KR20060060365A - 잔디의 주요병해를 일으키는 곰팡이성 병원균에 대한방제용 미생물 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＣＪ-9 - Google Patents

잔디의 주요병해를 일으키는 곰팡이성 병원균에 대한방제용 미생물 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＣＪ-9 Download PDF

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Abstract

본 발명은 잔디의 토양전염성 병해 방제에 유용한 길항미생물 및 이를 이용한 미생물 제제에 관한 것이다. 상기 길항미생물인 Bacillus subtilis CJ-9 (KCCM-10564) 균주를 함유한 미생물제제는 잔디의 주요 식물병인 라지벳취(Large patch)에 높은 생육저지 효과를 나타내었다.
Bacillus subtilis CJ-9, 라지벳취, 길항미생물

Description

잔디의 주요병해를 일으키는 곰팡이성 병원균에 대한 방제용 미생물 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＣＪ-9{Bacillus subtilis CJ-9 inhibiting and controlling the growth of the pathogenic fungus on the turf-grass}
도1은 PDA 배지에서 골프장의 라이족니아 병원균(라지벳취)에 대한 후보 길항미생물들의 항균활성을 투명환의 크기(mm)로 나타낸 것이다.
도2는 후보 길항미생물들의 라지벳취 방제효과를 나타낸 것이다.
도3은 라지벳취에 대한 길항미생물의 성장 및 방제효과를 바탕으로 측정된 RPI 수치 비교를 나타낸 것이다.
도4는 선발된 길항미생물 CJ-9 균주의 동정을 위한 API Kit(CHB) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도5는 선발된 길항미생물 CJ-9 균주의 동정을 위한 세포 지방산 분석 결과를 나타낸 것이다.
도6은 길항미생물 CJ-9의 동정을 위한 16s rDNA 유전자 분석 결과를 나타낸 것이다.
도7은 길항미생물 CJ-9(yellow로 표시)의 계통분류도와 동정결과를 나타낸 것이다.
도8은 라지벳취와 길항미생물 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) CJ-9 (KCCM-10564)의 생육저지효과를 검증하기 위한 대칭배양 시험결과를 나타낸 것으로 A는 대조군이고 B는 CJ-9이다.
도9는 바실러스 섭티리스(Bacillus subtilis) CJ-9(KCCM-10564) 균주의 최적 생산 배지조성을 나타낸 것이다.
도10은 바실러스 섭티리스(Bacillus subtilis) CJ-9(KCCM-10564) 균주의 최적 배양 온도 및 초기 pH의 시험결과를 나타낸 것이다.
도11은 바실러스 섭티리스(Bacillus subtilis) CJ-9(KCCM-10564)의 배양 곡선(pH, DO 조절, 대량 생산용 배지)을 나타낸 것이다.
도12는 바실러스 섭티리스(Bacillus subtilis) CJ-9(KCCM-10564) 액상수화제 시제들의 40℃ 항온기 내에서의 안정성 평가를 나타낸 것이다.
도13은 다양한 종류의 담체들을 이용하여 대류 건조(농업용 건조기 사용)한 시제들에 대한 포자 생존율, 수화성, 경도, 분말도, 수분 함량과 브라운 벳취 병원균에 대한 항균력을 나타낸 것이다.
도14는 40℃ 항온기 보관 시의 건조방식에 따른 길항 미생물 시제(수화제)의 미생물 생존율 및 항균활성의 변화를 나타낸 것이다.
도15는 바실러스 섭티리스(Bacillus subtilis) CJ-9(KCCM-10564) 미생물제제의 제형별 라지벳취에 대한 방제 효과를 나타낸 것이다.
도16은 바실러스 섭티리스(Bacillus subtilis) CJ-9 액상수화제의 라지벳취 방제효과를 나타낸 것이다.
본 발명은 잔디의 토양전염성 병해 방제에 유용한 길항미생물 및 이를 이용한 미생물 제제에 관한 것으로 더욱 상세하게는 잔디의 주요 식물병인 라지벳취(Large patch)에 높은 생육저지 효과를 나타내는 길항미생물인 Bacillus subtilis CJ-9 (KCCM-10564) 균주를 함유한 미생물제제에 관한 것이다.
골프장의 잔디는 수확을 목적으로 하는 농작물과 달리 관리에 초점을 맞추어 스포츠를 즐기는 것이기 때문에 농지와 달리 답압 스트레스에 의한 병저항성의 약화, 빈번한 예초에 의한 상처 유발, 잦은 살수, 과다한 댓취층 형성 등으로 인하여 발병이 조장되어 다른 식물보다 더 많은 병해가 발생하고, 방제가 어렵기 때문에 관리책임을 맡고 있는 코스관리자는 농약 과다사용의 유혹을 벗어나기 어려워 방제를 위한 농약 사용량도 증가하기 쉽다.
병충해의 방제법에는 크게 유기합성농약에 의한 방제법과 생물학적 방제법으로 나눌 수 있다. 1900년대 초부터 사용하기 시작한 유기합성 농약은, 작물 보호의 수단으로서 매우 유효하며, 식료 생산의 증대, 안정 공급, 농업 종사자의 노동력의 경감 등에 매우 큰 역할을 담당하여 왔으나, 근년, 특히 선진국을 중심으로 안전 지향, 건강 지향, 자연 지향이라는 사회적 요구가 높아지고 있고, 효율적인 식료 생산에 중요한 역할을 해 왔던 합성 농약을 둘러싸는 사회 환경은 매우 엄격해지고 있다. 따라서 이러한 유기합성농약의 단점을 없앨 수 있는 생물농약의 개발에 많은 관심이 집중되고 있다.
생물농약(미생물농약)이란 미생물자체를 직접 이용하거나 미생물을 포함한 제제를 이용하여 농작물에 해를 주는 곤충, 응애, 선충 등의 해충과 각종 식물병원균 혹은 잡초를 방제하는데 쓰이는 농약이라고 할 수 있다. 이러한 미생물 농약은 유기합성 농약과 비교할 때, 저독성이며 생태계에 영향이 적고 약제내성이나 저항성유발을 보이지 않는 특성을 가지고 있으며 약효발현이 늦고 제품의 안정성 및 생산 방법상의 난점이 있는 경우가 있다. 따라서 최근까지는 미생물농약이 전체 농약시장에서 차지하는 비율이 유기합성농약에 비해 극히 미약한 상태에 있었다. 그러나 앞에서 서술한 바와 같이 유기합성농약의 남용에 따른 환경오염을 예방하기 위한 방편으로 최근에는 효과가 좋으면서 경제적인 무공해, 저독성 미생물농약 개발연구에 많은 관심이 집중되고 있다. 지금까지 알려진 미생물농약에는 크게 미생물살충제, 미생물살균제, 그리고 미생물 제초제 등으로 구별할 수 있다.
미생물과 인간과의 긴밀함은 오래되었고, 문명과 함께 하고있다. 한국의 식생활에 옛날부터 된장, 간장, 술, 절임, 고추장은 모두 미생물에 의해 만들어지고, 외국의 치즈, 요구르트, 와인도 미생물에 의해 만들어진 것이다. 농업에서도 미생물은 여러 가지의 부문에서 이용되고 있고, 퇴비의 제조는 미생물을 이용한 대표적인 농업적 기술이다. 이와 같이 옛날부터 미생물은, 무의식적으로 경험적으로 인간의 생활에 밀접하게 이용되어 왔다. 미생물은 1632년 레벤버그에 의해 발견되었다. 겨우 356년 전의 일이고, 고흐에 의해 순수배양 (미생물의 성상을 알기 위해 어째든 필요한 기술)된 후 100여년이라는 짧은 세월이다.
토양 중에는 매우 많은 종류의 미생물이 다수 서식하고 있고, 그 수는 흙 1g당 수 천억이라고 한다. 그러나, 현대의 과학으로 해명되고 있는 것은 토양미생물 중 겨우 0.1%이고, 나머지 99.9%는 미지의 미생물이다. 길항미생물에 대해서도 아직 미지의 분야라고 말할 수 있을 것이다. 식물은 토양에서 영양분을 섭취하지만, 토양에 시비된 비료는 그대로는 식물에 이용되지 않는 것이 많고, 또 그대로는 비바람 등에 의해 모두 유실되어 버린다. 토양미생물은 토양에 사용된 비료나 유기물을 식물에 이용할 수 있는 형태까지 분해하여 균체에 축적하고 있다. 비료의 분해 이외에도, 미생물은 공기 중에서 질소를 고정하거나, 암석에서 미네랄을 빼내어 이것을 균체로 축적하거나 하는 작용을 한다. 이 균체에 축적된 영양분은 비바람에 의해 손실되는 일없이, 미생물의 번식에 수반하여 서서히 식물에 제공된다. 식물이 잎을 떨어뜨리거나, 생물이 사멸하거나 하면, 그곳에 미생물이 번식한다. 미생물이 번식하면 서서히 식물은 분해되고, 무기화되어 토양으로 변한다. 이 미생물도 마침내 사멸하여 토양으로 변하게 된다. 토양으로 변한 물질은 또 식물의 영양원으로서 흡수되고, 물질의 순환이 이뤄진다. 만일, 미생물이 없었다면, 지구상은 생물의 유체로 덮여져 버리게 된다. 이와 같이 미생물은 물질의 순환에 큰 역할을 담당하고 있다.
이 순환은 결국에, 미생물이 살아가기 위한 다양한 것을 먹이로서 섭취하는 사실에 의한 것이나, 그 속에서 미생물끼리도 서로 영향을 주면서 살아가고 있다. 미생물은 생존해 가기 위해서 자신의 생육환경을 무엇인가의 방법으로 확보할 필요가 있다. 이를 위해, 다른 미생물의 생육을 억제하는 듯한 물질을 생산하여 자신의 생육환경을 만들어낸다. 이것이 미생물끼리의 타감작용으로 이야기되고 있는 현상이다.
먹이의 경합, 물질의 생산, 기생 등에 의해 병원균을 살균하거나, 억제하는 작용을 '길항'이라고 부르고 있다. 이와 같이 모든 미생물은 살아가기 위해, 다른 미생물에 대해 무엇인가의 영향을 주고 있으며, 이 중 방제에 도움이 되는 것을 '길항미생물'이라고 한다.
반복적인 농약의 사용으로 인해 약제내성균의 출현과 농산물의 잔류독성 및 환경오염 등으로 인해 많은 사회적인 문제가 대두되고 있어 점차 그 사용이 제한되고 있고, 일부 식물병은 기존의 화학합성 농약으로는 방제가 불가능하다고 알려지고 있다. 이러한 상황에서 무공해 생물농약인 길항미생물에 의한 방제는 매우 바람직하며, 그의 개발이 절실히 요구되고 있다. 최근 이러한 문제점들을 해결하고 농작물의 각종 병만을 제어하여 농작물의 생산성을 증대시키기 위한 대체 수단으로 미생물 자체 또는 미생물이 생산하는 2차 대사산물을 이용하려는 생물학적 방제에 대한 관심이 고조되면서 선진국에서 이 분야가 매우 활발히 진행되고있다. 또한 향후 10년 안에 생물학적 방제의 시장이 10조원이상으로 확대될 것으로 전망되고있고, 관련 생명공학 기술의 발전에 따라 그 가능성은 점점 높아질 것으로 예상되고 있기 때문에 기존 유기합성 농약을 대체할 독성이 적고 약효가 우수한 미생물 살균제에 대한 필요성이 꾸준히 증가되고 있는 실정이다.
이와 관련한 종래 기술로는 식물의 생장을 촉진하는 조성물로 N-아실 락탐 화합물과 미생물균주를 포함하는 조성물이 개시되어있고(EP 공개 제 0294053호), 토탄을 주성분으로 하는 현탁액 상태의 미생물 전달매체 조성물과 미생물균주를 포함하는 조성물을 이용하여 식물의 생장을 촉진하고 병해를 방지하는 방법이 개시되어있으며(미합중국특허 제 4,595,589호), 초탄, 모래와 옥수수를 주성분으로 하는 미생물 전달매체와 미생물균주를 포함하는 조성물을 상기와 같은 용도로 이용하는 방법이 개시되고있다(미합중국특허 제 5,403,584호). 이중 EP특허는 화학적으로 합성된 화합물을 이용하고 있는데서 오는 문제점을 여전히 안고있고 상기 미국 특허에 개시되어있는 조성물은 모두 자연에서 얻어지는 물질들로 이루어지므로 환경오염문제를 해결하는데 도움이 되지만 그 성분의 문제로 인해 멸균 후 분말상으로 제조되기가 용이하지 않고 현탁액상으로도 안정하게 유지되기가 곤란하여 식물의 종자에 직접 처리하는 경우에 그다지 효과적이지 않다. 또한 항균성을 가지고 있는 미생물균주를 포함하는 미생물제제에서, 가장 중요한 요소인 항균성 미생물균주의 항균성이 일정 수준 이상으로 높아야 하며 이러한 활성이 안정하게 유지될 수 있어야 하나, 현재까지의 미생물제제에서는 그다지 만족할 만한 결과를 거두지 못했다.
본 발명은 상기한 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 특이적인 식물병원균에 대한 길항력을 갖는 미생물을 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 잔디의 주요병해를 일으키는 곰팡이에 대한 방제용 미생물 바실러스 섭티리스(Bacillus subtilis) CJ-9 (KCCM- 10564)을 제공한다.
또한 본 발명의 본 발명의 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 잔디의 주요병해를 일으키는 곰팡이에 대한 방제용 미생물 제제 조성물를 제공한다.
본 발명에 있어서 상기 잔디의 병해는 라지벳취인 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 바실러스 섭티리스를 라지벳취에 의한 잔디의 병해를 방제하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명자들은 토양미생물로부터 식물병해 방제효과가 있는 균주를 찾아내고자 노력한 결과, 길항미생물 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) CJ-9(KCCM-10564)을 분리하였으며, 이 길항미생물들을 함유한 미생물제제를 이용한 잔디의 주요병해를 일으키는 곰팡이에 대한 방제효과 및 곰팡이에 의한 잔디의 주요병해의 방제를 통해 본 발명을 완성하였다.
본 미생물제제는 라지벳취의 주요 원인 미생물들에 대해 생육저지효과가 있어 곰팡이에 의한 잔디의 주요병해 방제에 매우 효과적인 미생물이라 할 수 있다.본 미생물제제에 함유되어 있는 균주들은 당사 연구진이 자연계 토양 내에서 분리한 것으로서 일반적으로 안전하다고 여겨지는 GRAS(Generally recognised as safe)균주에 속하며 전통 발효식품의 주요 작용 균주와 유사한 종류이다. 본 균주는 자연계에 살포되었을 때, 비교적 오래 생존할 수 있는 내생포자를 형성하며, 대사산물로서 저분자의 환상 펩티드를 생산하는데 이 성분이 곰팡이에 대한 항균성을 나타낸다. 이러한 환상 펩티드로는 이투린(iturin)과 써팩틴(surfactin)이 대표적이 며 일본 및 구미에서 많은 연구가 진행되고 있는 성분으로서 열안정성이 매우 높고 독성이 거의 없으며, 식물 병원성 곰팡이에 대해 광범위하고 높은 항균력을 나타낸다. 따라서 본 균주들에 의한 항곰팡이성 기작은 미생물제제 내에 포함되어 있는 배양액 중에 생성된 활성성분이 일차로 작용하여 곰팡이의 생육을 억제하며, 이차로 미생물제제 내의 생균이 적용현장에서 서식하면서 활성성분을 생산하여 곰팡이의 생육을 원천적으로 억제하여 발병율을 감소시킨다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다.
[실시예]
실시예 1: 라지벳취에 대한 길항미생물의 검색 및 선별
골프장 페어웨이에 발생하는 병원성미생물인 라지패취(Rhizoctonia solani MAFF 305245)에 대한 길항활성을 갖는 미생물을 분리하기 위해서, 경기 및 강원도 지역의 밭토양과 삼림토양의 토양시료를 계절별로 채취하였다. 길항균을 분리하기 위하여 통상의 삼중층평판법을 이용하였다. 양질의 밭토양 250g에 2배량의 증류수를 넣고 가압멸균한 다음, 거즈를 이용하여 여과하였다. 여액를 증류수를 사용하여 1L로 조정한 다음 한천 15g를 용해하고 30ml용 시험관에 10ml씩 분주한 다음, 통상의 방법으로 가압멸균하여 50℃의 항온수조에 보관한다. 이어서 채취한 토양시료에서 각각 1g를 멸균생리식염수 100ml에 잘 현탁한 다음, 현탁액 2-3방울을 상기 시험관에 넣고 잘 혼합한 후, 곧바로 페트리디쉬에 부어 고화시킨다. 고화된 페트리 디쉬 상에 한천용액 5ml를 분주하여 고화시킨다. 그 다음, 계대배양중인 사면배지로부터 라지벳취 병원균의 포자현탁액(1×105 cfu/ml)을 만들고, 이를 50℃ 항온기에 준비된 감자한천배지 10ml에 2-3방울 첨가하고 잘 혼합한 후에 상기의 페트리디쉬에 다시 분주하여 삼중층평판배지를 제조하였다. 제조된 평판배지를 30℃ 항온기에서 3-7일간 배양하고, 라지벳취 병원균에 대한 길항성을 투명환의 형성으로 판단하였다. 우수한 미생물을 통상의 방법으로 순수분리하고 일반세균 배양용 배지(Nutrient Broth)를 이용하여 배양한 다음, 통상의 대칭배양법과 투명환 직경을 조사하여 길항력이 높은 길항미생물 균주 4개(CJ-2, CJ-4, CJ-5, CJ-9)를 일차로 선별하였다(도 1 참조).
1차 선발된 4가지 균주를 가지고 간이 폿트실험을 통해 라지벳취에 대해 길항력이 우수한 균주를 2차 선발하였다. 시험작물은 골프장 페어웨이의 주초종인 한국 잔디(중지)로 잔디 포지에서 지름 9cm의 잔디 뗏장을 채취하여 폿트에 옮긴 후에 25～30℃의 온실에서 40일 이상 활착을 시킨 후에 시험에 사용하였다. 라지벳취의 접종원은 1일 간격으로 2회 연속 살균한 sand-oatmeal 배양기(1,000ml 삼각플라스크에 모래 380g, oatmeal 20g을 넣어 혼합하고, 증류수 76ml을 첨가)에 감자한천배지(PDA)에서 5일간 배양한 Rhizoctonia solani AG2-2(Ⅳ)의 균총을 코르크보아로 잘라 5개씩 이식하여 25℃ 항온기에서 20일간 배양하여 준비하였다. 병원균 접종은 길항미생물 처리 직전에 폿트당 접종체 15g 수준으로 처리하였으며, 길항미생물 처리는 대상 길항미생물이 충분히 자랄 수 있도록 적절한 배지(PDA 또는 TSA)에서 충분히 배양한 다음 배양액을 100배 희석하여 폿트당 200ml씩 처리하였다. 대조 화학 약제는 펜시쿠론 수화제를 사용하였으며 1,000배 희석액을 살포하였다. 약제 처리 후에 Dew chamber(온도 25℃, 상대습도 100%) 안에 두어서 발병을 유도시켰다. 처리 10일 후에는 발병면적율을 조사하고 무처리 대비 방제가(%)를 구하였다. 그 결과 CJ-5, CJ-9 균주가 화학농약 처리와 통계적으로 동일한 수준의 우수한 방제력을 보였다(도 2 참조).
라지 벳취에 대한 최종 길항 미생물의 선정은 길항력과 생장 속도를 복합적으로 고려하기 위하여 RPI(Relative Performance Indies) 기법을 도입하였다.
i) 병해에 대한 길항력에 관한 RPIEfficacy
RPIEfficacy = [{(x - x')/σ}-2]×25
ⅱ) 후보균의 생장속도에 대한 RPIKinetics
RPIKinetics = [{(x - x')/σ}+2]×25
상기 식에서 x : 단일 실험 값이고, x': 모든 실험의 평균 값이며, σ : 표준 편차이다.
Efficacy는 앞서의 생물 검정 시험에서의 방제가로 계산하였으며, Kinetics는 후보균들을 15ml test tube에 5ml LBS 배지(soluble starch ; 10g/L, Tryptone 10g/L, Yeast extract 5g/L, NaCl ; 5g/L)에서 30℃, 16시간 1차 사면배양 후 30ml test tube에 10ml LBS에서 2차 사면배양(30℃, 12hr)하여 최종 OD600값을 이용하였다. 그 결과, 라지벳취에 대한 길항후보균 가운데 RPI값이 가장 큰 CJ-9 균주를 최종 선발하였다(도 3 참조).
실시예 2: 최종 선발된 라지벳취 길항미생물의 동정
앞에서 제시한 방법으로 최종 선발된 길항미생물 CJ-9을 동정하기위한 현미경적, 생화학적 및 분자생물학적 연구를 수행하였다. 분리한 균주 CJ-9을 전자현미경으로 관찰하면 간균의 형태를 띠고 있었고 그람염색 결과 그람양성으로 확인되었으며 운동성을 지니고 있었다. API kit(CHB) 분석(도 4 참조)과 세포 지방산 분석(도 5 참조)을 한 결과 Bacillus 속에 속하는 세균으로 추정되었다. 보다 정확한 동정을 위해 16s rDNA 유전자 분석을 실시하였다(도 6 참조). 이를 바탕으로 추정된 계통분류도 조사 결과, 본 균주는 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)로 동정되었다(도 7 참조). 이 균주는 대한민국 서울시 서대문구 홍제 1동 유림빌딩 소재 한국종균협회에 2004년 4월 6일자로 KCCM-10564의 수탁번호로 기탁되어 있다.
실시예 3: 잔디 라지벳취(Rhizoctonia solani MAFF 305245)에 대한 길항미생물 바실러스 섭티리스(Bacillus subtilis) CJ-9의 생육저지효과
골프장 잔디 페어웨이에 피해를 가장 많이 주는 병원균인 라지벳취(Rhizoctonia solani MAFF 305245)에 대한 Bacillus subtilis CJ-9 균주의 생육저지효과를 대칭배양법으로 조사하였다. 감자한천배지의 한쪽에 라지벳취 병원균 포자를 접종하고 다른 한쪽에는 길항미생물을 직선으로 접종한 후 생육 적온에서 3～4일 배양한다. 그 결과, 도 8에서 볼 수 있는 바와 같이, 길항미생물 바실러스 섭티리스(Bacillus subtilis) CJ-9 균주와 식물 병원균과의 길항효과 검정결과, 잔디의 주요 병원성 균인 라지벳취(R. solani MAFF 305245)에 대하여 생육저지효과를 나타내어 균사생육억제 현상이 높게 나타났다.
실시예 4: 길항미생물 바실러스 섭티리스(Bacillus subtilis) CJ-9의 배양조건 확립
Bacillus subtilis 배양에 일반적으로 이용되는 산업용 배지(Soybean meal 8g/L, Corn starch 10g/L, MgSO4·7H2O 1.5g/L, (NH4)2SO 4 2.5g/L, KH2PO4 3g/L, Yeast extract 5g/L)를 적용하여 최적 배지 조건을 통계적 처리 방법인 PBD(Plackett Burman Design)과 BBD(Box-Behnken experimental Design)을 통해 Minitab을 이용하여 분석하였다. 그 결과로 도9의 최적 생산 배지를 개발하였다.
배양 최적 조건을 확립하기위하여, 배양온도를 25, 28, 30, 32, 35, 37, 40℃와 pH 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9를 조합하여 1일간 배양 후 최대 균체 생성량 및 포자 생성을 보이는 온도 및 pH를 선발하였다. 그 결과 pH는 초기 pH 7.0 온도는 30에서 35℃에서 유사한 결과를 보였다(도 10 참조).
적절한 통기율을 파악하기 위하여 위에서 선발된 최적 조건으로 동일 플라스크에서 배양 부피를 달리하여 배양한 후 균체가 최대로 생성된 부피를 선발하여 균체의 호기 혐기 정도를 파악하였다. 그 결과, 통기적 호기성균임을 알 수 있었고, 그에 따른 scale-up시 용존산소량도 주요한 고려사항임을 유추 할 수 있었다. 이상의 결과로 5L 발효조에서 초기 pH 7.0 과 DO=75% 이상, 100～120rpm, 0.5～0.7vvm, 30℃, 최저 pH 6.0, DO 5%이상으로 제어하여 배양한 결과, 24시간 배양 후에 8.6×109 cfu/ml의 생균수를 나타내었고, 최대성장 속도(μMAX.)는 0.161 hr-1였다(도 11 참조).
실시예 5: 길항미생물 바실러스 섭티리스(Bacillus subtilis) CJ-9의 제형화상기의 배양물을 용도에 따라 액상수화제와 수화제의 미생물제제로 제조하였다. 각각의 제형 개발 과정은 아래와 같다.
(액상 수화제형의 개발) 배양 종료 시점에 다른 세균의 오염을 방지하기 위하여 5N 황산을 사용하여 pH를 4.0로 수정하고 관련 문헌자료를 참고하여 곰팡이 오염 및 포자와 활성 물질의 안정성 개선을 위하여 적합할 것으로 판단되는 보존제와 투입량을 설계하여 3종의 액상수화제 시제들을 제조하였다. 이렇게 제조한 액상수화제 시제들을 40℃ 항온기에 두고 8주 동안 미생물의 생존율과 라지벳취에 대한 항균활성을 관찰한 결과 시제1이 가장 양호하였다(도 12 참조).
(수화제형의 개발) 먼저 다양한 종류의 담체들을 이용하여 대류 건조(농업용 건조기 사용)한 시제들에 대한 포자 생존율, 수화성, 경도, 분말도, 수분 함량과 브라운 벳취 병원균에 대한 항균력을 확인한 결과, lactose, celite, dextrin, white carbon, alginate를 사용하였을 때에 라지벳취 병원균에 대한 항균활성이 15mm 이상으로 안정적으로 보존되었으며, 포자 생존율은 lactose 및 skim milk가 각각 59%, 72%로 유효성분의 보존성이 가장 우수하게 나타났다. 항균활성이 다소 우수하게 보였던 white carbon, celite는 포자 보존율이 각각 19%, 23%로 다소 낮게 나타났다. 따라서 lactose 및 alginate가 항균활성 및 유효성분의 보존성이 가장 안정적으로 우수하였다(도 13 참조).
다음으로 산업적으로 가장 유용한 건조 방법을 탐색하기 위하여 각기 다른 건조방법을 사용하여 수화제로 각각 시제를 제조하여 40℃에서 8주간 보관하면서 일주일 단위로 라지벳취 병원균(R. solani AG2-2Ⅳ)에 대한 항균활성과 미생물 생존율을 확인한 결과, 일반 대류식 건조 방식보다는 분무 건조 방식이나 동결 건조가 항균 활성 및 미생물 밀도 보존에 더 좋은 방식임을 알 수 있었다(도 14 참조). 다만, 분무 건조 방식이 동결 건조에 비하여 소요 비용이 적게 들어서 최종적으로 분무 건조 방식을 선발하였다. 동결 건조 시제는 5% celite(W/V) 와 5% lactose(W/V)을 배양액에 첨가한 후 F/D(일신랩)을 이용하여 -10℃에서 5℃까지 온도를 상승시켜 승화 건조한 것이고, 분무건조방식은 동일 증량제를 이용하여 inlet 140℃ outlet 85℃, 6L/hr(feeding rate) 조건으로 건조하였으며, 대류식 건조방식은 농업용 열풍 건조기에서 동일 증량제를 첨가한 후 50℃에서 24시간 건조한 것이다. 각각의 수분함량은 각각 2%, 2%, 7% 이었다.
(제형별 약효 평가) 시험작물은 골프장 페어웨이의 주초종인 한국 잔디(중지)로 잔디 포지에서 지름 9cm의 잔디 뗏장을 채취하여 폿트에 옮긴 후에 온실에서 40일 이상 활착을 시킨 후에 시험에 사용하였다. 라지 벳취의 접종원은 1일 간격으로 2회 연속 살균한 sand-oatmeal 배양기(1,000ml 삼각플라스크에 모래 380g, oatmeal 20g을 넣어 혼합하고, 증류수 76ml을 첨가)에 감자한천배지(PDA)에서 5일간 배양한 Rhizoctonia solani AG2-2(Ⅳ)의 균총을 코르크보아로 잘라 이식하여 25℃ 항온기에서 20일간 배양하여 준비하였다. 병원균 접종은 길항미생물 처리 직전에 폿트당 접종체 15g 수준으로 처리하였다. 미생물 제제 시제들은 1×106 cfu/ml수준으로 적절히 희석한 다음에 폿트당 300ml씩 처리하였다. 약제 처리 후에 Dew chamber(온도 25℃, 상대습도 100%) 안에 두어서 발병을 유도시켰다. 약제 처리 7 일 후에 약효를 조사한 결과 수화제와 액상수화제는 모두 우수한 약효를 나타내었다(도 15 참조).
실시예 6: 길항미생물 바실러스 섭티리스(Bacillus subtilis) CJ-9을 이용한 온실내 잔디 라지벳취 방제효과
액제 미생물제제를 이용하여 라지벳취(Rhizoctonia solani MAFF 305219)를 대상으로 온실내 포트실험을 통해 길항력을 검정하였다. 시험작물은 골프장 페어웨이의 주초종인 한국 잔디(중지)로 잔디 포지에서 지름 9cm의 잔디 뗏장을 채취하여 폿트에 옮긴 후에 25～30℃의 온실에서 40일 이상 활착을 시킨 후에 시험에 사용하였다. 라지 벳취의 접종원은 1일 간격으로 2회 연속 살균한 sand-oatmeal 배양기(1,000ml 삼각플라스크에 모래 380g, oatmeal 20g을 넣어 혼합하고, 증류수 76ml을 첨가)에 감자한천배지(PDA)에서 5일간 배양한 Rhizoctonia solani AG2-2(Ⅳ)의 균총을 코르크보아로 잘라 5개씩 이식하여 25℃ 항온기에서 20일간 배양하여 준비하였다. 병원균 접종은 길항미생물 처리 직전에 폿트당 접종체 15g 수준으로 처리하였다. 라지 벳취에 대한 길항미생물로 바실러스 섭티리스(Bacillus subtilis) CJ-9을 최적 배양법으로 배양한 후에 1×107 cfu/ml 수준으로 적절히 희석한 다음에 폿트당 200ml씩 처리하였다. 약제 처리 후에 Dew chamber(온도 25℃, 상대습도 100%) 안에 두어서 발병을 유도시켰다. 처리 10일 후에 조사한 결과 바실러스 섭티리스(Bacillus subtilis) CJ-9 균주 배양액의 방제가는 67.6%로 대조 화학 약제의 약 86% 수준의 우수한 효과를 나타내었다(도 16 참조).
상기의 구성에서 알 수 있는 바와 같이 본 발명의 미생물 제제는 잔디 라지벳취에 대한 우수한 방제효과를 나타내었다.

Claims (4)

  1. 잔디의 주요병해를 일으키는 곰팡이에 대한 방제용 미생물 바실러스 섭티리스(Bacillus subtilis) CJ-9 (KCCM-10564).
  2. 제1항 균주를 유효성분으로 포함하는 잔디의 주요병해를 일으키는 곰팡이에 대한 방제용 미생물 제제 조성물.
  3. 제2항에 있어서 상기 잔디의 병해는 라지벳취인 것을 특징으로 미생물제제 조성물.
  4. 바실러스 섭티리스 균주를 이용하여 라지벳취에 의한 잔디의 병해를 방제하는 방법.
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KR100746310B1 (ko) * 2006-12-07 2007-08-06 주식회사 파이오니아 풋마름병 방제 효과를 갖는 페니바실러스 폴리믹사ｋｐｂ３종

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