JPH01228481A - 新規抗コリン物質ｐｆ６７６６及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規な抗コリン物質ＰＦ６７６６及びその製造
法に関する。

〔従来の技術〕

従来、植物が生産するアルカロイド中に抗コリン活性を
有するものが知られている。

〔発明が解決しようとする課題］ 本発明は医療用として有用な新規抗コリン物質を得るこ
とを目的とする。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは有用な微生物生産物を見出す目的で天然の
土壌より数多くの微生物を単離し、その生産物について
４々研究を行った。その結果本発明者らが新たに土壌か
ら分離したペニシリウム属に属する微生物を培地中に層
重すると、培養液中に優れた抗コリン活性を有するＰ］
１Ｐ６７６６物質が生産さｎることを見出した。

すなわち本発明は、新規な抗コリン物質ＰＦ６７６６及
びその製造法を提供するものである。

１、生産菌 本発明に用いる抗コリン物質ＰＦ６７６５生産菌はペニ
シリウム属の１株でＰＩ？６７６６物質生産能を有する
ものであればよく、特に限定はない。Ｕ」えばＰＦ６７
６６株が挙げらルる。

１）寄託番号 昭和６３年１月２９日に工業技術院微生物工業技術研究
所にＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｓｐ、　Ｐ　Ｆ６７６６
と表示し微工研菌寄第９８４７号（ＦＢＲＭ　　Ｐ−９
８４７）として寄託されている。

２）菌学的性状及び生理学的性質 （１）集落、性質 ■　各培地における生育状態 第　１　表 ２７℃、１４日間培養後の観察結果 を示した。

（２）生理的性質 生Ｗ温度範囲　　　１４〜３１℃ 至適生対温度範囲　２７〜３１℃ （３）顕微鏡的性質 ■　分生子柄　２〜３μｍφＸ２Ｓ〜１００μｍ滑らか
〜わずかに粗面 ■　ブランチ　２．６〜五６μｍφ×１４〜２０μｍ■
　メツレ　　２〜３ケ、２．５〜３μｍφ×１４〜２４
μｍ ■　梗　子　　３〜８ケ、２〜２．８μｍφ×８〜１０
　μｍ びんのような形状（細短 かいａのびん） ■　分生子　　球状、滑らか、２．３〜２．５μｍφ ５０〜１００μｍやや短かい 連鎖 以上の性質を要約すると １、　各種培地上でベルペット状に生育する。

２　分生子柄の先端に頂のうを作らず、分岐して梗子が
ほうき状体を形成する。

五　はうき状体は分岐しておシ、通常メツレの位置より
下方で１本若しくはそ れ以上のブランチを有する。

屯　分岐の様式は非対称形（ａｓｙｍｍｅｔ−ｒｉｃａ
　）　　である。

５　ブランチ先端には通常２〜５本のメツレが分岐して
いる。

＆　メツレ先端には通常３〜８本の梗子があり、梗子は
細長い洋ナシ〜細短い 首のびん様の形状である。

Ｚ　梗子先端には分生子が鎖状に漕生じ、分生子の平面
は滑らかで直径は２−３〜ｚ５μｍである。

上記特性から、ＰＦ６７６６株はペニシリウム属に属す
ると思われる。よってＰＦ６７６６株ｔペニシリウム・
エスヒ− （Ｐｅｎ１ｃｉ’ｌｌｉｕｍ　ｏｐ、　）　　Ｐ　１Ｐ
６７６６と称する。

２　培ｉ／ＰＦ６７６６の生産 新規抗コリン物質ＰＩ’６７６６は、ペニシリウム属に
属するＰＰ６７６６生産菌を適当な培地で好気的に培養
し、培養物から目的物質を採取することによ−り製造す
ることができる。

店地は、ＰＩＰ６７６６生産菌が利用しうる　　１任意
の栄望源を含有するものでありうる。具　　。

体内には、例えば、炭素源としてグルコース、　・フラ
クトース、マルトース、スターチ及び油　　式脂類など
が使用でき、窒素源として大豆粉、　　４綿実粕、乾燥
酵母エキス、ポリペプトン及びコーンステイープリカー
などの有機物並びに　　−アンモニウム塩又は硝蓋塩、
例えば硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム及び塩化アン
モニウムなどの無機物が使用できる。また必要に　　１
応じて食塩、塩化カリウム、リン酸塩、重金　　を属塩
など無機塩類を添加することができる。

発酵中の発泡を抑制するために、常法に従って適当な消
泡剤、例えばシリコーン系消泡剤を添加することもでき
る。

培養方法゛としては、一般に行われている生理活性物質
等の生産方法であればよく、特に好気的液体深部培養法
が適している。培製温度は１４〜３１℃が適当であるが
、２７〜３１℃が好ましい。この方法でＰＩＰ６７６６
物質の生産量は、振とり培養、通気かくはん培養共に培
養４〜７日間で最高に達する。このようにしてＰＦ６７
６６の蓄積された培養物が得られる。培養物中では、Ｐ
Ｆ６７６６儂菌体中及び培養ｐ液中に存在する。

このような培養物からＰＦ６７６６を採取するには、合
目的な任意の方法が利用可能でちる。その１つの方法は
、抽出の原理に基づくものであって、具体的には飼えば
培養ｐ液中のＰＦ６７６６については水不混和性の溶某
列えば酢酸エチル、ｎ−ブタノールなどで抽出する方法
、あるいは菌体内のＰＦ６７６６については濾過又は遠
心分離などで得た菌体集体をメタノール、エタノール、
アセトンなどで処理して回収する方法がある。菌体を分
離せずに培養物そのままを上記の抽出操作に付すことも
できる。適当な溶媒を用いた向流分配法も抽出の範ちゅ
うに入れることができる。

培養物からＰＦ６７６６ｆｔ採取する他の方法の１つは
、吸着の原理に基くものである。

例えば培養涙液あるいは上記のようにして抽出操作を行
うことによって得られる抽出液を対象として、適当な吸
１剤、ゲル濾過剤、ないしイオン交換樹脂、例えばシリ
カゲル、「セファデックスｌ１１１２０Ｊ（ファルマシ
ア社製）、「トヨバールＨＷ４０Ｊ（東洋σ達社製）、
「ダイヤイオンＨＰ−２０４（三菱化成工業社製）など
を用いたカラムクロマトグラフィー、［ヌクレオシル５
Ｃ１＠　Ｊ　（西独ナーゲル社製）などを用いた高速液
体クロマトグラフィー、「アンバーライトｃ　ｏ　−ｓ
　ｏＪ（オルガノ社製）、［ダウエックスｓｏｗＪ（ダ
ウ・ケミカル社製）、「０Ｍセファデックス」（ファル
マシア社製）などを用いたイオン交換クロマトグラフィ
ー、その他によって目的のＰＩ！？６７６６を吸着させ
、その後溶離させることによ５ＰＦ６７６６’を得るこ
とができる。このようにして得られたＰＦ６７６６溶液
を減圧濃縮乾固すれば、Ｐ”１Ｐ６７６６の粗標品が得
られる。

このようにして得られるＰＦ６７６６の粗標品を更に精
製するためには、上記の抽出法及び吸Ｍ法を必要に応じ
て組合せて必要回数行えばよい。例えば、「ダイヤイオ
ンＨＰ−２０」、「セファデックスＩ、Ｈ−２ＤＪなど
の吸着剤又はゲル濾過剤を用いたカラムクロマトグラフ
ィー、「０Ｍセファデックス」などを用いたイオン交換
クロマトグラフィー、及び「ヌクレオシル５Ｃ１，」な
どを用いた高速液体クロマトグラフィーを適宜組合せて
実施することかできる。

五　ＰＦ６７６６物質の物理化学的性質■　元素分析（
実測値） ｃ　　　　　　　　　　　ＨＮ ５五９２％　　　６０４％　　　＆０１嘩■　）Ｆ　Ａ
　Ｂ　（Ｆａｓｔ　Ａｔｏｍ　Ｂｏｍｂａｎｃｌｍｅｎ
ｔ　）　−ｖススベクトル ｍ／Ｚ　４６６が観測された。

■　融点 明確な融点を示さず、１４０℃よシ徐々に着色し分解し
た。

■　比旋光度 〔α〕背＝＋１５２．６°（ｃ＝αｏ６、メタノール）
■　紫外部吸収スペクトル ８ｇ１図のとおシ、すなわち第１図はＰＩＦ６７６６の
紫外部吸収スペクトル図であシ、横軸は吸光度、縦軸は
波長（ｎｍ　）を表す。

図中、実線はメタノール中、破線は［ＬＯ５Ｎ　ＨＣｌ
−メタノール中、−点鎖線はα０５Ｎ　ＮａＯＨ−メタ
ノール中の各測定値である。

’ｍａ工＜　ｎ　１優）： メタノール中　　３３５（５０）、２６２（θｈ、。

８４）、　２４５（１４３）、 ■　赤外部吸収スペクトル（ＫＢｒ法）第２図のとお）
、すなわち第２図はＰＦ６７６６のＫＥｒディスク法に
よる赤外吸収スペクトル図であり、横軸は波数（α−１
）、縦軸は吸光度を表す。

νＫＢｒ：　　３４５０．１６９０．１４５０．１２１
５、ａｘ １１４０５１−’ の　ｌＨ−ＮＭＲスペクトル（１９９，５０ＭＨ２）第
３図のとおυ、すなわち第３図はＰＦ６７６６の重メタ
ノール中における１９９．５０ＭＨｚ　’Ｈ−ＮＭＲス
ペクトル図であシ、横軸はδ（ｐｐｍ　）、縦軸は相対
強度を表す。

δ　　：　　７．８７（ＩＨ，ｄ、Ｊ−ａＯＨ２）、７
．６２（ＩＨ，ｄ、　、７２９ｍ −ａＯＨｚ）、７．２２（１）１．　ｔ、　Ｊ＝４０Ｈ
ｚ）、４．２９（ＩＨ，８）、五１〜五６（ｍ）、五Ｏ
３（Ｉ　Ｈ。

ｄ、　Ｊ−１４，０Ｈ２）、２．６４（ＩＨ，ｄｄ、　
Ｊ−１２，０Ｆｉｚ及びｔｏｎｚ）、２．５３（３Ｈ，
ｓ）、２．４３ＣＩＨ，ｄ、　Ｊ＝１５．０Ｈｚ）、１
．６〜２．３（ｍ）、ｔ５８（３Ｈ，ｓ）　、　１．３
７（３Ｈ，ｄ、、Ｔ−７，０Ｈｚ）、１．１９（５Ｈ，
θ）、１．０４（３Ｈ，ｓ）、α９３（５Ｈ，ａ） 重メタノール中テトラメチルシラン （ＴＭＳ　）を基準物質として測定した。

■　”Ｃ−ＮＭＲスペクトル（５α１０　ＭＨｚ　）第
４図のとおシ、すなわち第４図はＰＦ６７６６の重水中
における５α１０　ＭＨｚ１３　Ｃ−ＨＭＲスペクトル
図であり、横軸はδ（ｐｐｍ　）、縦軸は相対強度を表
す。

δ　　　　：　　　１９７．０（Ｆ３）　、　１８６．
５（日）、　１４五６（θ）、９９ｍ １５４．５（θ）、１３五１（ｄ）、１２９．３（ｄ）
、１２２．９（ｃｌ）、　１１７．８（１３）、　６＆
２（ｄ）、６４．４（Ｂ）、　６１２（８）、　６１．
３（ｓ）、５９．９（ｔ）、　５９．２（ｄ）、　５ａ
７（ｄ）、５４．２（ｄ）、　４ａ１（ｄ）、　３９．
４（ｔ）、ａｔ５（ｔ）、　３α１（ｔ）、　２ａ４（
ｑ）、２＆８（ｔ）、　２４．８（ｑ）、　２ｔ２（ｑ
）、２ｘ８（ｑ）、　１ａ２（ｑ）、　１７．１（ｔ）
、１２．２（（１） 重水中ジオキサンを基準物質として測定した。

■　溶解性 水、メタノール、酢酸エチル、クロロポルムに可溶 ｎ−ヘキサン、エーテルに難溶 Ｏ物質の色及び性状 無色〜白色、固体 Ｏ呈色反応 ドラーゲンドル：’　ｉＩｔ性 Ｏ薄層クロマトグラフィー （メルク社「シリカゲル”　ＦｚｓＪ使用）展開溶媒系
　　　　　　　Ｒｆ値 クロロホルム／メタノール／２８％アンモ　　［Ｌ８３
ニア水＝１００／１／２ ベンゼン／酢ｆｉエチル／２８％アンモニア　　α６１
水＝４０／１０／１ ４、　　ＰＩＰ６７６６物質の用途 本発明によるＰＦ６７６６物質は、ムスカリン様アセチ
ルコリンのレセプターへの結合阻害活性及び摘出回腸を
用いたアセチルコリンの平滑筋収縮作用に対する阻害活
性を有するという点で有用である。すなわち眼科領域に
おいて散瞳薬、調節機能麻痺薬としての用途、胃腸管の
けいれん・運動機能先進、胆管や尿路のけいれん・運動
障害、女性生殖器のけいれんなどの各種平滑筋収縮の際
の鎮けい薬としての用途、麻酔前処置、制汗剤など分泌
抑制薬としての用途、パーキンソン病、振戦ｇ痺、舞踏
病などの錐体外路系疾患治療への用途、抗コリンエステ
ラーゼ系農薬中毒の治療への用途、胃潰扇、十二指腸潰
瘍に対する抗潰瘍剤としての用途がある。要約すると、
抗コリン剤、抗潰瘍剤、鎮けい剤としての用途がある。

生理活性 １）レセプター結合阻害活性 ＰＦ６７６６は、ムスカリン様アセチルコリンアンタゴ
ニストであるキヌクリジニル・ベンジＶ−）（ＱＮＢ）
のムスカリン様アセチルコリンレセグターへの結合を阻
害した。

例えば、モルモット脳ホモジネートを１％（Ｗ／￥％）
となるように５０　ｍＭのトリス塩酸バッファー（ｐＨ
７，４）に懸濁し、トリチウムラベル化した（”Ｈ」−
Ｑ、ＮＢを１．６５ｍＭとなるように添加し、種々の濃
度のＰＦ６７６６を添加した際のレセプター結合阻害活
性は第２表のとお９でるる。

第２表 試　料　　試料濃度（μｇ／−）　結合阻害活性＠）　
　ＩＣ３゜ＰＦ６７６６　　　　　　α１０　　　　　
　　　１ｊＩ１３９　　　　　　　　　　３５　　　　
　　　　ＣＬ７５１．５６　　　　　　６６　　　　　
μｇｊ’ｍｌ＆２５　　　　　　　　　　　１３９ ２）摘出回腸における抗コリン活性 ＰＦ６７６６は、摘出回腸におけるアセチルコリンの平
滑筋収縮作用を阻害した。列えハ、ハートＶイ系モルモ
ット（２５０〜５５０　ｔ、雄）の回腸を摘出後３７℃
のタイロード液中マグヌス法にて抗コリン活性を測定シ
たところ、Ｚ７Ｘ１０−７Ｍのアセチルコリンの平滑筋
収縮作用を５０％阻害する濃度、すなわちＫＤ、。はＣ
Ｌ８μｇ／ｗｄであった。

〔実施列〕

以下、本発明を実施例によシ更に具体的に説明するが、
本発明はこれら実施例に限定されない。

以下において「％」は「ｗ／′ｖ％」を示す。

実施Ｐ２す１ （１１種母の調製 使用した培地は、下記の組成の成分を１ｔの水に溶解し
たものである。ｐＨは無調整とした。

グルコース　　　　五〇％ ポリペプトン　　　（１５％ 酵母エキス　　　　ＣＬ１％ リン酸１カリウム　　　　　［１１％ 硫酸マグネシウム　　　　［ＬＯ５％ 上記培地５０−を５００−の三角フラスコに分注し殺菌
後、ペニシリウム・エスピー”ＰＩＦ６７６６株（ＩＰ
ｚＲＭ　Ｐ−９８４７）ｔ、スラントより１白金耳接種
し、２７℃、２００ｒｐｍのロータリーシェカーにて７
２時間回転△ 培養したもの全種母とした。

（２）培養 使用した培地は種母の調製に用いた培地と同じものを用
いた。この培地を５００−ずつ２ｔの三角フラスコに分
注殺菌したものへ、上記種母１０ｓｄを添加し、ロータ
リーシェーカーを用いて２７℃、１６０　ｒｐｍにて回
転培養を行った。

（３）ＰＦ６７６６の採取 上記（２）の条件で４日間の培養の後、培養液５ｔを濾
過し、Ｆｉ上清は酢酸エチルにて抽出を行い、また菌体
はメタノール処理後、メタノールを留去した後、酢酸エ
チルにて抽出　４を行いこれを先の酢酸エチル抽出溶媒
層と合せ、減圧下にて濃縮乾固する。得られたＰＦ６７
６６粗抽出物約１．５２をシリカゲル（メルク社製）カ
ラムクロマトグラフィーに付す。

クロロホルム−メタノール系の溶媒にて展開し、クロロ
ホルム／メタノール＝１０／１にて溶出されるＰＩＰ６
７６６７ラクシヨンを得る。

これを！Ｉ縮乾固後メタノールに溶解し、その一定量を
［ヌクレオシル５Ｃｔａ　Ｊのカラム（１０■φＸ　２
５０　ｍ　）を用いた高速液体クロマトグラフィーにか
け、ＣＬ１％のトリフルオロ酢酸を含む水とアセトニト
リルの系で溶出し、ＰＦ６７６６フラクシヨンを得る。

これを濃縮乾固してＰＦ′６７６６の無色〜白色の固体
４．３岬が得られた。

〔発明の効果〕

以上詳細に説明した通り、本発明により抗コリン活性を
有する新規物質及びその製造方法が提供された。

【図面の簡単な説明】

第１図はＰＦ６７６６の紫外部可視部吸収スペクトル図
、第２図はＰＦ６７６６のｌｌｒディスク法による赤外
吸収スペクトル図、第５図はＰＦ６７６６の重メタノー
ル中における１９９．５０ＭＨｚ　ｌＨ−ＮＭＲ２ベク
トル図、第４図はＰＦ６７６６の重水中における５　［
１１０ＭＨｚ　”Ｏ−ＮＭＲスペクトル図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の理化学的性質を有する抗コリン物質ＰＦ６７
   ６６ 元素分析（実測値） Ｃ５３．９２％ Ｈ６．０４％ Ｎ６．０１％ 〔α〕＾２＾０＿Ｄ＝＋１３２．６°（ｃ＝０．０６、
   メタノール）紫外部吸収スペクトル λ＿ｍ＿ａ＿ｘ（Ｅ＾１＾％＿１＿ｃ＿ｍ）：メタノー
   ル中３３５（５０）、２６２（ｓｈ．，８４）、２４５
   （１４３）、２２８（１０７） ０．０５ＮＨＣｌ−メタノール中３３１（５０）、２６
   ２（ｓｈ．，８１）、メタノール中 ２４５（１４１）、２２１（１１２） ０．０５ＮＮａＯＨ−メタノール中３３７（５０）、２
   ６２（ｓｈ．，９４）、メタノール中 ２４７（１３６）、２２９（１０２） 赤外部吸収スペクトル（ＫＢｒ法） ν＾Ｋ＾Ｂ＾ｒ＿Ｍ＿ａ＿ｘ：３４５０、１６９０、１
   ４５０、１２１５、１１４０ｃｍ＾−＾１ ＾１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（１９９．５０ＭＨｚ）δ＿
   ｐ＿ｐ＿ｍ：７．８７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）、
   ７．６２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）、７．２２（１
   Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）、４．２９（１Ｈ，ｓ）、３
   ．１〜３．６（ｍ）、３．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１４．
   ０Ｈｚ）、２．６４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ及
   び６．０Ｈｚ）、２．５３（３Ｈ，ｓ）、２．４３（１
   Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．０Ｈｚ）、１．６〜２．３（ｍ）、
   １．５８（３Ｈ，ｓ）、１．３７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．
   ０Ｈｚ）、１．１９（３Ｈ，ｓ）、１．０４（３Ｈ，ｓ
   ）、０．９３（３Ｈ，ｓ） ＾１＾３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（５０．１０ＭＨｚ）δ
   ＿ｐ＿ｐ＿ｍ：１９７．０（ｓ）、１８６．５（ｓ）、
   １４３．６（ｓ）、１３４．３（ｓ）、１３３．１（ｄ
   ）、１２９．３（ｄ）、１２２．９（ｄ）、１１７．８
   （ｓ）、６６．２（ｄ）、６４．４（ｓ）、６２．２（
   ｓ）、６１．３（ｓ）、５９．９（ｔ）、５９．２（ｄ
   ）、５８．７（ｄ）、５４．２（ｄ）、４８．１（ｄ）
   、３９．４（ｔ）、３１．５（ｔ）、３０．１（ｔ）、
   ２８．４（ｑ）、２６．８（ｔ）、２４．８（ｑ）、２
   ４．２（ｑ）、２３．８（ｑ）、１８．２（ｑ）、１７
   ．１（ｔ）、１２．２（ｑ） 溶解性 水、メタノール、酢酸エチル、クロロホル ムに可溶 ｎ−ヘキサン、エーテルに難溶 物質の色及び性状 無色〜白色、固体 呈色反応 ドラーゲンドルフ陽性 ２、ペニシリウム属に属する請求項１記載の新規抗コリ
   ン物質ＰＦ６７６６生産菌を培養し、その培養物から新
   規抗コリン物質ＰＦ６７６６を採取することを特徴とす
   る新規抗コリン物質ＰＦ６７６６の製造法。 ３、ＰＦ６７６６物質生産菌がＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ
   ｓｐ．ＰＦ６７６６株である請求項２記載の製造法。