JPH0272144A

JPH0272144A - Ｆｒ９００２８０物質およびその製造法

Info

Publication number: JPH0272144A
Application number: JP63223049A
Authority: JP
Inventors: Hidetsugu Murai; 村井　英継; Michio Yamashita; 道雄山下; Masanori Okamoto; 正則岡本; Keizo Yoshida; 吉田　啓造; Masakuni Okuhara; 奥原　正国
Original assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1988-09-06
Filing date: 1988-09-06
Publication date: 1990-03-12

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］この発明は生理活性を有するＦＲ９００２８０物質また
はその塩およびそれらの製造法に関する。

［発明が解決しようとする課題］ＦＲ９００２８０物質の塩としては医薬として用い得る
無毒性の塩が挙げられ、それらには塩基との塩および酸
付加塩が含まれる。塩基との塩としては具体的にはアル
カリ金属（ナトリウム、カリウムなど）との塩、アルカ
リ土金属（カルシウム、マグネシウムなど）との塩、ア
ンモニウム塩などの無機の塩基との塩、有機アミン（ト
リエチルアミン、ピリジン、ピッリン、エタノールアミ
ン、トノエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、
ジベンジルアミン、Ｎ、Ｎ’　−ジベンジルエチレンジ
アミンなど）との塩などが挙げられる。

酸付加塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、りん酸な
どの無機酸との塩、有機カルボン酸あるいはスルホン酸
（ぎ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、マレイン酸、酒石酸
、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエ
ンスルホン酸など）、アミノ酸（アルギニン、アスパラ
ギン酸、グルタミン酸など）との塩などが挙げられる。

［課題を解決するための手段］この発明のＦＲ９００２８０物質はフミコラ属に属する
ＦＲ９００２８０物質生産菌を培地に培養し、得られる
培養液からＦＲ９００２８０物質を分離採取することに
よって得ることができる。

この発酵工程の詳細は下記の通りである。

）生産菌ＷＦ２４２１株は岡山県津山市で採取された土壌試料か
ら分離きれた。

Ａ、生理学的性質生育温度：８−３８℃ （最適生育温度：２３−２７°Ｃ）生育ｐＨ範囲、４．２−８．２（最適生育ｐＨ範囲：５．３）（ポテトデキストロース寒天による）Ｂ、培養および顕微鏡による観察ポテトデキストロース寒天上ではかなり急速に生育し、
アレウロ型分生子は気菌糸の側面に速かにかつ大抵は豊
富に形成される。

気菌糸は生育当初はほとんど白色で、やがて極めて淡い
灰色となり、やがて少しずつ濃くなり、最終的にはほと
んど暗色となる。この色は気菌糸の側面に形成された暗
色のアレウロ型分生子の色によるものである。

アレウロ型分生子をきさえる小柄もまた顕微鏡下では暗
色である。一方、気菌糸は一見無色ではあるが、がたま
りとなると検知できる程度の量の色素を含有する。アレ
ウロ型分生子は平滑で、暗色で一つの細胞からなり、概
して球状であるが、時としては倒卵形であったり、洋な
し形であったりし、その細胞壁は堅固で厚い。

アレウロ型分生子は基本的には単生であり、２個ないし
３個がくっつき合っていることはほとんどない。

大部分のアレウロ型分生子は直径１２−１５μの範囲に
入るが、場合によってはこれ以下の、あるいはこれ以上
の太ききとなる場合もある。

フィアライドは単一で、細長い先細の細胞で８−１６Ｘ
　２−３μであり、気菌糸の側面に形成される。

フィアライドに形成された分生子は、小さく、透明で、
倒卵形で３−２μの大きさであり、それらは分生予調ま
たは分生子塊を形成する。

以上のごとく、ＷＦ２４２１株の特徴は培地上で、暗色
の球形で、厚い細胞壁をもつ直径１２−１５μのアレウ
ロ型分生子を形成することにあり、このことから、ＷＦ
２４２１はフミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ旺旦
憇）であると同定し、フミコラ・グリセアＷ２４２１　
（）Ｉｕｍｉｃｏｌａ　旺垣肋ＷＦ２４２１　）と命名
した。

フミコラ・グリセアＷＦ２４２１は茨城系つくば南東１
工目１−３　工業技術院微生物工業技術研究所に徽工研
菌寄第１０１３５号として昭和６３年７月１４日に寄託
されている。

ｉ　）　ＦＲ９００２８０物質の生産この発明のＦＲ９００２８０物質はフミコラ属に属する
ＦＲ９００２８０物質生産菌を常法によって培地に培養
し、得られる培養液からＦＲ９００２１３０物質を分離
採取することによって得ることができる。

培地に添加する好適な炭素源としてはグルコース、澱粉
、キシロース、グリセリンのような炭水化物などが挙げ
られる。

培地に添加する好適な窒素源としては酵母抽出液、ペプ
トン、グルテンミール、綿実粉、大豆粉、コーンステイ
ブリカー、乾燥酵母、小麦胚芽のほか、アンモニウム塩
（硝酸アンモニアム、硫酸アンモニウム、りん酸アンモ
ニウムなど）、尿素、アミノ酸などが挙げられる。

これらの炭素源や窒素源は必ずしも純粋なものでなくて
よく、あまり純粋でないものの方が、微量の生育因子や
適量の無機物を含んでいることによってよい結果を招く
こともある。

また、適宜、炭酸ナトリウムまたは炭酸力ルシラムなど
、りん酸ナトリウムまたはリン酸カリウムなど、塩化ナト
リウムまたは塩化カリウムなど、ヨウ化ナトリウムまた
はヨウ化カリウムなどマグネシウム塩、銅塩またはコバ
ルト塩などを添加してもよい。

大量生産には深部培養を用いるのがよい。

培養は培養条件や規模によって異なるが通常１０〜４０
℃、好ましくは２５〜３５℃で、５０〜１００時間行わ
れる。

ＦＲ９００２８０物質は、多くの場合、培養液の培養濾
液に見出されるので培養濾液から常法によって分離採取
することができる。

分離採取きれたＦＲ９００２８０物質は分離採取の方法
によって、遊離の形である場合もあり、塩の形である場
合もある。それらは常法によって相互に変換することが
できる。

ｉ　）　ＦＲ９００２８０物質の物理化学的性質このよ
うにして得られるＦＲ９００２８０物質は下記の物理化
学的性質を有する。

ａ　）　Ｎａ塩 ■外　　観：白色粉末 ■性　　状：酸性物質 ■融　　点＝２２０°Ｃ（分解） ■比旋光度：［α］乙５°０（Ｃ＝１．　Ｈ２Ｏ）　４
３２゜■分子式：　Ｃｔ９Ｈｔ９ＮｚＯｇＮａ■元素分
析：　Ｃ，５３，００；　Ｈ，４，６３；　Ｎ、　６．
３９ｉＮａ、　５．６１　（Ｘ）［計算値：Ｃ，５３，５２；　Ｈ，４，４１Ｎ、　６．
５７；Ｎａ、　　５．３９　（Ｘ）コ ■ｐＫａ　　　　３．ＬＬ、　７．２８■紫外部吸収ス
ペクトル中性、塩酸酸性水溶液下２８２午（ε　４．９００＞水酸化ナトリウムアルカリ性水溶液下３１３雫（ε６．８７０） ■赤外吸収スペクトル： ””　４３２５０．２９２０　（ｆｆ）、　２９００゜
シＩ、１ａｘ２８５０、２７２０．２７００〜２０００．１６５０゜
１５９５、１５５５　（肩）、　ｔｓｔｏ　（肩）。

１４９５、１４５８．１３７５．１３０５．１２６８゜
１２３０、１１６８．１１３９．１１１５．１０５７゜
１０３７、９６８．８９５．８２５．７２０　ｃｍ−１
０１Ｈ核磁気共鳴スペクトル：（ｏ２ｏ）ｇ　　（ｐｐｍ）　　’　　３．５４　　（
２Ｈ１ｍ）、　４．８８（２Ｈ，ｍ）、　５．１４　（
ＩＨ，ｄ、Ｊ＝６Ｈｚ＞、　６．９５−８．０１　　（
８Ｈ，ｍ） ■溶解性二本に可溶アセトン、クロロホルム、酢酸エチルに不溶ｏ′ｗＩ層クロマトグラフィ（シリカゲル・プレート）
ニジリカゲル：Ｋｘｅｓａｌｇｅｌ　６０　Ｆ２５４（メルク社製）０
呈色反応硫酸セリウム反応　　　　陽性ヨード反応　　　　　　　陽性エールリッヒ反応　　　　陽性ニンヒドリン反応　　　　陰性ドラーゲンドルフ反応　　陰性以上の物理化学的性質およびその他の研究からＦＲ９０
０２８０物質は下記構造式を有することが判明した。

ＦＲ９００２８０物質のメチルエステルの製造−２０℃
で冷却下３０分間ジアゾメタンに処理し、濃縮乾固し、
ＦＲ９００２８０物質のメチルエステルを得た。

［作用コこの新規なＦＲ９００２８０物質およびその塩はアルド
ースリダクターゼ阻害活性を有していることが見出され
、たとえば角膜損傷癒合欠損、白内障、二ニーａパンー
１網膜症、腎障害のような糠床病合併症とくに白内障や
ニューロパシーの治療的処置のための薬剤として価値が
ある。

ＦＲ９００２８０物質のアルドースリダクターゼ活性活
性値を下に示す。

（１）酵素アッセイ法：０．５Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ６，２）　　　　　　　０
．１戚２、０Ｍ　ｒＥＨ’）　ｆ　’＞　ム０．２　ｍ
この発明の化合物（生理食塩水に溶かしたもの）　　　　０．１ｍ１ｌ酵素溶液（アルドース・リダクターゼ溶液、下記（２〉で調整したもの）　　　０．５ｍＱ６
０ｍＭＤ、Ｌ−グリセルアルデハイド　　　０．０５ｍ
ｍ２、５＋ｍＭニコチンアミド　アデニン　ジヌクレオ
チド　ホスフェート（還元体）（ＮＡＤＰＨ）　　　　
　　　　　　　　　　　０．０５ｍＡ上記反応液を３５
゛Ｃで２分間反応したときのＮＡＤＰＨの減少度合をエ
ルケービー　プロダクター（Ａ、Ｂ、社製）　（ＬＫＢ
　Ｐｒｏｄｕｃｔｅｒ　Ａ、Ｂ、　）のオートマチック
　リアクション　レート　アナライザーエルケービー−
８６００（Ａｕｔｏｍａｔｉｃ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｒ
ａｔｅＡｎａｌｙｚｅｒ　ＬＫＢ−８６００）を用いて
測定した。吸光度の変化が１分間当り０．００１のとき
酵素活性を１単位と決めた。

（２）酵素溶液の調製うさぎの眼をとり、そこから水晶体を集める。

４°Ｃ（以下の操作も全て４°Ｃで行った）で水晶体を
３倍量の蒸留水でホモジナイズし、次に１０，０００Ｇ
で６０分間遠心分離して、上澄液を得た。この上澄液を
０．０５Ｍ食塩水２Ｎに対して透析した。このようにし
て得られた透析内液を酵素溶液として使用する。

（３）テスト結果結果を以下の表に示す。

各々のＩＣ５ｏ値（Ｍ）は、アルドースリダクターゼ活
性を５０％抑制するときの本発明化合物の濃度をあられ
す。

以上の試験結果からこの発明のＦＲ９００２８０物質お
よびその塩がアルドースリダクターゼ阻害活性を有する
ことは明らかである。

この発明のＦＲ９００２８０物質またはその塩を含有す
る医薬組成物は、例えば、ＦＲ９００２８０物質または
その塩を外用、内用または非経口用に適した有機もしく
は無機担体もしくは賦形剤と混合して、固体、半固体ま
たは液体の形で医薬製剤の形として使用することができ
る。

それらの医薬製剤は錠剤、ペレット、カプセル、生薬、
溶液、エマルジョン、懸濁液およびその他の使用に適し
たあらゆる形状に混合して製剤化したものを含む。

また必要に応じてさらに、助剤、安定剤、濃厚止剤およ
び着色剤ならびに芳香剤を使用してもよい。

ＦＲ９００２８０物質またはその塩は医薬組成物中に、
疾患の過程または条件に合わせた所望の効果を発揮する
のに十分な量含有されていればよい。

組成物を人に適用するには静脈内注射、筋肉的注射また
は経口投与によって適用するのが好ましい。

ＦＲ９００２８０物質またはその塩の治療のための有効
投グー量は、治療すべき各個々の患者の年齢および条件
によって変化するが、一般的には静脈内投与の場合には
ＦＲ９００２８０物質またはその塩を１日当りに人の体
重ｋｇ当り０１〜１００ｍｇ、筋肉内投与の場合にはＦ
Ｒ９００２８０物質またはその塩を１日当りに人の体重
―当り０．１〜１００ｍｇ、経口投与の場合にはＲ９０
０２８０物質またはその塩を１日当りに人の体重−当り
０１〜１０００ｍｇ投与する。

［実施例コに直■ユコーンスターチ２０％、クルコース０．５％、大豆粉１
，０％、乾燥酵母１．０％およびコーンスターブリ力−
１，０％（ｐＨ７，０に調整）からなる培地１６０ｍ１
ｉずつを５００−フラスコ５本に入れ、滅菌し、フミコ
ラ・グリセアＷＦ２４２１株の１白金耳を植えて２８℃
、７２時時間上う培養した。

次に変性澱粉１．５％、クルコース２．０％、綿実粉０
２５％、グルテンミール０．２５％、乾燥酵母０．２５
％、小麦胚芽０．２５％、ＣａＣＯ３０，２％およびＦ
ｅ５０４７Ｈ２００，０２５％（ｐＨ無修正）を含む培
地１６０！を２００ｅ容培養タンクに入れ！滅菌し、上
で得た培養液（総１ｓｏｏｒｒＩｆ１）を植え、２８°
Ｃで７２時間培養した。

培養液を濾過し、１５０！の濾液を得て、これを２０２
の活性炭（和光紬薬製）に吸着きせ、６０ｆｆｉの水で
水洗後、８０％アセトン水６０１で活性物質を溶出した
。溶出液を減圧下濃縮し、６２の水溶液とした。これを
１．２２のＤＥＡＥセファデックスＡ−２５（ファルマ
シア・ジャパン株式会社製）　［ｐＨ６，５のリン酸緩
衝液で緩衝化コカラムに吸着させた。

カラムを２乏の水で水洗し、続いて０．１Ｍ食塩水２ｅ
で不純物を溶出させた後、０．５Ｍ食塩水２ｅで活性物
質を溶出した。＃出液を５００１１ＬＱの活性炭（和光
紬薬製）カラムに吸着させ、水洗後ＩＰの８０％アセト
ンで活性物質を溶出させた。これを減圧下濃縮乾固し、
杓５０ｇのシリカゲル（Ｋｉｅｓｃｌｇｅｌ　６０．７
０〜２３０　ｍｅｓｈ、メルク社製）と混合した。これ
を９０％インプロパツール水でバックしておいたシリカ
ゲル（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ　ｍｅｓｈ、　　メルク社製
６０．７０〜２３０）カラム（約５００１１１９　）上
に付し、９０％イソプロパツール水で展開すると活性物
質は１．２〜１６ρの両分に溶離した。これを濃縮し、
３ＱｍＱの水溶液とした後、ＣＭ−セファデックスＣ−
２５［１，２１，Ｈ＋タイプ］（ファルマシア・ジャパ
ン株式会社製）に吸着させ、水で展開すると１６００〜
１９００ｍ１ｌの両分に活性物質が遊離酸として溶出き
れた。この分画を水酸化ナトリウム水溶液でｐ）１５．
５とした後、凍結乾燥し、ＦＲ９００２８０物質のＮａ
塩の白色粉末２４ｇを得た。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされるＦＲ９００２８０物質またはその塩。
（２）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされるＦＲ９００２８０物質またはその塩を、フ
ミコラ属に属するＦＲ９００２８０物質生産菌を培地に
培養し、得られる培養液からＦＲ９００２８０物質を分
離採取することを特徴とするＦＲ９００２８０物質また
はその塩の製造法。