MX2007005382A - Nonadepsipeptidos acilados como derivados de lisobactina. - Google Patents
Nonadepsipeptidos acilados como derivados de lisobactina.Info
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Abstract
La invencion se refiere a nonadepsipeptidos (derivado de lisobactina) y a procedimientos para su preparacion, asi como a su uso para la preparacion de medicamentos para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades, especialmente enfermedades infecciosas bacterianas. Los nuevos derivados de lisobactina se diferencian de la sustancia natural por la cadena de peptidos terminales N que abarcan un resto de 3-(piridil-3)-alanil.
Description
NONADEPSIPEPTIDOS ACILADOS COMO DERIVADOS DE LISOBACTINA
CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a nonadepsipéptidos y a procedimientos para su preparación, asi como a su uso para la preparación de medicamentos para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades, especialmente enfermedades infecciosas bacterianas. La pared celular bacteriana se sintetiza por una serie de enzimas (biosíntesis de pared celular) y es esencial para la supervivencia o bien la propagación de microorganismos. La estructura de esta macromolécula, al igual que las proteínas participantes en su síntesis, está fuertemente conservada entre las bacterias. A causa de su naturaleza esencial y homogeneidad, la biosíntesis de pared celular es un punto de ataque ideal para nuevos antibióticos (D.W. Green, "The bacterial cell wall as a source of antibacterial targets", Expert Opin. Ther. Tarqets, 2002, 6, 1-19). La vancomicina y penicilina son inhibidores de la biosíntesis de pared celular bacteriana y representan ejemplos exitosos de la potencia antibiótica de este principio activo. Se utilizan desde hace decenas de años en clínica para el tratamiento de infecciones bacterianas, ante todo con patógenos gram-positivos. Por la creciente aparición de gérmenes resistentes, por ejemplo, estafilococos resistentes a meticilina, neumococos resistentes a penicilina y enterococos resistentes a vancomicina (F. Baquero, "Gram-positive resistance: challenge for the development of new antibiotics", J. Antimicrob. Chemother., 1997, 39, Suppl A: 1-6; A.P. Johnson, D.M. Livermore, G.S. Tillotson, "Antimicrobial susceptibility of Gram-positive bacteria: what's current, what's anticipated?", J. Hosp. Infect.. 2001 , (49), Supl A: 3-11 ), así como recientemente también por primera vez estafilococos resistentes a vancomicina (B. Goldrick, "First reported case of VRSA ¡n the United States", Am. J. Nurs., 2002, 102, 17) estas sustancias pierden cada vez más su actividad terapéutica.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La presente invención describe una nueva clase de inhibidores de la biosíntesis de pared celular sin resistencia cruzada frente a las clases de antibióticos conocidos.
Se describe la sustancia natural lisobactina y algunos derivados como antibacterianos activos en el documento US 4.754.018. Se describen también el aislamiento y actividad antibacteriana de la lisobactina en los documentos EP-A-196042 y JP 01132600. El documento WO04/099239 describe derivados de lisobactina con actividad antibacteriana.
Se describe adicionalmente la actividad antibacteriana de lisobactina y catanosina A en
O'Sullivan, J. eí al., J. Antibiot. 1988, 41 1740 - 1744, Bonner, D. P. eí al., J. Antibiot. 1988, 4J., 1745 - 1751 , Shoji, J. et al., J. Antibiot. 1988, 41 713 - 718 y Tymiak, A. A. et al., J. Org. Chem. 1989, 54, 1149 - 1157.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN Es un cometido de la presente invención poner a disposición compuestos alternativos con actividad antibacteriana comparable o mejorada, mejor tolerancia, por ejemplo menor nefrotoxicidad, y mejor distribución en el cuerpo, es decir, mejores propiedades farmacocinéticas como, por ejemplo, aumento de la fracción libre (fu), para el tratamiento de enfermedades bacterianas en personas y animales. Son objeto de la invención compuestos de fórmula
^ - NH ,
., (I),
en la que R1 significa hidrógeno y R2 significa 2,2-dimetil-1 -butilo, 2-etil-2-metil-1 -butilo, 2,2-dietil-1 -butilo, 2,2-dimetil-1 -pentilo o trimetllsililmetílo, o R1 significa trifluorometilo y R2 significa 2,2-dimetil-1 -propilo, 2,2-dimetil-1 -butilo, 2-etil-2-metil-1 -butilo, 2,2-dietil-1 -butilo,
2,2-dimetil-1-pentilo o trimetilsililmetilo, y sus sales, sus solvatos y los solvatos de sus sales. Son compuestos según la invención los compuestos de fórmula (I) y sus sales, solvatos, solvatos de las sales y profármacos, los compuestos de las fórmulas citadas a continuación abarcados por la fórmula (I) y sus sales, solvatos, solvatos de las sales y profármacos, así como los compuestos citados a continuación como ejemplos de realización abarcados por la fórmula (I) y sus sales, solvatos, solvatos de las sales y profármacos, a menos que en los compuestos citados a continuación abarcados por la fórmula (I), no se trate ya de sales, solvatos, solvatos de las sales y profármacos.
Los compuestos según la invención pueden existir, dependiendo de su estructura, en formas estereoisoméricas (enantiómeros, diastereómeros). La invención se refiere por tanto a los enantiómeros o diastereómeros o sus respectivas mezclas. A partir de dichas mezclas de enantiómeros y/o diastereómeros pueden aislarse los componentes estereoisoméricos individuales de modo conocido.
En caso de que los compuestos según la invención puedan hallarse en formas tautoméricas, la presente invención abarca todas las formas tautoméricas. Como sales, se prefieren en el marco de la presente invención sales fisiológicamente inocuas de los compuestos según la invención. Pero están también abarcadas sales que no son adecuadas para aplicaciones farmacéuticas por sí mismas, pero pueden usarse, por ejemplo, para el aislamiento o purificación de compuestos según la invención o sales mixtas. Por sal mixta en el marco de la presente invención se entiende una sal de adición que contiene dos o más ácidos o bien bases distintos como, por ejemplo, una sal de trífluoroacetato-mesilato. Las sales fisiológicamente inocuas de los compuestos según la invención abarcan sales de adición de ácido de ácidos minerales, ácidos carboxílicos y ácidos sulfónicos, por ejemplo, sales de ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido toluenosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido naftalenodisulfónico, ácido acético glacial, ácido trifluoroacético, ácido propiónico, ácido láctico, ácido tartárico, ácido málico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico y ácido benzoico.
Las sales fisiológicamente inocuas de los compuestos según la invención abarcan también sales de bases habituales como, por ejemplo y preferiblemente, sales de metales alcalinos (por ejemplo sales de sodio y potasio), sales de metales alcalinotérreos (por ejemplo, sales de calcio y magnesio) y sales de amonio, derivadas de amoniaco o aminas orgánicas de 1 a 6 átomos de C como, por ejemplo y preferiblemente, etiiamina, dietilamina, trietilamina, etildiisopropilamina, monoetanolamina, dietanolamina, trietanolamina, diciciohexilamina, dimetilaminoetanol, procaína, dibencilamina, ?/-metilmorfolina, arginina, lisina, etilendiamina y ?/-metilpiperidina. Como solvatos se designan en el marco de la invención aquellas formas de compuestos según la invención que forman un complejo en estado sólido o líquido mediante coordinación con
moléculas de disolvente. Los hidratos son una forma especial de solvatos en los que la coordinación se realiza con agua. Se prefieren compuestos de fórmula (I) en la que R1 significa hidrógeno y R2 significa 2, 2-d¡metil-1 -butilo o trimetilsililmetilo, o R1 significa trifluorometilo y R significa 2, 2-dimetil-1 -propilo, 2, 2-d¡metil-1 -butilo o trimetilsililmetilo, y sus sales, sus solvatos y los solvatos de sus sales. Se prefieren también compuestos de fórmula (I) en la que R1 significa hidrógeno y R significa 2, 2-dimetil-1 -butilo, 2-etil-2-metil-1-butilo, 2, 2-dietil-1 -butilo o trimetilsililmetilo, y sus sales, sus solvatos y los solvatos de sus sales. Se prefieren también compuestos de fórmula (I) en la que R1 significa hidrógeno y R2 significa 2,2-dimetil-1 -butilo, 2-etil-2-metil-1 -butilo, 2,2-dietil-1 -butilo, 2,2-dimetil-1 -pentilo o trimetilsililmetilo. Se prefiere especialmente el compuesto 3-(trimetilsilil)-D-alanil-3-(piridin-3-il)-L-alanil-des- (1 -D-leucil-2-L-leucil)lisobactina
o una de sus sales, sus solvatos o los solvatos de sus sales. Es además objeto de la invención un procedimiento para la preparación de compuestos de fórmulas (I), en el que el compuesto de fórmula O
HO H
H HO N
CH
HO ü O N' 1 Crl ( \ . Cl l O
HN (ll), N u.
CH HN , NH
se hace reaccionar con compuestos de fórmula
(lll),
en la que R1 y R2 tienen el significado dado anteriormente, y X1 significa halógeno, preferiblemente bromo, cloro o flúor, o hidroxi. En caso de que X1 represente halógeno, la reacción se realiza en general en disolventes inertes, eventualmente en presencia de una base, preferiblemente en un intervalo de temperatura de -30°C a 50°C a presión normal. Son disolventes inertes, por ejemplo, tetrahidrofurano, cloruro de metileno, piridina, dioxano o dimetilformamida, se prefiere cloruro de metileno o dimetilformamida. Son bases, por ejemplo, trietilamina, diisopropiletilamina o ?/-metilmorfolina, se prefiere diisopropiletilamina. En caso de que X1 represente hidroxi, la reacción se realiza en general en disolventes inertes en presencia de un reactivo deshidratante, eventualmente en presencia de una base, preferiblemente en un intervalo de temperatura de -30°C a 50°C a presión normal. Son disolventes inertes, por ejemplo, hidrocarburos halogenados como diclorometano o triclorometano, hidrocarburos como benceno, nitrometano, dioxano, dimetilformamida o acetonitrilo. Es igualmente posible utilizar mezclas de disolventes. Se prefieren especialmente diclorometano o dimetilformamida. Como reactivos deshidratantes son adecuados a este respecto, por ejemplo, carbodiimidas como, por ejemplo, N,N -dietil-, N,N, -dipropil-, ?/,?/'-diisopropil-, ?/,?/'-diciclohexilcarbodiimida, clorhidrato de ?/-(3-dimetilaminoisopropil)-?/'-etilcarbodiimida (EDC), ?/-ciclohexilcarbodiimida-?/- propiloximetilpoliestireno (PS-carbodiimída) o compuestos de carbonilo como carbonildiimidazol, o compuestos de 1 ,2-oxazolio como 3-sulfato de 2-etil-5-fenil-1 ,2-oxazolio o perclorato de 2-íerc-butil-
5-metilisoxazolio, o compuestos acilamino como 2-etoxi-1-etoxicarbonil-1 ,2-dihidroquinolina, o anhidrido del ácido propanofosfónico, o cloroformiato de isobutilo, o cloruro de bis-(2-oxo-3-oxa-zolidinil)fosforilo o hexafluorofosfato de benzotriazoliloxitri(dimetilamino)fosfonio, o hexafluorofosfato de 0-(benzotriazol-1 -il)-?/,?/, /',?/'-tetrametiluronio (HBTU), tetrafluoroborato de 2-(2-oxo-1-(2H)-piridil)-1 ,1 ,3,3-tetrametiluronio (TPTU) o hexafluorofosfato de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-?/,?/, /',?/'-tetrametiluronio (HATU), o 1 -hidroxibenzotriazol (HOBt), o hexafluorofosfato de benzotriazol-1 -iloxitris(dimetilamino)fosfonio (BOP), o ?/-hidroxisuccinimida o mezclas de estos, con bases. Son bases, por ejemplo, carbonatos alcalinos como, por ejemplo, carbonato de sodio o potasio o hidrogenocarbonato de sodio o potasio, o bases orgánicas como trialquilaminas, por ejemplo, trietilamina, ?/-metilmorfolina, ?/-metilpiperidina, 4-dimetilaminopiridina o diisopropiletilamina. Preferiblemente, la condensación se lleva a cabo con HATU o con EDC en presencia de HOBt. Los compuestos de fórmula (lll) portan eventualmente grupos protectores, de modo que en estos casos a la reacción del compuesto de fórmula (II) con compuestos de fórmula (lll) le sigue una separación de los grupos protectores con ácido trifluoroacético según procedimientos conocidos por el experto. La base libre de las sales de los compuestos de fórmula (I) puede obtenerse, por ejemplo, mediante adición de una base y posterior extracción, precipitación o separación cromatográfica según procedimientos conocidos por el experto. Especialmente, mediante el uso de bases unidas a polímeros como, por ejemplo, hidrogenocarbonato unido a polímero.
Es un objeto adicional de la invención un procedimiento para la preparación de compuestos de fórmula (I) o sus solvatos según la reivindicación 1 , en el que las sales de los compuestos o solvatos de las sales de los compuestos se transforman en los compuestos mediante la adición de una base.
El compuesto de fórmula (II) puede sintetizarse mediante degradación de Edman doble a partir de lisobactina (ejemplo 1A), como se describe en la parte experimental del ejemplo 2A.
Los compuestos de fórmula (lll) son conocidos o pueden sintetizarse según procedimientos conocidos a partir de los correspondientes reactantes. La preparación de los compuestos según la invención puede ilustrarse mediante el siguiente esquema de síntesis. Esquema de síntesis:
<, ^.
\
-u
Los compuestos según la invención muestran un espectro farmacológico y farmacocinético de acción valioso no previsible. Muestran una acción antibactenana. Son adecuados por tanto para uso como medicamentos para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades en personas y animales. Los compuestos según la invención se caracterizan por una nefrotoxicidad menor respecto a la de la lisobactina Los compuestos según la invención se caracterizan por una mejor farmacocinética respecto a la de la lisobactina. Muestran una mejor distribución en el cuerpo con una acción farmacológica igual o mejorada, lo que tiene como consecuencia una menor dosis terapéutica así como una ventana de tratamiento terapéutico más amplia.
Los compuestos según la invención tienen una mayor fracción libre (fu) en el plasma que la sobactina Los nonadepsipeptidos descritos actúan como inhibidores de la biosintesis de la pared celular bacteriana Son especialmente activos los preparados según la invención frente a bacterias y microorganismos similares a bacterias Por consiguiente, son especialmente buenos para la profilaxis y la quimioterapia de infecciones locales y sistémicas en medicina humana y animal producidas por estos patógenos Básicamente, los preparados según la invención pueden usarse contra todas las bacterias y microorganismos similares a bacterias que estén en posesión de una pared celular bacteriana (sáculo de mureina) o bien del sistema enzimático correspondiente, por ejemplo, mediante los siguientes patógenos o mediante mezclas de los siguientes patógenos Cocos gram-negativos (Neissena gonorrhoßae) así como bacilos gram-negativos como Enterobactenaceae, por ejemplo Eschepchia coll, Hamophilus influenzae, Pseudomonas, Klebsiella, Citrobacter (C freundn, C divernis), Salmonella y Shigella, otras Enterobacter (E aerogenes, E agglomerans), Hafnia, Serratia (S marcescens), Providencia, Yersmia, así como el genero Acmetobacter, Branhamella y Chlamydia Además, el espectro antibactenano abarca bacterias estrictamente anaeróbicas como, por ejemplo, Bacteroides fragilis, representantes del género Peptococcus, Peptostreptococcus, así como el género Clostpdium, además micobactenas, por ejemplo, M tuberculosus Muestran una acción especialmente marcada los compuestos según la invención contra cocos gram-positivos, por ejemplo, estafilococos (S aureus, S epidermidis, S haemolyticus, S carnosus), enterococos (£ faecalis, E faecium) y estreptococos (S agalactiae, S pneumoniae, S pyogenes) La enumeración anterior de patógenos es únicamente ejemplar, y en modo alguno debe interpretarse como limitante Como enfermedades causadas por los patógenos citados o infecciones mixtas y que pueden impedirse, mejorarse o curarse mediante los preparados según la invención, son de citar, por ejemplo Enfermedades infecciosas en personas como, por ejemplo, infecciones de las vías
urinarias sin complicaciones y con complicaciones, infecciones dérmicas y superficiales sin complicaciones, infecciones dérmicas y de partes blandas con complicaciones, inflamación pulmonar adquirida en hospital y ambulatoria, neumonías nosocomiales, exacerbaciones agudas e infecciones bacterianas secundarias de bronquitis crónica, otitis media aguda, sinusitis aguda, faringitis estreptocócica, meningitis bacteriana, uretritis/cervicitis gonocócica y no gonocócica sin complicaciones, prostatitis aguda, endocarditis, infecciones intraabdominales sin complicaciones y con complicaciones, infecciones ginecológicas, enfermedad inflamatoria pélvica, vaginosis bacteriana, osteomielitis aguda y crónica, artritis bacteriana aguda, terapia empírica en pacientes neutropénicos febriles, otras bacteremias, infecciones por MRSA, diarrea infecciosa aguda, infecciones por Helicobacter pylori, infecciones postoperatorias, infecciones odontogénicas, infecciones oftalmológicas, infecciones postoperatorias (incluyendo abscesos periproctales, infecciones de heridas, infecciones biliares, mastitis y apendicitis aguda), fibrosis quística y bronquiectasis. Además de en personas, pueden tratarse infecciones bacterianas también en otras especies. Se citan como ejemplos: cerdo: diarrea, enterotoxemia, sepsis, disentería, salmonelosis, síndrome de metritis- mastitis-agalactia, mastitis; rumiantes (vaca, oveja, cabra): diarrea, sepsis, bronconeumonía, salmonelosis, pasteurelosis, infecciones genitales; caballo: bronconeumonía, parálisis del potro, infecciones puerperales y postpuerperales, salmonelosis; perros y gatos: bronconeumonía, diarrea, dermatitis, otitis, infecciones de las vías urinarias, prostatitis; aves (gallina, pavo, codorniz, paloma, aves decorativas y otras): infecciones por E. coli, enfermedades crónicas de las vías respiratorias, salmonelosis, pasteurelosis, psitacosis. Pueden tratarse igualmente enfermedades bacterianas en la cría y mantenimiento de peces útiles y decorativos, en los que el espectro antibacteriano se amplía de los patógenos citados anteriormente a otros patógenos como, por ejemplo, Pasteurella, Brucella, Campylobacter,
Listeria, Erysipelothhs, Corynebacterium, Borellia, Treponema, Nocardia, Rikettsia, Yersinia. Es otro objeto de la presente invención el uso de los compuestos según la invención para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades, especialmente de enfermedades infecciosas bacterianas. Es otro objeto de la presente invención el uso de compuestos según la invención para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades, especialmente de las enfermedades anteriormente citadas. Es otro objeto de la presente invención el uso de los compuestos según la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades, especialmente de las enfermedades anteriormente citadas. Se prefiere usar los compuestos según la invención para la preparación de medicamentos que son adecuados para la profilaxis y/o el tratamiento de enfermedades bacterianas.
Es otro objeto de la presente invención un procedimiento para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades, especialmente de las enfermedades anteriormente citadas, usando una cantidad antibacterianamente eficaz de los compuestos según la invención. Son objeto adicional de la presente invención medicamentos que contienen al menos un compuesto según la invención y al menos uno o varios principios activos adicionales, especialmente para el tratamiento y/o la profilaxis de las enfermedades anteriormente citadas. Los principios activos de combinación preferidos son compuestos de actividad antibacteriana que tienen un espectro de actividad distinto, especialmente un espectro de actividad complementario de y/o sinérgico con los compuestos según la invención. Los compuestos según la invención pueden actuar sístémica y/o localmente. Con este fin, pueden administrarse de modo adecuado como, por ejemplo, oral, parenteral, pulmonar, nasal, sublingual, lingual, bucal, rectal, dérmico, transdérmico, conjuntíval, ótico o como implante o bien prótesis endovascular. Para estos modos de administración, pueden administrarse los compuestos según la invención en formas de administración adecuadas. Para administración oral, son adecuadas formas de administración que aportan los
compuestos según la invención de forma rápida y/o modificada que funcionan según el estado de la técnica, que contienen los compuestos según la invención en forma cristalina y/o amorfa y/o disuelta como, por ejemplo, comprimidos (comprimidos no recubiertos o recubiertos, por ejemplo con recubrimientos resistentes a los ácidos gástricos o recubrimientos de disolución retardada o insolubles que controlan la liberación del compuesto según la invención), comprimidos o películas/obleas de disgregación rápida en la cavidad bucal, películas/liofilizados, cápsulas (por ejemplo cápsulas de gelatina dura o blanda), grageas, granulos, pellas, polvos, emulsiones, suspensiones, aerosoles o soluciones. La administración parenteral puede tener lugar evitando una etapa de resorción (por ejemplo, intravenosa, intraarterial, intracardiaca, intraespinal o intralumbar) o incluyendo una resorción (por ejemplo, intramuscular, subcutánea, intracutánea, percutánea o intraperitonal). Para la administración parenteral son adecuados como formas de administración, entre otros, preparados de inyección e infusión en forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, liofilizados o polvos estériles. Para los demás modos de administración son adecuadas, por ejemplo, formas farmacéuticas de inhalación (entre otras, inhaladores de polvo, nebulizadores), gotas, soluciones y pulverizadores nasales; comprimidos, películas/obleas o cápsulas de administración lingual, sublingual o bucal, supositorios, preparaciones oculares o auriculares, cápsulas vaginales, suspensiones acuosas (lociones, mezclas para agitar), suspensiones lipófilas, pomadas, cremas, sistemas terapéuticos transdérmicos (como por ejemplo emplastos), leches, pastas, espumas, polvos finos, implantes o prótesis endovasculares. Los compuestos según la invención pueden transformarse en las formas de administración citadas. Esto puede realizarse de modo en sí conocido mediante mezclado con coadyuvantes inertes no tóxicos farmacéuticamente adecuados. Entre estos coadyuvantes se cuentan, en general, vehículos (por ejemplo celulosa microcristalína, lactosa, manitol), disolventes (por ejemplo polietilenglicoles líquidos), emulsionantes y agentes dispersantes o humectantes (por ejemplo dodeciisulfato de sodio, oleato de polioxisorbitán), aglutinantes (por ejemplo polivinilpirrolidona), polímeros sintéticos y naturales (por ejemplo albúmina), estabilizantes (por ejemplo antioxidantes,
por ejemplo ácido ascóbico), colorantes (por ejemplo pigmentos inorgánicos como, por ejemplo óxidos de hierro) y correctores del sabor y/u olor. Son otro objeto de la presente invención medicamentos que contienen al menos un compuesto según la invención, habitualmente junto con uno o varios coadyuvantes inertes no tóxicos farmacéuticamente adecuados, así como su uso para los fines citados anteriormente. En general, se ha mostrado ventajoso administrar en administración intravenosa cantidades de aproximadamente 0,001 a 100 mg/kg, preferiblemente de aproximadamente 0,1 a 10 mg/kg de peso corporal para conseguir resultados eficaces y, en administración oral, la dosificación asciende aproximadamente a 0,01 a 50 mg/kg, preferiblemente a 0,5 a 10 mg/kg de peso corporal.
A pesar de ello puede ser eventualmente necesario desviarse de las cantidades citadas, dependiendo por supuesto del peso corporal, modo de administración, comportamiento individual frente al principio activo, tipo de preparado y punto o intervalo temporal en el que se realiza la administración. Así, en algunos casos puede ser suficiente con menos de la cantidad mínima anteriormente citada, mientras que en otros casos deben superarse los límites superiores citados. En caso de administración de cantidades mayores, puede ser aconsejable distribuir éstas en varias tomas individuales a lo largo del día. Los datos de porcentajes en los siguientes ensayos y ejemplos son porcentajes en peso, a menos que se indique otra cosa; las partes son partes en peso. Las relaciones de disolventes, relaciones de dilución y datos de concentración de soluciones líquido/líquido se refieren respectivamente al volumen.
A. Ejemplos Abreviaturas Gen general Área superficie (de pico) cale. calculado
Boc íerc-butiloxicarbonilo A señal amplia (en espectros de RMN) Ej. ejemplo D doblete (en espectros de RMN) TLC cromatografía en capa fina DCI ionización química directa (en EM) DCM diclorometano DIEA ?/,?/-di¡sopropiletílamina DMAP 4-?/,?/-dimet¡laminopipdina DMSO dimetiisulfóxido DMF ?/,?/-dimetilformamida d. t. del teórico EDC 1-etil-3-(3-dimetilam¡nopropil)carbodiimida (también EDCl) EDCxHCI clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida AcOEt acetato de etilo El ionización por choque de electrones (en EM) ESI ionización por electropulverización (en EM) ESlneg análisis aniónico en espectroscopia de masas ESI ESlpos análisis catiónico en espectroscopia de masas ESI Pf. punto de fusión ene. encontrado sat. saturado H hora(s) HATU Hexafluorofosfato de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-?/,?/,?/',?/ -tetrametiluronio HOBt 1 -Hidroxibenzotriazol HPLC cromatografía líquida de alta presión/alta resolución AR alta resolución (High Resolution) a. v. a vacío
conc. concentrado EM-CL cromatografía líquida acoplada a espectroscopia de masas LDA diisopropilamiduro de litio M medio (en espectros UV y IR) M multiplete (en espectros de RMN) MALDI desorción/ionización láser auxiliada por matriz CMI concentración mínima inhibidora Min minuto/minutos MRSA Staphylococcus aureus resistente a meticilina EM espectroscopia de masas NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards neg. negativo NMM ?/-metilmorfolina RMN espectroscopia de resonancia nuclear (resonancia magnética nuclear) p.a. para análisis Pd paladio Pd-C paladio sobre carbono pos. positivo % porcentual PTFE politetrafluoretileno cuant. cuantitativo HPLC-FI HPLC en fase inversa TA temperatura ambiente TR tiempo de retención (en HPLC) f fuerte (en espectros UV e IR) s singlete (en espectros de RMN) TBTU tetrafluoroborato de 0-(benzotriazol-1 -il)-?/,?/,? ',?/ -tetrametiluronio
TCTU tetrafluoroborato de 0-(1 H-6-clorobenzotriazol-1 -il)-1 , 1 ,3,3-
tetrametiluronio TFA ácido trífluoroacético TFE 2,2,2-trifluoroetanol THF tetrahidrofurano TOF tiempo de vuelo (time of flight) UV ultravioleta Vis visible VRSA Staphylococcus aureus resistente a vancomicina d débil (en espectros UV e IR) ac. acuoso(s) Z, Cbz benciloxicarbonilo
Bibliografía Para la nomenclatura de los péptidos y ciclodepsípéptidos véanse: 1. A Guide to lUPAC Nomenclature of Organic Compounds (Recommendations 1993), 1993, Blackwell Scientífic publications. 2. Nomenclature and symbolism for amíno acids and peptídes. Recommendations 1983. IUPAC- IUB Joipt Commission on Biochemical Nomenclature, UK. Biochemical Journal 1984, 219, 345- 373, así como la bibliografia citada.
Procedimientos generales de EM-CG, EM-LC, EM-AR, HPLC y cromatografía sobre gel Procedimiento 1 (EM-AR-TOF): Se recogen los espectros EM-AR-TOF-ESI+ con un aparato Mícromass LCT (tensión capilar: 3,2 kV, tensión de cono: 42 V, temperatura de fuente: 120°C, temperatura de desolvatación: 280°C). Para ello, se usa una bomba de inyección (compañía Harvard Apparatus) para la alimentación de muestra. Como patrón sirve leucina-encefalina (Tyr- Gly-Gly-Phe-Leu). Procedimiento 2 (HPLC preparativa): aparato: HPLC Gilson Abimed; detector UV a 210 nm; sistema binario de bomba; columna: Waters Symmetry-Prep™ C18, 7 µm, 300 x 19 mm; eluyente A:
0,2% de acido tpfluoroacético en agua, eluyente B acetonitplo, caudal 25 ml/mín, temperatura de columna TA, 0 min 20% de B, pendiente de 0-10 mm 70% de B, pendiente de 10-10,1 min 20% de B, 15 min 20% de B Procedimiento 3 (cromatografía sobre gel en Sephadex LH-20): La cromatografía sobre gel se lleva a cabo sin presión en Sephadex LH-20 (compañía Pharmacia) Se fracciona según la actividad UV (detector UV para 254 nm, compañía Knauer) (recolector de fracciones ISCO Foxy 200) Dimensiones de columna 32 x 7 cm (escala 1000-100 µmol), 30 x 4 cm (escala 100-10 µmol), 25 x 2 cm (escala 10-1 µmol) A las escalas 1 mmol a 11 mmol se usa una columna de dimensión 80 x 30 cm En este caso, las fracciones se reúnen manualmente y sin detector de UV preconectado La asignación de las fracciones se realiza mediante HPLC (procedimiento 9) Procedimiento 4 (HPLC preparativa; Kromasil, ácido acético): aparato HPLC Gilson Abimed, detector UV a 210 nm, sistema binario de bomba, columna Kromas?l-100A C18, 5 µm, 250 x 20 mm, flujo 25 ml/mín, eluyente A agua/0,25-0,5% de ácido acético, eluyente B acetonitnlo, gradiente 0-3 min 5% de B, 3-30 min 5-100% de B, 30-38 min 100% de B, a continuación regeneración de la columna cromatográfica Procedimiento 5 (EM-LC): Instrumento Micromass Quattro LCZ con HPLC Agilent Sene 1100, columna Phenomenex Synergí 2µ Hydro-RP Mercury 20 mm x 4 mm, eluyente A 1 I de agua + 0,5 ml de ácido fórmico al 50%, eluyente B 1 I de acetonitnlo + 0,5 ml de ácido fórmico al 50%, gradiente 0,0 min 90% de A -» 2,5 min 30% de A -» 3,0 mm 5% de A -> 4,5 min 5% de A, flujo 0,0 min 1 ml/mín, 2,5 m?n/3,0 m?n/4,5 min 2 ml/mm, estufa 50°C, detección UV 208- 400 nm Procedimiento 6 (EM-LC): tipo de aparato de EM Micromass ZQ, tipo de aparato de HPLC Waters Alliance 2795, columna Phenomenex Synergí 2µ Hydro-RP Mercury 20 mm x 4 mm, eluyente A 1 I de agua + 0,5 ml de ácido fórmico al 50%, eluyente B 1 I de acetonitplo + 0,5 ml de ácido fórmico al 50%, gradiente 0,0 min 90% de A -» 2,5 min 30% de A - 3,0 min 5% de A -> 4,5 min 5% de A, flujo 0,0 min 1 ml/mín, 2,5 m?n/3,0 m?n/4,5 min 2 ml/mín, estufa 50°C, detección UV 210 nm Procedimiento 7 (EM-LC): tipo de aparato de EM Micromass ZQ, tipo de aparato de HPLC HP 1100 Senes, UV DAD, columna Phenomenex Synergí 2µ Hydro-RP Mercury 20 mm x 4 mm,
eluyente A: 1 I de agua + 0,5 ml de ácido fórmico al 50%, eluyente B: 1 I de acetonitrilo + 0,5 ml de ácido fórmico al 50%; gradiente: 0,0 min 90% de A -> 2,5 min 30% de A -» 3,0 min 5% de A -> 4,5 min 5% de A; flujo: 0,0 min 1 ml/min, 2,5 min/3,0 min/4,5 min. 2 ml/min; estufa: 50°C; detección UV:
210 nm. Procedimiento 8 (HPLC analítica): tipo de aparato de HPLC: HP 1050 Series; UV DAD 1100
Series; columna: Kromasil C18, 60 x 2 mm, 3,5 µm; eluyente A: agua/0,5% de ácido perclórico, eluyente B: acetonitrilo; gradiente: 0-0,5 min 2% de B, 0,5-4,5 min 2-90% de B, 4,5-9,0 min 90% de B, 9,0-9,2 min 90-2% de B, 9,2-10,0 min 2% de B; flujo: 0,75 ml/min, estufa: 30°C, detección
UV a 210 nm. Procedimiento 9 (HPLC analítica, Agilent Zorbax C8): aparato: Agilent 1100 con DAD (G1315B), bomba binaria (G1312A), automuestreador (G1313A), desgasificador de disolvente (G1379A) y termostato de columna (G1316A); columna: Agílent Zorbax Eclipse XDB-C8 4,6 x 150 x 5 mm; eluyente A: 0,05% de ácido perclórico al 70% en agua; eluyente B: acetonitrilo; gradiente: 0-1 min
10% de B, pendiente, 4-5 mip 90% de B, pendiente, 5,5 min 10% de B; flujo: 2,00 ml/min; temperatura de columna: 30°C. Procedimiento 10 (cromatografía sobre gel en Sephadex LH-20): Se lleva a cabo la cromatografía sobre gel en Sephadex LH-20 (compañía Pharmacia). Se fracciona según la actividad UV (detector UV para 254 nm, compañía Knauer) (recolector de fracciones ISCO Foxy 200). Dimensiones de columna: 32 x 7 cm (escala 1000-100 µmol); 30 x 4 cm (escala 100- 10 µmol); 25 x 2 cm (escala 10-1 µmol). Procedimiento 11 (HPLC preparativa Symmetry): aparato: HPLC Gilson Abimed; sistema binario de bomba: SymmetryPrep™C18, compañía Waters, 7 µm; 300 mm x 19 mm; eluyente A: agua/0,2% de ácido trifluoroacétíco, eluyente B: acetonítrilo; gradiente: 0-10 min 15-65% de B, a continuación regeneración de la columna cromatográfica; flujo: 25 ml/min; detección UV a 210 nm. Procedimiento 12 (HPLC preparativa Kromasil): aparato: HPLC Gílson Abimed; sistema binario de bomba; columna: Kromasil C18, 5 µm, 100 A, 250 x 20 mm; eluyente A: 0,05% de ácido trifluoroacético en agua, eluyente B: 0,05% de ácido trifluoroacético en acetonitrilo; gradiente: 0- 3 min 10% de B, pendiente, 30-38 min 90% de B, 38-45 min 10% de B; flujo: 20 ml/min; detección
UV a 210 nm. Procedimiento 13 (HPLC preparativa Waters Symmetry): aparato: HPLC Gilson Abimed; sistema binario de bomba; columna: Waters Symmetry-Prep™ C18, 7 µm, 300 x 19 mm; eluyente A: 0,05% de ácido trifluoroacético en agua, eluyente B: 0,05% de ácido trifluoroacético en acetonitrilo; gradiente: 0-3 min 10% de B, pendiente, 30-38 min 90% de B, 38-45 min 10% de B; flujo: 20 ml/min; detección UV a 210 nm. Procedimiento 14 (HPLC preparativa): aparato: HPLC Gilson Abimed; sistema binario de bomba; columna: Waters Symmetry-Prep™ C18, 7 µm, 300 x 19 mm; eluyente A: agua/0,2% de ácido trifluoroacético, eluyente B: acetonitrilo; gradiente: 0-10 min 25-65% de B, a continuación regeneración de la columna cromatográfica; flujo: 25 ml/min; detección UV a 210 nm. Procedimiento 15 (HPLC quiral Daicel Chiralpak): HPLC Agilent 1100; columna: Daicel Chiralpak AD-H 5 µm; 250 x 20 mm; isocrático: 75% de /'so-hexano, 25% de 2-propanol con 0,2% de ácido trifluoroacético y 1% de agua; flujo: 1 ,0 ml/min; estufa: 25°C; detector UV a 212 nm. Procedimiento 16 (HPLC preparativa): aparato: HPLC Gilson Abimed; sistema binario de bomba; columna: YMC ODS-AQ 5 µm, 250 x 30 mm; eluyente A: 0,05% de ácido trifluorocético en agua, eluyente B: 0,05% de ácido trifluoroacético en acetonitrilo; gradiente: 0-3 min 10% de B, pendiente, 30-38 min 90% de B, 38-45 min 10% de B; flujo: 50 ml/min; detector UV a 210 nm. Procedimiento 17 (EM-CG): Instrumento: Mícromass GCT, GC6890; columna: Restek RTX-35MS, 30 m x 250 µm x 0.25 µm; gradiente: 60°C (mantener 0,30 min), 50°C/min ? 120°C, 16°C/min ? 250°C, 30°C/min ? 300°C (mantener 1 J min); flujo constante con helio: 0,88 ml/min; estufa: 60°C; entrada: 250°C. Procedimiento 18 (HPLC): tipo de aparato HPLC: HP 1100 Series; columna UV DAD: Zorbax Eclipse XBD-C8 (Agilent), 150 mm x 4,6 mm, 5 µm; eluyente A: 5 ml HCI04/l agua, eluyente B: acetonitrilo; gradiente: 0-1 min 10% de B, 1-4 mín 10-90% de B, 4-5 min 90% de B; flujo: 2,0 ml/min; estufa: 30°C; detección UV: 210 y 254 nm. Procedimiento 19 (HPLC): columna: Kromasil RP-18, 60 mm x 2 mm, 3,5 µm; eluyente A: 5 ml HCIO4/I agua, eluyente B: acetonitrílo; gradiente: 0 mín 2% de B, 0,5 mín 2% de B, 4,5 min 90% de B, 9 min 90% de B; flujo: 0J5 ml/min; estufa: 30°C; detección UV: 210 nm.
Procedimiento 20 (HPLC): columna: Kromasil RP-18, 250 mm x 4 mm, 5 µm; eluyente A: 5 ml HCIO4/I agua, eluyente B: acetonitrilo; gradiente: 0 min 5% de B, 10 min 95% de B; flujo: 1 ml/min; estufa: 40°C; detección UV: 210 nm. Procedimiento 21 (HPLC): columna: Kromasíl RP-18, 250 mm x 4 mm, 5 µm; eluyente A: 2 ml HCIO4/I agua, eluyente B: acetonitrilo; ¡socrático: 45% de B, 55% de A; flujo: 1 ml/min; estufa: 40°C; detección UV: 210 nm. Procedimiento 22 (EM-LC): tipo de aparato de EM: Micromass ZQ; tipo de aparato de HPLC: HP 1100 Series; UV DAD; columna: Grom-Sil 120 ODS-4 HE 50 x 2 mm, 3,0 µm; eluyente A: agua/0,025% de ácido fórmico/l, eluyente B: acetonítrilo/0,025% de ácido fórmico; gradiente: 0-2,9 min 0-70% de B, 2,9-3,1 min 70-90% de B, 3,1-4,5 min 70-90% de B; estufa: 50°C, flujo: 0,8 ml/min, detección UV: 210 nm. Procedimiento 23 (HPLC): tipo de aparato de HPLC: HP 1050 Series; UV DAD 1100 Series; columna SymmetryPrep™C 8, compañía Waters, 50 x 2,1 mm, 3,5 µm; eluyente A: agua/0,05% de ácido trifluoroacético, eluyente B: acetonitrilo; gradiente: 0-9 mín 0-100% de B, 9-11 min 100% de B, 11-12 min 100-0% de B, a continuación regeneración de la columna cromatográfica; estufa: 40°C, flujo: 0,4 ml/min, detección UV: 210 nm. Procedimiento 24 (espectroscopia 19F-RMN cuantitativa): Se disuelven aproximadamente 10 mg pesados exactamente de sustancia de muestra y aproximadamente 20 mg pesados exactamente de 1 ,4-dibromotetrafluorobenceno en piridina, y se mide espectroscópicamente la 19F- RMN. Se integran y comparan d - 74 (TFA) y -132,0 (1 ,4-dibromotetrafluorbenceno). El contenido de TFA se da en % de TFA de la masa de sustancia de muestra. Procedimiento 25 (cromatografía iónica): Sistema de cromatografía iónica con sistema supresor y detector de conductividad; precolumna: A SUPP 4/5 Guard, columna de separación: A SUPP 5 4,0 x 250 mm; eluyente: carbonato de sodio 3,2 mM e hidrogenocarbonato de sodio 2,4 mM en agua; flujo: 0,7 ml/min. Se disuelve la muestra en metanol (20% del volumen de muestra final), se trata con baño de ultrasonidos durante 3 minutos y se rellena con agua. Se filtra la muestra a través de un filtro de acetato de celulosa exento de iones (poro 0,45 µm) y se inyecta. Cuantificación frente a patrones externos (0,5 mg/l - 10 mg/l).
Compuestos de partida Eiemplo 1A Bistrifluoroacetato de D-leucil-?/'-{(3S,6S, 12S, 15S, 18R,21 S,24S,27S,28R)-6-[( 1 S)-2-amino-1 -h¡droxi-2-oxoetil]-18-(3-{[amino(imino)metil]amino}propil)-12-[(1S)-1-hidroxietil]-3-(hidroximetil)-24-[( 1 R)-1 -hidroxi-2-metílpropil]-21 -ísobutil-15-[(1 S)-1 -metilpropílj-2,5,8, 11 ,14,17,20,23,26-nonaoxo-28-fenil-1 -oxa-4J, 10, 13, 16, 19,22,25-octaazaciclooctacosan-27-il}-L-leucinamida (lisobactina)
Fermentación: Medio de cultivo: YM: agar de levadura-malta: D-glucosa (4 g/l), extracto de levadura (4 g/l), extracto de malta (10 g/l), 1 litro de agua Lewatit. Antes de la esterilización (20 minutos a 121°C), se ajusta el pH a 7,2.
HPM: manita (5,4 g/l), extracto de levadura (5 g/l), peptona cárnica (3 g/l). Conserva de trabajo: la cepa liofilizada (ATCC 53042) se dispone en 50 ml de medio YM. Fermentación en matraz: Se inoculan 150 ml de medio YM o 100 ml de medio HPM en un matraz
Erlenmeyer de 1 I con 2 ml de la conserva de trabajo, y se deja crecer durante 30-48 horas a 28°C en un agitador a 240 rpm.
Fermentación en 30 I: Se utilizan 300 ml de la fermentación en matraz (medio HPM) para inoculación en 30 I de una solución de medio nutriente estéril (1 ml de antiespumante SAG 5693/I). Se deja crecer este cultivo durante 21 horas a 28°C a 300 rpm y una ventilación con aire estéril de 0,3 vvm. Se mantiene constante el pH con ácido clorhídrico 1 M a pH = 7,2. En total, se alimentan durante el tiempo de cultivo 880 ml de ácido clorhídrico 1 M. Cultivo principal (200 L): Se inoculan 15 x 150 ml de medio YM en matraces Erlenmeyer de 1 I con 2 ml de conserva de trabajo, y se dejan crecer a 28°C durante 48 horas y a 240 rpm en agitador. Se utilizan 2250 ml de este cultivo para inoculación en 200 I de una solución de medio nutriente estéril (YM) (1 ml de antiespumante SAG 5693/I) y se deja crecer durante 18,5 horas a 28°C, 150 rpm y una ventilación con aire estéril de 0,3 vvm. Para el control del desarrollo de la fermentación, se toman muestras cada hora (50 ml). Se mezclan 2 ml de este caldo de cultivo con 1 ml de metanol (0,5% de ácido trifluoroacético) y se filtran a través de un filtro de 0,45 µm. Se analizan 30 µl de esta suspensión mediante HPLC (procedimiento 18 y procedimiento 19). Después de 18,5 horas, se separa el caldo de cultivo del cultivo ppncipal a 17.000 rpm en sobrenadante y sedimento. Aislamiento: Se ajusta el sobrenadante (183 I) con ácido trifluoroacético concentrado o lejía de sosa a pH 6,5-7, y se aplica sobre una columna Lewapol (OC 1064, 60 I de contenido). A continuación, se eluye con agua pura, agua/metanol 1 :1 y a continuación con metanol puro (con 0,1 % de ácido trifluoroacético). Se concentra esta fase orgánica a vacío hasta un resto acuoso restante de 11 ,5 1.
Se une la fase acuosa restante a gel de sílice C18 y se separa (MPLC, Biotage Flash 75, 75 x 30 cm, KP-C18-WP, 15-20 µm, flujo: 30 ml; eluyente: acetonitrilo/agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; gradiente: 10%, 15% y 40% de acetonitrilo). La fase de 40% de acetonitrilo, que contiene la cantidad principal de ejemplo 1A, se concentra a vacío y a continuación se liofiliza (aprox. 13 g). Se separa esta mezcla sólida en porciones de 1 ,2 g en primer lugar en una HPLC preparativa (procedimiento 7), a continuación mediante filtración en gel en Sephadex LH-20 (5 x 70 cm, acetonitrílo/agua 1 :1 , respectivamente con 0,05% de ácido trifluoroacético) y una HPLC
preparativa adicional (procedimiento 20). Este procedimiento proporciona 2250 mg del ejemplo 1A. Se recoge el sedimento en 4 I de acetona/agua 4:1 , se mezcla con 2 kg de Celite, se ajusta a pH= 6 con ácido trifluoroacético, se agita y se centrifuga. Se concentra el disolvente a vacío y se liofiliza el residuo. Se recoge el liofilizado obtenido (89,9 g) en metanol, se separa por filtración, se concentra y se separa en gel de sílice (procedimiento 21 ). Se purifica después el ejemplo 1A mediante filtración en gel (Sephadex LH-20, 5 x 68 cm, agua/acetonitrilo 9:1 (con 0,05% de ácido trifluoroacético), flujo: 2J ml/min, tamaño de fracción: 13,5 ml) hasta una sustancia pura. Este procedimiento proporciona 447 mg del ejemplo 1A. HPLC (procedimiento 18): TR = 6,19 min EM (ESlpos): m/z = 1277 (M+H)+ 1H-RMN (500,13 MHz, d6-DMSO): d = 0,75 (d, 3H), 0,78 (d, 6H), 0,80 (t, 3H), 0,82 (d, 3H), 0,90 (d, 3H), 0,91 (d, 3H), 0,92 (d, 3H), 0,95 (d, 3H), 0,96 (d, 3H), 1 ,05 (m, 1H), 1 ,19 (d, 3H), 1 ,25 (m, 2H), 1 ,50 (m, 4H), 1 ,51 (m, 2H), 1 ,55 (m, 1 H), 1 ,61 (m, 1 H), 1 ,65 (m, 1H), 1 ,84 (m, 1H), 1 ,85 (m, 1H), 1 ,86 (m, 1 H), 1 ,89 (m, 1 H), 1 ,95 (m, 1 H), 2,75 (m, 2H), 3,40 (m, 1 H), 3,52 (m, 2H), 3,53 (dd, 1H), 3,64 (m, 2H), 3,66 (m, 1H), 3,68 (dd, 1H), 3J3 (m, 2H), 4,00 (dd, 1 H), 4,02 (a, 1H), 4.13 (a, 1 H), 4,32 (dd, 1H), 4,39 (t, 1 H), 4,55 (m, 1 H), 4,75 (dd, 1 H), 5,19 (t, 1 H), 5,29 (d, 1H), 5,30 (a, 1H), 5,58 (m, 2H), 6,68 (m, 3H), 6,89 (d, 1H), 6,93 (m, 3H), 6,94 (a, 1 H), 6,98 (d, 1H), 7,12 (a, 1H), 7,20 (a, 2H), 7,23 (m, 2H), 7,42 (m, 2H), 7,54 (d, 1H), 7,58 (d, 1H), 8,32 (a, 1H), 9,18 (a, 1H), 9,20 (m, 2H), 9,50 (a, 1 H). 13C-RMN (125,77 MHz, d6-DMSO): d = 10,3, 15,3, 19,0, 19,2, 19,6, 20,0, 20,9, 22,0, 22,4, 23,0, 23,2, 24,3, 24,4, 25,0, 25,4, 26,0, 27,8, 30,9, 35,4, 39,5, 40,8, 40,9, 41 ,6, 44,1 , 51 ,5, 52,7, 55,9, 56,2, 56,4, 57,9, 58,8, 60,2, 61 ,1 , 62,6, 70,1 , 71 ,6, 71 J, 75,5, 128,1 , 128,6, 136,7, 156,8, 168,2, 170,1 , 170,4, 171 ,2, 171 ,5, 171 ,9, 172,2, 172,4, 173,7. La asignación de las señales se realizó según la asignación descrita en la bibliografía (T.
Kato, H. Hinoo, Y. Terui, J. Antibiot.. 1988, 61, 719-725).
Eiemplo 2A Bis-trifluoroacetato de des-(1-D-leucíl-2-L-leucil)lisobactina (producto de degradación de Edman 2.'0 ),
or y i
H\
Se disuelve bistrifluoroacetato de lísobactina (60,0 g, 39,88 mmol) en piridina (840 ml) en atmósfera de argón. Después, se añade isotiocíanato de fenilo (32,35 g, 239,28 mmol, 6 equivalentes) y se agita la mezcla de reacción a 37°C durante 7 h. A continuación, se separa por destilación el disolvente en rotavapor a 40°C de temperatura de baño. Se mezcla el residuo con metil-íerc-butiléter (1400 ml) y se agita fuertemente durante 30 mín. Después, se separa por filtración con succión a través de una frita de vidrio (porosidad 3, diámetro 13 cm). Se aisla el producto intermedio (producto de degradación de Edman0,5) con un rendimiento bruto de 72 g y se hace reaccionar sin procesamiento. Para ello, se disuelve el producto bruto en ácido trifluoroacético (1026 ml) en atmósfera de argón y se agita durante 30 min a TA. Después, se concentra la solución en rotavapor a vacío a 20°C de temperatura de baño Se recoge el residuo con metíl-ferc-butiléter (1400 ml) y se agita fuertemente hasta que se forma un sólido amorfo en forma de polvo. Se separa éste por filtración a vacío a través de una frita (porosidad 3, diámetro 18 cm). Se agita el sólido entonces con dietiléter (1400 ml) y se separa de nuevo por filtración. Se repite este procedimiento con 2 porciones de
diclorometano (de 900 ml cada una). Se seca el producto bruto a vacío. Se obtienen 58 g de bistrifluoroacetato de des-(1-D-leucil)lisobactina bruto (producto de degradación de Edman1'0). Se disuelve el producto bruto sin purificación adicional en piridina (1080 ml) en atmósfera de argón. Después, se añade isotiocianato de fenilo (107 g, 0,80 mol, 20 equivalentes) y se agita la 5 mezcla de reacción a 37 a 40°C durante 7 horas. A continuación, se separa por destilación el disolvente en rotavapor a 40°C de temperatura de baño. Se mezcla el residuo con metil-ferc- butiléter (1400 ml) y se agita fuertemente. Después, se separa por filtración con succión a través de una frita de vidrio (porosidad 3, diámetro 13 cm). Se aisla el producto intermedio (producto de degradación de Edman''5) con un rendimiento bruto de 65 g y, después del secado a vacío en .10 bomba de aceite, se disuelve directamente en atmósfera de argón en ácido trifluoroacético (1240 ml) y se agita durante 30 min a TA. Después, se concentra la solución en rotavapor a vacío a 20°C de temperatura de baño. Se recoge el residuo con metil-.erc-butiléter (1400 ml) y se agita hasta que se forma un sólido amorfo en forma de polvo. Se separa éste por filtración a vacío a través de una frita (porosidad 3, diámetro 18 cm). Se agita entonces en primer lugar el sólido con 115 dietiléter (1400 ml), después con diclorometano (1400 ml), y se separa por filtración respectivamente. Se obtienen 55 g del producto bruto. Se purifica éste mediante HPLC preparativa (procedimiento 14). Se obtienen 28,55 g (56% d. t.) del compuesto del título. HPLC/UV-Vis (procedimiento 23): TR = 4,71 min, ?max (cualitativo) = 220 nm (s), 255-270 (d). ¿0 EM-CL(procedimiento 22): TR = 1 ,65 min; EM (ESlpos.): m/z (%) = 526 (100) [M + 2H]2+, 1051 (15) [M + H]+.
Eiemplo 3A Éster metílico del ácido (2Z)-2-{[(benciloxi)carbonil]amino}-3-(6-trifluorometilpiridin-3-il)acrílico
Se disuelven en THF (70 ml) 6-trifluorometilpiridin-3-carbaldehído (4,85 g, 27,70 mmol) y {[(benciloxi)carbonil]amino}(dimetoxifosforíl)acetato de metilo (9,17 g, 27,70 mmol, 1 ,0 equivalentes) y se enfría a -70°C. Se añade lentamente gota a gota a -70°C N,N,N,N-tetrametilguanidina (6,38 g, 55,39 mmol, 6,95 ml, 2,0 equivalentes) y después se agita durante 4 h a -70°C, a continuación durante 12 h a TA. Se concentra la mezcla de reacción, después se agita con acetato de etilo (2 x 100 ml) frente a agua, se lavan las fases orgánicas combinadas con una solución saturada de sal común y se secan sobre sulfato de sodio. Después de concentración a vacío, se purifica por cromatografía el producto bruto (gel de sílice, eluyente: tolueno, después tolueno/acetato de etilo 10:1 ). Se obtienen 6,93 g (66% d. t.) del compuesto del título. HPLC/UV-Vís (procedimiento 8): TR = 4,60 min. HPLC/UV-Vis (procedimiento 9): TR = 4,54 min. 1H-RMN (400 MHz, de-DMSO): d = 3 ,74 (s, 3H, OMe), 5,10 (s, 2H, CH2), 7,27 (s, 1 H, PirH), 7,33-7,38 (m, 5H, ArH), 7,94 (d, J = 8,5 Hz, 1 H, PirH), 8,27 (d, J = 8,5 Hz, 1 H, PirH), 8,93 (s, 1 H, ß-CH), 9,51 (s, 1H, NH). EM-CL(procedimiento 7): TR = 2,44 min; EM (ESlpos.): m/z (%) = 381 (100) [M + H]*; EM (ESlneg.): m/z (%) = 379 (100) [M - H]~. EM-AR-TOF (procedimiento 1): C18H16N204F3[M + H]+ cale. 381 ,1062, ene. 381 ,1065.
Eiemplo 4A Éster metílico de ?/-[(benciloxi)carbon¡l]-3-(6-trifluorometilpiridin-3-il)-L-alan¡na
Se disuelve el compuesto del ejemplo 3A (10,15 g, 26,69 mmol) en metanol p.a. (100 ml). Se hace pasar argón con una cánula durante aproximadamente 5 min, después se añade triflato de (+H ,2-bis-[(2S,5S)d¡etilfosfolano]benceno(ciclooctad¡en)rod¡o (') (289 mg, 400 µmol, 0,015 equivalentes) Se hidrogena durante 12 h a 400 kPa de presión de hidrógeno y a TA. Después, se filtra a través de tierra de diatomeas (metanol) y se concentra el eluido. Se purifica por cromatografía el producto bruto (gel de sílice, eluyente: tolueno/acetato de etilo 5:1). Se obtienen 9,9 g (97% d. t.) del compuesto del título. [a]2tVia = -24° (c = 0,093 en metanol). HPLC/UV-Vis (procedimiento 8): TR = 4,50 min. HPLC/UV-Vis (procedimiento 9): TR = 4,49 min. 'H-RMN (400 MHz, aVDMSO): d = 2,99 (dd, J = 3,5, 11 ,0 Hz, 1H, ß-CH), 3,22 (dd, J = 3,5, 11 ,0 Hz, 1 H, ß-CH), 3,66 (s, 3H, OMe), 4,40 (m, 1H, a-CH), 4,97 (s, 2H, CH2), 7,23 (m, 2H), 7,29-7,33 (m, 3H), 7,83 (d, J = 6,5 Hz, 1H), 7,93-7,98 (m, 2H), 8,65 (s, 1H, NH). EM-CL(procedimiento 7): TR = 2,40 min; EM (ESlpos.): m/z (%) = 383 (100) [M + H]+; EM (ESlneg.): m/z (%) = 273 (100), 381 (50) [M - H]~. EM-AR-TOF (procedimiento 1 ): Cl8H18N204F3 [M + H]+ cale. 383,1219, ene. 383,1223.
Eiemplo 5A Éster metílico de 3-(6-trifluorometilpíridin-3-¡l)-L-alanina
1 1
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Se disuelve el compuesto del ejemplo 4A (9,90 g, 25,89 mmol) en metanol (100 ml). Se hace pasai argón con una cánula durante aproximadamente 5 min, después se añade Pd sobre carbono (al 10%, 990 mg). Se hidrogena durante 12 h a 400 kPa de presión de hidrógeno y TA. Después, se filtra a través de tierra de diatomeas, se concentra y se seca a vacío de bomba de aceite. Rendimiento: 5,8 g (90% d. t.) del compuesto. [a]19,9Na = +3° (c = 0,186 en metanol). HPLC/UV-Vis (procedimiento 8): TR = 3,34 min. HPLC/UV-Vis (procedimiento 9): TR = 3,22 min. IR vmax (NaCI, cm"1): 3415, 1734, 1339, 1136, 1087. H-RMN (500 MHz, dg-DMSO): d = 2,85 (dd, J = 5,5, 13,5 Hz, 1H, ß-CH), 3,01 (dd, J = 5,5, 13,5 Hz, 1 H, ß-CH), 3,61 (s, 3H, OMe), 3,63-3,69 (m, 1H, a-CH), 7,82 (d, J = 7,5 Hz, 1 H), 7,93 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 8,61 (s, 1H). EM-CL(procedimíento 7): TR = 1 J4 min; EM (ESlpos.): m/z (%) = 249 (100) [M + H]+. EM-AR-TOF (procedimiento 1): C^H^NsO^ [M + CH3CN + H]+ cale. 290,1116, ene. 290,1122.
Eiemplo 6A Éster metílico de ?/-(ferc-butoxicarbonil)-3-(ferc-but¡l)-D-alanil-3-(6-trifluorometilp¡rid¡n-3-il)-L-alanina
m 70 77J
i o
Se añaden lentamente a -30°C ?/-metilmorfolina (12,92 g, 14,04 mmol, 5 equivalentes) y
HATU (9J1 g, 25,54 mmol, 1 equivalente) a una solución del compuesto del ejemplo 5A (6,34 g, 25,54 mmol) y ?/-(íerc-butoxicarboníl)-3-ferc-butil-D-alanina (6,27 g, 25,54 mmol, 1 ,0 equivalente) en DMF secada (240 ml). Se calienta lentamente la mezcla de reacción (aprox. 3 h) a TA, observándose una reacción completa mediante HPLC (procedimiento 9). Se añade dihídrogenofosfato de potasio (34,76 g, 255,44 mmol, 10 equivalentes) y se agita la mezcla de reacción durante 20 min, a continuación se filtra, se diluye con acetato de etilo y se lava con una solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato de sodio (10 ml). Se seca la fase orgánica mediante sulfato de sodio, se filtra y se concentra. Se purifica el producto bruto mediante cromatografía ultrarrápida (gel de sílice, gradiente de ciciohexano/acetato de etilo 10:1 a 2:1 ), obteniéndose 9J4 g (73% d. t.) del compuesto del título. [ ]19'9Na = +7,0° (c = 0,044 en metanol). HPLC/UV-Vís (procedimiento 8): TR = 4,89 mín. HPLC/UV-Vís (procedimiento 9): TR = 4,75 min. IR vmax (NaCI, cm"1): 2959, 1742, 1655, 1520, 1336, 1160, 1 136, 1087, 1050, 1027. 1H-RMN (500 MHz, 6-DMSO): d = 0,74 (s, 9H, tBu), 0,97-1 ,00 (m, 1 H, 3-CH2), 1 ,20-1 ,25
(m, 1H, /3-CH2), 1 ,35 (s, 9H, OtBu), 2,99-3,05 (m, 1 H, /3-CH2), 3,23-3,26 (m, 1 H, ¿8-CH2), 3,66 (s, 3H, OMe), 3,94 (m, 1 H, ar-CH), 4,60 (m, 1 H, s-CH), 6,82 (d, J = 8,5 Hz, 1 H, NH), 7J8 (d, J = 8,0 Hz, 1 H, PirH), 7,94 (d, j = 8,0 Hz, 1 H, PirH), 8,34 (d, J = 8,5 Hz, 1 H, NH), 8,64 (s, 1 H, PirH).
EM-CL(procedimiento 7): TR = 2,67 min; EM (ESlpos.): m/z (%) = 476 (100), [M + H]+; EM (ESlneg.): m/z (%) = 400 (80), 474 (40) [M - H]". EM-AR-TOF (procedimiento 1 ): C22H33N3O5F3 [M + H]+ cale. 476,2372, ene. 476,2364.
Eiemplo 7A ?/-ferc-Butoxicarbonil-3-íerc-butil-D-alanil-3-(6-trifluorometilpiridín-3-il)-L-alanina
Se añade a -20°C una solución de hidróxido de litio hidratado (1 ,16 g, 2,5 equivalentes, 48,37 mmol) en agua (20 ml) a una solución del compuesto del ejemplo 6A (9,2 g, 1 ,0 equivalentes, 19,35 mmol) en THF (360 ml) y agua (100 ml). Se calienta la mezcla de reacción (aprox. 1 ,5 h) a +15°C, observándose una reacción completa mediante HPLC (procedimiento 9). Para el procesamiento, se añade dihidrogenofosfato de potasio (26,33 g, 10 equivalentes, 193,5 mmol) (aprox. pH 7). Se filtra la mezcla de reacción y se concentra a vacío. Se purifica el producto bruto mediante cromatografía sobre gel (procedimiento 10, fase móvil metanol/acetona 4:1), obteniéndose 4J2 g (53% d. t.) de producto. [ ]20Na = +51 ,3° (c = 0,402 en metanol). HPLC/UV-Vis (procedimiento 8): TR = 4,63 min. HPLC/UV-Vis (procedimiento 9): TR = 4,55 min. IR vmax (NaCI, cm"1): 3305, 2959, 1663, 1519, 1336, 1173, 1134, 1086. 1H-RMN (500 MHz, d6-DMSO): d = 0,77 (s, 9H, tBu), 1 ,06-1 ,13 (m, 1H, ]S-CH2), 1 ,23-1 ,26 (m, 1H, /8-CH2), 1 ,34 (s, 9H, OtBu), 3,01 (tap, J = 11,0 Hz, 1H, ß-C 2), 3,23 (d a, J = 11 ,0 Hz, 1H,
3-CH2), 3,94 (t, J = 8,0 Hz, 1 H, or-CH), 4,42 (s a, 1 H, ar-CH), 6,90 (d, J = 8,5 Hz, 1H, NH), 7,74 (d, J = 7,5 Hz, 1H, PirH), 7,86 (d, J = 7,5 Hz, 1H, PirH), 8,00 (s a, 1H, NH), 8,56 (s, 1H, PirH) EM-CL(proced?m?ento 7) TR = 2,42 min, EM (ESlpos ) m/z (%) = 406 (100), 462 (85) [M + Hf, EM (ESlneg ) m/z (%) = 460 (100) [M - H]" EM-AR-TOF (procedimiento 1) C2?H31N3?5F3 [M + Hf cale 462,2216, ene 462,2203
Eiemplo 8A Tpfluoroacetato de ?/-ferc-butox?carbon?l-3-rerc-but?l-D-alan?l-3-(6-tpfluoromet?lp?pd?n-3-?l)-L-alan?l-des-(1-D-leuc?l-2-L-leuc?l)l?sobact?na
,
. í , C H
OF \ t~¡ C H
C M ' '7 N
K
Se añaden lentamente a -30°C ?/-met?lmorfol?na (2J7 g, 3,01 ml, 5 equivalentes, 27,38 mmol) y HATU (4,37 g, 2,1 equivalentes, 11 ,50 mmol) a una solución del compuesto del ejemplo 2 A (7,00 g, 1 ,0 equivalentes, 5,48 mmol) y el ejemplo 7A (3,03 g, 1 ,2 equivalentes, 6,57 mmol) en DMF secada (119 ml) Se calienta lentamente la mezcla de reacción (aprox 1 h) a TA, observándose una reacción completa mediante HPLC/UV-Vis (procedimiento 9). Se inactiva la reacción con dihidrogenofosfato de potasio (7,45 g, 10,0 equivalentes, 54,76 mmol) Se purifica la
mezcla de reacción mediante cromatografía sobre gel (procedimiento 10, fase móvil metanol/acetona 4:1), obteniéndose 12,63 g (cuant.) de producto. HPLC/UV-Vís (procedimiento 8): TR = 4,78 min. HPLC/UV-Vis (procedimiento 9): TR = 4,35 min. EM-CL(procedimiento 7): TR = 2,28 min; EM (ESlpos.): m/z (%) = 697 (100) [M + 2H]2+,
1493 (15) [M + H]+; MS (ESlneg.): m/z (%) = 745 (100) [M - 2H]2", 1491 (5) [M - H]". EM-AR-TOF (procedimiento 1 ): C67H104N16O19F3 [M + H]+ cale. 1493,7616, ene. 1493,7594.
Eiemplo 9A y eiemplo 10A (2S)-?/-(íerc-Butoxicarbon¡l)-3-(trimetilsilil)alan¡na y (2R)-?/-(ferc-butoxicarbonil)-3- (trimetilsilil)alanina Se realiza la síntesis según M. Merget, K. Günther, M. Bernd, E. Günther, R. Tacke, JL Orqanomet. Chem. 2001 628, 183-194. Se realiza la separación de los enantiómeros mediante HPLC preparativa en fase quiral: HPLC Gilson Abimed; columna: Daicel Chiralpak AD-H 5 µm; 250 x 20 mm; eluyente A: /so-hexano, eluyente B: 0,2% de ácido acético /1% de agua/2-propanol; isocrático; flujo: 15 ml/min; detector UV a 212 nm. La asignación de los isómeros se realiza mediante HPLC comparativa con una muestra auténtica de ?/-(terc-butoxicarboníl)-L-3-trimetilsililalanina (compuesto 2R, Mercachem AMR 39.260).
Eiemplo 9A ?/-(íerc-Butoxicarbonil)-D-3-trimetilsililalanina (compuesto 2S)
HPLC quíral (procedimiento 15): TR = 4,16 min, e.e. > 99%.
20 [a.D = +1 ,1 (c = 0,83 en metanol).
Eiemplo 10A ?/-(ferc-Butox?carbonil)-L-3-trimetils?lilalanina (compuesto 2R)
HPLC quiral (procedimiento 15): TR = 9,27 min, e.e. > 99%. 20 MD = -1.6 (c = 0,66 en metanol).
Eiemplo 11 A ?/-(íerc-Butoxicarbon?l)-3-(p?ridin-3-¡l)-L-alan¡nato de metilo CH O
10
La preparación se realiza análogamente a B. Neises, W. Steglich, Orq. Synth. 1985, 63, 183-187. Se disuelve (2S)-?/-(ferc-butoxicarboníl)-3-(piridin-3-¡l)alanina (25,00 g, 93,88 mmol) en 300 ml de diclorometano en atmósfera de argón. Se añaden metanol (11 ,4 ml, 9,02 g, 281 mmol, 3 equivalentes) y un granulo de DMAP. Después, se enfría la mezcla a 0°C y se añade EDC (19,80 g, 103 mmol, 1 ,1 equivalentes). Después de 5 min, se separa el baño de hielo y se deja agitar durante 1 h a TA. Después, se concentra a vacío, se mezcla el residuo con acetato de etilo y se
estrae frente a una solución saturada de hidrogenocarbonato de sodio. Se vuelve a extraer la fase acuosa una vez con acetato de etilo, después se lavan las fases orgánicas combinadas con ácido cítrico 0,5 M y a continuación otra vez con una solución saturada de hidrogenocarbonato de sodio. Se seca la fase orgánica sobre sulfato de sodio, se filtra y se concentra a vacío. Queda un aceite transparente que cristaliza al secar a vacío de bomba de aceite. Rendimiento: 23,60 g (90% d.t.). HPLC/UV-Vis (procedimiento 9): TR = 3,28 min. EM-CL(procedimiento 7): TR= 1 ,21 min, EM (ESlpos.): m/z (%) = 281 (100) [M + H]+. 1H-RMN (400 MHz, d6-DMSO): d = 1 ,30 (s, 9H), 2,86 (m, 1H), 3,04 (m, 1H), 3,63 (s, 3H), 4,22 (m, 1 H), 7,28 - 7,39 (m, 2H), 7,69 (d, 1 H), 8,43 (m, 2H).
Eiemplo 12A Bístrifluoroacetato éster metílico de 3-(piridin-3-íl)-L-alanina
Se disuelve el compuesto del ejemplo 11 A (11 ,8 g, 42,09 mmol) en ácido trifluoroacético en diclorometano (160 ml; solución al 30%) y se agita durante 30 min a TA. Después, se concentra a vacío. Se recoge el residuo en algo de agua y se liofiliza. Después, se mezcla el liofilizado con tolueno y se concentra a vacío. Finalmente, se seca hasta peso constante a vacío de bomba de aceite. Rendimiento: 17,15 g (cuant.). HPLC/UV-Vis (procedimiento 9): TR = 0,88 min. EM-CL(procedimiento 7): TR = 0,46 min, EM (ESlpos.): m/z (%) = 181 (100) [M + H]+. 1H-RMN (400 MHz, de-DMSO): d = 2,79 (dd, 1 H), 2,92 (dd, 1 H), 3,60 (s, 3H), 3,63 (m, 1H), 7,30 (m, 1H), 7,62 (d, 1H), 8,41 (m, 2H).
Eiemplo 13A ?/-(rerc-Butox?carbon?l)-3-(tr?met?ls?l?l)-D-alan?l-3-(p?pd?n-3-?l)-L-alan?nato de metilo
Se disuelven a 0°C en DMF (186 ml) el compuesto del ejemplo 9A (10,31 g, 39,4 mmol) y el compuesto del ejemplo 12A (16,10 g, 39,4 mmol, 1 equivalente) Después, se añaden ?/-met?lmorfol?na (17,34 ml, 16,00 g, 4 equivalentes) y HATU (22,49 g, 59,16 mmol, 1 ,5 equivalentes) Se agita la preparación durante 2 horas a TA Se mezcla con íerc-butilmetiléter y se lava con una solución saturada de carbonato de sodio Se vuelve a extraer la fase acuosa una vez con íerc-butilmetiléter, después se lavan las fases orgánicas combinadas con ácido cítrico acuoso
1 M, así como de nuevo con una solución saturada de carbonato de sodio, se seca sobre sulfato de sodio, se filtra y se concentra a vacío Se filtra a través de gel de sílice (ciclohexano/acetato de etilo 2 1 ) Rendimiento. 14,1 g (84% d.t ) HPLC/UV-Vis (procedimiento 9)- TR = 3,91 mm EM-CL(proced?m?ento 7) TR = 1 ,90 mm, EM (ESlpos ) m/z (%) = 424 (100) [M + H]+ 1H-RMN (400 MHz, o" -DMSO)- d = -0,09 (s, 9H), 0,56 - 0,75 (m, 2H), 1 ,47 (s, 9H), 2,90 (dd, 1 H), 3,09 (dd, 1 H), 3,62 (s, 3H), 3,98 (m, 1H), 4,49 (m, 1 H), 6,68 (d, 1H), 7,26 (dd, 1H), 7,61 (m, 1H), 8,20 (d, 1H), 8,40 (m, 2H)
Eiemplo 14A ?/-(íerc-Butox?carbon?l)-3-(tr?met?ls?l?l)-D-alan?l-3-(p?r?d?n-3-?l)-L-alan?na
Se suspende el compuesto del ejemplo 13A (7,4 g, 17,56 mmol) en THF/agua (6:4), se enfría a 0°C y se mezcla con hidróxido de litio monohidratado (1 ,47 g, 35,13 mmol, 2 equivalentes).
Se deja agitar a 0°C. Después de 1 hora, se añade otro equivalente (0J4 g) de hídróxido de litio
. Q monohidratado (0J4 g) y se agita durante otra hora. Se separa por destilación la mayoría del THF a vacío, se lava con dos porciones de metil-ferc-butiléter y se ajusta después la fase acuosa a PH
4 mediante la adición de ácido cítrico. Precipita un sólido. Se extrae con tres porciones de acetato de etilo, disolviéndose el sólido. Se secan las fases orgánicas combinadas sobre sulfato de sodio, se filtran y se concentran. Se purifica el producto bruto mediante cromatografía de gel
^ (procedimiento 3, fase móvil: metanol). Rendimiento: 6,67 g (93% d. t.). HPLC/UV-Vis (procedimiento 9): TR = 3,73 min. EM-CL(procedimento 7): TR = 1 ,68 min, EM (ESlpos.): m/z (%) = 410 (40) [M + H]+. 1H-RMN (300 MHz, d6-DMSO): d = -0,090 (s, 9H), 0,56 - 0,75 (m, 2H), 1 ,35 (s, 9H), 2,90 (dd, 1 H), 3,09 (dd, 1 H), 3,98 (m, 1 H), 4,41 (m, 1 H), 6,70 (d, 1 H), 7,26 (dd, 1H), 7,60 (m, 1 H), 8,00 2 (d, 1H), 8,37 (m, 2H).
Eiemplo 15A Trifluoroacetato de ?/-(fercf-butoxicarboníl)-3-(trimetilsilil)-D-alanil-3-(p¡rid¡n-3-¡l)-L-alanil-des-(1-D- leucil-2-L-leucíl)l?sobactina
Se disuelven el compuesto del ejemplo 2A (3,00 g, 2,35 mmol) y el compuesto del ejemplo 14A (1 ,44 g, 3,52 mmol, 1 ,5 equivalentes) en DMF (50 ml) y se enfría a 0°C. Después, se añaden
15 en primer lugar 4,7 ml (4,7 mmol, 2 equivalentes) de una solución de 4-metilmorfolina 1 M en DMF. A continuación, se añade inmediatamente HATU (1 ,52 g, 3,99 mmol, 1 J equivalentes) y se agita durante 15 mín a 0°C. Después, se añaden gota a gota otros 4J mL (4J mmol, 2 equivalentes) de la solución de 4-metilmorfolina 1 M en DMF. Se agita la preparación después durante 2 h a TA. Se purifica el producto bruto mediante cromatografía sobre gel (procedimiento 3). Se hace reaccionar
20 más adelante el producto sin purificación fina. Rendimiento: 3,6 g (82% d. t.) HPLC (procedimiento 9): TR = 3,90 min. EM-CL(procedimiento 7): TR = 2,00 min, EM (ESlpos.): m/z (%) = 721 ,8 (100) [M + 2 H]2+; 1442,1 (5) [M + H]+. Procedimiento alternativo: Se disuelven en DMF (280 ml) el compuesto del ejemplo 2A (14,00 g,
25 10,95 mmol) y el compuesto del ejemplo 14A (5,38 g, 13,14 mmol, 1 ,2 equivalentes) en DMF (280 ml) y se enfría a -20°C. Después, se añaden ?/-metilmorfolina (5,54 g, 6,02 ml, 5 equivalentes) y a continuación HATU (6,66 g, 17,52 mmol, 1 ,6 equivalentes). Se calienta lentamente la preparación a TA y se agita durante una noche (aprox. 16 h). Después, se añade dihidrogenofosfato de potasio
(14,91 g, 10 equivalentes) con agitación y se sigue agitando durante 30 minutos. Se purifica por cromatografía sobre gel el producto bruto (procedimiento 3, fase móvil: metanol). Se hace reaccionar el producto más adelante sin purificación fina. Rendimiento: 14,35 g (61% d. t.).
Eiemplo 16A 2,2-Dimetil-1-butanal
Se disuelve 2, 2-d¡metil-1 -butanol (4,0 g, 39 mmol) en diclorometano (136 ml) y se mezcla con óxido de aluminio (7,98 g, 78 mmol, 2 equivalentes) y con clorocromato de piridinio (16,88 g, 78 mmol, 2 equivalentes). Se agita la preparación a TA durante 1 h y después se filtra a través de una capa de gel de sílice. Se concentra cuidadosamente el filtrado, y se destila el residuo a presión normal (punto de ebullición: 102°C (99 kPa)). Rendimiento: 2,97 g (75% d. t.). EM-CG (procedimiento 17): TR = 2,21 min, EM (ESlpos.): m/z (%) = 99,9 (5) [M]+; 1H-RMN (400 MHz, CDCI3) d 0,83 (t, 3H), 1 ,03 (s, 6H), 1 ,51 (c, 2H), 9,42 (s, 1H).
Eiemplo 17A (22)-2-{[(Benciloxi)carbonil]amino}-4,4-dimetilhex-2-enoato de metilo
Se disuelven en 50 ml de THF el compuesto del ejemplo 16A (2,55 g, 25,46 mmol) y {[(benc¡loxí)carbonil]am¡no}(d¡metoxifosfohl)acetato de metilo (8,43 g, 25,46 mmol) y se enfría a
0°C. Se añade gota a gota N,N,N',N -tetrametilguanidina, después se agita primero durante 15 min a 0°C y a continuación durante 5 días a TA. Se mezcla la preparación con aproximadamente 20 g de gel de sílice, se concentra y se purifica por cromatografía (gel de sílice Biotage 40M, ZIF-SIM, ciciohexano /acetato de etilo 87:13). Rendimiento: 1 ,20 g (13% d. t.). í5 HPLC (procedimiento 9): TR = 3,71 min. EM (DCI): m/z (%) = 323,3 (100) [M + NH4]. 1H-RMN (400 MHz, CDCI3): d = 0,83 (m, 3H), 1 ,13 (s, 6H), 1 ,49 (c, 2H), 3.75 (s a, 3H), 5,72 (s a, 1 H), 6,58 (s a, 1 H), 5,12 (s, 2H), 7,36 (m, 5H).
O Eiemplo 18A ?/-[(Bencíloxi)carbonil]-4,4-dimetil-D-norleucinato de metilo
Se disuelve el compuesto del ejemplo 17A (1 ,2 g, producto bruto, 3,26 mmol) en etanol p.a. (60 ml). Se hace pasar argón con una cánula durante aproximadamente 5 minutos, después se
20 añade triflato de (+)-1 ,2-bis-[(2R,5R)dietilfosfolano]benceno(ciclooctadien)rodio (I) (28 mg, 0,04 mmol, 0,012 equivalenes) y se disuelve en baño de ultrasonidos. Se hidrogena durante 24 h a 300 kPa de presión de hidrógeno y TA. Se concentra la preparación y se purifica por cromatografía (gel de sílice Biotage 25M, ciciohexano/acetato de etilo 9:1 ). Rendimiento: 920 mg (92% d. t.). HPLC (procedimiento 9): TR = 4,96 min. 25 EM-CL(procedimiento 7): TR = 2,76 min; EM (ESlpos.): m/z (%) = 308 (25) [M + H]+. 1H-RMN (400 MHz, CDCI3): d = 0,80 (t, 3H), 0,86 (s, 6H), 1 ,29 (c, 2H), 1 ,41 (dd, 1 H), 1,73 (dd, 1 H), 3J2 (s, 3H), 4,40 (m, 1 H), 5,02 (d, 1 H), 5,11 (m, 2H), 7,35 (m, 5H).
Eiemplo 19A ? -[(Benciloxi)carbon¡l]-4,4-dimetil-D-norleucína
O
H,
Se disuelve el compuesto del ejemplo 18A (915 mg, 2,98 mmol) en THF (12 ml). Se enfría 0 la solución a 0°C, después se añaden 3J ml (7,4 mmol, 2,5 equivalentes) de una solución de hidróxido de litio hidratado 2 M en agua y se agita fuertemente durante 1 h. A continuación, se añade gota a gota ácido cítrico (1 M) hasta reacción acida y se extrae la mezcla con acetato de etilo. Se seca el extracto orgánico sobre sulfato de sodio, se concentra y se purifica por cromatografía (procedimiento 16). Rendimiento: 434 mg (50% d. t.). 15 HPLC (procedimiento 9): TR = 4,54 min. EM-CL(procedímíento 7): TR = 2,44 min, EM (ESlpos.): m/z (%) = 294 (20) [M + H]+. 1H-RMN (400 MHz, d6-DMSO): d = 0,80 (t, 3H), 0,83 (s, 6H), 1 ,21 (c, 2H), 1,53 (dd, 1H), 1 ,60 (dd, 1H), 3,99 (m, 1H), 5,02 (s, 2H), 7,35 (m, 5H), 7,58 (d, 2H), 12,52 (s a, 1H).
^ Eiemplo 20A ?/-[(Benciloxi)carbonil]-4,4-dímetil-D-norleucil-3-(p¡ridin-3-il)-L-alaninato de metilo O
Se disuelven en DMF (5 ml) a 0°C el compuesto del ejemplo 19A (430 mg, 1 ,47 mmol) y el
compuesto del ejemplo 12A (809 mg, 1 ,47 mmol, 1 equivalente), después se añaden 4-metilmorfolina (644 µl, 5,86 mmol, 4 equivalentes) y HATU (836 mg, 2,20 mmol, 1 ,5 equivalentes). Se agita la preparación durante 3 horas a TA. Se mezcla con acetato de etilo y se lava con una solución saturada de hidrogenocarbonato de sodio. Se extrae la fase acuosa una vez con acetato de etilo, después se lavan las fases orgánicas combinadas con ácido cítrico acuoso 1 M, así como otra vez con una solución acuosa de hidrogenocarbonato de sodio, se secan sobre sulfato de sodio, se filtran y se concentran a vacío. Se purifica por cromatografía el residuo (procedimiento 16). Rendimiento: 496 mg (74% d. t.). HPLC (procedimiento 9): TR = 3,94 min. EM-CL(procedimiento 7): TR = 1 ,85 min; EM (ESlpos.): m/z (%) = 456 (100) [M + H]+. 1H-RMN (300 MHz, aVDMSO): d = 0,80 (m, 9H), 1 ,10 (m, 3H), 1 ,30 (dd, 1H), 2,91 (dd, 1H), 3,12 (dd, 1H), 3,30 (s, 3H), 4,02 (m, 1H), 4,51 (m, 1H), 5,01 (d, 1H), 5,06 (d, 1H), 7,22 (dd, 1H), 7,30 (m, 5H), 7,63 (m, 1 H), 8,40 (m, 2H).
Eiemplo 21A ?/-[(Benciloxí)carbonil]-4,4-dimetil-D-norleucil-3-(pirid¡n-3-il)-L-alanina O
Se disuelve en THF (5 ml) el compuesto del ejemplo 20A (490 mg, 1 ,08 mmol). Se enfría la solución a 0°C, después se añaden 1 ,35 ml (2J mmol, 2,5 equivalentes) de una solución de hidróxido de litio monohidratado 2 M en agua y se agita fuertemente durante 1 h. Después, se añade gota a gota ácido cítrico (1 M en agua) hasta reacción acida y se extrae la mezcla con acetato de etilo. Se seca el extracto orgánico sobre sulfato de sodio y se concentra. Rendimiento: 484 mg (cuant.).
HPLC (procedimiento 9): TR = 3J6 min. EM-CL(procedimiento 7): TR = 1 ,88 min; EM (ESlpos.): m/z (%) = 442 (100) [M + H]+. 1H-RMN (400 MHz, d6-DMSO): d = OJO (m, 9H), 1 ,14 (m, 3H), 1 ,30 (dd, 1H), 2,64 (d, 1H), 2,75 (d, 1H), 2,89 (dd, 1 H), 3,11 (dd, 1 H), 4,03 (m, 1H), 4,45 (m, 1 H), 4,98 (d, 1H), 5,05 (d, 1H), 7,22 (dd, 1 H), 7,30 (m, 5H), 7,61 (m, 1 H), 8,40 (m, 2H).
Eiemplo 22A Trifluoroacetato de ?/-[(benciloxi)carbonil]-4,4-dimetil-D-norleuc¡l-3-(piridin-3-il)-L-alan¡l-des-(1-D-leucíl-2-L-leucil)lisobactína
Se disuelven en DMF (4 ml) el compuesto del ejemplo 2A (0,28 g, 0,22 mmol) y el compuesto del ejemplo 21 A (148 mg, 0,33 mmol, 1 ,5 equivalentes) y se enfría a 0°C. Después, se añaden en primer lugar 0,47 ml (0,44 mmol, 2 equivalentes) de una solución de ?/-metilmorfolina 1 M en DMF. A continuación, se añaden inmediatamente HATU (141 mg, 0,37 mmol, 1 J equivalentes) y se agita durante 15 min a 0°C. Después, se añaden gota a gota otros 0,44 ml (0,47 mmol, 2 equivalentes) de la solución de 4-metílmorfolina 1 M en DMF. Se agita después la preparación durante una noche a TA. Se purifica la preparación en Sephadex LH 20
(procedimiento 3, fase móvil: metanol). Se purifica el producto bruto mediante HPLC preparativa (procedimiento 13). Rendimento: 149 mg (43% d. t.). HPLC (procedimiento 9): TR = 3,93 min. EM-CL(procedimiento 7): TR = 2,13 min, EM (ESlpos.): m/z (%) = 737,4 (100) [M + 2H]2+, 1473 (2) [M + H] +.
Ejemplos de realización Eiemplo 1 Bistrifluoroacetato de 3-íerc-butil-D-alanil-3-(6-trifluorometilpiridín-3-il)-L-alanil-des-(1-D-leucil-2-L-leucil)lisobactina
Se añade lentamente ácido trifluoroacético (150 ml) a una solución del compuesto del ejemplo 8A (10,3 g, 1 ,0 equivalentes, 4,48 mmol, producto bruto) en diclorometano (150 ml) a TA. Se agita la mezcla de reacción a TA (10 min), observándose una reacción completa mediante HPLC (procedimiento 9). Se concentra la mezcla de reacción en rotavapor y se purifica mediante HPLC preparativa (procedimiento 11), obteniéndose 3,48 g (48% d. t.) de producto. HPLC/UV-Vis (procedimiento 8): TR = 4,03 min.
HPLC/UV-Vis (procedimiento 9): TR = 3,64 min. EM-CL(procedimiento 7): TR = 1 ,69 min; EM (ESlpos.): m/z (%) = 697 (100) [M + 2H] 2+
1393 (5) [M + H]+; EM (ESlneg.): m/z (%) = 695 (100) [M - 2H]2", 1391 (20) [M - H]~. 19F-RMN (400 MHz, d5-piridina): d = -67 (Ar-CF3), -74 (CF3COOH), -132 (1 ,4 dibromotetrafluorobenceno como referencia). Contenido de TFA: 14,3% en peso. EM-AR (procedimiento 1 ):
[M + H]+ cale. 1393,7091 , ene. 1393,7119.
Eiemplo 2 Tristrifluoroacetato de 3-(t metilsilil)-D-alanil-3-(pirid¡n-3-il)-L-alaníl-des-(1-D-leucil-2-L-; leucipiisobactina
Se suspende el compuesto del ejemplo 15A (9,12 g, 4,93 mmol, producto bruto) en ácido tñfluoroacético en diclorometano (65 ml, solución al 30%). Se agita la preparación a TA durante 20 min. Se separa por destilación el disolvente. Se seca el residuo a vacío de bomba de aceite y después se purifica por cromatografía (procedimiento 14). Rendimiento: 5,54 g (67% d. t.)
HPLC (procedimiento 9): TR = 3,32 min. EM-CL(procedimiento 7): TR = 1 ,41 min, EM (ESlpos.): m/z (%) = 671 J (100) [M + 2 H] 2* .
EM-AR-TOF (procedimiento 1 ): C6oH97N16Ol7Si [M + H]+ cale. 1341 ,6987, ene. 1341 ,7019. 1H-RMN (500 MHz, d5-piridina): d = -0,172 (s, 9H), 0,611 (d, J = 6,9 Hz, 3H), 0,881 (d, J = 7,9 Hz, 3H), 0,948 (d, J = 6,3 Hz, 3H), 0,954 - 0,997 (m, 6H), 1,135 (d, J = 6,0 Hz, 3H), 1 ,208 (m, 2H), 1 ,361 (d, J = 5,4 Hz, 3H), 1 ,439 (m, 1H), 1 ,497 (m, 1H), 1,953 (m, 2H), 2,04 (m, 1H), 2,154 (m,
5 3H), 2,372 (m, 3H), 3,111 (m, 1 H), 3,266 (m, 1 H), 3,563 (d, J= 14,95 Hz, 1 H), 3J26 (dd, J = 12,2, 14,95 Hz, 1 H), 3,840 (d, J = 9,6 Hz, 1H), 3,960 (m, 1H), 4,152 (m, 1H), 4,198 (m, 1H), 4,278 (m, 1H), 4,382 (m, 1 H), 4,488 (m, 1 H), 4,565 (dd, J = 9,5, 9,6 Hz, 1 H), 4,628 (m, 1 H), 4,630 (m, 1H), 4,779 (d, J= 12,2 Hz, 1H), 5,069 (m, 1H), 5,159 (dd, J = 9,3 Hz, 1H), 5,264 (m, 1H), 5,362 (s, 1H), 5,98 (d, J = 9,9 Hz, 1 H), 6,351 (dd, J = 8,5 Hz, J = 8J Hz, 1H), 7,169 (m, 1H), 7,246 (m, 1 H), 7,382 0 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 7,512 (m, 2H), 7,583 - 7,614 (m, 2H), 7,728 (m, 2H), 7,90 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 8,126 (m, 3H), 8,341 (m, 1H), 8,576 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 8,695 (m, 2H), 8,793 (m, 1H), 9,139 (s a, 1H), 9,715 (m, 1 H), 10,957 (s a, 1H), 11,268 (s a, 1 H). 13C-RMN (126 MHz, ds-piridina): d = -1 ,8, 11 ,08, 15,84, 18,8, 18,8, 19,79, 20,89, 20,93, 21 ,65, 23,38, 24,78, 26,57, 26,88, 28,80, 31 ,04, 34,06, 36,84, 40,95, 41 ,25, 44,38, 50,94, 52,82,
15 55,99, 56,10, 56,74, 58,40, 59,10, 60,34, 60,72, 62,33, 62,55, 70,72, 72,06, 75,58, 75,65, 123,66, 128,25, 128,95, 129,80, 132,39, 136,77, 137,18, 149,17, 158,11 , 162,15, 162,41 , 162,70, 162,96, 169,01 , 169,69, 170,21 , 172,57, 173,27, 173,44, 173,66, 174,07, 174,36, 175,34, 175,56. 19F-RMN (400 MHz, drpiridina): d = -74 (CF3COOH), -132 (1 ,4-dibromotetrafluorobenceno como referencia). Contenido de TFA: 19,3% en peso. 20) La estructura se confirma mediante un análisis de estructura de rayos X de monocristal.
Eiemplo 3 Trismetanosulfonato de 3-(trimetilsilil)-D-alanil-3-(piridin-3-il)-L-alanil-des-(1-D-leucil-2-L- leucil)lisobactina 25
Se disuelve tristñfluoroacetato de 3-(trimetilsilil)-D-alanil-3-(piridin-3-il)-L-alaníl-des-(1-D-leucil-2-L-leucil)lisobactína (447 mg, 0,27 mmol) en 22 ml de agua. Se añade ácido metanosulfónico (al 70%). Se agita fuertemente la preparación y después se liofiliza. Se recoge el liofilizado con agua (3,4 ml) y se añade una solución de metanosulfonato de sodio al 70% (0,9 ml). Se agita durante 10 min a TA. Después, se centrifuga el producto. Se obtienen 472 mg de producto bruto. Se suspenden en agua (5 ml) productos brutos reunidos de varias preparaciones (en total 1053 mg, 0,63 mmol) y se agita a TA durante 4 días. Se centrifuga de nuevo y se seca el sólido obtenido a vacío. Se obtienen 575 mg (55% d. t.) del producto. HPLC (procedimiento 9): TR = 3,30 min. EM-CL(procedimiento 7): TR = 1 ,49 min, EM (ESlpos.): m/z (%) = 671 ,8 (100) [M + 2 H]2*, 1342,1 (5) [M + H]+. 1H-RMN (500 MHz, dj-piridina): d = -0,170 (s, 9H), 0,702 (d, J = 6,3 Hz, 3H), 0,867 (d, J = 6, 1 Hz, 3H), 0,972 (d, J = 6,2 Hz, 3H), 0,966 - 1 ,069 (m, 9H), 1 ,186 (d, J = 6,5 Hz, 3H), 1 ,315 (m, 2H), 1 ,448 - 1 ,501 (m, 6H), 2,010 (m, 1H) , 2,084 (m, 3H), 2,180 - 2,365 (m, 4H), 2,540 (m, 1 H), 3,082 (s, 9H), 3, 166 (m, 1 H), 3,325 (m, 1 H), 3,623 (d, J = 14,05 Hz, 1 H), 3,865 (dd, J = 13,7,
14,05 Hz, 1H), 3,967 - 3,986 (m, 2H), 4,257 (m, 1 H), 4,339 (m, 2H), 4,410 (m, 1H), 4,566 (m, 1 H), ,591 - 4,686 (m, 2H), 4,75 (d, 1 H, J = 12,1 Hz, 1H), 4,859 (m, 1H), 5,086 (m, 1H), 5,229 (m, 1H), 5,348 (m, 1H), 5,375 (s, 1H) 6,02 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 6,403 (m, 1H), 7,068 (d, J = 9,8 Hz, 1H), 7,222 (m, 3H), 7,544 (m, 3H), 7,625 (m, 1 H), 7,681 (m, 1 H), 7,830 (d, J = 7,6 Hz, 1 H), 7,921 (d, J = 9,35 Hz, 1 H), 8,071 (m, 2H), 8,188 (s a, 1 H), 8,285 (s a, 1 H), 8,420 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 8,614 (d, J = 4,0 Hz, 1H), 8,701 (m, 1H), 8,874 (s a, 1H), 10,175 (m, 1H), 10,279 (m, 1H), 10,941 (s a, 1H). 19F-RMN (piñdina, 400 MHz, procedimiento 24): d -74,0 (s, TFA, 0,20), -132,0 (s, 1 ,4-díbromotetrafluorobenceno, 1000,0), TFA = 0,02% en peso. Procedimiento alternativo: Se empaquetan 32 g de Dowex 1X8-400 (en forma de HCl) en una columna (35 mm de diámetro). Se añaden aproximadamente 60 ml de solución de hidróxido de sodio 1 M a la columna, seguidos de 60 ml de agua de HPLC. Después, se acondiciona con 60 ml de ácido metanosulfónico 1 M y a continuación se lava con aproximadamente 100 ml de agua hasta reacción neutra del eluido (Macherey & Nagel Tritest). Después, se disuelven 2,00 g (1,19 mmol) de tristrifluoroacetato de 3-(trímetilsilil)-D-alanil-3-(piridin-3-il)-L-alanil-des-(1-D-leucil-2-L-leucil)lisobactina (ejemplo 2) en 90 ml de agua, se añade la solución y se eluye lentamente. Se lava la columna con aproximadamente 20 ml de agua. Se combinan los eluidos que contienen producto, se someten a filtración fina (tamaño de poro 0,20 µm) y se liofilizan. Se acondiciona de nuevo la columna y se vuelve a usar. Se obtienen 1 J9 g (1 ,10 mmol, 92% d. t.) del ejemplo 3 a partir de 2000 mg (1 ,19 mmol) del ejemplo 2.
Eiemplo 4 Tristrifluoroaceato de 4,4-dimetil-D-norleucil-3-(piridin-3-il)-L-alanil-des-(1-D-leuc¡l-2-L- leucil)lisobactina
Se disuelve el compuesto del ejemplo 22A (149 mg, 0,09 mmol) en metanol que contiene 0,05% de ácido trifluoroacético (10 ml). Se añade paladio sobre carbono activo (al 10%; 20 mg), después se hidrogena un total de 2,5 h a TA y presión normal con hidrógeno. Se separa por filtración el producto bruto del catalizador y se concentra el filtrado. Se purifica por cromatografía el residuo (procedimiento 13) Rendimiento: 68 mg (46% d. t.). HPLC (procedimiento 9): TR = 3,29 min. EM-CL(procedimiento 7): TR = 1 ,49 min, EM (ESlpos.)- m/z (%) = 671 ,0 (100) [M +2H]2*, 1340 (5) [M + H] +. EM-AR-TOF (procedimiento 1 ): C62H98N16Ol7 [M + H]+ cale. 1339,7369, ene. 1339J368.
Eiemplo 5 (ejemplo comparativo) Tristpfluoroacetato de 3-íerc-butil-D-alan?l-3-(piridin-3-il)-L-alanil-des-(1-D-leucil-2-L-leucil)lisobactina
Eiemplo 6 Trisclorhidrato de (trimet¡lsilil)-D-alaníl-3-(piridin-3-il)-L-alan¡l-des-(1-D-leucil-2-L-leucil)lisobactina
Se empaquetan 32 g de Dowex 1X8-400 (en forma de HCl) en una columna (35 mm de diámetro). Se añaden aproximadamente 60 ml de solución de hidróxido de sodio 1 M a la columna, seguidos de 60 ml de agua de HPLC. Después, se acondiciona con 60 ml de ácido clorhídrico 1 M y a continuación se lava con aproximadamente 100 ml de agua hasta reacción neutra del eluido. (Macherey & Nagel Tritest). Después, se disuelven 2,00 g (1,19 mmol) de trístrifluoroacetato de 3-(trimetils¡lil)-D-alanil-3-(piridin-3-il)-L-alanil-des-(1-D-leucil-2-L-leuc¡l)lisobact¡na (ejemplo 2) en 90 ml de agua, se añade la solución y se eluye lentamente. Se lava la columna con aproximadamente 20 ml de agua. Se purifican los eluidos que contienen producto, se someten a filtración fina (tamaño de poro 0,20 µm) y se liofilizan. Se acondiciona de nuevo la columna y se vuelve a usar. Se obtienen 1,54 g (1,06 mmol, 89% d. t.) del ejemplo 6 a partir de 2.000 mg (1,19 mmol) del ejemplo 2. HPLC (procedimiento 9): TR = 3,30 min. EM-CL(procedimíento 7): TR = 1,47 min, EM (ESlpos.): m/z (%) = 671,5 (100) [M+2 H]2+, 1341,4(20), [M+H]+. Cromatografía iónica (procedimiento 25): CI" (cale.) = 7,43 %, CI" ene. = 7,1 %; TFA (ene.) <
0,1 %. 1H-RMN (500 MHz, cf5-pirídina) d = -0,170 (s, 9H), 0,580 (d, J = 6,3 Hz, 3H), 0J72 (d, J = 5J Hz, 3H), 0,920 (d, J = 5,8 Hz, 3H), 0,974 - 0,985 (m, 6H), 1,147 (d, J = 6,4 Hz, 3H), 1,250 - 1,358 (m, 2H), 1,411 (d, J = 5,7 Hz, 3H), 1,468 (m, 1H), 1,604 (m, 1H), 1,959 - 2,049 (m, 3H), 2,154 - 2,228 (m, 3H), 2,380 (m, 3H), 2,935 (m, 1H), 3,120 (m, 1H), 3,300 (m, 1H), 3,607 (d, J = 14,9 Hz, 1H), 3,762 (dd, J= 14J Hz, 1H), 3,882 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 3,938 (m, 1H), 4,204 (m, 1H), 4,253 (m, 1H), 4,389 (m, 1H), 4,465 (m, 1H), 4,589 - 4,661 (m, 4H), 4,806 (d, J= 12,1 Hz, 1H), 5,027 (m, 1H), 5,202 (dd, J= 9,4 Hz, 1H), 5,289 (m, 1H), 5,390 (s, 1H), 6,000 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 6,394 (dd, J= 9,0 Hz, 1H), 7,173 (m, 2H), 7,428 (m, 1H), 7,54 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 7,664 - 7,973 (m, 3H), 7J67 (d, J = 8,6, 1H), 7,918 - 7,973 (m, 3H), 8,038 (s a, 2H), 8,098 (s a, 1H), 8,185 (s a, 1H), 8,253 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 8,582 (m, 1H), 8,684 (d, J = 9,8 Hz, 1H), 8J41 (s a, 1H), 8J82 (m, 1H), 9,928 (s a, 1H), 10,272 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 10,886 (s a, 1H), 11,135 (s a, 1H). 19F-RMN (piridina, 400 MHz, procedimiento 24): TFA < límite de determinación.
Eiemplo 7 Tris-L-lactato de (tr¡metilsilil)-D-alanil-3-(piríd¡n-3-il)- -alanil-des-(1-D-leucil-2-L-leucil)lisobactina O. -NH,
H
Ch >
Se empaquetan 32 g de Dowex 1X8-400 (en forma de HCl) en una columna (35 mm de diámetro). Se añaden aproximadamente 60 ml de solución de hidróxido de sodio 1 M a la columna, seguidos de 60 ml de agua de HPLC. Después, se acondiciona con 60 ml de ácido láctico 1 M y a continuación se lava con aproximadamente 100 ml de agua hasta reacción neutra del eluido. (Macherey & Nagel Tritest). Después se disuelven 2,00 g (1 ,19 mmol) de tristrífluoroacetato de 3- (trimet¡ls¡líl)-D-alanil-3-(pir¡din-3-il)-L-alanil-des-(1-D-leucil-2-L-leucil)lisobactina (Ejemplo 2) en 90 ml de agua, se añade la solución y se eluye lentamente. Se lava la columna con aproximadamente 20 ml de agua. Se purifican los eluidos que contienen producto, se someten a filtración fina (tamaño de poro 0,20 µm) y se liofílizan. Se acondiciona de nuevo la columna y se vuelve a usar. Se obtienen 1903 mg (1 ,18 mmol, 99% d. t.) del ejemplo 7 a partir de 2000 mg (1 ,19 mmol) del
ejemplo 2. HPLC (procedimiento 9): TR = 3,29 min. EM-CL(procedimíento 7): TR = 1,38 min, EM (ESlpos.): m/z (%) = 671,7 (100) [M+2 H]2+,
1341,8(20), [M+H]+. 1H-RMN (500 MHz, ds-piridina): d = -0,170 (s, 9H), 0,754 (d, J = 6,3 Hz, 3H), 0,836 (d, J =
6,1 Hz, 3H), 0,922 (d, J = 6,2 Hz, 3H), 0,922 - 0,957 (m, 6H), 1,054 (d, J = 6,4 Hz, 3H), 1,190 (m,
2H), 1,416 (d, J = 5,8 Hz, 3H), 1,439 - 1,662 (m, 4H), 1,529 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 1,598 (d, J =
6.5 Hz, 3H), 1,669 (d, J = 6,9 Hz, 3H), 1,923 - 2,280 (m, 9H), 3,057 (m, 1H), 3,266 (m, 1H), 3,564 (d, J= 14,5 Hz, 1H), 3,761 (dd, J= 13J Hz, 1H), 3,840 (m, 1H), 4,049 (m, 1H), 4,109 (m, 1H), 4,164 (m, 1H), 4,202 (m, 1H), 4,410 (m, 1H), 4,484 (m, 1H), 4,616 (dd, J = 6,7, 13,6 Hz, 1H), 4,656 (m, 1H), 4,669 (dd, J = 7,0, 13,9 Hz, 1H), 4J80 (d, J= 13,0 Hz, 1H), 4,921 (m, 1H), 5,144 (dd, J =
9.6 Hz, 1H), 5,281 (m, 1H), 5,363 - 5,426 (m, 3H), 5,362 (s, 1H), 5,989 (d, J = 9,8 Hz, 1H), 6,323 (m, 1H), 7,122 (m, 1H), 7,180 (m, 1H), 7,381 (m, 1H), 7,596 (m, 1H), 7,671 - 7,925 (m, 6H), 8,036 (s a, 1H), 8,208 (m, 3H), 8,412 (m, 1H), 8,551 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 8,714 (m, 2H), 8J94 (m, 1H), 10,298 (s a, 1H), 10,938 (s a, 1H). 19F-RMN (piridina, 400 MHz, procedimiento 24): TFA < límite de determinación.
Eiemplo 8 Tris-D-tartrato de (trimetilsilil)-D-alanil-3-(piridin-3-il)- -alanil-des-(1-D-leucil-2-L-leuc¡l)lisobactina
Acondicionamiento del intercambiador iónico: Se lavan 5 g de DOWEX 1X8 400 (sal de HCl) con lejía de sosa 1 M, hasta reacción alcalina del eluido. Después, se lava con 2 volúmenes de columna de agua y a continuación con ácido D-tartárico 1 M, hasta reacción acida del eluido. Después, se lava con agua hasta que el eluido sea neutro (Macherey & Nagel Tritest). Se disuelven después 100 mg (59 µmol) del ejemplo 2 en 10 ml de agua y se aplican sobre la columna. A continuación, se lava con varias porciones de aproximadamente 10 ml de agua. Se disuelve el reactante sólo moderadamente y permanece parcialmente en la columna. Se combinan las fracciones de eluido que contienen producto y se liofilizan. Se obtienen 57 mg (31 µmol, 52% d. t.) del producto. La integración del espectro de 1H-RMN indica una estequiometría 1 :3 para (tr¡metilsil¡l)-D-alanil-3-(piridin-3-il)-L-alanil-des-(1-D-leucil-2-L-leucil)lisobactina : ácido D-tartárico. HPLC (procedimient. 9): TR = 3,29 min. EM-CL(procedimiento 7): TR = 1 ,37 min, EM (ESlpos.): m/z (%) = 671 ,7 (100) [M+2 H]2+, 1341,9 (20), [M+H]+.
1H-RMN (500 MHz, dj-piridina): d = -0,172 (s, 9H), 0,597 (d, J = 6,3 Hz, 3H), 0,776 (d, J = 5,7 Hz, 3H), 0,924 (d, J = 5,8 Hz, 3H), 0,954 - 0,997 (m, 6H), 1 ,173 (d, J = 5,7 Hz, 3H), 1 ,303 (m, 2H), 1 ,434 (d, J = 5,7 Hz, 3H), 1 ,468 (m, 1 H), 1 ,632 (m, 1 H), 1 ,972 (m, 2H), 2,051 (1 H, m), 2,174 (m, 3H), 2,402 (m, 3H), 3,129 (m, 1H), 3,305 (m, 1 H), 3,602 (d, J= 15,2 Hz, 1 H), 3,799 (dd, J = 14,6 Hz, 1H), 3,893 (d, J = 12,3 Hz, 1H), 3,967 (m, 1H), 4,228 (m, 1H), 4,276 (m, 1H), 4,409 (m, 1 H), 4,468 (m, 1H), 4,578 - 4,669 (m, 4H), 4J91 (d, Jaß = 11 ,5 Hz, 1H), 5,044 (m, 1H), 5,226 (dd, = 9,4 Hz, 1H), 5,190 (m, 1H), 5,362 (s, 1H), 5,417 (s, 6H), 5,997 (d, J = 9,7 Hz, 1H), 6,403 (dd, J = 8,9 Hz, 1 H), 7,182 (m, 1 H), 7,551 - 8,210 (m, 13H), 8,589 (d, J = 3,6 Hz, 1 H), 8,711 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 8,782 (m, 2H), 9,902 (s a, 1H), 10,358 (m, 1H), 10,882 (s a, 1H), 11,093 (s a, 1H).
Eiemplo 9 (Trimetils¡l¡l)-D-alanil-3-(piñdin-3-il)-L-alanil-des-(1-D-leucil-2-L-leucil)lisobactina
Se empaqueta hidrogenocarbonato unido a polímero PL-HC03 (Polymer Labs, capacidad 1 ,8 mmol/g) en una columna. Para la reacción de 100 mg (59 µmol) del compuesto del ejemplo 2 se usan 396 mg (corresponde a 12 equivalentes de* hidrogenocarbonato) de la resina. Se lava la
resina con pihdina. Después, se añade una solución del ejemplo 2 (100 mg, 59 µmol) en piridina (0J5 ml) a la columna y se eluye lentamente. Se lava la columna en primer lugar con piridina adicional (2 ml) y después con agua (aproximadamente 2 ml). Se combinan todos los eluidos y se concentran sin aporte de calor a vacío de bomba de aceite. Se disuelve el residuo de tipo vitreo en algunas gotas de agua y se liofiliza inmediatamente. Se obtiene el compuesto del título en forma de un polvo amorfo incoloro. HPLC (procedimiento 9): TR = 3,30 min. EM-CL(procedim?ento 7): TR = 1 ,49 min, EM (ESlpos.): m/z (%) = 671 ,8 (100) [M+2 H]2+, 1341 ,9 (10), [M+Hf , EM (ESlneg)- m/z (%) = 669,9 (100) [M-2 H]2", 1340,0 (100) M-H]". 19 F-RMN (pindina, 400 MHz, procedimiento 24): TFA 2,9%.
Eiemplo 10 Mesilato-trifluoroacetato de (trimetilsilil)-D-alanil-3-(pir?d¡n-3-il)-L-alanil-des-(1-D-leucil-2-L-leucil)lísobactina
Mediante recnstalización del ejemplo 3 con agua impurificada con TFA a TA, puede obtenerse el compuesto del título en forma de sustancia cristalina (evaporación lenta de la
solución). EM-CL(procedimiento 6): TR = 1 ,41 min, EM (ESlpos.): m/z (%) = 671 ,9 (100) [M+2 H]2\ 1342,1 (10), [M+H]\ EM (ESlneg): m/z (%) = 669,9 (100) [M-2 H]2', 1340,1 (80) M-H]". EM-AR-TOF (procedimiento 1 ): C60H97N16O17Si [M + H]+ cale. 1341 ,6982, ene. 1341 ,7006. La estructura y la forma de sal se confirman mediante análisis de estructura de rayos X monocristalino.
B. Valoración de la actividad fisiológica La actividad in vitro de los compuestos según la invención puede mostrarse en los siguientes ensayos:
Determinación de la concentración mínima inhibidora (CMI): Se determina la CMI en un ensayo de dilución líquida según las directrices del NCCLS. Se incuban cultivos de una noche de Staphylococcus aureus 133, Enterocococcus faecalis 27159, E. faecium 4147 y Streptococcus pneumoniae G9a con las sustancias de ensayo descritas en una serie de dilución 1 :2. Se lleva a cabo la determinación de la CMI con un número de células de 105 gérmenes por ml de medio Isosensitest (compañía Difco, Irvine/EE.UU.) con excepción de S. pneumoniae, que se ensaya en caldo BHI (compañía Difco, Irvine/EE.UU.) con suero bovino al 10% a un número de células de 106 gérmenes por ml. Se incuban los cultivos a 37°C durante 18-24 horas, S. pneumoniae en presencia de 10% de C02. Se define como CMI la concentración de sustancia menor respectiva a la que no aparece ya crecimiento visible de bacterias. Los valores de CMI se dan en µg/ml. Se reproducen los datos de actividad in vitro representativos y los datos de fu para los compuestos según la invención en la Tabla A:
Tabla A
Puede mostrarse la idoneidad de los compuestos según la invención para el tratamiento de infecciones bacterianas en el siguiente modelo animal:
Infección sistémica con Staphylococcus aureus 133: Se cultivan células de S. aureus 133 durante una noche en caldo BHI (compañía Oxoid, Nueva York/EE.UU.). Se diluye el cultivo de una noche 1:100 en caldo BHI reciente y se incuba durante 3 horas. Las células, que se encuentran entonces en fase de crecimiento logarítmico, se centrifugan y se lavan dos veces con solución de sal común fisiológica tamponada. Después, se ajusta fotométricamente una suspensión celular en solución de sal común a una extinción de 50 unidades. Después de una etapa de dilución (1 :15), se mezcla esta suspensión 1 :1 con un solución de mucina al 10%. De esta solución de infección, se aplican 0,25 ml/20 g de ratón por vía intraperitoneal (correspondiente a 1x106 gérmenes/ratón). La terapia se realiza por vía ¡ntraperitoneal o intravenosa 30 minutos después la infección. Para el ensayo de infección, se usan ratones CFW1 hembra. Se registra la supervivencia de los animales durante 6 días. Pueden mostrarse las propiedades de los compuestos según la invención con respecto a la
tolerancia renal en el siguiente modelo animal:
Modelo de ratón para la determinación de efectos nefrotóxicos: Se analizan los efectos nefrotóxicos secundarios de los nonadepsipéptidos mediante análisis histopatoiógicos de los riñones de ratones después de la toma múltiple de una dosificación determinada. Para ello, se tratan 5-6 animales por vía intravenosa (i.v.) o intraperitoneal (i.p.) con sustancias que se disuelven en solución acuosa o con la adición de solutol. Se determinan los efectos tóxicos renales mediante la valoración con microscopía óptica de cortes de parafina de los riñones teñidos con hematoxilina y eosina (H&E). Opcionalmente se lleva a cabo una reacción 'ácido de Schiff- y periódico' (PAS) para una mejor representación de las glicoproteínas. Se establecen los efectos nefrotóxicos semicuantitativamente para cada animal como el grado de gravedad de la basofília tubular y degeneración/regeneración que aparece (grados de gravedad: 0
= sin efecto; 1 = efecto minimo; 2 = efecto ligero; 3 = efecto moderado; 4 = lesiones graves). El grado de gravedad medio de la degeneración/regeneración así como la incidencia (número de animales afecados) se calcula por grupo de animales o derivado. Se indican igualmente modificaciones renales adicionales como dilatación tubular así como necrosis y agrupación de material necrótico.
Modelo de ratas para la determinación de efectos nefrotóxicos: Se analizan los efectos nefrotóxicos secundarios de los nonadepsipéptidos mediante análisis histopatoiógicos de los riñones de ratas después de la toma múltiple de una dosificación determinada. Para ello, se tratan 5 animales diariamente por vía intravenosa (i.v.) con sustancias que se disuelven en solución salina o solución de lactato de Ringer. Se determinan los efectos tóxicos renales mediante la valoración con microscopía óptica de cortes de parafina de los riñones teñidos con hematoxilina y eosina (H&E). Opcionalmente se lleva a cabo una reacción 'ácido de Schiff- y periódico' (PAS) para una mejor representación de las glicoproteínas. Se establecen los efectos nefrotóxicos semicuantitativamente para cada animal como el grado de gravedad de la basofilia tubular y degeneración/regeneración que aparece (grados de gravedad: 0 = sin efecto; 1 =
efecto mínimo; 2 = efecto ligero; 3 = efecto moderado; 4 = lesiones graves). El grado de gravedad medio de la degeneración/regeneración así como la incidencia (número de animales afectados) se calcula por grupo de animales o derivado. Se indican igualmente modificaciones renales adicionales como dilatación tubular así como necrosis y agrupación de material necrótico.
Principio de determinación de la fracción libre mediante Transil: El procedimiento aquí descrito para la determinación de la fracción libre (fu) de una sustancia de ensayo se divide en dos partes: a) Determinación de la relación de distribución de Transil®/tampón (MAtampón) mediante incubación de la sustancia de ensayo en una dispersión de Transil®-tampón (pH 7,4) y posterior determinación de la concentración en la dispersión y en el sobrenadante de tampón. b) Determinación de la relación de distribución de Transil®/plasma (MApiasma) mediante incubación de la sustancia de ensayo en una dispersión de Transil®-plasma y posterior determinación de la concentración en la dispersión y en el plasma. El cociente de ambas relaciones de distribución proporciona la fu. En sustancias altamente unidas a proteína, se diluye generalmente el plasma con tampón fosfato isotónico (pH 7,4) y a continuación se suspende en Transil®. La determinación de la fu' (fracción libre en plasma diluido) en esta solución de proteína diluida se realiza análogamente a la determinación de la fu. La fracción libre en plasma no diluido se calcula a partir de la fu" y del factor de dilución. Compárese con este procedimiento también: Schuhmacher, Joachim; Kohlsdorfer, Christian; Buehner, Klaus; Brandenburger, Tim; Kruk, Renate, "High-throughput determination of the free fraction of drugs strongly bound to plasma proteins." Journal of Pharmaceutical Sciences 2004, 93, 816-830.
Determinación de la afinidad de membrana de una sustancia de ensayo después de distribución entre Transil® y tampón (MA,amp?n):
Se llevaron a cabo todas las incubaciones en matraces de vidrio adecuados, por ejemplo, viales de vidrio o probetas esmeriladas. Generalmente, el volumen total asciende a 0,5-5 ml, y el volumen de Transil® a 10-100 µl. En el caso de afinidades de membrana mayor de lo esperado, la dispersión de Transil® puede diluirse con tampón fosfato a pH 7,4, por ejemplo Dulbeccos PBS hasta 20 veces. El tampón fosfato a pH 7,4 se dispone en el matraz de incubación y se pipetea Transil® después de mezclado concienzudo. Se pipetea la sustancia de ensayo a una concentración, por ejemplo, de 200 ng/ml, n = 6. La proporción de disolvente orgánico debe ser <2%. Las preparaciones se incuban durante 30 min a temperatura ambiente, por ejemplo, en un Mini-Shaker con un ángulo de aproximadamente 45° aproximadamente a 400 rpm. Para la determinación del valor al 100%, se toma al menos una alícuota de, por ejemplo, 100 µl, el resto de la preparación se centrifuga aproximadamente durante 10 min aproximadamente a 1.800 g. Se toman de cada muestra al menos 2 alícuotas (por ejemplo, 100 µl) del sobrenadante para la determinación de la concentración.
Determinación del Ar,a?ma en plasma no diluido o diluido: El volumen total de incubación y el volumen de Transil® añadido dependen de la fracción libre esperada. Generalmente, el volumen total asciende a 0,5 -1 ml, el volumen de Transil® a 10- 100 µl. En caso de fracciones libres muy bajas, se diluye el plasma de la especie que se va a analizar con solución tampón isotónica, pH 7,4, por ejemplo 10 -400 veces, y a continuación se mezcla con Transil®. El resto del procedimiento adicional se realiza como se ha descrito anteriormente para la determinación de los valores de MAtamp6n.
Principio de determinación de la fracción libre mediante ultrafiltración: Se filtra el plasma de la especie a analizar a través de una membrana semipermeable. Se mide la concentración de sustancia en el filtrado y se calcula a partir de ella la fracción libre fy. Se usa el Centrifree micropartition system de Millipore/Amicon. Las membranas de ultrafiltración tienen un tamaño de exclusión de 30.000 Da. La sustancia se dosifica a 1 ml de plasma con una concentración de aproximadamente 1 µg/ml. La proporción de disolvente debe
ser < 2 %. Después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, se pipetea el plasma en el sistema de ultrafiltracíón y se centpfuga durante 10 minutos a 1800 g. Se mide la concentración de sustancia en el ultrafiltrado (Cu: concentración de sustancia no unida) y en el plasma antes de la centrifugación (C; concentración de sustancia total). Se calcula la fracción libre según la fórmula: fu (%) = Cu/C *100.
C. Ejemplos de realización para composiciones farmacéuticas Los compuestos según la invención pueden transformarse en preparados farmacéuticos de la siguiente manera:
Comprimidos: Composición: 100 mg del compuesto del ejemplo 1, 50 mg de lactosa (monohidratada), 50 mg de almidón de maíz (nativo), 10 mg de polivinílpirrolidona (PVP 25) (compañía BASF, Ludwigshafen, Alemania) y 2 mg de estearato de magnesio. Peso del comprimido 212 mg. Diámetro 8 mm, radio de curvatura 12 mm. Preparación: Se granula la mezcla de principio activo, lactosa y almidón con una solución al 5% (m/m) de PVP en agua. Se mezcla el granulado con estearato de magnesio durante 5 minutos después de secar. Se comprime esta mezcla con una prensa de comprimidos habitual (para el formato de los comprimidos véase anteriormente). Como valor normativo para la compresión se usa una fuerza de compresión de 15 kN.
Suspensión administrable por vía oral: Composición: 1000 mg del compuesto del ejemplo 1 , 1000 mg de etanol (al 96%), 400 mg de Rhodigel (goma de xantana de la compañía FMC, Pennsylvania, EE.UU.) y 99 g de agua. Una monodosis de 100 mg de compuesto según la invención corresponde a 10 ml de
suspensión oral. Preparación: Se suspende el Rhodigel en etanol, se añade el principio activo a la suspensión. Se realiza la adición del agua con agitación. Se agita hasta la terminación del hinchamiento del Rhodigel aproximadamente 6 h.
Solución administrable por vía intravenosa: Composición: 100-200 mg del compuesto del ejemplo 1 , 15 g de polietilenglicol 400 y 250 g de agua para inyecciones. Preparación: Se disuelve el compuesto del ejemplo 1 junto con polietilenglicol 400 en agua con agitación. Se esteriliza por filtración la solución (diámetro de poro 0,22 µm) y se rellenan en condiciones asépticas frascos de infusión termoesterilizados. Se cierran estos con tapones de infusión y cápsulas con reborde.
Claims (11)
- REIVINDICACIONES Compuesto de fórmula en la que R1 significa hidrógeno y R2 significa 2,2-dimetíl-1-butilo, 2-etil-2-metil-1 -butilo, 2,2-dietil-1 -butilo, 2,2-dimetíl-1- pentilo o trimetilsililmetílo, R1 significa trifluorometilo y R2 significa 2, 2-dimet¡l-1 -propilo, 2, 2-dimetil-1 -butilo, 2-etil-2-metil-1 -butilo, 2,2-dietil-1 - butilo, 2, 2-dimetil-1 -pentilo o trimetilsilílmetilo, o una de sus sales, sus solvatos o solvatos de sus sales.
- 2. Compuesto según la reivindicación 1 , caracterizado porque R1 significa hidrógeno y R2 significa 2, 2-dimet¡l-1 -butilo o trimetilsililmetilo, o R1 significa tpfluorometilo y R2 significa 2,2-d?met?l-1-prop?lo, 2, 2-d?met?l-1 -butilo o tpmetilsililmetilo
- 3 Compuesto según la reivindicación 1 , caracterizado porque R1 significa hidrógeno y R2 significa 2,2-d?met?l-1 -butilo, 2-et?l-2-met?l-1 -butilo, 2,2-d?et?l-1 -butilo tpmetilsililmetilo
- 4 Compuesto según la reivindicación 1 con la siguiente estructura 3-(tr?met?ls?l?l)-D-alan?l-3-(p?r?d?n-3-?l)-L-alan?l-des-(1 -D-leuc?l-2-L-leuc?l)l?sobact?na O, -NH, o una de sus sales, sus solvatos o los solvatos de sus sales
- 5 Procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1 , caracterizado porque se hace reaccionar el compuesto de fórmula NH con un compuesto de fórmula en la que R1 y R2 tienen el significado dado en la reivindicación 1 , y X1 significa halógeno, preferiblemente bromo, cloro o flúor, o hidroxí.
- 6. Compuesto según una de las reivindicaciones 1 a 4 para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades.
- 7. Uso de un compuesto según una de las reivindicaciones 1 a 4 para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades.
- 8. Uso de un compuesto según una de las reivindicaciones 1 a 4 para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la profilaxis de infecciones bacterianas.
- 9. Medicamento que contiene un compuesto según una de las reivindicaciones 1 a 4 en combinación con un coadyuvante inerte no tóxico farmacéuticamente adecuado.
- 10. Medicamento según la reivindicación 9 para el tratamiento y/o la profilaxis de infecciones bacterianas.
- 11. Procedimiento para combatir infecciones bacterianas en personas y animales mediante la administración de una cantidad antibacterianamente eficaz de al menos un compuesto según una de las reivindicaciones 1 a 4, un medicamento según ia reivindicación 9 o un medicamento obtenido según la reivindicación 7 u 8. RESU M EN La invención se refiere a nonadepsipéptidos (derivado de lisobactina) y a procedimientos para su preparación, así como a su uso para la preparación de medicamentos para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades, especialmente enfermedades infecciosas bacterianas. Los nuevos derivados de lisobactina se diferencian de la sustancia natural por la cadena de peptidos terminales N que abarcan un resto de 3-(piridil-3)-alanil.
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