CN114762700B - 一种狐粪青霉培养物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种狐粪青霉培养物在制备促进皮肤愈合的药物中的应用，所述狐粪青霉为保藏号为CGMCC NO.17187的狐粪青霉菌株。本发明研究表明，狐粪青霉培养物具有促进成纤维细胞的增殖和促进皮肤愈合的作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种狐粪青霉培养物在促进皮肤愈合方面的应用，属于微生物 领域。
背景技术
人体的皮肤组织在受到外界的各种创伤之后容易形成疤痕，疤痕的存在影 响了美观，因此产生了很多去疤痕的药物。疤痕在愈合的过程中需要皮肤纤 维组织的生长，从而连接和保护周围正常的健康组织。自然界中某些微生物 的代谢物可以加快皮肤纤维细胞的增长，促进伤口的愈合。在安全性评价的 基础上，此类发酵产物提取物是安全无毒的，因此开发此类天然产物是一种 相对安全、绿色、无副作用的药物。
发明内容
为解决现有技术存在的问题，本发明提供一种狐粪青霉培养物在促进皮 肤愈合方面的应用。
本发明提供一种狐粪青霉培养物在制备促进皮肤愈合的药物中的应用， 所述狐粪青霉为保藏号为CGMCC NO.17187的狐粪青霉菌株。
进一步，本发明提供所述狐粪青霉培养物在制备促进成纤维细胞增殖的 药物中的应用。
在具体的实施方式中，所述狐粪青霉培养物为狐粪青霉液体培养物、固 体培养物、狐粪青霉固体培养残基或狐粪青霉提取物。
其中，所述狐粪青霉液体培养物为狐粪青霉菌CGMCC NO.17187经液体 培养获得的培养物。其中，所述液体培养包括摇瓶培养、种子罐培养、发酵 罐培养中的任意一种或几种方法的组合；所述液体培养时间为9-12天。所述 液体培养应用的培养基为本领域常规的液体培养基，如PSA培养基、PDA培 养基、PDY培养基、PSB培养基、酵母浸出粉-复合氨基酸-蔗糖培养基，酵 母浸出粉-白砂糖-大豆水解蛋白培养基，麸皮煮汁-白砂糖培养基等；优选为PDA培养基。
其中，所述狐粪青霉固体培养物为狐粪青霉菌CGMCC NO.17187经固体 培养获得的菌丝体、孢子粉或子实体。
其中，所述狐粪青霉固体培养残基为狐粪青霉经过固体培养、采收子实 体后剩余的固体培养残基，所述固体培养阶段所用的固体培养基为以小麦、 玉米、大米、小米、荞麦、大麦、燕麦、糙米、粳米中的任意一种或几种谷 物或麸皮、大豆皮、棉籽壳中的任意一种或几种农作物皮壳为主要原料的培 养基。优选小麦培养基。
其中，所述狐粪青霉提取物为狐粪青霉液体/固体培养物经有机溶剂提取 获得的提取物。所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿、乙醚、石 油醚、丙酮中的任意一种。
优选的，所述有机溶剂为甲醇或乙酸乙酯。
优选的，所述有机溶剂提取的提取方法为静置提取或水浴提取；提取时 间为1h～2h。
优选的，所述提取次数为1～2次。
本发明所提及的狐粪青霉菌株CGMCC NO.17187，其分类命名为 Penicilliumvulpinum，该菌株已作为专利菌种保藏于位于我国北京的中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC NO：17187，保 藏日期：2019年2月28日。该菌株主要形态特征为：在马铃薯葡萄糖培养基 及麦芽汁培养基上菌落直径为20-23mm，菌落边缘呈现白色，中部呈现灰绿 色，平铺，气生菌丝稀少；质地颗粒状，孢梗束大量产生，长约2-5mm，菌丝体红褐色，背面浅黄褐色，色素不溶于培养基中。分生孢子结构大量产生 于孢梗束顶端，帚状枝多见三轮生，叉开。分生孢子梗短，波浪状弯曲，壁 光滑，无色，在孢梗束上排列紧密；瓶梗柱状，颈部短，5.0-9.3×2.0-3.0μm； 分生孢子椭球形或近球形，光滑，串生，2.5-4.0μm。
生物材料保藏信息
本发明狐粪青霉(Penicillium vulpinum)新菌株，已作为专利菌种保藏于 位于我国北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保 藏编号：CGMCC NO：17187，保藏日期：2019年2月28日。
具体实施方式
实施例1狐粪青霉菌CGMCC No.17187的主要形态特征
将狐粪青霉CGMCC No.17187菌株接于马铃薯葡萄糖培养基上，24℃培 养十天，菌落直径为20-23mm，菌落边缘呈现白色，中部呈现灰绿色，平铺， 气生菌丝稀少；质地颗粒状，孢梗束大量产生，长约2-5mm，菌丝体红褐色， 背面浅黄褐色，色素不溶于培养基中。分生孢子结构大量产生于孢梗束顶端， 帚状枝多见三轮生，叉开。分生孢子梗短，波浪状弯曲，壁光滑，无色，在 孢梗束上排列紧密；瓶梗柱状，颈部短，5.0-9.3×2.0-3.0μm；分生孢子椭球 形或近球形，光滑，串生，2.5-4.0μm。
实施例2狐粪青霉菌液体培养物的制备
菌株的活化：将保藏的狐粪青霉划线接种于PDA斜面培养基上，置于 26±2℃培养箱中培养3-5天；
种子液配制：配制200ml/瓶的PDA液体培养基，将生长好的斜面直接接 入液体摇瓶，置于26±2℃，180rpm摇床中培养两天，制备种子液；
液体扩大培养：将制备好的种子液分别取40ml加入到新的200ml PDA培 养基中，置于26±2℃，180rpm摇床中继续培养，扩大培养7-10天，取出， 即得液体培养物。
所述PDA培养基配方：200g土豆煮汁，加入20g葡萄糖，定容至1L， 再加入20g琼脂粉。
实施例3狐粪青霉发酵液甲醇提取物的制备
取实施例2制备的发酵液，水浴加热至体积达到原来的1/5，加入等体积 的甲醇，常温静置提取2h，或者60℃温浴提取1h。取上清液进行蒸发，产 物加入原液3％量的甲醇溶解(100ml发酵液加入3ml甲醇)，得甲醇提取物。
实施例4狐粪青霉发酵液乙酸乙酯提取物的制备
取实施例2制备的发酵液，水浴加热至体积达到原来的1/5，分别加入等 体积的乙酸乙酯，常温静置提取2h，或者60℃温浴提取1h。取上清液进行 蒸发，产物加入原液3％量的甲醇溶解(100ml发酵液加入3ml甲醇)，得乙 酸乙酯提取物。
实施例5狐粪青霉菌固体培养物的制备
固体培养基的制备，40g小麦+50ml的水进行121℃，30min的灭菌处理， 加入制备的种子液6ml，进行避光培养3天，然后光照培养20天左右，温度 控制在21±2℃，湿度控制：60％-95％，采收子实体，并保留固体培养残基。
实施例6狐粪青霉菌子实体甲醇提取物的制备
准确称取1g实施例5制备的狐粪青霉的子实体，加入40ml的甲醇溶液， 超声提取1h，置于4℃过夜，离心25min取上清，蒸发浓缩后用5ml甲醇进 行溶解，备用。
实施例7狐粪青霉菌子实体乙酸乙酯提取物的制备
准确称取1g实施例5制备的狐粪青霉的子实体，加入40ml的乙酸乙酯 溶液，超声提取1h，置于4℃过夜，离心25min取上清，蒸发浓缩后用5ml甲 醇进行溶解，备用。
实施例8狐粪青霉菌固体培养残基提取物的制备
准确称取10g实施例5采收子实体后的固体培养残基，加入40ml的甲醇 溶液，超声提取1h，置于4℃过夜，离心25min取上清，蒸发浓缩后用5ml甲 醇进行溶解，备用。
实施例9蝉花虫草发酵液乙酸乙酯提取物的制备
取蝉花虫草发酵液，水浴加热至体积达到原来的1/5，分别加入等体积的 乙酸乙酯，常温静置提取2h，或者60℃温浴提取1h。取上清液进行蒸发， 产物加入原液3％量的甲醇溶解(100ml发酵液加入3ml甲醇)，得乙酸乙酯 提取物。
实施例10蝉花虫草子实体乙酸乙酯提取物的制备
准确称取1g蝉花虫草的子实体，加入40ml的乙酸乙酯溶液，超声提取 1h，置于4℃过夜，离心25min取上清，蒸发浓缩后用5ml甲醇进行溶解， 备用。
实施例11狐粪青霉提取物促进成纤维细胞L929细胞增殖的效果实验
1.实验方法
采用0.25％的胰蛋白酶消化对数期细胞，终止后离心收集细胞，制成细胞 悬液，细胞计数调整其浓度至5-10×104/ml。
将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入100ul，这样待测细胞密度为 5000-10000/孔(边缘孔用无菌PBS填充)。
将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底(96孔 平底板)，加入狐粪青霉发酵液乙酸乙酯提取物(按实施例4制备)、狐粪 青霉子实体乙酸乙酯提取物(按实施例7制备)、蝉花虫草子实体乙酸乙酯 提取物(按实施例10制备)、蝉花虫草发酵液乙酸乙酯提取物(按实施例9 制备)各100ul，提取液浓度为100％，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两 小时，或半天时间。
5％的CO2，37℃孵育16-48h，倒置显微镜下观察药物的作用效果。
每孔加入10ul cck-8溶液，继续培养4h。
在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
2.实验结果
结果见表1。
表1不同培养物促进成纤维细胞L929细胞增殖
从以上结果可以看出，在加入一定量的甲醇以后吸光值略有下降，但与 对照相比无显著性差异。而在加入狐粪青霉提取物的情况下，细胞的吸光值 增加，与对照组吸光值相比呈现极显著的差异，说明药物对细胞的生长有促 进作用。而狐粪青霉子实体的提取物和蝉花虫草子实体以及发酵液的提取物 的OD值与对照相比并未显现出明显的增加，对细胞的增长没有影响。
对豚鼠进行剃毛，采用砂纸打磨豚鼠背部的皮肤直至表皮破损出血，对 照组涂抹生理盐水，实验组涂抹狐粪青霉提取液，观察发现涂抹狐粪青霉提 取液的实验组豚鼠皮肤恢复速率大于对照组。
Claims (7)
1.一种狐粪青霉培养物在制备促进皮肤愈合的药物中的应用，所述狐粪青霉为保藏号为CGMCC NO.17187的狐粪青霉菌株。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述狐粪青霉培养物在制备促进成纤维细胞增殖的药物中的应用。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述狐粪青霉培养物为狐粪青霉液体培养物、狐粪青霉固体培养物或狐粪青霉固体培养残基。
4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述狐粪青霉培养物为狐粪青霉提取物，所述狐粪青霉提取物为狐粪青霉液体或固体培养物经有机溶剂提取获得的提取物。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述有机溶剂为乙酸乙酯。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述有机溶剂提取的提取方法为静置提取或水浴提取；提取时间为1h～2h；所述提取次数为1～2次。
7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述狐粪青霉液体培养物为狐粪青霉菌CGMCC NO.17187经液体培养获得的培养物，所述液体培养包括摇瓶培养、种子罐培养、发酵罐培养中的任意一种或几种方法的组合；所述液体培养时间为9-12天。
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| 狐粪青霉挥发性物质的抑菌活性及成分分析;陈利军等;《菌物研究》;第8卷(第04期);231-233,244 * |
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