HUT71859A

HUT71859A - Sequiterpenes, their preparation and their use as inhibitors acting on the gaba benzodiazepine receptor

Info

Publication number: HUT71859A
Application number: HU9501840A
Authority: HU
Inventors: Didier Vincent Renno; Gerard Bernard O'beirne; Brent Raymond Copp
Original assignee: Xenova Ltd
Priority date: 1992-12-22
Filing date: 1993-12-22
Publication date: 1996-02-28
Also published as: TW242141B; GB2284603B; HU9501840D0; IL108140A0; CZ164695A3; BG99736A; RU95113350A; KR950704324A; CZ284121B6; GB9226724D0; SK77595A3; AU677272B2; NZ258986A; MX9400174A; US5565486A; IL108140A; NO952483D0; ZA939626B; NO952483L; GB2284603A

Description

A találmány új, benzodiazepin receptor kötő vegyületekre vonatkozik. A találmány kiterjed a vegyületek előállítására, a vegyületeket tartalmazó gyógyszer- és állatgyógyászati készítményekre, valamint azokra a mikroorganizmusokra is, amelyekből a találmány szerinti vegyületeket előállítjuk.

A benzodiazepin (Bz) kifejezést szokásosan a benzo-1,4-diazepin alapvázzal szerkezetileg rokon vegyületek jelölésére alkalmazzák [Haefli et al. , Advances in Drug Rés., 14, 165-322 (1985)]. Ennek az új gyűrűrendszernek az első szintetikus analógjai közül néhányat famakológiailag teszteltek. A vizsgálatok azt mutatták, hogy a benzodiazepinek trankvilláns és görcsoldó hatással rendelkeznek. A további vizsgálatok eredményeként 1960-ban megkezdődött a klór-diazepoxid (Librium) gyógyászati alkalmazása.

A kiterjedt elektrofiziológiai és kötési vizsgálatok során megállapították, hogy a benzodiazepin hatásmechanizmus magában foglalja a fő gátlási neurotranszmitternek, a gamma-amino-vajsavnak (gamma-aminobutyric acid; GABA) az alloszterikus modulációját. Közelebbről ez a hatás a GABA-Bz-Cl“ ionofór receptor komplexen át zajló kloridionfluxus növelésével a neuronok hiperpolarizációját eredményezi. A GABA-Bz-Cl~ ionofór receptor komplexet A. altípusként vagy másként GABA_A-ként jelölik.

A jelenleg ismert benzodiazepinek legtöbbje agonista, amely a GABA gátlóhatás potencirozása útján fejti ki hatását. Ily módon a benzodiazepinek szedatív, hipnotikus, görcsoldó és anxiolyticus hatást fejtenek ki. A részleges (kis hatékonyságú) agonisták ugyancsak érdekesek, mivel ezek alkalmazása csökkent heti a benzodiazepin-terápia nemkívánatos hatásait, például a szedálást, valamint a klinikai hatás fenntartása során kialakuló toleranciát és addikciót. A klasszikus benzodiazepin hatásokkal ellentétes biológiai aktivitással rendelkező inverz agonisták, azaz a görcsokozók ugyancsak szükséges szerepet játszanak a memóriajavitásban. Az antagonistáknak nincs biológiai aktivitásuk, azonban a fenti hatások túlzott mértékű kifejeződésének (azaz a túladagolásnak) az ellensúlyozásában ezek is felhasználást nyernek.

A benzodiazepinek esetén a szerkezet-aktivitás összefüggés (structure activity relationship; SÁR) jellemzését már teljes egészében elvégezték, és azonosították a farmakofort. Az új, potenciális hatóanyagok kutatásának fő iránya ezért elsődlegesen az endogén receptor ligand azonosítása, illetve az új struktúrák felé tolódott. Különféle kémiai vegyületcsoportok (például benzazepinek, β-karbolinok, ciklopirrolonok, fenil-kinolinok, triazolopiridazinok és imidazopiridinek) esetén már kimutatták, hogy a vegyületek aktívak ezen a helyen. A ciklopirrolon-származék zopiclone és az imidazopiridin-származék zolpidem hipnotikumként már bevezetésre került.

Azt találtuk, hogy egy tápközegnek az Acremonium strictum (X06/15/458 Xenova organizmus, IMI 354451) gomba egy törzsével végzett fermentációja olyan új vegyületeket eredményezett, amelyek gátolják a benzodiazepinnek a GABA-Bz-CK ionofor receptor komplexen jelenlévő benzodiazepin receptorhoz történő kötődését. Ezek a vegyületek szeszkviterpének, amelyek a szintetikus származékaikkal együtt egy új vegyületosztályt képeznek.

• · · ·· »··· ·

A jelen találmány olyan (I) általános képletú szeszkviterpénekre és a vegyületek gyógyszerészetileg vagy állatgyógyászatilag elfogadható sóira vonatkozik, amelyek képletében a__ b

-- es —— mindegyikének jelentése egyes egyiknek a jelentése egyes kötés, és a kettős kötés;

együtt az és kötéssel, valamint azzal szénatommal, amelyhez ezek a kötések kapcsolódnak, egy vagy (b) általános képletü gyűrűt képez, ahol a (b) általános képletben

R jelentése hidrogénatom vagy hidroxicsoport; és jelentése kettős kötés, vagy ha A jelentése egy fentiekben meghatározott (a) képletü gyűrű, akkor A jelentése kettős vagy azokkal a szénatomokkal, amelyekhez kapcsolódik, egy ' epoxidkötést képez.

Az egyik találmány szerinti megoldás értelmében az (I) ál talános képletü szeszkviterpén olyan (II) általános képletü szerkezettel rendelkezik, amelyben

Y jelentése kettős kötés, vagy azokkal a szénatomokkal, amelyekhez kapcsolódik, egy Ό epoxidkötést képez.

Egy másik találmány szerinti megoldásban az (I) általános képletü szeszkviterpénnek olyan (III) általános képletü molekulaszerkezete van, amelyben

R jelentése hidrogénatom vagy hidroxicsoport.

Egy további, találmány szerinti megoldás értelmében az (I) általános képletú szeszkviterpénnek olyan (IV) általános képle...:. · · .

·..· ··:· ···· · .·

- 5 tű szerkezete van, amelyben

X jelentése (e) vagy (f) képletű csoport.

Az olyan (II) általános képletű szeszkviterpént, amelynek képletében Y jelentése kettős kötés, a továbbiakban (A) vegyületként hivatkozzuk. Az olyan (II) általános képletű szeszkviterpént, amelyben Y azokkal a szénatomokkal, amelyekhez kapcsolódik, egy epoxidkötést képez, a továbbiakban (A') vegyületnek nevezzük. Az olyan (III) általános képletű szeszkviterpént, amelynek képletében R jelentése hidroxicsoport, a továbbiakban (B) vegyületként hivatkozzuk. Az olyan (III) általános képletű szeszkviterpént, amelynek képletében R jelentése hidrogénatom, a továbbiakban (C) vegyületnek nevezzük. Az (A) vegyület nátriumsója (15-ONa) a (D) vegyület. Az olyan (IV) általános képletű szeszkviterpént, amelynek képletében X jelentése (f) képletű csoport, a továbbiakban (E) vegyületként hivatkozzuk. Az olyan (IV) általános képletű szeszkviterpént, amelynek képletében X jelentése (e) képletű csoport, a továbbiakban (F) vegyületként, illetve (F) általános képletű vegyületként hivatkozzuk. A jelen leírásban alkalmazott találmány szerinti vegyületek kifejezés magában foglalja valamennyi (I) általános képletű szeszkviterpént, továbbá ezeknek a vegyületeknek a gyógyszerészetileg vagy állatgyógyászatilag elfogadható sóit is.

Az (I) általános képletű szeszkviterpéneket egy általunk X06/15/458 jelzéssel ellátott mikroorganizmusból izoláltuk, amely mikroorganizmust az alábbi morfológiai adatok alapján az Acremonium strictum gomba egyik törzseként azonosítottunk:

í maláta extraktum agaron 10 napig végzett tenyésztésnél • · • · · « ···· ©·9 9 • · «

e · • · az X06/15/458 törzs telepei 15-20 mm átmérőjűét (összehasonlítás: 37-40 mm), bőséges spóraképződés, inkább tiszta fehér, mint a szürkésfehér árnyalataiban változó, sűrű tartalmú, inkább kompakt, mint micéliumvesztéses; nagyobbrészt bársonyos és csak a centrumban pelyhes, ahelyett hogy a centrumban bolyhos lenne, szegély egyenetlen, felszíni, nincs élesen elhatárolva és bemerülve; conidiophorák plectonematicus-synnematicusak és inkább felszíniek, mint bemerültek; jobbára orthophialis, ritkábban komplexebb, fokozatosan vékonyodó, inkább üvegszerűen átlátszó, mint kromofil, az alapnál 40-54 μη hosszú χ 1,5 μΐη széles (összehasonlítás: 20-40 χ 1,5-2,0 μΐη) . Konídiumok fehér, viszkózus masszában hengeresek, 3,0-7,0 χ 1,5 μη.

Az organizmus az Acremonium strictum jellegzetes törzseihez hasonlítva a következő eltérésekkel rendelkezik: lassabb növekedési sebesség; tiszta fehér kompakt telepek; szegély felszíni, egyenetlen és diffúz; a conidiophorák felszíniek és jobbára synnematicusak; a conidiophorák átlaghossza nagyobb.

A fentiekben ismertetett mikroszkopikus és makromorfológiai tulajdonságok alapján az X06/15/458 gombaizolátum legjobban mint Acremonium c. f. strictum W. Gams osztályozható be [Gams, W., (1971), Cephalosporium-artige Schimmelpilze; Gustav Fischer publ.].

Az X06/15/458 törzset a Budapesti Szerződés értelmében 1992. október 07-én a következő intézetben helyeztük letétbe: International Mycological Institute, Egham, Surrey, Nagy-Britannia; deponálási szám: IMI 354451.

A fenti ismertetés az Acremonium strictum egy olyan tör* * * · « \.· ···· ···· · · ·’ * · · ··»« __ ~Ί __ zsét illusztrálta, amely felhasználható a találmány szerinti szeszkviterpének előállításában.

Ugyanakkor a találmány kiterjed a fentiekben ismertetett mikroorganizmus mutánsaira is. A találmány oltalmi körébe tartoznak például azok a mutánsok, amelyeket természetes szelekció útján nyerünk, vagy azok, amelyeket mutációt kiváltó ágensekkel, például ionizáló sugárzással, így ultraibolya-besugárzással, illetve kémiai mutagénekkel, például nitrozo-guanidinnel vagy ezekhez hasonló kezelésekkel állítunk elő.

Ugyancsak a találmány részét képezi a találmány szerinti vegyületek előállítási eljárása, amelynek során (i) egy (I) általános képletú szeszkviterpént termelő X06/15/458 (IMI 354451) gombatörzset vagy ennek mutánsát szén- és nitrogénforrásban, valamint szervetlen sók jelenlétében fermentáljuk; (ii) a szeszkviterpént izoláljuk a fermentációs közegből; (iii) kívánt esetben egy olyan (I) általános képletú szeszkviterpént, amelyben A jelentése (c) képletú gyűrű, egy olyan (I) általános képletú szeszkviterpénné oxidálunk, amelyben A jelentése (d) képletú gyűrű; és/vagy (iv) kívánt esetben a szeszkviterpént egy gyógyszerészetileg vagy állatgyógyászatilag elfogadható sójává alakítjuk.

Az (I) általános képletú szeszkviterpéneket jellegzetesen egy vizes tápközegnek az alábbiakban ismertetett körülmények között egy Acremonium strictum X06/15/458 termelőtörzzsel vagy az X06/15/458-nak egy termelő mutáns törzsével végzett aerob fermentációja során állítjuk elő. A találmány szerinti eljárásban történő felhasználásra alkalmas a legtöbb olyan vizes kö zeg, amelyeket az antibiotikus anyagok előállítása során használnak. Ezek a tápközegek a mikroorganizmus által asszimilálható szén- és nitrogénforrásokat tartalmaznak. Kívánt esetben (általában alacsony koncentrációkban) szervetlen sókat is adhatunk a tápközegekhez. Az előbbieken kívül a fermentálóközegek a mikroorganizmusok növekedéséhez és a kívánt vegyületek termeléséhez szükségesek fémeket is tartalmazhatnak nyomnyi mennyiségben. Ezek a fémek általában elegendő koncentrációban jelen vannak a tápforrásként alkalmazható komplex szén- és nitrogénforrásokban, de kívánt esetben természetesen külön is hozzáadhatjuk a fémeket a fermentálóközeghez. A találmány további részét képezi egy (I) általános képletü szeszkviterpént termelő X06/15/458 gombatörzsnek vagy ennek egy mutánsának biológiailag tiszta tenyészete. Az ilyen tenyészetek más mikroorganizmusoktól lényegében mentesek.

Asszimilálható szén-, nitrogén- és ásványanyagforrásokat egyszerű vagy komplex tápanyagok segítségével biztosíthatunk. A szénforrások általában glükózt, maltózt, keményítőt, glicerint, melaszt, dextrint, laktózt, szacharózt, fruktózt, karbonsavakat, aminosavakat, glicerideket, alkoholokat, alkánokat és növényi olajokat tartalmaznak. A szénforrások általában a fermentálóközegnek 0,5-10 tömeg%-át alkotják.

A nitrogénforrások általában szójabablisztet, kukorica áztatólét, szeszipari oldható anyagokat, élesztőextraktumokat, gyapotmaglisztet, peptonokat, őrölt mogyorólisztet, malátakivonatot, melaszt, kazeint, aminosav-keverékeket, (gáz vagy oldat formájában) ammóniát, ammóniumsókat vagy nitrátokat tartalmaz • ·

- 9 nak. Karbamidot és más amidokat is alkalmazhatunk. A nitrogénforrások általában a fermentálóközegnek 0,1-10 tömegt-át alkotj ák.

A tenyésztőközegbe beépíthatő tápanyag ásványi sók közé általában azok a szokásosan alkalmazott sók tartoznak, amelyek alkalmasak nátrium-, kálium-, ammónium-, vas-, magnézium-, cink-, nikkel-, kobalt-, mangán-, vanádium-, króm-, kalcium-, réz-, molibdén-, bőr-, foszfát-, szulfát-, klorid- és karbonátionok szabaddá tételére.

Az intenzív habzás szabályozása érdekében egy habzásgátló is jelen lehet, amelyet szükséges időközönként folyamatosan adagolhatunk.

Az Acremonium strictum X06/15/458 alkalmazásával végzett fermentálást 20 °C és 35 °C, előnyösen 24 °C és 30 °C közötti hőmérséklet-tartományban hajthatjuk végre. Az optimális eredmények elérése érdekében ezeket a fermentációkat legelőnyösebb 24 °C és 26 °C közötti hőmérséklet-tartományban végezni. A vegyületek előállítására alkalmas tápközeg pH-jának az értéke 5,0 és 8,5 között változhat; az előnyös pH-tartomány 6,0 és 7,5 közötti értékű.

A kis mennyiségű fermentálásokat előnyösen úgy végezzük, hogy a tápközeg alkalmas mennyiségeit ismert steril módszerek alkalmazásával bemérjük egy lombikba, majd a lombikot az Acremonium strictum spóráival vagy vegetatív sejtnövekményeivel inokuláljuk, a lombikot vattával lazán lezárjuk, majd állandó, körülbelül 25 °C-os szobahőmérsékleten, 95-300 fordulat/perc sebességű forgó rázógépen 2-10 napig hagyjuk a fermentációt

- 10 • · · · *··· ·· • · ♦ · · » ···· · · * * végbemenni .

Nagyobb mennyiségek esetén a fermentálást előnyösen alkalmas, keverővei és a fermentálóközeget levegőztető eszközzel ellátott tartályokban hajtjuk végre. A tápközeget összeállítjuk a tartályban, majd sterilizálás után az Acremonium stríctum vegetatív sejtnövekményének forrásával a tápközeget inokuláljuk. A fermentációt 1-8 napon keresztül folytatjuk, miközben a tápközeget 24 °C és 30 °C közötti hőmérséklet-tartományban kevertetjük és/vagy levegőztetjük. A levegőztetés mértéke több tényezőtől függ, egyebek mellett például a fermentor méretétől és keverés sebességétől. A nagy méretű fermentálások esetén a kevertetést általában körülbelül 95-500 fordulat/perc sebességgel és a levegőztetést körülbelül 0,1-1,0 térfogatrész/perc sebességgel végezzük.

A fermentáció leállításakor az (I) általános képletü szeszkviterpének elsődlegesen a micéliumban vannak és innen nyerhetők ki, majd tisztíthatok. A vegyületnek a fermentléből történő elválasztását és tisztítását, valamint a vegyület kinyerését oldószeres extrakcióval, majd különféle kromatográfiás módszerekkel és oldószerrendszerekkel végzett hagyományos kromatográfiás frakcionálások alkalmazásával valósíthatjuk meg. Ily módon a szeszkviterpént lényegében tiszta formában állíthatjuk elő.

Az (I) általános képletü szeszkviterpének szerves oldószerekben, így etil-acetátban, metanolban és acetonban oldódnak.

Ezt a tulajdonságot felhasználhatjuk a vegyületeknek a fermentációs micéliumból történő kinyerésére. Ennek megfelelően a

- 11 fermentációs micéliumot egy szerves oldószer, például aceton közel egyenlő térfogatával alkalmasan összekeverünk. Az így kapott nyers extraktumot ezt követően csökkentett nyomás alatt betöményitjük, majd az így nyert vizes szuszpenziót egy szerves oldószerrel visszaextraháljuk, és ennek eredményeként egy nyers szerves extraktumot nyerünk. Az egész extraktumot szűrjük (vagy centrifugáljuk), majd az oldószert csökkentett nyomás alatt lepároljuk. A szerves maradékot ezt követően kezdetben kromatográfiás úton, például Sephadex LH-20 oszlopkromatográfiával, eluensként metanolt alkalmazva tisztítjuk.

A kívánt termék és néhány szennyezőanyag visszamarad az oszlopon, míg a szennyezőanyagok (különösen a nempoláris szenynyezőanyagok) legnagyobb része eluálódik az oszlopról. Az oszlopon visszamaradó további szennyezőanyagok eltávolítása érdekében az oszlopot egy nempoláris szerves oldószerrel, például hexánnal vagy toluollal mossuk, majd a mosást metilén-diklorid vagy kloroform és egy másik szerves oldószer, például metanol vagy etil-acetát keverékeivel folytatjuk. Az oldószert lepároljuk, és a maradékot, például oszlopkromatográfia, vékonyréteg-kromatográfia, preparatív rétegkromatográfia vagy nagyteljesítményű folyadékkromatográfia segítségével tovább kromatografáljuk. Az egyik előnyös megoldás értelmében ezt a további kromatográfiás lépést ismételt reverz fázisú C18 HPLC (25 χ 10 cm, acetonitril/víz gradiens elúció) útján hajtjuk végre.

A megfelelő adszorbensek közé tartozik a szilikagél és az oktadecil-kötött szilícium-dioxid. Eleuensként különféle oldószereket vagy oldószerkeverékeket alkalmazhatunk. A kívánt ve• ·

- 12 gyület jelenlétének detektálása és izolálása érdekében az eluátum frakcióit ezt követően vékonyréteg-kromatográfiás, nagyteljesítményű folyadékkromatográfiás vagy más, szokásos úton vizsgáljuk. Az előbbi módszerek alkalmazásával a kívánt szeszkviterpént tartalmazó, tisztított kompozíciókat nyerünk. A szeszkviterpén jelenlétét a különböző kromatoráfiás frakciók fizikai-kémiai jellemzőire és/vagy a benzodiazepin-receptor komplex kötési aktivitására vonatkozó analízis segítségével határozzuk meg.

Az olyan (I) általános képletú szeszkviterpént, amelyben A jelentése (c) képletü gyűrű, azaz az (E) vegyületet a megfelelő 15,16-orto-kinon-származékává oxidálhatjuk, azaz egy olyan (I) általános képletü szeszkviterpénné, amelyben A jelentése (d) képletú gyűrű; ez a termék az (F) vegyület. Az (F) vegyület az (F) képletnek megfelelő molekulaszerkezettel rendelkezik.

Az oxidációt elvégezhetjük úgy, hogy az (E) vegyületnek egy oldatát levegőn állni hagyjuk. Alternatív módon az oxidációt úgy is végrehajthatjuk, hogy az előbbiekben említett, levegőn végzett oxidáció során a (E) vegyület oldatához egy oxidálószert adva felgyorsítjuk a reakciót. Alkalmas oxidálószer például a nátrium-perjodát (NaIO₄) .

Egy (I) általános képletü szeszkviterpént átalakíthatunk egy gyógyszerészetileg vagy állatgyógyászatilag elfogadható sóvá .

Az alkalmas sók példái közé tartoznak — egyebek mellett — az alkálifémekkel, például a nátriummal és káliummal alkotott sók, valamint az ammóniumsók. A (D) vegyületet, azaz az (A) ve- 13 gyület nátriumsóját például úgy állíthatjuk elő, hogy az (A) vegyületet metanolban nátrium-hidroxiddal reagáltatjuk.

A találmány szerinti vegyületek aktívak a GABA-Bz-Cl' ionofor receptor komplexen lévő benzodiazepin receptorhoz tartozó ligandok által modulált rendellenességek kezelésében. A találmány szerinti megoldás értelmében a betegeket egy olyan eljárással kezeljük, amelynek során a találmány szerinti vegyületek egyikének terápiás szempontból hatásos mennyiségét adjuk be a betegeknek. Ily módon az agonista aktivitással rendelkező találmány szerinti vegyületek felhasználhatók az olyan állapotok szabályozására, amelyeket a benzodiazepinnek a GABA-Bz-Cl“ ionofor receptor komplexen lévő benzodiazepin receptorhoz történő kötődése befolyásol. Ennek megfelelően az ilyen vegyületeket görcsoldókként, anxiolyticumokként, izomrelaxánsokként és hipnotikumokként alkalmazhatjuk. A humán vagy az állati szervezet állapota ennek eredményeként javítható.

A találmány szerinti vegyületek aktivitást mutattak egy olyan benzodiazepin-receptor kötési vizsgálatban, amelyben egy triciált, a tisztított GABA-Bz-Cl~ ionofor receptor komplexen lévő receptorra specifikus ligandot alkalmazunk. Ennek a vizsgálatnak a részleteit a később ismertetendő 5. Példában foglaljuk össze.

A találmány szerinti vegyületeket különféle dózisformákban, így például orális úton történő beadásra szolgáló tabletták, kapszulák, cukor- vagy filmbevonatos tabletták (drazsék) , folyékony oldatok vagy szuszpenziók formájában, illetve parenteralis, így intramuszkuláris, intravénás vagy szubkután be • · · adásra szolgáló kompozíciók formájában adhatjuk be. Ennek megfelelően a találmány szerinti vegyületek beadhatók injekciós vagy infúziós úton is.

A dózis nagysága különféle tényezőknek, így a beteg korának, testtömegének és állapotának, illetve a beadási módnak a függvénye. Felnőtt embereknél egy találmány szerinti vegyület önmagában történő beadásakor a bármely beadásra mód esetén alkalmazható jellegzetes dózis nagysága 0,001-10 mg/testtömeg-kg, leggyakrabban 0,01-5 mg/testtömeg-kg. Ezeket az adagokat például napi 1-5 alkalommal — egyebek mellett — bolus infúzió, többórás infúzió és/vagy ismételt beadás útján juttathatjuk be a szervezetbe.

A találmány szerinti vegyületeket gyógyszerészetileg vagy állatgyógyászatilag elfogadható hordozót vagy hígítót is tartalmazó, gyógyszer- vagy állatgyógyászati készítményekként történő felhasználásra szolgáló kompozíciókká formáljuk. A kompozíciókat szokásosan hagyományos eljárások szerint állítjuk elő, és gyógyszerészeti vagy állatgyógyászati szempontból alkalmas formákban adjuk be.

Például az orális beadásra szolgáló szilárd készitményformák a hatóanyagon kívül — egyebek mellett — a következő komponenseket tartalmazhatják: hígítók, például laktóz, dextróz, szacharóz, cellulóz, kukoricakeményitő vagy burgonyakeményítő; lubrikánsok, például szilicium-dioxid, talkum, sztearinsav, magnézium- vagy kalcium-sztearát és/vagy polietilénglikolok; kötőanyagok, például keményítők, gumiarábikumok, zselatin, metil-cellulóz, (karboxi-metil)-cellulóz vagy poli(vinil-pirroli• · · · * · • « · • · · · · · · • ······«··· · · *· · · · · ····

-lódon) ; szétesést elősegítő szerek, például keményítő, alginsav, alginátok vagy nátrium-keményítő-glikolát; pezsgőkeverékek; színezőanyagok, édesítőszerek; nedvesítőszerek, például lecitin, poliszorbátok, lauril-szulfátok. Az ilyen készítményeket ismert módszerekkel, például keverési, granulálási, tablettázási, cukorbevonási vagy filmbevonási (drazsírozási) eljárások alkalmazásával állíthatjuk elő.

Az orális beadásra szolgáló folyékony diszperziók például szirupok, emulziók vagy szuszpenziók lehetnek. A szirupok hordozóként például szacharózt vagy szacharózt glicerinnel és/vagy mannitot és/vagy szorbitot tartalmazhatnak. A diabeteses betegeknek beadandó szirupok hordozóként csak olyan termékeket tartalmazhatnak, amelyek nem, illetve csak igen kis mennyiségben metabolizálódnak glükózzá; ilyen termék lehet például a szorbit. A szuszpenziók és az emulziók hordozóként például természetes gumit, agart, nátrium-alginátot, pektint, metil-cellulózt, (karboxi-metil)-cellulózt vagy poli(vinil-alkohol)-t tartalmazhatnak .

Az intramuszkuláris injekciók céljára szolgáló szuszpenziók vagy oldatok a hatóanyag mellett egy gyógyszerészeti szempontból elfogadható hordozót, például steril vizet, olívaolajat, etil-oleátot, glikolokat, így propilénglikolt és — kívánt esetben — megfelelő mennyiségű lidokain-hidrokloridot tartalmazhatnak. Az intravénás injekció vagy infúzió céljára szolgáló oldatok hordozóként steril vizet, általában injekciós vizet tartalmazhatnak. Előnyösen azonban ezek a készítmények steril, vizes izotóniás nátrium-klorid-oldat formájában vannak. Altér-

-16natív módon a találmány szerinti vegyületeket liposzómákba is kapszulázhatjuk.

Az alábbi példák a találmány illusztrálására szolgálnak.

1. Példa - X06/15/458 tenyésztése folyékony közegben

Az X06/15/458 törzs kiindulási anyagát úgy állítottuk elő, hogy egy MEA (2 1 maláta extraktum, 1,5 1 agar) táptalajon növesztett, érett ferde tenyészetet 5 ml 10 % vizes glicerinoldatban szuszpendáltunk. Ennek a kiindulási anyagból álló szuszpenziónak az 1 ml-es részleteit 1,5 ml-es fagyasztófiolákban -135 °C hőmérsékleten tároltuk. Miután a szuszpenziót visszanyertük a fagyasztásos tárolásból, egy előtenyészetet állítottunk elő oly módon, hogy 0,5 ml kiindulási anyagot aszeptikus körülmények között hozzámértünk egy 25 mm * 200 mm méretű tesztcsőben lévő S tápoldat [1,5 % glicerin, 1,5 1 szójabab pepton, 1 % D-glükóz, 0,5 % maláta extraktum, 0,3 1 nátrium-klorid, 0,1 1 kalcium-karbonát, 0,1 Tween 80, 0,1 1 Junlon

PW110 (szállító: Honeywell and Stein Ltd., Times House, Throwley Way, Sutton, Surrey, SM1 4AF) ; pH 6-ra beállítva] 10 ml-éhez, majd a tesztcsövet 25 °C hőmérsékleten 4 napon keresztül 240 fordulat/perc sebességgel rázattuk.

Ezt követően egy intermedier tenyészetet állítottunk elő oly módon, hogy egy előtenyészetet aszeptikus körülmények között átvittünk egy 21-es Erlenmeyer-lombikban lévő S tápoldat 300 ml-ébe, majd az így nyert keveréket forgó rázógépen 240 fordulat/perc sebesség mellett, 25 °C hőmérsékleten 3 napon keresztül inkubáltuk.

• · · · »···«* * • < · ····«> · · • · ···· ···· · « · • · · · ·· ····

A termelőtenyészetet úgy állítottuk elő, hogy egy intermedier tenyészetet aszeptikus körülmények között átvittünk egy olyan, 14 literes, kevertetett fermentorba, amely 10 liter P tápoldatot [2,38 1 trehalóz, 0,69 1 élesztő extraktum, 0,1 1 (karboxi-metil)-cellulóz), 0,1 % Tween 80, 0,98 á MES; pH 6-ra beállítva] tartalmazott. Az edény tartalmát 340 fordulat/perc sebességgel kevertettük és 0,7 térfogatrész/perc sebességgel levegőztettük. A pH értékét nem szabályoztuk, ennek ellenére ez az érték 6,0 és 7,0 közötti tartományon belül maradt. A fermentáció ideje alatt a fermentort állandó, 25 °C-os hőmérsékleten tartottuk. Hét nap elteltével a fermentációt leállítottuk és a termék extrakciója érdekében a biomasszát kigyűjtöttük.

A nagyobb mennyiségű fermentálásokat 75 literes fermentorok alkalmazásával a következők szerint hajtottuk végre. Az előbbiek szerint, 4 darab 25 χ 200 mm méretű tesztcsőben előállított 40 ml előtenyészetet átvittük egy 2 liter S tápoldatot tartalmazó 3 literes fermentorba. A tartály tartalmát 500 fordulat/perc sebességgel kevertettük és 0,25 térfogatrész/perc sebességgel levegőztettük. A pH értékét nem szabályoztuk, és a hőmérsékletet 25 °C-os értéken tartottuk. Négy nap elteltével az így nyert intermedier tenyészetet aszptikus körülmények között átvittük egy 50 liter P tápoldatot tartalmazó 75 literes fermentorba. Annak érdekében, hogy a fermentáció folyamatának ideje alatt legalább 70 % oldott oxigén tenziót tartsunk fenn, a 75 literes tartály tartalmát 350 fordulat/perc sebességgel kevertettük és 0,5 térfogatrész/perc sebességgel levegőztettük. A pH értékét nem szabályoztuk, ennek ellenére ez az érték 6,0 * · · « · • · · · · ♦ • · · · · · · • · ···· ···· » « · • · * · ·· ····

- 18 és 7,0 közötti tartományon belül maradt. A fermentáció ideje alatt a fermentort állandó, 25 °C-os hőmérsékleten tartottuk. Hét nap elteltével a fermentációt leállítottuk és a biomasszát kigyűj töttük.

2. Példa - Az (A) vegyület extrakciója és tisztítása

Egy 14 literes fermentáció fermentlevét centrifugáltuk, és a körülbelül 344 g micéliumot háromszor 5 liter acetonnal extraháltuk. Az extraktumot szárazra pároltuk, majd az így nyert 8,0 g maradékot tiszta metanollal ismét feloldottuk. A tisztítást reverz fázisú preparatív HPLC útján végeztük, amelynek során egy Waters Delta-Pak C18 [10 nm (100 angström), 15 gm] kolonnát (belső átmérő: 10,0 mm, hossz: 25,0 cm) alkalmaztunk; a 4 perces mozgó fázis gradiens (80 1 vizes acetonitril, 12 ml/perc áramlási sebesség) 20 percig (100 % acetonitril, 12 ml/perc áramlási sebesség) lineárisan emelkedett. A folyamatos detektálást 280 nm hullámhossznál végeztük.

A 17-18 perces retenciós idejű csúcshoz tartozó frakciókat egyesítettük, majd az így nyert anyagot ugyanazon a kolonnán tovább tisztítottuk, amelynek során azonban 15 perces mozgó fázis gradiens (40 i vizes acetonitril, 12 ml/perc áramlási sebesség) emelkedett lineárisan 20 percig (100 i acetonitril, 12 ml/perc áramlási sebesség).

A 9 és 10 perc retenciós idő közötti csúcshoz tartozó anyagot kinyertük. Ez a termék az olyan (II) általános képletü szeszkviterpén volt, amelyben Y jelentése kettős kötés. A vegyület a következő fizikai jellemzőkkel rendelkezett:

• ·

- 19 ···· «· * · · • · ·«·« ·· · ··

Összegképlet: C Ή^Ο· Molekulatömeg: 358

Oldható: metanolban, acetonban, etil-acetátban

UV:	[ km. .1 :<	(nm) (ε) ] :
	276, 6	(4900)	MeOH
	207, 6	(30 000)	MeOH-KOH
	311,2	(4100)
Tömegspektometria:	[m/z (intenzitás 1)]:
DEI		358	(Mö 100), 233 (55), 203 (15), 155 i	(20)
DCI	(ΝΗ;)	359	(MH⁺, 100), 233 (10), 203 (20), 155	(20)

Nagy felbontású Cl: 359,2270, C,>;_;HjiO.i összegképlethez 359,2214 kell

IR (KBr) : [v cm] :

3395,2, 2930,2, 1730,4 ^LH-NMR: [400 MHz, CD₅OD, δ (m, J, helyzet) ] :

1,13 (3H, s, 3H-21), 1,14 (3H, s, 3H-20), 1,37 (1H, m, H-lOa),

1,51 (3H, s, 3H-19), 1,58 (1H, széles ddd, 13,2, 10,1, 6,8, H-10a), 1,72 (3H, s, 3H-22), 1,85 (1H, széles dd, 13,0, 4,5, H-

-6a), 2,08 (1H, széles dd, 12,5, 7,1, H-9a), 2,22 (1H, széles dd, 9,8, 5,2, H-ll) , 2,23 (1H, széles dd, 11,6, 11,6, H-9b),

2,33 (1H, széles dd, 12,7, 12,7, H-6b) , 2,38 (1H, dd, 14,5, 9,9, H-2a), 2,70 (1H, széles ddd, 14,5, 2,2, 1,6, H-2b) , 3,02 (1H, ddd, 7,8, 5,6, 1,5, H-17), 3,67 (1H, dd, 5,8, 5,8, H-13), 3,80 (1H, dd, 9,3, 7,9, H-18a), 3,83 (1H, széles dd, 6,0, 6,0, H-12), 4,03 (1H, széles dd, 9,3, 1,5, H-18b) , 5,17 (1H, m, H-7), 5,24 (1H, dd, 15,9, 1,5, H-4), 5,32 (1H, ddd, 15,9, 10,0,

2,2, H-3).

¹³C-NMR: [100 MHz, CD_;iOD, δ (m, helyzet)]:

*·*· · 4 »*»f4« • « · · 44 • · * · · 4· • ·····*··· 4« · · · *· 4 44 4

- 2 0 17,66, (q, C-22), 23,71 (q, C-19), 24,92 (q, C-20), 30,85 (q, C-21), 32,24 (t, C-10), 37,37 (t, 09), 39,37 (s, 05),42,22 (d, 013), 43,11 (t, 06), 45,01 (d, Oll), 45,17 (t, 02), 48,97 (d, 017), 70,86 (t, 018), 83,70 (d, 012), 88,94 (s, C1), 121,90 (d, 03) , 124,68 (d, 07), 135,25 (s, 015) , 13“,39 (s, 08), 144,73 (d, 04), 166,96 (s, 014), 200,99 (s, 016).

3, Példa - A (B) vegyület extrakciója és tisztítása

Egy 75 literes fermentáció fermentlevét centrifugáltunk, és a micéliumot ötször 10 liter etil-acetáttal extraháltuk. Az extraktumot szárazra pároltuk, majd az így nyert maradékot tiszta metanollal ismét feloldottuk. A tisztítást reverz fázisú preparatív HPLC útján végeztük, amelynek során egy Waters Delta-Pak C18 [10 nm (100 angström) , 15 μπι] kolonnát (belső átmérő: 10,0 mm, hossz: 25,0 cm) alkalmaztunk; az 5 perces mozgó fázis 80 % vizes acetonitril (12 ml/perc áramlási sebesség) volt. A folyamatos detektálást 280 nm hullámhossznál végeztük.

A 23-25 perces retenciós idő mellett eluálódott termék a (B) vegyület volt, azaz az olyan (III) általános képletű szeszkviterpén, amelyben R jelentése hidroxicsoport. A vegyület a következő fizikai jellemzőkkel rendelkezett:

Összegképlet: C2.1H30CŰ Molekulatömeg: 414

Oldható: metanolban, etil-acetátban, kloroformban, acetonban

UV: (nm) (s) ] :

200 HPLC oldószer (H-O-CH₃CN)

268

368

- 21 »*·· · » ·*· • · · · * • · · · V « a ♦ · «·«· «··« · · · • · · * *· ··»«

277,0	(29 500)		MeOH
353,5	(3900)
289, 8	(32 100)		MeOH-KOH
344,4	(3800)
271, 6	(47 000)		MeOH-TFA
324,8	(3400)
Tömegspektometria:	[m/z	(intenzitás %) ]
DEI	414	(Μ',	100), 331 (45),
DCI (NH;;)	415	(MHÖ	100)

Nagy felbontású El:

414,2059,

277 (20), 211 (50)

CyiH,₀O_ó összegképlethez 414,2034 kell

211,0240, kell

IR (KBr) : [v cm^-’] :

3265, 2960, 2930, 2855, 1735, 1625 ^TH-NMR: [400 MHz, CDC1-_S, δ (m, J, helyzet)]:

1.4 (t), 1,7 (dd) 1,75 (dd) , 2,05 (dd) , 2,16 (d+dd) , 2,3 (t),

2.4 (dd) , 2,7 (dt) , 4,9 (d+td) , 5,05 (d+d) , 5,2 (dd) , 5,25 (dd) .

¹³C-NMR: [100 MHz, CDC1,, δ (m, helyzet)]:

160, 4, 150, 146, 1, 144,2, 144, 142, 1, 136, 126, 9, 123, 7, 123, 118,7, 86, 9, 84, 3, 82,3, 43, 5, 41, 4, 40, 7, 38,2, 37,7, 29, 4,

28,2, 24,2, 22,7, 17.

4. Példa - A (C) vegyület extrakciója és tisztítása

Egy 75 literes fermentáció fermentlevét centrifugáltunk, és a micéliumot ötször 10 liter etil-acetáttal extraháltuk. Az

- 22 - · . ..

extraktumot szárazra pároltuk, majd az így nyert maradékot tiszta metanollal ismét feloldottuk. A tisztítást reverz fázisú preparativ HPLC útján végeztük, amelynek során egy Waters Delta-Pak PrepPak 3000 kolonnát [C18, 10 nm (100 angström), 15 pm, belső átmérő: 47 mm, hossz: 30,0 cm] alkalmaztunk; a 0,5 perces mozgó fázis gradiens (80 ΐ vizes acetonitril, 50 ml/perc áramlási sebesség) 30 percig (100 1 acetonitril, 50 ml/perc áramlási sebesség) lineárisan emelkedett. A 18-19 perces retenciós idő között eluálódott termék a (C) vegyület volt, azaz az olyan (II) általános képletú szeszkviterpén, amelyben R jelentése hidrogénatom. Az így nyert anyagot ugyanazon a kolonnán tovább tisztítottuk, amelynek során azonban 5 perces mozgó fázis gradiens (30 1 vizes acetonitril, 50 ml/perc áramlási sebesség) emelkedett lineárisan 10 percig (15 % vizes acetonitril, 50 ml/perc áramlási sebesség). Ezt az oldószerelegyet 15 percen keresztül 15 1 vizes acetonitril koncentráción tartottuk (50 ml/perc áramlási sebesség), majd 5 percig lineárisan emeltük (100 % acetonitril, 50 ml/perc áramlási sebesség). Emellett a gradiens mellett a számunkra érdekes csúcs [(C) vegyület] 22 és 24 perc közötti retenciós idővel rendelkezett. A vegyület a következő fizikai jellemzőkkel rendelkezett:

Összegképlet: C;.;H₃o0₅ Molekulatömeg: 398

Oldható: metanolban, acetonban, etil-acetátban

UV: [λ_ηι51?; (nm) (ε) ] :

270,6 (41 700) MeOH

338,4 (3800)

209,3 (13 300)

MeOH-KOH * · ·

282,3 (41 400)

326,4	(3200)
342, 8	(3900)
390,0	(3000)
271,2	(52 200)	MeOH-TFA
316, 6	(4300)
Tömegspektometria:	[m/z (intenzitás %) ] :
DEI	398	(M', 100), 315 (90), 256 (100), 233	(95) ,
	195	(40)
DCI (NH-_:)	399	(MH\ 100), 222 (10), 205 (90), 195	(20) ,
	172	(70)

Nagy felbontású El: 398,2093, C._:1H;:Os összegképlethez 398,2085 kell

IR (KBr) : [v cm'¹] :

3400 (éles), 3200, 2928, 1750, 1600, 1380 ^-NMR: [400 MHz, CRDg, referencia: 7,16 ppm, 6 (m, J, helyzet) ] :

0,75* (3H, s, 3H-23), 0, 93* (3H, s, 3H-22), 1,01 (3H, s, 3H-21), 1,11 (1H, t, 11,7 H-lOa), 1,40 (1H, széles dd, 14,9, 7,6, H-lOb), 1,45 (3H, széles s, 3H-24), 1,63 (1H, dd, 13,0, 5,0, H-6a), 2,05 (1H, széles t, 11,5, H-6b), 2,10 (1H, m, H-2a), 2,11 (1H, m, H-9a) , 2,17 (1H, dd, 11,0, 3,8, H-ll), 2,60 (1H, t,

12,1, H-9b), 2,74 (1H, széles d, 14,5, H-2b) , 4,37 (1H, dd,

12,9, 1,6, H-20a) , 4,44 (1H, dd, 13,0, 3,2, H-20b), 4,59 (1H, széles dt, 11,2, 3,0, H-12), 5,01 (1H, dd, 15,8, 1,5, H-4),

5,11 (1H, dd, 15,8, 2,8, H-3), 5,15 (1H, széles dd, 10,0, 3,2,

H-7) , 6, 57 (1H, s, H-18) .

^,5C-NMR	: [100 MHz	, C.;D..,	referencia: 128,00	ppm, <	> (m, hely-
zet) ] :
17,20	(q, C-24),	22,82 (	:q, C-21), 24,21* (q	, C-23)	, 28,61 (t,
C-10),	29,55* (q,	C-22),	38,28 (t, C-9), 38,	33 (s,	C-5), 41,44
(d, C-	11), 41,93	(t, c-	6), 43,98 (t, C-2),	75, 35	(t, C-20),
85, 28	(d, C-12),	86,75 (	[S, C-l), 108,49 (d,	C-18),	120,05 (d,
C-3) ,	124,20 (d,	C-7) ,	127,94 (s, C-13),	136,22	(s, C-8),
137,45	(s, C-19),	143,74	(d, C-4), 147,96 (s,	C-14),	149,71 (s,
C-15),	160,00 (s,	C-17),	165, 58 (s, C-16).

5. Példa - Az (A') vegyület extrakciója és tisztítása

Az X06/15/458 biomasszáját kiszűrtük, 25 liter acetonnal többször extraháltuk, majd az extraktumot szűréssel elválasztottuk a biomasszától. Az acetont rotációs vákuumbepárlón eltávolítottuk, és a visszamaradt vizes szuszpenziót fagyasztva szárítottuk (liofilizáltuk). Ennek eredményeként egy gumit nyertünk, amelyet feloldottunk 250 ml metanolban, majd szűrés után 150 ml-re betöményítettük. A mintát reverz fázisú HPLC útján kromatográfáltuk, amelynek során 15 μη töltetű, 47 χ 100 mm-es C18 (oktadecil-szilícium-dioxid) Delta-Pak kolonnát használtunk. A gradiens elúció során 100 ml/perc áramlási sebesség mellett 30 perces időtartamban 80:20 térfogatarányú viz/acetonitril -» 20:80 térfogatarányú víz/acetonitril oldószerelegyet alkalmaztunk. Az (A) vegyületet 278 nm-nél detektáltuk. Az aktív frakciót ugyanezen a kolonnán, azonos áramlási sebesség mellett ismételten kromatográfáltuk, azonban ebben az esetben a gradiens elúció során 40 perces időtartamban 60:40 térfogatará• *

- 25 nyú viz/acetonitril -> 35:65 térfogatarányú víz/acetonitril oldószerelegyet alkalmaztunk. Az acetonitril eltávolítása érdekében az aktív frakciót rotációs vákuumbepárlón betöménvitettük, majd a maradékot fagyasztva szárítottuk, és így egy szilárd anyagot nyertünk [(.A) vegyület, 1. részlet] .

A további tisztítást normál fázisú kromatográfia útján végeztük, amelynek során 16 cm-es magasságig szilikagéllel (MERCK, 230-400 mesh, szemcseméret: 0,040-0,063 mm) töltött, 30 cm x 1,4 cm méretű gyorsoszlopot alkalmaztunk, valamint az izokratikus elúciót 40:60:1 térfogatarányú hexán/etil-acetát/ecetsav eleggyel végeztük. Az illékony oldószert csökkentett nyomás alatt eltávolitottuk, majd a maradékként nyert színtelen olajból fagyasztva szárítással eltávolítva a maradék oldószert fehér, kristályos anyagot nyertünk [(A) vegyület, 3. részlet].

A terméket hat héten keresztül mélyhűtőben tároltuk. Tárolás után a szilárd anyag reverz fázisú HPLC tisztítását Prep 3000 kolonnán hajtottuk végre (6 pm C18-Nova-Pak HR töltetű, 25 x 100 mm kolonna). Áramlási sebesség 20 ml/perc, 20 perces gradiens, 70:30 térfogatarányú víz/acetonitril 100 1 acetonitril. Az (A) vegyületen kívül egy második, még polárosabb komponenst is izoláltunk, amelyet az (A) vegyület 7,8-epoxidjaként azonosítottunk. Ez a termék az (A') vegyület. Alternatív módon a Delta-Prep kolonna alkalmazásával is elválasztottuk az (A) vegyületet a 7,8-epoxidjától; ebben az esetben 20 perces időtartamú 60:40 térfogatarányú viz/acetonitril -+ 40:60 térfogatarányú víz/acetonitril gradienst használtunk.

Az (A') vegyületet úgy azonosítottuk, hogy a vegyület UV,

- 26 MS és NMR adatait összevetettük az (A) vegyület esetén nyert megfelelő adatokkal (lásd: 2. Példa).

Az (A' ) vegyület a következő fizikai jellemzőkkel rendelkezik:

Összegképlet:

Oldható: metanolban (jól)

UV: [λ_!ΜΧ (nm) ] :

278 (metanol)

Tömegspektometria: módszer

Cl MH^b

MNH,^H

El M

Molekulatömeg: 374

m/ z	intenzitás
375	100
392	0
374
219	20
153	40
43	100

IR (KBr) : [v cm ] :

3383 (széles), ^I-NMR: [CDjOD, δ ppm] :

1,13 (3H, s), 1,29 (3H,s), (3H, dd) , 1,53 (2H, m) , 1,82 m) , 2,55 (1H, m) , 2,75(1H,

3,70 (1H, dd) , 3,75 (1H, dd) , ¹³C-NMR: [CD3OD, δ ppm] :

2959 (széles), 1624,1387.

1,39 (3H, s), 1,45 (1H, m) ,1,49 (1H, dd) , 2,00 (1H, m), 2,10 (2H, m) , 2, 80 (1H, m) , 3, 00 (1H, m) ,

3,80 (1H, dd), 5,55 (2H, d) .

200,7 (C-16), 165,9 (C-14), 143,4 (C-4), 135,0 (C-15), 122,6

(C-3), 87,6	(c-l),	82, 6	(C-12),	70,7	(C—18), 63,7	(C-8), 62,3
(C-7), 47,6	(C-11),	44, 9	(C-2) ,	42,1	(C-13), 41,4	(C-6), 36,6

(C-5), 36,5 (C-9), 31,2 (C-2), 27,4 (C-10), 24,7 (C-20), 23,1 • · · · (C—19), 17,6 (C-22), 48,6 (C-17) - oldószer által takart.

6. Példa - Az (E) vegyűlet extrakciója és tisztítása

Egy 75 literes X06/15/458 fermentáció fermentlevét centrifugáltuk, és a micéliumot ötször 10 liter etil-acetáttal extraháltuk. Az extraktumot szárazra pároltuk, majd az így nyert maradékot tiszta metanollal ismét feloldottuk. A tisztítást reverz fázisú preparatív HPLC útján végeztük, amelynek során egy Waters Delta-Pak PrepPak 3000 kolonnát [C18, 10 nm (100 angström), 15 pm, belső átmérő: 47 mm, hossz: 30,0 cm] használtunk; izokratikus mobil fázisként 40 1 vizes acetonitrilt alkalmaztunk 50 percen keresztül (50 ml/perc áramlási sebesség), majd ezt követően 10 percen át acetonitriles mosást végeztünk. A 44 és 48 perc között eluálódott termék volt a célvegyület, azaz az (E) vegyűlet. A detektálást 200 nm hullámhosszon végeztük. Az ehhez a csúcshoz tartozó anyagot reverz fázisú félpreparatív HPLC útján tovább tisztítottuk, amelynek során Waters Delta-Pak PrepPak 3000 kolonnát [C18, 10 nm (100 angström), 15 pm, belső átmérő: 10 mm, hossz: 25,0 cm] használtunk; izokratikus mobil fázisként 55 % vizes acetonitrilt alkalmaztunk 28 percen keresztül (15 ml/perc áramlási sebesség), majd ezt követően 10 percen át acetonitriles mosást végeztünk. A 23 és 28 perc között eluálódott termék volt a célvegyület, azaz az (E) vegyűlet. A detektálást 200 nm hullámhosszon végeztük. Az (E) vegyűlet a következő fizikai jellemzőkkel rendelkezik: Összegképlet: C₃₃H₃o0₄ Molekulatömeg: 370

Oldható: metanolban, etil-acetátban

UV:	[ ínm)	(c) oldószer] :
	213, 4			24 400 MeOH
	230, 0_SH			7500
	277,3			9200
	215, 6			6900 MeOH-KOH
	22 8,2₃₃			5400
	286, 1			5200
Törnegspehtométria:	[m/í	: (intenzitás 7) ] :
El		370	(M^b,	2), 167 (80), 166 (100)
DCI	(ΝΗ;)	371	(MH’	, 30), 205 (100), 167 (100), 149 (401,
		135	(25)	, 123 (40), 121 (30), 109 (40)
IR	(KBr):	[v cm ^l] :
		3333	, 4,	2932,2, 2862,7, 1720,7, 1622,3, 1469,9,
		1381	,2,	1329,1, 1286,7, 1167,1.
^TH-NMR: [400	MHz,	C₃D₃/CD₃OD, referencia: CD₃OD-re 3,40 ppm,

(m, J, helyzet)]:

0,86* (3H, s, 3H-22), 1,07* (3H, s, 3H-21), 1,26 (3H, s, 3H-20), 1,36 (1H, dd, 13,6, 11,3, H-lOa), 1,62 (3H, széles s, 3H-23), 1, 68 (1H, m, H-lOb) , 1,75 (1H, m, H-6a) , 2,09 (1H, dd,

9,	8, 8,6, H-ll) ,	2,21	(1H,	t,	12,3,	H-6b), 2,27 (1H, dd, 12,7,
7,	1, H-9a), 2,34	(1H,	dd,	14,	5, 10,	3, H-2a) , 2,70 (1H, széles
t,	11,7, H-9b),	2, 84	(1H,	dt,	14,5,	2,1, H-2b), 4,81 (1H, dd,

11,4, 1,2, H-19a), 4,88 (1H, széles ddd, 10,2, 2,3, 1,5, H-12), 5,02 (1H, ddd, 11,3, 2,5, 0,9, H-19b) , 5,19 (1H, dd, 15,9, 1,7, H-4), 5,24 (1H, széles ddd, 11,9, 4,5, 1,2, H-7), 5,33 (1H, ddd, 15,9, 10,3, 2,4, H-3), 6,64 (1H, széles s, H-17) .

¹³C-NMR: [100 MHz, Cí-D₆/CD₃OD, referencia: CD-,OD-re 49, 00 ppm, δ • · · ·

- 29 (m, helyzet) ] :

17,8 (q, C-23), 22,20 (q, C-20), 24,11* (q, C-22), 29,56 (t, C-

-10) ,	30,32* (q,	C-21),	38,	33 (s, C-5), 38,55 (t,	C-9), 4	2, 12
(t, c-	6), 43,72	(d, C-	11),	43,89 (t, C-2), 73,50	(t, c-	19) ,
83, 12	(d, C-12),	86, 05	(s,	C-l), 101,43 (d, C-17),	119,23	V ö f
C-13),	121,10 (d	, C-3),	123,84 (d, C-7), 131,08**	( s, C -	15) ,
136,89	(s, C-8),	140,31	(s,	C-14), 143,02 (d, C-4),	147,54	(s,

C-16).

*, **: az aszignációk esetleg felcserélhetek

7. Példa - Az (F) vegyület előállítása és azonosítása

A 6. Példában ismertetett (E) vegyület metanollal készített oldatát levegőn történő, feleslegben vett nátrium-perjódát hozzáadásával gyorsított oxidációnak vetettük alá.

A vegyület tisztítását reverz fázisú preparatív HPLC útján végeztük, amelynek során Waters Delta-Pak kolonnát [C18, 10 nm (100 angström), 15 pm, belső átmérő: 10,0 mm, hossz: 25,0 cm] használtunk, valamint lépcsőzetes oldószer gradienst alkalmaztunk: 5 percig 25 % vizes acetonitril (12 ml/perc) , majd 35 percen keresztül emelkedés 80 % vizes acetonitril koncentrációig (12 ml/perc). A 30 és 32 perc között eluálódott termék volt az (F) célvegyület. A detektálást 200 nm hullámhossznál végeztük .

Az (F) vegyület a következő fizikai jellemzőkkel rendelkezik:

Összegképlet: C23H28O4 Molekulatömeg: 368

Oldható: metanolban • ···· ····

UV: [λ_Μ,_:, (nm) (í:) oldószer]:

04 CH₅CN: Η Ό HPLC oldószer

300

482 ~H-NMR: [400 MHz, CD-OD, referencia: CDOD-re 3,40 ppm, <5 (m,

J) ] :

6, 03	(1H,	széles s), 5,24 (1H,	dd,	J = 1,8, 15,9) , 5, 07 (1H,
széles dd,	J = 3,	4, 10,9), 5,00	(1H,	ddd,	J = 2,5, 10,6, 15, 9) ,
4,79	(1H,	dd, J	= 1,2, 15,6),	4, 65	(1H,	dd, J = 2,2, 15,5),
4,55 (1H,	d, 9,7)	, 2,63 (1H, dt	, J =	2,1,	14,8), 2,44 (1H, dd,
J = 10,5,	14,7) ,	2,27 (2H, m) ,	2,11	(1H,	dd, J - 7,2, 12,9) ,

1,88 (1H, d, J = 9,0), 1,77 (1H, m) , 1,65 (3H, s), 1,50 ( 1H, széles t, J = 11,0), 1,27 (3H, s), 1,07 (3H, s), 1,04 (3H, s). ^1JC-NMR: [100 MHz, CD₅OD, referencia: CD₅OD-re 49,00 ppm, δ (m) ] :

180,	16	(s) ,	175,03 (s)	, 159,46 (s) , 144,57	(d) , 1	37, 71	(s) ,
124,	25	(d) ,	120, 6	(d) ,	114,37 (d) , 88, 75 (s),	81, 63	(d) ,	71, 91
(t) ,	4	3, 40	(t) ,	42, 68	(t), 42,58 (t), 39,19	(s) ,	38, 96	(t) ,

30,52 (q), 30,22 (t), 24,50 (q) , 21,90 (q) , 17,21 (q).

8. Példa - A találmány szerinti vegyületek vizsgálata benzodiazepin-receptor kötési tesztben

A receptor extraktum egy olyan, nyers synaptosomás preparátum volt, amelyet Láng és munkatársainak módszere szerint [Láng et al., FEBS Lett., 104, 149-153 (1979)] ökör agykéregből izoláltunk. A receptorkötés meghatározásához Breastrup és

Squires eljárásának [Breastrup and Squires, PNAS, 74, 3805-3809 (1977)] az O'Beirne és Williams által módosított [Q'Beirne and Williams, Eur. J. Biochem., 175, 413-421 (1988)] változatát használtuk fel. A receptor preparátumot 50 mM Tris/Cl-ban (pH 7,4) az (A) vegyülettel és [ Ή]-flunitrazepam agonistával 1 nM végkoncentráció mellett inkubáltuk. A kötött radioligandot üvegszálszűrőn kiszűrtük és folyadékszcintillációs számlálóval mértük. A nemspecifikus kötést úgy határoztuk meg, hogy a ligand helyett 1 μΜ Diazepamot alkalmaztunk.

A kötési adatokat súlyozott nemlineáris regressziós analízissel, LIGAND [Munson and Rodbard, Analytic Biochem., 107, 220-239 (1980)] és EBDA [McPherson-Computer Prog. in Biomed., 17, 107-114 (1983)] számítógépes programot alkalmazva egy- vagy kéthelyes modellekre illesztettük.

A fentiekben ismertetett eljárást megismételtük a 3. és 4. Példa szerinti (B) és (C) vegyület, továbbá a (D) vegyület alkalmazásával [a (D) vegyület az (A) vegyület nátriumsója].

Az 5-7. Példában ismertetett (A'), (E) és (F) vegyület esetén meghatároztuk az IC_;j értékeket is.

Az így nyert eredményeket az alábbi 1. Táblázatban foglaljuk össze:

··· · • · • ♦ ♦ ·· · ·

1. Táblázat:

A benzodiazepin-receptorhoz történő benzodiazepin kötődésnek a találmány szerinti vegyületek általi gátlása

• « · · · ·· · ·

*··· ····

1. Táblázat (folytatás)

Vegyüiet	Koncentráció	%-os gátlás	IC50
(A’ )	2,8x10’” M	104	8 5 n.M
	9, 3x10“'	103
	2,8x10“'	85
	9,3x10“	83
	2,8x10“	79
	9, 3x10“	51
	2,8x10“'	32
	9, 3x10“ '	19
	2,8x10“°	9
(E)	9,5x10’·' M	104	5 0 0 nM
	4, 8x10’”	101
	9,5x10“'	93
	4, 8x10”	88
	9,5x10“'	65
	4,8x10“'	52
	9, 5xl0”^!	42
	4, 8x10’“	37
	9, 5x10“ ’	27
	4, 8x10“”	22
(F)	2,7x10“'' M	94	3,0 μιΜ
	9, 0x10“”	89
	2,7x10“	77
	9,0x10“”	65
	2, 7x10“	48
	9, 0x10“°	41
	2,7x10“'	33
	9, 0x10’-	27
	2,7x10“-	24
	9, 0χ10“”	15

• · ···· · · ···· • · · · » · • · · · · · » * ···«···»·♦ · · ♦· * · ·· ····

- 34 9. Példa - Gyógyszerkészítmény

Egyenként 0,15 g tömegű és 25 mg találmány szerinti vegyületet tartalmazó tablettákat állíthatunk elő a következők szerint :

Összetétel 10 000 tablettához találmány szerinti vegyület (250 g) laktóz (800 g) kukoricakeményítő (415 g) talkumpor (30 g) magnézium-sztearát (5 g)

A találmány szerinti vegyületet, a laktózt és kukoricakeményítő felét összekeverjük. A keveréket 0,5 mm-es hálóméretű szitán nyomjuk keresztül. 10 g kukoricakeményítőt 90 ml meleg vízben szuszpendálunk. Az így nyert pasztát a por granulálására használjuk. A granulátumot szárítjuk és 1,4 mm-es hálóméretű szitán kis fragmentumokká tördeljük. A keményítő maradékát, a talkumot és- a magnézium-sztearátot hozzáadjuk a fragmentumokhoz, a keveréket óvatosan összekeverjük, majd tablettákká ala kítjuk .

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Egy (I) általános képletű szeszkviterpén — amelynek képletében a b —=— és ; mindegyikének jelentese egyes kötés, vagy az egyiknek a jelentése egyes kötés, és a másik jelentése kettős kötés;

__a__ 13

A együtt az ----- és ~z-~- kötesse!, valamint azzal szénatommal, amelyhez ezek a kötések kapcsolódnak, egy (a) , (c), (d) képletű vagy (b) általános képletű gyűrűt képez, ahol a (b) általános képletben

R jelentése hidrogénatom vagy hidroxicsoport; és

Y jelentése kettős kötés, vagy ha A jelentése egy fentiekben meghatározott (a) képletű gyűrű, akkor A jelentése kettős vagy azokkal a szénatomokkal, amelyekhez kapcsolódik, egy epoxidkötést képez — vagy egy gyógyszerészetileg vagy állatgyógyászatilag elfogadható sója.
2. Egy 1. igénypont szerinti, (II) általános képletű szeszkviterpén — amelynek képletében

Y jelentése kettős kötés, vagy azokkal a szénatomokkal, amelyekhez kapcsolódik, egy epoxidkötést képez — vagy egy gyógyszerészetileg vagy állatgyógyászatilag elfogadható sója.
3. Egy 1. igénypont szerinti, (III) általános képletű szeszkviterpén — amelynek képletében

R jelentése hidrogénatom vagy hidroxicsoport — vagy egy gyógyszerészetileg vagy állatgyógyászatilag elfogadha-

- 36 tó sója.
4. Egy (IV) általános képletü szeszkviterpén — amelynek képletében

X jelentése (e) vagy (f) képletü csoport — vagy egy gyógyszerészetileg vagy állatgyógyászatilag elfogadható sója.
5. Eljárás egy 1. igénypont szerinti vegyület előállítására, azzal jellemezve, hogy (i) egy (I) általános képletü szeszkviterpént termelő X06/15/458 (IMI 354451) gombatörzset vagy ennek mutánsát szénás nitrogénforrás, valamint szervetlen sók jelenlétében fermentálunk;

(ii) a szeszkviterpént izoláljuk a fermentációs közegből;

(iii) kívánt esetben egy olyan (I) általános képletú szeszkviterpént, amelyben A jelentése (c) képletü gyűrű, egy olyan (I) általános képletü szeszkviterpénné oxidálunk, amelyben A jelentése (d) képletü gyűrű; és/vagy (iv) kívánt esetben a szeszkviterpént egy gyógyszerészetileg vagy állatgyógyászatilag elfogadható sójává alakítjuk.
6. Egy, az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti vegyület a (gamma-amino-vajsav)-benzodiazepin-Cl ionofor receptor komplexben lévő benzodiazepin receptorhoz tartozó ligandok által modulált rendellenességek kezelésében történő felhasználásra.
7. Egy 7.igénypont szerinti vegyület görcsoldóként, anxiolyticumként, izomrelaxánsként vagy hipnotikumként, illetve a memóriajavitásban vagy a gyógyszer-túladagolás terápiájában történő felhasználásra.
8. Gyógyszer- vagy állatgyógyászati készítmény, amely gyógyszerészetileg vagy állatgyógyászatilag elfogadható hordozót vagy hígítót, valamint hatóanyagként egy, az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti vegyületet tartalmaz.
9. Az X06/15/458 — IMI 354451 — gombatörzsnek vagy egy mutánsának egy biológiailag tiszta tenyészete, amely egy 1. igénypont szerinti (I) általános képletű szeszkviterpént termel .
10. Eljárás egy 1. igénypont szerinti (I) általános képletű szeszkviterpént termelő X06/15/458 — IMI 354451 — gombatörzsnek vagy egy mutánsának a fermentálására, azzal jellemezve, hogy az X06/15/458 törzset vagy mutánsát szén- és nitrogénforrás, valamint szervetlen sók jelenlétében fermentálj uk.