JPH03271284A - 新規化合物フォリパスタチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はホスフォリパーゼＡ２阻害作用を有する新規化
合物フォリパスクチン（Ｆｏｌｉｐａｓｔａｔｉｎ）お
よびその製造法に関する。

（従来の技術） 炎症反応では、そこに関与するメデイエータ−類（プロ
スタグランデイン、ロイコトリエン等）は、細胞膜中の
リン脂質と結合しているアラキドン酸から生合成され、
このアラキドン酸放出反応の律速酵素はホスフォリパー
ゼＡ２であるとされている。

一方、ステロイドホルモンは各種の炎症に著効を示すが
、この作用機序の一部がステロイドによって誘導される
タンパク質群（リポコルチンと総称される）によるホス
フォリパーゼＡ２阻害であることを示す多くのデータが
得られている。

従って単独でホスフォリパーゼＡ２を阻害する化合物は
、ステロイドの持つ多様な作用のうちの抗炎症作用のみ
を有し、かつホルモン作用のない薬剤と成りうる。ホス
フォリパーゼＡ２阻害作用を有する化合物として、これ
まで海産物由来のマノアライド（Ｍａｎｏａｌｉｄｅ）
　　（Ｊａｃｏｂｓ、　Ｒ，Ｓ、、らｒＴｅｔｒａｈｅ
ｄｒｏｎＪ　　４１．９８１−９８４　（１９８５）　
）　、シュードブチロシン類（Ｐｓｅｕｄｏｐｔｅｒｏ
ｓｉｎｓ）　　（Ｌｏｏｋ、　Ｓ。

Ａｏ、らｒＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ
ｉ、　ＵＳＡＪ　８３゜６２３８−６２４０　（１９８
６）　）が知られている。しかしながら、阻害の非特異
性、毒性といった面から未だ実用に供されてはいない。

また、現在市販されている抗炎症剤として例えばインド
メサシン（Ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ）　　（Ｋａｐｌ
ａｎ、　Ｌ、。

ら　　ｒＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ
ＡＪ　　　７５．　２９５５−２９５８　（１９７８）
　）があげられる、これは試験管内でホスフォリパーゼ
Ａ２阻害作用を示すことが知られているが、薬効量では
その阻害作用は極めて弱く、更にこれはデプシドン（ｄ
ｅｐｓｉｄｏｎｅ）骨格を有していない。

従来デプシドン（ｄｅｐｓｉｄｏｎｅ）骨格を有する化
合物としては多数知られており、例えば微生物生産物で
あるエメグイシン（ｅｍｅｇｕｉｓｉｎ）　Ａ、　Ｂお
よびＣ（Ｋａｃｙａｈａｒａ、　Ｎ、、ら　ｒＪ、　Ｃ
ｈｅｒａ、　Ｓｏｃ、、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｔｒａｎｓ、Ｊ
　１、（９）、２６１１−２６１４　（１９８８）　）
　、あるいはニヅリン（ｎｉｄｕｌｉｎ）　、デクロロ
ノルニヅリン（ｄｅｃｈｌｏｒｏｎｏｒｎｉｄｕｌｉｎ
）　＋　　トリスデクロロノルニヅリン（ｔｒｉｓｄｅ
ｃｈｌｏｒｏｎｏｒｎｉｄｕｌｉｎ）　　（Ｓｉｅｒａ
ｎｋｉｅｗｉｃｚ、　Ｊ、、らｒＡｃｔａ　Ｃｈｅｍ、
　５ｃａｎｄ、Ｊ　２６、Ｎ（１２゜４５５−４５８（
１９７２）　）　　等をあげることができる。しかしな
がら、これらの化合物が抗炎症作用を有することは知ら
れていない。

（発明が解決しようとする課題） 本発明者らは、ビルのサプライ系ダストより分離したア
スペルギルス属に属する５ＡＮＫ　１６８８８株の培養
物から、ホスフォリパーゼＡ２阻害作用を示し、抗炎症
作用を有する新規化合物フォリパスクチンが生産される
ことを見出して本発明を完成した。

（課題を解決するための手段） 本発明のフォリパスタチンは下記の構造式および理化学
的性状を有する。

ｌ）構造式 ２）物質の性状：中性、脂溶性、白色針状結晶３）融点
：　　２４６−２４８℃ ４）元素分析：　（％） 実測値　　Ｃ１７１，７１Ｈ１６，４６計算値　　Ｃ１
７２，６１Ｈ１６，３６５）分子量：　　３８０　　（
質量分析法により測定）６）分子式：　　Ｃ２３Ｈ２４
０５（高分解能質量分析スペクトル法により測定） ７）紫外線吸収スペクトル：λｍ□ｎｍ（Ｅ；、；）エ
タノール中で測定した紫外線吸収スペクトルは第１図に
示す通りである。

吸収スペクトルは、２１０　（４３、９６３）、　　２
７８（１０，０７４）　ｎｍであり、アルカリ性で２０
７．３２０ｎｍにシフトする。

８）赤外線吸収スペクトル：　”ｌ’　ｚＢ）（Ｃｍ　
’臭化カリウム（ＫＢｒ）錠剤法で測定した赤外線吸収
スペクトルは第２図に示す通りである。

１６７０．１４２３．１２７５．１２６６．１１３１９
）１Ｈ−核磁気共鳴スベクトル：　（δ：ｐｐｍ）重ク
ロロホルム中、内部基準にテトラメチルシランを使用し
て測定した核磁気共鳴スペクトル（２７０Ｍ）（ｚ）は
、第３図に示す通りである。

１．６８（３Ｈ，ｄｄ、Ｊ＝６．９および１．１Ｈｚ）
、１．７８（３Ｈ，ｄｄ、　Ｊ＝６．９および１、１Ｈ
ｚ）、１．８８（３Ｈ，ｔ、Ｊ＝１．２Ｈｚ）、２．０
６（３Ｈ，ｔ、Ｊ＝１．２Ｈｚ）、２．１８（３Ｈ，ｓ
）、 ５．３８（ＬＨ，ｑｑ、　Ｊ＝６．９および１．４Ｈｚ
）、５．５４　（ＬＨ，ｑｑ、Ｊ＝６．６および１．４
Ｈｚ）。

６．６２（ＩＨ，ｓ）、６．５０（ＩＨ，ｓ）、１０）
１３Ｃ−核磁気共鳴スベクトル：（δ：　ｐｐｍ）重ク
ロロホルム中、内部基準にテトラメチルシランを使用し
て測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、
第４図に示す通りである。この実験条件で重クロロホル
ムのシグナルは７０．１　ｐｐｍに発現した。

また、マススペクトルデータと一致して２３個の炭素が
観察された。

８．９３　（ｑ）、９．３２（ｑ）、１４．０５　（ｑ
）、１４．２１　（ｑ）、１７．７６（ｑ）、１８．１
４（ｑ）、１１２．１（ｄ）、１１２−８６（ｄ）１１
３．４４（ｓ）、１１４．７６（ｓ）、１１５．９７（
ｓ）、１２４．６５　（ｄ）、１２６．０７（ｄ）、１
３５．０９（ｓ）、１３６．３（ｓ）、１３７．２１　
（ｓ）、１４３．６１（ｓ）、１４４．８１（ｓ）、１
４９．２８（Ｓ）、１５３．２３（ｓ）。

１５９．８６（ｓ）、１６３．０１（ｓ）、１６４．３
２（ｓ）、１工）溶解性： メタノール、アセトン、クロロホルム、酢酸エチルに可
溶、水に不溶。

１２）高速液体クロマトグラフィｍ： 分離カラム；　ラジアルバックツバパックカートリッジ
Ｃｌ８（粒子径 ４　μｍ、カラムサイズ、８ｍｍ　Ｘ １００　ｍｍ　（ウォーターズ社製））移動相：　アセ
トニトリル：水＝工：１流速；２ｍｌ／分 検出波長；　　ＵＶ　２１０　ｎｍ カラム温度２５℃のとき８．６分にピークを観測するこ
とが出来た。

本発明のフォリパスクチンは不飽和結合による種々の異
性体を有する。前記式においては、これらの異性体およ
びこれらの異性体の混合物がすべて単一の式で示されて
いる。従って、本発明においてはこれらの異性体および
これらの異性体の混合物をもすべて含むものである。

本発明のフォリパスタチンは、常法にしたがって塩とす
ることができる。そのような塩としては例えばリチウム
、ナトリウム、カリウムのようなアルカリ金属：カルシ
ウム、バリウムのようなアルカリ土類金属；アルミニウ
ム：あるいはリジン、アルギニンのような塩基性アミノ
酸；などどの塩をあげることができる。このような塩の
うち、好適には薬理上許容される塩である。

フォリパスクチンの生産菌である５ＡＮＫ　１６８８８
株の菌学的性状は次の通りである。

本発明のフォリパスタチンを生産する上記５ＡＮＫ１６
８８８株は、千代田区内のビルのサプライ系ダストから
分離したものである。

ＣＹ　Ａ　（Ｃｚａｐｅｋ　ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃ
ｔ　ａｇａｒ）上の生長は２５℃、７日で２．３　ｃｍ
に達する。表面は、ビロード状で不規則なしわを有する
。中央部には綿毛状の気菌糸が発達し、わずかに盛り上
がる。

分生子を豊富に生じ、コロニー縁辺部ではｄｅｅｐｇｒ
ｅｅｎ　（２６Ｄ８）を呈し、中央部付近はｄｅｅｐ　
ｙｅｌｌ。

ｗ　（４Ａ８）を呈する。菌糸は白色である。

ＭＥＡ　（Ｍａｌｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　ａｇａｒ）上の
コロニーは２５℃、７日で３．２ｃｍに達する。表面は
平坦でビロード状である。分生子は全面でｄｅｅｐ　ｇ
ｒｅｅｎ（２６Ｄ８）　、但し縁辺部は白色で、中央部
に白色の気菌糸が発達する。裏面はｇｒｅｙｉｓｈ　ｂ
ｒｏｗｎ　（８Ｆ３）を呈する。

ＣＹ２Ｏ３（２０％蔗糖を含むＣｚａｐｅｋ　ｙｅａｓ
ｔ　ａｇａｒ）上のコロニーは２５℃、７日で４、０ｃ
ｍに達する。

裏面の色がｐａｌｅ　ｙｅｌｌｏｗ　（４Ａ３）である
点を除き、コロニーの性状はＣＹＡ上のそれと同じであ
る。

浸出物はない。

可溶性色素は３７℃、ＣＹＡ上でのみｍ察され、ｐａｓ
ｔｅｌ　ｙｅｌｌｏｗ　（ＬＡ４）を呈する。３７℃で
はＣＹＡ上７日間で１．５ｃｍのコロニーを形成する。

分生子頭はＭＥＡ上では柱状、ＣＹＡ上では放射状であ
る。ＣＹＡ上では、白色で線状の菌糸が分生子柄に混じ
り突出する。

分生子柄の壁は平滑で厚く、褐色を呈する。

頂球は直径８−１８μｍ、とっくり型からこん棒状型で
、頂球の上部１／３−２／３はメトレ（７−１０Ｘ３−
４．５μｍ）におおわれ、その上にとつくり型のフイア
ライド（６，５−７，Ｏｘ　２．５−４μｍ）が存在す
る。

分生子は、球形であり、表面は平滑か、いくぶん粗であ
る。完全世代は観察されなかった。

以上の諸形質から既知菌株のそれらと比較検討したとこ
ろ、阿、Ａ、Ｋ１１ｃｈおよびＪ　、Ｉ　、Ｐｉｔｔ著
ｒＡ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　ｃｏ
ｍｍｏｎ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｐｅｃｉｅｓ、Ｊ
　１９８８年、Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ　５ｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃａｎｄ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ　Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ、　Ｄｉｖｉｓｉｏ
ｎ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ発行に記
載されてし）るアスペルギルス・ウンギュイス・エミー
ル・ヴイール・アンド・ガラデイン・トム・アンド・レ
イパー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｕｎｇｕｉｓ　（Ｅ
ｍｉｌｅ−Ｗｉｅｌ　ａｎｄ　Ｇａｕｄｉｎ）Ｔｈｏｍ
　　ａｎｄ　Ｒａｐｅｒ）とよく一致した。従って本菌
を公知菌アスペルギルス・ウンギュイス・エミール・ヴ
イール・アンド・ガラデイン・トム・アンド・レイパー
と同定し、保存番号として５ＡＮＫ１６８８８　（微工
研菌寄第１１２５９号、ＦＥＲＮ　Ｐ−１１２５９）を
付与した。

なお、色の表示はＡ　、ＫｏｒｎｅｒｕｐおよびＪ、Ｈ
Ｊａｎｓｃｈｅｒ著ｒＭｅｔｈｕｅｎ　ｈａｎｄｂｏｏ
ｋ　ｏｆ　ｃｏｌｏｕｒＪ第３版、１９７８年、Ｅｙｒ
ｅ　Ｍｅｔｈｕｅｎ、　Ｌｏｎｄｏｎ、発行に従って行
なった。

以上、フォリパスタチンの生産菌について説明したが、
カビの諸性質は一定したものではなく、自然的、人工的
に容易に変化することは周知の通りであり、本発明で使
用し得る菌株は、アスペルギルス属に属するフォリパス
タチンを生産する全ての菌株を包含するものである。

なお、同定に用いた培地の組成は以下のとおりである。

（１）　　ＣＹＡ　（Ｃｚａｐｅｋ　ｙｅａｓｔ　ｅｘ
ｔｒａｃｔ　ａｇａｒ）Ｋ２ＨＰＯ４１，Ｏｇ ＊Ｃｚａｐｅｋ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ　　　　１０
．ＯｍｌＰｏｗｄｅｒｅｄ　ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃ
ｔ　　５．ＯｇＳｕｃｒｏｓｅ　　　　　　　　　３０
．ＯｇＡｇａｒ　　　　　　　　　　　１５．０　　ｇ
Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ　Ｗａｔｅｒ　　　　１０００　　
　ｍｌ（２）　　＊Ｃｚａｐｅｋ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａ
ｔｅａＮＯ３ Ｃ１ Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ２０ ＦｅＳ（Ｌ　”　７７Ｈ２ ＯＺｎ５０４７Ｈ２０ ＣｕＳＯ４”　７Ｈ２０ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ　Ｗａｔｅｒ ３０．０　　ｇ ５．０ｇ ５．０ｇ ０．１ｇ ０．１ｇ ０．０５　ｇ １００　　　　ｍｌ （３）　　ＭＥＡ　（Ｍａｌｔ Ｍａｌｔ　ｅｘｔｒａｃｔ Ｐｅｐｔｏｎｅ Ｇｌｕｃｏｓｅ ｇａｒ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ　Ｗａｔｅｒ ｅｘｔｒａｃｔ　ａｇａｒ） ２０．０ １．０ ’　２０．０ ２０、Ｏ ０００ （４）　　ＣＹ２Ｏ５（２０％蔗糖を含むＣｚａｐｅｋ
　ｙｅａｓｔａｇａｒ） Ｋ２ＨＰＯ４１，Ｏｇ ＊Ｃｚａｐｅｋ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ　　　　　１
０．Ｏｍ１Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　　　　　　　
　　５．ＯｇＳｕｃｒｏｓｅ　　　　　　　　　　　２
００．０　　ｇＡｇａｒ　　　　　　　　　　　　１５
．０　　ｇＤｉｓｔｉｌｌｅｄ　Ｗａｔｅｒ　　　　　
１０００　　　ｍ１本発明の新規化合物フォリパスタチ
ンを得るため、これらの微生物の培養は他の発酵生成物
を生産するために用いられるような培地中で行う。この
ような培地中には、微生物が同化出来る炭素源、窒素源
および無機塩を含有する。

一般に、炭素源としてグルコース、フラクトース、マル
トース、シュークロース、マンニトール、グリセロール
、デキストリン、オート麦、ライ麦、トウモロコシデン
プン、ジャガイモ、トウモロコシ粉、大豆粉、綿実油、
糖蜜、クエン酸、酒石酸などを単一に、あるいは併用し
て用いる事が出来る。一般には、培地量の１−１０重量
％で変量する。

窒素源としては、一般に蛋白質を含有する物質を発酵工
程に用いる。適当な窒素源としては、大豆粉、フスマ、
落花生粉、綿実油、綿実粉、カゼイン加水分解物、ファ
ーマミン、魚粉、コーンスチープリカー、ペプトン、肉
エキス、イースト、イーストエキス、マルトエキス、硝
酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等
である。

窒素源は、単一または併用して培地量の０．２−６重量
％の範囲で用いる。

培地中にとり入れる栄養無機塩は、ナトリウム、アンモ
ニウム、カルシウム、フォスフェート、サルフェート、
クロライド、カーボネート等のイオンを得ることの出来
る通常の塩類である。また、カリウム、カルシウム、コ
バルト、マンガン、鉄、マグネシウム等の微量の金属も
含む。

液体培養に際しては、消泡剤としてシリコン油、植物油
、界面活性剤等が使用される。

アスペルギルス・ウンギュイス・エミール・ヴイール・
アンド・ガラデイン・トム・アンド・レイパー５ＡＮＫ
　１６８８８株を培養しフォリパスタチンを生産する培
地のｐＨは、５．０−８．０に変化出来る。

菌の生育は２２℃から３８℃の範囲が良好であり、更に
フォリパスタチンの生産には２２℃から２８℃が好適で
ある。

フォリパスタチンは、好気的に培養して得られる。通常
用いられる好気的培養法として、例えば固体培養法、振
どう培養法、通気攪拌培養法、等があげられる。

小規模な培養においては、２６℃で数日間振どう培養を
行うのが良好である。培養は、バッフル（水流調節壁）
のついた三角フラスコ中で、１−２段階の種の発育工程
により開始する。種発育段階の培地は、炭素源および窒
素源を併用出来る。

種フラスコは定温インキュベーター中で２６℃、７日間
振とうするか、または充分に成長するまで振とうする。

成長じた種を第二の種培地、または生産培地に接種する
のに用いる。中間の発育工程を用いる場合には、本質的
に同様の方法で成長させ、生産培地に接種するために、
それを部分的に用いる。接種したフラスコを一定温度で
数日間振とうし、インキュベーションが終わったらフラ
スコの含有物を遠心分離またはろ過する。

大量培養の場合には、攪拌機、通気装置を付けた適当な
タンクで培養するのが好ましい。この方法によれば、栄
養培地をタンクの中で作成出来る。

栄養培地を１２５℃まで加熱して滅菌し、冷却後、滅菌
培地にあらかじめ成長させてあった種を接種する。培養
は２６℃で通気攪拌して行う。この方法は、多量の化合
物を得るのに適している。

培養の経過に伴って生産されるフォリパスタチンの量の
経時変化は、高速液体クロマトグラフィーを用い測定す
ることができる。通常は、７２時間から１５０時間の培
養でフォリパスタチンの生産量は最高値に達する。

培養終了後、培養液中の液体部分及び菌体内に存在する
フォリパスタチンは、菌体、その他の固形部分を珪藻土
をろ渦動剤とする、ろ過操作または遠心分離によって分
別し、そのろ液または上清中および菌体中に存在するフ
ォリパスタチンを、その物理化学的性状を利用し抽出精
製することにより得られる。

例えば、ろ液または上清中に存在するフォリパスタチン
は、中性ｐＨ条件下で水と混和しない有機溶剤、例えば
酢酸エチル、ｎ−ヘキサン、クロロホルム、塩化エチレ
ン、塩化メチレンなどの単独または、それらの組み合わ
せにより抽出精製することができる。あるいは吸着剤と
して、例えば活性炭または吸着用樹脂であるアンバーラ
イトＸＡＤ−２，ＸＡＤ−４（ローム・アンド・ハース
社製）等や、ダイアイオンＨＰ−１０，ＨＰ−２０、Ｃ
ＨＰ−２０，ＨＰ−５０（三菱化成（株）製）等が使用
される。フォリパスタチンを含む液を上記のごとき吸着
剤の層を通過させて不純物を吸着させて取り除くか、ま
たはフォリパスタチンを吸着させた後、メタノール水、
アセトン水、ｎ−ブタノール水などを用いて溶出させる
ことにより得られる。

また、菌体内に存在するフォリパスタチンは、５０−９
０％の含水アセトンまたは含水メタノールにより抽出し
有機溶剤を除去した後、ろ液と同様な抽出精製操作を行
なうことにより得られる。

このようにして得られたフォリパスタチンは、更にシリ
カゲル、マグネシウム−シリカゲル系のフロリジルのよ
うな担体を用いた吸着カラムクロマトグラフィー、セフ
ァデックスＬＨ−２０（ファルマシア社製）等を用いた
分配カラムクロマトグラフィー、および順相、逆相カラ
ムを用いた高速液体クロマトグラフィー等で精製するこ
とが出来る。

本発明のフォリパスタチンは、文献未載の新規化合物で
あり、動物（例、ヒト、イヌ、ネコ、ウサギ等）に対し
てホスフォリパーゼＡ２阻害作用を示し、抗炎症作用を
有する結果、例えば皮膚炎治療剤として有用である。

本発明のフォリパスクチンを医薬として用いる場合、常
法に従ってそれ自体または適宜の薬学的に許容される保
存剤、賦形剤、油脂性軟膏基剤等と混合しくフォリパス
タチンは０．０１〜２．０％）、軟膏剤などの形態で非
経口的に安全に用いることが出来る。用量は対象疾患に
より異なるが、例えば成人に対しては症状に応じて適量
を１日１〜数回、直接患部に塗布まは無菌ガーゼにのば
して貼布するのが好ましい。

（実施例） 次に実施例をあげて本発明を更に具体的に説明する。

実施例１．少量培養法によるフォリパスタチンの生産 Ａ）培養 アスペルギルス・ウンギュイス・エミール・ヴイール・
アンド・ガラデイン・トム・アンド・レイパー５ＡＮＫ
　１６８８８株を、無菌的に、滅菌した後述の組成の培
地１００　ｍｌを含むバッフルの付いた５００　ｍｌの
三角フラスコ（種フラスコ）に−白金耳接種した。

次いでこれを２６℃で３日間、２００　ｒｐｍ　（７ｃ
ｍの回転半径）のロータリー振どう機で培養した。

培地組成 グリセリン ジャガイモ マルトエキスイ ーストエキス ０　　ｇ ５ｇ ５ｇ イオン交換水　　　　　　　　１０００　　ｍｌｐｆ（
　６．５に調整 種培養と同じ組成の培地を、おのおの１００　ｍｌずつ
バッフルのついた５００　ｍｌの三角フラスコ２０本に
入れ、滅菌後、種フラスコから２ｍｌずつ成長菌を取っ
て接種した。この２０本の三角フラスコを種培養と同じ
条件で７日間振どう培養した。

Ｂ）単離 培養液全体物を、３０００　ｒｐｍ、２０分間遠心分離
した。沈でん物を抽出のためにとっておいた。

１、７Ｌの上清をｐＨ　７．０に調整し分液ロートに入
れ、２Ｌの酢酸エチルで２回抽出した。得られた酢酸エ
チル層を３Ｌの飽和食塩水で洗浄し、さらに無水硫酸ナ
トリウムで乾燥した後、ロータリーエバポレーターで減
圧下、濃縮乾固して　２７３ｍｇの油状物を得た。

菌体を章む前述の沈でん物に、アセトン３００ｍｌを加
え、１時間攪拌しながら抽出した。得られた抽出液をろ
過し、ろ液よリロータリーエバポレーターで、減圧下ア
セトンを留去した。残留物に水を加え１０００　ｍｌと
した後、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ　７．０に調整
し酢酸エチル１０００ｍｌで２回抽出した。得られた酢
酸エチル層を２Ｌの飽和食塩水で洗浄し、さらに無水硫
酸ナトリウムで乾燥した後、ロータリーエバポレーター
で減圧下、濃縮乾固して３９１　ｍｇの油状物を得た培
養ろ液から得られた油状物２７３　ｍｇと、菌体部分か
ら得られた油状物３９１　ｍｇとを併せて６６４ｍｇを
逆相液体クロマトグラフィーに付して精製した。すなわ
ち、逆相力ラムの、センシューパックＯＤＳＨ−５２５
１　　（２０　ｍｍ　ｉ．ｄ．　Ｘ　２５０　ｍｍ、セ
ンシュー科学（株）製）にアセトニトリル２００μｍに
溶解した全量を注入した。６５％アセトニトリル／トリ
エチルアミン−リン酸バッファー（ｐＨ　３．２）を流
速６．０　ｍｌ／分で展開溶出し、示差屈折計を用いて
検出し現れるピーク画分を集め、それぞれロータリーエ
バポレーターで減圧下、濃縮乾固して活性を測定した。

乾固物のうち、２０分に現われたピークが強い活性を示
した。

得られた乾固物３００　ｍｇをエタノールと水の混合溶
剤を用いて精製すると融点２４６−２４８℃を有する白
色針状結晶のフォリパスタチン１２６　ｍｇが得られた
。

実施例２．大量培養法によるフォリパスタチンの生産 Ａ）培養 フォリパスタチンを得るためのアスペルギルス・ウンギ
ュイス・エミール・ヴイール・アンド・ガラデイン・ト
ム・アンド・レイパー５ＡＮＫ　１６８８８株を用いる
大量培養を行なった。培養行程に用し）る種培養培地は
以下の組成を有した。

培地組成 グリセリン　　　　　　　　　５０　　ｇジャガイモ　
　　　　　　　　　５０　　ｇマルトエキス　　　　　
　　　　　５ｇイーストエキス　　　　　　　　　５ｇ
消泡剤（ＣＢ−４４２）　　　　　　　　０．２　　ｇ
イオン交換水　　　　　　　　　１０００　　ｍ１ＰＨ
６，５に調整 ５００　ｍｌのバッフルのついた三角フラスコに、１０
０　ｍｌの培地を入れ、微生物を接種する前に１２０℃
で２０分間加熱滅菌し、無菌的にアスペルギルス・ウン
ギュイス・エミール・ヴイール・アンド・ガラデイン・
トム・アンド・レイパー５ＡＮＫ　１６８８８株を接種
した。次いでこれを、２６℃で３日間、２００　ｒｐｍ
のロータリーシェーカーで振どう培養した。

３０　Ｌステンレス製ジャーファーメンタ−中に、１５
　Ｌの種培養と同一の組成の培地を入れ、これを１２０
℃で３０分間加熱殺菌した。次いでこれに上述の種培養
液２００　ｍｌを入れ、２６℃で６日間、７．５　Ｌ／
分の空気流量で溶存酸素濃度を０．３−０．５　ｐｐｍ
に保つため攪拌速度を１１００−３０Ｏｒｐの範囲で自
動的にコントロールし攪拌培養した。

Ｂ）単離 前述の５ＡＮＫ　１６８８８株の培養全体物１５Ｌ中に
、１．５　Ｋｇのろ適用のセライトを加え、混合物をフ
ィルタープレスを通じてろ過し、菌体区分とる液に分け
た。

菌体区分４．８　Ｋｇは、これに２ＯＬのアセトンを加
え室温下で１時間攪拌し抽出した。得られた抽出液をろ
過し、菌体と抽出ろ液に分けた。菌体区分に再度８０％
アセトン１５　Ｌを加え１時間攪拌し抽出した。抽出液
をろ過し、得られた抽出ろ液を、さきのる液と併せた。

これをロータリーエバポレーターで減圧下、アセトンを
留去して水溶液５Ｌを得た。得られた水溶液をｐＨ７，
０に調節した後、１０　Ｌの酢酸エチルで２回抽出し、
１５　Ｌの酢酸エチル層を得た。得られた酢酸エチル層
を１５　Ｌの飽和食塩水で洗浄し、次いで８００ｇの無
水硫酸ナトリウムで乾燥後、ロータリーエバポレーター
で減圧下、濃縮乾固すると油状物７８．４　ｇが得られ
た。

ろ液１４　Ｌは、これを水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ
７，０に調整し、１５Ｌの酢酸エチルで２回抽出した。

酢酸エチル層を併せ、飽和食塩水２０　Ｌで洗浄し、次
いで無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮乾固すると油状
物２９　ｇが得られた。

菌体から得られた油状物７８．４　ｇおよびろ液から得
られた油状物２９　ｇを、メタノール１５０　ｍｌに溶
解し、次いで逆相液体クロマトグラフィーに付して精製
した。すなわち、逆相カラムの、０ＤＳ（１０ｃｍ　ｉ
、ｄ、Ｘ　５０　ｃｍ、１５〜３０Ｐ（栗田工業（株）
製）を用いメタノール溶液を４回に分けてカラムに付し
た。カラムは、６０％アセトニトリル・水の移動相で２
００　ｍｌ／分で溶出した。カラムに接続した示差屈折
計が示す３５分から５０分のピークを分取した。この両
分について高速液体クロマトグラフィー（カラム；　８
ＮＶＣ１８４（ウォータース社製）、移動相：５０％ア
セトニトリル／トリエチルアミン・リン酸バッファー（
ｐＨ３，２）、　　流速；　２．Ｏｍｌ／ｍｉｎ、検出
；　ＬＩＶ　２１０　ｎｍ）により成分の純度をモニタ
リングした。そして、実施例１゜で得られた結晶のピー
クと同じ画分であることを確認した。この両分をロータ
リーエバポレーターで減圧下、濃縮乾固して合計６．６
ｇの油状物を得た。

次いで、得られた油状物を再度、逆相液体クロマドグラ
フィーに付して精製した。すなわち、逆相カラムの、セ
ンシューパックＯＤＳ　Ｈ−５２５１（２０ｍｍ　ｉ、
ｄ、　Ｘ　２５０　ｍｍ、センシュー科学（株）製）に
、アセトニトリルに溶解した油状物を注入した。６０％
アセトニトリル／水を流速７．０　ｍ１７分で展開、溶
出し、示差屈折計を用いて検出し、２６分に現れるピー
クの画分を集め、ロータリーエバポレーターで減圧下、
濃縮乾固してフォリパスタチンを無色油状物として５．
６ｇ得た。この油状物を更にエタノールと水の混合溶剤
を用いて精製すると融点２４６−２４８℃を有する白色
針状結晶の（実施例の効果） 試験例１．ホスフォリパーゼＡ２阻害試験法ホスフォリ
パーゼＡ２はＦｏｒｓｔらの方法（Ｆｏｒｓｔ、　Ｓ、
、らｒＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪ　、　２５．８３８
１（１９８６）　）に準じ次のようにして調整した。す
なわち、家兎にカゼインを腹腔内注射し、無菌的に起炎
して腹腔滲出液を得た。これをタンパク質分解酵素阻害
剤の存在下でゲルろ過、イオン交換樹脂のカラム操作に
より酵素標品とした。基質のリン脂質はホスファチジル
コリンの２位に放射標識アラキドン酸が結合したものを
卵黄ホスファチジルコリンで希釈し、超音波処理でミセ
ルにしたものを用いた。へペス緩衝液（ｐＨ７，５）中
に、塩化カルシウム、酵素、阻害検体を加え１０分間保
温した後、最終濃度１００μＨの基質を加え酵素反応を
行なった。次いでＤｏｌｅ試薬（Ｄｏｌｅ、　Ｖ、　Ｐ
、、らｒＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙＪ　、　２３５．２５９５　（１９６０））にて遊
離したアラキドン酸をヘプタン層に抽出し、放射活性を
化合物非添加の対照と比較することにより阻害層を求め
ると、ＩＣ５°＝６５μ河となった。

試験例２．好中球でのホスフォリパーゼＡ２阻害試験法 好中球は次のようにして得た。すなわち、ラットにカゼ
インを腹腔内注射し好中球を誘引し、これをヘパリン含
有燐酸緩衝液にて回収した。得られた好中球を放射標識
アラキドン酸にて標識した（Ｏｋａｊｉｍａ、　Ｆ、、
らｒＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈ
ｅｍｉｓｔｒｙＪ　、　２５９．１３８６３−１３８７
１　（１９８４）　）　、この実験法では、アラキドン
酸は９０％程度ホスファチジルコリンにとりこまれた。

標識された好中球は充分に洗浄した後、培養液に懸濁し
、阻害検体を添加して１０分間保温し、遊走ペプチド（
ｆｏｒｍｙｌ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ）を添加して好
中球を活性化した。ホスフォリパーゼＡ２によって培養
液中に放出された放射標識アラキドン酸の放射活性と化
合物非添加の対照と比較することにより阻害層を求めた
結果、工Ｃ５°＝２４μ阿となった。

Ｃａｒｌｓｏｎらの方法（Ｃａｒｌｓｏｎ、　Ｒ，Ｐ、
、らｒＡｇｅｎｔｓａｎｄ　ＡｃｔｉｏｎｓＪ　、　１
７．１９７　（１９８５）　）に準じＣＤＦ　ｌ系マウ
ス（各群５匹）の耳の内側にホルボールエステルを塗布
した０次いで、２０分後に片耳に阻害検体を溶解した薬
液を、別の耳に溶剤（アセトン−エタノール＝１：１）
のみを塗布した。検体を塗布して２２０分後にクロロホ
ルムにて麻酔致死せしめた後、耳型量を比較することに
より阻害を検討した。無処置対照としては片耳のみホル
ボールエステルを塗布し、次いで両耳に溶剤のみを塗布
して上記と同様に処理した群を用いた。

結果を以下に示す。

阻害率（％） 対照群（溶剤のみ）　　　　　　　０ フォリパスタチン（０，５ｍｇ／ｍｌ）　　４０マノア
ライド（０，５ｍｇ／ｍｌ）　　　　４０インドメタシ
ン（０，５ｍｇ／ｍｌ）　　　７０ａｎｄ　Ａｃｔｉｏ
ｎｓＪ　、　１７．１９７　（１９８５）　）に準じＳ
Ｄ系ラット（各群５匹）の耳の内側にホルボールエステ
ルを塗布した。次いで、２０分後に片耳に阻害検体を溶
解した薬液を、別の耳に溶剤（アセトン−エタノール＝
１：１）のみを塗布した。検体を塗布して２２０分後に
クロロホルムレこで麻酔致死せしめた後、耳型量を比較
することにより阻害を布して上記と同様に処理した群を
用し）た。

結果を以下に示す。

阻害率（幻 対照群（溶剤のみ）　　　　　　　０ フオリポスタチン（０，５ｍｇ／ｍｌ）　　　４０マノ
アライド（０，５ｍｇ／ｍｌ）　　　　　３１インドメ
タシン（０，５ｍｇ／ｍｌ）　　　　６１試験例５．急
性毒性 マウスにフォリパスタチンを２００　ｍｇ／ｋｇ経口投
与したが毒性は認められなかった。

次に製剤例を示す。

製剤例１．軟膏 処方 フォリパスタチン　　　　　　　　　０．５　　ｍｇ塩
酸クロロへキシジン　　　　　　　２．０　　ｍｇ油脂
性の軟膏基剤　　　　　　　１０００　　　ｍｇフォリ
パスタチンを細末にして軟膏基剤の一部と混和し、残り
の基剤を加えて全質均等になるまでかきまぜて練り合わ
せた。

（発明の効果） 以上から、本発明のフォリパスタチンは顕著なホスフォ
リパーゼＡ２阻害作用を示し、抗炎症作用を有する抗炎
症剤として有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、フォリパスタチンの紫外線吸収スペクトルを
示す。 第２図は、同物質の赤外線吸収スペクトルを示す。 第３図および第４図は、同物質のそれぞれ、１Ｈ−核磁
気共鳴スペクトルおよび１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル
を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示されるフォリパスタチンおよびその塩。 ２、アスペルギルス属に属するフォリパスタチン生産菌
   を培養し、その培養物よりフォリパスタチンを採取する
   ことを特徴とするフォリパスタチンの製造法。 ３、アスペルギルス属に属するフォリパスタチン生産菌
   がアスペルギルス・ウンギュイス・エミール・ヴィール
   ・アンド・ガウディン・トム・アンド・レイパーＳＡＮ
   Ｋ　１６８８８株（微工研菌寄第１１２５９号、ＦＥＲ
   Ｍ　Ｐ−１１２５９）である請求項２、記載の製造法。 ４、フォリパスタチンを有効成分とするホスフォリパー
   ゼＡ＿２阻害剤。