JPH02231089A - ビタミンｄ類の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 業　の府用 本発明は、ヒドロキシビタミンＤ類の微生物を利用する
製造方法に関する． 更未立韮遣 有機化学的方法によりビタミンＤ類の１α及び／又は２
５位に直接水酸基を導入することは極めて困難で、その
例は未だ報告されていない。

一方、動物臓器を用いた酵素化学的方法により原料のビ
タミンＤ類の１α及び／又は２５位に直接水酸基を導入
することは、従来から可能であった．すなわち、１α位
に直接水酸基を導入する場合、ニワトリなどの動物の腎
のホモジネートやミトコンドリア画分を用いる方法［ネ
ーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第２３０巻、第２２８頁（
１９７１年）、ジャーナルオブバイ才口ジカノレケミス
トリ−（Ｊ．Ｂｉｏ，Ｃｈｅｗ．　）　，第２４７巻、
第７５２８頁（１９７２年）、バイオケミストリー（Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２５巻，第５５１２頁（
１９８６年）など］が知られている。また、２５位に直
接水酸基を導入する場合、ラットなどの動物の単離した
肝臓にビタミンＤ類を含む溶液を潅流きせる方法［ジャ
ーナル才ブクリニカルインベスティゲーション（Ｊ．　
ＣＩｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．　）．第４８巻，第２０３
２頁（１９６９年）、バイオケミカルアンドバイオフィ
ジカノレ　リサーチコミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　）
　，第６６巻．第６３２頁（１９７５年）コやラットな
どの動物の肝のホモジネートを用いる方法［バイオケミ
カルアンドバイオフイジカルリサーチコミｘニケーショ
ン（Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏ
ｍｍｕｎ．　）　，第３６巻，第２５１頁（１９６９年
》］が知られている。

発明が解決しようとする課題 しかしながら、動物臓器を用いた酵素化学的方法では、
多量の動物の腎又は肝が必要であり、しかもその調製に
手間がかかり、非効率的で実用的な製造法ではない。

本発明は、より容易な操作による１α一及び／又は２５
−ヒドロキシビタミンＤ類を得る方法を提供することを
目的とする。

課　を解決するための　段 本発明者らは、特定の微生物を利用することにより、ビ
タミンＤ類の１α及び／又は２５位に直接水酸基を導入
できることを見出し、本発明を完成した． 本発明は、ビタミンＤ類を水酸化するアミコラタ（如二
堕互連）属に属する放線菌菌体又はその産生ずる酵素を
含有する溶液中に１α又は２５位に水素原子を有するビ
タミンＤ類を加えて、それぞれその水素原子を水酸基に
変換することを特徴とする１α−ヒドロキシビタミンＤ
類又は２５−ヒドロキシビタミンＤ類の製造方法、並び
にビタミンＤ類を水酸化するアミコラタ（９）属に属す
る放線菌菌体又はその産生ずる酵素を含有する溶液中に
１α及び２５位に水素原子を有するビタミンＤ類を加え
て、その水素原子を水酸基に変換することを特徴とする
１α−ヒドロキシビタミンＤ類又は１α．２５−ジヒド
ロキシビタミンＤ類の製造方法である。すなわち、本発
明によれば、１α位又は２５位に水素原子を有するビタ
ミンＤ類は、それぞれその水素原子が水酸基に変換され
る。また、１α及び２５位に水素原子を有するビタミン
Ｄ類は、まずその２５位水素原子が水酸基に変換され、
次いで、１α位が水酸基に変換される． 本発明の製造方法は、ビタミンＤ類の１α及び／又は２
５位に直接、１工程で水酸基を導入する方法であり、１
α又は２５位以外にいずれの置換基を有していてもよい
．従って、本発明においてビタミンＤ類とは、たとえば
、ビタミンＤ，系及びビタミンＤ．系の化合物であり、
その１７位側鎖の水素原子又は水酸基がフッ素などのハ
ロゲン原子、水酸基、低級アルキル基などで置換されて
いてもよい。原料のビタミンＤ類の１α又は２５位は、
これが水素原子以外のときは水酸基であることが好まし
い．それらは、たとえば、ビタミンＤよ、ビタミンＤ．
、１α−ヒドロキシビタミンＤい１α，２４−ジヒドロ
キシビタミンＤａ、２５−ヒドロキシビタミンＤ．、２
５−ヒドロキシビタミンＤよ、２４．２５−ジヒドロキ
シビタミンＤ．、２３．　２５−ジヒドロキシビタミン
Ｄｓ、２５．２６−ジヒドロキシビタミンＤ，、２３．
　２４．　２５−　トリヒドロキシビタミンＤ１、２４
．２４−ジフルオ口−２５−ヒドロキシ−２６．　２７
−ジメチルビタミンＤ．、２５−ヒドロキシ−２６．　
２６．　２６．　２７．２７．２７−ヘキサフル才口ビ
タミンＤ１などである。

本発明に使用されるアミコラタ（　担股巾κ）属に属す
る放線菌菌体でとは本発明者らが埼玉県大宮市の土壌よ
り新たに分離したものであり、微生物の名称及び記号１
アミ．コラタ・サツルネアＡ＝７９８３（ｄ　ｓａｔｕ
ｒｎｅａ　Ａ−７９８３）Ｊ及び「微生物の保管受託番
号第２３０７号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２３０７）」として
工業技術院微生物工業研究所に寄託されている。

本菌株の菌学的性状を以下に示す。

１）形態 栄養菌糸は合成寒天培地及び天然寒天培地においてよく
発達し、不規則的に分岐する。また隔壁は認められない
。胞子はグリセリン・アスパラギン寒天培地及びスター
チ無機寒天培地などで良好に形成される．顕微鏡で観察
すると胞子形成菌糸の分岐方法は単純分岐で胞子は直鎖
状に形成される。胞子は通常３個以上の連鎖が認められ
、培養の後期には長い鎖状を呈し、表面は平滑である．
胞子の形状は円筒形で、その大きさは０．５〜０．８Ｘ
２．０〜４，ＯＰである。菌核、胞子のう、べん毛胞子
は観察されない。

２）培地上での生育状態 各種培地で３０℃、１４日間培養したときの肉眼的観察
結果を第１表に示す。

第１表 ３）生理的性質 （１）生育温度範囲 栄養寒天培地上において２０〜３０℃の範囲で良好に生
育する． １０″Ｃ以下、４０℃以上の温度範囲では生育しない。

（２ｌ）生化学的性質 ａ》好気性、嫌気性の区別；　　好気性ｂ》ゼラチンの
液化；　　　　　陰性 Ｃ》脱脂乳の凝固；　　　　　　陰性 ｄ》脱脂乳のペブトン化；　　　陽性 ｅ》スターチの加水分解；　　　陰性 ｆ》メラニン様色素生成；　　　陽性 ｇ》硝酸還元能；　　　　　　　陽性 （３）炭素源の利用 （ブリドハム・ゴドリーブ寒天培地） 利用スる：Ｄ−クルコース，シュクロース，０−キシロ
ース，Ｌ−イノシトール， Ｄ−マニトール，ｐ−フラクトース わずかに利用する：Ｌ−アラビノース，ラムノース，ラ
フィノース （荀細胞壁のミフール酸含有の有無　　無（９細胞膜の
リン脂質タイブ　　　　　Ｐ■以上の性状から本菌株が
放線菌に属することは明らかであり、上記諸性状をＩ　
．　Ｓ．　Ｐ．’インターナショナル・ストレブトマイ
セス・プロジェクト」，バージー著「マニュアル・オブ
・ディターミナティブ・バクテリオロジー」第８版（１
９７４年）及びワックスマン著「ジ・アクチノミセテス
」第２　巻（１９６１年）及び「インターナショナル・
ジ〜−ナル・才ブ・システマティック・バクテリオロジ
ー」第３６巻，第２９〜３７ページ（１９８６年）に報
告されている多くの既知菌種と比較した結果、本菌株は
アミコラタ・サツルネアに最も近い性状を示していた。

以上の結果より、本菌株はアミフラタ・サツルネアと種
を同じくするものと判断し、本菌株はアミフラタ・サツ
ルネアＡ−７９８３と命名した。

本発明の方法は、放線菌の菌体又はその産生する酵素を
含有する溶液中で、基質ビタミンＤ類を好気的条件下で
反応きせることによって行うものである。

反応に必要な放線菌の菌体を得るためには、好気条件下
で本菌の培養を培地中で行う。

培地は主として液体培地を用い、炭素源としてグルコー
ス，マルトース，デキストロース，スターチ，アラビノ
ース．キシロースを単独又は混合して用いる．窒素源と
しては、ポリペブトン，カザミノ酸，酵母エキス，肉エ
キス，コーンスチーブリカー及びソイビーンミールなど
を単独又は混合して用いる。その他、本菌株の生育を助
け、１α一及び／又は２５−ヒドロキシビタミンＤ類の
生産を促進する有機物及び無機塩を必要により添加する
ことができる。培養方法は振どう培養、通気攪拌培養な
どの好気培養が適しており、ｐＨ６〜７．４、２８〜３
０℃で２〜８日間培養する。

この培養により得られた菌体を含有する溶液を、１α一
及び／又は２５−ヒドロキシビタミンＤ類を生産する反
応に用いる。すなわち、培養中の菌体を含む培養液をそ
のまま用いるか、培養終了後、遠心分離又は濾過により
分離した菌体を懸潤した溶液を用いる。また、培養後に
得られた菌体を破砕後、遠心分離などにより菌体を除い
た溶液を用いることができる．さらにまた、菌体は光架
橋性樹脂プレボリマー、たとえばＥ　Ｎ　Ｔ　３４００
［商品名；関西ペイント（株）製］などや、ウレタン・
ブレボリマー、たとえばＰＵ−９［商品名；東洋ゴム（
株》製］などやκ一カラギナンなどの多糖類に固定化し
てから溶液に添加してもよい．また、前記菌体の凍結乾
燥したものを上記と同様に用いることもできる。

本発明において用いられる反応溶液は、前記培地を用い
て培養した培養液であるか、あるいはトリスー酢酸、ト
リスー塩酸、コハク酸ナトリウム−コハク酸、コハク酸
カリウムーコハク酸、クエン酸ナトリウムークエン酸、
リン酸塩（カリウム塩、ナトリウム塩など〉、カコジル
酸ナトリウムー塩酸、イミダゾールー塩酸、ホウ酸一ホ
ウ砂などの緩衝液を単独又は混合したものである。その
他、溶液には、目的のビタミンＤ類の生産を促進する界
面活性剤、有機物及び無機塩を必要により添加すること
ができる． 本発明の製造方法は、前記菌体を含有する溶液中で振と
う操作、通気攪拌操作などに付して好気条件下で行うこ
とが適しており、ｐＨ５〜８、２０〜３７℃で５分間〜
９６時間攪拌振とラする．また、酸素気流下で反応する
ことができる。基質のビタミンＤ類は攪拌振とう開始時
に適量添加する．また、培養中の菌・体を含む培養液を
用いる場合は、基質ビタミンＤ類を添加後、更に同条件
下で２４〜９６時間培養して本反応を行う。

なお、１α及び２５位に水素原子を有するビタミンＤ類
を原料とする場合、後記の高速液体クロマトグラフィー
等で生成物を確認して反応時間をきめ、２５−ヒドロキ
シビタミンＤ類又は１α，２５−ジヒドロキシビタミン
Ｄ類をそれぞれ製造することができる． これらの反応により製造きれたビタミンｐ類を単離する
には、血液中からビタミンＤ類を採取する一般的な方法
に準じて行えばよい．たとえば、反応終了後、反応液を
有機溶媒により抽出し、濃縮乾固する．これを２−プロ
パノールーｎ−ヘキサンなどの適当な溶媒に溶解し、遠
心分離により不溶物を除いた後、シリカゲル順層力ラム
（たとえば、ゾルバックスＳＩＬ，米国デュポン社製）
を用いた高速液体クロマトグラフイー又はシリカゲル逆
層カラムくたとえば、ゾルバックス０１）Ｓ．米国デュ
ポン社製》を用いた高速液体クロマトグラフィーに付す
ことにより目的のヒドロキシビタミンＤ類を単離するこ
とができる。

また、セファデックスＬ　Ｈ　−　２０（ファルマシア
社製、スウェーデン）等を用いた分配クロマトグラフィ
ーやローバー力ラム（メルク社製、スイス）等を用いた
シリカゲルグロマトグラフイーによっても目的のヒドロ
キシビタミンＤ類を単離することができる。

允」ヱと穫朱 本発明の方法により、ビタミンＤ類の１α及び／又は２
５位へ直接水酸基を導入することが可能になった．すな
わち、本発明の微生物を用いる方法では、微生物や反応
溶液などの調製に手間がかからす、しかも１段階で短時
間に行うことができ、極めて容易かつ能率的である。

火及眉 以下、実施例及び試験例をあげて本発明をさらに詳細に
説明する， 実施例１ グルコース１．５％、ソイビーンミール１．５％、コー
ンスチーブリ力−０．５％、塩化ナトリウム０．５％、
炭酸カルシウム０．２％、ｐＨ７．０の無菌液体培地く
以下、培地Ａと称す）５０ｍｌｌの入った５００ｍＱの
三角フラスコ１木にアミコラタ・サツルネアＡ　−７９
８３株を１白金耳接種し、２８゜Ｃで４８時間攪拌振と
う培養した。この培養液を上記と同じ無菌液体培地１　
００ｍｌｌの入った５００ｍＱの三角フラスコ２０本の
それぞれに２ｍＱずつ接種し、２８℃で４８時間攪拌振
とう培養した。対数増殖期中にあるこのアミコラタ・サ
ツルネアＡ−７９８３のそれぞれのフラスコ培養液中に
５００μのエタノールに溶解した基質ビタミンＤ．２０
■及び０．２ｍｌのツイーン８０を添加し、これを再び
２８℃で７２時間攪拌振とう培養した。培養終了後、こ
の培養液をブライ・アンド・ダイヤ−（Ｂｌｉｇｈ　＆
　Ｄｙｅｒ）法で抽出し、クロロホルム層を４０゜Ｃ以
下で減圧乾固後、直ちにクロロホルム：ｎ一ヘキサン−
６５：３５の混合溶媒１０ｒｄに溶解し、セファデック
スＬ　Ｈ　−　２０（ファルマシア社製、スウェーデン
）クロマトグラフィーに付した。

溶出溶媒；クロロホルム：ｎ−ヘキサンー６５：３５．
（溶出量約２ｊ２） カラム容積；　４００ｍＱ 生成物の確認はシリカゲルくキーゼルゲル６０Ｆ２５４
　，メルク社製，スイス〉の薄層クロマトグラフィーで
行なった．標準化合物として市販の２５一ヒドロキシビ
タミンＤ．（デュフ７一社製，オランダ）をこれに用い
た。

ｉ５Ｆｌ媒：クロロホルム：メタノールー３０：１紫外
線吸収にてスポットを検出。

溶出後、２５−ヒドロキシビタミンＤ，を含む両分を集
めた。これを４０゜Ｃ以下で、窒素ガス置換しながら減
圧濃縮乾固した後、直ちにｉ−プロパノール：ｎ−ヘキ
サン−３：４７の混合溶媒２ｍｌｌに溶解し、同じ混合
溶媒で調製したシリカゲル・カラム（ローバー力ラム・
サイズＢ，リクロブレップＳｉ６０：商品名、メルク社
製、スイス）に吸着させた． このシリカゲル・カラムを調製したものと同じ混合溶媒
１１でこれを溶出し、２５−ヒドロキシビタミンＤ８溶
出画分をシリカゲル（゜キーゼルゲル６０Ｆ２５４　，
メルク社製，スイス）の薄着クロマトグラフィーで確認
し、２５−ヒドロキシビタミンＤ．を含む両分を集め、
窒素ガス気流下で濃縮乾固した。

この濃縮乾固した両分に０．５ｍｌのｎ−ヘキサンを加
え、更に窒素ガスで封入した後、０゜Ｃ以下で２日間静
置し、白色板状結晶として２５−ヒドロキシビタミンＤ
ｍ４０ｒｒｔを得た。これは市販の２５−ヒドロキシビ
タミンＤ．（デュファ一社製，オランダ〉の標品と液体
クロマトグラフィ−［（１）ゾルバックスＳＩＬ及び（
クゾルバックスＯＤＳ，デュポン社製、米国］の保持時
間、紫外線吸収スベクトラム、マススペクトルｒＡ裂ハ
ターン、”Ｃ−ＮＭＲスペクトラム及び’Ｈ−ＮＭＲス
ペクトラムが完全に一致した。

（１）ソルバックスＳＩＬ液体クロマトグラフィー力ラ
ムサイズ；４．６ｍｎφＸ２５ｃｍ，ｍ出溶媒；　２−
プロバノール：ｎ−ヘキサン−３：２２， カラム温度；２５゜Ｃ，溶出速度；１．５ｍＱ／分，フ
オトダイ才一ドアレイ検出器（ウォーターズＭ９９０，
日本ミリボア・リミテッド社製）で測定． 標品の保持時間；４．０分 （２）ゾルバックスＯＤＳ液体クロマトグラフィー力ラ
ムサイズ；４．６＋ｆｆｌｌφｘ２ｓｃｍ，溶出溶媒；
水：メタノール＝１　：　９　，力２ム温度；４０″Ｃ
，溶出速度；１．ＯｍｌＪ／分，フォトダイ才一ドアレ
イ検出器（ウォーターズＭ９９０．日本ミリボア・リミ
テッド社製）で測定． 標品の保持時間；８．０分 ０）最大紫外部吸収： 入（Ｈｇｘ−　２６５　ｎｍ（エタノーノレ）ＥＩ　　
　ＭＳ（ｍ／ｚ）： ４００（Ｍ”）　，　３８２（Ｍ”−Ｈ！Ｏ）　，　２
７１　，　２５３　，　１３６　，１１８．５９ 実施例２ 培地Ａ５０ｍｌの入った５００ｍｌの三角フラスコ１本
にアミコラタ・サッルネアＡ−７９８３株を１白金耳接
種し、２８゜Ｃで４８時間攪拌振とう培養した。次に内
容量５ｌの培養ジャーを用いて、培地Ａ３Ｎに前記種培
養液５０ｍｌを接種し、２８゜Ｃで４８時間攪拌振とう
培養した。対数増殖期中にあるこのアミフラタ・サッル
ネアＡ−７９８３のそれぞれのフラスコ培養液中に１５
ｍｌのエタノールに溶解した基質ビタミンＤ　ｍ６００
＊及び１５ｍＱのツィーン８０を添加し、これを再び２
８゛Ｃで７２時間攪拌振とう培養した。培養終了後、こ
の培養液を濾過し、菌体と濾液に分け、菌体はブライ・
アジド・グイヤー法で抽出し、濾液はクロロホルム１１
で抽出した。菌体と濾液それぞれのクロロホルム抽出画
分を集め約２１とした後、窒素ガス気流下、４０゜Ｃ以
下で減圧濃縮し、約２０ｍｌｌとした。これにｎ−ヘキ
サン１０ｍｆｔを加え、セファデックスＬ　Ｈ　−　２
０（ファルマシア社製、スウェーデン）クロマトグラフ
ィーに付した。

溶出溶媒；ジクロ口メタン：ｎ−ヘキサンー７０：３０
，（溶出量約２Ａ） カラム容積；　４００ｍｌｌ 生成物の確認はシリカゲル（キーゼルゲル６０Ｆ２５４
　，メルク社製，スイス）の薄層クロマトグラプイーで
行なった．標準化合物として市販の２５−ヒドロキシビ
タミンＤ．（デュファ一社製，オランダ）をこれに用い
た。

ｉ開ｍ媒Ｓクロロホルム：メタノール＝３０：１紫外線
吸収にてスポットを検出。

溶出後、２５−ヒドロキシビタミンＤ．を含む画分を集
めた。これを４０゜Ｃ以下で、窒素ガス置換しながら減
圧濃縮乾固した後、直ちに２−プロバノール：ｎ−ヘキ
サン−３：４７の混合溶媒３ｍｌに溶解し、同じ混合溶
媒で調製したシリカゲル・カラム（ローパー力ラム・サ
イズＢ　２５ｆｆｌｌｌφＸ　３１Ｑｍｍ　，ノク口ブ
レップＳｉ６０：商品名、メルク社製、スイス）に吸着
させた。

このシリカゲル・カラムを調製したものと同じ混合溶媒
１１でこれを溶出し、２５−ヒドロキシビタミンＤ．溶
出画分をシリカゲル（キーゼルゲル６０Ｆ２５４　．メ
ルク社製，スイス）の薄層クロマトグラフィーで確認し
、２５−ヒドロキシビタミンＤ．を含む画分を集め、窒
素ガス気流下で濃縮乾固した。

この濃縮乾固した画分に１．０ｍｌのｎ−ヘキサンを加
え、更に窒素ガスで封入した後、０℃以下で２日間静置
し、白色板状結晶として２５−ヒドロキシビタミンＤｍ
ｌＯＯ■を得た。これは市販の２５−ヒドロキシビタミ
ンＤＡ（デュファ一社製，オランダ）の標品と液体クロ
マトグラフィ−［ゾルバックスＳＩＬ及びゾルバックス
ＯＤＳ，デュポン社製、米国］の保持時間、紫外線吸収
スペクトラム、’Ｈ−ＮＭＲスペクトラム及び”Ｃ−Ｎ
ＭＲスペクトラムが完全に一致した。

最大紫外部吸収： ＾ｍａ）ｃ−　２６５　Ｈｍ（エタノール）Ｅ　Ｉ−Ｍ
Ｓ（ｍ／ｚ）： ４００（Ｍ”）　，　３８２（Ｍ”−Ｈ！Ｏ）　，　２
７１　，　２５３　，　１３６　．１１８　．５９ 実施例３ 培地Ａ　５０憾の入った５００憾の三角フラスコ５本そ
れぞれにアミコラタ・サツルネアＡ−７９８３株を１白
金耳接種し、２８゜Ｃで７２時間攪拌振とう培養した。

培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を集め、この菌
体を１５ｍＭ　トリスー酢酸、２５ｍＭコハク酸ナトリ
ウム及び２ｍＭ酢酸マグネシウムからなるｐＨ７．　４
の緩衝液（以下、緩衝液Ｂと称す）２００ｍｆｌに懸濁
し、５００ｍＱの三角フラスコ５本にそれぞれ４０ｍｌ
ずつ分注し、２８゜Ｃで５分間保温した。その三角フラ
スコ５本のそれぞれに４００μのエタノールに溶解した
４００題の基質２５−ヒドロキシビタミンＤ．を添加し
、２８℃で４５分間攪拌振とうした。各三角ブラスフの
反応液を集め、塩化メチレン４０Ｑｍｕで抽出し、塩化
メチレン層を４０゜Ｃ以下で減圧乾固後、直チに２−プ
ロバノール：ｎ−ヘキサン−３＝２２の混合溶媒２ｍｌ
ｌに溶解し、−２０゜Ｃで一夜放置した．これを遠心分
離し不溶性画分を除き、上清液を得た．この上清液を４
０℃以下で減圧下濃縮し、高速液体クロマトグラフィー
［ゾルバックスＳＩＬ，米国デュポン社製］に付した。

カラムサイズＨ４，６ＷＩＣＡＸ２５印，溶出溶媒：２
−プロパノール：ｎ−ヘキサンー３：２２， カラム温度；２５゜Ｃ，　溶出速度；１．５ｍｌｌ／分
，フォトダイオードアレイ検出器《ウォーターズＭ　９
９０　，日本ミリボア・リミテッド社製〉で測定。

溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間１４．５分付近のピークの画分を集めた．次に
これを４０゜Ｃ以下で減圧濃縮し、高速液体クロマトグ
ラフィー［ゾルバックスＯＤＳ，米国デュポン社製］に
付した。

カラムサイズ；４，５ｍｌｌφＸ２５ｃＩＴｌ，溶出溶
媒；水：メタノール−１：９． カラム温度；４０℃，溶出速度：１．Ｏ＋ｒＩｆＬ／分
，フオトダイ才一ドアレイ検出器（ウォーターズＭ　９
９０　，日本ミリボア・リミテッド社製）で測定． 溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間５．６分付近のピークの画分を集めた．これを
４０℃以下で、窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固する
ことにより、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ．を
２００題得た。これは市販の１α，２５−ジヒドロキシ
ビタミンＤ．（デュファ一社製，オランダ）の標品と液
体クロマトグラフィーの保持時間［ゾルバックスＳＩＬ
］、紫外線吸収スペクトラム、マススペクトル開裂パタ
ーンが完全に一致した。

最大紫外部吸収： λｍａｘｌｌｌＩ２６５ｎｆｆｌ（エタノール）Ｅ　Ｉ
−ＭＳ（ｍ／ｚ）： ４１６（Ｍ”）　，　３９８（Ｍ”−Ｈ！Ｏ）　，　３
８０（Ｍ”−２Ｈ！Ｏ）　．２８７　，　２６９　，　
２５１　，　１５２　，　１３４　，　１２９　，　１
１６　，　１１１　，また、１α，２５−ジヒドロキシ
ビタミンＤ．リセブターを用いた本調製標品のラジオリ
セブターアッセイ試験の結果は１α．２５−ジヒドロキ
シビタミンＤ．（デュファ一社製，オランダ）の標品の
それと一致したく試験例に示す》。

実施例４ 培地’Ａ５０ｔｄの入った５００ｍｌの三角フラスコ５
本それぞれにアミコラタ・サッルネアＡ−７９８３株を
１白金耳接種し、２８゜Ｃで７２時間攪拌振とう培養し
た．その三角フラスコ５本のそれぞれに４００μのエタ
ノールに溶解した４００尾の基質２５−ヒトロキシビタ
ミンＤ．を添加し、２８゜Ｃで４５分間攪拌振とうした
。各三角フラスコの反応液を集め、塩化メチレン４００
ｙｎＱで抽出し、塩化メチレン層を４０°Ｃ以下で減圧
乾固後、直ちに２−プロパノール：ｎーヘキサン＝３：
２２の混合溶媒２ｍＱに溶解し、−２０゜Ｃで一夜放置
した。これを遠心分離し不溶性画分を除き、上清液を得
た。この上清液を４０゜Ｃ以下で減圧下濃縮し、高速液
体クロマトグラフィ−［ゾ）Ｌ，　ハックスＳＩＮ，，
米国デュポン社製コに｛−ｔ　ｔ，た． カラムサイズ；４，６＋ｎｍφＸ２５ＣＩＴｌ，溶出溶
媒；２−プロバノール：ｎ−ヘキサンー３：２２， カラム温度；２５゜Ｃ，　溶出速度；１．５ｍＱ／分，
フ才トダイ才一ドアレイ検出器くウォーターズＭ　９９
０　，日本ミリボア・リミテッド社製）で測定。

溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間１４，５分付近のピークの両分を集めた。次に
これを４０℃以下で減圧濃縮し、高速液体クロマトグラ
フィ−［ゾルバックスＯＤＳ，米国デュポン社製コに付
した。

カラムサイズ；４．５ｍｎφＸ２５ＣＴＩ１，溶出溶媒
；水：メタノール−１：９， カラム温度；　４０’Ｃ　，　　溶出速度；１．ＯｍＱ
／分，フォトダイオードアレイ検出器（ウォーターズＭ
　９９０　．日本ミリポア・リミテッド社製）で測定。

溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間５．６分付近のピークの画分を集めた．これを
４０℃以下で、窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固する
ことにより、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ．を
＃尾得た。これは市販の４／５０ １α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ．（デュファー社
製，オランダ》の標品と液体クロマトグラフィーの保持
時間［ゾルバックスＳＩＬ］、紫外線吸収スペクトラム
、マススペクトル開裂ハターンが完全に一致した。

最大紫外部吸収： λｍＨｚ＝　２６５　ｎｍ（エタノール）Ｅ　Ｉ−ＭＳ
（ｍ／ｚ）： ４１６（Ｍ”）　，　３９８（Ｍ”−Ｈ！０）　，　３
８０（Ｍ”−２Ｈ！Ｏ）　．２８７　，　２６９　，　
２５１　，　１５２　，　１３４　，　１２９　，　１
１６　，　１１１　．実施例５ 培地Ａ　５０ｍｌｌの入った５００ｍｌｌの三角フラス
コ５本それぞれにアミフラタ・サッルネアＡ−７９８３
株を１白金耳接種し、２８゜Ｃで７２時間攪拌振とう培
養した．その三角フラスコ５本のそれぞれに４００−の
エタノールに溶解した５００Ｐ１ｇの基質１α−ヒドロ
キシビタミンＤ，を添加し、２８゜Ｃで６０分間攪拌振
とうした。各三角フラスコの反応液を集め、塩化メチレ
ン４００ｍｌｌで抽出し、塩化メチレン層を４０℃以下
で減圧乾固後、直ちに２−プロバノール：ｎ一ヘキサン
−３：２２の混合溶媒２ｍｌに溶解し、２０゜Ｃで一夜
放置した。これを遠心分離し不溶性画分を除き、上清液
を得た。この上清液を４０゜Ｃ以下で減圧下濃縮し、高
速液体クロマトグラフィ−［ゾルバックスＳＩＬ，米国
デュポン社製］に付した。

カラムサイズ：４．６ＴｆｎφＸ　２５ｃｍ　，溶ａｌ
［；　２−プロバノール：ｎ−ヘキサンー３：２２， カラム温度；２５゜Ｃ，　溶出速度．１．５ｒｄ／分，
フオトダイ才一ドアレイ検出器（ウォーターズＭ　９９
０　，日本ミリボア・リミテッド社製）で測定。

溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間１４．５分付近のピークの両分を集めた。次に
これを４０゜Ｃ以下で減圧濃縮し、高速液体クロマトグ
ラフィ−［ゾルバックスＯＤＳ，米国デュポン社製コに
付した。

カラムサイズ；４．６ＩＩｆＩｌφＸ２５ＣＴＩ１，溶
出溶媒：水：メタノール＝１：９， カラム温度；４０゜Ｃ，　溶出速度；１．ＯｍＱ／分，
フォトダイ才一ドアレイ検出器（ウォーターズＭ　９９
０　．日本ミリボア・リミテッド社製）で測定。

溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間５．６分付近のピークの画分を集めた。これを
４０゜Ｃ以下で、窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固す
ることにより、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ，
を５００属得た。これは市販の１α，２５−ジヒドロキ
シビタミンＤＳ（デュファ一社製，オランダ》の標品と
液体クロマトグラフィーの保持時間［ゾルバックスＳＩ
Ｌ］、紫外線吸収スペクトラム、マススペクトル開裂パ
ターンが完全に一致した。

最大紫外部吸収： λｙ１（１ｘ”　２６５　ｎｆｆｌ（エタノーノレ）Ｅ
　Ｉ−ＭＳ（ｍ／ｚ）： ４１６（Ｍ＋）．　３９８（Ｍ”−１４！０）　．　３
８０（Ｍ”−２Ｈ！Ｏ）　，２８７　，　２６９　，　
２５１　，　１５２　，　１３４　，　１２９　，　１
１６　，　１１１　．実施例６ 実施例３と同様にして、２４．２５−ジヒドロキシビタ
ミンＤ．から１α．２４．２５−トリヒドロキシビタミ
ンＤ．を得た。

（１）ソルバックスＳＩＬ液体クロマトグラフィー力ラ
ムサイズＨ４．６１ｆｌｎφＸ２５ｃｍ，１Ｈ溶Ｗ；２
−プロパノール：ｎ−ヘキサン−１：９， カラム温度；２５゜Ｃ，　溶出速度；１．５ｍｌｉ／分
，フ才トダイ才一ドアレイ検出器（ウォーターズＭ９９
０，日本ミリポア・リミテッド社製》で測定， 生成標品の保持時間；２９．４分 （ク最大紫外部吸収： 入，，，６ｚ＝　２６５　ｎｍ（エタノーノレ》（３）
Ｅ　Ｉ−ＭＳ（ｍ／ｚ）： ４３２（Ｍ”）　，　４１４（Ｍ”−Ｈよ０）　，　３
９６（Ｍ”−２Ｈ．０）　．２８７　，　２６９　，　
２５１　，　１５２　，　１３４　，　１１６　．　５
９実施例７ 実施例３と同様にして、２５−ヒドロキシビタミンＤ，
から１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ，を得た． （１）ゾルバックスＳＩＬ液体クロマトグラフィー力ラ
ムサイズＨ４．５＋１ｕφＸ２５ｃｍ，ｓ出ｕ媒：ｚ−
ｔ口バノール二〇−ヘキサン”１：９＋ カラム温度；２５℃，　溶出速度；１．５ｍＱ！／分，
フォトダイオードアレイ検出器（ウォーターズＭ９９０
，日本ミリボア・リミテッド社製）で測定， 生成標品の保持時間．１４．４分 （２）最大紫外部吸収： 入ｍａｘ＝　２６５　ｎｍ（エタノーノレ》（３）Ｅ　
Ｉ−ＭＳ（ｍ／ｚ）： ４２ｇ（Ｍ”）　．　４１０（Ｍ”−Ｈ！Ｏ）　，　３
９２（Ｍ”−２Ｈ．Ｏ）　，２８７　，　２６９　，　
２５１　，　１５２　，　１３４　，　１１６　．　５
９実施例８ 実施例３と同様にして、２４．２４−ジフル才ロー２５
−ヒドロキシ−２６．２７−ジメチルビタミンＤ．から
１α．２５−ジヒドロキシ−２４．２４−ジフル才ロー
２６．２７−ジメチルビタミンＤ．を得た。

（１）最大紫外部吸収： λＩｎ８ｘＭａ２６５ｎｍ（エタノール）（クＥ　Ｉ−
ＭＳ（ｍ／ｚ）： ４８０（Ｍ”）　．　２８７　，　２６９　，　２５１
　，　１５２　，　１３４　，実施例９ 実施例３と同様にして、２５−ヒドロキシ−２６．２６
，　２６．　２７．　２７．　２７−へキサフルオ口ビ
タミンＤ．から１α．２５−ジヒドロキシ−２６．　２
６．　２６．　２７．　２７．　２７　−ヘキサフル才
口ビタミンＤ．を得た。

（１）最大紫外部吸収： λ晶Ｘｘ　２６５　ｎｍ（エタノール）（Ｚ）　Ｅ　Ｉ
　−　Ｍ　Ｓ（ｍ／ｚ）　：５２４（Ｍ”）　．　２８
７　，　２６９　，　２５１　，　１５２　，　１３４
　，実施例１０ 実施例１と同様にして、ビタミンＤ，から２５−ヒドロ
キシビタミンＤ，を得た。

（υ最大紫外部吸収： λｆＩｌｇｘ−　２６５　ｎｍ（　エタノール》■Ｅ　
Ｉ−ＭＳ（ｍ／ｚ）： ４１２（Ｍ”）　，　３９４　，　２７１　，　２５３
　，　１３６　，　１１８　．　５９試験例 １α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ．リセブターを用
いた標品ラジ才リセブターアッセイ試験ニワトリの胎児
の腸管より調製された１α，２５一ジヒドロキシビタミ
ンＤ，リセブター［ヤマサ醤油（株）］を１０ｍＭトリ
スー塩酸、０．　５ｍＭ　ＥＤＩＡ，１ｍＭジチ才スレ
イトール、１０ｍＭモリブデン酸ナトリウム、ｐＨ７．
４の緩衝液に懸濁させ、これをリセブター溶液（プロテ
イン約０．　５ｍｇ／　ｍＱ）として使用した。

このリセブター溶液に、５０％エタノールに溶解した被
検薬［１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ，の標品（
デュファ一社製，オランダ〉］及び実施例３で得られた
１α，２５−ジヒドロキジビタミンＤ．を３又は１０μ
、１０−’〜１０−’Ｍになるように添加した．次いで
１Ｈ−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤＡ（約０．
４μＭ）を添加し、０゜Ｃで３時間インキユベーション
して反応を行った。リセブター結合物と非結合物の分離
はチャフール法を用いた。特異的結合量は、上記反応よ
り得られる総結合量から１０μＭの１α，２５−ジヒド
ロキシビタミンＤ，存在下に得られる非特異的結合量を
差し引いて求めた。被検薬の結合能は、リセプターへの
ｓＨ−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ．の結合を
５０％阻害する濃度ＮＣｓ。》で示した。

結果を下記第２表に示した。

第２表 く結果〉 以上、実施例３で得られた１α，２５−ジヒドロキシビ
タミンＤ．は、ラジオリセブターアッセイ試験において
、市販の標品と同一の活性を示した。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ビタミンＤ類を水酸化するアミコラタ（￥Ａｍｙ
   ｃｏｌａｔａ￥）属に属する放線菌菌体又はその産生す
   る酵素を含有する溶液中に１α又は２５位に水素原子を
   有するビタミンＤ類を加えて、それぞれその水素原子を
   水酸基に変換することを特徴とする１α−ヒドロキシビ
   タミンＤ類又は２５−ヒドロキシビタミンＤ類の製造方
   法
2. （２）ビタミンＤ類を水酸化するアミコラタ（￥Ａｍｙ
   ｃｏｌａｔａ￥）属に属する放線菌菌体又はその産生す
   る酵素を含有する溶液中に１α及び２５位に水素原子を
   有するビタミンＤ類を加えて、その水素原子を水酸基に
   変換することを特徴とする１α−ヒドロキシビタミンＤ
   類又は２５−ジヒドロキシビタミンＤ類の製造方法