CN108795970B - 构巢曲霉异源表达系统的构建及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种构巢曲霉异源表达系统的构建方法，包括如下步骤(1)或步骤(2)：(1)敲除构巢曲霉dppV基因、mnn9基因或pepA基因中的任一或任两个，构建蛋白水解酶敲除的构巢曲霉突变菌株；(2)在构巢曲霉中过表达RsmA基因，构建RsmA基因过表达的构巢曲霉突变菌株。本发明所提供的构巢曲霉蛋白水解酶敲除和RsmA过表达菌株有助于重要工业蛋白酶的高效表达生产；所提供的gpdA启动子和xylP启动子表达元件可调控在构巢曲霉异源表达真菌天然产物时的产生不同化合物生成的方向，也可以用于改造或发现可用于医药的化合物，对于研发具有重要工业价值的蛋白酶和潜在的真菌天然产物药物具有重要的意义。

Description

构巢曲霉异源表达系统的构建及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及构巢曲霉异源表达系统的构建及其应用。

背景技术

丝状真菌具有表达量大、胞外分泌率高、蛋白质分子折叠和修饰系统接近高等真核细胞、生产的外源蛋白具有天然活性等特性，因此，在饮料、奶酪等食品工业和酶的商业化生产中得到广泛使用，成为非常具吸引力的可用于生产异源重组蛋白的表达宿主系统。在基础研究上，蛋白表达系统的建立是从分子水平上研究该菌株中酶表达调控的先决条件，同时，又是研究酶的结构功能关系，以定向改造酶的结构，达到改进酶催化活性和催化特性的重要基础；在应用研究上，因多拷贝整合是丝状真菌转化的特点，因此，通过转化引入多拷贝内源基因后，利用菌株中现成的酶形成机制，可较大幅度地提高酶产量。丝状真菌在发酵工业上长期以来一直用于抗生素、酶类和有机酸等的生产，丝状真菌强大的分泌酶类的能力使其在工业酶生产中确立了核心地位。丝状真菌作为基因工程受体菌有着与细菌、酵母菌不同的独特优势，主要包括：(1)具有很高的蛋白产生和分泌能力；(2)能正确进行各种翻译后加工，包括肽链剪切、糖基化和形成二硫键等修饰；(3)多种丝状真菌是确认的安全生产菌株，并有成熟的发酵和后处理工艺；(4)可以获得稳定的重组子，进而可以进行可控性育种，是很有希望的异源基因表达系统，利用丝状真菌转化引起多拷贝整合的特点为丝状真菌工业用菌株的育种开辟了新的途径。这些广泛具有工业应用价值的丝状真菌主要包括Aspergillus等属的一些类群，如A.awamori、A.niger、A.oryzae、A.nidulans和Trichoderma reesei等。为了充分挖掘丝状真菌作为细胞工厂生产异源蛋白的能力，研究主要集中在胞内蛋白质量控制的细胞机制、分泌途径改造、蛋白修饰加工及工程菌稳定性等方面。近年来，组学实验技术的迅速发展为实现丝状真菌高效表达异源蛋白提供了更为广阔的前景，如何利用新方法新技术构建新的高效丝状真菌表达系统来生产重要的酶类越来越迫切。就构巢曲霉而言，其DNA转化早在上世纪80年代就已取得成功，构巢曲霉(A.nidulans)作为丝状真菌研究的模式菌株基因组测序工作早已完成，近年来，构巢曲霉的转化系统也得到很大的发展，丝状真菌构巢曲霉作为重要的一种异源蛋白表达的宿主菌是提高外源蛋白表达效率的重要选择之一。

漆酶(Laccase，EC 1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，主要由真菌产生。漆酶催化氧化呈现高度的底物非专一性，对许多结构不同、难降解的高分子有机物质具有广谱的降解能力。据统计，漆酶可催化包括酚类及其衍生物、氯酚及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物等六大结构类型的多达250多种底物的氧化。在适宜的氧化还原介质存在的情况下，漆酶还可以氧化非酚的木质素亚基等物质；漆酶能把分子氧直接还原为水，漆酶的氧化过程不需要过氧化氢的参与和其它次级代谢产物的存在,即可催化有机污染物的氧化，与物理的和化学的方法相比，漆酶作为绿色环保型生物催化剂具有高效率、低能耗的优点，其应用涉及造纸、纺织、木材加工、饮料食品、土壤修复和生物能源等多个领域。正是漆酶广泛而重要的应用前景，引起了生物科学、环境科学及多种工业部门的特别关注，成为世界范围的研究热点，如何获得大量廉价的漆酶显得日益重要。由于自然界中野生型菌株产生漆酶与其次生代谢相关，产生的漆酶活力普遍比较低，远远达不到生产和研究的需要；其次，漆酶生产菌株的发酵水平普遍较低，很难满足对漆酶的需要。

真菌次级代谢产物是天然药物的重要来源，研究发现，真菌中合成次级代谢产物的基因成簇存在，这为从真菌次级代谢产物的生物合成及药物开发带来了便利。生物信息学分析发现，真菌基因组中蕴含着丰富的次级代谢产物信息，远远超出我们的预期。然而，大多数的基因簇或不表达或表达量极低，导致真菌天然产物发现受到很大局限。利用异源表达宿主进行的基因簇表达可促进天然产物的发现，可通过把强启动子插入到基因簇调控基因的前面以促进“沉默”化合物代谢途径基因簇的在异源宿主中的激活表达和天然产物的产生。如在构巢曲霉系统中常用的组成型启动子有甘油醛-3-磷酸脱氢酶的编码基因启动子，即gpdA启动子，广泛应用于顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、黄曲霉(Aspergillusflavus)、土曲霉(Aspergillus terreus)及黑曲霉(Aspergillus niger)等真菌中。组成型启动子是不受调控的，而诱导型启动子则可以随着条件的改变而启动或关闭下游基因的表达。产黄青霉(Penicillium chrysogenum)中发现的木糖诱导型启动子xylP启动子是今年来发现的具有极大应用潜力的诱导型启动子，该启动子受木糖和木聚糖的诱导，而受到葡萄糖的抑制；研究发现在xylP启动子作为调节元件时，能随培养基碳源的改变而选择性表达下游基因，进而可用来对特定的生物合成途径中的一些修饰酶进行灵活表达，在一定程度上带来产物的多样性。因此如何开发利用xylP启动子用于天然产物生物合成基因簇的体系是开发合成生物学技术元件中重要的内容。Aurovertins是首次从齿梗孢霉中分离得到的一类抗肿瘤化合物，齿梗孢霉存在生长缓慢，遗传背景不清晰等缺陷，在此基础上研究aurovertin生物合成途径难度较大，利用异源表达系统对真菌天然产物进行研究是发现新aurovertin类化合物及解析其生物合成途径的有效手段。

综上所述，构建用于表达工业用酶或真菌天然产物生物合成基因簇新型高效的构巢曲霉异源表达系统对于研发具有重要工业价值的蛋白酶和潜在的真菌天然产物药物具有重要的意义。

发明内容

本发明提供了一种构巢曲霉异源表达系统的构建方法，包括如下步骤(1)或步骤(2)：

(1)敲除构巢曲霉dppV基因、mnn9基因或pepA基因中的任一或任两个，构建蛋白水解酶敲除突变菌株；

(2)在构巢曲霉中过表达RsmA基因，构建RsmA基因过表达突变菌株。

以上所述的方法，其中，所述步骤(1)中还包括通过所述敲除菌株中gpdA启动子、外源基因自身启动子、AMA1自主复制序列构建基因表达载体的步骤；步骤(2)中还包括通过所述RsmA基因过表达突变菌株相应的aflR启动子构建异源表达载体的步骤。

以上所述的方法，其中，所述步骤(2)中还包括利用gpdA启动子和xylP启动子构建基因表达载体，调控化合物生物合成基因簇的步骤。

本发明的另一个方面，还提供以上所述的方法构建的表达载体、转基因细胞或突变菌株。

本发明的再一方面，提供利用以上所述的表达载体、转基因细胞或突变菌株表达外源蛋白或化合物的方法。

以上所述的方法，其中，所述外源蛋白为漆酶。

以上所述的方法，其中，构建所述表达漆酶的突变菌株利用的出发菌为构巢曲霉(Aspergillus nidulans)。具体为将以上构建的重组载体导入能产生漆酶的构巢曲霉突变株中，得到能产生漆酶的基因工程菌。

以上所述的方法，其中，所述化合物为aurovertin类化合物。

以上所述的方法，其中，构建所述表达aurovertin类化合物的突变菌株利用的出发菌为构巢曲霉(Aspergillus nidulans)。具体为将以上构建的重组载体导入能产生aurovertin类化合物的构巢曲霉中，得到能产生aurovertin类化合物的基因工程菌。

以上所述的方法，其中，通过添加不同浓度的木糖或木聚糖获得不同产量的aurovertin类化合物。

本发明所提供的构巢曲霉蛋白水解酶敲除和RsmA过表达菌株有助于重要工业蛋白酶的高效表达生产；所提供的gpdA启动子和xylP启动子表达元件在构巢曲霉异源表达真菌天然产物的表达方向，也可用于改造或发现具有潜在医药开发价值的化合物。

附图说明

图1为构巢曲霉蛋白水解酶基因敲除及阳性转化子PCR鉴定示意图(图中：5F和3F分别为所敲除目标基因的上游和下游序列；P1F/R和P2F/R分别代表转化子PCR鉴定时的扩增片段的位置和长度)。

图2为构巢曲霉RsmA过表达菌株构建及阳性转化子PCR鉴定示意图。

图3为漆酶表达载体构建及构巢曲霉基因工程菌阳性转化子PCR鉴定示意图。

图4为基于不同启动子模式的漆酶构巢曲霉基因工程菌株单位体积漆酶的产量。

图5为基于构巢曲霉中蛋白水解酶缺失模式的漆酶构巢曲霉基因工程菌株单位体积漆酶的产量。

图6为基于aflR启动子在RsmA过表达构巢曲霉突变菌中的漆酶构巢曲霉基因工程菌株单位体积漆酶的产量。

图7为aurovertin生物合成基因簇异源表达设计方案及突变株次级代谢产物分析。A.aurovertin生物合成基因簇构成；B.aurovertin异源表达载体设计方案；C.含aurA至aurG基因的突变株HPLC分析结果。

图8为利用aurovertin生物合成基因簇异源表达的构巢曲霉基因工程菌发酵分离纯化出的7个目标化合物结构式。

图9为aurovertin生物合成基因簇异源表达的构巢曲霉基因工程菌株在利用gpdA启动子过表达转录因子基因aurF后的产物aurovertin I和aurovertin E的定量分析。

HPLC定性分析过表达转录因子突变株与对照生产aurovertin类化合物的产量差别，纵坐标：紫外吸收峰值，横坐标：时间min(图9-A)；过表达转录因子突变株化合物aurovertin I和aurovertin E的定量分析比较(图9-B)。

图10为aurovertin生物合成基因簇异源表达的构巢曲霉基因工程菌株在不同碳源培养基中aurovertin类化合物比例变化。

HPLC定性分析xylP(p)::aurG突变株在不同碳源培养基中aurovertin类化合物的产量差别，纵坐标：紫外吸收峰值，横坐标：时间min(图10-A)；xylP(p)::aurG突变株中化合物aurovertin I、aurovertin E、aurovertin C和aurovertin B的产量所占总化合物产量比例分析比较(图10-B)。xylP(p)::aurG突变株化合物aurovertin I、aurovertin E、aurovertin C和aurovertin B的定量分析比较(图10-C)。

图11为化合物1-7的LC-MS分析图谱。

图12为化合物1-7的¹H-NMR分析；其中，图12-A为化合物1在氘代丙酮的¹H(500MHz)NMR谱学分析；图12-B化合物1和2在氘代丙酮的¹H(500MHz)NMR谱学分析；图12-C化合物3在氘代氯仿中的¹H(500MHz)NMR谱学分析；图12-D化合物3和4在氘代丙酮中的¹H(500MHz)NMR谱学分析；图12-E化合物5在氘代氯仿中的¹H(500MHz)NMR谱学分析；图12-F化合物5和6在氘代氯仿中的¹H(500MHz)NMR谱学分析；图12-G化合物7在氘代氯仿中的¹H(500MHz)NMR谱学分析。

具体实施方式

本发明经过深入研究，首次公开了构巢曲霉的异源表达系统的构建方法，本发明还公开了利用构巢曲霉基因工程菌株生产获得外源蛋白酶或化合物的方法。

以下结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，所述构巢曲霉菌株(Aspergillus nidulans)可通过商业途径购买得到(如中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC等)。

实施例1构巢曲霉蛋白水解酶缺失菌株的构建

构巢曲霉作为基因改造的出发菌株。本实施例利用高保真酶PCR扩增pyroA营养缺陷型标记基因序列和构巢曲霉蛋白水解酶基因dppV、mnn9和pepA上下游1300bp序列，进而采用Double-joint PCR方法分别构建构巢曲霉蛋白水解酶基因dppV、mnn9和pepA的单基因敲除盒，并利用PEG介导的原生质体遗传转化方法对构巢曲霉进行基因敲除。

构巢曲霉的PEG介导的原生质体遗传转化方法如下：

本发明所用的构巢曲霉菌种活化培养基为GMM培养基，每1L所述固体培养基按如下方法配制：葡萄糖10g，硝酸盐母液50mL，微量元素母液1mL，酵母抽提物1g，琼脂15-20g，上述成分依次添加，最后补加蒸馏水终体积至1L，pH值调至6.5，121℃高压湿热灭菌20-30分钟。倒90mm培养皿，划线接种，37℃静置培养4天，4℃保存用于培养接种。

其中，硝酸盐母液配制(1L)方法如下：硝酸钠NaNO₃120g，氯化钾KCl 10.4g，硫酸镁MgSO₄·7H₂O 10.4g，磷酸氢二钾K₂HPO₄·3H₂O 30.4g，上述成分依次添加，最后补加蒸馏水终体积至1L，pH值自然，121℃高压湿热灭菌20-30分钟，室温保存；

微量元素母液配制(100mL)方法如下：硫酸锌ZnSO₄·7H₂O 2.2g，硼酸H₃BO₃1.1g，氯化锰MnCl₂·4H₂O 0.5g，硫酸亚铁FeSO₄·7H₂O 0.16g，氯化钴CoCl₂·5H₂O 0.16g，硫酸铜CuSO₄·5H₂O 0.16g，钼酸铵(NH₄)6Mo₇O₂₄·4H₂O 0.11g，EDTA钠盐Na₂EDTA 5.0g，上述成分依次添加，最后补加蒸馏水终体积至100mL，121℃高压湿热灭菌20-30分钟，室温保存。

转化培养基为SMM培养基，每1L所述固体培养基按如下方法配制：GMM培养基添加山梨醇218.6g。

具体转化步骤如下：

构巢曲霉活化：先将构巢曲霉孢子悬液划线至GMM(补充相应的营养缺陷型成分)平板上，在37℃培养箱黑暗条件下培养3天；然后用0.1％Tween 80收集孢子，经过滤布过滤后，取适量孢子悬液到含30mL LMM培养基的三角瓶中，37℃，250rpm，摇床培养4-6小时进行孢子萌发；收集萌发好的孢子，4℃保存备用。

原生质体制备：挑取适量萌发的孢子加入到含有无菌的10mL酶解液(Osmoticbuffer：含MgSO₄·7H₂O 147.9g，Na₂HPO₄0.23g，NaH₂PO₄·2H₂O 0.53g，用1M Na₂HPO₄将pH值调至5.8，用超纯水补足至500mL，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存备用)的三角瓶中，80rpm，37℃，摇床培养2-4小时进行细胞壁裂解，获得原生质体，保存于STC buffer(218.6g山梨醇，1.47g CaCl₂·2H₂O，10mL 1M Tris-HCl(pH7.5)，用超纯水补足至1L，灭菌后4℃保存)中。

原生质体转化：将3-5μg质粒(体积控制在15μL之内)加入到100μL原生质体溶液中混合均匀，冰浴50分钟后加入1.25mL 60％PEG溶液，轻轻颠倒转动，室温横放静置20分钟，加入5mL STC buffer，轻轻混匀，平均加至5个SMM平板上；从烘箱取出事先化好的上层培养基，各加5mL，立即晃动培养皿，使混合均匀，最后放入37℃培养箱，过夜后再倒置，培养2-3天。即可得到相应的转化子。

然后挑取转化子并提取基因组DNA，利用PCR方法对转化子进行验证和鉴定，分别获得dppV、mnn9和pepA单基因缺失的突变菌株(TYWL57(ΔdppV)、TYWL58(Δmnn9)和TYWL59(ΔpepA))；

构巢曲霉基因工程菌转化子筛选及验证方法如下：

使用尖牙签将挑选10-20个构巢曲霉转化子转接至GMM(补充相应的营养缺陷成分)平板上，在37℃培养3天，用扁头牙签刮取少量孢子，接至3mL LMM培养基中(补充相应的营养缺陷成分)，37℃静置培养16小时，提取转化子基因组DNA，最后以转化子的基因组DNA为模板，使用根据相应的敲除或过表达目的基因设计的引物(漆酶基因或aurovertin生物合成相关基因)进行PCR扩增，并利用琼脂糖凝胶电泳进行验证，筛选并获得阳性转化子，分别获得表达漆酶构巢曲霉基因工程菌(TYWL16(OE::Self-P-AMA1-laccase)、TYWL23(OE::aflR-P-laccase)、TYWL33(OE::Self-P-laccase)、TYWL61(OE::gpdA-P-laccase)、TYWL69(OE::aflR-P-laccase,OE::RsmA)、TYWL70(OE::Self-P-laccase,ΔdppV)、TYWL64(OE::Self-P-laccase,Δmnn9)、TYWL62(OE::Self-P-laccase,ΔpepA)、TYWL66(OE::Self-P-laccase,Δmnn9ΔpepA)、TYWL68(OE::Self-P-laccase,ΔdppVΔpepA)、TYWL71(OE::Self-P-laccase,ΔdppVΔmnn9)，以及表达产生aurovertin类化合物的构巢曲霉基因工程菌(TYZM1(OE::aurA-F)、TYZM13(OE::aurA-F，OE::gpdA-P-aurA-F)、TYZM14(OE::aurA-F，OE::gpdA-P-aurF，OE::xylP-P-aurG))，转化子鉴定原理见图3。

然后利用上述技术方法，分别以Riboflavin或pyrG营养缺陷型标记基因分别构建蛋白水解酶基因mnn9和pepA的单基因敲除盒，分别以单基因缺陷菌株为受体菌株进行基因敲除，分别获得了dppV和pepA、dppV和pepA、mnn9和pepA双基因敲除的突变菌株(TYWL60(ΔdppVΔmnn9)、TYWL63(ΔdppVΔpepA)和TYWL65(Δmnn9ΔpepA))。敲除原理、敲除盒及突变株鉴定结果见图1。

实施例2构巢曲霉RsmA基因过表达菌株的构建

构巢曲霉作为基因改造的出发菌株。本实施例首先利用高保真酶PCR扩增pyrG营养缺陷型标记基因、组成型强启动子gpdA启动子序列及RsmA基因的上游1300bp序列和RsmA基因1300bp的基因片段，然后利用Double-joint PCR方法将pyrG营养缺陷型标记基因和组成型强启动子gpdA启动子构建构巢曲霉RsmA基因的过表达盒，并利用PEG介导的原生质体遗传转化方法对构巢曲霉进行遗产转化(转化方法同实施例1)，完成同源重组和对该菌中的RsmA基因进行过表达改造，然后挑取转化子并提取基因组DNA，利用PCR方法对转化子进行鉴定，获得RsmA基因过表达的基因工程菌株(方法同实施例1)，此菌株可与表达的外源基因表达元件中aflR启动子相对应，获得高效表达的基因宿主菌株(TYWL13(OE::RsmA))。RsmA基因过表达菌株构建原理及突变株鉴定结果见图2。

实施例3漆酶相关表达载体及aurovertin生物合成相关表达载体的构建

本申请所用漆酶基因(如SEQ ID NO：1所示)来自血红密孔菌(Pycnoporussanguineus)(GenBank:AY510604.1)，以血红密孔菌基因组DNA为模板，利用高保真酶进行PCR扩增，分别克隆到含有其漆酶基因自身启动子序列、其终止子序列的表达盒(3476bp)和漆酶基因，同时以构巢曲霉基因组DNA为模板，利用高保真酶进行PCR扩增，分别克隆到gpdA启动子(1513bp)和aflR启动子(660bp)序列；然后利用常规的酶切连接方法和Quick-change载体构建技术方法，转化大肠杆菌，构建到含有AMA1自主复制序列的载体(参见文献：Aleksenko A,Clutterbuck AJ.The plasmid replicator AMA1in Aspergillusnidulans is an inverted duplication of a low-copy-number dispersed genomicrepeat.Mol Microbiol.1996,19(3):565-574.)及pyrG(pYH-wA-pyrG载体)、pyroA(pYW25.16载体)或riboflavin营养缺陷基因序列的载体(pYH-wA-pyrG载体上插入从构巢曲霉基因组DNA中扩增的gpdA启动子序列(1442bp)和从烟曲霉基因组DNA中扩增的Ribo序列(2305bp)替换pYH-wA-pyrG上的pyrG序列)上，获得不同的漆酶基因表达载体，包括pYWL16(Self-P-AMA1-laccase-pyrG)、pYWL17(Self-P-laccase-pyrG)、pYWL55(aflR-P-laccase-ribo)、pYWL97(gpdA-P-laccase-pyrG)、pYWL99(Self-P-laccase-ribo)、pYWL100(Self-P-laccase-pyroA)。上述构建的表达载体用于转化不同的构巢曲霉突变株受体菌。

本申请所用aurovertin的生物合成基因簇基因序列来自齿梗孢霉(Calcarisporium arbuscula)，以齿梗孢霉基因组DNA为模板，利用高保真酶进行PCR扩增，克隆aurovertin的生物合成基因簇及其单个基因序列，其中aurA基因登录号为GenBank:KT581574.1，8414bp；aurB基因登录号为GenBank:KT581575.1，693bp；aurC基因登录号为GenBank:KT581576.1，1629bp；aurD基因登录号为GenBank:KT581577.1，1617bp；aurE基因登录号为GenBank:KT581578.1，580bp；aurF基因登录号为GenBank:KT581579.1，1949bp；aurG基因登录号为GenBank:KT581580.1，1940bp。所述齿梗孢霉(Calcarisporiumarbuscula)菌株可通过商业途径购买得到(如苏州北纳创联生物技术有限公司等)。

在扩增整个基因簇大片段时，将其分成4段进行克隆，各片段间含有约150bp左右overlap序列，然后利用酵母组装技术(具体原理和操作见文献：

Muller,NarayanaAnnaluru,Joy Wu Schwerzmann,Sarah M.Richardson,Jessica S.Dymond,EricM.Cooper,Joel S.Bader,JefD.Boeke,Srinivasan Chandrasegaran.Assembling LargeDNA Segments in Yeast,Protocol Gene Synthesis of the series Methods inMolecular Biology.2012(852):133-150)在将含有aurA-F的aurovertin的生物合成基因簇组装到pYH-wA-pyrG质粒(pYH-wA-pyrG质粒参见文献：Yin,W.-B.,Chooi,Y.H.,Smith,A.M.,Cacho,R.A.,Hu,Y.,White,T.C.,and Tang,Y*.Discovery of cryptic polyketidemetabolites from dermatophytes using heterologous expression in Aspergillusnidulans.ACS Synth.Biol.2013,2(11):629-634.)上，获得aurovertin生物合成基因簇除aurG基因以外的所有基因的表达载体pYWB31(aurA-F-pyrG)；利用Quick-change方法将aurF基因构建到pYW25.16载体(在商业化pGMT质粒上插入从构巢曲霉基因组DNA中扩增的gpdA启动子序列(1442bp)和从烟曲霉基因组DNA中扩增的pyroA序列(2797bp))上，获得含有gpdA启动子元件及aurF基因的表达载体pYZM2(gpdA-P-aurF-ribo)；最后，以产黄青霉的基因组DNA为模板，利用高保真酶进行PCR扩增，克隆到木糖诱导型启动子xylP的序列(1642bp)，同样利用Quick-change方法将与xylP启动子元件结合的aurG基因表达元件构建到pYZM2载体上，获得同时含有gpdA启动子元件及aurF基因的表达盒和xylP启动子元件结合的aurG基因表达盒的表达载体pYZM4(gpdA-P-aurF-ribo，xylP-P-aurG)。上述构建的表达载体用于转化构巢曲霉获得产生aurovertin类相应的基因工程菌。

实施例4基因工程菌漆酶发酵及漆酶酶活性测定

构巢曲霉漆酶基因工程菌生产漆酶的发酵培养基为LMM培养基(葡萄糖10g，20XNitrate Salts 50mL，1000X Trace elements 1mL，酵母提取物5g，5M NaOH调节pH值至6.5，用蒸馏水补足至1L，根据突变株的营养缺陷的基因型补充缺陷营养)，接种量为100mLLMM培养基加入10⁵-10⁶个孢子，培养条件为28℃,摇床转速为200rpm/min，培养4天，培养48小时后添加终浓度为0.2-0.5mM的CuSO₄诱导，取发酵液上清进行漆酶酶活测定。漆酶酶活测定采用ABTS法，反应体系为2mL，含pH 4.0酒石酸缓冲液1mL，蒸馏水0.78mL、发酵液上清液20μL和ABTS 200μL，30℃水浴1分钟，反应30秒，于420nm处测定光吸收值，每组3个重复。1个酶活力单位定义为在当前反应条件下每分钟氧化1μmolABTS所需的酶量。不同表达模式构建的漆酶基因工程菌的生产漆酶的活力分别见图4，图5和图6。

实施例5aurovertin基因工程菌产生相应化合物的HPLC验证

为进一步验证构巢曲霉基因工程菌aurovertin的生物合成相关基因的功能，将基因工程菌在GMM培养基中25℃培养10天，添加不同前体喂养，通过高效液相色谱HPLC分析方法来检测不同基因工程菌产生aurovertin类化合物的情况。结果见图7和图9。

在下述条件下进行萃取：将培养10天获得菌丝和培养基进行化合物萃取。将培养物分成小块置于三角瓶中，加入2倍体积MEA(乙酸乙酯：甲醇：冰乙酸＝89:10:1)进行超声萃取(超声频率100Hz，时间为1小时)；收集提取液进行旋转蒸发(温度30℃，转速100rpm/min，真空度<3mm Hg)；蒸干后用分析纯甲醇溶解，稀释适当浓度进样20-40μL，40-100％甲醇冲柱，进行HPLC分析。

在下述条件下进行HPLC分析：装置：Waters e2695系统检测器：Waters 2998(200-600nm)；色谱柱：38020-41 COSMOSIL 5C18-MS-II Packed Column，4.6mm I.D.x 250mm；洗脱速度：1mL/min，洗脱剂：水和甲醇在20min内将甲醇含量由40％甲醇增加至100％甲醇(分析结果见图7-C)。

实施例6构巢曲霉基因工程菌次级代谢产物分离纯化及鉴定

为进一步验证构巢曲霉基因工程菌aurovertin的生物合成基因的aurG和aurF的功能，将基因工程菌在LMM培养基或大米培养基中25℃培养10天，添加不同浓度的碳源木糖和葡萄糖，并通过质谱LC-MS分析方法来检测基因工程菌喂养不同物质的产物变化。利用gpdA启动子过表达转录因子基因aurF后的产物aurovertin I和aurovertin E的定量分析，结果见图9；利用xylP启动子过表达酰基转移酶aurG后，在不同碳源培养基中获得不同的aurovertin类化合物比例变化，结果见图10。上述分析结果同时在确定aurF和aurG基因在aurovertin类化合物生物合成中功能，即：转录因子合成基因aurF是aur基因簇的正调控因子，在其前面引入构巢曲霉的组成型启动子gpdA启动子，通过aurB-E表达的加强使aurovertin类化合物的产量得以提升，目标产物产量提高15-20倍；另外，在酰基转移酶的合成基因aurG前引入木糖诱导型启动子xylP启动子，在培养基中添加木糖能够诱导aurG的表达，使含乙酰基化合物比例增加从而改变目标化合物之间产量的比例，这为如何大量获得对乳腺癌具有潜在治疗能力的化合物7(aurovertin B)提供了重要依据和方法，在培养基中添加木糖，可使该基因工程菌产生更多的aurovertin B；为获得更多aurovertin类化合物的前体化合物3(aurovertin E)，则不需要添加木糖。同时上述结果也验证了组成型gpdA启动子结合诱导型xylP启动子的组合策略在表达相关化合物生物合成方向上，利用木糖或木聚糖进行调控表达的有效性。

在下述条件下进行萃取：将培养10天获得菌丝和LMM培养基或大米进行化合物萃取。加入2倍体积的MEA(乙酸乙酯：甲醇：冰乙酸＝89:10:1)进行超声萃取(超声频率100Hz，时间为1小时)；收集提取液进行旋转蒸发(温度30℃，转速100rpm/min，真空度<3mmHg)；蒸干后用分析纯的甲醇溶解，稀释适当浓度进样20-40uL，60-80％甲醇冲柱，进行HPLC分析和LC-MS分析。

在下述条件下进行HPLC分析：装置：Waters e2695系统检测器：Waters 2998(200-600nm)；色谱柱：38020-41COSMOSIL 5C18-MS-II Packed Column，4.6mm I.D.x 250mm；洗脱速度：1mL/min，洗脱剂：水和甲醇在20分钟内将甲醇含量由40％甲醇增加至80％甲醇。

在下述条件下进行LC-MS分析：装置：QTOF LC/MS 6520系统(安捷伦公司)；RP C18色谱柱：Kromasil 100-5C18column；4.6x 250mm；25℃，电喷离子化来源，洗脱速度：1mL/min。分析结果见图11。

在下述条件下进行¹H-NMR分析:装置：BrukerAvanceⅢ500核磁共振波谱仪；将纯品溶解在氘代试剂中采集核磁共振氢谱图数据，将氢谱数据归属后与已发表文献的数据进行比较，从而确定样品的化学结构。化合物1、3、5和7均通过核磁共振氢谱结合LC-MS数据确定结构；而化合物2、4和6则是通过比较与之相对应的顺反异构体(分别是化合物1、3和5)的氢谱确定结构。分析结果见图12。

最后应说明的是：上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院微生物研究所；中国科学院大学

<120> 构巢曲霉异源表达系统的构建及其应用

<130> 170211CI

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3476

<212> DNA

<213> 血红密孔菌（Pycnoporus sanguineus）

<400> 1

cggaccacgt cacatctcac tggcactagt ctatcgccgc ggattatcaa cgctttcaaa 60

gcgaaatccc gggtctcaac actcggcagg aacgtcttca aagcgccaat ggtttgatcc 120

tgtagggctt tcaggaacag cctgaatagc tacgaaaaag tggggagact ggtgggctca 180

tcgcagtccg tagtcccgag atttgccaac gcagagtccc gagcagcagg gtctgctcgt 240

acaacgtaag taatgatcac caggtagcga tggcttcgcc gctcagtgcc tctccgttcc 300

ggacacagca aaacgcttgc tacttagcgc gcgcctcgct cactccgaca tggacgcatc 360

tcgccgactc ggccttctct cttcgaaacc gtcctgagtt ttgcatacat ttctcaaacg 420

ggctctggcg cgaccaattc cacggccttg ttaccgctct taccttggca cggacaccgc 480

cctctatacc aaaccgggcc tcgtcccacc cagaactcag cagtcgccgt gcctatcacg 540

ccggaactct ctcatctgtc ggtaacagac attcacgtcc tgaagccaca acaaacatgt 600

gtacaccgcg agcttccccg tgctcggacg ggggtgcccc gccacgacga gtacataagg 660

cggggtgcgg tgaggcattt aagcaagccg ccagcccacc cacttctctc tcttgcctcg 720

gtcgtcgcgc agaatcagcc atgggctccg gtctattcag cctcttcgtc gccatcgcgg 780

ccatctctgg cagtctcgct gccatcgggc ccaaggcgga cctcgtcatc tccgatgctg 840

ttgtcaatcc cgatggcacg cctcgagctg ctgttgtcgt gaatggtgac ttccctgggc 900

ctctcatctc tgggaagaag gtaggggacg tggtctatgc cttggacgta ccacggctaa 960

tcatgctggt gtagggggat cacttccagc tcaacgtgat caacaagttg accaaccaca 1020

ccatgctgaa gacgaccagt atagtacgct ggctgattct tgtgaagtgg ctaaggaact 1080

catgtgtcct tcgcagcact ggcacggact cttccaggaa cacactaact gggccgacgg 1140

tcccgcattc gtcaatcagt gtcccattgc ttctggacac tccttcctat acgacttcca 1200

tgtgcccgat caagccggta cgtcttcgca gagcacacga tgtctcggaa acctaatcaa 1260

tcggtttggc gtctaggcac gtactggtat cacagccatc tgtccacgca gtactgcgac 1320

ggattgcgag gaccgcttgt cgtgtacgac ccccacgatc ctcaggcgca tctgtatgat 1380

gttgacaacg gtgaattctt tgaattgcct ggcgtgcgac agccttctga cgcgcgtgat 1440

agatgacact gtcattacct tggcggattg gtaccatgtc gcggccaagc tgggcccgca 1500

attcccgtgc gtctttctct tctattcatc acggagaagt ttgttcatgt aatgctacag 1560

gaggggcgcg aactctaccc tcatcaacgg ccttggacgc gcggcaacgg atagcacttc 1620

cgacttgact gtcattaccg tggagcatgg gaagcggtaa gcacggtcaa cacacactcc 1680

aagaggaagc ccgctcatct ttcgagtcat ttcctccatc ttcagctatc gtttcaggct 1740

tgtgtcgatc tcttgtgacc ccaaccacac cttcagcatc gatggacaca acatgactat 1800

cattgaagtc gatggcgtca acagcaagcc cctcaccgtc gactccatcc agatcttcgc 1860

cgctcagcgc tactccttcg tggtcagtag cctccctgac atgcatcata gcaagaacac 1920

tggctcaatc attctgttga ctagttgaat gctaaccaac cggtggacaa ctactggatt 1980

cgtgcgaatc cgagtggcgg gaccctgggc ttcgagggcg ggatcaactc tgccatcctc 2040

cggtacaagg gtgccccgga tgccgaaccc accaacacga cggcaccgac atctgtgatt 2100

cctcttgtgg agacaaattt gcaccctctc aagcccatgc aagtggtatg tttcatgagt 2160

ctgttgtatc attataaaac gcgctgacac tgtacccaaa gcctggccga tctggtgttg 2220

gtaacgtcga ttatgcgaag accctcaatt tcaactttgt gagtagcttc aattgagcat 2280

tagacaaatg cacggagtgc tgagatgtcg cccttcccga ccaccagaac ggcaccaatt 2340

tcttcatcaa caatgcgacg ttcactccgc ccacagtccc cgtcctcctc cagatcctga 2400

gcggagcgca caacgcgcag gacctcctac ctgcagggtc tgtttacacc cttcctccgc 2460

acagcgccat cgagatcacc atgccagcta cgaccatggc cccgggctca ccccacccct 2520

tccacttgca cggcgtatgt ctaaaatgcc tcaaactgta tgtcaaatgc atctgctaac 2580

acgccgcctt cctgttcaac agcacgtctt cgctgtcgta cgcagcgccg gcagctccga 2640

gtacaactac cacgacccca tcttccgcga cgtcgtgagc accggccagc ccggcgacag 2700

cgtcacgatc cggttcatga cggacaatcc gggcccgtgg ttcctccatt gccacatcga 2760

cttccatctc gaggccggct tcgcgatcgt gttcgcggag gacgtgaatg atatcaagta 2820

cgcgaacccg gtcccgccgt cgtgggagga gctctgcccc atctacgaca agctcccgga 2880

gtccgaccat tagatgccga ccgggatccc ccgggctgca ggaattcgat atacaagctc 2940

ccggagtccg accattaggc tcgtggcgcg gactcctttg ggacatttct tccttcgttt 3000

ggttctgcta tcaaggacat ggaggctatg gtcaggttaa taccgcgcgg acatttggat 3060

aatattcagg caaatgtcgt ggcttcgagt gttggtccgc tcgtagtcta acagtaaaca 3120

ctctttggtc gtcctgcttg gttcgctata caccggtgct tgaatacgtc catatcgtta 3180

tgtattgtac agtaaatcat atattaacca atgtgaatcc ggacaacagg tatgtggatg 3240

acgaagcgac gatactcaga taccagtccc acacatgagt acaatatgaa tccagacccg 3300

cgtccaacat gtacagcaag aagtcccaag gctacgcgca tcctgatcac gaagtacaat 3360

acagcaatct ctagacaaca gcgaaccaag ctccacatga gaatccgatc aatcagccct 3420

agtcactcaa acagtggcag gaagatggcg tgtccgcaga agcgcgggta ggtgtg 3476

Claims (2)

1.一种构巢曲霉异源表达系统表达外源蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：

敲除构巢曲霉（1）mnn9基因和pepA基因，或（2）dppV基因和pepA基因，构建蛋白水解酶敲除突变菌株；所述外源蛋白为漆酶。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤中还包括通过敲除菌株中gpdA启动子、外源基因自身启动子、AMA1自主复制序列构建基因表达载体的步骤。

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