CN101407775A - 一种制备阿维菌素的方法及其专用菌株 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备阿维菌素的方法及其专用菌株。本发明菌株为阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)ZLX6001，保藏编号为CGMCC No.2712。本发明的制备阿维菌素的方法，是发酵阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)ZLX6001，得到阿维菌素。实验证明，本发明的菌株生产阿维菌素有效组分B1a的能力强，可达6000μg/ml发酵液，而且本发明菌株连续传5代后其生产阿维菌素有效组分B1a的能力还保持原来水平，表明其遗传稳定性好。用本发明菌株来制备阿维菌素的方法，能够提高生产阿维菌素的效率，而且方法简单、成本低廉。因此，本发明菌株及制备阿维菌素的方法适合于在阿维菌素的生产中推广应用。

Description

一种制备阿维菌素的方法及其专用菌株

技术领域

本发明涉及一种制备阿维菌素的方法及其专用菌株。

背景技术

阿维菌素是一种大环内酯类抗生素，具有广谱的抗线虫和肠道寄生虫的性质，是目前世界上最有前景的生物杀虫杀螨剂。阿维菌素的杀虫作用是通过释放神经传导抑制剂、使害虫缓慢麻痹致死来实现的，对宿主的副作用较低，在环境中无累积，对人、畜均具有安全性，所以阿维菌素在动物保健和农业生产方面有广泛的应用，具有广阔的市场发展前景。阿维菌素是由除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)生产的一组由十六元大环内酯与一个二糖(齐墩果糖)所构成的一类杀虫抗生素，共有4对8个同系物，即阿维菌素A1a/A1b、B1a/B1b、A2a/A2b、B2a/B2b。在这8个化合物中，以阿维菌素B1a活性最高。1999年，阿维菌素成为世界第21大畅销农药，第4大畅销杀虫剂，销售额高达1.6亿美元。以阿维菌素为母体，还可以开发出一系列活性更高、选择性更强、使用更加安全的衍生新品种，已商品化的品种包括伊维菌素、埃玛菌素、道拉菌素、埃珀利诺菌素和色拉菌素等。其中的伊维菌素是目前世界上销售量最大的兽药，1981年的年销售额就达到了10亿美元，创单项兽药销售收入最高；埃珀利诺菌素则被美国FDA认定为全程安全畜用驱虫剂。此外，近年来又有研究发现阿维菌素有抗肿瘤的功效，并且对肿瘤细胞的抗药性也有一定的抑制作用。阿维菌素具有不易产生抗药性、易降解和无残留的特点，使其成为高毒农药的最佳替代品。基于以上优点，阿维菌素在各个国家的需求不断上升。因此，需要提高阿维菌素的生产效率，以供应日益增长的需求。

发明内容

本发明的一个目的是提供一株阿维链霉菌，该菌株能高产阿维菌素。

本发明所提供的阿维链霉菌菌株为阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)ZLX6001，保藏编号为CGMCC No.2712。

阿维链霉菌菌株ZLX6001是好氧的革兰氏阳性嗜温放线菌，形成分枝状基生菌丝和长的紧密螺旋的气生菌丝。孢子链由15个或以上的表面光滑的圆形或卵形孢子构成。在燕麦培养基上形成灰色的气生孢子团，菌落背面黑褐色。在蛋白胨酵母提取物和铁培养基上产生黑色素。

该菌株已于2008年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.2712。

本发明的另一个目的是提供一种制备阿维菌素的方法。

本发明所提供的制备阿维菌素的方法，是发酵阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)ZLX6001，得到阿维菌素。

所述发酵的方法是将所述菌株接种于发酵培养基中，在温度为25-30℃的条件下培养。

其中，所述发酵培养基由终浓度为105-195g/L的玉米淀粉、终浓度为20-36g/L的豆粕粉、终浓度为6-12g/L的酵母粉、终浓度为0.175-0.325g/L的(NH₄)₂SO₄、终浓度为0.014-0.026g/L的CoCl₂、终浓度为0.015-0.028g/L的Na₂MoO₄、终浓度为0.0016-0.003g/L的MnSO₄、终浓度为2800-5200U/L的淀粉酶和终浓度为0.6-1.0g/L的CaCO₃组成，余量为水；所述终浓度均为在所述发酵培养基中的浓度。

所述发酵培养基优选为如下培养基：由终浓度为150g/L的玉米淀粉、终浓度为28g/L的豆粕粉、终浓度为9g/L的酵母粉、终浓度为0.25g/L的(NH₄)₂SO₄、终浓度为0.02g/L的CoCl₂、终浓度为0.022g/L的Na₂MoO₄、终浓度为0.0023g/L的MnSO₄终浓度为4000U/L的淀粉酶和终浓度为0.8g/L的CaCO₃组成。

所述发酵可以在振荡的条件下进行，所述振荡的转速可以为200-250rpm，旋转半径为50mm。所述振荡的转速优选为220rpm。

为了防止发酵液因过多蒸发而浓缩，造成虚假的发酵单位，保持发酵过程中环境相对湿度为50-60％。

所述发酵的温度优选为28℃。

所述发酵的时间可为192-240小时，优选为240小时。

实验证明，本发明的菌株生产阿维菌素有效组分B1a的能力强，可达6000μg/ml发酵液，而且本发明菌株连续传5代后其生产阿维菌素有效组分B1a的能力还保持原来水平，表明其遗传稳定性好。用本发明菌株来制备阿维菌素的方法，能够提高生产阿维菌素的效率，而且方法简单、成本低廉。因此，本发明菌株及制备阿维菌素的方法适合于在阿维菌素的生产中推广应用。

附图说明

图1为阿维菌素有效组分B1a标准品色谱图。

图2为发酵滤液中阿维菌素有效组分B1a色谱图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、菌株的制备

一、菌株的制备

本实验中用到的高通量初筛方法如下：

发酵阶段：采用96孔深孔板，每孔中装培养基0.3ml。每孔接入菌种，28℃静置培养10天。所用培养基由终浓度为150g/L的玉米淀粉、终浓度为28g/L的豆粕粉、终浓度为9g/L的酵母粉、终浓度为0.25g/L的(NH₄)₂SO₄、终浓度为2g/L的CoCl₂、终浓度为0.022g/L的Na₂MoO₄、终浓度为0.0023g/L的MnSO₄、终浓度为4000U/L的淀粉酶、终浓度为0.8g/L的CaCO₃、和终浓度为20g/L的琼脂组成。

提取阶段：将每孔用1ml甲醇浸泡，捣碎，取上清。

测定阶段：用酶标仪测定上清在245nm下的UV吸收值。

菌株的制备过程如下：

1、从土壤中分离菌株

取河北省的土壤，将土壤制成悬浮液，将土壤悬浮液接种于分离培养基中进行培养，挑取单菌落进行稀释划线分离纯化，获得纯培养菌株；分离培养基由终浓度为20g/L的葡萄糖(单独灭菌后加入)，终浓度为20g/L的琼脂，终浓度为2g/L的酵母膏，终浓度为0.5g/L的天门冬素及终浓度为0.5g/L的K₂HPO₄组成，余量为水；pH7.2-7.4；115度，灭菌20分钟；

初筛：获得的纯培养菌株进行摇瓶发酵培养，发酵液经8000rpm离心5分钟，上清液经0.45μm的微孔滤膜过滤获得发酵滤液；HPLC分析法检测发酵液中是否含有阿维菌素；将能产生阿维菌素有效组分B1a的菌株分别进行如下系列菌种改造。

2、菌种改造

(1)紫外线复合链霉素诱变

取菌悬液7ml，加入无菌培养皿中，以30W的紫外照射仪于30cm处照射。设定照射时间分别为60s、90s。分离培养基灭菌后，加入终浓度0.1μg/ml、0.2μg/ml经过滤除菌的链霉素，铺制平皿，经紫外线处理后的菌悬液稀释涂布于平皿中，28℃培养10d。挑取单菌落按照上述方法进行高通量筛选、摇瓶复试。获得的高产菌株进行下一步诱变。

(2)紫外线复合链霉素诱变(第2轮)

对第一轮紫外线复合链霉素诱变获得的高产菌株用同样的方法再次进行紫外线复合链霉素诱变。28℃培养10d。挑取单菌落进行高通量初筛、摇瓶复试。获得的高产菌株进行下一步诱变。

(3)5-氟尿嘧啶诱变

将菌株斜面接种于无有机氮源的饥饿培养基中，培养过夜，经稀释后涂布于含有不同浓度的5-氟尿嘧啶平皿中，5-氟尿嘧啶的终浓度分别为50μg/ml、100μg/ml。28℃培养10d。挑取单菌落进行高通量初筛、摇瓶复试。获得的高产菌株进行下一步诱变。

(4)微波复合链霉素诱变

以脉冲频率为2450MHz的650W家用微波炉，分别对平皿中菌悬液进行辐射处理。每次照射5s后使平皿冷却，再进行照射，并将照射时间累计，累计照射时间分别为60s、90s。分离培养基灭菌后，加入终浓度0.1μg/ml、0.2μg/ml经过滤除菌的链霉素，铺制平皿。经微波处理后的菌悬液稀释涂布于平皿中，28℃培养10d。挑取单菌落进行高通量初筛、摇瓶复试。获得的高产菌株进行下一步诱变。

(5)NTG(亚硝基胍)复合链霉素诱变

亚硝基胍(NTG)诱变用0.1mol/L，pH6.0的磷酸盐缓冲液制备孢子悬液，分别用终浓度为1mg/ml、2mg/ml和4mg/ml的NTG处理单孢子悬液，于28℃震荡30min，用生理盐水离心洗涤孢子3次，经稀释后涂布于含终浓度0.1μg/ml、0.2μg/ml经过滤除菌的链霉素的平皿。28℃培养10d。挑取单菌落进行高通量初筛、摇瓶复试。获得的高产菌株进行基因工程育种。

(6)aveC/aveR基因定向进化

阿维菌素的天然发酵产物共有8个组分：A1a，A1b，A2a，A2b，B1a，B1b，B2a和B2b，其中“A”组分和“B”组分的区别在于C-5位不同，“B”组分在C5-O-甲基转移酶(AveD)的催化下在C-5位的羟基上连一个甲基即转化为组分“A”(Ikeda etal.，1998)；“a”组分和“b”组分的区别在于对支链脂肪酸的利用上，“a”组分在C-25位是仲丁基，其支链脂肪酸来源于L-异亮氨酸，而“b”组分在C-25位是异丙基，来源于L-缬氨酸；阿维菌素“1”组分和“2”组分的区别在于C-22，23位不同，“1”组分在C-22，23位为CH＝CH，“2”组分为CH2-CHOH.“1”组分的合成与AveC有关。我们通过对aveR和aveC基因进行定向进化改造，获得有益突变，转化阿维链霉菌，筛选获得阿维菌素产量和有效组分提高的工程菌。

实验流程：

aveC/aveR的易错PCR随机突变和突变文库的建立：

易错PCR扩增：通过改变PCR的条件，降低一种dNTP的量(降至5％-10％)使PCR易于出错，达到随机突变的目的；加入dITP来代替被减少的dNTP，使下一轮循环中出现更多的错误；在PCR缓冲液中另加入Mn2+，有利于提高突变率。

50μl反应体系包含25ng DNA，30pmoles PCR引物(aveR基因：正向引物

5’GTT/CTAGACGGTATTCCATTCGGTGTTGC3’和反向引物

5’GTGA/ATTCGTGAGGCGGAAGACGAG3’；aveC基因：正向引物

5’GTT/CTAGACTGCTCACGCTCGCGGAC 3’和反向引物

5’GTGA/ATTCACCTGCCCTGAACTCAGTAAG3’)，50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH8.3)，和0.01％gelatin。除了上述成分，标准反应混合液包含1.5mM MgCl₂，2.5单位LA Taq polymerase，和0.2mM dNTPs；突变反应混合液包含3mM或6mM MgCl₂，0.5mM或0.8mM MnCl₂，5单位LA Taq polymerase，0.2mM dATP和1mMdGTP/dACP/dTTP。反应条件为94℃1min，60℃1min，72℃3min，5个循环；94℃1min，60℃1min(+0.5℃/循环)，72℃3min，30个循环；94℃1min，75℃1min，72℃3min，5个循环。PCR反应产物DpnI酶消化去除模板DNA，酚/氯仿/异戊醇纯化，乙醇沉淀，然后溶于20μl 10mM Tris-HCl(pH8.5)。所有EP-PCR产物酶切；50μl酶切产物胶回收，30μl洗脱；30μl产物与pSET152连接并转化ET12567；

易错突变库的建立：易错PCR产物乙醇沉淀，溶于20μl 10mM Tris-HCl(PH8.5)；所有EP-PCR产物酶切，酶切产物胶回收，与pEasy T1载体连接，转化E.coli DH5α，涂于LB+Amp平板上培养；刮下所有生长的转化菌落，置于LB+Amp液体培养基培养；提取质粒，建立易错片断突变库。易错突变库质粒EcoRI/XbaI酶切与EcoRI/XbaI酶切的载体pSET152连接，转化E.coli ET12567/(pUZ8002)。通过接合转移把易错基因转化进入阿维链霉菌。

aveC基因的定点突变：设计突变位点为AveC蛋白序列92位D突变为E，133位A突变为T。为了便于筛选突变体，在引入相应的突变时引入aveC基因序列中没有的酶切位点，这样只有突变体有相应的酶切位点，可以从非突变体中筛选出突变基因。以质粒pBJC为模板，定点突变引物PCR扩增aveC基因，Dpn I酶切消化扩增产物，转化pEasy T1，挑克隆，Dde I/Pvu II酶切鉴定，测序验证突变基因。EcoRI/XbaI酶切回收突变片断，EcoRI/XbaI酶切的载体pSet152连接，转化阿维链霉菌和产生菌。

结果：aveR和aveC基因通过易错PCR引入突变。通过pBJC-T3测序后DNA序列和蛋白质氨基酸序列的比对，AveC蛋白序列92位D突变为E，133位A突变为T。将经过定向进化的基因转化进入阿维链霉菌产生菌。挑取阳性克隆进行高通量初筛、摇瓶复试，从中筛选得到阿维菌素有效组分B1a产量提高的菌株。

(7)阿维链霉菌寡核苷酸表达谱芯片实验

从转录水平分析高产和低产菌株在转录表达水平上的差异，通过RT-PCR的方法验证芯片杂交结果中的差异表达基因sigA与阿维菌素生物合成基因的关系，找到与产量密切相关的关键基因点。针对该基因构建了易错PCR片段的质粒库，并将其转入阿维菌素高产菌株中。挑取阳性克隆进行高通量初筛、摇瓶复试，从中筛选得到阿维菌素有效组分B1a产量提高的菌株。

经过上述系列方法，最终获得了阿维菌素高产菌株ZLX6001。

二、菌株的鉴定

本发明菌株ZLX6001是好氧的革兰氏阳性嗜温放线菌，形成分枝状基生菌丝和长的紧密螺旋的气生菌丝。孢子链由15个或以上的表面光滑的圆形或卵形孢子构成。在燕麦培养基上形成灰色的气生孢子团，菌落背面黑褐色。在蛋白胨酵母提取物和铁培养基上产生黑色素。具体见表1。

表1、本发明菌株ZLX6001生理生化特征

对该菌株ZLX6001进行16S rDNA序列测定，序列如序列表中序列1所示。生理生化特征与序列特征表明，本发明菌株ZLX6001属于阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)，将其命名为ZLX6001，该菌株已于2008年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.2712。

实施例2、发酵阿维链霉菌ZLX6001生产阿维菌素

应用响应曲面法优化高产菌株ZLX6001发酵培养条件。

牛肉浸提物购自北京双旋微生物培养基有限公司；玉米淀粉购自黑龙江龙凤玉米开发有限公司，豆粕粉购自秦皇岛市汇禾源实业有限公司，花生饼粉购自北京康明威培养基技术有限公司，酵母粉购自OXOID，淀粉酶购自北京奥博星生物技术有限公司。

斜面培养基组成：由终浓度为15g/L的葡萄糖、终浓度为3g/L的牛肉浸提物、终浓度为0.5g/L的天门冬酰胺、终浓度为0.5g/L的KH₂PO₄和终浓度为18g/L的琼脂组成，余量为水，所述终浓度均为各物质在斜面培养基中的浓度；斜面培养基的pH值为7.2-7.5。

种子培养基组成：由终浓度为30g/L的玉米淀粉、终浓度为8g/L的豆粕粉、终浓度为10g/L的花生饼粉、终浓度为4g/L的酵母粉和终浓度为3g/L的CoCl₂组成，余量为水，所述终浓度均为在种子培养基中的浓度；种子培养基的pH值为6.8-6.9。121℃，灭菌25min。

发酵培养基I组成：由终浓度为150g/L的玉米淀粉、终浓度为28g/L的豆粕粉、终浓度为9g/L的酵母粉、终浓度为0.25g/L的(NH₄)₂SO₄、终浓度为0.02g/L的CoCl₂、终浓度为0.022g/L的Na₂MoO₄、终浓度为0.0023g/L的MnSO₄、终浓度为4000U/L的淀粉酶、终浓度为0.8g/L的CaCO₃组成，余量为水，所述终浓度均为在发酵培养基I中的浓度；发酵培养基I的pH值为7.4。121℃，灭菌25min。

发酵培养基II组成：由终浓度为105g/L的玉米淀粉、终浓度为20g/L的豆粕粉、终浓度为6g/L的酵母粉、终浓度为0.175g/L的(NH₄)₂SO₄、终浓度为0.014g/L的CoCl₂、终浓度为0.015g/L的Na₂MoO₄、终浓度为0.0016g/L的MnSO₄、终浓度为2800U/L的淀粉酶、终浓度为0.6g/L的CaCO₃组成，余量为水，所述终浓度均为在发酵培养基II中的浓度；发酵培养基II的pH值为7.3。121℃，灭菌25min。

发酵培养基III组成：由终浓度为195g/L的玉米淀粉、终浓度为36g/L的豆粕粉、终浓度为12g/L的酵母粉、终浓度为0.325g/L的(NH₄)₂SO₄、终浓度为0.026g/L的CoCl₂、终浓度为0.028g/L的Na₂MoO₄、终浓度为0.003g/L的MnSO₄、终浓度为5200U/L的淀粉酶、终浓度为1.0g/L的CaCO₃组成，余量为水，所述终浓度均为在发酵培养基III中的浓度；发酵培养基III的pH值为7.5。121℃，灭菌25min。

一、利用发酵培养基I发酵阿维链霉菌ZLX6001制备阿维菌素

(一)发酵阿维链霉菌ZLX6001

1、斜面培养：

将阿维链霉菌ZLX6001接种到斜面培养基上，在28℃、环境相对湿度为50-60％条件下培养10-12天。

2、种子培养

挖取步骤1中得到的斜面菌苔1cm²，将其接入装有40ml灭过菌的种子培养基的种子瓶，在如下条件下培养44-48小时：温度为28℃、环境相对湿度为50-60％、转速为200-250rpm、旋转半径为50mm，得到种子培养液。

3、发酵培养

发酵培养方法：取上述种子培养液按5％(V/V)的接种量接种于装有30ml灭过菌的发酵培养基I的瓶中，在如下条件下发酵培养240小时：温度为28℃、湿度为55％、转速为220rpm、旋转半径为50mm，得到发酵液。

(二)提取阿维菌素及产量检测

1、提取方法如下：

(1)取1ml发酵液，以8000rpm的速度离心5min，弃上清，加入10ml 90％(体积百分含量)甲醇溶液，以200rpm的速度(旋转半径为50mm)振摇6小时，以8000rpm的速度离心5min，取上清溶液，共得到10ml上清。

(2)取1ml上清，用0.45μm的微孔滤膜过滤，获得1ml发酵滤液。

2、HPLC分析

采用LC-9101型循环制备HPLC，JAIGEL-ODS-AP型SP-120-15制备柱。

用C₁₈反相柱，柱温30℃，取步骤1的发酵滤液，自动进样器进样，进样量10μl；以甲醇：水(体积比为9∶1)为流动相进行分离，流速为1ml/min，利用UV检测器在波长245nm处检测并自动形成分离图谱；在此色谱条件下，阿维菌素B1a标准品(DR，Germany)的色谱图如图1所示，阿维菌素B1a标准品的保留时间为6分钟左右。

计算发酵滤液中保留时间为6分钟左右处的洗脱峰面积，计算阿维菌素B1a的量。发酵滤液中阿维菌素B1a色谱图如图2所示。

实验设3次重复，结果取平均数。结果表明，10μl发酵滤液中获得6μg阿维菌素B1a，本发明菌株生产阿维菌素B1a的能力为6000μg/ml发酵液。

二、利用发酵培养基II发酵阿维链霉菌ZLX6001制备阿维菌素

(一)发酵阿维链霉菌ZLX6001

1、斜面培养：

方法同实验一中所述一致。

2、种子培养

方法同实验一中所述一致。

3、发酵培养

发酵培养方法：取上述种子培养液按3％(V/V)的接种量接种于装有30ml灭过菌的发酵培养基II的瓶中，在如下条件下发酵培养192小时：温度为25℃、环境相对湿度为50％、转速为200rpm、旋转半径为50mm，得到发酵液。

(二)提取阿维菌素及产量检测

1、提取方法如下：

方法同实验一中所述一致。用1ml发酵液提取得到10ml上清。取1ml上清，用0.45μm的微孔滤膜过滤，获得1ml发酵滤液。

2、HPLC分析

方法同实验一中所述一致。

实验设3次重复，结果取平均数。结果表明，10μl发酵滤液中获得5μg阿维菌素B1a，本发明菌株生产阿维菌素B1a的能力为5000μg/ml发酵液。

三、利用发酵培养基III发酵阿维链霉菌ZLX6001制备阿维菌素

(一)发酵阿维链霉菌ZLX6001

1、斜面培养：

方法同实验一中所述一致。

2、种子培养

方法同实验一中所述一致。

3、发酵培养

发酵培养方法：取上述种子培养液按5％(V/V)的接种量接种于装有30ml灭过菌的发酵培养基III的瓶中，在如下条件下发酵培养240小时：温度为30℃、环境相对湿度为60％、转速为250rpm、旋转半径为50mm，得到发酵液。

(二)提取阿维菌素及产量检测

1、提取方法如下：

方法同实验一中所述一致。用1ml发酵液提取得到10ml上清。取1ml上清，用0.45μm的微孔滤膜过滤，获得1ml发酵滤液。

2、HPLC分析

方法同实验一中所述一致。

实验设3次重复，结果取平均数。结果表明，10μl发酵滤液中获得5.5μg阿维菌素B1a，本发明菌株生产阿维菌素B1a的能力为5500μg/ml发酵液。

实施例3、本发明菌株遗传稳定性检测

将本发明菌株ZLX6001进行斜面传代，共传5代，每代菌的培养方法均如实施例2中实验一所述一致，每代培养得到的菌均按照实施例2中实验一中所述方法进行发酵和提取，并计算菌株生产阿维菌素B1a的能力。

实验设3次重复，结果取平均数。结果表明本发明菌株ZLX6001在5次传代后，生产能力还能保持原来水平，表明本发明菌株ZLX6001的遗传稳定性好。

序列表

<160>1

<210>1

<211>1448

<212>DNA

<213>链霉菌属阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)

<400>1

gacgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac gatgaagccc ttcggggtgg      60

attagtggcg aacgggtgag taacacgtgg gcaatctgcc ctgcactctg ggacaagccc     120

tggaaacggg gtctaatacc ggataatact ctcgcaggca tctgtgaggg ttaaaagctc     180

cggcggtgca ggatgagccc gcggcctatc agcttgttgg tgaggtagtg gctcaccaag     240

gcgacgacgg gtagccggcc tgagagggcg accggccaca ctgggactga gacacggccc     300

agactcctac gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggcgaaagc ctgatgcagc     360

gacgccgcgt gagggatgac ggccttcggg ttgtaaacct ctttcagcag ggaagaagcg     420

aaagtgacgg tacctgcaga agaagcgccg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata     480

cgtagggcgc aagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag agctcgtagg cggcctgtca     540

cgtcgggtgt gaaagcccgg ggcttaaccc cgggtctgca ttcgatacgg gctagctaga     600

gtgtggtagg ggagatcgga attcctggtg tagcggtgaa atgcgcagat atcaggagga     660

acaccggtgg cgaaggcgga tctctgggcc attactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg     720

gagcgaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acggtgggaa ctaggtgttg     780

gtgacattcc acgtcgtcgg tgccgcagct aacgcattaa gttcccggcc tggggagtac     840

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ttgggacg                                                             1448

Claims (10)

1、阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)ZLX6001，保藏编号为CGMCC No.2712。

2、一种制备阿维菌素的方法，是发酵阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)ZLX6001 CGMCC No.2712，得到阿维菌素。

3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述发酵的方法是将所述菌株接种于发酵培养基中，在温度为25-30℃的条件下培养。

4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基由终浓度为105-195g/L的玉米淀粉、终浓度为20-36g/L的豆粕粉、终浓度为6-12g/L的酵母粉、终浓度为0.175-0.325g/L的(NH₄)₂SO₄、终浓度为0.014-0.026g/L的CoCl₂、终浓度为0.015-0.028g/L的Na₂MoO₄、终浓度为0.0016-0.003g/L的MnSO₄、终浓度为2800-5200U/L的淀粉酶和终浓度为0.6-1.0g/L的CaCO₃组成，余量为水；所述终浓度均为在所述发酵培养基中的浓度。

5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述发酵在振荡的条件下进行，所述振荡的转速为200-250rpm，旋转半径为50mm。

6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述发酵的环境相对湿度为50-60％。

7、根据权利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于：所述温度为28℃。

8、根据权利要求3-7中任一所述的方法，其特征在于：所述培养的时间为192-240小时，优选为240小时。

9、根据权利要求5-8中任一所述的方法，其特征在于：所述振荡的转速为220rpm。

10、根据权利要求3-9中任一所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基由终浓度为150g/L的玉米淀粉、终浓度为28g/L的豆粕粉、终浓度为9g/L的酵母粉、终浓度为0.25g/L的(NH₄)₂SO₄、终浓度为0.02g/L的CoCl₂、终浓度为0.022g/L的Na₂MoO₄、终浓度为0.0023g/L的MnSO₄、终浓度为4000U/L的淀粉酶和终浓度为0.8g/L的CaCO₃组成，余量为水；所述终浓度均为在所述发酵培养基中的浓度。

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