung (T. Kato, H. Hinoo, Y. Terui, J. Antibiot. , 1988, 61, 719-725).
Beispiel 2A
Gemisch von Dihydro-Lysobactin-trifluoracetat {D-Leu-Leu-Phe-[(3R)-Leu(3-OH)]-Leu-D-Arg- Ile-aThr-Gly-[(3S)-3-Asn(3-OHr)]-Ser-Trifluoracetat} und Octahydro-Lysobactin-trifluoracetat {D- Leu-Leu-Ala(3-cyclohexyl)-[(3J?)-Leu(3-OH)]-Leu-D-Arg-Ile-aThr-Gly-[(3,Sr)-3-Asn(3-OH)]-Ser- Trifluoracetat}
Lysobactin-bistrifluoracetat (Beispiel IA, 500 mg, 0.33 mmol) wird in Isopropanol/Wasser 2:1 (30 ml) gelöst. Unter Argonschutzgasatmosphäre wird Palladium auf Kohle (10%ig; 100 mg) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird (nach Entgasung) in einem Druckautoklaven bei 80-70 bar Wasserstoffdruck und RT für 48 h gerührt. Zur Reaktion wird erneut Palladium auf Kohle (10%ig; 100 mg) gegeben. Das Reaktionsgemisch wird (nach Entgasung) erneut im einem Druckautoklaven bei 80-70 bar Wasserstoffdruck und RT für 48 h gerührt. Nun ist mittels HPLC (Methode 2) kein Lysobactin mehr detektierbar. Das Reaktionsgemisch wird über einer Glasfritte (Porengröße 4) oder über Kieselgur filtriert, im Vakuum eingeengt, erneut in lVCethanol/0.2% Essigsäure aufgenommen, über einem Spritzenfϊlter (Fa. Biotage, PTFE) filtriert, irn Vakuum eingeengt und im Hochvakuum getrocknet. Man erhält 496 mg (quant.) Produkt (80%» Dihydrolysobactin, 20% Octahydrolysobactin).
Beispiel 3A
[(3i?)-3-Hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreony-l-glycyl-[(35)-3-hydroxy- L-asparaginyl]-L-serin-trifluoracetat
{Edman -Abbauprodukt-trifluoracetat}
775 mg Dihydrolysobactin und Octahydrolysobactin werden in 77.5 ml Methanol gelöst und dann mit 667 ml Spaltpuffer (0.1 M Ammoniumhydrogencarbonatlösung/0.5 M Harnstoff pH 8) versetzt. Vor der Enzymzugabe wird die Lösung im Trockenschrank auf 370C er~wärmt. 31 mg Chymotrypsin (31 ml Chymotrypsinlösung Wasser/Ethylenglykol 1:1, 1 mg/ml; 1 :25; 37°C vorgewärmt) werden hinzugegeben und die Reaktion bei 37°C durchgeführt. Die Enzymreaktion wird nach 60 min mit 30 ml Acetonitril und ca. 6 ml TFA abgestoppt. Der pH- Wert der Lösung liegt zwischen 1 - 2. Bis zur präparativen Trennung kann die Lösung bei -2O0C gelagert werden.
Präparative Trennung der Fragmente 1-3 und 4-11
Ca. 800 ml der Spaltlösung werden über einen Filter (0.2 μm) filtriert und in zwei Portionen von je ca. 400 ml an einer Source 15RPC-Säule (40 ml) mit einem Acetonitril/TTA-Gradienten chromatographiert. Bedingungen: Eluent A: 0.1%TFA, Eluent B: 0.1%TFA/Acetor»itril; Gradient: 0%B nach 45%B in 40 min; Fluss: 2 ml/ min; UV-Detektion 210 nm; Fraktionsgröße 1.5 ml.
Die Fragmente 4-11 (R4 = ca. 15 min) und 1-3 (LLF) (R1 = ca. 25 min) sowie 1-3 (LLA(3-cyclo- hexyl)) (R1 = ca. 30 min) werden zusammengegeben und lyophilisiert. Man erhält so die Titelverbindung als Fragment 4 — 11.
HPLC/UV-Vis (Methode 3): Rt = 1.2 min. LC-MS (Methode 7): Rt = 1.0 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 453.5 (100) [M + 2H]2+, 906 (10) [M + H]+. MS (ESIneg.): m/z (%) = 904 (100) [M - H]". LC-MS (Methode 5): R1 = 3.6 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 453.5 (100) [M + 2H]2+. MS (ESIneg.): m/z (%) = 904 (100) [M - Hf.
Beispiel 4A
Methyl-(2)-2-[(^erf-butoxycarbonyl)amino]-4,4-dimethylpent-2-enoat
Pivalaldehyd (303.2 g, 3.41 mol, 10 Äquivalente) und Methyl-{[tert-butoxycarbonyl]amrjno}- (dimethoxyphosphoryl)acetat (101.5 g, 0.341 mol, 1.0 Äquivalente) werden in Tetrahydrofuran
(800 ml) gelöst und auf -700C gekühlt. Bei -7O0C wird NN,N,N-Tetramethylguanidin (78.7 g,
0.683 mmol, 6.95 ml, 2.0 Äquivalente) langsam zugetropft und dann wird 4 h bei -700C geröhrt, anschließend wird 4 Tage bei RT gerührt. Das Reaktionsgemisch wird eingeengt, dann wird mit
Essigsäureethylester (2 x 500 ml) gegen Wasser extrahiert, die vereinigten organischen Phase» mit gesättigter Νatriumchloridlösung (100 ml) gewaschen und über Νatriumsulfat getrocknet. TSTach dem Einengen wird das Rohprodukt chromatographiert (1.5 kg Kieselgel, Eluent:
Cyclohexan/Essigsäureethylester 5:1). Es werden 67 g (76% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
Alternativ kann das Rohprodukt nach der wässrigen Aufarbeitung durch Kristallisation aus Cyclo- hexan/Essigsäureethylester gereinigt werden.
R/(Kieselgel, Cyclohexan/Essigsäureethylester 4:1) = 0.5
LC-MS (Methode 7): Rt = 2.5 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 158 (100) [M - Boc + H]+, 280 (5) [M + Na]+.
1H NMR (400 MHz, J6-DMSO): δ = 1.08 (s, 9H, C(CH3)3), 1.38 (s, 9H, OC(CH3)3), 3.61 (s= 3H, CO2CH3), 6.40 (s, IH, CßH), 8.14 (s, IH, NH). HR-TOF-MS (Methode 1): C]3H23NO4 [M + H]+ gef. 258.1696, ber. 258.1700.
Beispiel 5A
N-tert-ButoxycarbonyW-tert-butyl-D-alanin-methylester
Methyl-(2Z)-2-[(?er?-butoxycarbonyl)amino]-4,4-dimethylpent-2-enoat (Beispiel 4A, 60 g, 233.2 mmol) wird in Ethanol p.a./Dioxan 3:1 (1000 ml) gelöst. Mit einer Kanüle wird etwa 10 min
Argon durchgeleitet. Die Lösung wird ins Ultraschallbad gestellt (ca. 5 min), und es wird (+}-
1 ,2-Bis-[(2i?,5i?)diethylphospholano]benzen(cyclooctadien)rhodium(I)-Triflat (600 mg, 1 Gew.-%) zugegeben. Es wird für 3 Tage bei 3.5 bar Wasserstoffdruck und RT hydriert. Das
Reaktionsgemisch wird über Kieselgur filtriert und das Eluat eingeengt. Das Rohprodukt wird chromatographiert (Kieselgel, Eluent: Cyclohexan/Essigsäureethylester 4:1). Es werden 60 g (99% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
[α]20 Na = +5° (c = 0.33 in CHCl3).
DCI-MS (NH3): m/z (%) = 221 (100), 260 (40) [M + H]+, 277 (100) [M + NH4]+. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 0.93 (s, 9H), 1.40 (m, 10H), 1.68 (dd, J= 3.7, 14.5 Hz, 1H),3.68 (s, 3H), 4.30 (t, J= 7.9 Hz, IH), 4.81 (d, br, J= 7.7 Hz, IH).
13C NMR (126 MHz, CDCl3): δ = 28.30 (3C), 29.52 (3C), 30.61, 46.27, 51.19, 52.17, 79.79,
155.11, 174.39.
HR-TOF-MS (Methode 1): C26H5IN2O8 ber. 519.3640, gef. 519.3634 [M + H]+.
Beispiel 6A
N-tert-Butoxycarbonyl-3-tert-butyl-D-alanin
N-ϊert-Butoxycarbonyl-3-fert-butyl-D-alanin-methylester (Beispiel 5A, 60 g, 231 mmol) wird in Tetrahydrofuran p.a. (463 ml) gelöst. Bei RT wird langsam eine Lösung von Lithiumhydroxid- monohydrat (19.4 g, 462.7 mmol) in Wasser (463 ml) zugetropft. Wenn das HPLC-Chromato- gramm (Methode 2) vollständigen Umsatz zeigt (ca. 20 h) wird das Reaktionsgemisch unter Eiskühlung vorsichtig mit 1 Ν wässriger Salzsäure auf pH 3-4 eingestellt. Dem Reaktionsgemisch wird Νatriumchlorid (150 g) zugefügt, um es anschließend mit Essigsäureethylester (zweimal 500 ml) zu extrahieren. Die vereinigten organischen Phasen werden mit gesättigter Νatriumchlorid-Lösung und dann mit Νatriumsulfat getrocknet und filtriert. Das Filtrat wird am Rotationsverdampfer eingeengt und am Hochvakuum getrocknet. Man erhält 55.4 g (98% d. Th.) der Titelverbindung.
HPLC/UV-Vis (Methode 4): R, = 4.2 min.
DCI-MS (NH3): m/z (%) = 263 (100) [M + NH4J+, 280 (5) [M + N2H7J+.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 0.96 (s, 9H9 C(CH3)3), 1.42 (m, 10H, OC(CH3)3, H^), 1.79 („d", J= 14.4 Hz, IH, HA), 4.31 (t, J= 8.0 Hz, IH, Hα), 4.82 (d, J= 8.4 Hz, IH, NH).
13C NMR (126 MHz, CDCl3): δ = 28.32 (3C), 29.54 (3C), 30.74, 45.92, 51.24, 80.19, 155.41,
178.93.
HR-TOF-MS (Methode 1): C24H47N2O8 ber. 491.3327, gef. 491.3328 [2M + Hl+.
Beispiel 7A
3 -tert-Buty 1-L-alanin-methylester-hydrochlorid
HCl
Zur Herstellung der Titelverbindung vergleiche S. D. Bull, S. G. Davies, A. C. Garner, M. D. O'Shea, J. Chem. Soc. Perkin Trans.l, 2001, 3281-3287.
Die Titelverbindung wird nach der Arbeitsvorschrift 2 aus N-tert-Butoxycarbonyl-3-/ert-butyl- L-alanin-methylester (28.0 g, 108 mmol) und 4 Ν Salzsäure in Dioxan (280 ml) hergestellt. Ausbeute 22 g (quantitativ). Das Produkt wird ohne Reinigung weiter umgesetzt.
1H NMR (400 MHz, J6-DMSO): δ = 0.95 (s, br, 9H, tBu), 1.65 (dd, IH), 1.80 (dd, IH), 3.75 (s, 3H, OCH3), 3.90 (dd, IH), 8.60 (s, br, 3H).
Beispiel 8A
N-(^er?-Butoxycarbonyl)-3-?e?-f-butyl-D-alanyl-3-fer/-butyl-L-alanin-methylester
Zu einer Lösung von 3-tert-Butyl-L-alanin-methylester-hydrochlorid (1.1 Äquivalente, 21 g, 107 mmol) in Dichlormethan p.a. (1.4 1) werden bei -2O0C nacheinander HOBt (3 Äquivalente, 39.4 g, 292 mmol), N-Methylmorpholin (3 Äquivalente, 32.1 ml, 291.8 mmol), N-te/t-Butoxy- carbonyl-3-tert-butyl-D-alanin (Beispiel 6A, 1.0 Äquivalente, 97.3 mmol), EDC (2 Äquivalente, 37.3 g, 194.6 mmol) und erneut N-Methylmorpholin (2 Äquivalente, 21.4 ml, 1^4.5 mmol) gegeben. Das Reaktionsgemisch erwärmt sich langsam (ca. 12 h) auf RT, wobei vollständiger Umsatz der Amin-Komponente mittels HPLC beobachtet wird. Das Reaktionsgernisch wird anschließend mit gesättigter wässriger Νatriumhydrogencarbonat-Lösung (300 ml), 5%iger wässriger Citronensäure (zweimal 500 ml), gesättigter wässriger Νatriumhydrogencarbonat- Lösung (500 ml) und gesättigter Νatriumchlorid-Lösung gewaschen. Man trocknet über Νatrium- sulfat und filtriert. Im Vakuum wird bis zur Trockne eingedampft und anschließend im Hochvakuum nachgetrocknet. Man erhält 36 g (96% d. Th.) der Titelverbindung, die otxne weitere Reinigung umgesetzt wird.
DCI-MS (NH3): m/z (%) = 387 (40) [M + H]+, 404 (100) [M + NTH4J+.
1H NMR (400 MHz, J6-DMSO): δ = 0.95 (s, br, 18H, tBu), 1.35 (dd, IH), 1.45 (s, 9H, OtBu), 1.50 (dd, IH), 1.65 (dd, IH), 1.95 (dd, br, IH), 3.70 (s, 3H, OCH3), 4.15 („t", br, IH), 4.55 („t", br, IH), 4.80 (d, IH), 6.65 (d, br, IH).
Beispiel 9A
N-(ter^Butoxycarbonyl)-D-leucyl-L-leucin-benzylester
Zu einer Lösung von L-Leucin-benzylester-hydrochlorid (1.1 Ä-quivalente, 300 mg, 1.1 mmol; vgl. T. Wakamiya, M. Kamata, S. Kusumoto, H. Kobayashi, Y. Sai, et al., Bull. Chem. Soc. Jpn., 1998, 71, 699-710) in Dichlormethan p.a. (30 ml) werden bei -100C nacheinander HOBt (4 Äquivalente, 540 mg, 4 mmol), N-Methylmorpholin (3 Äquivalente, 3 mmol), N-tert-Butoxycarbonyl-D-leucin (1.0 Äquivalente, 230 mg, 1 mmol; Fa. Bachern), EDC (2 Äquivalente, 380 mg, 2 mmol) und erneut N-Methylmorpholin (2 Äquivalente, 2 mmol) gegeben. Das Reaktionsgemisch erwärmt sich langsam (ca. 12 h) auf RT, wobei vollständiger Umsatz der Amin-Komponente mittels HPLC beobachtet wird. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum eingeengt, in Acetonitril aufgenommen und mittels präparativer HPLC (Methode 13) gereinigt. Man erhält 362 mg (80% d. Th.) der Titelverbindung.
HPLC/UV-Vis (Methode 4): R1 = 5.3 min. [Ot]20 Na = +19° (c = 0.10 in Methylenchlorid).
Beispiel IQA
N-(ferr-Butoxycarbonyl)-3-ter/-butyl-D-alanyl-3-rert-butyl-L-alanin
N-(re/*?-Butoxycarbonyl)-3-^rϊ-butyl-D-alanyl-3-^er?-butyl-L-alanin-methylester (Beispiel 8A, 36 g, 93.1 mmol) wird in Tetrahydrofuran p.a. (279 ml) gelöst. Bei ca. 100C wird langsam eine Lösung von Lithiumhydroxid-monohydrat (7.82 g, 186.3 mmol, 2 Äquivalente) in Wasser (187 ml) zugetropft. Wenn das HPXC-Chromatogramm (Methode 2) vollständigen Umsatz zeigt (ca. 20 h) wird das Reaktionsgemisch bei 200 mbar vom THF befreit und dann mit Methyl-terMπitylether (200 ml) extrahiert. Die organische Phase wird mit Essigsäureethylester (5O0 ml) verdünnt und dann mit Wasser versetz* und anschließend vorsichtig mit 1 Ν wässriger Salzsäure auf pH 3-4 eingestellt. Die vereinigten organischen Phasen werden mit gesättigter wässriger Kochsalzlösung gewaschen, über Νatriumsulfat getrocknet, filtriert, im Vakuum eingedampft und im Hochvakuum getrocknet. Man erhält 97.4 g (97% d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 7): Rt = 2.26 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 373 (100) [M + H]+.
HR-TOF-MS (Methode 1 ): C19H37N2O5 ber. 373.2702, gef. 373.2717 [M + H]"*". 1H NMR (400 MHz, J6-DMSO): δ = 0.83 (s, br, 18H, tBu), 1.31 (s, 9H, OtBu>, 1.40 (d, J= 6.1 Hz, 2H5 ^-CH2), 1.48 (dd, J= 14.1, 9.4 Hz, lH, yß-CH), 1.59 (dd, J= 14.1, 2.7 Hz, lH5 jS-CH')5 3.98 (m, IH, α-CH), 4.12 (m, IH, α-CH), 6.73 (d, J= 9.1 Hz, IH, NH), 7.72 (d, J= 7.9 Hz, IH, NH), 12.42 (s, br, IH, CO2H).
13C NMR (125 MHz, J6-DMSO): δ = 28.49 (3C), 29.66 (3C), 29.78 (3C), 30.52, 30.58, 44.63 OS-CH2), 45.24 05-CH2), 49.67 (α-CH), 52.40 (α-CH), 78.29, 155.05, 172.97, 174.61.
Beispiel IIA
N-(?er?-Butoxycarbonyl)- D-leucyl-L-leucin
N-(Butoxycarbonyl)-D-leucyl-L-leucin-benzylester (Beispiel 9A, 308 mg, 0.69 mmol) wird nach der Arbeitsvorschrift 3 umgesetzt. Man erhält 244.6 mg (99% d. Tri.) der Titelverbindung.
Beispiel 12A
Unter Argonschutzgasatmosphäre wird eine 1 N Lösung von Lithiumhexamethyldisilazid (157.5 mmol, 157.5 ml, 2.2 Äquivalente) in THF in das Reaktionslösungsmittel THF (300 ml) vorgelegt. Bei -780C wird eine Lösung von (rac)-3-[(terf-Butoxycarbonyl)amino]-3-phenylpropan- säuremethylester (A. V. Rao Rama, A. K. Singh, Ch. V. N. S. Varaprasad, Tetrahedron Lett., 32, 1991, 4393-4396) (20 g, 71.2 mmol) langsam zugetropft. Man rührt 1 0 min bei -250C und kühlt dann erneut auf -780C herunter. Dibenzylazadicarboxylat (34.2 g, 114.6 mmol, 1.6 Äquivalente) wird in einer Portion zum Reaktionsgemisch gegeben. Es wird 3 h bei -60 bis -45°C gerührt. Um die Reaktion zu stoppen, wird erneut auf -78°C heruntergekühlt und mit Essigsäure (20.5 ml, 358 mmol, 5 Äquivalente) versetzt, und dann auf 00C und schließlich RT erwärmt. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum eingedampft und in Essigsäureethylester (1000 ml) aufgenommen. Die Suspension wird mit gesättigter wässriger Natrϊumhydrogencarbonatlösung (zweimal), Wasser (einmal), 5%iger wässriger Zitronensäure (zweimal) und gesättigter wässriger Natriumchloridlösung (einmal) gewaschen. Alle wässrigen Phasen werden einzeln mit Essigsäureethylester reextrahiert. Alle organischen Phasen werden irn Vakuum eingedampft und erneut in Dichlormethan (2000 ml) aufgenommen, filtriert, über Natrϊumsulfat getrocknet, erneut filtriert, im Vakuum eingedampft und im Hochvakuum getrocknet. Man erhält 7.2 g (18% d. Th.) der Titelverbindung als Feststoff. Das Filtrat der Dichlormethanphase (vide suprά) wird eingeengt und dann wird erneut aus Methanol umkristallisiert, wobei man 13.2 g (26% d. Th.) der Titelverbindung erhält.
Alternatives Syntheseverfahren: Unter Argonschutzgasatmosphäre Λvird eine 1 N Lösung von Lithiumhexamethyldisilazid (590.7 mmol, 590.7 ml, 2.2 Äquivalente) in THF im Reaktionslösungsmittel THF (2500 ml) vorgelegt. Bei -78°C wird eine Lösung von (rac)-3-[(tert- Butoxycarbonyl)amino]-3-phenylpropansäuremethylester (75 g, 268.5 mmol) langsam zugetropft (Innentemperatur ca. -700C). Man rührt 10 min bei -25°C und kühlt dann erneut auf -700C
herunter. Trockenes Dibenzylazadicarboxylat (128.2 g, 429.6 mmol, 1.6 Äquivalente) wird in vier Portionen als Feststoff zum Reaktionsgemisch gegeben. Es wird 2 h bei -60 bis -500C gerührt. Um die Reaktion zu stoppen, wird erneut auf -780C heruntergekühlt und mit Essigsäure (76.!? ml, 1342 mmol, 5 Äquivalente) versetzt, und dann auf 00C und schließlich RT erwärmt. Hierbei fällt die Titelverbindung als Feststoff aus, der im Vakuumtrockenschrank getrocknet wird (4.1 g, 2.2% d. Th., Kristallisat 1). Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum eingedampft und der Rückstand in Essigsäureethylester umkristallisiert, wobei man die Titelverbindung als Feststoff erhält (38 .8 g, 24.3% d. Th., Kristallisat T). Die Mutterlauge wird mit Essigsäureethylester verdünnt und dann mit Wasser (zweimal) und gesättigter wässriger Natriumchloridlösung (zweimal) gewaschen. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet, filtriert, im Vakuum eingedampft und im Hochvakuum getrocknet. Das Rohprodukt wird aus Essigsäureethylester-Diethylether umkristallisiert. Man erhält die Titelverbindung als Feststoff (50.4 g, 28% d. Th., Kristallisa-t 3). Die Mutterlauge wird eingedampft und mittels Flashchromatographie (1.5 kg Kies&lgel, Toluol/Essigsäureethylester 4:1) gereinigt. Man erhält 4.7 g (1.7% d. Th.) der Titelverbindung. Gesamtausbeute 98.0 g Titelverbindung (56.2% d. Th.).
LC-MS (Methode 5): Rt = 6.8 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 578 (40) [M + H]+, 1156 (100) [2M + H]+.
MS (ESIneg.): m/z (%) = 576 (100) [M -H]".
HR-TOF-MS (Methode 1): C3IH36N3O8 [M + H]+ gef. 578.2490, ber. 578.2497.
Die relative Stereochemie der Titelverbindung ist durch eine Röntgenstruktur bestätigt (Abb. L ).
Beispiel 13A
Methyl-(2S*,3i?*)-N-[(benzyloxy)carbonyl]-N-[(benzyloxy)carbonylamino]-3-[(^ert-butoxy- carbonyl)amino]-phenylalaninat
Unter Argonschutzgasatmosphäre wird eine Lösung von Methyl-(2R*,3jf?*)-N2-[(benzyloxy)- carbonyl]-N2-[(benzyloxy)carbonylamino]-3-[(^ert-butoxycarbonyl)amino]-phenylalaninat (Bei¬ spiel 12A, 20.5 g, 35.5 mmol) in trockenem DMF p.a. (750 ml) bei 00C mit N,NN,N-Tetra- methylguanidin (50 ml, 399 mmol) versetzt. Man lässt das Reaktionsgemisch auftauen und rührt bis das HPLC-Chromatogramm (Methode 2) vollständigen Umsatz (ca. 60% Produkt) anzeigt (ca. 12 h), um die Reaktion dann durch Zugabe von Essigsäure (pH 4-6) zu stoppen. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum bei RT eingedampft und in Essigsäureethylester aufge¬ nommen. Die organische Phase wird mit Wasser (zweimal), 5%iger Zitronensäure (zweimal), Wasser (einmal), gesättigter wässriger Νatriumhydrogencarbonatlösung (zweimal), gesättigter wässriger Νatriumchloridlösung (einmal) gewaschen, über Νatriumsulfat getrocknet, filtriert, im Vakuum eingedampft, im Hochvakuum getrocknet. Das Rohprodukt wird mittels präparativer HPLC (Methode 11) oder Flashchromatographie (Kieselgel, Cyclohexan/Essigsäureethylester 3:1) gereinigt. Man erhält 7.7 g (37% d. Th.) der Titelverbindung und 5 g der Ausgangsverbindung (25% d. Th.).
Alternatives Syntheseverfahren: Unter Argonschutzgasatmosphäre wird eine Lösung von Methyl- (2i?*,3R*)-N2-[(benzyloxy)carbonyl]-N2-[(benzyloxy)carbonylamino]-3-[(^erf-butoxycarbonyl)- amino]-phenylalaninat (Beispiel 13A, 22.0 g, 38.1 mmol) in trockenem Dichlormethan p.a. (540 ml) bei 00C mit N,N,N,N-Tetramethylguanidin (50 ml, 399 mmol) versetzt. Man lässt das Reaktionsgemisch auftauen und rührt bis das HPLC-Chromatogramm vollständigen Umsatz (ca. 65% Produkt) anzeigt (ca. 12 h), um die Reaktion dann durch Zugabe von Essigsäure (23 ml, pH 4-6) zu stoppen. Die organische Phase wird mit Wasser (zweimal), gesättigter wässriger Νatrium¬ hydrogencarbonatlösung (zweimal), gesättigter wässriger Νatriumchloridlösung (einmal) gewaschen. Die wässrigen Phasen werden mit Dichlormethan reextrahiert. Die vereinigten
organischen Phasen werden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert, im Vakuum eingedampft, im Hochvakuum getrocknet. Das Rohprodukt wird mittels Flashchromatographie (6 1 Kieselgel, Cyclohexan/Essigsäureethylester 3:1) gereinigt. Man erhält 13.7 g (62% d. Th., bezogen auf zurückgewonnenes Ausgangsmaterial 69%) der Titelverbindung und 3.1 g der Ausgangsverbindung (10% d. Th.).
HPLC/UV-Vis (Methode 2): R1 = 3.0 min. LC-MS (Methode 8): R1 = 3.0 min;
MS (ESIpos.): mfz (%) = 478 (100) [M -Boc + H]+, 578 (30) [M + H]+. LC-MS (Methode 5): R1 = 7.0 min; MS (ESIpos.): mfz (%) = 578 (40) [M + H]+, 1156 (100) [2M + H]+. MS (ESIneg.): mfz (%) = 576 (100) [M - H]". HR-TOF-MS (Methode 1): C3IH36N3O8 [M + H]+ gef. 578.2483, ber. 578.2497.
Beispiel 14A
Methyl-(2S*,3R*)-3-[(ter^-butoxycarbonyl)amino]phenylalaninat
Unter Argonschutzgasatmosphäre wird zu einer Lösung von Methyl-(25'*,3i?*)-N-[(benzyloxy)- carbonyl]-N-[(benzyloxy)carbonylamino]-3-[(te7t-butoxycarbonyl)amino]-phenylalaninat (Beispiel 13 A, 705 mg, 1 .22 mmol) in Methanol/Dichlormethan 1:1 (42 ml) Raney-Νickel (61 mg, ca. 10mol%) gegeben. Das Reaktionsgemisch wird in einem Druck-Autoklaven bei 80 bar Wasserstoffdruck und RT hydriert (40 h). Das HPLC-Chromatogramm zeigt vollständigen Umsatz. Das Reaktionsgemisch wird unter Argonschutzgasatmosphäre über einer Glasfritte filtriert, die Glasfritte wird mehrfach mit Methanol/Wasser/0.2% Essigsäure gewaschen. Das Filtrat wird im Vakuum eingedampft und am Hochvakuum getrocknet. Man erhält einen Feststoff (ca. 3 g) der dann im Ultraschallbad in Essigsäureethylester suspendiert wird. Die Suspension wird mit einer Lösung von EDTA (400 mg) in 7%iger wässriger NatriumhydrogencarbonatlOsung (400 ml) versetzt. Die wässrige Phase wird mit Essigsäureethylester (100 ml3 dreimal) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden dann mit gesättigter wässriger Νatriumhydrogen-
carbonatlösung (einmal), und mit gesättigter wässriger Natriumchloridlösung (zweimal) gewaschen. Alle wässrigen Phasen werden einzeln mit Essigsäureethylester reextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden dann über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und am Hochvakuum getrocknet. Als Produkt erhält man einen Feststoff (1.26 g, quant.) der ohne Feinreinigung weiter umgesetzt wird.
HPLC/UV-Vis (Methode 3): Rt = 1.7 min. LC-MS (Methode 5): R, = 4.1 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 239 (100), 295 (80) [M + H]+.
1H NMR (400 MHz, ^6-DMSO): δ = 1.36 (s, 9H), 3.34 (s, 3H), 3.60 (d, J = 5.3 Oz, IH), 4.89 (dd, J = 9.6, 4.9 Hz, IH), 7.20-7.34 (m, 5H), 7.41 (d, J= 9.4 Hz, IH).
13C NMR (125 MHz, ^6-DMSO): δ = 28.24 (3C), 52.84, 54.91, 56.86, 79.23, 127.14 (2C), 128.44,
128.88 (2C), 137.28, 154.86, 168.16.
HR-TOF-MS (Methode 1): C15H22N2O4 [M + H]+ gef. 295.1658, ber. 295.1653.
Beispiel 15A
Methyl-(25'*,3R*)-N-[(benzyloxy)carbonyl]-3-[(fert-butoxycarbonyl)amino]phenylalaninat
Unter Argonschutzgasatmosphäre wird zu einer Lösung von Methyl-(2S*,3R.=i=)-3-[(terϊ-butoxy- carbonyl)amino]phenylalaninat (Beispiel 14A, 360 mg, 1.2 mmol) und N-Benzryloxycarbonyloxy- succinimidester (610 mg, 2.44 mmol, 2 Äquivalente) in THF (25 ml) bei O0C Λ^-Methylmorpholin (260 mg, 2.6 mmol, 2.1 Äquivalente) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wärmt; sich langsam auf (12 h), wobei vollständiger Umsatz mittels HPLC (Methode 2) beobachtet wird. Anschließend wird Essigsäure (0.7 ml) zugegeben, im Vakuum eingeengt und mittels piäparativer HPLC (Methode 13) gereinigt. Man erhält 396 mg (76% d. Th.) der Titelverbindung.
HPLC/UV-Vis (Methode 3): R4 = 2.7 min. LC-MS (Methode 5): Rt = 6.4 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 329 (100) [M -Boc + H]+, 429 (80) [IM + H]+, 858 (60) [2M + H]+. 1H NMR (500 MHz, ^-DMSO): δ = 1.35 (s, 9H), 3.63 (s, 3H), 4.57 (dd, J = 9.5, 4.0 Hz, IH), 4.93 (m, 2H), 5.27 (dd, J = 10.1, 4.1 Hz, IH)5 7.19-7.34 (m, 10H), 7.50 (d, J= 10.2 Hz, IH), 7.59 (d, J= 10.2 Hz, IH)1 13C NMR (126 MHz, J^-DMSO): δ = 28.26 (3C), 52.33, 54.67, 59.06, 65.73, 78.73, 126.66 (2C), 127.42, 127.65 (2C), 128.00, 128.44 <2C), 128.53 (2C), 136.91, 139.26, 154.98, 156.25, 170.91. HR-TOF-MS (Methode 1): C23H28N2O6Na [M + Na]+ gef. 451 .1823, ber. 451.1845.
Beispiel 16A
(25*,3i?*)-N2-[(Benzyloxy)carbonyl]-3-[(terf-butoxycarbonyl)amino]-phenylalanin
Unter Argonschutzgasatmosphäre wird eine Lösung von Methyl-(2<S'*,3i?*)-N-[(benzyloxy)- carbonyl]-3-[(te^butoxycarbonyl)amino]phenylalaninat (Beispiel 15A, 755 mg, 1.76 mmol) in THF/Wasser 2:1 (30 ml) vorgelegt. Bei 00C wird unter starkem Rühren eine entgaste l%ige wässrige Lösung von Lithiumhydroxid-Monohydrat (86.5 mg, 3.6 mmol, 2 Äquivalente) langsam zugetropft. Man rührt bei RT so lange nach, bis das HPLC-Chromatogramm (Methode 2) voll¬ ständigen Umsatz anzeigt (ca. 1 h). Anschließend versetzt man mit Essigsäure (0.5 ml), konzentriert das Reaktionsgemisch im Vakuum auf und ufoerschichtet mit Essigsäureethylester (100 ml). Die wässrige Phase wird nun mit 5%iger Zitronensäure angesäuert (pH 2-3) und dann mit Essigsäureethylester (50 ml, dreimal) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit gesättigter wässriger Νatriumchloridlösung (20 ml, zweimal) gewaschen, über Νatriumsulfat getrocknet, filtriert, im Vakuum eingeengt und im Hochvakuum getrocknet. Man erhält 750 mg
(quant.) Rohprodukt der Titelverbindung, welches mittels präparativer HPLC feingereinigt wird (Methode 13).
HPLC/UV-Vis (Methode 2): R, = 2.4 min.
LC-MS (Methode 5): Rt = 6.1 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 359 (100), 415 (60) [M + H]+, 829 (60) [2M + H]+.
MS (ESIneg.): m/z (%) = 413 (100) [M - H]".
1H NMR (500 MHz, ^6-DMSO): δ = 1.31 (s, 9H), 4.42 (dd, J = 10.0, 3.9 Hz, IH), 4.87 (s, 2H),
5.22 (dd, J = 10.0, 3.7 Hz, IH), 7.14-7.28 (m, 10H), 7.43-7.46 (m, 2H), 12.91 (s, br, IH).
13C NMR (126 MHz, ^n-DMSO): δ = 28.33 (3C), 54.84 (Cα), 58.94 (Cß), 65.54, 78.56, 126.52
(2C), 127.22, 127.53 (2C), 127.92, 128.37 (2C), 128.49 (2C), 137.03, 140.14, 155.08, 156.29,
171.60.
HR-TOF-MS (Methode 1): C22H26N2O6 [M + H]+ gef. 415.1860, ber. 415.1864.
Beispiel 17A
(3R)-N2-[(Benzyloxy)carbonyl]-3-[(^erf-butoxycarbonyl)amino]-L-phenylalanin
Das Enantiomerengemisch von (2S*,3i?*)-N-[(Benzyloxy)carbonyl]-3-π(tert-butoxycarbonyl)- amino]phenylalanin (Beispiel 16A, 750 mg, 1.8 mmol) wird mittels präparativer HPLC (Methode 15) getrennt. Man erhält 334 mg (98% ee, 45% d. Th.) (2S,3R)-N-[(Benzyloxy)carbony\]-3-[(tert- butoxycarbonyl)amino]phenylalanin (Titelverbindung) und 275 mg (98% ee, 37% d. Th.) (2R,3S)- N-[(Benzyloxy)carbonyl]-3-[(tert-butoxycarbonyl)amino]phenylalanin (weiteres Enantiomer).
Enantiomerenbestimmung nach Methode 16.
M20 Na = +22° (c = 0.50 in Chloroform) (Titelverbindung). M20 Na = -20° (c = 0.49 in Chloroform) (weiteres Enantiomer).
1H NMR (500 MHz, J0-DMSO): δ = 1.35 (s, 9H), 4.46 (dd, J = 9.6, 3.6 Hz, IH), 4.91 (s, 2H), 5.26 (dd, J = 9.9, 3.6 Hz, IH), 7.18-7.32 (m, 10H), 7.48-7.51 (m, 2H), 12.95 (s, br, IH). 13C NMR (126 MHz,
δ = 28.34 (3C), 54.84, 58.96, 65.55, 78.56, 126.53 (2C), 127.23, 127.55 (2C)5 127.93, 128.39 (2C), 128.51 (2C), 137.05, 140.16, 155.09, 156.30, 171.62. HR-TOF-MS (Methode 1): C22H26N2O6 [M + H]+ gef. 415.1864, ber. 415.1864.
Beispiel 18A
2-(Trimethylsilyl)ethyl-(3R)-N-[(benzyloxy)carbonyl]-3-[(^e7t-butoxycarbonyl)amino]-L- phenylalaninat
Eine Mischung von (3i?)-N2-[(Benzyloxy)carbonyl]-3-[(fe/t-butoxycarbonyl)amino]-L-phenyl- alanin (Beispiel 17A, 151 mg, 0.36 mmol), 2-(Trimethylsilyl)ethanol (431 mg, 3.64 mmol, 10 Äquivalente) und Molsieb 4 A (ca. 10 mg) in trockenem Dichlormethan p.a. (2.7 ml) wird für 30 min bei RT unter Argonschutzgasatmosphäre gerührt. Anschließend werden bei -300C DCC (150 mg, 0.73 mmol, 2 Äquivalente) und DMAP (44.5 mg, 0.36 mmol, 1 Äquivalent) zugegeben. Man lässt das Reaktionsgemisch auftauen (ca. 12 h) und rührt bei RT so lange nach, bis das HPLC-Chromatogramm vollständigen Umsatz anzeigt (12-72 h). Das Reaktionsgemisch wird bei RT im Vakuum eingedampft und mittels präparativer HPLC (Methode 13) gereinigt. Man erhält 145 mg (77% d. Th.) der Titelverbindung.
[α]20Na = +7.8° (c = 0.45 in Chloroform)
HPLC/UV-Vis (Methode 3): R, = 3.3 min.
LC-MS (Methode 5): Rt = 7.3 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 515 (100) [M + H]+, 1030 (60) [2M + H]+.
1H NMR (500 MHz, J6-DMSO): δ = -0.02 (s, 9H), 0.88 (t, J = 8.6 Hz, 2H), 1.31 (s, 9H), 4.01-
4.15 (m, 2H), 4.48 (dd, J = 9.5, 4.0 Hz, IH), 4.86 (d, J = 13.1 Hz, IH), 4.90 (d, J = 12.6 Hz, IH),
5.25 (dd, J = 10.0, 4.0 Hz, IH), 7.14-7.29 (m, 10H), 7.48 (d, IH, J= 10.2 Hz), 7.51 (d, IH, J =
9.5 Hz).
13C NMR (126 MHz, J6-DMSO): δ = -1.67 (3C), 16.78, 27.96 (3C), 54.38, 58.83, 62.95, 65.34,
78.30, 126.29 (2C), 127.06, 127.30 (2C), 127.66, 128.13 (2C), 128.20 (2C), 136.63, 139.17,
154.58, 155.95, 170.02.
HR-TOF-MS (Methode 1): C27H38N2O6Si [M + H]+ gef. 515.2564, ber. 515.2572.
Beispiel 19A
2-(Trimethylsilyl)ethyl-(3i?)-3-amino-N2-[(benzyloxy)carbonyl]-L-phenylalaninat-trifluoroacetat
2-(Trimethylsilyl)ethyl-(3i?)-N-[(benzyloxy)carbonyl]-3-[(ter?-butoxycarbonyl)amino]-L-phenyl- alaninat (Beispiel 18A, 550 mg, 1.7 mmol) wird nach der Arbeitsvorschrift 1 umgesetzt (Reaktionszeit: 10 min). Das Rohprodukt wird mittels präparativer HPLC (Methode 21) gereinigt. Man erhält 424 mg (75% d. Th.) der Titelverbindung.
[α]2V = -11 -2° (c = 0.47 in Chloroform)
HPLC/UV-Vis (Methode 2): Rt = 1.9 min.
LC-MS (Methode 7): Rt = 2.0 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 387.2 (60), 415 (100) [M + H]+.
1H NMR (500 MHz, J6-DMSO): δ = -0.07 (s, 9H), 0.52 (rn, 2H), 3.77 (m, IH), 3.88 (m, IH), 4.50
(d, J = 9.0 Hz, IH), 4.58 ("t", J = ca. 8.2 Hz, IH), 5.08 (s= 2H), 7.34-7.43 (m, 10H), 8.12 (d, IH,
J= 8.5 Hz, IH), 8.67 (s, br, 2H).
13C NMR (126 MHz, J0-DMSO): δ = -1.46 (3C), 16.51, 55.14, 57.92, 63.36, 66.28, 128.02 (2C), 128.18, 128.22 (2C), 128.56 (2C), 128.95 (2C), 129.54, 134.00, 136.70, 156.14, 169.06. HR-TOF-MS (Methode 1): C22H30N2O4Si [M + H]+ gef. 415.2036, ber. 415.2048.Beispiel 20A
N2;-tert-Butoxycarbonyl[(3i?)-3-hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreonyl- glycyl-[(35)-3-hydroxy-L-asparaginyl]-L-serin-trifluoFacetat
Zu einer Lösung der Edmani 0-Vorstufe (Beispiel 3A, 690 mg, 680 μmol, 1 Äquivalent) in Wasser- Dioxan 1 :2 (30 ml) werden unter Argonschutzgasatmosphäre Di-tert-butyldic arbonat (369 mg, 1.69 mmol, 2.5 Äquivalente) und N-Methylmorpholin (68 mg, 680 μmol, 1 Äquivalent) gegeben. Das Reaktionsgemisch wird so lange gerührt bis das HPLC-Chromatogramm vollständigen Umsatz zeigt (ca. 48 h). Das Reaktionsgemisch wird mit Kaliumdihydrogenphospha-t (5 Äquivalente) versetzt, im Vakuum eingeengt und mittels präparativer HPLC (Methode 21 oder Methode 11 gefolgt von anschließendem Umsalzen des Chromatographieproduktes durch Zusatz von TFA (2000 μmol, als 0.05%ige Lösung in Acetonitil-Wasser 1:1)) gereinigt. Man erha.lt 531 mg (70% d. Th.) der Titelverbindung.
HPLC/UV-Vis (Methode 3): R1 = 1.7 min. LC-MS (Methode 5): R, = 4.6 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 453.5 (60) [M - Boc + 2H]2+, 1006 (100) [M + H]+. MS (ESIneg.): m/z (%) = 1004 (100) [M - H]". HR-TOF-MS (Methode 1): C42H77Ni2Oj6 [M + H]+ gef. 1005.5560, ber. 1005.5576.
Beispiel 21A
N2-(Benzyloxycarbonyl)-N3-{N2 ;-^rf-butoxycarbonyl[(3i?)-3-hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D- arginyl-L-isoleucyl-L-allothreonyl-glycyl-[(3S)-3-hydroxy-L-asparaginyl]-L-seryl}-(3i?)-3-amino-
L-phenylalanin-(2-(trimethylsilyl)ethyl)ester-trifluoracetat
Zu einer Lösung der Diaminosäure (Beispiel 19A, 1.2 Äquivalente, 42.5 mg, 80 μmol), der Octa- peptidsäure (Beispiel 2OA, 1.0 Äquivalente, 75.0 mg, 70 μmol) und N-Methylmorpholin (1-0 Äqui¬ valente, 70 μmol) in trockenem Dimethylformamid (2 ml) wird bei 00C untex Argon- Schutzgasatmosphäre zunächst HATU (1.5 Äquivalente, 38.2 mg, 100 μmol) gegeten. Das Reaktionsgemisch wird gerührt (ca. 15 min) und erneut mit N-Methylmorpholin (2.5 Äquivalente, 175 μmol) versetzt. Das Reaktionsgemisch erwärmt sich langsam (ca. 12 h) auf Raumtemperatur und zeigt dann vollständigen Umsatz der Amin-Komponente (HPLC-Kontrolle). Das Reaktions¬ gemisch wird mit festem Kaliumdihydrogenphosphat (5 Äquivalente, 350 μmol) versetzt und dann im Hochvakuum eingedampft und chromatographisch aufgereinigt (Methode 21 oder MCethode 13 gefolgt von anschließendem Umsalzen des Chromatographieproduktes durch Zusatz von TFA (200 μmol, als 0.05%ige Lösung in Acetonitil-Wasser 1 :1)). Man erhält 73.5 mg (72% d. Th.) Produkt.
HPLC/UV-Vis (Methode 2): R1 = 2.3 min. LC-MS (Methode 5): R, = 5.5 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 637.6 (60), 1402 (100) [M + H]+. MS (ESIneg.): m/z (%) = 1400 (100) [M - H]", 1447 (20) [M - HCO2H - H]".
Beispiel 22A
N2-(Benzyloxycarbonyl)-N5-{N2/-fe/'?-butoxycarbonyl[(3/?)-3-hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D- arginyl-L-isoleucyl-L-allothreonyl-glycyl-[(3iS)-3-hydroxy-L-asparaginyl]-L-seryl}-(3jR)-3-amino-
L-phenylalanin-trifluoracetat
Der Nonapeptid-trimethylsilylester (Beispiel 21A, 70 mg, 46 μmol) und Molsieb 4 A (ca. 10 mg) werden in trockenem THF (3 ml) unter Argon-Schutzgasatmosphäre vorgelegt. Bei RT wird unter starkem Rühren eine 1 N TBAF-THF-Lösung (320 μl, 7 Äquivalente) zugetropft und so lange gerührt bis das HPLC-Chromatogramm (Methode 2) vollständigen Umsatz zeigt (ca. 1 h). Das Reaktionsgemisch wird nun mit Essigsäure neutralisiert (50 μl, ca. 20 Äquivalente). Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum eingedampft und mittels präparativer HPLC (Methode 21 oder Methode 13 gefolgt von anschließendem Umsalzen des Chromatographieproduktes durch Zusatz von TFA (200 μmol, als 0.05%ige Lösung in Acetonitil-Wasser 1 :1)) gereinigt. Man erhält 50.2 mg (77% d. Th.) der Titelverbindung.
HPLC/UV-Vis (Methode 2) : R, = 2.1 min. LC-MS (Methode 5): Rt = 5.2 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 601.6 (60) [M - Boc + 2H]2+, 1302 (100) [M + H]+. MS (ESIneg.): m/z (%) = 1300 (100) [M - H]".
Beispiel 23A
N2-(Benzyloxycarbonyl)-N5-{N2;-tert-butoxycarbonyl[(3/?)-3-hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D- arginyl-L-isoleucyl-L-allothreonyl-glycyl-[(3,S)-3-hydroxy-L-asparaginyl]-L-seryl}-(3i?)-3-aniino-
L-phenylalanin-(pentafluorphenyl)ester-trifluoracetat
Die Nonapeptidsäure (Beispiel 22A, 54.4 mg, 38 μmol) wird unter Argon-Schutzgasatmosphäre in Dichlormethan (1 ml) vorgelegt. Bei -200C werden nacheinander Pentafluorphenol (71 mg, 380 μmol, 10 Äquivalente), EDC (17 mg, 192 μmol, 2.3 Äquivalente) und DMAP (1 mg, 8 μmol, 0.2 Äquivalente) zugegeben. Man lässt langsam auftauen (ca. 3 h) und rührt bei RT nach (ca. 12 h) bis das HPLC-Chromatogramm vollständigen Umsatz anzeigt (Methode 2). Das Rohprodukt wird ohne Reinigung weiter umgesetzt.
LC-MS (Methode 8): R, = 2.3 min;
MS (ESIpos.) : m/z (%) = 685 (100) [M - Boc + 2H]2+, 1468 (10) [M + H]+.
MS (ESIneg.): m/z (%) = 1282 (100), 1465 (40) [M -H]"
Beispiel 24A
N5-(Benzyloxycarbonyl)-N3-{[(3-z?)-3-hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L- allothreonyl-glycyl-[(35)-3-hydroxy-L-asparaginyl]-L-seryl}-(3i?)-3-amino-L-phenylalanin-
(pentafluorρhιenyl)ester-bishydrochlorid
Gemäß der Arbeitsvorschrift 2 wird das N-(tert-Butoxycarbonyl)-Cyclopeptid (Beispiel 23 A, 60 mg, 40 μmol) unter Argon-Schutzgasatmosphäre umgesetzt. Man erhält nach GefHertrocknung 50 mg (96% d. Th.) Produkt, das direkt ohne weitere Reinigung umgesetzt wird.
HPLC/UV-Vis (Methode 2): Rt = 1.9 min, λmax (qualitativ) = 210 nm (s), 255-270 (w). LC-MS (Methode 5): Rt = 4.7 min;
MS (ESIpos.): mk (%) = 684.3 (10O) [M + 2H]2+, 1368 (50) [M + H]+. MS (ESIneg.): m/z (%) = 1366 (100) [M - Hf.
Beispiel 25A
N2J-(Benzyloxycarbonyl)-[(3i?)-3-amino-L-phenylalanyl)]-[(ii?)-3-hydroxy-L-leucyl]— L-leucyl-D- arginyl-L-isoleucyl-L-allothreonyl-glycyl-[(35)-3-hydroxy-L-asparaginyl]-L-serin-Cy ≤>-N5 i-lactam- trifluoracetat
Eine Lösung des Pentafluorphenolesters (Beispiel 24A, 15.8 mg, 11 μmol) in DMF (1 ml) wird mit Dioxan (20 ml) verdünnt und dann (als Suspension) unter starkem Rühren unter Argon- Schutzgasatmosphäre in auf 8O0C vorgeheiztes Pyridin p.a. (80 ml) getropft. Das Reaktionsge- misch wird bei 85°C nachgerührt bis das HPLC-Chromatograinm (Methode 2) vollständigen Um¬ satz zeigt (ca. 1 h). Es wird im Vakuum eingeengt. Das Rohprodukt wird zunächst gelchromatographiert (Methode 14) und dann mittels präparativer HPLC (Methode 10) fein¬ gereinigt. Man erhält 4.3 mg (33% d. Th.) der Titelverbindung.
Alternatives Syntheseverfahren (Direkte Cyclisierung der freien nonapeptidischen Aminosäure): Bei O0C wird eine Lösung des freien Nonapeptids (N2-(Benzyloxycarbonyl)-N5-{[(3i?)-3-hydroxy- L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreonyl-glycyl-[(35)-3-hydroxy-L-asparaginyl]-L- seryl}-(3i?)-3-amino-L-phenylalanin-trifluoracetat, 280 mg, 0.22 mmol) in DMF (70 ml) und ΝMM (142 μl, 6 Äquivalente) mit HATU (245 mg, 0.65 mmol, 3 Äquivalente) versetzt. Das Reaktionsgemisch wird bis zu vollständigem Umsatz gerührt (1.5 h, HPLC-Kontrolle). Anschließend wird das Reaktionsgemisch mit Methanol (10 ml) gequencht, im Vakuum eingeengt und direkt mittels präparativer HPLC gereinigt (Methode 35). ΪMan erhält das Produkt als Feststoff (201.5 mg, 70% d. Th.).
LC-MS (Methode 5): R1 = 4.8 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 592.6 (20) [M + 2H]2+, 1184 (100) [M + H]+. MS (ESIneg.): m/z (%) = 1182 (100) [M - H]". LC-MS (Methode 7): R, = 1.8 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 592.7 (50) [M + 2H] i22++, 1184 (100) [M + H]+.
MS (ESIneg.): m/z (%) = 536.6 (100), 1182 (50) [M - H]", 1229 [M - H + HCO2H]".
HR-TOF-MS (Methode 1): C54H83Ni4O16 [M + H]+ gef. 1183.6122, ber. 1183.6 106.
Beispiel 26A
[(3i?)-3-Amino-L-phenylalanyl)]-[(3i?)-3-hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L- allothreonyl-glycyl-[(3jS)-3-hydroxy-L-asparaginyl]-L-serin-Cλ9-NJ /-lactam-bishydrochlorid
Das Cbz-geschützte Cyclopeptid (Beispiel 25A, 4.3 mg, 3.3 μmol) wird in Methanol (4 ml) gelöst und unter Argonschutzgasatmosphäre mit lOproz. Palladium-Kohle (100 mg) sowie wässriger I N Salzsäure (200 μl) versetzt. Bei RT und Normaldruck wird so lange hydriert (ca. 1 h) bis die analytische HPLC (Methode 2) vollständigen Umsatz anzeigt. Das Reaktionsgemisch wird filtriert (über Kieselgur, Celite® oder einen Spritzenfilter, Fa. Biotage, PTFE), im Vakuum eingeengt und am Hochvakuum getrocknet. Man erhält 4 mg (quant.) der Titelverbindung.
Alternatives Darstellungsverfahren (Titelverbindung als TrifluoracetatV Das Cbz-geschützte Cyclopeptid (Beispiel 25A, 330 mg, 254 μmol) wird in Methanol (200 ml) gelöst und unter Argon¬ schutzgasatmosphäre mit lOproz. Palladium-Kohle (127 mg) sowie Salzsäure (1526 μl, 6 Äquivalente) versetzt. Es wird ca. 1 h hydriert und erneut Katalysator (100 mg) sowie Salzsäure (3 Äquivalente, 760 μl) zugegeben. Bei RT und Normaldruck wird so lange weiterhydriert (ca. 1 h) bis die analytische HPLC (Methode 2) vollständigen Umsatz anzeigt. Das Reaktionsgemisch wird filtriert (über Kieselgur, Celite), im Vakuum eingeengt und am Hochvakuum getrocknet. Das
Rohprodukt wird mittels präparativer HPLC gereinigt (Methode 33). Man erhält 250 rng (77% d. Th.) der Titelverbindung als Trifluoracetat.
HPLC/UV-Vis (Methode 3): Rt = 1.4 min, ^x (qualitativ) = 210 nm (s), 255-270 (w). LC-MS (Methode 7): Rt = 1.1 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) - 525.6 (100) [M + 2H]2+.
MS (ESIneg.): m/z (%) = 1048 (100) [M - H]", 1095 [M - H + HCO2H]-
HR-TOF-MS (Methode 1): C46H77Ni4O14 [M + H]+ gef. 1049.5728, ber. 1049.5739.
Beispiel 27A
N2 y-(ter?-Butoxycarbonyl)-[3-rerr-butyl-D-alanyl]-[3-/e?"f-butyl-L-alanyl]-[(3i?)-3-amino-L- phenylalanyl)]-[(3jR)-3-hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreonyl-glycyl- [(3S)-3-hydroxy-L-asparaginyl]-L-serin-Cλ//-N5Mactam-trifluoracetat
Zu einer Lösung des Cyclopeptids (Beispiel 26A, 1.0 Äquivalente, 11.0 mg, 10 μmol), der Dipeptidsäure N-(fer^Butoxycarbonyl)-3-ter^butyl-D-alanyl-3-te^butyl-L-alanin (4.0 Äqui¬ valente, 14.6 mg, 40 μmol) und N-Methylmorpholin (2.0 Äquivalente, 20 μmol) in trockenem Dimethylformamid (270 μl) wird bei O0C unter Argon-Schutzgasatmosphäre zunä.chst HATU (4.1 Äquivalente, 14.6 mg, 40 μmol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wird gerührt (ca. 15 min) und erneut mit N-Methylmorpholin (5.0 Äquivalente, 50 μmol) versetzt. Das Reaktionsgemisch erwärmt sich langsam (ca. 12 h) auf Raumtemperatur und zeigt dann vollständigen Umsatz der
Amin-Komponente (HPLC-Kontrolle, Methode 3). Das Reaktionsgemisch wird mit festem Kaliumdihydrogenphosphat (10 Äquivalente, 500 μmol) versetzt und dann im Hochvakuum einge¬ dampft und chromatographisch aufgereinigt (Methode 21 oder Methode 13 gefolgt von anschließendem Umsalzen des Chromatographieproduktes durch Zusatz von TFA (100 μmol, als 0.05%ige Lösung in Acetonitril- Wasser 1 :1)). Man erhält 10.5 mg (70% d. Th.) Produkt.
HPLC/UV-Vis (Methode 3): R, = 2.5 min, λmax (qualitativ) = 210 ran (s), 255-270 (w).
LC-MS (Methode 5): R, = 5.5 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 702.6 (30) [M + 2H]2+, 1404 (20) [M + H]+.
MS (ESIneg.): m/z (%) = 700.7 (50) [M - 2H]2", 1402 (10) [M - H]-, 1448 [M - H + HCO2H]-.
LC-MS (Methode 7): R4 = 2.3 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 653 (100) [M - Boc + 2H]2+, 1404 (50) [M + H]+.
HR-TOF-MS (Methode 1): C65H1IiNi6O18 [M + H]+ gef. 1403.8232, ber. 1403.8257.
Beispiel 28A
Nzy-(Benzyloxycarbonyl)-D-leucyl-L-leucyl-[(3i?)-3-amino-L-phenylalanyl)]-[(3/?)-3-hydroxy-L- leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreonyl-glycyl-[(35)-3-hydroxy-L-asparaginyl]-L- serin-C/ /;-NJJ-lactam-trifluoracetat
Herstellung analog Beispiel 27A aus der Verbindung aus Beispiel 26A (900 μg, 0.8 μmol) und N-(Benzyloxycarbonyl)-D-leucyl-L-leucin (Beispiel 3OA, 1200 μg, 3.2 μmol, 4 Äquivalente). Das
Rohprodukt wird mittels Gelchromatographie (Methode 14) gereinigt, wobei man nach Gefriertrocknung 500 μg (41% d. Th.) Produkt als Feststoff erhält.
HPLC/UV-Vis (Methode 3): R1 = 2.3 min, LC-MS (Methode 5): Rt = 5.2 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 706.2 (100) [M + 2H]2+, 1410 (20) [M + H]+. MS (ESIneg.): m/z (%) = 1408 (100) [M - H]"
Beispiel 29A
N^Benzyloxycarbonyty- D-leucyl-L-leucin-rnethylester
Zu einer Lösung von L-Leucin-methylester-hydrochlorid (1.1 Äquivalente, 753.2 mg, 4.15 mmol) in Dichlormethan p.a. (20 ml) werden bei -100C nacheinander HOBt (4 Äquivalente, 2038 mg, 15.08 mmol), N-Methylmorpholin (3 Äquivalente, 11.3 mmol), N-Benzyloxycarbonyl-D-leucin (1.0 Äquivalente, 1000 mg, 3.8 mmol), EDC (2 Äquivalente, 1441 mg, 7.5 mmol) und erneut N-Methylmorpholin (2 Äquivalente, 7.5 mmol) gegeben. Das Reaktionsgemisch erwärmt sich langsam (ca. 12 h) auf RT, wobei vollständiger Umsatz der Amin-Komponente mittels HPLC beobachtet wird. Das Reaktionsgemisch wird eingeengt, in Essigsäureethylester (ca. 200 ml) auf¬ genommen und anschließend mit gesättigter wässriger Νatriumhydrogencarbonat-Lösung (einmal), 5%iger wässriger Citronensäure (zweimal), gesättigter wässriger Νatriumhydrogencarbonat- Lösung (einmal) und gesättigter ΝatriumcJhlorid-Lösung gewaschen. Man trocknet über Νatrium- sulfat und filtriert. Im Vakuum wird bis zur Trockne eingedampft und anschließend im Hochvakuum nachgetrocknet. Man erhält 1483 mg (93% d. Th.) der Titelverbindung, die ohne weitere Reinigung umgesetzt wird.
LC-MS (Methode 7): Rt = 2.59 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 393 (100) [M + O]+.
Beispiel 30A
7V-<TBenzyloxycarbonyl)- D-leucyl-L-leucin
N-(Benzyloxycarbonyl)-D-leucyl-L-leucin-methylester (Beispiel 29A, 1.12 g, 2.85 mmol) wird bei 00C in THF/Wasser 2:1 (15 ml) vorgelegt und dann mit Lithϊumhydroxid-Monohydrat (140 mg,
5.71 mmol, 2 Äquivalente) versetzt. Wenn das HPLC-Chromatogramm (Methode 2) vollständigen
Umsatz zeigt (ca. 1 h) wird das Reaktionsgemisch mit Essigsäure auf pH 3-4 eingestellt, kalt im
Vakuum eingeengt und dann über Nacht an der Gefriertrockrrung von Lösungsmittel befreit. Das
Rohprodukt wird mittels präparativer HPLC (Methode 13) gereinigt, wobei man 958 mg (88.7% d. Th.) der Titelverbindung erhält.
LC-MS (Methode 7): Rt = 2.33 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 379 (100) [M + H]+.
HR-TOF-MS (Methode 1): C20H3IN2O5 [M + H]+ gef. 379.2227, ber. 379.2233.
Beispiel 31A
Methyl-(2i?,3i?)-N2-[(ben2yloxy)carbonyl]-N2-[(benzyloxy)carbonylamino]-3-[(ter^-butoxy- carbonyl)amino]-phenylalaninat
Methode A (5 g Maßstab): Unter Argonschutzgasatmosphäre wird eine 1 N Lösung von Lithiumhexamethyldisilazid (39.4 mmol, 39.4 ml, 2.2 Äquivalente) in THF im Reaktionslösungsmittel THF (200 ml) vorgelegt. Bei -780C wird eine Lösung von (S)-3-[(tert- Butoxycarbonyl)amino]-3-phenylpropansäuremethylester (5.0 g, 17.9 mmol) langsam zugetropfit. Man rührt 10 min bei -250C und kühlt dann erneut auf -780C herunter. Dibenzylazadicarboxylat (8.54 g, 28.6 mmol, 1.6 Äquivalente) wird in einer Portion zum. Reaktionsgemisch gegeben. Es wird 3 h bei -50 bis -6O0C gerührt. Um die Reaktion zu stoppen, wird erneut auf -780C herunter¬ gekühlt und mit Essigsäure (5.1 ml, 89.5 mmol, 5 Äquivalente) versetzt, und dann auf 00C und schließlich RT erwärmt. Aufarbeitung analog Beispiel 12A (Methode B). Man erhält 4.8 g (44% d. Th.) der Titelverbindung als Feststoff.
Methode B (50 g Maßstab): Unter Argonschutzgasatmosphäre wird eine 1 N Lösung von Lithiumhexamethyldisilazid (452.9 mmol, 452.9 ml, 2.2 Äquivalente) in THF im Reaktionslösungsmittel THF (1800 ml) vorgelegt. Bei -7O0C wird eine Lösung von (S)-3-[(tert- Butoxycarbonyl)amino]-3-phenylpropansäuremethylester (57.5 g, 205.8 mmol) in THF (600 ml) langsam zugetropft. Man rührt 10 min bei -25°C und kühlt dann erneut auf -7O0C herunter. Dibenzylazadicarboxylat (98.2 g, 329.4 mmol, 1.6 Äquivalente) wird in 4 Portionen zum Reaktionsgemisch gegeben. Es wird 2 h bei -50 bis -600C gerülxrt. Um die Reaktion zu stoppen, wird erneut auf -7O0C heruntergekühlt und mit Essigsäure (61.7 ml, 1 mol, 5 Äquivalente) versetzt, und dann über Nacht auf RT erwärmt. Das Präzipitat in der Reaktionslösung wird abgesaugt. Der Filterrückstand wird im Hochvakuum bei 5O0C getrocknet (46.1 g, Rohprodukt 1). Die filtrierte Mutterlauge (Reaktionsgemisch) wird im Vakuum eingeengt (Rohprodukt 2). Die beiden Rohprodukte 1 und 2 werden aus heißem Essigsäureethylester (2 x 500 ml) umkristallisiert (Rückfluss, I h; Produktfraktionen 1 (31.7 g) und 2 (37.4 g). Die Mutterlauge wird erneut
eingedampft und aus tert-Butylmethylether (370 ml) umkristallisiert. Man erhält hierbei Produktfraktion 3 (14.5 g). Insgesamt erhält man 83.6 g (70% d. Th.) der Titelverbindung als Feststoff.
M20Na = -13° (c = 0.20 in Chloroform). HPLC/UV-Vis (Methode 2): R, = 2.88 min. LC-MS (Methode 29): R, = 2.8 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 478 (100) [M -Boc + H]+, 578 (70) [M + H]+, 1156 (20) [2M + H]+; MS (ESIneg.): m/z (%) = 576 (100) [M - H]".
1HNMR (500 MHz, J6-DMSO, 335 K, breite Signale): δ = 1.35 (s, 9H), 3.15 (s, 3H), 3.30 (s, 3H), 4.90-5.15 (m, 6H), 7.20-7.40 (m, 10H), 8.30, 8.95 (3s, br, 2H).
Beispiel 32A
Methyl-(2ιS',3i?)-N-[(benzyloxy)carbonyl]-N-[(benzyloxy)carbonylamino]-3-[(te^"?-butoxycarbonyl)- amino] -pheny lalaninat
Unter Argonschutzgasatmosphäre wird eine Lösung von Methyl-(2i?,3J?)-N2-[(benzyloxy)- carbonyl]-N2-[(benzyloxy)carbonylamino]-3-[(^erf-butoxycarbonyl)amino]phen.ylalaninat (3.95 g, 6.84 mmol) in trockenem Dichlormethan p.a. (170 ml) bei O0C mit N,N,N,Λ/-Tetramethylguanidin (16.6 ml, 132 mmol) versetzt. Man lässt das Reaktionsgemisch auftauen und rührt bis das HPLC- Chromatogramm (Methode 2) vollständigen Umsatz (ca. 60% Produkt) anzeigt (ca. 12 h), um die Reaktion dann durch Zugabe von Essigsäure (10.5 ml, pH 4—6) zu stoppen. Die organische Phase wird mit Wasser (zweimal), gesättigter wässriger Νatriumhydrogencarbonatlösung (zweimal), gesättigter wässriger Νatriumchloridlösung (einmal) gewaschen. Die wässrigen Phasen werden mit
Dichlormethan reextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert, im Vakuum eingedampft, im Hochvakuum getrocknet. Das Rohprodukt wird mittels Flashchromatographie (Kieselgel, Toluol/Essigsäureethylester 4:1) gereinigt. Man erhält 2.4 g (61% d. Th., bezogen auf zurückgewonnenes Ausgangsmaterial 68%) der Titelverbinduug und 490 mg der Ausgangsverbindung (12% d. Th.).
W20 Na = -120.7° (c = 0.52 in Chloroform). HPLC/UV-Vis (Methode 2): R, = 2.99 min. LC-MS (Methode 29): Rt = 2.9 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 478 (100) [M -Boc + H]+, 578 (50) [M + H]+, 1156 (10) [2M + H]+; MS (ESIneg.): m/z (%) = 502 (100), 576 (40) [M - Hf.
HR-TOF-MS (Methode 1): C3]H36N3O8 [M + H]+ gef. 578.2505, ber. 578.2497.
Beispiel 33A
Methyl-(2S,3R)-3-[(tert-butoxycarbonyl)amino]phenylalaninat
Unter Argonschutzgasatmosphäre wird zu einer Lösung von Methyl-(2)S',3i?)-N-[(benzyloxry)- carbonyl]-N-[(benzyloxy)carbonylamino]-3-[(tert-butoxycarbonyl)amino]phenylalaninat (600 mg, 1.04 mmol) in Methanol/Dichlormethan 1:1 (12 ml) Raney-Νickel (86 mg) gegeben. Das Reaktionsgemisch wird in einem Druck-Autoklaven bei 80 bar Wasserstoffdruck und RT hydriert (72 h). Das HPLC-Chromatogramm zeigt vollständigen Umsatz. Das Reaktionsgemisch wird unter Argonschutzgasatmosphäre über einer (mit Kieselgur überschichteten) Glasfritte filtriert. Die Glasfritte wird mehrfach mit MethanolAVasser/0.2% Essigsäure gewaschen. Das Filtrat wird mit Wasser gewaschen (zweimal) und dann im Vakuum eingedampft. Als Rohprodukt erhält rαan einen Feststoff (280 mg, 92% d. Th.) der ohne Feinreinigung weiter umgesetzt wird. Für analytische Zwecke kann eine gelchromatographische Feinreinigung (Methode 14, Methanol/O.1% TFA) vorgenommen werden.
[Cc]20 Na = +11° (c = 0.25 in Chloroform) (TFA-SaIz).
HPLC/UV-Vis (Methode 2): R, = 1.5 min. LC-MS (Methode 29): Rt = 1.2 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 239 (100), 295 (40) [M + H]+.
1H NMR (500 MHz, J6-DMSO, TFA-SaIz): δ = 1.36 (s, 9H), 3.50 (s, 3H), 4.30 (d, J = 7.2 Hz, IH), 5.05 („t", J = 8.0 Hz, IH), 7.30-7.39 (m, 5H), 7.60 (d, J= 9.7 Hz, IH).
13C NMR (125 MHz, J0-DMSO, TFA-SaIz): δ = 28.25 (3C), 52.87, 54.88, 56.87, 79.29, 127.12
(2C), 128.45, 128.89 (2C), 137.18, 154.83, 168.14.
HR-TOF-MS (Methode 1): C15H22N2O4 [M + H]+ gef. 295.1663, ber. 295.1653.
Beispiel 34A
Methyl-(2>S',3i?)-N-[(benzyloxy)carbonyl]-3-[(?ert-butoxycarbonyl)amino]phenylalaninat
Unter Argonschutzgasatmosphäre wird zu einer Lösung von Methyl-(2<S',3i?)-3-[(fer?-bxιtoxy- carbonyl)amino]phenylalaninat (250 mg, 0.62 mmol) und N-Benzyloxycarbonyloxysuccimimid- ester (180 mg, 0.71 mmol, 1.15 Äquivalente) in einem Gemisch aus Dichlormethan (20 nxl) und Wasser (45 ml) bei 00C festes Νatriumhydrogencarbonat (80 mg, 0.93 mmol, 1.5 Äquivalente) zugegeben. Das Reaktiosgemisch wärmt sich langsam auf (12 h), wobei vollständiger Umsatz mittels HPLC (Methode 2) beobachtet wird. Die wässrige Phase wird mit Dichlormethan reextra¬ hiert und anschließend mit 5%iger wässriger Zitronensäure, gesättigter wässriger Νa-trium- hydrogencarbonatlösung und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, über Νatriurnsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Anschließend wird mittels Flashchromatographie (Kieselgel, Toluol/ Essigsäureethylester 4:1) gereinigt. Man erhält 144 mg (47% d. Tri.) der Titelverbindung
51
- 81 -
[α]20 Na = +13.3° (c = 0.70 in Chloroform). HPLC/UV-Vis (Methode 2): R, = 2.6 min. LC-MS (Methode 7): R1 = 2.7 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 329 (100) [M -Boc + H]+, 373 (80), 429 (60) [M + H]+, 858 (10) £2M + H]+.
1HNMR (400 MHz, ^6-DMSO): δ = 1.37 (s/9H), 3.62 (s, 3H), 4.58 (dd, J = 9.5, 4.2 Hz, 1H>, 4.94 (m, 2H), 5.27 (dd, J = 10.4, 4.0 Hz, IH), 7.21-7.35 (m, 10H), 7.50 (d, J= 10.5 Hz, IH), 1.59 (d, J= 9.4 Hz, IH).
13C NMR (126 MHz, ^-DMSO): δ = 28.25 (3C), 52.31, 54.66, 59.03, 65.71, 78.72, 126.64- (2C), 127.40, 127.63 (2C), 127.99, 128.42 (2C), 128.51 (2C), 136.90, 139.24, 154.97, 156.23, 170. 89. HR-TOF-MS (Methode 1): C23H29N2O6 [M + H]+ gef. 429.2011, ber. 429.2021.
Beispiel 35A
(3i?)-N2-[(Benzyloxy)carbonyl]-3-[(ferf-butoxycarbonyl)amino]-L-phenylalanin
Unter Argonschutzgasatmosphäre wird eine Lösung von Methyl-(25l,3i?)-N-[(benzyloxy)carbonyl]- 3-[(^ert-butoxycarbonyl)amino]phenylalaninat (152 mg, 0.30 mmol) in THF/Wasser 2:1 (22.5 ml) vorgelegt. Bei O0C wird unter starkem Rühren eine entgasten l%ige wässrige Lösu.ng von Lithiumhydroxid-Monohydrat (14.8 mg, 0.62 mmol, 2 Äquivalente) langsam zugetropft. Man rührt bei RT so lange nach, bis das HPLC-Chromatogramm (Methode 2) vollständigen Umsatz, anzeigt (ca. 1 h). Anschließend versetzt man mit Essigsäure (0.1 ml), konzentriert das Reaktionsgemisch im Vakuum auf und gefriertrocknet den Rückstand. Das Rohprodukt wird mittels präparativer HPLC feingereinigt (Methode 13). Als Produkt erhält man 74 mg (59% d. Th.) der Titelverbindung.
[Ot]20 Na = +22° (c = 0.50 in Chloroform) (durch chirale Chromatographie); [α]2°Na = +21.5° (c = 0.51 in Chloroform) (durch enantioselektive Synthese) LC-MS (Methode 7): Rt = 2.4 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 315 (90), 359 (100), 415 (80) [M + H]+, 729 (30), 829.5 (50) [2M + H]+. MS (ESIneg.): m/z (%) = 413 (100) [M - H]". Chirale HPLC/UV-Vis (Methode 24): Rt = 5.4 min (schmaler Peak).
1H NMR (500 MHz, J0-DMSO): δ = 1.35 (s, 9H), 4.46 (dd, J = 9.6, 3.6 Hz, IH), 4.91 (s, 2H), 5.26 (dd, J = 9.9, 3.6 Hz, IH), 7.18-7.32 (m, 10H)5 7.48-7.51 (m, 2H), 12.95 (s, br, IH). 13C NMR (126 MHz, J6-DMSO): δ = 28.34 (3C), 54.84, 58.96, 65.55, 78.56, 126.53 (2C), 127.23,
I O 127.55 (2C), 127.93, 128.39 (2C), 128.51 (2C), 137.05, 140.16, 155.09, 156.30, 171.62. HR-TOF-MS (Methode 1): C22H26N2O6 [M + H]+ gef. 415.1864, ber. 415.1864.
Beispiel 36A
(31S)-N2-[(Benzyloxy)carbonyl]-3-[(teλt-butoxycarbonyl)amino]-D-phenylalanin
15 Darstellungsvorschrift siehe Beispiel 35 A.
[Ot]20Na = -20° (c = 0.49 in Chloroform).
Chirale HPLC/UV-Vis (Methode 24): R, = 11.4 min (breiter Peak). LC-MS (Methode 7): R1 = 2.5 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 315 (40), 359 (40), 415 (50) [M -+ H]+, 729 (20), 829.5 (10) [2M + H]+. 20 MS (ESIneg.): m/z (%) = 413 (100) [M - Hf.
1H NMR (500 MHz, J0-DMSO): δ = 1.35 (s, 9H), 4.45 (dd, J = 9.6, 3.2 Hz, IH), 4.91 (s, 2H), 5.26 (dd, J = 9.4, 3.6 Hz, IH), 7.18-7.30 (m, 10H), 7.47-7.52 Cm, 2H), 12.95 (s, br, IH).
HR-TOF-MS (Methode 1): C22H26N2O6 [M + H]+ gef. 415.1869, ber. 415.1864.
Beispiel 37A
2-(Trimethylsilyl)ethyl-(3iS)-N-[(benzyloxy)carbonyl]-3-[(fert-butoxycarbonyl)amino]-D- phenylalaninat
Eine Mischung von (35)-N2-[(Benzyloxy)carbonyl]-3-[(?ert-butoxycarbonyl)amino]-D-phenyl- alanin (3.96 g, 9.55 mmol), 2-(Trimethylsilyl)ethanol (11.3 g, 95.6 mmol, 10 Äquivalente) und Molsieb 4 Ä (ca. 200 mg, frisch pulverisiert) in trockenem Dichlormethan p.a. (77 ml) wird für 3 h bei RT unter Argonschutzgasatmosphäre gerührt. Anschließend werden bei -300C DCC (3.94 g, 19.11 mmol, 2 Äquivalente) und DMAP (1.17 g, 9.55 mmol, 1 Äquivalent) zugegeben. Man lässt das Reaktionsgemisch auftauen (ca. 12 h) und rührt bei RT so lange nach, bis das HPLC- Chromatogramm (Methode 2) vollständigen Umsatz anzeigt (ca. 12 h). Das Reaktionsgemisch wird über Kieselgur filtriert und dann bei RT im Vakuum eingedampft. Das Rohprodukt wird an einer RPig-Kartusche vorfraktionert (Eluent Wasser, dann Acetonitril) und mittels präparativer Flashchromatographie (1.5 kg Kieselgel, Toluol/Essigsäureethylester 4:1) gereinigt. Man erhält 3.6 g (73% d. Th.) der Titelverbindung.
[Oc]20Na = -8.0° (c = 0.52 in Chloroform) HPLC/UV-Vis (Methode 3): R, = 3.2 min.
LC-MS (Methode 7): R, = 3.3 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 387 ( 100), 515 (90) [M + H]+. 1H NMR (500 MHz, ^6-DMSO): δ = -0.02 (s, 9H), 0.88 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 1.31 (s, 9H), 4.02- 4.15 (m, 2H), 4.48 (dd, J = 9.6, 4.3 Hz, IH), 4.86 (d, J = 12.6 Hz, IH), 4.90 (d, J = 12.6 Hz, IH),
5.25 (dd, J = 10.0, 3.8 Hz, IH), 7.14-7.29 (m, 10H), 7.47 (d, J= 10.3 Hz, IH), 7.50 (d, J= 9.7 Hz,
IH).
HR-TOF-MS (Methode 1): C27H38N2O6Si [M + H]+ gef. 515.2567, ber. 515.2572.
Beispiel 38A
2-(Trimethylsilyl)ethyl-(3)S)-3-amino-N^-[(benzyloxy)carbonyl]-D-phenylalaninat-trifluoracetat
2-(Trimethylsilyl)ethyl-(3iS)-N-[(benzyloxy)carbonyl]-3-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-D-phenyl- alaninat (3600 mg, 7.0 mmol) wird nach der Arbeitsvorschrift 1 umgesetzt (Reaktionszeit: 10 min). Das Rohprodukt wird mittels präparativer HPLC (Methode 13, Methode 21) gereinigt. Man erhält 3060 mg (83% d. Th.) der Titelverbindung.
[Oc]20Na - +15.0° (c = 0.22 in Chloroform) HPLC/UV-Vis (Methode 3): R1 = 1.9 min. LC-MS (Methode 8): R4 = 1.8 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 387.2 (60), 415 (100) [M + H]+. 1H NMR (500 MHz, J6-DMSO): δ = -0.06 (s, 9H), 0.52 (m, 2H), 3.76 (rn, IH)3 3.88 (m, IH), 4.49 (d, J = 9.3 Hz, IH), 4.58 ("t", J = 9.0 Hz, IH), 5.08 (s, 2H), 7.34-7.44 (m, 10H), 8.12 (d, J= 8.5 Hz, IH), 8.62 (s, br, 2H). HR-TOF-MS (Methode 1): C22H30N2O4Si [M + H]+ gef. 415.2042, ber. 415.2048.
Beispiel 39A
(3iS)-N-Boc-y?-phenylalanin-methylester
Das Enantiomerengemisch von (rαc)-N-Boc-/?-phenylalanin-methylester (62.8 g, 224.8 mmol) wird mittels präparativer HPLC (Methode 32) in die Enantiomere getrennt. Man erhält 29.1 g (3 R)-N- Boc-/?-phenylalanin-methylester (95.7% ee, 46% d. Th., Beispiel 40, später eluierend) und 30.5 g (3S)-N-Boc-/?-phenylalanin-methylester (>99% ee, 49% d. Th., Titelverbindung, früher eluierend).
M20 Na = -30° (c = 0.52 in Chloroform). HPLC/UV-Vis (Methode 3): R4 = 2.5 min.
1H NMR (500 MHz, (I6-DMSO): δ = 1.35 (s, 9H), 2.67 (dd, J= 15.4, 6.0 Hz, 1 H), 2.75 (dd, J = 15.7, 8.6 Hz, IH), 3.55 (s, 3H), 4.92 (m, IH), 7.23 (m, IH), 7.29-7.33 (m, 4H), 7.48 (d, J = 8.3 Hz, IH).
13C NMR (126 MHz, ^6-DMSO): δ = 28.38 (3C, (C(CH3)3)), 41.19 (C^H2), 51 .25 (CαH), 51.54 (OCH3), 78.07 (C(CH3)3), 126.47 (2C), 127.17, 128.46 (2C), 142.95, 154.90, 170.86. HR-TOF-MS (Methode 1): C15H22NO4 [M + H]+ gef. 280.1533, ber. 280.1544.
Beispiel 4OA
(3R)-N-Boc-/?-phenylalanin-methylester
Die Synthese erfolgt gemäß Beispiel 39A. η20
[α] Na = +30° (c = 0.52 in Chloroform).
1H NMR (500 MHz, J0-DMSO): δ = 1.35 (s, 9H), 2.68 (dd, J= 15.2, 6.0 Hz, IH), 2.75 (dd, J =
15.6, 8.8 Hz, IH), 3.55 (s, 3H), 4.92 (m, IH), 7.23 (m, IH), 7.30-7.33 (m, 4H), 7.48 (d, J = 8.7 Hz,
IH).
HR-TOF-MS (Methode 1): C15H2iNO4 [M + H]+ gef. 280.1555, ber. 280.1544.
Beispiel 41A
Methyl-3-(6-methylpyridin-2-yl)-Z-alaninat
Ein Gemisch von Methyl-N-(benzyloxycarbonyl)-3-(6-methylpyridin-2-yl)-L-alaninat (7.25 g, 22.1 mmol) [S. W. Jones, C. F. Palmer, J. M. Paul, P. D. Tiffin, Tetrahedron Lett. 1999, 40, 1211- 1214] und lOproz. Palladium auf Kohle (0.690 g) in Ethanol (80 ml) wird bei RT und Normal¬ druck für 1 h hydriert. Das Reaktionsgemisch wird über einen Spritzenfilter (Fa. Millipore, 0.45 μ, hydrophobes PTFE) gegeben, der mit Ethanol (zweimal je 10 ml) nachgewaschen wird. Der Rückstand wird am Rotationsverdampfer eingeengt (herausschleppen von Lösungsmittelresten mit Toluol, zweimal) und im Hochvakuum getrocknet. Als Produkt erhält man ein Öl (3.89 g, Ausbeute 91 % der Th.).
HPLC/UV-Vis (Methode 2): R1 = 0.3 min.
LC-MS (Methode 30): R, = 0.70 min, breiter Peak; MS (ESIpos.): m/z (%) = 195 (100) [M + H]+. 1H NMR (400 MHz, Jn-DMSO): δ = 1.95 (m, 2H), 2.41 (s, 3H), 2.86 (dd, J= 7.4 Hz, IH), 2.99 (dd, J= 5.9 Hz, IH), 3.59 (s, 3H), 3.73 (dd, J= 7.4, 5.7 Hz, IH), 7.02 (d, J= 7.5 Hz, IH), 7.06 (d, J= 7.1 Hz, IH), 7.56 (t, J= 7.5 Hz, IH).
Beispiel 42A
N-^er^-Butoxycarbonyl-3-to^-butyl-D-alanyl-3-(6-methylpyridin-2-yl)-L-alanin-methylester
Zu einer Lösung N-(ter£-Butoxycarbonyl)-3-ter/-butyl-D-alanin (Beispiel 6A, 1.0 Äquivalente, 1.6 g, 6.6 mmol) und Methyl-3-(6-methylpyridin-2-yl)-L-alaninat (Beispiel 41A, 1.1 Äquivalente, 1.4 g, 7.2 mmol) in trockenem DMF (26 ml) werden bei 00C langsam ΝMM (2 Äquivalente, 13.1 mmol) und zuletzt HATU (1.3 Äquivalente, 3.2 g, 8.5 mmol) gegeben. Das Reaktionsgemisch erwärmt sich langsam (ca. 12 h) auf RT, wobei vollständiger Umsatz mittels HPLC (Methode 2) beobachtet wird. Zur Aufarbeitung wird das Reaktionsgemisch im Rotationsverdampfer ein. geengt (Wasserbad 35°C) mit Essigsäureethylester (100 ml) verdünnt und anschließend mit gesättigter Νatriumhydrogencarbonat-Lösung (zweimal 20 ml), 5 proz. Zitronensäure (zweimal 20 ml), und gesättigter wäßriger Νatiumchloridlösung gewaschen. Die organische Phase wird über Νatriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Als Produkt erhält man einen Feststoff (2.88 g, 99% d. Th.) der mittels präparativer HPLC (Methode 13) feingereinigt werden kann.
HPLC/UV-Vis (Methode 2): Rt = 2.1 min.
LC-MS (Methode 29): R, = 1.73 min; MS CESIpos.): m/z (%) = 422 (100) [M + H]+;
MS CESIneg.): m/z (%) = 420 (20) [M - H]", 466 (100) [M - H + HCO2H]".
HR-TOF-MS (Methode 1): C2IH34N3O5 [M + H]+ ber. 408.2498, gef. 408.2503.
1H NlMR (400 MHz, J6-DMSO): δ = 0.79 (s, 9H), 1.23-1.43 (m, HH), 2.42 (s, 3H), 2.99-3 _ 13 (m,
2H), 3.60 (s, 3H), 3.95 (dt, J= 8.9, 3.8 Hz, IH), 4.64 (m, IH), 6.83 (d, J= 8.9 Hz, IH), 7.02 (d, J = 7.8 Hz, IH), 7.07 (d, J= 7.7 Hz, IH), 7.54 (t, J= 7.7 Hz, IH), 8.18 (d, J= 7.9 Hz, IH).
Beispiel 43 A
N-ter?-Butoxycarbonyl-3-/e/*f-butyl-Z)-alanyl-3-(6-methyl-2-pyridyl)-I-alanin
(Beispiel
42A, 850 mg, 2.02 mmol) wird nach der Allgemeinen Arbeitsvorschrift 4 umgesetzt. Man erhält 766 mg (93% d. Th.) Produkt.
Beispiel 44A
(^rf-Butoxycarbonyl)-[3-terf-butyl-D-alaiiyl]-[3-(6-methylpyrid-2-yl)-L-alanyl]-[(3i?)- 3-amino-L-phenylalanyl)]-[(3R)-3-hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreo- nyl-glycyl-[(31S)-3-hydroxy-L-asparagmyl]-L-serin-
lactam-bistrifluoracetat
Nach der Arbeitsvorschrift 5 werden das Cyclopeptid (Beispiel 26A_, 40.0 mg, 31.32 μmol) und die Dipeptidsäure (Beispiel 43 A, 22.9 mg, 56.37 μmol, 1.8 Äqivalente) unter Zuhilfenahme von NMM (17.2 μl, 156.58 μmol, 5 Äquivalente) und HATU (21.43 mg, 56.36 μmol, 1.8 Äquivalente) in DMF (15 ml) innerhalb von 2.5 h zum Amid bei -100C umgesetzt. Die Titelverbindung wird nach chromatographischer Reinigung (Methode 37) als Feststoff erhalten (29.4 mg, 55% d.Th.).
HPLC/UV-Vis (Methode 2): R1 = 2.25 min. LC-MS (Methode 7): Rt = 2.05 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 1439 (5) [M + H] +, 720 (100) [M + 2H]2+; MS (ESIneg.): m/z (%) = 1436 (100) [M - Hf, 718 [M - 2H]2\
HR-TOF-MS (Methode 1): C67H108N17O]8 [M + H]+ ber. 1438.8053,, gef. 1438.8060.
Beispiel 45A
N2 /-(fert-Butoxycarbonyl)-[3-rer?-butyl-D-alanyl]-[3-(pyrid-2-yl)-L-alanyl]-[(3i?)-3-amino-L- phenylalanyl)]-[(3i?)-3-hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreonyl-glycyl-
[(3S)-3-hydroxy-L-asparaginyl]-L-serin-Cλ//-N5J-lactam-bistrifluoracetat
Nach der Arbeitsvorschrift 5 werden das Cyclopeptid (Beispiel 26A, 100.0 mg, 78.29 μoiol) und das N-(^er?-Butoxycarbonyl)-4-methyl-D-leucyl-3-pyridin-2-yl-Z,-alanin (55.5 mg, 140.63 μmol, 1.8 Äqivalente) (siehe WO2004099239) unter Zuhilfenahme von ΝMM (43.0 μl, 156.58 μmol, 5 Äquivalente) und HATU (21.43 mg, 391.46 μmol, 1.8 Äquivalente) in DMF (8 ml) über Nacht zum Amid bei RT umgesetzt. Die Titelverbindung wird nach dem Chromatographieren (Methode 35) als Feststoff erhalten (111.3 mg, 86% d.Th.).
HPLC/UV-Vis (Methode 25): Rt = 19.44 min. LC-MS (Methode 7): R1 = 2.15 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 1424 (25) [M + H] +, 713 (100) [M + 2H]2+; MS (ESIneg.): m/z (%) = 1422 (100) [M - H]", 711 [M - 2H]2".
HR-TOF-MS (Methode 1): C66H106NnO18 [M + H]+ ber. 1424.7897, gef. 1424.7906.
Beispiel 46A
4-Methyl-D-leucin-trifluoracetat
Wie in der Arbeitsvorschrift 1 beschrieben ist, wird aus der Boc-geschützten Aminosäure (Beispiel 6A, 20.0 g, 81.53 mmol) die Titelverbindung mit 21.7 g (quant.) Rohausbeute erhalten.
MS (ESIpos): m/z (%) = 146 (100) [M+H]+.
HR-TOF-MS (Methode 1): C7H16N2O2-C2H3N [M + CH3CN + H]+ ber. 187.1442, gef. 187.1450. 1H NMR (500 MHz, ^6-DMSO): δ = 0.95 (m, 9H), 1.58 (dd, J = 14.5 Hz, 5.2 Hz, IH), 1.81 (dd, J = 14.5 Hz, 6.3 Hz, IH), 3.79 (t, J = 5.4 Hz, IH), 8.32 (s, br., 3H). 13C NMR (126 MHz, c?ö-DMSO): δ = 29.27 (3C), 30.26, 44.30, 50.01, 172.23.
Beispiel 47A
N-[(Benzyloxy)carbonyl]-4-methyl-D-leucin
Die Aminosäure (Beispiel 46A, 10.0 g, 38.6 mmol) und N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimidester (11.1 g, 44.4 mmol, 1.15 Äquivalente) werden in Dichlormethan/Wasser 4:1 (250 ml) gelöst. Das Reaktionsgemisch wird bei 00C mit festem Νatriumhydrogencarbonat (4.86 g, 57.9 mmol, 1.5 Äquivalente) und mit festem Tetra-n-butylammoniumbromid (1.2 g. 3.9 mmol, 0.1 Äqui¬ valente) versetzt, um dann über Nacht bei RT gerührt zu werden. Das HPLC-Chromatogramm zeigt vollständigen Umsatz. Die basische wäßrige Phase wird mit Dichlormethan gewaschen (sechsmal). Anschließend wird mit 1 N wässriger Salzsäure auf pH 2-3 eingestellt. Die wässrige
Phase wird nun mit Essigsäureethylester (dreimal) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit konz. wässriger Kochsalzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Das erhaltene Rohprodukt wird mittels präparatrver HDPLC (Methode 35) aufgereinigt. Man erhält 6.86 g (64% d. Th.) der Titelverbindung.
[α]20 Na = +2° (c = 0.17 in CHCl3).
HPLC/UV-Vis (Methode 3): R, = 2.2 min.
LC-MS (Methode 29): Rt = 2.0 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 236 (100), 280 (50) [M + H]+;
MS (ESIneg): m/z (%) = 170 (100), 278 (40) [M -H]". 1H NMR (400 MHz, ^6-DMSO): δ = 0.81 (d, J= 6.3 Hz, 3H), 0.86 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 0.89 (s,
9H), 1.48 (m, 3H), 1.57 (m, 2H), 3.61 (s, 3H), 4.14 (m, IH), 4.23 (m, IH), 5.03 (s, 2H), 7.27-7.40
(m, 6H), 8.19 (d, J= 7.9 Hz, IH).
13C NMR (126 MHz, ^6-DMSO): δ = 29.53 (3C), 30.50, 44.11, 51.49, 65.47, 127.75 (2C), 127.95,
128.51 (2C), 137.34, 156.03, 174.97. HR-TOF-MS (Methode 1): C15H22NO4 ber. 280.1544, gef. 280.1535 [M + H]+.
Beispiel 48A
Methyl-N-[(benzyloxy)carbonyl]-4-methyl-D-leucyl-L-leucinat
Methyl-L-leucinat-hydrochlorid (600.9 mg, 3.31 mmol, 1.1 Äquivalente) wird unter Argon- Schutzgasatmosphäre in Dichlormethan (250 ml) vorgelegt, die Lösung mit HOBt (1625.3 mg,
12.03 mmol, 4 Äquivalente), ΝMM (992 μl, 9.02 mmol, 3 Äquivalente), Benzyloxycarbonyl- geschützten Aminosäure (Beispiel 47 A, 840.0 mg, 3.0 mmol, 1 Äquivalente), EDC (1149.7 mg,
6.01 mmol, 2 Äquivalente) und mit weiteren ΝMM (661 μl, 6.02 mmol, 2 Äquivalente) bei -100C versetzt und über wird Nacht unter Rühren zum vollständigen Umsatz gebracht. Zur Aufarbeitung wird die Reaktionslösung am Rotationsverdampfer bei 300C Badtemperatur eingeengt, der
Rückstand in Essigsäureethylester und gesättigter Natriumbicarbonat-Lösung gelöst, die
abgetrennte wässrige Phase mit Essigsäureethylester extrahiert, die vereinigten organischen Phasen nacheinander mit 5%iger Zitronensäure-Lösung, mit gesättigter Natriumbicarfoonat-Lösung und gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Abtrennen des Trockenmittels wird das Lösungsmittel vollständig am Rotationsverdampfer bei 3O0C Badtemperatur entfernt. Das Produkt wird nach dem Lyophilisieren mit 1200 mg (98% d.Th.) Ausbeute erhalten.
HPLC (Methode 2): Rt = 2.65 min. LC-MS (Methode 7): R1 = 2.84 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 407 (100), 813 (27) [2M + H]+. 1H NMR (400 MHz, ^6-DMSO): δ = 0.81 (d, J= 6.3 Hz, 3H), 0.86 (d, J= 6.3 Hz, 3H), 0.89 (s, 9H), 1.42-1.55 (m, 5H), 3.61 (s, 3H) 4.15 (m, IH), 4.23 (m, H), 5.03 (s, 2H)5 7.28-7.41 (m, 6H), 8.01 (d, J= 7.9 Hz, 1H).HR-TOF-MS (Methode 1): C22H35N2O5 ber. 407.2541, gef. 407.2534 [M + H]+.
Beispiel 49A
N-[(Benzyloxy)carbonyl]-4-methyl-D-leucyl-L-leucin
Die Titelverbindung wird aus dem Methylester (Beispiel 48A, 1.1 g, 2.71 mmol) durch Hydrolyse nach der Arbeitsvorschrift 4 dargestellt. Nach 4 h Reaktionsdauer zeigt das HPLC-Chromato- gramm (Methode 2) fast vollständigen Umsatz an. Zur Feinreinigung wird das Rohprodukt über die präparative RP-HPLC (Methode 36) chromatographiert und man erhält anschließend 980 mg (92% d.Th.) Produkt.
HPLC (Methode 2): R1 = 2.40 min. LC-MS (Methode 7): R, = 2.56 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 393 (100) [M + H]+, 785 (72) [2M + H]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 391 (57) [M - H]", 783 (100) [2M - H]".
1H NMR (400 MHz, J6-DMSO): δ = 0.81 (d, J= 6.3 Hz, 3H), 0.86 (d, J= 6.3 Hz, 3H), 0.88 (s, 9H), 1.42-1.55 (m, 5H), 4.11-4.23 (m, 2H), 5.03 (s, 2H), 7.27-7.39 (m, 6H), 8.01 Cd, J= 8.0 Hz, IH), 12.52 (s, br., IH). HR-TOF-MS (Methode 1): C2IH33N2O5 ber. 393.2384, gef. 393.2383 [M + H]+.
Beispiel 5OA
N2 ;-(Benzyloxycarbonyl)-[3-fer?-butyl-D-alanyl]-L-leucyl-[(3R)-3-amino-L-phenylaIanyl)]-[(3i?)-
3-hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreonyl-glycyl-[(35)-3-hydroxy-L- asparaginyl]-L-serin-C/ y/-NJ"3-lactam-trifluoracetat
Nach der Arbeitsvorschrift 5 werden das Cyclopeptid (Beispiel 26A5 120.0 mg, 93.95 μmol) und die Dipeptidsäure (Beispiel 49 A, 63.38 mg, 169.11 μmol, 1.8 Äqivalente) unter Zuhilfenahme von NMM (52 μl, 469.75 μmol, 5 Äquivalente) und HATU (64.3 mg, 169.11 μmol, 1.8 -Äquivalente) in DMF (15 ml) über Nacht zum Amid bei RT umgesetzt. Die Titelverbindvmg wird nach Chromatographie (Methode 35) mit 138 mg (96% d.Th.) Ausbeute erhalten.
HPLC (Methode 25): R1 = 21.46 min. LC-MS (Methode 7): R^ = 2.19 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 1424 (25) [M +- H]+, 712 (100) [M +2 H]2+,
MS (ESIneg): m/z (%) = 1422 (22) [M - H]", 710 (100) [M -2 H]2".
HR-TOF-MS (Methode 1): C67Hi07Ni6Oi8 ber. 1423.7944, gef. 1423.7964 [M + H]+.
Beispiel 51A
(2Z)-2-{[(Benzyloxy)carbonyl]amino}-3-(6-trifluormethyl-pyridin-3-yl)-acrylsäure-methylester
6-Trifluormethylpyridin-3-carbaldehyd (4.85 g, 27.70 mmol) und Methyl- {[benzy loxycarbonyl]- amino}(dimethoxyphosphoryl)acetat (9.17 g, 27.70 mmol, 1.0 Äquivalente) werden in THF (70 ml) gelöst und auf -700C gekühlt. Bei -700C wird NN,N,N-Tetramethylguanidin (6.38 g, 55.39 mmol, 6.95 mL, 2.0 Äquivalente) langsam zugetropfit und dann wird 4 h bei -70°C, anschließend 12 h bei RT gerührt. Das Reaktionsgemisch wird eingeengt, mit Essigsäureethylester (zweimal 100 ml) gegen Wasser extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, über Νatriumsulfat getrocknet und filtriert. Nach dem Einengen wird das Rohprodukt chromatographiert (Kieselgel, Eluent: Toluol, dann Toluol:Essigsäureethylester 10:1). Es werden 6.93 g (66% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
HPLC/UV-Vis (Methode 22): Rt = 4.60 min. HPLC/UV-Vis (Methode 17): Rt = 4.54 min. LC-MS (Methode 29): R, = 2.44 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 381 (100) [M + H]+; MS (ESIneg.): m/z (%) = 379 (100) [M - H]".
1H NMR (400 MHz, J6-DMSO): δ = 3.74 (s, 3H), 5.10 (s, 2H), 7.27 (s, IH), 7.33-7.38 (m, 5H), 7.94 (d, J= 8.5 Hz, IH), 8.27 (d, J= 8.5 Hz, IH), 8.93 (s, IH), 9.51 (s, IH). HR-TOF-MS (Methode 1): C]8Hi6N2O4F3 [M + H]+ ber. 381.1062, gef. 381.1065.
Beispiel 52A
N-[(Benzyloxy)carbonyl]-3-(6-trifluormethyl-pyridin-3-yl)-L-alaπin-methylester
Beispielverbindung 51A (10.15 g, 26.69 mmol) wird in Methanol p.a. (100 ml) gelöst. Mit einer Kanüle wird etwa 5 min Argon hindurchgeleitet, dann wird (-f-)-l,2-Bis-[(2)S',5>S)diethylphospho- lano]benzen(cyclooctadien)rhodium(I) Triflat (289 mg, 400 μmol, 0.015 Äquivalente) zugegeben.
Es wird über 12 h bei 4 bar Wasserstoffdruck und RT hydriert. Dann wird es über Kieselgur filtriert (Methanol) und das Eluat eingeengt. Das Rohprodukt wird chromatographiert (Kieselgel,
Eluent: Toluol:Essigsäureethylester 5:1). Es werden 9.9 g (97% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
[Ot]20Na = -24° (c = 0.093 in Methanol).
HPLC/UV-Vis (Methode 22): R, = 4.5 min.
HPLC/UV-Vis (Methode 17): R4 = 4.49 min.
LC-MS (Methode 29): R, = 2.40 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 383 (100) [M + H]+;
MS (ESIneg.): m/z (%) = 273 (100), 381 (50) [M -H]".
1H NMR (400 MHz, J15-DMSO): δ = 2.99 (dd, J= 3.5 and 1 1.0 Hz5 IH), 3.22 (dd, J= 3.5 and
11.0 Hz, IH), 3.66 (s, 3H), 4.40 (m, IH), 4.97 (s, 2H), 7.23 (d, J = 5.5 Hz, IH), 7.29-7.33 (m, 3H),
7.83 (d, J= 6.5 Hz, IH), 7.93-7.98 (m, 2H), 8.65 (s, IH). HR-TOF-MS (Methode 1): C18H18N2O4F3 [M + H]+ ber. 383.1219, gef. 383.1223.
Beispiel 53A
3 -(6-Trifluormethy l-pyridin-3 -yl)-L-alanin-methylester
Die Beispielverbindung 52A (9.90 g, 25.89 mmol) wird in Methanol (100 ml) gelöst. Mit einer Kanüle wird etwa 5 min Argon hindurchgeleitet, dann wird Pd über C (10%, 990 mg) zugegebexi. Es wird über 12 h bei 4 bar Wasserstoffdruck und RT hydriert. Dann wird über Kieselgur filtriert, eingeengt und unter Hochvakuum getrocknet. Ausbeute: 5.8 g (90% d. Th.) der Titelverbindung.
[α]199Na = +3° (c = 0.186 in Methanol).
HPLC/UV-Vis (Methode 22): R, = 3.34 min. HPLC/UV-Vis (Methode 17): R1 = 3.22 min.
IR vmax (NaCl, cm"1) : 3415, 1734, 1339, 1136, 1087.
LC-MS (Methode 29): R4 = 1.74 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 249 (100) [IM + H]+.
1H NMR (500 MHz, U6-OUSO): δ = 2.85 (dd, J= 5.5 and 13.5 Hz, IH), 3.01 (dd, J= 5.5 aod 13.5 Hz, IH), 3.61 (s, 3H), 3.63-3.69 (m, IH), 7.82 (d, J= 7.5 Hz, IH), 7.93 (d, J= 7.5 Hz, IH),
8.61 (s, IH).
HR-TOF-MS (Methode 1): C12Hi5N3O2F3 [M + H]+ ber. 290.1116, gef. 290.1122.
Beispiel 54A
N-(terM3utoxycarbonyl)-3 -(t ert-buiy l)-D-alanyl-3 -(6-trifluormethy l-pyridin-3 -y l)-L-alanin- methylester
Zu einer Lösung von Beispielverbindung 53A (6.34 g, 25.54 mmol) und N-(tert-Butoxycarbonyl)- 3-tert-butyl-D-alanin (6.27 g, 25.54 mmol, 1.0 Äquivalente) in trockenem DMF (240 mL) werden bei -3O0C langsam ΝMM (12.92 g, 127.72 mmol, 14.04 ml, 5 Äquivalente) und HATU (9.71 g, 25.54 mmol, 1 Äquivalente) gegeben. Das Reaktionsgemisch erwärmt sich langsam (ca. 3 h) auf RT, wobei vollständiger Umsatz mittels HPLC (Methode 17) beobachtet wird. Kaliumdihydrogenphosphat (34.76 g, 255.44 mmol, 10 Äquivalente) wird zugegeben, und das Reaktionsgemisch wird 20 min gerührt, anschließend wird es filtriert, mit Essigsäureethylester ver¬ dünnt und mit ges. Νatriumhydrogencarbonat-Lsg (10 ml) gewaschen. Die organische Phase wird mittels Νatriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Das Rohprodukt wird mittels Flashchromatographie (Kieselgel, Eluent: Gradient Cycloh.exan:Essigsäureethylester 10:1 bis 2:1) aufgereinigt, wobei man 9.74 g (73% d. Th.) der Titelverbindung erhält.
[Ot]199 Na = +7.0° (c = 0.044 in Methanol).
HPLC/UV-Vis (Methode 22): Rt = 4.89 min. HPLC/UV-Vis (Methode 17): R4 = 4.75 min.
LC-MS (Methode 29): R4 = 2.67 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 476 (100), [M + H]+;
MS (ESIneg.): m/z (%) = 400 (80), 474 (40) [M - H]".
1H NMR (500 MHz, J0-DMSO): δ = 0.74 (s, 9H), 0.97-1.O0 (m, IH), 1.20-1.25 (m, IH), 1.35 (s, 9H), 2.99-3.05 (m, IH), 3.23-3.26 (m, IH), 3.66 (s, 3H), 3.94 (m, IH), 4.60 (m, IH), 6.82 (d, J=
8.5 Hz, IH), 7.78 (d, J= 8.0 Hz, IH)5 7.94 (d, J= 8.0 Hz* IH), 8.34 (d, J= 8.5 Hz, IH), 8.64 (s,
IH).
IR vmax (NaCl, cm"1) : 2959, 1742, 1655, 1520, 1336, 1160, 1136, 1087, 1050, 1027.
HR-TOF-MS (Methode 1): C22H33N3O5F3 [M + H]+ ber. 476.2372, gef. 476.2364.
Beispiel 55A
N2 /-(rer?-Butoxycarbonyl)-[3-terf-butyl-D-alanyl]-[3-(6-trifluormethylpyrid-3-yl)-L-alanyl]-[(3i?)- 3-amino-L-phenylalanyl)]-[(3i?)-3-hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreo- nyl-glycyl-[(35)-3-hydroxy-L-asparaginyl]-L-serin-Cy 'y-N5" J-lactam-trifluoracetat
Nach der Arbeitsvorschrift 5 werden das Cyclopeptid (Beispiel 26A, 175.0 mg, 0.14 mmol) und die Dipeptidsäure (Beispiel 54A, 113.8 mg, 0:25 μmol, 1.8 Äqivalente) unter Zuhilfenahme von NMM (75 μl, 0.69 mmol, 5 Äquivalente) und HATU (93.8 mg, 0.25 mmol, 1.8 Äquivalente) in DMF (15 ml) über Nacht zum Amid bei -100C umgesetzt. Die Titelverbindung wird nach Chromatographie (Methode 35) mit 190 mg (86% d.Th.) Ausbeute erhalten.
HPLC (Methode 25): Rt = 21.51 min. LC-MS (Methode 7): Rt = 2.27 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 1494 (33) [M + H]+, 747 (100) [M +2 H]2+, MS (ESIneg): m/z (%) = 1492 (10) [M - H]", 745 (100) [M -2 H]2~. HR-TOF-MS (Methode 1): C57H105N17Oi8F3 ber. 1492.7771, gef. 1492.7778 [M + H]+.
Beispiel 56A
Memyl-(2Z)-2-[(terf-butoxycarbonyl)amino]-3-cyclopentylacrylat
Methyl- {[ter^butoxycarbonyl]amino}(dimethoxyphosphoryl)acetat (39.2 g, 132.00 mmol) und Cyclopentancarbaldehyd (38.9 g, 396.00 mmol, 3 Äquivalente) werden in THF (320 ml) vorgelegt und NNNN-Tetramethylguanidin (24.8 ml, 22.81 g, 198.00 mmol, 1.5 Äquivalente) wird bei -7O0C zur Lösung gegeben. Unter Auftauen des Kältebades wird die Reaktion langsam auf RT gebracht. Innerhalb von 2 Tagen wird vollständiger Umsatz erreicht. Zur Aufarbeitung wird die Reaktion mit Essigsäureethylester (1600 ml) und Wasser (800 ml) versetzt und die abgetrennte organische Phase über Νatriumsulfat getrocknet. Das Trockenmittel wird durch Filtration separiert und das Filtrat am Rotationsverdampfer eingeengt. Aus dem Rückstand wird das Produkt durch Säulenchromatographie (Kieselgel 60: l kg, Eluent: Cyclohexan/Essigsäureethylester 4:1) mit 34.8 g (98% d.Th.) Ausbeute isoliert.
HPLC/UV-Vis (Methode 4): R, = 4.76 min. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ = 1.28-1.43 (m, 2H), 1.46 (s, 9H), 1.52-1.78 (m, 4H), 1.83-1.97 (m, 2H), 2.71 (m, IH), 3.78 (s, 3H), 5.79 (s, br., IH), 6.50 (d, J= 9.9 Hz, IH).
Beispiel 57A
Methyl-N-(?er^-butoxycarbonyl)-3-cyclopentyl-L-alaninat
Die Beispielverbindung 56A (13.0 g, 48.27 mmol) wird in Ethanol (220 ml) gelöst, die Lösung 10 min mit Argon durchspült und für 5 min ins Ultraschallbad gestellt. Nach der Zugabe von (+)- l,2-Bis-[(2S,55)diethylphospholano]benzen(cyclooctadien)rhodium(I) Triflat (100.0 mg, 0.13 mmol) wird nochmals 30 min mit Argon gespült, im Ultraschallbad 5 min entgast und anschließend für 3 Tage bei RT bei einem Wasserstoff-Druck von 3.5 bar hydriert. Zur Aufarbeitung wird der das Lösungsmittel vollständig am Rotationsverdampfer entfernt und über Kieselgel 60 (300 ml, Eluent: Cyclohexan/Essigsäureethylester 2/1) chromatographiert. Man erhält die Titelverbindung mit 12.9 g (94% d.Th.).
HPLC/UV-Vis (Methode 4): Rt = 4.88 min. DCI-MS (NH3): m/z = 289 (100) [M + NH4J+, 560 (15) [2M +NHJ+.
1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ = 1.00-1.25 (m, 2H), 1.45 (s, 9H), 1.48-1.95 (m, 9H), 3.72 (s, 3H), 4.28 (m, IH), 4.95 (d, J= 8.4 Hz, IH).
Beispiel 58A
MethyW-cyclopentyl-L-alaninate-hydrochlorid
Aus der N-geschützten Aminosäure (Beispiel 57A, 5.0 g, 18.43 mmol) wird nach der Arbeitsvor¬ schrift 2 die Titelverbindung mit 3.9 g Rohausbeute (quant.) erhalten.
LC-MS (Methode 30): R1 = 2.02 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 172 (100) [M + H]+. 1H NMR (300 MHz, d6) δ = 0.98-1.18 (m, 2H), 1.40-1.67 (m, 4H) 1.68-1.85 (m, 4H darin 1.82 (d, J= 6.6 Hz, 2H)), 1.92 (m, IH), 3.75 (s, 3H)5 3.90 (t, J= 8.4 Hz, IH), 8.63 (s, br., 3H).BeispieI 59A
Methyl-N-(fer?-butoxycarbonyl)-3-cyclopentyl-D-alaninat
Aus dem Acrylat (Beispiel 56A, 13.0 g, 48.27 mmol) und dem (+)-l,2-Bis-[(2i?,5R)diethyl- phospholano]benzen(cyclooctadien)rhodium(I) Triflat (lOO.O mg, 0.13 mmol) werden, wie in der Beispielvorschrift 57A beschrieben ist, 12.6 g (96% d.Th.) der Titelverbindung hergestellt.
MS (DCI, NH3): m/z (%) = 289 (100) [M + NH4J+, 560 (15) [2M + NHt]+.
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ = 1.00-1.21 (m, 2H), 1.45 (s, 9H), 1.48-1.93 (m, 9H), 3.73 (s, 3H), 4.28 (m, I H), 4.95 (m, IH).
Beispiel 6OA
N-(fert-Butoxycarbonyl)-3-cyclopentyl-D-alanin
Die Beispielverbindung 59A (5.0 g, 18.43 mmol) wird nach der Arbeitsvorschrift 4 innerhalb von 2 h zur iV"-geschützten Aminosäure umgesetzt. Man erhält 5.11 g (quant.) der Titelverbindung.
[Ot]20Na = +7° (c = 0.13 in CH2Cl2). HPLC/UV-Vis (Methode 2): R, = 2.33 min. LC-MS (Methode 7): Rt = 2.26 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 158 (100) [M -C4H8-CO2+ H]+; MS (ESIneg): m/z (%) = 256 (58) [M - H]". 1H NMR (300 MHz, Ci6-DMSO) δ = 1.05 (m, 2H), 1.38 (s, 9H), 1.42-1.78 (m, 8H), 1.83 (m, IH), 3.85 (m, IH), 7.04 (d, J = 8.2 Hz, IH), 12.27 (s, br., IH).
Beispiel 61A
Methyl-N-(fer?-butoxycarbonyl)-3-cyclopentyl-D-alanyl-3-cyclopentyl-L-alaninat
Das peptidische Amin (Beispiel 58A, 0.9 g, 4.27 mmol, 1.1 Äquivalente) wird in Dichlormethan (250 ml) unter Argon- Schutzgasatmosphäre vorgelegt, die Lösung auf -100C gekühlt und an¬ schließend nacheinander mit HOBt (2.1 g, 15.54 mmol, 4 Äquivalente), ΝMM (1.3 ml, 1.2 g, 11.67 mmol, 3 Äquivalente), der peptidischen Säure (Beispiel 6OA, 1.0 g, 3.89 mmol), EDC (1.5 g, 7.77 mmol, 2 Äquivalente) und nochmals mit ΝMM (0.8 ml, 0.8 g, 7.76 mmol, 2 Äquivalente) versetzt. Die Reaktion wird langsam im Kühlbad auf RT gebracht über Nacht vollständig umgesetzt. Zur Aufarbeitung wird der Reaktion Wasser zugegeben, am Rotationsverdampfer eingeengt (Wasserbad 350C), mit Essigsäureethylester und gesättigter Natriumhydrogencarbonat- Lösung versetzt und die abgetrennt wässrige Phase zweimal mit Essigsäureethylester extrahiert, die vereinigten organischen Phasen anschließend nacheinander mit gesättigter, wässriger 5%iger Zitronensäure-Lösung, gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung und gesättigter Natiumchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wird tiber Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Als Rohprodukt erhält 1.64 g (quant.) der Titelverbindung.
HPLC/UV-Vis (Methode 2): R. = 2.97 min.
LC-MS (Methode 7): R1 = 2.94 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 411 (100) [M + H]+, 311 (57) [M -C4H8-CO2+ H]+.
Beispiel 62A
N-(tert-Butoxycarbonyl)-3-cyclopentyl-D-alanyl-3-cyclopentyl-L-alanin
Das Dipeptid (Beispiel 61 A, 1.5 g, 3.65 mmol) wird nach der Arbeitsvorschrift 4 innerhalb von 1 h zur dipeptidischen Carbonsäure umgesetzt. Nach der Feinreinigung (Methode 13) des gefrierge¬ trockneten Rohproduktes wird die Titelverbindung mit 923.4 mg (64% d.Th.) iso liert.
HPLC/UV-Vis (Methode 2): Rt = 2.65 min. LC-MS (Methode 7): R, = 2.60 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 397 (100) [M + H]+, 297 (60) [M -C4H8-CO2+ H]+, 793 (46) [2M + H]+; MS (ESIneg): m/z (%) = 395 (57) [M - Hf, 791 (100) [2M - Hf. 1H NMR (4OO MHz, J6-DMSO) δ = 1.05 (m, 4H) 1.38 (s, 9H), 1.43 (m, 4H), 1.55 (m, 6H), 1.61-1.86 (m, 8H), 3.96 (m, IH), 4.16 (m, IH), 6.75 (d, J= 8.5 Hz, IH), 7.96 (d, J= 7.9 Hz, IH) 12.55 (s, br, IH). HR-TOF-MS (Methode 1): C2IH38N2O5 ber. 397.2702, gef. 397.2697 [M + H]+.
Beispiel 63A
N2 ;-(^er^-Butoxycarbonyl)-[3-cyclopentyl-D-alanyl]-[3-cyclopentyl-L-alanyl]-[(3i?)-3-amino-L- pheny lalany I)] - [(3R)-3 -hydroxy-L-leucyl] -L-leucy l-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreonyl-glycy 1- [(J^-S-hydroxy-L-asparaginyll-L-serin-C^^-N'^-lactam-trifluoracetat
Nach der Arbeitsvorschrift 5 werden das Cyclopeptid (Beispiel 26A, 30.0 mg, 23.49 μmol) und die Dipeptidsäure (Beispiel 62A, 16.8 mg, 42.28 μmol, 1.8 Äqivalente) unter Zuhilfenahme von NMM (13 μl, 117.43 μmol, 5 Äquivalente) und HATU (16.1 mg, 40.54 mmol, 1.8 Äquivalente) in DMF (2 ml) innerhalb von 2.5 h zum Amid bei -1O0C umgesetzt. Die Titelverbindung wird nach dem Chromatographieren (Methode 37) mit 26.6 mg (67% d.Th.) Ausbeute erhalten.
HPLC (Methode 2): Rt = 2.30 min. LC-MS (Methode 7): R, = 2.21 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 1428 (35) [M + H]+, 664 (100) [M +2 H]2+, MS (ESIneg): m/z (%) = 1426 (100) [M - HT".
HR-TOF-MS (Methode 1): C67H1nNi6O18 ber. 1427.8257, gef. 1427.8242 [M + H]+.
Beispiel 64A
N-[(Benzyloxy)carbonyl]-3-(terr-butyl)-D-alanyl-3-(pyridm-3-yl)-L-alanin-methylester-trifluor- acetat
3-Pyridin-3-yl-L-alanin (800 mg, 3.16 mmol) und N-(Benzyloxycarbonyl)-3-ferf-butyl-D-alanin (1.47 g, 3.16 mmol, 1 Äquivalent) werden bei 00C in DMF (12 ml) gelöst. Dann werden 4-Methyl- morpholin (1.74 ml, 15.8 mmol, 5 Äquivalente) und HATU (1.8 g, 4.74 mmol, 1.5 Äquivalente) zugegeben und über ca. 3 h bei RT gerührt. Man extrahiert mit Essigsäureethylester (zweimal) gegen konz. Νatriumhydrogencarbonat, wäscht die vereinigten organischen Phasen mit 1 M Zitronensäure und erneut mit konz. Νatriumhydrogencarbonat, trocknet über Νatriumsulfat, filtriert und engt im Vakuum ein. Nach chromatographischer Reinigung (Methode 39) erhält man 1.1 g (63% d.Th.) der Titelverbindung.
W199Na = +6° (c = 0.13 in Methanol).
HPLC (Methode 17): Rt = 3.92 min.
HPLC (Methode 23): Rt = 4.06 min.
LC-MS (Methode 7): R, = 2.03 min, MS (ESIpos.): m/z (%) = 442 (100) [M+H]+.
IR vmax (NaCl, cm"1): 3295, 2952, 2359, 1715, 1659, 1522, 1435, 1365, 1283, 1243, 1138, 1048,
1326.
HR-TOF-MS (Methode 1): C24H32N3O5 [M + H]+ ber. 442.2342, gef. 442.2342.
Beispiel 65A
N-(Benzyloxycarbonyl)-3-(ferr-butyl)-D-alanyl-3-(pyridin-3-yl)-L-alanin
Beispiel 64A (1.1 g, 1.98 mmol) und wird in THF- Wasser 3:1 (48 ml) aufgenommen und auf -2O0C gekühlt. Lithiumhydroxid (119 mg, 2.5 mmol, 4.95 Äquivalente) wird zugegeben und es wird bei RT 12 h gerührt. Die Reaktion wird durch Zusatz von Kaliumdihydrogenphosphat (1.35 g) gestoppt und im Vakuum eingeengt. Nach chromatographischer Reinigung (Methode 14) erhält man 0.57 g (67% d.Th.) der Titelverbindung als Feststoff.
M20Na = +44° (c = 0.15 in Methanol). HPLC (Methode 17): Rt = 3.73 min. HPLC (Methode 23): R1 = 3.88 min. LC-MS (Methode 7): Rt = 1.72 min, MS (ESIpos.): m/z (%) = 428 (100) [M+H]+.
IR vmax (NaCl, cm"1): 3290, 2956, 1659, 1613, 1537, 1414, 1251, 1205, 1184, 1136, 1050, 1028. HR-TOF-MS (Methode 1): C23H29N3O5 [M + H]+ ber. 428.2180, gef. 428.2169.
Beispiel 66A
Nz/-(Benzyloxycarbonyl)-[3-(tert-butyl)-D-alanyl]-[3-(pyridin-3-yl)-L-alanyl]-[(3i?)-3-amino-L- phenylalanyl)]-[(3i?)-3-hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreonyl-glycyl- [(3)S)-3-hydroxy-L-asparaginyl]-L-serin-C/ ;;-N3J-lactam-bistrifluoracetat
Nach der Arbeitsvorschrift 5 werden das Cyclopeptid (Beispiel 26A5 20.0 mg, 1 5.66 μmol) und die Dipeptidsäure (Beispiel 65 A, 12.0 mg, 28.19 μmol, 1.8 Äqivalente) unter Zuhilfenahme von NMM (9 μl, 78.3 μmol, 5 Äquivalente) und HATU (10.7 mg, 28.19 μmol, 1.8 Äquivalente) in DMF (6 ml) innerhalb von 2.5 h zum Amid bei -200C bis -100C umgesetzt. Nach Chromatographie (z.B. Methode 36) werden 16.5 mg (61% d.Th.) der Titelverbindung erhalten.
HPLC (Methode 25): R4 = 18.55 min. LC-MS (Methode 29): R4 = 1.73 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 1458 (20) [M + H]+, 730 (100) [M +2 H]2+, MS (ESIneg): m/z (%) = 1456 (27) [M - H]", 728 (100) [M -2 H]2". HR-TOF-MS (Methode 1): C69Hi04NnO18 ber. 1458.7740, gef. 1458.7739 [M +- H]+.
Beispiel 67A
Methyl 3 -(teτ-7-buty l)-L-alaninat-trifluoracetat
Methyl-N-(ter^butoxycarbonyl)-3-(te?t-butyl)-L-alanmat (16 g, 61.70 mmol) [J. A. Bajgrowicz, et al., Tetrahedron Lett, 1984, 2759-2762] wird mit Trifluoressigsäure/Dichlormethan 3:1 (220 ml) versetzt und 1.5 h bei RT gerührt. Es wird anschließend im Vakuum eingeengt und der Rückstand im HV getrocknet. Die Ausbeute ist quantitativ (16.5 g).
MS (DCI5 NH3): m/z = 160 (100) [M+H]+.
1HNMR (300 MHz5 J6-DMSO): δ = 0.92 (s, 9H), 1.59 (dd, J= 4.7, 14.5 Hz5 1 Η), 1.80 (dd, J= 7.6, 14.5 Hz, IH), 3.75 (s, 3H), 3.95 (dd, J= 4.7, 7.6 Hz5 IH), 8.5-8.3 (br. s, 3H).
Beispiel 68A
Methyl-N-(ter^butoxycarbonyl)-D-leucyl-3-(ter^butyl)-L-alaninat
Das peptidische Amin (Beispiel 77A, 4.0 g, 14.68 mmol, 1.1 Äquivalente) wird unter Argon- Schutzgasatmosphäre in Dichlormethan (365 ml) vorgelegt, die Lösung wird nacheinander mit HOBt (7.2 g, 53.23 mmol, 4 Äquivalente), NMM (4.3 ml, 39.92 mmol, 3 Äquivalente), N-(tert- Butoxycarbonyl)-.D-leucin (3.1 g, 13.31 mmol, 1 Äquivalent) [T. Kato, N. Izumiya, Bull. Chem. Soc. Jpn., 1966, 39, 2242-2249], EDC (5.1 g, 26.62 mmol, 2 Äquivalente) und mit weiteren NMM (3 ml, 26.61 mmol, 2 Äquivalente) bei -10°C versetzt und über wird Nacht unter Rühren zum vollständigen Umsatz gebracht. Zur Aufarbeitung wird die Reaktionslösung am Rotationsverdampfer bei 3O0C Badtemperatur eingeengt und anschließend mittels präparativer HPLC chromatographiert (z.B. Methode 35). Man erhält 5.5 g (80% d.Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 7): Rt = 2.72 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 373 (78) [M + H]+, 273 (100) [M -C4H8-CO2+ H]+.
Beispiel 69A
N-(fer^Butoxycarbonyl)-D-leucyl-3-(teτt-butyl)-L-alanin
Die Beispielverbindung 68A (400 mg, 1.07 mmol) wird nach der Arbeitsvorschrift 4 innerhalb von 1 h zur dipeptidischen Carbonsäure umgesetzt. Zur Aufarbeitung wird die Lösung mit Kalium- dihydrogenphosphat (219.2 mg, 1.61 mmol, 1.5 Äqivalente) versetzt, kalt am Rotationsverdampfer eingeengt und mittels präparativer HPLC (z.B. Methode 35) feingereinigt. Man erhält die Titelverbindung mit als Lyophilisat (282.0 mg, 65% d.Th.). (Analytische Daten siehe WO2004099239).
Beispiel 70A
N2' '-(tert-Butoxycarbony l)-D-leucy l-[3 -(tert-buty l)-L-alany 1] -[(3R)-3 -amino-L-pheny lalany I)] -
[(3i?)-3-hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreonyl-glycyl-[(3.S)-3-hydroxy-
L-asparaginyl]-L-serin-C/ ;;-N3 5-lactam-fluoracetat
Nach der Arbeitsvorschrift 5 werden das Cyclopeptid (Beispiel 26A, 30.0 mg, 23.49 μmol) und die Dipeptidsäure (Beispiel 69A, 15.2 mg, 42.28 μmol, 1.8 Äqivalente) unter Zuhilfenahme von NMM (13 μl, 117.45 μmol, 5 Äquivalente) und HATU (16.1 mg, 42.28 μmol, 1.8 Äquivalente) in DMF (10 ml) über Nacht zum Amid bei RT umgesetzt. Die Titelverbindung wird nach dem Chromato- graphieren (Methode 36) mit 34.0 mg (96% d.Th.) Ausbeute erhalten.
HPLC (Methode 2): Rt = 2.25 min. LC-MS (Methode 7): Rt = 2.18 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 1390 (77) [M + H]+, 645 (100) [M -C4H8-CO2+2 H]2"*, MS (ESIneg): m/z (%) = 1387 (73) [M - H]", 693 (100) [M -2 H]2". HR-TOF-MS (Methode 1): C64H109N16O18 ber. 1389.8101, gef. 1389.8101 [M -J- H]+.
Beispiel 71A und Beispiel 72A
(2S>N-(ter^Butoxycarbonyl)-3-(trimethylsilyl)-D-alanin (71A) und (2i?)-N-(tert-Butoxycart>onyl)- 3-(trimethylsilyl)-L-alanin (72A)
Die Synthese erfolgt nach M. Merget, et al., J. Organomet. Chem. 2001 628, 183-194. Die Trennung der Enantiomere erfolgt durch präparative HPLC an chiraler Phase (Methode 2S). Die Zuordnung der Isomere erfolgt durch HPLC-Vergleich mit einer authentischen Probe von h/-(tert- Butoxycarbonyl)-L-3-trimethylsilylalanin (2R Verbindung, Mercachem AMR 39.260)
Beispiel 7 IA, N-(fert-Butoxycarbonyl)-3-trimethylsilyl-D-alanin
Chirale HPLC (Methode 26): Rt = 4.16 min, e.e> 99 %.
[α]D 20 = +1.1 (c = 0.83, Methanol)
Beispiel 72A, N-(ferf-Butoxvcarbonvl)-3-trimethvlsilyl-L-alanin
Chirale HPLC (Methode 26): Rt = 9.27 min, e.e> 99 %
[α]D 20 = -1.6 (c = 0.66, Methanol)
Beispiel 73A
3-Trimethylsilyl-L-alanin-methylester-hydrochlorid
Die Verbindung aus Beispiel IIA. (300 mg) wird in Methanol (3 ml) gelöst und auf 00C abgekühlt. Trimethylsilylchlorid (590 mg, 4.7 Äquivalente) wird in 30 min. zugetropft und die Mischung über Nacht auf RT erwärmt. Die flüchtigen Komponenten werden am Rotavapor und anschließend im Hochvakuum entfernt. Man erhält die Zielverbindung (224 mg, 92% d. Th.).
1H NMR WrDMSO, 300 MHz): δ = 0.03 (s, 9H), 0.97-1.71 (m, 2H), 3.73 (s, 3H), 3.93 (dd, J = 5.3, 10.9 Hz, IH), 8.40 (br s, 3H).
Beispiel 74A
N-Benzyloxycarbonyl-3-trimethylsilyl-L-alanin-methylester
Die Verbindung aus Beispiel 73 A (2.0 g) wird in THF (40 ml) unter Argon bei 0°C vorgelegt. Tri- ethylamin (2.3 g, 2.4 Äquivalente) wird zugegeben und anschließend eine Lösung von JV-Benzyl- oxycarbonyloxysuccinimid (2.83 g, 1.2 Äquivalente) in THF (20 ml) zugetropft. Dann wird die Mischung über Nacht bei RT gerührt, zur Hälfte eingeengt, mit Essigsäureethylester verdünnt, zweimal mit Wasser und einmal mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und einrotiert. Der Rückstand wird über präparative HPLC (Methode 41) gereinigt. Man erhält die Zielverbindung (2.32 g, 79% d. Th.)
HPLC (Methode 18): Rt = 4.96 min.
MS (DCI, NH3): m/z = 327 [M-KNH4J+ (IOO), 310 (3) [M+H]+.
Beispiel 75A
(2i?)-N-Benzyloxycarbonyl-3-trϊmethylsilyl-L-alaninol
Zu einer Lösung von Beispiel 74A (2.32 g, 7.5 mmol) in THF (14 ml) werden Lithiumclilorid (0.64 g, 15 mmol) und Natriumborhydrid (0.57 g, 15 mmol) und dann Ethanol (22 ml) zugegeben. Die Mischung wird über Nacht bei RT gerührt. Zur Aufarbeitung wird unter Kühluαg mit Eiswasser und mit Zitronensäurelösvmg (10%ig in Wasser) auf pH 4 gestellt, dann mit 200 ml Wasser verdünnt und dreimal mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird über HPLC (Methode 41) getrennt und die geeigneten Fraktion im Vakuum eingeengt. Man erhält die Titelverbindung als Öl (1.24 g, 59% d. Th).
HPLC (Methode 4): R, = 4.48 min.
MS (DCI5 NH3): m/z
OOO), 282 (13) [M+H]+.
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ = 0.O3 (s, 9H), 0.58-0.84 (m, 2H), 2.13 (br.s, IH), 3.45 (br.rn, IH),
3.65 (br.m, IH), 3.83 (br.m, IH), 4.72 (br.m, IH), 5.08 (s, 2H), 7.33 (m, 5H).
Beispiel 76A
(2i?)-N-Benzyloxycarbonyl-3-trimethylsilyl-L-alaninal
Eine Lösung Pyridin-SO3-Komplex (2.04 g, 12.8 mmol) in wasserfreiem DMSO (12 ml) wird zu einer Lösung von Beispiel 75A (0.36 g, 1.28 mmol) und N,N-Diisopropylethylamin (1.65 g, 12.8 mmol) in 7 ml DMSO unter Argon bei 100C zugegeben. Das Kühlbad wird entfernt und die Mischung 20 min. nachgerührt. Es werden 400 ml Eiswasser zugegeben und die Lösung wird dreimal mit Diethylether extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden zweimal mit einer Zitronensäurelösung (10%ig in Wasser), einmal mit Wasser, einmal mit gesättigter Bicarbonatlösung und einmal mit gesättigter Νatriumchlorid-Lösung gewaschen, über
Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und einrotiert. Die Titelverbindung wird als Öl erhalten (0.39 g, 93% d. Th.) und direkt als Rohprodukt weiter eingesetzt.
MS (DCI, NH3): m/z = 297 [M+NHtf OOO), 280 (25) [M+H]+.
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ = 0.07 (s, 9H), 0.78 (dd, J = 9.4, 1 4.0 Hz, IH), 1.12 (dd, J = 5.8, -5 14.0 Hz, IH), 5.13 (s, 2H), 7.35 (m, 5H), 9.53 (s, IH).
Beispiel 77A
3-(te^Butyl)-L-alanin-methylester-trifluoracetat
Der (25)-N-fert-Butoxycarbonyl-3-^e?*t-butyl-L-alanin-methylester (529 mg, 2.04 mmol) wird in 0 TFA / Dichlormethan 1 :3 (3 ml) bei RT gerührt, die Lösung einrotiert und im Hochvakuum getrocknet. Man erhält 540 mg (97% d. Th.) Produkt.
1H NMR W5-DMSO, 300 MHz): δ = 0.92 (s, 9H), 1.59 (dd, J = 4.7, 14.4 Hz, IH), 1.80 (dd, J = 7.5, 14.4 Hz, IH), 3.76 (s, 3H), 3.95 (dd, J= 4.7, 7.5 Hz, IH), 8.33 (br.s, 3H).
Beispiel 78A
5 N-[(2i?)-2-Benzyloxycarbonylamino-3-trimethylsilyl-propyl]-3-(terf-butyl)-L-alaninmethylester- hydrotrifluoracetat
Unter Argon werden die Beispielverbindung 77A (4.33 g, 15.9 mmol), die Beispielverbindung 76A (7.2 g, 20.6 mmol) und Νatriumacetat (1.3 g, 15.9 mmol) in DMEF (140 ml) bei 00C vorgelegt.
Natriumcyanborohydrid (1.99 g, 31.7 mmol) wird zugegeben und die Mischung bei 00C 2 h gerührt. Zur Aufarbeitung wird die Mischung mit 1 1 Essigsäureethylester verdünnt und zweimal mit einer 5%-igen Lösung von Natriumbicarbonat gewaschen. Die wässrigen Phasen werden mit Essigsäureethylester reextrahiert. Die vereinigte organischen Phasen werden mit ges. Natrium- chlorid-Lösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Der Rück¬ stand wird durch präparative HPLC (Methode 39) gereinigt. Man erhält 6.02 g (71% d. Th.) der Titelverbindung als Kristalle.
HPLC (Methode 4): R, = 4.8 min. ESI-MS (pos.): m/z = 423 (100) [M+HT|+. 1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ = 0.03 (s, 9H), 0.76 (dd, J = 5.1, 14.7 Hz, IH), 0.94 (s, 9H), 0.95 (dd, J = 10.2, 14.7 Hz, IH), 1.95-1.80 (m, 2H), 2.93 (dd, J = 2.5, 12.5 Hz, IH), 3.35 (dd, J= 9. 8, 11.3 Hz, IH), 3.81 (s, 3H), 3.85 (dd, J = 4.5, 7.9 Hz, IH), 4.07-3.90 (m, IH), 5.05 (d, J= 11.5 Hz, IH), 5.16 (d, J= 11.5 Hz, IH), 5.63 (d, J= 0.9 Hz, IH), 7.33 (s, 5H).
Beispiel 79A
N-[(2i?)-2-Benzyloxycarbonylamino-3-trimethylsilyl-propyl]-3-(fert-butyl)-L-alanin-hydrochloricl
Die Beispielverbindung 78A (6.02 g, 1 1.2 mmol) wird in Methanol (225 ml) gelöst und bei RT mit einer 1 Ν Lithiumhydroxid-Lösung (101 ml) in Wasser (9 Äquivalente) versetzt. Die Reaktions¬ mischung wird bei RT über Nacht O^ h) gerührt, dann mit 1 N Salzsäure angesäuert und am Rotationsverdampfer von Methanol befreit. Die zurückbleibende Suspension wird mit 200 ml Wasser verdünnt und dreimal mit Essigsäureethylester extrahiert. Die vereinigte organischen Phasen werden über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Der Rückstand wird am Hochvakuum getrocknet. Man erhält 5.3 g (quantitativ) der Titelverbindung, die ohne Reiniguxig weiter umgesetzt wird.
HPLC (Methode 4): R1 = 4.6 min.
MS (ESIpos): m/z (%) = 409 (100) [M+Hf,
MS (ESIneg): m/z (%) = 407 (10) [M-H]".
1H-NMR W5-DMSO, 400 MHz): δ = 0.03 (s, 9H), 0.82 (m, 2H), 0.95 (s, 9H), 1.68 (br.d, J= 14.5, IH), 1.84 (dd, J = 9.0, 14.5, IH), 2.88 (m, IH), 3.10 (m, IH), 3.80-4.03 (m, 2H), 5.01 (d, J= 12, IH), 5.13 (d, J= 12, IH), 7.29 (d, J= 9.0, IH), 7.43-7.56 (m, 5H), 8.7-9.2 (br, 2H, NH2 +).
Beispiel 8OA
N2;-[(2i?)-2-(Benzyloxycarbonylamino)-3-(trimethylsilyl)-propyl]-[3-(tert-butyl)-L-alanyl]-[(3i?)- 3-amino-L-phenylalanyl)]-[(3i?)-3-hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreo- nyl-glycyl-[(35)-3-hydroxy-L-asparaginyl]-L-serin-C; ;o-N5J-lactam-bisfluoracetat
Nach der Arbeitsvorschrift 5 werden das Cyclopeptid (Beispiel 26A, 30.0 mg, 23.49 μmol) und di& Dipeptidsäure (Beispiel 69 A, 18.8 mg, 42.28 μmol, 1.8 Äqivalente) unter Zuhilfenahme von NMMI (13 μl, 117.45 μmol, 5 Äquivalente) und HATU (16.1 mg, 42.28 μmol, 1.8 Äquivalente) in DMF (15 ml) innerhalb von 2.5 h zum Amid bei -200C bis -100C umgesetzt. Die Titelverbindung wird, nach dem Chromatographieren (Methode 36) mit 34.0 mg (96% d.Th.) Ausbeute erhalten.
HPLC (Methode 25): R, = 19.59 min.
LC-MS (Methode 7): R, = 1.97 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 720 (100) [M + 2H]2+. HR-TOF-MS (Methode 1): C67HiIiN16O17 ber. 1439.8077, gef. 1439.8036 [M + H)+.
Beispiel 81A
(2S)-N-Benzyloxycarbonyl-3-ter?-butyl-L-alaninal
Die Verbindung wird analog zur Synthesesequenz von Beispiel 75A und Beispiel 76A aus Z-ß- ter/.-Butyl-alanin-methylester hergestellt.
MS (DCI, NH3): m/z = 281 [M+NH4]+(100); 264 (20) [M+H]+.
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): δ = 1.00 (s, 9H), 1.30 (dd, J = 8.3, 14.7 Hz, IH), 1.83 (dd, J = 3.8,
14.6 Hz, IH), 4.33 (dt, J= 3.8, 8.7 Hz, IH), 5.06 (m, IH), 5.12 (s, 2H), 7.36 (m, 5H), 9.58 (s, IH).
Beispiel 82A
N-[(25)-2-Benzyloxycarbonylamino-4,4-dimethylpentyl]-3-(ter?-butyl)-L-alaninmethylester- trifluoracetat
Die Verbindung wird analog zu Beispiel 78A aus Beispiel 81 A und Beispiel 77 A hergestellt. Ausbeute: 860 mg (36% d. Th.).
HPLC (Methode 4): R, = 4.7 min.
MS (ESI pos): m/z = 407 (100) [M+H]+.
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): δ = 0.91 (s, IH), 0.93 (s, 9H), 1.34 (br.d, J = 15, IH), 1.53 (dd, J =
8.7, 14.7, IH), 1.68-1.95 (m, 2H), 2.89 (dd, J = 3.5, 12 Hz, IH), 3.33 (dd, J = 10.5, 12 Hz, IH),
3.84 (m, IH), 3.80 (s, 3H), 3.99 (m, IH), 5.04 (d, J= 12 Hz, IH), 5.13 (d, J= 12 Hz, IH), 5.73 (br.d, J= 8.5 Hz, IH), 7.32 (m, 5H).
Beispiel 83A
N-[(2S)-2-Benzyloxycarbonylaπn.ino-4,4-dimethylpentyl]-3-^erf-butyl-L-alanin-trifluoracetat
Diese Verbindung wird analog zu Beispiel 79A aus Beispiel 83 A (1.10 g, 2.11 mmol) und 1 Ν Lithiumhydroxid-Lösung (19 ml) hergestellt. Ausbeute: 895 mg (83% d. Th.).
HPLC (Methode 4): Rt= 4.47 min.
MS (ESIpos.): m/z (%) = 393 ( 100) [M+H]+; MS (ESIneg.): m/z (%) = 391 (<4) [M-H]".
1H NMR WrDMSO, 300 MHz): δ = 0.89 (s, 9H), 0.93 (s, 9H), 1.30-1.45 (m, 2H), 1.64 (dd, J = 2,
14 Hz, IH), 1.81 (dd, J = 9.7, 14 Hz, IH), 2.88 (m, IH), 2.98 (m, IH), 3.85-3.99 (m, 2H), 4.99 (d,
J= 12.7 Hz, IH), 5.12 (d, J= 12.7 Hz, IH), 7.07 (d, J= 9.0 Hz, IH), 7.27-7.40 (m, 5H).
13C NMR (126 MHz, ^6-DMSO): δ = 29.00 (3C), 29.38 (3C), 29.96 (2C), 42.22, 45.10, 45.64, 50.52, 56,97, 65,39, 127.56 (2C), 127.73, 128.23 (2C), 136.83, 155.47, 171.47.
HR-TOF-MS (Methode 1): C22H37N2O4 [M + H]+ gef. 393.2753, ber. 393.2748
Beispiel 84A
N2 /-[(26)-2-(Benzyloxycarbonylamino)-3-(terr-butyl)propyl]-[3-(fert-butyl)-L-alanyl]-[(3i?)- 3-amino-L-phenylalanyl)]-[(3i^)-3-hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreo- nyl-glycyl-[(3S)-3-hydroxy-L-a.sparaginyl]-L-serin-Cλyo-NJ'2-lactam-bistrifluoracetat
Nach der Arbeitsvorschrift 5 werden das Cyclopeptid (Beispiel 26A, 170.0 mg, 0.13 mmol), die Dipeptidsäure (Beispiel 83A, 121.4 mg, 0.24 mmol, 1.8 Äqivalente), NMM (73 μl, 0.67 μmol, 5 Äquivalente) und HATU (91.1 mg, 42.28 μmol, 1 .8 Äquivalente) in DMF (6 ml) innerhalb von 2.5 h zum Amid bei -2O0C bis — 100C umgesetzt. Die Titelverbindung wird chromatographiert (z.B. Methode 35), wobei man 34.0 mg (96% d.Th.) der Titelverbindung erhält.
HPLC (Methode 2): Rt = 2.08 min.
LC-MS (Methode 7): R1 = 1.9 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 712.7 (100) [M + 2H]2+, 1424 (5) [M + H]+; MS (ESIneg.): m/z (%) - 1422.7 (100) [ML - H]". HR-TOF-MS (Methode 1): C68H1nNi6O17 [M + H]+ gef. 1423.8318, ber. 1423.8313. Beispiel 85A
N2 y-[(2i?)-2-(Benzyloxycarbonylamino)-3-(^r/-buτyl)propyl]-[3-(ferr-butyl)-L-alanyl]-[(3/?)-
3-amino-L-phenylalanyl)]-[(3i?)-3-hydroxy-L-leucyll-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreo- nyl-glycyl-[(3S)-3-hydroxy-L-asparaginyl]-L-serin-Cλ/(>-N3'2-lactam-bisfluoracetat
Gemäß der Arbeitsvorschrift 5 werden das Cyclopeptid (Beispiel 26A, 42.0 mg, 32.88 μmol), N- ((2R)-2- { [(Benzy loxy)carbony 1] amino } -4,4-dimethylpentyl)-3 -{tert-bxity l)-L-alanintrifluoracetat (29.98 mg, 59.18 μmol, 1.8 Äqivalente), ΝMM (18 μl, 164.40 μmol, 5 Äquivalente) und HATU (22.5 mg, 59.18 μmol, 1.8 Äquivalente) in DMF (15 ml) innerhalb von 2.5 h zum Amid bei -200C bis -1O0C umgesetzt. Die Titelverbindung wird nach einer Chromatographie (Methode 10) erhalten (37.5 mg, 69% d.Th.).
Die dipeptidische Säure, N-((2R)-2-{[(Benzyloxy)carbonyl]amino }-4,4-dimethylpentyl)-3-(tert- butyl)-L-alanin-hydrotrifluoracetat, kann analog der Sequenz Beispiel 82A aus der Verbin¬ dung 77 A und N-Benzyloxycarbonyl-3-(te?t-butyl)-D-alanmal und anschließender Verseifung (Siehe Beispiel 83A) dargestellt werden.
HPLC (Methode 2): Rt = 2.13 min. LC-MS (Methode 7): Rt = 1.98 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 712 (100) [M + 2H]2+, MS (ESIneg.): m/z (%) = 1422 (100) [M - H]", 710 (40) [M - 2H]2~.
HR-TOF-MS (Methode 1): C68HmNi6O17 [M + H]+ gef. 1423.8282, ber. 1423.8308.
Beispiel 86A
Methyl-N-(fer?-butoxycarbonyl)-3-(pyridin-3-yl)-L-alaninat
EP2005/011451
- 121 -
(2S)-N-(fer^Butoxycarbonyl)-3-(pyridin-3-yl)alanin (25.00 g, 93.88 mmol) wird unter Argon in 300 ml Dichlormethan gelöst. Methanol (11.4 ml, 9.02 g, 281 mmol, 3 Äquivalente) und ein Körnchen DMAP werden hinzugefugt. Dann wird die Mischung auf 00C gekühlt. EDC (19.80 g, 103 mmol, 1.1 Äquivalente) wird zugesetzt. Nach 5 min. entfernt man das Eisbad und lässt über 1 h bei RT rühren. Dann engt man im Vakuum ein, versetzt den Rückstand mit Essigsäureethylester und schüttelt gegen gesättigte Natriumhydrogencarbonatlösung aus. Die wässrige Phase wird einmal mit Essigsäureethylester nachextrahiert, dann werden die vereinigten organischen Phasen mit 0.5 M Zitronensäure und anschließend nochmals mit gesättigter Natriumhydrogen- carbonatlösung gewaschen. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Es verbleibt ein Öl, das beim Trocknen im Ölpumpenvakuum kristallisiert. Ausbeute: 23.60 g (90% d. Th.).
HPLC/UV-Vis (Methode 17): R1 = 3.28 min.
LC-MS (Methode 7): R,= 1.21 min, MS (ESIpos.): m/z (%) = 281 (100) [M + H]+. 1H NMR (400 MHz, J0-DMSO) S = 1.30 (s, 9H), 2.86 (m, IH), 3.04 (m, IH), 3.63 (s, 3H), 4.22 (m, IH), 7.28-7.39 (m, 2H), 7.69 (d, IH), 8.43 (m, 2H).
Beispiel 87A
3 -(Pyr idin-3 -y l)-L-alanin-methy 1 ester-bistr ifluoracetat
Die Verbindung aus Beispiel 86A (11.8 g, 42.09 mmol) wird in Trifluoressigsäure in Dichlormethan (160 ml; 30%ige Lösung) gelöst und 30 min. bei RT gerührt. Dann engt man im
Vakuum ein. Der Rückstand wird in etwas Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Dann wird das Lyophilisat mit Toluol versetzt und im Vakuum eingeengt. Schließlich wird bis zur Gewichtskonstanz im Ölpumpenvakuum getrocknet. Ausbeute: 17.15 g (quant).
HPLC/UV-Vis (Methode 23): R, = 0.88 min. LC-MS (Methode 7): R, = 0.46 min,
MS (ESIpos.): m/z (%) = 181 (100) [M + H]+.
1H NMR (400 MHz, ^DMSO) δ = 2.79 (dd, IH), 2.92 (dd, IH), 3.60 (s, 3H), 3.63 (m, IH), 7.30
(m, IH), 7.62 (d, IH), 8.41 (m, 2H).
Beispiel 88A
Methyl-N-(terM3utoxycarbonyl)-3-(trimethylsilyl)-D-alanyl-3— (pyridin-3-yl)-L-alaninat
Die Verbindung aus Beispiel 87A (10.31 g, 39.4 mmol) und die Verbindung aus Beispiel 71 A (16.10 g, 39.4 mmol, 1 Äquivalent) werden bei O0C in DMF (186 ml) gelöst. Dann werden NMM (17.34 mL, 16.00 g, 4 Äquivalente) und HATU (22.49 g, 59. 16 mmol, 1.5 Äquivalente) zugesetzt. Der Ansatz wird zwei Stunden bei RT gerührt. Man versetzt mit tert-Butylmethylether und wäscht mit gesättigter Natriumcarbonatlösung. Die wässrige Phase wird einmal mit tert-Butylmethylether nachextrahiert, dann werden die vereinigten organischen Phasen mit 1 M wässriger Zitronensäure sowie abermals mit gesättigter Natriumcarbonatlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Es wird über Kieselgel filtriert (Cyclohexan/Essigsäure- ethylester 2:1). Ausbeute: 14.1 g (84% d. Th.).
HPLC/UV-Vis (Methode 17): R, = 3.91 min. LC-MS (Methode 7): Rt = 1.90 min, MS (ESIpos.): m/z (%) = 424 (100) [M + H]+.
1H NMR (400 MHz, efe-DMSO) δ = -0.09 (s, 9H), 0.56 - 0.75 (m, 2H), 1.47 (s, 9H), 2.90 (dd, IH), 3.09 (dd, IH), 3.62 (s, 3H), 3.98 (m, IH), 4.49 (m, IH), 6.6S (d, IH), 7.26 (dd, IH), 7.61 (m, IH), 8.20 (d, IH), 8.40 (m, 2H).
Beispiel 89A
N-(fer?-Butoxycarbonyl)-3-(trimethylsilyl)-D-alanyl-3-(pyridin-3-yl)-L- alanin
Die Verbindung aus Beispiel 88A (7.4 g, 17.56 mmol) wird in THF-"Wasser (6:4) aufgenommen, auf O0C gekühlt und mit Lithiumhydroxid-Monohydrat (1.47 g, 35.13 mmol, 2 Äquivalente) versetzt. Man lässt bei O0C rühren. Nach einer Stunde wird ein weiteres Äquivalent (0.74 g)
Lithiumhydroxid-Monohydrat zugesetzt und eine weitere Stunde gerührt. Man destilliert den
Großteil des THF im Vakuum ab, wäscht mit zwei Portionen MTBE und stellt dann die wässrige
Phase durch Zusatz von Zitronensäure auf pH 4. Ein Feststoff fällt aus. Es wird mit drei Portionen Essigsäureethylester extrahiert, wobei sich der Feststoff löst. Die vereinigten organischen Phasen werden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Das Rohprodukt wird durch
Gelchromatographie (Methode 3, Fließmittel: Methanol) gereinigt. Ausbeute: 6.67 g (93% d. Th.).
HPLC/UV-Vis (Methode 17): R1 = 3.73 min. LC-MS (Methode 7): R, = 1.68 min, MS (ESIpos.): m/z (%) = 410 (40) [M + H]+.
1H NMR (300 MHz, J0-DMSO) δ = -0.090 (s, 9H), 0.56 - 0.75 (m, 2H), 1.35 (s, 9H), 2.90 (dd, IH), 3.09 (dd, IH), 3.98 (m, IH), 4.41 (m, IH), 6.70 (d, IH), 7.26 (dd, IH), 7.60 (m, IH), 8.00 (d, IH), 8.37 (m, 2H).
Beispiel 9OA
N-(tot-Benzyloxycarbonyl)-3-(trimethylsilyl)-D-alanyl-3-pyridin-3-yl-L-alanin
Die Verbindung aus Beispiel 89A (500 mg, 1.22 mmol) wird in 30% TFA in Dichlormethan (20 ml) gelöst und 30 min bei RT gerührt. Dann wird eingeengt, der Rückstand in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Das Lyophilisat (600 mg Feststoff) wird unter Argon in THF (25 ml) vorgelegt, bei 00C werden dann N-(Benzyloxycarbonyloxy)-succinimid (320 mg, 1.28 mmol, 1.15 Äquivalente) und schließlich 4-Methylmorpholin (150 μl, 1.34 mmol, 1.2 Äquivalente) zugesetzt. Man lässt auf RT erwärmen und über Nacht weiterrühren Die Reaktion wird durch Zusatz von Eisessig abgestoppt und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand, wird in Essigsäureethylester aufgenommen und zweimal gegen 0.5 M Zitronensäure ausgeschüttelt. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird chromatographisch gereinigt (Methode 34). Ausbeute: 395 mg (0.71 mmol, 58% d. Th.).
HPLC (Methode 17): R4 = 3.79 min.
LC-MS (Methode 7): R1 = 1.84 min, MS (ESIpos.): m/z C%) = 444.1 (100) [M+H]+. 1H NMR (400 MHz5 ^5-DMSO) δ = -0.07 (s, 9H), 0.60-O.75 (m, 2H), 2.97-3.03 (m, IH), 3.28 (m, IH), 3.88 (m, IH), 4.54 (m, IH), 4.98 (d, J= 12.7, IH), 4.98 (d, J = 12.7, IH), 5.07 (d, J = 12.7, IH) 7.27-7.35 (m, 6H), 7.65 (m, IH), 8.08 (d, J= 7.04, IH), 8.19 (d, J= 8.8, IH), 8.62 (s, 2H).
Beispiel 91A
N2 /-(Benzyloxycarbonyl)-[3-(trimethylsilyl)-D-alanyl]-[3-(pyrid-3-yl)-L-alanyl]-[(3R)-3-amino-L- phenylalanyl)]-[(3i?)-3-hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreonyl-glycyl- [(i^-S-hydroxy-L-asparaginylJ-L-serin-C^ ^-N'^-lactaπi-bistrifluoracetat
Zu einer Lösung des Cyclopeptids (Beispiel 26A., 1.0 Äquivalente, 18.6 mg, 15 μmol), der Dipep- tidsäure (Beispiel 9OA, 1.5 Äquivalente, 9.7 mg, 22 μmol) und NMM (1.0 Äquivalente, 15 μmol) in trockenem DMF (200 μl) wird bei -2O0C unter Argon-Schutzgasatmosphäre zunächst HATU (1.6 Äquivalente, 8.9 mg, 23 μmol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wird gerührt (ca. 15 min) und erneut mit NMM (2.5 Äquivalente, 38 μmol) versetzt. Das Reaktionsgemisch erwärmt sich langsam (ca. 12 h) auf RT und zeigt dann vollständigen Umsatz der Amin-Komponente (HPLC-
Kontrolle, Methode 2). Das Reaktionsgemisch wird mit festem Kaliumdihydrogenphosphat (10
Äquivalente, 500 μmol) versetzt und dann im Vakuum eingedampft und chromatographisch aufge- reinigt (Methode 21). Man erhält 15.8 mg (63% d. Th.) Produkt.
HPLC/UV-Vis (Methode 2): Rt = 1.9 min, X1113x (qualitativ) = 210 nm (s), 255-270 (m).
LC-MS (Methode 7): Rt = 2.0 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 738 (100) [M - Boc + 2H]2+, 1475 (15) [M + H]+;
MS (ESIneg.): m/z (%) = 682 (100), 736 (80) [ME - 2H]2", 1473 (60) [M - H]".
Beispiel 92A
3-?e^-Butyl-D-alanyl-3-ter?-butyl-L-alanin-hydrochlorid
Λ/-(ter/-Butoxycarbonyl)-3-ter^butyl-D-alanyl-3-fert-butyl-L-alanin (4.5 g, 12.1 mmol, Beispiel 1 OA) wird in Dioxan (3 ml) vorgelöst. Bei RT wir eine 4 N Lösung von Chlorwasserstoff in Dioxan (30.2 mmol, 120 mmol, 10 Äquivalente) zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird für 30 min gerührt, im Vakuum eingedampft und im Hochvakuum getrocknet. Man erhält die Titelver- bindung als Feststoff (3.5 g, 99% d. Th.).
LC-MS (Methode 7): R4 = 1.52 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 273.6 (100) [M + H]+;
MS (ESIneg): m/z (%) = 271.5 (100) [M - H]". 1H NMR (500 MHz, J6-DMSO): δ = 0.85 (s, 9H), 0.86 (s, 9H), 1.49 (dd, J = 14.3, 1.6 Hz, IH),
1.50 (d, J = 13.8 Hz, IH), 1.64 (dd, J= 14.3, 4.0 Hz, IH), 1.71 (dd, J= 14.3, 6.9 Hz, IH), 3.77
(„t", J= 6.5 Hz, IH), 4.14 (m, IH), 8.27 (s, br, 3H), 8.94 (d, J= 8.2 Hz, IH), 12.58 (s, br, IH).
13C NMR (126 MHz, ^6-DMSO): δ = 28.41 (3C), 29.50 (3C), 30.08, 30.38, 44.46, 44.80, 50.03,
50.30, 169.10, 173.98. HR-TOF-MS (Methode 1): C14H29N2O3 ber. 273.2173, gef. 273.2167 [M + H]+.
Beispiel 93A
7V-(Benzy loxycarbony l)-3 -tert-buty 1-D-alany 1-3 -tert-butyl-L-alanin
- 12.7 -
3-tert-Butyl-D-alanyl-3-tert-butyl-L-alanin (3.73 g, 12.1 mmol, Beispiel 92A) wird unter Argon¬ schutzgasatmosphäre in THF (170 ml) gelöst. Nach Zugabe von Wasser (170 ml), Benzyloxy- carbonyloxysuccinimidester (4.52 g, 18.1 mmol, 1 .5 Äquivalente) und N-Methylmorpholin (4.28 g, 4.23 mmol, 3.5 Äquivalente) bei O0C wird bei R-T kräftig gerührt, bis alles Edukt umgesetzt ist (mehrere Stunden, BDPLC Kontrolle, Methode 2). Der Ansatz wird mit Eisessig gequecht. Im Vakuum das TBDF abgezogen. Die zurückbleibende wässrige Phase wird mit Essigsäureethylester überschichtet mit 4 Ν Salzsäure auf pH < 3 angesäuert und dann mehrfach mit Essigsäureethylester extrahiert. Die organischen Phasen werden mit Brine gewaschen über Νatriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Der erhaltene Schaum wird mit Acetonitril verrührt, wobei sich ein Feststoff bildet, der abfiltriert wird, dann mit wenig Acetonitril gewaschen wird. Dieser Prozeß kann mit dem Fitrat - nachdem es eingeengt wurde - noch mehrfach wiederholt werden. Die vereinigten Festoffe werden am Hochvakuum getrocknet, wobei man die Titelverbindung als Feststoff erhält. Die zurückgebliebene Mutterlauge wird eingeengt und mittels präparativer HPLC (Methode 10) aufgereinigt. Man erhält die Titelverbindung (vereinigte Feststoffe und Reinigungsprodukt aus HPLC Trennung) als Feststoff (3.49 g, 71% d. Th.).
HPLC/UV-Vis (Methode 2) : Rt = 2.6 min.
LC-MS (Methode 8): R, = 2.46 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 363 (60), 407 (100) [M + H]+. MS (ESIneg): m/z (%) = 297 (100), 405.5 (40) [M - H]".
1H NMR (500 MHz, ^6-DMSO): δ = 0.81 (s, 9H), 0.83 (s, 9H), 1.40-1.44 (m, 2H), 1.49 (dd, J= 14.3, 9.7 Hz, IH), 1.58 (dd, J= 13.5, 1.4 Hz, IH), 4.07 (m, IH), 4.13 (m, IH), 4.94 (d, J= 12.3 Hz, IH), 4.99 (d, J= 12.5 Hz, IH), 7.25-7.32 (m, 5H), 7.92 (d, J= 8.5 Hz, IH). 13C NMR (126 MHz, ^6-DMSO): δ = 29.49 (3C), 29.75 (3C), 30.41, 30.46, 44.52, 45.11, 49.55, 52.73, 65.49, 127.70 (2C), 127.91, 128.48 (2C), 137.31, 155.59, 172.52, 174.50. HR-TOF-MS (Methode 1): C22H34N2O5 ber. 407.2541, gef. 407.2531 [M + H]+.
Beispiel 94A
N2-(Benzyloxycarbonyl-[3-fer?-butyl-D-alanyl]-3-tert-butyl-L-alanyl)-[(3i?)-3-^er?-butylammo-L- phenylalanin]-methylester
Zu einer Lösung des racemischen Aminosäuremethylesters (1.0 Äquivalente, 4.16 g, 10.19 mmol, Beispiel 14) in Dichlormethan p.a. (100 ml) werden bei -300C nacheinander HOBt (4 Äquivalente, 5.51 g, 40.77 mmol), N-Methylmorpholin (4 Äquivalente, 4O.77 mmol), das N-Benzyloxycarbonyl- Dipeptid (N-(Benzyloxycarbonyl)-3-ferf-butyl-D-alanyl-3-fcrt-butyl-L-alanin, 1.1 Äquivalente, 4.56 g, 11.21 mmol, Beispiel 93A) und EDC (2 Äquivaleote, 3.91 g, 20.38 mmol) gegeben. Das Reaktionsgemisch erwärmt sich langsam (ca. 12 h) auf RT, wobei vollständiger Umsatz der Amin- Komponente mittels HPLC beobachtet wird (Methode 2). Das Reaktionsgemisch wird mit Kalium- dihydrogenphosphat (5.0 Äquivalente, 6.93 g, 50.96 mmol) gequencht, im Vakuum eingeengt, in Essigsäureethylester (ca. 400 ml) aufgenommen und anschließend mit 5%iger wässriger Zitronen¬ säure (zweimal), destilliertem Wasser und gesättigter Νatriumchlorid-Lösung gewaschen. Man trocknet über Νatriumsulfat und filtriert. Das Rohprodukt wird anschließend über Kieselgel filtriert. Im Vakuum wird die Lösung bis zur Trockαe eingedampft und anschließend im Hochvakuum nachgetrocknet. Man erhält 5.36 g (77% d. Th.) der Titelverbindung als Diastereomerengemisch mit relativer (2.S'*,3i?*)-Stereochemie am Aminophenylalanin. Die Diastereomere werden in einem weiteren Chromatographieschritt voneinander getrennt (Methode 42). Man erhält 2.87 g (41% d. Th.) der Titelverbindung (de >99%, Methode 28). Diese Reaktion kann analog auch mit dem enantiomerenreinen Aminosäuremethylester durchgeführt werden. Man erhält direkt diastereomerenreines Produkt.
HPLC/UV-Vis (Methode 3) : R, = 3.1 min. HPLC/UV-Vis (Methode 28): R, = 4.84 min.
LC-MS (Methode 8): R1 = 2.7 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 583.5 (100) [M + H - CO2 -C4Hs]+, 683.5 (60) [M + H]+; MS (ESIneg.): m/z (%) = 681.6 (10) [M - H]", 727.6 (100) [M - H + HCO2Hr. LC-MS (Methode 7): R4 = 3.1 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 583.5 (100) [M + H - CO2 -C4Hg]+, 683.5 (40) [M + H]+; MS (ESIneg.): m/z (%) = 573 (100), 681.6 (5) [M - H]"; 727-6 (40) [M - H + HCO2H]-
Beispiel 95A
N2-(Benzyloxycarbonyl-[3-/erf-butyl-D-alanyl]-3-/er/-butyl-C-alanyl)-[(3i?)-3-^e/-f-butylamino-L- Phenylalanin]
Unter Argonschutzgasatmosphäre wird eine Lösung des Tripeptid-Methylesters (Beispiel 94A, 1.0O g5 1.46 mmol) in THF/Wasser 2:1 (300 ml) vorgelegt. Bei 00C wird unter starkem Rühren eine entgaste 5%ige wässrige Lösung von Lithiumhydroxid (59.6 mg, 2.5 mmol, 1.7 Äquivalente) langsam zugetropft. Man rührt bei 00C so lange nach, bis das HPLC-Chromatogramm (Methode 2) vollständigen Umsatz anzeigt (ca. 6 h). Bei zu langer Reaktionszeit besteht Epimerisierungsgefahr. Anschließend versetzt man mit Essigsäure (0.4 ml), konzentriert das Reaktionsgemisch im Vakuum auf und überschichtet mit Essigsäureethylester (1OO ml). Die wässrige Phase wird nun mit 5%iger Zitronensäure angesäuert (pH 2-3) und dann mit Essigsäureethylester (50 ml, dreimal) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit gesättigter wässriger Natriumchlorid- lösung (20 ml, zweimal) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert, im Vakuum eingeengt
und im Hochvakuum getrocknet. Das Rohprodukt wird mittels präparative HPLC (Methode 38) feingereinigt. Man erhält 682 mg (56% d. Th.) der Titelverbindung.
HPLC/UV-Vis (Methode 2): Rj = 2.9 min. HPLC/UV-Vis (Methode 25): R, = 24.6 min. LC-MS (Methode 7): R1 = 2.9 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 569.2 (100), 669.3 (50) [M + H]+, 1337.4 (40);
MS (ESIneg.): m/z (%) = 667.2 (100) [M - Hf, 1335.4 (80).
HR-TOF-MS (Methode 1): C36H53N4O8 [M + H]+ gef. 669.3881, ber. 669.3858.
Beispiel 96A
N2-(Benzyloxycarbonyl-[3-?er^-butyl-D-alanyl]-3-tert-butyl-L-alanyl)-[(3i?)-3-/er?-butylamino-L- phenylalanin]-[2-(trimethylsilyl)ethyl)]ester
Eine Mischung von der Tripeptidsäure (Beispiel 96A, 733 mg, 1.10 mmol), 2-(Trimethylsilyl)- ethanol 1.30 g, 11.0 mmol, 10 Äquivalente) und IMolsieb 4 A (ca. 100 mg) in trockenem Dichlor- methan p.a. (6.5 ml) wird für 30 min bei RT unter Argonschutzgasatmosphäre gerührt. An¬ schließend werden bei -3O0C DCC (452 mg, 2.20 mmol, 2 Äquivalente) und DMAP (134 mg, 1.10 mmol, 1 Äquivalent) zugegeben. Man lässt das Reaktionsgemisch auftauen (ca. 12 h) und rührt bei RT so lange nach, bis das HPLC-Chromatogramm (Methode 2) vollständigen Umsatz anzeigt (ca. 12 h). Das Reaktionsgemisch wird mit Eisessig (125 μl) gequencht, dann bei RT im
Vakuum eingedampft, in wenig Dichlormethan (6.5 ml) suspendiert, über einer ec RP18-HPLC Kartusche (Fa. Macherey Nagel) filtriert, erneut eingeengt und dann mittels präparativer HPLC (Methode 35) feingereinigt. Man erhält 706 mg (84% d. Th.) der Titelverbindung.
HPLC/UV-Vis (Methode 2): R, = 3.4 min. LC-MS (Methode 7): R1 = 3.4 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 669.5 (80), 769.6 (100) [M + 2H]2+, 1556 (30). HR-TOF-MS (Methode 1): C4IH65N4O8Si [M + H]+ gef. 769.4548, "ber. 769.4567.
Beispiel 97A
N2-(Benzyloxycarbonyl-[3-?ert-butyl-D-alanyl]-3-^erϊ-butyl-L-alanyl)-(3JR)-3-amino-L- phenylalanin-[2-(trimethylsilyl)ethyl)]ester-trifluoracetat
Das N-(te?t-Butoxycarbonyl)-geschützte Tripeptid (720 mg, 0.94 mmol, Beispiel 96A) wird unter Argon-Schutzgasatmosphäre vorgelegt. Bei RT und unter starkem Rühren wird 4 Ν Salzsäure in Dioxan (40 ml) zugetropft. Man rührt, bis die analytische HPLC (Methode 2) vollständigen Um- satz anzeigt (ca. 30 min). Das Reaktionsgemisch wird bei RT im Vakuum eingedampft. Das Roh¬ produkt wird mittels präparativer HPLC (Methode 10) gereinigt und lyophilisiert. Man erhält die Titelverbindung als Lyophilisat (394 mg, 54% d. Th.).
HPLC/UV-Vis (Methode 25): R, = 25.2 min.
HPLC/UV-Vis (Methode 2): R, = 2.4 min. LC-MS (Methode 8): R4 = 2.3 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 669.6 (100) [M + H]+; MS (ESIneg.): m/z (%) = 703.6 (100) [M - H + HCO2H]". LC-MS (Methode 7): R1 = 2.6 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 669.4 (100) [M + H]+.
Beispiel 98A
N2-(Benzy loxycarbony l-[3 -t ert-buty 1-D-alanyl] -3 -tert-buty l-L-alanyfJ-N3- { fert-butoxycarfeony 1- [(3i?)-3-hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreonyl-glycyl-[(35)-3— hydroxy- L-asparaginyl]-L-seryl}-(3i?)-3-amino-L-phenylalanin-[2-(trimethylsilyl)ethyl)]ester-trifluoracetat
Zu einer Lösung des Boc-Octapeptids (Beispiel 2OA, 1.0 Äquivalente, 114.4 mg, 0.10 mmol), des Tripeptids (Beispiel 97A, 1.0 Äquivalente, 80.0 mg, 0.10 mmol, Beispiel 97A) und von N-Methyl- morpholin (1.0 Äquivalente, 0.10 mmol) in trockenem DMF (3.0 ml) wird bei -150C ujnter Argon- Schutzgasatmosphäre zunächst HATU (1.5 Äquivalente, 58.3 mg, 0.15 mmol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wird gerührt (ca. 15 min) und erneut mit ΝMM (1.0 Äquivalente, ClO mmol) versetzt. Das Reaktionsgemisch wird auf O0C erwärmt und erneut mit HATU (2.5 Äquivalente, 0.25 mmol) versetzt. Das Reaktionsgemisch erwärmt sich langsam (ca. 12 h) auf RT und zeigt dann vollständigen Umsatz der Amin-Komponente (HPLC-Kontrolle, Methode 3). Das Reaktions¬ gemisch wird mit festem Kaliumdihydrogenphosphat (5 Äquivalente, 0.50 mmol) versetzt und dann im Hochvakuum eingedampft und chromatographisch aufgereinigt (Methode 21 oder Methode 13) gefolgt von anschließendem Umsalzen des Chromatographieproduktes &~urch Zusatz
von TFA (100 μmol, als 0.05%ige Lösung in Acetonitil-Wasser 1 :1). Man erhält 140.5 mg (78% d. Th.) Produkt.
HPLC/UV-Vis (Methode 2): R1 = 2.6 min. HPLC/UV-Vis (Methode 25): R, = 26.6 min. LC-MS (Methode 7): R1 = 2.5 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 1656.8 (100) [M + H]+;
MS (ESIneg.): m/z (%) = 1655 (100) [M - H]-.
HR-TOF-MS (Methode 1): C78H13IN16O2ISi [M + H]+ gef. 1655.9467, ber. 1655.9439.
Beispiel 99A
^-(Benzyloxycarbonyl-tS-Zer^-butyl-D-alany^-S-fer^-butyl-L-alany^-N5- {fer/-butoxycarbonyl-
[(3i?)-3-hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreonyl-glycyl-[(3iS)-3-hydroxy- L-asparaginyl]-L-seryl}-(3J?)-3-amino-L-phenylalanin-trifluoracetat
Eine Lösung des TMSE-Esters (460 mg, 0.260 mmol, Beispiel 98A) in trockenem THF (8 ml) wird mit Molsieb 4 A versetzt und unter Argonschutzgasatmosphäre bei RT gerührt (15 min). Die ge¬ trocknete Lösung wird anschließend über einen Zeitraum von 2 h in zwei Portionen mit einer 1 N Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid in THF (4.16 ml, 4.16 mmol, 16 Äquivalente) versetzt. Man rührt bis vollständiger Umsatz beobachtet wird (HPLC, Methode 2). Das Reaktionsgemisch wird mit Eisessig (298 μl, 5.198 mmol, 20 Äquivalente) gequencht, im Vakuum eingeengt und direkt mittels präparativer HPLC (Methode 21) gereinigt. Nach Lyophilisation erhält man das Produkt als Lyophilisat (375 mg, 86% d. Th.).
HPLC/UV-Vis (Methode 2): R1 = 2.4 min.
LC-MS (Methode 7): Rt = 2.3 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 728.8 (100) [M + 2H - CO2 - C4Hg]2+, 778.8 (30) [M + 2H]2+, 1556.9
(40) [M + H]+;
MS (ESIneg.): m/z (%) = 1554 (100) [M - H]".
HR-TOF-MS (Methode 1): C73H119N16O2, [M + H]+ gef. 1555.8737, ber. 1555.8731.
Beispiel IQOA
N2-(Benzyloxycarbonyl-[3-?er^-butyl-D-alanyl]-3-/er/-butyl-L-alanyl)-NJ-{(3i?)-3-hydroxy-L- leucyl-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreonyl-glycyl-[(iS)-3-hydroxy-L-asparaginyl]-L- seryl}-(3i?)-3-amino-L-phenylalanm-bistrifluoracetat
Die N-(tert-Butoxycarbonyl)-geschützte Verbindung (100 mg, 0.06 mmol, Beispiel 99A) wird unter Argon-Schutzgasatmosphäre vorgelegt. Bei RT und unter starkem Rühren wird 4 Ν Salzsäure in Dioxan (15 ml) zugetropft. Man rührt, bis die analytische HPLC (Methode 2) vollständigen Umsatz anzeigt (ca. 30 min). Das Reaktionsgemisch wird bei RT im Vakuum eingedampft. Das Rohprodukt wird mittels präparativer HPLC (Methode 35) gereinigt und lyophilisiert. Man erhält die Titelverbindung als Lyophilisat (85.5 mg, 85% d. Th.).
HPLC/UV-Vis (Methode 2): R, = 1.9 min.
HPLC/UV-Vis (Methode 25): R1 = 18.4 min, A^13x (qualitativ) = 210 nm (s), 255-270 (w).
LC-MS (Methode 7): R, = 1.8 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 728.7 (100) [M + 2H]2+;
MS (ESIneg.): m/z (%) = 1454 (100) [M - H]".
HR-TOF-MS (Methode 1): C68H111N]6O19 [M + H]+ gef. 1455.8192, ber. 1455.8206.
Beispiel IQlA
N2-(Benzyloxycarbonyl)-N5-{[(3i?)-3-hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L- allothreonyl-glycyl-[(3>S)-3-hydroxy-L-asparaginyl]-L-seryl}-(3i?)-3-ammo-L-phenylalanin-tri- fluoracetat
Das N-(tert-Butoxycarbonyl)-geschützte Νonapeptid (Beispiel 22A, 1200 mg, 0.848 mmol) wird in Dioxan (10 ml) unter Argon-Schutzgasatmosphäre vorgelegt. Bei RT und unter starkem Rühren wird 4 Ν Salzsäure in Dioxan (230 ml) zugegeben. Man rührt, bis die analytische HPLC (Methode 2) vollständigen Umsatz anzeigt (ca. 1 h). Das Reaktionsgemisch wird am Rotationsverdampfer eingeengt, dann wird der Rückstand bei RT mit Wasser versetzt und anschließend im Vakuum eingedampft. Das Rohprodukt wird mittels präparativer HPLC (Methode 11) aufgereinigt und lyophilisiert. Man erhält die Titelverbindung als farblosen Feststoff (918 mg, 95% Reinheit, 83% d. Th.).
HPLC/UV-Vis (Methode 2): R1 = 1.6 min. HPLC/UV-Vis (Methode 25): R, = 14.3 min. LC-MS (Methode 7): R4 = 1.4 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 601.6 (100) [M + 2H]2+, 1201.7 (20) [M + H]+; MS (ESIneg.): m/z (%) = 1199.8 (100) [M - Hf.
Beispiel 102A
Λ^ ;-(Benzyloxycarbonyl)-[3-/ert-butyl-D-alanyl]-[3-ter^-butyl-L-alanyl]-[(3JR)-3-amino-L-phenyl- alanyl)]-[(3i?)-3-hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreonyl-glycyl-[(3S)-3- hydroxy-L-asparaginy^-L-serin-C' ^-N'^-lactam-trifluoracetat
Zu einer Lösung des Cyclopeptids (Beispiel 26A, 1.0 Äquivalente, 16.1 mg, 15 μmol), der Dipep- tidsäure N-(Benzyloxycarbonyl)-3-fert-butyl-D-alanyl-3-ferf-butyl-L-alanin (9.4 mg, 23 μmol, 1.5 Äquivalente, Beispiel 93A) und N-Methylmorpholin (1.0 Äquivalente, 15 μmol) in trockenem DMF (250 μl) wird bei 00C unter Argon-Schutzgasatmosphäre zunächst HATU (1.6 Äquivalente, 9.4 mg, 25 μmol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wird gerührt (ca. 15 min) und erneut mit N-Methylmorpholin (3.5 Äquivalente, 54 μmol) versetzt. Das Reaktionsgemisch erwärmt sich langsam (ca. 12 h) auf RT und zeigt dann vollständigen Umsatz der Amin-Komponente (HPLC- Kontrolle, Methode 3). Das Reaktionsgemisch wird mit festem Kaliumdihydrogenphosphat (10 Äquivalente, 150 μmol) versetzt und dann im Hochvakuum eingedampft und chromatographisch aufgereinigt (Methode 10). Man erhält 17.7 mg (74% d. Th.) Produkt.
Alternatives Darstellungsverfahren: Bei 00C wird eine Lösung des freien Undecapeptids (N2- (Benzyloxycarbonyl-fS-fert-butyl-D-alanylj-S-förf-butyl-L-alany^-^-l^^-S-hydroxy-L-leucyl-L- leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreonyl-glycyl-[(SjS)-3-hydroxy-L-asparaginyl]-L-seryl}-(3R)- 3-amino-L-phenylalanin-bistrifluoracetat, Beispiel IO OA, 70 mg, 42 μmol) in DMF (30 ml) und ΝMM (32 μl, 6 Äquivalente) mit HATU (47 mg, 125 μmol, 3 Äquivalente) versetzt. Das Reaktionsgemisch wird bis zu vollständigem Umsatz gerührt (12 h, HPLC-Kontrolle). Anschließend wird das Reaktionsgemisch mit Kaliurndihydrogenphosphat (IO Äquivalente,
56.6 mg) gequencht, im Vakuum eingeengt und direkt mittels präparativer HPLC (Methode 36) gereinigt. Man erhält das Produkt als Feststoff (74.4 mg, 73% d. Th.).
HPLC/UV-Vis (Methode 2): R, = 2.3 min.
HPLC/UV-Vis (Methode 25): R, = 24.0 min, Km (qualitativ) = 210 nm (s), 255-270 (w). - 1HNMR (500 MHz, ^-Pyridin) δ 0.98-1.21 (m, 39H, 12 CH3),, 1.36 (m, IH), 1.52 (s, br, IH), 1.60 (d, J= 4.1 Hz, 3H, CH3), 1.89 (m, IH), 1.96-2.03 (m, 2H), 2.09-2.35 (m, 5H), 2.47 („d", J= 15.3 Hz, IH), 3.15 (s, br, 2H)5 3.87 („d", J = 14.2 Hz, IH), 4.04 („d", J = 9.5 Hz, IH), 4.17 (s, br, IH), 4.37-^.55 (m, 4H), 4.66 (s, br, IH), 4.74 (q, J= 5.2 Hz, 1 H), 4.83 („t", J= 9.3 Hz, IH), 4.91 (s, br, IH), 5.20 (s, IH), 5.36-5.42 (m, 2H), 5.62 (d, J= 12.1 Hz, IH), 5.70 (d, J= 12.5 Hz, IH), 5.99-6.06 (m, 2H), 6.73 (s, br, 2H), 7.24 („t", J= 7.6 Hz, IH), 7.28 (d, J = 6.8 Hz, IH), 7.34 („t", J= 7.6 Hz, 2H), 7.40 (m, IH), 7.46 („t", J= 7.2 Hz, 2H), 7.57 Cm, 2H), 7.62 (s, br, IH), 7.68 (s, br, IH), 7.82 (s, br, IH), 7.97 („d", J= 6.5 Hz, 2H), 8.19 (s, br, IH), 8.24-8.29 (m, 2H), 8.35 (s, IH), 8.52 (s, IH), 8.57 (m, IH), 8.63 (m, IH), 8.85 (s, br, IH), 9.05 (s, IH), 9.75 (s, IH), 11.30 (s, br, IH). Für 8 Protonen können keine Signale zugeordnet werden. LC-MS (Methode 7): R, = 2.1 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 719.8 (100) [M + 2H]2+, 1437.9 (30) [M + H]+; MS (ESIneg.): m/z (%) = 663.7 (100), 1435.9 (100) CM - HT". HR-TOF-MS (Methode 1): C68Hi09Ni6O18 [M + H]+ gef. 1437.8135, ber. 1437.8101.
Beispiel 103A
D-Leucyl-N/-{(3,S',65<,125',15S,18i?,21S,24)S',27S,28JR)-6-[(lS)-2-amino-l-hydroxy-2-oxoethyl]-18- (3 - { [amino(imino)methy 1] amino} propy I)- 12- [( 1 S)- 1 -hy droxy ethy 1] -3 -(hydroxymethy l)-24-[( 1 R)- 1 - hydroxy-2-methylpropyl]-21 -isobutyl- 15-isopropy 1-2,5,8, 11,14,17,20,23 ,26-nonaoxo-28-phenyl- 1 - oxa-4,7, 10, 13 , 16, 19,22,25-octaazacyclooctacosan-27-yl} -L-lencinamid-bistrifluoracetat
Zur Synthese von Katenosin A siehe WO 04/099239 Beispiel 2A.
Ausfuhrungsbeispiele
Beispiel 1
[3-/er^-Butyl-D-alanyl]-[3-/er/-butyl-L-alanyl]-[(3i?)-3-ammo-L-phenylalanyl)]-[(3i?)-3-hydroxy-L- leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreonyl-glycyl-[(35)-3-hydroxy-L-asparaginyl]-L- serin-C' ^-N^-lactam-bistrifluoracetat
Gemäß der Arbeitsvorschrift 1 wird das N-(/erM3utoxycarbonyl)-Cyclopeptid (Beispiel 27A, 10 mg, 10 μmol) umgesetzt. Nach chromatographischer Reinigung mittels präparativer HPLC (Me¬ thode 10) erhält man durch Gefriertrocknung 6.5 mg (64% d. Th.) Produkt.
In einem alternativen Verfahren wird die Titelverbindung gemäß der Arbeitsvorschrift 3 aus dem Cbz-geschützten Cyclopeptid (Beispiel 102A) hergstellt.
HPLC/UV-Vis (Methode 3): Rt = 1.9 min, λmax (qualitativ) = 210 nm (s), 265 (m). LC-MS (Methode 5): R1 = 4.51 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 652.8 (100) [M + 2H]2+, 1304.9 (10) [M + H]+.
MS (ESIneg.): m/z (%) = 650.7 (10), 1301.9 (10) [M - H]", 1347.9 [M - H + HCO2H]-. 1H NMR (500 MHz, ^-Pyridin) δ = 0.82 (3H), 0.95 (3H), 0.99 (3H), 1.05 (9H), 1.07 (3H), 1.11 (9H), 1.12 (3H), 1.18 (3H), 1.32, 1.46, 1.61 (3H), 1.93, 1.97, 2.02, 2.03, 2.13 (2H), 2.19 (2H), 2.27, 2.32, 2.35, 2.35, 2.35, 3.18 (2H), 3.94, 4.02, 4.15, 4.31, 4.36, 4.37, 4.47, 4.50, 4.58, 4.59,
4.75, 4.99, 5.17, 5.33, 5.38, 6.00, 6.00, 6.40, 7.21 (2H), 7.45 (2HT), 7.64, 7.72, 7.73, 7.92, 8.02, 8.17, 8.23, 8.30, 8.50, 8.55, 8.85, 9.09, 11.29. Keine eindeutigen 1H Signale werden gefunden für: tBuAla1 NH2, tBuAla2 NH, HyLeu4 NH, HyLeu4 OH, Arg6 NCH, Arg6 NζH2, α//oThr8 OH, HyAsn10 OH, Ser11 OH. 13C NMR (126 MHz, ^-Pyridin) δ = 10.40, 16.00, 19.20, 19.20, 20_70, 21.30, 23.90, 24.70, 26.20, 26.50, 28.60, 29.40 (3C), 29.80 (3C), 30.90, 36.00, 41.10, 41.30, 44.00, 44.23, 44.60, 47.00, 47.20, 51.50, 52.80, 54.30, 55.50, 55.60, 56.60, 57.70, 58.40, 60.30, 60.60, 62.60, 63.00, 70.20, 71.90, 75.20, 128.20 (2C), 128.30, 129.10 (2C), 137.70, 158.23, 169.38, 171.04, 172.23, 172.43 (2C), 173.12, 174.04, 174.29, 174.66, 174.84, 175.41, 176.64. HR-TOF-MS (Methode 1): C60HI03N16OI6 [M + H]+ gef. 1303.7719, ber. 1303.7733.
Die Struktur wird durch eine Einkristall-Röntgenstrukturanalyse bestätigt.
Beispiel 2
D-Leucyl-L-leucyl-[(3i?)-3-amino-L-phenylalanyl)]-[(3i?)-3-hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl- L-isoleucyl-L-allothreonyl-glycyl-[(3,S)-3-hydroxy-L-asparagmyl]-I^-serin-C;'7/-N5'5-lactam-bistri- fluoracetat
Unter Argonschutzgasatmosphäre wird das Cbz-geschützte Cyclopeptid (Beispiel 28A, 800 μg,
0.5 μmol) in Methanol (1 ml) gelöst und dann mit 1 N wässriger Salzsäure (50 μl) und lOproz.
Palladium-Kohle (1 mg) versetzt. Bei RT und Normaldruck wird so lange hydriert (ca. 1 h) bis die analytische HPLC (Methode 2) vollständigen Umsatz anzeigt. Das Reaktionsgemisch wird filtriert
(Spritzenfilter der Fa. Biotage, PTFE), im Vakuum eingeengt und am Hochvakuum getrocknet. Das Rohprodukt wir mittels präparativer HPLC (Methode 10) gereinigt. Als Produkt erhält man 600 μg (76% d. Th.) eines Feststoffs.
[αfV = -66.0° (c = 0.24 in Methanol). HPLC/UV-Vis (Methode 3): R, = 1.7 min, λmax (qualitativ) = 210 nm (s), 265 (m). LC-MS (Methode 5): R, = 4.3 min; MS (ESIpos.): m/z (%) - 638.7 (100) [M + 2H]2+. MS (ESIneg.): m/z (%) = 1274 (100) [M -H]". 1H NMR (500 MHz,
= 0.72 (3H), 0.77 (3H), 0.89 (3H), 0.96 (3H), 0.99 (3H), 1.02 (3H), 1.02 (3H), 1.08 (3H), 1.09 (3H), 1.22 (3H), 1.29, 1.44, 1.58 (3H), 1.75, 1.99, 2.0O5 2.09 (2H), 2.10, 2.14 (2H), 2.17, 2.21 (2H), 2.21, 2.29, 2.29, 2.39, 2.39, 3.18, 3.33, 4.00, 4.10, 4.21, 4.35, 4.35, 4.48, 4.53, 4.61, 4.71, 4.80, 5.06, 5.17, 5.35, 5.36, 6.04, 6.05, 6.63, 7.25 (2H), 7.50 (2H), 7.67, 7.70, 7.88, 8.07, 8.11, 8.24, 8.24, 8.26, 8.47, 8.54, 8.95, 9.23, 9.31, 11.26. Keine eindeutigen. 1H Signale werden gefunden für: Leu1 NH2, Leu2 NH, HyLeu4 OH, Arg6 NςH, Arg6 NζH2, α//oThrs OH, HyAsn10 OH, Ser11 OH-13C NMR (126 MHz, rfrPyridin) δ = 16.27, 19.17, 19.90, 20.49, 20.87, 21.11, 21.70, 22.63, 23.40, 24.19, 24.81, 25.23, 25.23, 26.06, 26.61, 21.70, 28.97, 31.04, 36.52, 40.00, 41.31, 41.94, 42.40, 45.43, 52.60, 53.26, 53.72, 56.09, 56.62, 57.94, 58.53, 58.75, 60.83, 60.83, 62.61, 63.47, 70.50, 72.11, 75.39, 128.09 (2C), 128.19, 128.99 (2C), 138.52, 158.12, 169.39, 170.44, 172.25, 172.46, 173.13, 173.58, 174.16, 174.32, 174.59, 174.59, 174.69, 176.64. MALDI-MS: m/z (%) = 1275 (100) [M + H]+, 1297 (5) [M + Na]+, 1313 (5) [M + K]+. MALDI-MS/MS@1275: m/z (%) = 86 (100), 199 (50), 1049 (20). HR-TOF-MS (Methode 1): C58H99N16O16 [M + H]+ gef. 1275.7424, ber. 1275.7420.
Die Struktur wird durch eine Einkristall-Röntgenstrukturanalyse bestätigt.
Es wird eine Aminosäureanalyse (Methode 9) durchgeführt (Tabelle A).
Tabelle A
in 20% Methanol 1 mg/ml gelöst
LY
PR
JR_
Summe 1 _
Hy- n.d. Kein Standard ßNH2Ph nicht anfärbbar in der AA _
Hy- n.d. Kein Standard _
Hy-Asn, Hy-Leu konnten nicht quantfiziert werden,da kein Standard vorhanden Hy-Asn ist sehr wahrscheinlich als Hy-Asp enthalten.
Beispiel 3
[3-(Trimethylsilyl)-D-alanyl]-[3-(pyrid-3-yl)-L-alanyl]-[(3i?)-3-amino-L-phenylalanyl)]-[(3i?)-3- hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreonyl-glycyl-[(3iS)-3-hydroxy-L- asparaginylJ-L-serin-C' ^-N^-lactam-tristrifluoracetat
Gemäß der Arbeitsvorschrift 3 wird das Cbz-geschützte Cyclopeptid (Beispiel 91 A, 19.9 mg, 12 μmol) umgesetzt. Nach chromatographischer Reinigung mittels präparativer HPLC (Methode 21) erhält man durch Gefriertrocknung 14.7 mg (99% d. Th.) Produkt.
HPLC/UV-Vis (Methode 2): R4 = 1.4 min, λmax (qualitativ) = 210 nm (s), 265 (m). LC-MS (Methode 5): R4 = 1.50 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 671.0 (100) [M + 2H]2+, 1340.4 (10) [M + H]+; MS (ESIneg.): m/z (%) = 668.8 (100), 1338.4 (10) [M - H]". HR-TOF-MS (Methode 1): C60H97N17O16Si [M + H]+ gef. 1340.7117, ber. 1340.7142.
Die Struktur wird durch eine Einkristall-Röntgenstrukturanalyse bestätigt.
Beispiel 4
[3-(^r/-Butyl)-D-alanyl]-[3-(pyrid-3-yl)-L-alanyl]-[(3R)-3-amino-L-phenylalanyl)]-[(^)-3- hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreonyl-glycyl-[(35)-3-hydroxy-L- asparaginyl]-L-serin-Cλ7;-NJ 5-lactam-tristrifluoracetat
Gemäß der Arbeitsvorschrift 3 wird das Cbz-geschützte Cyclopeptid (Beispiel 66A, 15.0 mg, 8.89 μmol) umgesetzt. Nach chromatographischer Reinigung mittels präparativer HPLC (Methode 38) erhält man durch Gefriertrocknung 11.7 mg (79% d. Th.) Produkt.
Beispiel 5
Analog der Arbeitsvorschrift 3 wird das Cbz-gescrmtzte Cyclopeptid (Beispiel 84A, 169.0 mg, 0.11 mmol) umgesetzt. Das Produkt wird nach der Feinreinigung über die präparative RP-HPLC (z.B. Methode 35) mit 140.0 mg (84% d.Th.) Ausbeute isoliert.
HPLC/UV-Vis (Methode 25): R, = 15.01 min.
LC-MS (Methode 7): R, = 1.54 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 645 (100) [M + 2H]2+,
MS (ESIneg.): m/z (%) = 1288 (100) [M - H]", 643.8 (16) [M -2H]2\
HR-TOF-MS (Methode 1): C60H105N16Oi5 [M + H]+ gef. 1289.7950, ber. 1289.7940.
Beispiel 6
[3-(rert-Butyl)-D-alanyl]-[3-(6-methylpyrid-2-yl)-L-alanyl]-[(3i?)-3-amino-L-phenylalanyl)]-[(-?i?)-
3-hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreonyl-glycyl-[(36)-3-hydroxy-L- asparaginylJ-L-serin-C^ ^-N^^-lactam-tristrifluoracetat
Analog der Arbeitsvorschrift 1 wird das tert-Butoxycarbonyl-geschützte Cyclopeptid (Bei¬ spiel 44A, 142.0 mg, 85.20 μmol) umgesetzt. Das Produkt wird nach der Feinreinigung über die präparative RP-HPLC (Methode 39) mit 118.0 mg (82% d.Th.) Ausbeute isoliert.
HPLC/UV-Vis (Methode 25): Rt = 12.88 min. LC-MS (Methode 7): Rt =» 1.58 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 1339 (5) [M + H] +, 670 (100) [M + 2H]2~*~, MS (ESIneg.): m/z (%) = 1337 (100) [M - H]", 668 (6) [M - 2H]2\ HR-TOF-MS (Methode 1): C62H1OiN17Oi6 [M + H]+ gef. 1338.7507, ber. 1338.7529.
Beispiel 7
[3-(^rt-Butyl)-D-alanyl]-[3-(6-trifluormethyl-pyrid-3-yl)-L-alanyl] -[(3i?)-3-amino-L-phenyl- alany I)] -[(3R)-3 -hy droxy-L-leucy 1] -L-leucyl-D-arginy 1-L-isoleucy 1-L-allothreonyl-glycy l-[(3iS)-3 - hydroxy-L-asparaginyl]-L-serin-Cλ/;-N3J-lactam-bis-trifluoracetat
Analog der Arbeitsvorschrift 1 wird das te?~/-Butoxycarbonyl-geschützte Cyclopeptid (Bei¬ spiel 55A, 180.0 mg, 0.11 mmol) umgesetzt. Das Produkt wird nach der Feinreinigung über die präparative RP-HPLC (Methode 39) mit 182.0 mg (97% d.Th.) Ausbeute isoliert.
HPLC/UV-Vis (Methode 2): Rt = 1.71 min. LC-MS (Methode 29): Rt = 1.30 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 1392 (10) [M + H] \ 697 (100) [M + 2H]2+, MS (ESIneg.): m/z (%) = 1391 (20) [M - H]", 695 (100) [M - 2H]2\ HR-TOF-MS (Methode 1): C62H97N17O16F3 [M + H]+ gef. 1392.7267, ber. 1392.7260.
Beispiel 8
Nz;-[(2i?)-2-Amino-3-(trimethylsilyl)-propyl]-[3-(ter/-butyl)-L-alanyl]-[(3i?)-3-amino-L-phenyl- alanyl)]-[(3R)-3-hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreonyl-glycyl-[(3ιS)-3- hydroxy-L-asparaginylJ-L-serin-C' ^-N^Mactam-tris-trifluoracetat
Analog der Arbeitsvorschrift 3 wird das Beazyloxycarbonyl-geschützte Cyclopeptid (Bei¬ spiel 8OA, 32 mg, 19.19 μmol) umgesetzt. Das Produkt wird nach der Feinreinigung über die prä- parative RP-HPLC (Methode 39) mit 21.3 mg (67°/o d.Th.) Ausbeute isoliert.
9
Analog der Arbeitsvorschrift 3 wird das Benzyloxycarbonyl-geschützte Cyclopeptid (Bei¬ spiel 7OA, 32.0 mg, 21.28 μmol) umgesetzt. Das Produkt wird nach der Feinreinigung über die präparative RP-HPLC (Methode 35) mit 22.7 mg (70% d.Th.) Ausbeute isoliert.
HPLC/UV-Vis (Methode 25): R, = 14.00 min. LC-MS (Methode 7): Rt = 1.63 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 1289 (4) [M + H] +, 645 (100) [M + 2H]2+, MS (ESIneg.): m/z (%) = 1287 (100) [M - Hf. HR-TOF-MS (Methode 1): C59H1OiN16Oi6 [M + H]+ gef. 1289.7583, t>er. 1289.7576.
Beispiel 10
[3-ter^-Butyl-D-alanyl]-[3-(pyrid-2-yl)-L-alanyl]-[(3i?)-3-amino-L-phenylalanyl)]-[(3i?)-3-hydroxy- L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreonyl-glycyl-[(35)-3-hydroxy-L-asparaginyl]-L- serin-CΛ ; 7-N5J-lactam-tris-trifluoracetat
Analog der Arbeitsvorschrift 1 wird das terMSutoxycarbonyl-geschützte Cyclopeptid (Bei¬ spiel 45A, 105.0 mg, 63.53 μmol) umgesetzt. Das Produkt wird nach der Feinreinigung über die präparative RP-HPLC (Methode 35) mit 84.4 mg (80% d.Th.) Ausbeute isoliert.
HPLC/UV-Vis (Methode 25): Rt = 14.16 min. LC-MS (Methode 7): R4 = 1.30 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 1325 (15) [M + H] +, 663 (100) [M + 2H]2+, MS (ESIneg.): m/z (%) = 1323 (100) [M - H]". HR-TOF-MS (Methode 1): C6iH98N17Oi6 [M + H]+ gef. 1324.7351, ber. 1324.7372.
Beispiel 11
[3-^r^Butyl-D-alanyl]-L-leucyl-[(3Ä)-3-amino-L-phenylalanyl)]-[(3i?)-3-hydroxy-L-leucyl]-L- leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreonyl-glycyl-[(35)-3-hydroxy-L-asparaginyl]-L-serin-Cλ;;-
N5'5-lactam-tris-trifluoracetat
Analog der Arbeitsvorschrift 1 wird das fert-Butoxycarbonyl-geschützte Cyclopeptid (Bei¬ spiel 5OA, 131.0 mg, 85.19 μmol) umgesetzt. Das Produkt wird nach der Feinreinigung über die präparative RP-HPLC (Methode 35) mit 49.5 mg (38% d.Th.) Ausbeute isoliert.
HPLC/UV-Vis (Methode 25): R1 = 14.56 min. LC-MS (Methode 7): R, = 1.58 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 1290 (5) [M + H] +, 645 (100) [M + 2H]2+, MS (ESIneg.): m/z (%) = 1288 (100) [M - Hf, 643 (100) [M - 2H]2". HR-TOF-MS (Methode 1): C59H101Ni6O16 [M + H]+ gef. 1289.7567, ber. 1289.7576.
Beispiel 12
[3-cyc/o-Pentyl-D-alanyl]-[3-cjc/o-pentyl-L-alanyl]-[(3R)-3-amino-L-phenylalanyl)]-[(3i?)-3- hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreonyl-glycyl-[(35)-3-hydroxy-L- asparaginylJ-L-serin-C^'-N^Mactam-bistrifluoracetat
Analog der Arbeitsvorschrift 1 wird das terf-Butoxycarbonyl-geschützte Cyclopeptid (Bei¬ spiel 63A, 25.0 mg, 15 μmol) umgesetzt. Das Produkt wird nach der Feinreinigung über die präpa- rative RP-HPLC (Methode 35) mit 24.5 mg (quant.) Ausbeute isoliert.
HPLC/UV-Vis (Methode 25): R1 = 17.2 min.
LC-MS (Methode 7): R4 = 1.66 min;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 664.8 (100) [M + 2H]2+, 1328 (10) [M+H]+,
MS (ESIneg.): m/z (%) = 1326 (100) [M - H]".
HR-TOF-MS (Methode 1): C62H103N16Oi6 [M + H]+ gef. 1327.7761, ber. 1327.7733.
B. Bewertung der physiologischen Wirksamkeit
Die in vzϊro-Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann in folgenden Assays gezeigt werden:
Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK);
Die MHK wird im Flüssigdilutionstest gemäß der NCCLS-Richtlinien bestimmt. Übernachtkultu¬ ren von Staphylococcus aureus 133, Entercococcus faecahs 27159, E. faecium 4147 und Strepto¬ coccus pneumoniae G9a werden mit den beschriebenen Testsubstanzen in einer 1 :2 Verdünnungs¬ reihe inkubiert. Die MHK-Bestimmung wird mit einer Zellzahl von 105 Keimen pro ml in Isosensi- test-Medium (Fa. Difco, Irvine/USA) durchgeführt, mit Ausnahme von S pneumoniae, der in BHI- Bouillon (Fa. Difco, Irvine/USA) mit 10% Rinderserum bei einer Zellzahl von 106 Keimen pro ml getestet wird. Die Kulturen werden bei 370C für 18-24 Stunden inkubiert, S pneumoniae in Ge¬ genwart von 10% CO2.
Die jeweils niedrigste Substanzkonzentration, bei der kein sichtbares Bakterienwachstum mehr auftritt, wird als MHK definiert. Die MHK- Werte werden in μg/ml angegeben.
Repräsentative in-vitro-Wirkdaten für die erfindungsgemäßen Verbindungen sind in Tabelle B wiedergegeben:
Tabelle B
Die Eignung der erfmdungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung von bakteriellen Infektionen kann im folgenden Tiermodell gezeigt werden*
Systemische Infektion mit Stapftylococcus aureus 133:
Zellen von & aureus 133 werden über Nacht in BHI-Bouillon (Fa. Oxoid, New York/ USA) ange¬ züchtet. Die Übernachtkultur wird 1 : 100 in frische BHI-Bouillon verdünnt und für 3 Stunden in¬ kubiert. Die dann in der logarithmischen Wachstumsphase befindlichen Zellen werden abzentrifu- giert und zweimal mit gepufferter, physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Danach wird pho¬ tometrisch eine Zellsuspension in Kochsalzlösung mit einer Extinktion von 50 Einheiten einge¬ stellt. Nach einem Verdünnungsschritt (1 :15) wird diese Suspension 1 :1 mit einer 10%igen Mucin- lösung gemischt. Von dieser Infelctionslösung werden 0.25 ml/20 g Maus intraperitoneal (entspre¬ chend 1x106 Keimen/Maus) appliziert. Die Therapie erfolgt intraperitoneal oder intravenös 30 Minuten nach der Infektion. Für den Infektionsversuch werden weibliche CFWl -Mäuse verwen¬ det. Das Überleben der Tiere wird über 6 Tage protokolliert.
Die Eigenschaften der erfindungsgemäßen Verbindungen im Hinblick auf die Nierenverträglich¬ keit können im folgenden Tiermodell gezeigt werden:
Maus-Modell zur Bestimmung nephrotoxischer Effekte:
Nephrotoxische Nebenwirkungen der Nonadepsipeptide werden durch histopatho logische Unter¬ suchungen der Nieren in Mäusen nach mehrfacher Gabe einer bestimmten Dosierung analysiert. Dafür werden 5 - 6 Tiere täglich entweder intravenös (i.V.) oder intraperitoneal (i.p.) mit Substan¬ zen behandelt, die in wässriger Lösung oder unter Zusatz von Solutol gelöst werden. Nierentoxi¬ sche Effekte werden durch lichtmikroskopische Auswertung Hämatoxilin und Eosin (H&E) ge- färbter Paraffinschnitte der Nieren bestimmt. Eine 'Periodic-Acid Schiff (PAS)-Reaktion wird wahlweise zur besseren Darstellung von Glykoproteinen durchgeführt. Nephrotoxische Effekte werden semiquantitativ für jedes Tier als Schweregrade der auftretenden tubulären Basophilie und Degeneration/Regeneration festgelegt (Schweregrade: 0 = kein Effekt; 1 = minimaler Effekt; 2 = leichter Effekt; 3 = moderater Effekt; 4 = schwere Läsionen). Der durchschnittliche Schweregrad der tubulären Degeneration/Regeneration sowie die Inzidenz (Anzahl der betroffenen Tiere) wird pro Tiergruppe oder Derivat berechnet. Darüber hinausgehende Nierenveränderungen wie tubuläre Dilatation sowie Nekrosen und Ansammlung nekrotischen Materials werden ebenfalls aufgeführt.
C1 Ausführungsbeispiele für pharmazeutische Zusammensetzungen
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können folgendermaßen in pharmazeutische Zubereitungen überfuhrt werden:
Tablette:
Zusammensetzung:
100 mg der Verbindung von Beispiel 1, 50 mg Lactose (Monohydrat), 50 mg Maisstärke (nativ), 10 mg Polyvinylpyrolidon (PVP 25) (Fa. BASF, Ludwigshafen, Deutschland) und 2 mg Pvlagnesi- umstearat.
Tablettengewicht 212 mg. Durchmesser 8 mm, Wölbungsradius 12 mm.
Herstellung:
Die Mischung aus Wirkstoff, Lactose und Stärke wird mit einer 5%-igen Lösung (m/m) des PVPs in Wasser granuliert. Das Granulat wird nach dem Trocknen mit dem Magnesiumstearat für 5 min gemischt. Diese Mischung wird mit einer üblichen Tablettenpresse verpresst (Format der Tablette siehe oben). Als Richtwert für die Verpressung wird eine Presskraft von 15 kN verwendet.
Oral applizierbare Suspension:
Zusammensetzung:
1000 mg der Verbindung von Beispiel 1, 1000 mg Ethanol (96%), 400 mg Rhodigel (Xanthan gum der Fa. FMC, Pennsylvania, USA) und 99 g Wasser.
Einer Einzeldosis von 100 mg der erfϊndungsgemäßen Verbindung entsprechen 10 ml orale Sus- pension.
Herstellung:
Das Rhodigel wird in Ethanol suspendiert, der Wirkstoff wird der Suspension zugefügt. Unter Rühren erfolgt die Zugabe des Wassers. Bis zum Abschluss der Quellung des Rhodigels wird ca. 6h gerührt.
Intravenös applizierbare Lösung:
Zusammensetzung:
100-200 mg der Verbindung von Beispiel 1, 15 g Polyethylenglykol 400 und 250 g Wasser für Injektionszwecke.
Herstellung:
Die Verbindung von Beispiel 1 wird zusammen mit Polyethylenglykol 400 in dem Wassex unter Rühren gelöst. Die Lösung wird sterilfiltriert (Porendurchmesser 0.22 μm) und unter aseptischen Bedingungen in hitzesterilisierte Infusionsflaschen abgefüllt. Diese werden mit Infusionsstopfen und Bördelkappen verschlossen.