JP2006345817A - アスペルギルス・オリザの新規変異株及び選択マーカー - Google Patents

Abstract

【課題】 アスペルギルス・オリザ（麹菌）の栄養要求性変異株と、それに遺伝子導入するための選択マーカー遺伝子とを提供する。
【解決手段】 麹菌の変異処理により、胞子形成能が高く生育も良好な麹菌メチオニン要求性変異株met-30、麹菌ヒスチジン要求性変異株his-4及び麹菌ロイシン要求性変異株leu-5が得られた。またメチオニン要求性変異を相補する遺伝子metA、ヒスチジン要求性変異を相補するhisA及びANhisA、ロイシン要求性変異を相補するANleu2及びANleu2Bが得られた。特に麹菌ロイシン要求性変異株leu-5と選択マーカーANleu2との宿主−ベクター系は、麹菌へのマルチコピーの遺伝子導入を行え、液体培養及び固体培養の双方でタンパク質の高生産を可能とした。
【選択図】なし

Description

本発明は、麹菌アスペルギルス・オリザの形質転換用の選択マーカー遺伝子、それを含むベクター、及びこのベクターを用いた形質転換において宿主として用いることができるアスペルギルス・オリザ変異株に関する。また本発明は、この選択マーカーを用いてこの宿主を形質転換する方法、この方法により得られる形質転換体、及びこの形質転換体を用いてタンパク質を製造する方法に関する。

麹菌アスペルギルス・オリザ（Aspergillus oryzae）は、我が国で千年以上にわたって、清酒、醤油、味噌、味醂などの醸造食品の製造に利用されてきた食品産業上最も重要な微生物の一種である。

また、麹菌が菌体外にアミラーゼ、プロテアーゼなどの産業上有用な酵素を大量に分泌生産すること、及び麹菌が医薬のリード化合物となる可能性の高い低分子二次代謝産物を分泌生産することも多数報告されている。

さらに、麹菌の菌体とその生産物の安全性は高く、安全な微生物として米国FDAからGRAS (generally recognized as safe)に認定されており、安全な遺伝子組み換えの宿主としての実用化に適している（FDAのHP）。

実際に麹菌は、その高いタンパク質分泌生産能力を利用して、異種タンパク質生産の宿主として実用化されている。例えば、工業用酵素剤として用いられるリゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）のリパーゼが、麹菌を宿主として遺伝子組み換えにより生産されている(Biotechnology, 6, 1419 (1988)；特開昭 62-272988）。アスペルギルス・オリザは遺伝子組み換えを行うことにより、効率よく生産量が数百倍とする育種が可能である。

このような遺伝子組み換えやセルフクローニングにより麹菌に遺伝子導入するためには、形質転換が必須の工程となる。これは、麹菌には有性生活環が認められず、無性生活環で形成される分生子も多核であるため、交配のような古典遺伝学的手法による育種は、アスペルギルス・ニドランス（Aspergillus nidulans）やニュロスポラ・クラサ（Neurospora crassa）のような他の糸状菌と異なり、困難だからである（五味勝也等、蛋白質・核酸・酵素、３５、2552-2566, (1990)）。また、麹菌は全ての生活環で常に多核であるため、紫外線や変異原性薬剤処理などによる変異も困難だからである（五味勝也、新生化学実験講座１７ 微生物実験法（日本生化学会編）、東京化学同人、410-415, (1992)）。

遺伝子操作による麹菌の形質転換も非常に難しい（五味勝也、農化、７１，1013-1017 (1997)）。

麹菌の形質転換が困難である理由の１つに形質転換効率の低さがある。形質転換体が得られる頻度は、大腸菌では１マイクログラムDNAあたり10⁷個程度、出芽酵母では１マイクログラムDNAあたり10⁴個程度であるが、麹菌では１マイクログラムDNAあたり0.01から10個程度であり、非常に形質転換効率が低い（五味勝也、農化、７１，1013-1017 (1997)）。

さらに、麹菌の形質転換に利用できる選択マーカーは非常に少ない。特に、同属のアスペルギルス・ニドランスと較べても非常に少ない（五味勝也、農化、７１，1013-1017 (1997)）。

形質転換は、栄養要求性などの劣性の変異を有する宿主とそれを補う劣性の選択マーカーとの組み合わせを利用するものと、野生型宿主と薬剤耐性のような優性マーカーとの組み合わせを利用するものとに大別される。

一般に、糸状菌の中でも分生子が多核である菌種には栄養要求性変異を付与するのが難しい。通常の栄養増殖期は多核であるが、分生子では単核となるアスペルギルス・ニドランスでは多種多様な栄養要求性変異株が存在しているが、麹菌に栄養要求性を付与するのは特に難しい（五味勝也、農化、７１，1013-1017 (1997)）。

薬剤耐性などの優性マーカーについては、アスペルギルス・ニドランスでは、ベノミル、ブレオマイシン、フレオマイシン、ハイグロマイシン、オリゴマイシン、オーレオバシジンなどの薬剤に対する耐性マーカーを含むベクターと、これらの薬剤に感受性を示す宿主との宿主−ベクター系が構築されている。一方、麹菌はこれらの薬剤を始めとする多くの薬剤に耐性を示すことから薬剤耐性マーカーを利用した形質転換を行い難く、実際に優性マーカーを利用した形質転換は殆ど報告されていない。

麹菌の形質転換に用いる選択マーカーとしては、niaD及びptrAが主に利用されている。niaDは硝酸還元酵素をコードする遺伝子であり、硝酸還元能を付与する劣性の選択マーカーとして利用されている(Mol. Gen. Genet., 218, 99-104, (1989))。ptrAはチアゾール合成酵素をコードする遺伝子であり、ピリチアミン耐性を付与する優性の選択マーカーとして利用されている(Biosci. Biotechnol. Biochem., 64, 1416-1421, (2000))。

しかし、niaDを含むベクターやptrAを含むベクターは、導入遺伝子コピー数が１〜３コピー程度である。麹菌での遺伝子組み換えやセルフクローニングによるタンパク質生産するうえで、１〜３コピーより多くの遺伝子の導入が有利となる。よって、niaDやptrAよりもさらに多数のコピー数で、遺伝子導入できるベクターに供する選択マーカーが求められている。

また、この他に、麹菌で利用できる選択マーカーとして、argB(Enzyme Microbiol. Technol., 6, 386-389, (1984)), pyrG(Biochem. Biophys. Res. Commun., 112, 284-289, (1983)), amdS(Gene, 26, 205-221, (1983))、 sC(Gene, 84, 329-334, (1989))、adeA, adeB(Biosci. Biotechnol. Biochem., 68, 656-662, (2004))、hemA(Curr. Genet., 38, 291-298, (2000))が報告されている。しかし、これらのマーカー遺伝子は麹菌に由来するものではなかったり、使用できる宿主が限定されたり、胞子形成能や増殖速度の点で劣る。これらは実験室レベルでは利用できるが、早い増殖速度や高い胞子形成能が求められる産業分野では利用できない等の難点がある。

また、麹菌での組み換えタンパク質生産では、遺伝子導入用ベクターに供する選択マーカーの種類によって、当該ベクターによる宿主ゲノム中での遺伝子導入座位が異なる。遺伝子導入座位は、ベクター中の物質生産用のプロモーターの発現効率に大きな影響を与える。このため、物質生産を効率よく行う上では、使用するプロモーターの種類によって最適の選択マーカーを選択することが必要になる。よって、麹菌の物質生産においては、出来るだけ多くの選択マーカーを開発することにより幅広い物質生産が可能となる。

またグルコアミラーゼなどの加水分解酵素遺伝子のように、１遺伝子で物質生産が可能となるモノコンポーネント物質生産のために形質転換を行う場合には、一つの選択マーカーがあればよい。しかし、二次代謝産物の遺伝子組み換えによる物質生産などでは複数の生合成遺伝子を麹菌に導入する必要があることから、麹菌で実用できる選択マーカーを増やすことが求められている。これまで、麹菌の産業上の利用形態としては、酵素生産などのモノコンポーネント物質生産が主要な形態であった。今後、麹菌の形質転換用選択マーカーが増えれば、二次代謝産物などの複数の生合成遺伝子群を同一の麹菌宿主に導入することができ、当該産物の遺伝子組み換えによる大量生産が可能となる。これらの二次代謝産物等は生産量が少なく産業上利用されていないが、大量生産できれば医薬品などの産業分野に利用できる。

本発明は、アスペルギルス・オリザ（麹菌）を用いた遺伝子の導入に使用できる新規な選択マーカー遺伝子、このマーカー遺伝子を含むベクター、このベクターを用いて形質転換できる麹菌変異株、この変異株の形質転換方法、この方法により得られる形質転換体、及びこの形質転換体を用いてタンパク質を製造する方法を提供することを課題とする。

上記課題を解決するために本発明者らは研究を重ね、アスペルギルス・オリザの変異処理により、生育がよく、かつ胞子形成能が高いメチオニン要求性変異株、ヒスチジン要求性変異株、及びロイシン要求性変異株をそれぞれ得た。

また、アスペルギルス・オリザや、アスペルギルス・ニドランスのゲノムから、これらの栄養要求性変異株を相補できる遺伝子を見出し、さらにこれらの遺伝子を選択マーカーとしてそれぞれ含むベクターを用いて上記変異株を形質転換すれば、目的遺伝子が効率よく発現することを見出した。

本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、下記の麹菌変異株などを提供する。

項１． アスペルギルス・オリザ（Aspergillus oryzae）のメチオニン要求性変異株。

項２． 以下の(1)又は(2)のマーカー遺伝子。
(1) 配列番号１で示される塩基配列からなるマーカー遺伝子。
(2) 配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシスタチオニン-g-シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなるマーカー遺伝子。

項３． 項２記載のマーカー遺伝子を含むベクター。

項４． 下記の(a)又は(b)のベクターを用いて項１に記載のメチオニン要求性変異株を形質転換する工程と、項２に記載のマーカー遺伝子を指標にして形質転換体を選択する工程とを含む、形質転換体の製造方法。
(a) 項３に記載のベクターであって、さらに目的遺伝子を含むもの
(b) 項３に記載のベクター、及びこれとは異なるベクターであって目的遺伝子を含むもの
項５． 項４の方法により得られる形質転換体。

項６． アスペルギルス・オリザ（Aspergillus oryzae）のヒスチジン要求性変異株。

項７． 以下の(3)又は(4)のマーカー遺伝子
(3) 配列番号２で示される塩基配列からなるマーカー遺伝子。
(4) 配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつホスホリボシル-5-アミノ-1-ホスホリボシル-4-イミダゾールカルボキシアミドイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなるマーカー遺伝子。

項８． 以下の(5)又は(6)のマーカー遺伝子
(5) 配列番号３で示される塩基配列からなるマーカー遺伝子。
(6) 配列番号３で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつホスホリボシル-5-アミノ-1-ホスホリボシル-4-イミダゾールカルボキシアミドイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなるマーカー遺伝子。

項９． 項７又は８に記載のマーカー遺伝子を含むベクター。

項１０． 下記の(c)又は(d)のベクターを用いて項６に記載のヒスチジン要求性変異株を形質転換する工程と、項７又は８に記載のマーカー遺伝子を指標にして形質転換体を選択する工程とを含む、形質転換体の製造方法。
(c) 項９に記載のベクターであって、さらに目的遺伝子を含むもの
(d) 項９に記載のベクター、及びこれとは異なるベクターであって目的遺伝子を含むもの
項１１． 項１０に記載の方法により得られる形質転換体。

項１２． 以下の(7)又は(8)のマーカー遺伝子
(7) 配列番号４で示される塩基配列からなるマーカー遺伝子。
(8) 配列番号４で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつb-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなるマーカー遺伝子。

項１３． 以下の(9)又は(10)のマーカー遺伝子
(9) 配列番号５で示される塩基配列からなるマーカー遺伝子。
(10) 配列番号５で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつb-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなるマーカー遺伝子。

項１４． 項１２又は項１３に記載のマーカー遺伝子を含むベクター。

項１５． 下記の(e)又は(f)のベクターを用いてアスペルギルス・オリザのロイシン要求性変異株を形質転換する工程と、項１２又は１３に記載のマーカー遺伝子を指標にして形質転換体を選択する工程とを含む、形質転換体の製造方法。
(e) 項１４に記載のベクターであって、さらに目的遺伝子を含むもの
(f) 項１４に記載のベクター、及びこれとは異なるベクターであって目的遺伝子を含むもの
項１６． 項１５に記載の方法により得られる形質転換体。

項１７． 項５、１１、又は１６に記載の形質転換体を培養する工程と、培養物から目的遺伝子がコードするタンパク質を回収する工程とを含むタンパク質の製造方法。

本発明の麹菌メチオニン要求性変異株、麹菌ヒスチジン要求性変異株、及び麹菌ロイシン要求性変異株は、胞子形成能が高く生育も良好である。このため、これらの変異株は、これらの栄養要求性を相補できる選択マーカー遺伝子を用いて目的遺伝子を導入して目的タンパク質を生産するための宿主として、産業上の実用性が高い。

また、メチオニン要求性変異株を相補する遺伝子として、metAが得られた。ヒスチジン要求性変異株を相補する遺伝子としてhisA及びANhisAが得られた。麹菌変異株のロイシン要求性変異株を相補する遺伝子としてANleu2及びANleu2Bが得られた。

metA、hisA、ANhisA、ANleu2、又はANleu2Bは、それぞれ麹菌内で機能できる任意のプロモーター及びターミネーターと組み合わせて使用することにより、任意の目的遺伝子をメチオニン要求性変異株、ヒスチジン要求性変異株、又はロイシン要求性変異株に導入する際の選択マーカーとして使用できる。これにより、産業上実用性の高い麹菌の宿主−ベクター系の開発に成功した。

metA, hisA, ANhisA, ANleu2、及びANleu2Bは、Aspergillus属由来の遺伝子に限定されず、他の糸状菌、担子菌、キノコ、植物、放線菌、バクテリア、哺乳類、昆虫などの種々の生物由来の遺伝子を用いた形質転換に際して選択マーカーとして使用できる。このため、他生物由来の機能性低分子の遺伝子組み換えによる生産も可能となり、種々のポリぺプチド、機能性ペプチド、糖ペプチド、脂質、糖脂質のように医薬、機能性食品、医薬部外品などとして産業上価値の高い物質を、安全性の高い麹菌で産業的に生産できるようになる。

また、この宿主−ベクター系は、異種生物由来の遺伝子を含む遺伝子組み換えによる物質生産だけでなく、麹菌のみの遺伝子組み換えによる物質生産も行える。麹菌の遺伝子のみを用いたセルフクローニングによる物質生産は食品産業でのパブリックアクセプタンスが高いことから、本発明の宿主−ベクター系は食品産業において極めて有用である。

麹菌の形質転換に使用できる優性の選択マーカー遺伝子として、従来ptrAが知られている。本発明により新しい選択マーカー遺伝子が見出されたため、これらの選択マーカーを2種以上組み合わせて、2種以上の遺伝子を宿主に導入することができるようになった。麹菌は様々な機能性低分子を生合成できるところ、このような機能性低分子化合物は、通常、複数の生合成酵素による生合成経路により生合成される。多数の選択マーカーを使用することによりこれらの複数の生合成遺伝子を麹菌に導入でき、得られた形質転換体により機能性低分子を生産できるようになる。

中でも、ANleu2は、これを選択マーカーとして含むベクターを用いてロイシン要求性変異株を形質転換する場合に、このベクターを最大約30コピー宿主に導入することができ、非常に効率的な物質生産を行うことができる。さらに、ANleu2は、別のベクターに含まれる目的遺伝子をコトランスフォーメーションにより共に宿主に導入する際の選択マーカーとして用いる場合にも、目的遺伝子を宿主に導入することができるというメリットがある。また、コトランスフォーメーションにより目的遺伝子をマルチコピー導入することができる。

以下、本発明を詳細に説明する。
（１）メチオニン要求性麹菌変異株、ヒスチジン要求性麹菌変異株及びロイシン要求性変異株
本発明の第１のアスペルギルス・オリザ（麹菌）変異株は、その生育にメチオニンを要求するものである。この変異株は、プレート培養の場合、例えばツァペックドックス培地中に通常10nM以上、好ましくは1mM以上のL-メチオニンが含まれていれば生育するものである。

本発明の第２のアスペルギルス・オリザ（麹菌）変異株は、その生育にヒスチジンを要求するものである。この変異株は、プレート培養の場合、例えばツァペックドックス培地中に通常10nM以上、好ましくは1mM以上のL-ヒスチジンが含まれていれば生育するものである。

本発明の第３のアスペルギルス・オリザ（麹菌）変異株は、その生育にロイシンを要求するものである。この変異株は、プレート培養の場合、例えばツァペックドックス培地中に通常10nM以上、好ましくは1mM以上のL-ロイシンが含まれていれば生育するものである。

本発明の麹菌メチオニン要求性変異株、麹菌ヒスチジン要求性変異株及びロイシン要求性変異株は、例えば以下のようにして取得できる。

胞子形成培地で生育させた麹菌を界面活性剤溶液に懸濁させ、ガラスフィルターで麹菌分生子を回収する。この麹菌分生子に対して、数分間紫外線を照射して死滅率約99%となるように変異処理を行う。変異処理した麹菌を胞子形成培地で生育、増幅させ、上記方法で麹菌分生子を回収し、変異処理麹菌群とする。

この分生子を、硝酸塩を単一窒素源とするツァペックドックス液体培地において３０℃、１２時間液体培養し、発芽した菌糸をガラスフィルターで除き、発芽しない濾液中の分生子のみを回収し、得られた分生子をさらにツァペックドックス液体培地において３０℃で１２時間液体培養する。この操作を５度繰り返し、硝酸塩を単一窒素源とするツァペックドックス液体培地で生育不能な麹菌変異株の分生子を濃縮する。得られた分生子を、窒素源として硝酸塩以外の窒素含有物質を要求する株が濃縮される。

得られる麹菌変異株の分生子を単離して、硝酸塩を単一窒素源とするツァペックドックスプレート培地で生育できず、かつカザミノ酸添加したツァペックドックスプレート培地で生育可能な麹菌変異株を単離する。これにより、窒素源としてアミノ酸を要求する株が濃縮される。

得られる麹菌株の中から、硝酸塩を単一窒素源とするツァペックドックス液体培地で生育できず、かつL-メチオニン、L-ヒスチジン又はL-ロイシンを、例えば10nM添加したツァペックドックスプレート培地で生育可能な麹菌変異株を単離する。

このようにして得られるメチオニン要求性変異株は、メチオニン要求性マーカーとピリチアミン感受性マーカー(Biosci. Biotechnol. Biochem., 64, 1416-1421, (2000))との２種類の選択マーカーを利用して少なくとも２種の遺伝子による形質転換が可能である。また得られたヒスチジン要求性変異株は、ヒスチジン要求性マーカーとピリチアミン感受性マーカー(Biosci. Biotechnol. Biochem., 64, 1416-1421, (2000))との２種類の選択マーカーを利用して少なくとも２種の遺伝子による形質転換が可能である。さらに得られたロイシン要求性変異株は、ロイシン要求性マーカーとピリチアミン感受性マーカー(Biosci. Biotechnol. Biochem., 64, 1416-1421, (2000))との２種類の選択マーカーを利用して少なくとも２種の遺伝子による形質転換が可能である。

麹菌メチオニン要求性変異株、ヒスチジン要求性変異株又はロイシン要求性変異株は、この他、エチルメタンスルホン酸(EMS)などの変異原性を有する化学物質を用いた変異導入処理法、外来性又は内在性トランスポゾンや任意の遺伝子断片を麹菌ゲノム中に導入することにより、メチオニン、ヒスチジンあるいはロイシン生合成系遺伝子を不活化させる方法等によって取得することもできる。
（２）マーカー遺伝子
本発明の第１のマーカー遺伝子は、下記の(1)、又は(2)のマーカー遺伝子である。
(1) 配列番号１で示される塩基配列からなるマーカー遺伝子。
(2) 配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシスタチオニン-g-シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなるマーカー遺伝子。

上記(1)、又は(2)のマーカー遺伝子は、麹菌メチオニン耐性株のメチオニン耐性を相補できるため、本発明の麹菌メチオニン耐性株に遺伝子導入する際の選択マーカーとして使用できる。なお、配列番号１は、後述する、麹菌ゲノム由来の配列番号６の塩基番号2183〜4060（metA遺伝子）に該当する。

本発明の第２のマーカー遺伝子は、下記の(3)、又は(4)のマーカー遺伝子である。
(3) 配列番号２で示される塩基配列からなるマーカー遺伝子。
(4) 配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつホスホリボシル-5-アミノ-1-ホスホリボシル-4-イミダゾールカルボキシアミドイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなるマーカー遺伝子。

上記(3)、又は(4)のマーカー遺伝子は、麹菌ヒスチジン耐性株のヒスチジン耐性を相補できるため、本発明の麹菌ヒスチジン耐性株に遺伝子導入する際の選択マーカーとして使用できる。なお、配列番号２は、後述する、麹菌ゲノム由来の配列番号７の塩基番号1872〜2963（hisA遺伝子）に該当する。

本発明の第３のマーカー遺伝子は、下記の(5)、又は(6)のマーカー遺伝子である。
(5) 配列番号３で示される塩基配列からなるマーカー遺伝子。
(6) 配列番号３で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつホスホリボシル-5-アミノ-1-ホスホリボシル-4-イミダゾールカルボキシアミドイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなるマーカー遺伝子。

上記(5)、又は(6)のマーカー遺伝子は、麹菌ヒスチジン耐性株のヒスチジン耐性を相補できるため、本発明の麹菌ヒスチジン耐性株に遺伝子導入する際の選択マーカーとして使用できる。なお、配列番号３は、後述する、アスペルギルス・ニドランスゲノム由来の配列番号８の塩基番号1741〜2742（ANhisA遺伝子）に該当する。

本発明の第４のマーカー遺伝子は、下記の(7)、又は(8)のマーカー遺伝子である。
(7) 配列番号４で示される塩基配列からなるマーカー遺伝子。
(8) 配列番号４で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなるマーカー遺伝子。

上記(7)、又は(8)のマーカー遺伝子は、麹菌ロイシン耐性株のロイシン耐性を相補できるため、本発明の麹菌ロイシン耐性株に遺伝子導入する際の選択マーカーとして使用できる。なお、配列番号４は、後述する、アスペルギルス・ニドランスゲノム由来の配列番号９の塩基番号320〜1549（ANleu2遺伝子）に該当する。

本発明の第５のマーカー遺伝子は、下記の(9)、又は(10)のマーカー遺伝子である。
(9) 配列番号５で示される塩基配列からなるマーカー遺伝子。
(10) 配列番号５で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなるマーカー遺伝子。

上記(9)、又は(10)のマーカー遺伝子は、麹菌ロイシン耐性株のロイシン耐性を相補できるため、本発明の麹菌ロイシン耐性株に遺伝子導入する際の選択マーカーとして使用できる。なお、配列番号５は、後述する、アスペルギルス・ニドランスゲノム由来の配列番号10の塩基番号492〜1913（ANleu2B遺伝子）に該当する。

(1)及び(3)のマーカー遺伝子は、例えば実施例に記載されているショットガンクローニングにより麹菌ゲノムからクローニングすることができる。概説すれば、麹菌ゲノムDNAを制限酵素で切断した後、分断化した麹菌ゲノムDNAをベクターに導入して麹菌ゲノムライブラリーを作製する。これを用いて、麹菌メチオニン要求性変異株又は麹菌ヒスチジン要求性変異株を形質転換し、形質転換体のゲノムDNAを制限酵素で切断し、分子内結合させる。これをインバースPCR(Trigrlia T et al, Nucl. Acids. Res., 16, 8186, (1988))の鋳型ライブラリーとして、上記ベクター中の配列に基づき設計したプライマーを用いて遺伝子増幅をする。この遺伝子の一部をシーケンスし、Saccharomyce cerevisiae由来の公知のシスタチオニン-g-シンターゼ遺伝子及びホスホリボシル-5-アミノ-1-ホスホリボシル-4-イミダゾールカルボキシアミドイソメラーゼ遺伝子の塩基配列 (http://db.yeastgenome.org/cgi-bin/SGD/seqTools)とそれぞれ相同性の高いオープンリーディングフレームを選択すればよい。

(1)及び(3)のポリヌクレオチドは、この他、麹菌ゲノムライブラリーを鋳型としてPCRを行うことにより取得できる。このとき、(1)のマーカー遺伝子では配列番号６（配列番号１をオープンリーディングフレームとして含む）の配列をもとに設計したプライマーにより遺伝子増幅し、(3)のマーカー遺伝子では配列番号７（配列番号２をオープンリーディングフレームとして含む）の配列をもとに設計したプライマーにより遺伝子増幅をすればよい。

また(1)及び(3)のポリヌクレオチドは、配列番号１、又は配列番号２に基づき設計したプローブを用いたハイブリダイゼーションにより麹菌ゲノムライブラリーをスクリーニングすることによっても取得できる。さらに化学合成によっても取得できる。

(5)のポリヌクレオチドは、麹菌hisAホスホリボシル-5-アミノ-1-ホスホリボシル-4-イミダゾールカルボキシアミドイソメラーゼ遺伝子と58%の相同性を示す、ホスホリボシル-5-アミノ-1-ホスホリボシル-4-イミダゾールカルボキシアミドイソメラーゼをコードする遺伝子であり、ANhisAと命名する。また、(7)のポリヌクレオチドは、β−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であり、ANleu2と命名する。(9)のポリヌクレオチドも、β−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であり、ANleu2Bと命名する。

(5)のマーカー遺伝子は、アスペルギルス・ニドランス（Aspergillus nidulans）ゲノムデータベース(http://www.broad.mit.edu/annotation/fungi/aspergillus/index.html)中から、hisAと相同性の高く、ホスホリボシル-5-アミノ-1-ホスホリボシル-4-イミダゾールカルボキシアミドイソメラーゼをコードすると予測されるオープンリーディングフレームを検索することにより得られる。また、(7)及び(9)のマーカー遺伝子は、アスペルギルス・ニドランスゲノムデータベース中から、麹菌β−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（配列番号13の塩基番号1893〜3324）と相同性が高く、β−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードすると予測される遺伝子を検索することにより得られる。

また、(7)及び(9)のマーカー遺伝子は、アスペルギルス・ニドランスゲノムライブラリーを鋳型としたPCRにより得ることもできる。この場合、(7)のマーカー遺伝子では配列番号9（配列番号4をオープンリーディングフレームとして含む）の配列をもとに設計したプライマーにより遺伝子増幅し、(9)のマーカー遺伝子では配列番号10（配列番号5をオープンリーディングフレームとして含む）の配列をもとに設計したプライマーにより遺伝子増幅をすればよい。また、(7)及び(9)のマーカー遺伝子は、それぞれ配列番号4及び配列番号5に基づき設計されたプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、アスペルギルス・ニドランスゲノムライブラリーをスクリーニングすることによっても得ることができる。

本発明の(1)〜(10)のマーカー遺伝子は、化学合成によっても取得できる。

本発明において、「あるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」は、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual（Sambrookら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、1989年）に記載の方法等によって得ることができる。本発明において「ストリンジェント」な条件としては、６×SSC（standard saline citrate; 1×SSC＝0.15M NaCl, 0.015M sodium citrate）、0.5% SDS及び50%ホルムアミドの溶液中において42℃で一夜加温した後、0.1×SSC、0.5% SDSの溶液中において68℃で30分間洗浄した場合にそのポリヌクレオチドから脱離しない条件が挙げられる。

(2)、(4)、(6)、(8)、及び(10)の各マーカー遺伝子には、麹菌又はアスペルギルス・ニドランス以外の生物種のゲノム上に存在する対応遺伝子や、天然又は非天然のアレル変異体などが含まれる。他生物種のポリヌクレオチドは、例えばNCBIのblastサーチ(ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）により選抜できる。
（３）ベクター
本発明のベクターは、選択マーカーとして上記(1)〜(10)のいずれかのマーカー遺伝子を含むものである。

これらは、宿主で機能できるプロモーター及びターミネーターとともにベクターに含まれていればよい。ベクター中のマーカー遺伝子、プロモーター、及びターミネーターの位置関係は特に限定されないが、通常、ターミネーターはマーカー遺伝子より下流に存在していればよい。本発明のベクターは、特に麹菌内で発現できるプロモーター及びターミネーターにより発現できるようにベクター内に含まれることが好ましい。この場合、プロモーター及びターミネーターは、他生物由来のプロモーター及びターミネーターであってもよく、また麹菌由来の他遺伝子のプロモーター及びターミネーターであってもよい。麹菌由来の高発現プロモーターとして、例えばsodM（特開2001-224381）、 glaB（特開2000-245465、特開平11-243965）、 及びmelO（特開2001-046078）などが挙げられる。また、麹菌由来のターミネーターとしては、glaBのターミネーター（特開2000-245465、特開平11-243965）などが挙げられる。

選択マーカーが形質転換培養条件下で効率的に転写されるように、各選択マーカーはその選択マーカーの本来のプロモーター及びターミネーターとともにベクターに含まれることが最も好ましい。即ち、(1)のmetA遺伝子は、配列番号６の一部として、metA遺伝子のプロモーター(配列番号６の塩基番号1〜2182)及びターミネーター(配列番号６の塩基番号4061-4400)とともにベクター中に含まれることが好ましい。同様に、(3)のhisA遺伝子は、配列番号７の一部として、hisA遺伝子のプロモーター(配列番号７の塩基番号1〜1871)及びターミネーター(配列番号７の塩基番号2964〜3500)とともにベクターに含まれることが好ましい。同様に、(5)のANhisA遺伝子は、配列番号８の一部として、ANhisA遺伝子のプロモーター(配列番号８の塩基番号1〜1740)及びターミネーター(配列番号８の塩基番号2743〜3000)とともにベクターに含まれていることが好ましい。同様に、(7)のANleu2遺伝子は、配列番号９の一部として、ANleu2遺伝子のプロモーター(配列番号９の塩基番号1〜319)及びターミネーター(配列番号９の塩基番号1550〜3560)とともにベクター中に含まれていることが好ましい。同様に、(9)のANleu2B遺伝子は、配列番号10の一部として、ANleu2B遺伝子のプロモーター(配列番号１０の塩基番号1〜491)及びターミネーター(配列番号１０の塩基番号1914〜3920)とともにベクターに含まれていることが好ましい。

また、metA, hisA, ANhisA, ANleu2，ANleu2B及びそれらの変異体遺伝子は麹菌に限定されず、対応する栄養要求性を付与した種々のアスペルギルス属糸状菌、ペニシリウム属糸状菌、トリコデルマ属糸状菌、ノイロスポラ属糸状菌、リゾップス属糸状菌、ムコール属糸状菌、モナスカス属糸状菌のような糸状菌；サッカロマイセス属酵母、シゾサッカロマイセス属酵母、ピキア属酵母、カンジダ属酵母のような酵母を宿主とする遺伝子導入に際しても選択マーカー遺伝子として使用できる。この他、植物、キノコ、担子菌、放線菌、動物、昆虫、細菌、古細菌の生細胞においても選択マーカーとして使用できる。

この場合、metA, hisA, ANhisA, ANleu2、ANleu2B及びそれらの変異体遺伝子は、上記の生物種の細胞内で機能できるプロモーター及びターミネーターと組み合わせて使用すればよい。また、上記説明した、これらの遺伝子の本来のプロモーター及びターミネーターと組み合わせて使用しても上記の異種生物種内で選択マーカーとして機能できる。

目的遺伝子を発現させるためのプロモーターやターミネーターが異種生物由来のヌクレオチド配列であるベクターとして、例えば大腸菌ベクターであって麹菌内でも機能できるもの等が挙げられる。
マーカー遺伝子及びそれに対するプロモーター及びターミネーターだけでなく、生産しようとするタンパク質をコードする目的遺伝子を発現させるためのプロモーターやターミネーターも麹菌由来のヌクレオチド配列であるベクターは、麹菌由来の目的遺伝子を発現させる目的遺伝子発現カセットとしてセルフクローニングに使用できる。目的遺伝子発現カセットにおいて、麹菌由来のプロモーター、麹菌由来の目的遺伝子、麹菌由来のターミネーターの連結順序は特に限定されないが、通常、ターミネーターは目的遺伝子より下流に存在していればよい。

麹菌由来のプロモーター及びターミネーターの例は前述したとおりである。
目的遺伝子は、特に限定されないが、有用なタンパク質として例えばフィターゼ、リアーゼ、ペクチナーゼおよび他のペクチン分解酵素、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、イソメラーゼ、インベルターゼ、トランスフェラーゼ、リボヌクレアーゼ、キチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、カタラーゼ、ラッカーゼ、フェノールオキシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ペルオキシダーゼ、リパーゼ、ヒドロラーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼのようなタンパク質分解酵素、アミノペプチダーゼ、又はカルボキシペプチダーゼ遺伝子等が挙げられる。

セルフクローニングに使用するには、麹菌ESTデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｒｉｂ．ｇｏ．ｊｐ／ｋｅｎ／ＥＳＴ／ｄｂ／ｂｌａｓｔ．ｈｔｍｌ）又は麹菌ゲノムデータベースを検索することにより得られる麹菌由来の上記遺伝子を使用すればよい。

本発明において、目的遺伝子には、タンパク質などをコードするものに限らず、アンチセンス、コサプレッション、又はRNAiのようなジーンサイレンシング機能を有するポリヌクレオチドも包含される。これらのポリヌクレオチドは、産業上好ましくない酵素や低分子の生産を抑制することで、産業上有用な麹菌を育種する場合に利用可能である。

ベクター中には目的遺伝子が１種単独で含まれていてもよく、又は２種以上含まれていてもよい。

また、後述するコトランスフォーメーションにより宿主に目的遺伝子を導入する場合は、本発明のベクターには、目的遺伝子が含まれていなくてもよい。
（４）形質転換方法・形質転換体
上記説明した本発明のベクターを用いて、上記説明した本発明のメチオニン要求性変異株、ヒスチジン要求性変異株、又はロイシン要求性変異株を形質転換し、各ベクターに含まれるマーカー遺伝子を指標にして形質転換体を選択することにより、目的遺伝子を含むベクターが導入された形質転換体を得ることができる。

ベクターとしては、本発明のマーカー遺伝子及び目的遺伝子を含むベクターを用いるか、又は本発明のマーカー遺伝子を含むベクターと目的遺伝子を含むベクターとを併用することができる。

形質転換方法は、特に限定されず、麹菌の形質転換を行える公知の方法を採用できる。このような公知の方法として、PEG-カルシウム法、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、アグロバクテリウム法、遺伝子銃法などが挙げられる。

本発明のマーカー遺伝子を選択マーカーとして含み、さらに目的遺伝子も発現可能に含むベクターを用いて宿主を形質転換することにより、宿主に目的遺伝子を導入することができる。また、以下に説明するようなコトランスフォーメーションによっても目的遺伝子を宿主に導入することができる。

また糸状菌の形質転換方法としてはコトランスフォーメーション法がアスペルギルス属糸状菌で多数報告されている(Mol. Gen. Genet., 209, 71-77, (1987)), （特開昭62-272988）。コトランスフォーメーション法とは、選択マーカーを含むプラスミドと、選択マーカーを含まない別個独立のプラスミドとを、同時に用いた形質転換を行う場合に、選択マーカーを有するプラスミドに加えて選択マーカーを含まない別個独立のプラスミドも同時に糸状菌染色体DNAへ形質転換される現象である。特に、マルチコピーで形質転換を可能とする選択マーカーにおいてコトランスフォーメーションが起き易い
例えば、本発明のマーカー遺伝子ANleu2を選択マーカーとした場合、マーカー遺伝子が最大30コピーのマルチコピーで導入されることから、コトランスフォーメーションが起き易い。よって、ANleu2を選択マーカーとして使用すれば、１又は複数の高発現させたい目的遺伝子を、選択マーカーを含むベクターとは別のプラスミドにサブクローニングした状態で、１つの選択マーカーにより同時に麹菌に導入できる。また、複数の目的遺伝子をそれぞれ含む複数のベクターを、選択マーカーを含むベクターとコトランスフォーメーションすることもできる。

宿主に導入したい遺伝子が大きすぎたり、遺伝子数が多すぎる結果、ベクターのサイズが大きくなりすぎて形質転換効率が低下する場合に、コトランスフォーメーションを行うことができれば、形質転換効率を向上させることができる。また、麹菌用のベクターはマルチクローニングサイトが最適化されていないため、選択マーカーと目的遺伝子とを同じプラスミドにサブクローニングしようとする場合に制限酵素サイトの選択に手間取る。この場合に、コトランスフォーメーションを行うことができれば、麹菌への形質転換効率がよくなり、ハイスループットに麹菌での遺伝子発現を確認できるようになる。

本発明のマーカー遺伝子を用いた形質転換に際しては、要求性変異株を、その栄養要求性を相補するマーカー遺伝子を選択マーカーとして含むベクターで形質転換した後、さらにチアゾール合成酵素遺伝子(ptrA)のような他のマーカー遺伝子を選択マーカーとするベクターで形質転換することができる。

形質転換体を選択するに当たっては、ツアペックドックス培地のような合成培地であって、メチオニン、ヒスチジン、又はロイシンを含まない培地上に生育する株を選択すればよい。
（５）タンパク質の製造方法
タンパク質をコードする目的遺伝子を含むベクターが導入された形質転換体を用いれば、宿主にタンパク質を効率よく生産させることができる。即ち、本発明のタンパク質の生産方法は、上記説明した本発明の形質転換体を培養する工程と、培養産物から目的遺伝子がコードするタンパク質を回収する工程とを含む方法である。

形質転換体を培養する培地は、宿主である麹菌の培養に適した培地とすればよい。例えば、ポテトデキストロース培地（ニッスイ社）または最少培地（２%グルコース（又はスターチ）、0.3%ＮａＮＯ_３、0.2%ＫＣｌ、0.1%ＫＨ_２ＰＯ_４，0.05%ＭｇＳＯ_４、0.002%ＦｅＳＯ_４、ｐＨ6.0）等を使用できる。培地は、固体培地でも液体培地でもよい。なお、固体培地にする場合は、例えば1.5%程度の寒天を添加した培地を用いることができる。

培養温度は、形質転換体の生育可能温度範囲であればよく、例えば25〜42℃程度が挙げられる。培養時間は、その他の条件によって異なるが、通常２〜７日間程度、特に３〜５日間程度とすればよい。

培養終了後、目的遺伝子が分泌タンパク質の遺伝子である場合は、培養上清を回収すればよい。寒天培地の場合も培養上清としての寒天培地を回収すればよい。また、目的遺伝子が細胞内にタンパク質を生産するものである場合は、濾紙、ガラスフィルターなどで集菌し、通常は、液体窒素で凍結粉砕したり、海砂Ｂですり潰したりすればよい。また、別法としてポリトロンやホモジナイザーなども菌体の破砕に利用できる。得られた破砕液を5000〜12000g程度で５〜20分間程度遠心分離し、上清を回収すればよい。

さらに、これらの上清を、公知のタンパク質精製方法、例えばイオン交換、疎水、ゲルろ過、アフィニティなどの各種クロマトグラフィーに供することにより目的タンパク質を回収することができる。

これにより得られるタンパク質には、単純タンパク質の他に、糖タンパク質、リポタンパク質、リンタンパク質のような複合タンパク質も含まれる。
実施例
以下、本発明を実施例及び試験例を示してより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。

麹菌メチオニン要求性変異株、麹菌ヒスチジン要求性変異株、及び麹菌ロイシン要求性変異株の取得
麹菌Aspergillus oryzae O-1013 (FERM P-16528として産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている)からメチオニン、ヒスチジン及びロイシン要求性変異を有する株の育種を試みた。変異導入法としては公知の紫外線照射法を採用した。

麹菌O-1013株を胞子形成プレート培地（6% malto extract, 2% yeast extract, 2% agar）にて３０℃で３日間培養した。プレート上に滅菌水を適量加え、コンラッジ棒で胞子と菌体の混合物を懸濁した。当該懸濁液から菌糸を除くため、3G3ガラスフィルターで濾過した。濾液の胞子懸濁液を2000rpmで５分間の遠心処理により濃縮し、胞子濃度2×10⁶/mlとなるように滅菌水中に再懸濁した。

この胞子液2mlを直径5cmのプレートに入れ、約１５cm離れた距離から紫外線を照射した。30秒照射するごとに100μlずつサンプリングしつつ、紫外線照射を約９分間継続した。サンプリングした麹菌は３０分間室温で遮光した。サンプリング液の一部を用いて麹菌の死滅率を測定し、死滅率が９９%の画分を選択して、その画分を胞子形成培地において３０℃で９６時間培養することにより胞子を調製した。

2X10⁶/ml濃度の胞子調製液2mlを最少培地ツァペックドックス培地（グルコース３%、硫酸マグネシウム0.1%、リン酸水素２カリウム0.1%、塩化カリウム0.05%、硝酸ナトリウム0.3%、硫酸鉄0.01mM、pH6.3）100ml中において３０℃で１２時間液体培養した。この培地で発芽生育した菌体は栄養要求性変異株でないため、栄養要求性変異株濃縮のため、生育菌体を3G3ガラスフィルターで除去した。濾液中の非発芽胞子画分を2000rpmで５分間の遠心処理により沈降した分生子を集め、再度当該分生子を最少培地ツァペックドックス培地100ml中において３０℃で１２時間液体培養した。この濃縮操作を５回繰り返し、５回終了後の麹菌胞子を単離した。

単離には、ポテトデキストロース寒天培地（ニッスイ社製）を使用した。上記単離株のうち最少培地ツァペックドックス培地（グルコース３%、硫酸マグネシウム0.1%、リン酸水素２カリウム0.1%、塩化カリウム0.05%、硝酸ナトリウム0.3%、硫酸鉄0.01mM、1.5%寒天、pH6.3）で生育できず、0.1%カザミノ酸を含む同培地で生育可能なアミノ酸要求性変異麹菌株を３００株選択した。

この１００株のアミノ酸要求性変異株の中で、最少培地ツァペックドックス培地で生育できず、0.1% L-メチオニン、0.1% L-ヒスチジン又は0.1% L-ロイシンを含む同培地で生育可能な株をそれぞれについて単離した。この中で最も生育がよく、胞子形成能が高い株をメチオニン要求性変異麹菌株、ヒスチジン要求性変異麹菌株又はロイシン要求性変異株として選択した。得られたメチオニン要求性変異株をAspergillus oryzae met-30、ヒスチジン要求性変異株をAspergillus oryzae his-4、さらにロイシン要求性変異麹菌株は、Aspergillus oryzae leu-5と命名した。

ロイシン要求性変異麹菌株Aspergillus oryzae leu-5については、特許生物寄託センターにFERM P−20079として寄託している（寄託日：平成16年6月7日）。

麹菌メチオニン要求性変異、麹菌ヒスチジン要求性変異及び麹菌ロイシン要求性変異を相補する遺伝子のショットガンクローニング
麹菌メチオニン要求性変異株、麹菌ヒスチジン要求性変異株、及び麹菌ロイシン要求性変異株を相補できる遺伝子探索のため、ショットガンクローニングを行った。

野生株の麹菌Aspergillus oryzae O-1013株をDPY培地(2% dextrin, 1% peptone, 0.5% yeast extract)を用いて30℃で3日間液体培養した。菌体をガーゼ濾過により回収し、麹菌菌体を液体窒素で破砕して、抽出バッファー（50mM EDTA, 1% SDS）で抽出した。これに対してフェノール-クロロホルム抽出して、最後にエタノール沈殿を行い、麹菌ゲノムDNAとした。

50μlの反応系において、この麹菌ゲノムDNA 10μgあたりSau3AI 5UNITS（ニッポンジーン）を加え37℃で5分間反応させた。得られたDNAは約4 kb程度の断片であることがアガロースゲル電気泳動により確認された。T4 DNAリガーゼを用いて、このSau3AI消化物 100μgと大腸菌プラスミドpUC118（既にBamHI消化後、バクテリアアルカリホスファターゼ（宝バイオ）にて脱リン酸化したもの）1μgとを16℃で一晩反応させることによりライゲーションさせた。これを麹菌ゲノムDNAライブラリーとした。

次に、麹菌メチオニン要求性変異株met-30株、麹菌ヒスチジン要求性変異株his-4株、及び麹菌ロイシン要求性変異株leu-5株を、それぞれDPY培地(2% dextrin, 1% peptone, 0.5% yeast extract)を用いて30℃で3日間液体培養し、上記の麹菌ゲノムライブラリーで形質転換した。形質転換は、プロトプラスト−カルシウム−PEG法を採用し常法に従い行った。詳しくは、プロトプラスト化酵素として宝バイオのヤタラーゼと半井化学のセルラーゼとを用い、プロトプラストの等張液には0.8M NaClを用いた。麹菌メチオニン要求性変異株、麹菌ヒスチジン要求性変異株及び、麹菌ロイシン要求性変異株の各プロトプラスト5x10⁷/mlに対して、上記麹菌ゲノムライブラリー10μgをそれぞれ作用させることにより、麹菌メチオニン要求性変異株、麹菌ヒスチジン要求性変異株及び麹菌ロイシン要求性変異株を形質転換した。

形質転換体は、ツァペックドックス最少培地（グルコース３%、硫酸マグネシウム0.1%、リン酸水素２カリウム0.1%、塩化カリウム0.05%、硝酸ナトリウム0.3%、硫酸鉄0.00001M、0.8M NaCl、1.5%寒天、pH6.3）において30℃で7日間培養することにより選択した。形質転換体は、それぞれの宿主に対して1株ずつ得られた。

次に得られたそれぞれの形質転換体から導入遺伝子を回収するために、インバースPCRを行った。得られた形質転換体をDPY培地(2% dextrin, 1% peptone, 0.5% yeast extract)を用いて30℃で3日間液体培養した。麹菌菌体をガーゼ濾過により回収し、液体窒素で破砕し、抽出バッファー（50mM EDTA, 1% SDS）で抽出した。これに対してフェノール-クロロホルム抽出して、最後にエタノール沈殿を行い、麹菌ゲノムDNAを得た。

50μlの反応系において、メチオニン要求性相補形質転換体ゲノムDNA 10μgあたりHindIII 5UNITS（ニッポンジーン）、ヒスチジン要求性相補形質転換体ゲノムDNA 10μgあたりXhoI 5UNITS（ニッポンジーン）、ロイシン要求性相補形質転換体ゲノムDNA 10μgあたりBamHI 5UNITS（ニッポンジーン）を添加し、37℃で60分間反応させた。これらの消化ゲノムDNAに対して、フェノール抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿を順に施し、さらにT4 DNAリガーゼにより16℃で一晩処理することによりセルフライゲーションさせた。これをインバースPCRの鋳型ライブラリーとした。

インバースPCRは以下のプログラムで、LA-Taq（宝バイオ）を用いて行った。
プライマーは大腸菌プラスミド領域にハイブリダイズできるM13 Primer M1(5’-AGTCA CGACG TTGTA-3’（配列番号11）)、及びM13 Primer RV(5’- CAGGA AACAG CTATG AC-3’（配列番号12）)を用いた。

＜PCR条件＞
・96℃ (5分)を１サイクル
・96℃ (20秒), 60℃ (30秒), 72℃ (5分)を 30サイクル
・72℃ (7分)を１サイクル
PCR増幅産物をアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、メチオニン要求性変異株由来の形質転換体は約4.5 kbのDNA断片、ヒスチジン要求性変異株由来の形質転換体は約3.5 kbのDNA断片、ロイシン要求性変異株由来の形質転換体は約2.5 kbのDNA断片の増幅が確認された。

このバンドをQIAquick gel extraction kit(QIAGEN)で抽出し、M13 Primer M1(5’-AGTCA CGACG TTGTA-3’（配列番号11）)及びM13 Primer RV(5’- CAGGA AACAG CTATG AC-3’（配列番号12）)を用いたダイレクトシーケンスを行った。シーケンスキットは、PEバイオサイエンスのビッグダイターミネーターキットを用い、シーケンサーはPEバイオサイエンスのABI310のキャピラリーシーケンサーを使用した。

得られた塩基配列について、麹菌ゲノムデータベースに対してブラストサーチを行った。その結果、メチオニン要求性変異株由来の形質転換体の大腸菌プラスミドにサブクローニングできた断片は、配列番号6の塩基番号1898〜1901の5’-GATC-3’から塩基番号4004〜4007の5’-GATC-3’までの領域（配列番号6の塩基番号1898〜4007の領域）であった。

ヒスチジン要求性変異株由来の形質転換体の大腸菌プラスミドにサブクローニングできた断片は、配列番号7の塩基番号1491〜1494の5’-GATC-3’から塩基番号2838〜2841の5’-GATC-3’までの領域（配列番号7の塩基番号1491〜2841の領域）であった。

ロイシン要求性変異株由来の形質転換体の大腸菌プラスミドにサブクローニングできた断片は、配列番号13の塩基番号990〜993の5’-GATC-3’から塩基番号3612〜3615の5’-GATC-3’までの領域（配列番号13)の塩基番号990〜3615の領域）であった。5’-GATC-3’はSau3AI認識部位を表す。

このメチオニン要求性変異を相補する遺伝子断片には、メチオニン生合成への関与が示唆される、ホモシステインからメチオニンを合成するシスタチオニン-g-シンターゼであって出芽酵母Saccharomyces cerevisiae由来のものと相同性の高いタンパク質をコードする遺伝子が含まれている。そこで、当該遺伝子をmetAと命名した。

また、ヒスチジン要求性変異を相補する遺伝子断片には、ヒスチジン生合成への関与が示唆されるホスホリボシル-5-アミノ-1-ホスホリボシル-4-イミダゾールカルボキシアミドイソメラーゼであって出芽酵母Saccharomyces cerevisiae由来のものと相同性の高いタンパク質をコードする遺伝子が含まれている。そこで、当該遺伝子をhisAと命名した。

さらに、ロイシン要求性変異を相補する遺伝子断片には、ロイシン生合成への関与が示唆される、β-イソプロピルリンゴ酸を2-オキソイソカプロン酸へ酸化するβ-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼであって出芽酵母Saccharomyces cerevisiae由来のものと相同性の高いタンパク質をコードする遺伝子が含まれている。そこで、当該遺伝子をleu2と命名した。

metA、hisA及びleu2の全長のcDNAを得るためにRT-PCRを行った。ツァペックドックス培地を用いて30℃で3日間液体培養した麹菌Aspergillus oryzae O-1013菌体から、ニッポンジーン社ISOGENを利用して全RNAを抽出した。その全RNAから宝酒造Oligotex-dT30<Super>mRNA purification kitを用いてmRNAを抽出した。得られたmRNA 0.5μgをもとに宝酒造のTakara RNA LA PCR kit (AMV) ver.1.1によりRT-PCRを試みた。プライマーは、metAについてはP1: 5’- TGGAAAGCAAATGTCGGTTATG-3’（配列番号14）及びP2: 5’- CAGCTTGGAAGGATACTGGTAG-3’（配列番号15）、hisAについてはP3: 5’- CCAAGTTCAAAGATCCATTGGA-3’（配列番号16）及びP4: 5’- CGGACCATGGAACAGAGAGAAAT-3’（配列番号17）、leu2についてはP5: 5’- ATAGTCCATTGTACTCAGACA -3’（配列番号18）及びP6: 5’- CCTTCCATATCCCATTAT -3’（配列番号19）を利用した。反応条件は、以下の通りである。
＜PCR条件＞
・30℃ (10分), 42℃ (60分), 99℃ (5分), 5℃ (5分), 96℃ (5分)を１サイクル
・96℃ (20秒), 45℃ (30秒), 72℃ (3分)を30サイクル
・72℃ (7分)を１サイクル
PCR反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、それぞれの増幅産物をゲルから抽出し、上記と同様にして増幅産物の塩基配列を決定した。この遺伝子のイントロン配列及びエキソン配列を決定した結果、metAはイントロン3つを含む遺伝子であり、563アミノ酸残基からなるシスタチオニン-g-シンターゼをコードすると推測された。hisAはイントロン2つを含む遺伝子であり、258アミノ酸残基からなるホスホリボシル-5-アミノ-1-ホスホリボシル-4-イミダゾールカルボキシアミドイソメラーゼをコードすると推測された。leu2はイントロン4つを含む遺伝子であり、386アミノ酸残基からなるβ-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードすると推測された。

metA遺伝子については、配列番号6の塩基番号1〜2182はプロモーター領域、塩基番号2183〜4060はオープンリーディング領域、塩基番号4061〜4400はターミネーター領域である。また配列番号6の塩基番号2183〜4060までのオープンリーディング領域のうち、3つのイントロンは、塩基番号3528〜3583、3768〜3827、及び3871〜3940である。また、オープンリーディングフレームから推測されるアミノ酸配列を配列番号20に示した。

hisA遺伝子については、配列番号7の塩基番号1〜1871はプロモーター領域、塩基番号1872〜2963はオープンリーディング領域、塩基番号2964〜3500はターミネーター領域である。また配列番号7の塩基番号1872〜2963までのオープンリーディング領域のうち、2つのイントロンは、塩基番号2172〜2358、及び2546〜2673である。また、オープンリーディングフレームから推測されるアミノ酸配列を配列番号21に示した。

leu2の遺伝子については、配列番号13の塩基番号1〜1892はプロモーター領域、塩基番号1893〜3324はオープンリーディング領域、塩基番号3325〜4000はターミネーター領域である。また配列番号13の塩基番号1893〜3324までのオープンリーディング領域のうち、4つのイントロンは、塩基番号1944〜2006、2028〜2117、2346〜2405、及び3034〜3091である。また、オープンリーディングフレームから推測されるアミノ酸配列を配列番号22に示した。

アスペルギルス・ニドランス(Aspergillus nidulans)ゲノムデータベースからの相同遺伝子の探索
実施例1で、麹菌栄養要求性変異株として、ヒスチジン要求性変異株Aspergillus oryzae his-4とロイシン要求性変異株Aspergillus oryzae leu-5 (FERM P-20079)を取得した。Aspergillus oryzae his-4は、hisAにコードされるホスホリボシル-5-アミノ-1-ホスホリボシル-4-イミダゾールカルボキシアミドイソメラーゼ活性が欠損している。またAspergillus oryzae leu-5は、leu2にコードされるβ−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損している。

幅広いタンパク質の遺伝子組み換え生産を可能にするには、この知見を利用してさらに選択マーカーの種類を増やすことが必要である。

そこで、アスペルギルス・ニドランス(Aspergillus nidulans)の遺伝子の中から、2株の麹菌栄養要求性変異株his-4、及びleu-5をそれぞれ相補できる選択マーカーを探索した。

アスペルギルス・ニドランスゲノムデータベース（http://www.broad.mit.edu/annotation/fungi/aspergillus/index.html）から、アスペルギルス・オリザのホスホリボシル-5-アミノ-1-ホスホリボシル-4-イミダゾールカルボキシアミドイソメラーゼ（配列番号21）に対応する酵素をコードすることが推測される遺伝子を抽出し、ANhisAと命名した。

ANhisAは、イントロン2つを含む遺伝子であり、259アミノ酸残基からなるホスホリボシル-5-アミノ-1-ホスホリボシル-4-イミダゾールカルボキシアミドイソメラーゼをコードする遺伝子であると推測された。配列番号８の塩基番号1〜1740はプロモーター領域、塩基番号1741〜2742はオープンリーディング領域（ANhisA）、塩基番号2743〜3000はターミネーター領域である。また配列番号８の1741〜2742までのオープンリーディング領域のうち、２つのイントロンは、2041〜2182、2379〜2458である。アミノ酸配列は配列番号23に示した。

また、アスペルギルス・ニドランスゲノムデータベースから、アスペルギルス・オリザのβ−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（配列番号22）に対応する酵素をコードしていることが推測される2つの遺伝子を抽出し、ANleu2、及び ANleu2Bと命名した。ANleu2は、イントロン２つを含む遺伝子であり、370アミノ酸残基からなるβ−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であると推測された。配列番号9の塩基番号1〜319はプロモーター領域、塩基番号320〜1549はオープンリーディング領域（ANleu2）、塩基番号1550〜3560はターミネーター領域である。また配列番号9の320〜1549までのオープンリーディング領域のうち、2つのイントロンは、795〜851、1273〜1332である。アミノ酸配列は配列番号24に示した。

ANleu2Bは、イントロン4つを含む遺伝子であり、359アミノ酸残基からなるβ−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であると推測された。配列番号10の塩基番号1〜491はプロモーター領域、塩基番号492〜1913はオープンリーディング領域（ANleu2B）、塩基番号1914〜3920はターミネーター領域である。また配列番号10の492〜1913までのオープンリーディング領域のうち、４つのイントロンは、543〜686、756〜819、916〜989、1618〜1677である。アミノ酸配列は配列番号25に示した。

メチオニン要求性変異麹菌へのmetA遺伝子、ヒスチジン要求性変異麹菌へのhisA及びANhisA遺伝子、ロイシン要求性変異麹菌へのANleu2, ANleu2B遺伝子の形質転換
＜プラスミドの構築＞
得られたmetA, hisA, ANhisA, ANleu2及びANleu2Bを大腸菌プラスミドにサブクローニングしたベクター遺伝子が、麹菌栄養要求性変異株を形質転換できることを確認した。

まずmetA, hisA, ANhisA, ANleu2及びANleu2Bをそれぞれ大腸菌プラスミドpGEM-TのTAベクター（プロメガ社）へサブクローニングするためのPCRを行った。metA及びhisAは麹菌O-1013株ゲノムDNAを鋳型としてLA-Taq（宝バイオ）によるPCR増幅を行った。ANhisA, ANleu2、及びANleu2Bはアスペルギルス・ニドランス(Aspergillus nidulans)ゲノムDNAを鋳型としてLA-Taq（宝バイオ）によるPCR増幅を行った。

プライマーとしては、metA用にプライマーP7(5’- CAGTAGGTTCTAGAAGAATAAG-3’：配列番号26)及びプライマーP8(5’- CTCGTGGGGACTATGTGAAGTG-3’：配列番号27)を使用し、hisA用にプライマーP9(5’- GAAAAGAAAGGCGCGGTTGTGA-3’：配列番号28)及びプライマーP10(5’- CACGCATTCAACACCGACACGAC-3’：配列番号29)を使用した。またANhisA用にプライマーP11(5’-GTCCACTTCAAACGACGATTAA-3’：配列番号30)及びプライマーP12(5’- GAATATATATATATATATATATATATATATATTGGC-3’：配列番号31)を使用し、ANleu2用にプライマーP13(5’-TGCCAGTTTTACCAGCTTGACC-3’：配列番号32)及びプライマーP14(5’- CTTTCATGTCATGTCCCTAGAAG-3’：配列番号33)を使用し、ANleu2B用にプライマーP15(5’- TTTCCTCTTTTGCGACAAGTCCTC-3’：配列番号34)及びプライマーP16(5’- ACAATATATAACTCACGTGACCC-3’：配列番号35)を使用した。
＜PCR条件＞
・96℃ (5分)を１サイクル
・96℃ (20秒), 60℃ (30秒), 72℃ (5分)を30サイクル
・72℃ (7分)を１サイクル
その結果、それぞれ適正なゲノム遺伝子産物が増幅した。得られたPCR増幅産物をフェノール-クロロホルム抽出した後、エタノール沈殿を行った。得られた増幅産物をアガロースゲル電気泳動で切り出し、QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN)で抽出した。

切り出したmetA, hisA, ANhisA, ANleu2, 及びANleu2B遺伝子断片は、LA-Taqの増幅産物よりその末端にアデニンが追出しており、TベクターであるpGEM-T（プロメガ社）へ、T4 DNAリガーゼ（プロメガ社）を用いて4℃で20時間処理することによりライゲーションさせた。その後、ライゲーション液を大腸菌JM109コンピテントセル（宝バイオ）へ形質転換した。形質転換体はアンピシリン、IPTG及び X-galを添加したLB培地を用いて白色コロニーとして単離された。

各形質転換体から、常法に従いプラスミドを調製した。metA, hisA, ANhisA, ANleu2, 及びANleu2BがサブクローニングされたプラスミドをそれぞれpAOM1, pAOH1, pANH1, pANLA, 及びpANLBと命名した。
＜形質転換＞
上記の麹菌メチオニン要求性変異株のpAOM1による形質転換、麹菌ヒスチジン要求性変異株のpAOH1及びpANH1による形質転換、並びに麹菌ロイシン要求性変異株のpANLA及びpANLBによる形質転換は、常法であるPEG-カルシウム法を用いて行った(Mol. Gen. Genet., 218, 99-104, (1989))。形質転換体の選択培地としては、ツァペックドックス最少培地（グルコース３%、硫酸マグネシウム0.1%、リン酸水素2カリウム0.1%、塩化カリウム0.05%、硝酸ナトリウム0.3%、硫酸鉄0.00001M、0.8M NaCl、1.5%寒天、pH6.3）を用いた。30℃で7日間培養した後、複数の形質転換体がそれぞれ得られた。この時の形質転換頻度は、pAOM1は1.5 μg-DNA、 pAOH1では2.7/μg-DNA、pANH1は0.1 /μg-DNA、 pANLAでは2.1/μg-DNA、pANLBは1.6 /μg-DNAであった。

次に、これらの形質転換体のゲノムDNAを常法により取得した。pAOM1形質転換体ゲノムDNAはPstI、 pAOH1形質転換体ゲノムDNAはPstI、pANH1形質転換体ゲノムDNAはSalI、 pANLA形質転換体ゲノムDNAはPvuII、pANLB形質転換体ゲノムDNAはEcoRIで処理した後、0.8%濃度アガロースゲル電気泳動し、Hybond N+メンブレン（アマシャムバイオサイエンス）へ0.4N NaOHによるアルカリトランスファーを行い、さらにGene Image kit（アマシャムバイオサイエンス）を用いてサザンブロット解析を行った。

図1はpAOM1(metAを含む)のサザン解析結果を示す。得られたmetA遺伝子中に制限酵素部位がないSalIでのゲノム消化によりサザン解析を行ったが、シグナルが高分子側に認められ、遺伝子が形質転換されたことを確認しにくかった。そこで、metA中に切断部位があるPstIを用いてゲノムDNAを消化して、サザン解析を行うことにした。対照は、麹菌メチオニン要求性変異株met-30株のゲノムDNAをPstI消化したものを10μgアプライし、5株の形質転換体はゲノムDNAをPstI消化したものを10μgアプライした。プローブは、配列番号6の全長を使用した。図1中、矢印は、対照株には存在しない形質転換により導入されたmetA遺伝子を示す。図1に示したようにpAOM1による5株の形質転換体には、対照株麹菌O-1013株には認められないバンドが存在し、１コピーの遺伝子導入が確認された。よって、metAはプラスミドとして麹菌メチオニン要求性変異株の栄養要求性を相補できることが示された。

以上より、metAを含むプラスミドと麹菌メチオニン要求性変異株との宿主ベクター系は、遺伝子組み換え麹菌を構築できるシステムとして産業上利用可能であることが分かる。

図２はpAOH1(hisAを含む)のサザン解析結果を示す。対照は、麹菌ヒスチジン要求性変異株his-4株のゲノムDNAをPstI消化したものを10μgアプライし、10株の形質転換体はゲノムDNAをPstI消化したものを10μgアプライした。プローブは、配列番号7の全長を使用した。図２中、矢印は、対照株と異なるサイズとなった、形質転換により導入されたhisA遺伝子を示す。図２に示したようにpAOH1による形質転換体は、対照株麹菌O-1013株には認められないサイズのバンドが１本認められる。よって１コピーの遺伝子導入が確認された。よって、hisAはプラスミドとして麹菌ヒスチジン要求性変異株の栄養要求性を相補できることが示された。

以上より、hisAを含むプラスミドと麹菌ヒスチジン要求性変異株との宿主ベクター系は、遺伝子組み換え麹菌を構築できるシステムとして産業上利用可能であることが分かる。

図３はpANH1(ANhisAを含む)のサザン解析結果を示す。対照は、麹菌ヒスチジン要求性変異株his-4株のゲノムDNAを消化したものを10μg、1株の形質転換体はゲノムDNAをSalI消化したものを10μgアプライした。プローブは、配列番号８の全長を使用した。図３に示すように、対照株にはAspergillus nidulans由来のANhisA遺伝子とハイブリダイズする遺伝子は認められず、pANH1による形質転換体は、対照株には認められないバンドが存在し、１コピーの遺伝子導入が確認された。よって、ANhisAはプラスミドとして麹菌ヒスチジン要求性変異株の栄養要求性を相補できることが示された。

以上より、ANhisAを含むプラスミドと麹菌ヒスチジン要求性変異株との宿主ベクター系は、遺伝子組み換え麹菌を構築できるシステムとして産業上利用可能であることが分かる。

図４はpANLA(ANleu2を含む)のサザン解析結果を示す。対照は、麹菌ロイシン要求性変異株leu-5株のゲノムDNAをPvuII消化したものを10μg、6株の形質転換体はゲノムDNAをPvuII消化したものを10μgアプライした。プローブは、配列番号９の全長を使用した。図４で示すように、対照株にはAspergillus nidulans由来のANleu2遺伝子とハイブリダイズする遺伝子は認められず、pANLAによる形質転換体B, C, D, Eは、対照株には認められないバンドが存在し、2-4コピーの遺伝子導入が確認された。

また図４の形質転換体A株は、ANleu2遺伝子がマルチコピー導入されていることが確認された。そこで、得られた形質転換体A株の導入遺伝子コピー数を検討した。野生株のAspergillus nidulans株はサザンブロット解析とゲノムデータベースからANleu2遺伝子がゲノム中に１コピー存在することが確認された。よって、野生株Aspergillus nidulans株及び当該形質転換体A株のANleu2遺伝子数を、ドットブロットハイブリダイゼーションにより推測した。具体的にはそれぞれのゲノムDNAを常法により調製し、1マイクログラムのゲノムDNAを2倍希釈したものをHybond N+メンブレンへブロットした。固定は0.4M NaOHによるアルカリ固定とした。またプローブとしては、配列番号４のANleu2遺伝子のオープンリーディングフレームの全長を用いた。サザンハイブリダイゼーションは、Gene Image kit（アマシャムバイオサイエンス）を用いて行った。形質転換体AのゲノムDNAを１スポットあたり1/8μg〜1/128μgまで２倍希釈系列でブロットする一方で、野生株Aspergillus nidulans株のゲノムDNAを１スポットあたり１μg〜1/8μgまで２倍系列でブロットした。スポット後のメンブンレンに対して、上記プローブを用いてサザン解析を行った。コピー数は、野生株のスポットと形質転換体のスポットとの黒化度の比較により行った。その結果、形質転換体A株にはANleu2遺伝子が約32コピー導入されていることが確認された。よって、ANleu2と麹菌ロイシン要求性変異株の新規な宿主ベクター系では、最大30コピーのプラスミドの形質転換が可能であることが示された。よって、ANleu2はプラスミドとして麹菌ロイシン要求性変異株の栄養要求性を相補できることが示された。

以上より、ANleu2を含むプラスミドと麹菌ロイシン要求性変異株との宿主ベクター系は、遺伝子組み換え麹菌を構築できるシステムとして産業上利用可能であることが分かる。

図５はpANLB(ANleu2Bを含む)のサザン解析結果を示す。対照は、麹菌ロイシン要求性変異株leu-5株のゲノムDNAをEcoRI消化したものを10μg、6株の形質転換体はゲノムDNAをEcoRI消化したものを10μgアプライした。プローブは、配列番号１０の全長を使用した。図５に示すように、対照株にはAspergillus nidulans由来のANleu2B遺伝子とハイブリダイズする遺伝子は認められず、pANLBによる形質転換体は、対照株には認められないバンドが存在し、1コピーの遺伝子導入が確認された。よって、ANleu2Bはプラスミドとして麹菌ロイシン要求性変異株の栄養要求性を相補できることが示された。

以上より、ANleu2Bを含むプラスミドと麹菌ロイシン要求性変異株との宿主ベクター系は、遺伝子組み換え麹菌を構築できるシステムとして産業上利用可能であることが分かる。

ANleu2を選択マーカーとする麹菌ロイシン宿主ベクター系を利用したタンパク質の大量生産１（sodMプロモーターを利用した液体培養におけるグルコアミラーゼ生産）
上記の実施例４からANleu2を選択マーカーとした麹菌宿主ベクター系では最大３０コピーのプラスミドの形質転換が可能であることが明らかとなり、タンパク質の遺伝子組み換え生産に非常に有利な宿主ベクター系であることが予測される。そこで、当該宿主ベクター系を用いてタンパク質の遺伝子組み換え生産を検討した。麹菌の液体培養で強力に発現するsodMプロモーター支配下でグルコアミラーゼ遺伝子glaBの発現を試みた。

まずsodMプロモーター（配列番号３６）とglaBオープンリーディングフレーム（配列番号３７）とglaBターミネーター（配列番号３８）とを含む遺伝子発現カセットの構築を試みた。sodMエンハンサーの増幅用にプライマー(P17: 5’-TTATGTACTCCGTACTCGGTTGAATTATTAATCGGG-3’、配列番号３９)、及びプライマー(P18: 5’- GAAGGTTGTTCCGCATTTTGGGTGGTTTGGTTGGTATTCTGGTT-3’、配列番号４０)を用い、glaBオープンリーディングフレーム増幅用にプライマー(P19: 5’- CCAACCAAACCACCCAAAATGCGGAACAACCTTCTTTTTTCCC-3’、配列番号４１)、及びプライマー(P20: 5’- GCACTGGAAAGTACATCTACCACGACCCAACAGTTGGGGTAGT-3’、配列番号４２)を用い、glaBターミネーター増幅用にプライマー(P21: 5’-CTGTTGGGTCGTGGTAGATGTACTTTCCAGTGCGTGTAGTCTAC-3’、配列番号４３)、及びプライマー(P22: 5’-GCGAACAGAGCTATACCTTCACATACC-3’、配列番号４４)を用いてそれぞれ、麹菌ゲノムDNAを鋳型としてLA-Taq（宝バイオ）を用いてPCR増幅した。
＜1回目のPCR条件＞
・96℃ (5分)で１サイクル
・96℃ (20秒), 60℃ (30秒), 72℃ (5分)で30サイクル
・72℃ (7分)で１サイクル
得られたPCR増幅産物はアガロースゲル電気泳動を行い、切り出しはQIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN)を用いた。次に２段階目のPCRとしてこれらの３つのフラグメントを混合し、プライマーP17とプライマーP22を用いてLA-Taq（宝ホールディングス）によるPCR増幅を行った。
＜2回目のPCR条件＞
・96℃ (5分)で１サイクル
・96℃ (20秒), 68℃ (7分)で30サイクル
・68℃ (7分)で１サイクル
その結果、約3.7-kbの融合遺伝子産物が増幅した。得られたPCR増幅産物をアガロースゲル電気泳動で切り出した。切り出しは、QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN)を用いた。当該断片は末端にアデニンを有しており、T-ベクターであるpGEM-T（プロメガ社）にDNA ligase（プロメガ社）を用いてライゲーションし、大腸菌E. coli JM109（宝バイオ）に形質転換した。その結果、融合遺伝子がサブクローニングされたプラスミドpMB1を得ることができた。

得られたpMB1と、ANleu2がサブクローニングされたpANLAをコトランスフォーメーションにより麹菌ロイシン要求性変異株leu-5株に形質転換した。コトランスフォーメーションは、常法の形質転換のDNA供与のステップでpMB1とpANLAを等量形質転換することによって可能である。

得られた形質転換体6株のゲノムDNAを抽出して、それぞれ10μg をEcoRI消化後、アガロース電気泳動を行い、HybondN+メンブレンへ転写した。配列番号３７のglaBの全長をプローブとしてゲノムサザン解析を行った。その結果図６に示したように、コトランスフォーメーションを用いても、glaB遺伝子は最大５コピー形質転換されていた。

次にサザン解析でコピー数の多い形質転換体A, E, F, Gのグルコアミラーゼ生産性を検討した。sodMプロモーターは、液体培養特異的に発現するプロモーターである（特開2001-224381）。よって、上記形質転換体４株について、10mlのGPY培地(2% glucose, 1% peptone, 0.5% yeast extract)を用いて30℃で３日間液体培養による前培養後、本セルフクローニング株を液体培地50ml（グルコース３%、硫酸マグネシウム0.1%、リン酸水素２カリウム0.1%、塩化カリウム0.05%、硫安0.2%、硫酸鉄0.00001M、pH6.3）中で液体培養を37℃で７日間行った。その結果、図７で示したように、形質転換体A, E, F, G（図６のサザン解析の番号に対応した形質転換体）の菌体外のグルコアミラーゼ生産量を検討した。最も生産量が高かった形質転換体F株は、３日で培養液1l当たり1290mg、培養７日で2340mgのグルコアミラーゼ生産量を示した。なおグルコアミラーゼ活性は、糖化力測定キット（キッコーマン）を用いた。またグルコアミラーゼの比活性は550 unit/mg-proteinを使用した。（Appl. Microbiol. Biotechnol., 57: 131-137 (2001)を参照して比活性を算出した）
よって、本宿主−ベクター系を用いることで液体培養におけるタンパク質の遺伝子組み換え生産が可能であることが示された。

ANleu2を選択マーカーとする麹菌ロイシン宿主ベクター系を利用したタンパク質の大量生産２（glaBプロモーターを利用した固体培養におけるグルコアミラーゼ生産）
上記の実施例４からANleu2を選択マーカーとした麹菌宿主ベクター系では最大３０コピーのプラスミドの形質転換が可能であることが明らかとなり、タンパク質の遺伝子組み換え生産に非常に有利な宿主ベクター系であることが予測される。そこで、当該宿主ベクター系を用いてタンパク質の遺伝子組み換え生産を検討した。麹菌の固体培養で強力に発現するglaBプロモーター支配下でグルコアミラーゼ遺伝子glaBの発現を試みた。

まず麹菌のglaB遺伝子（配列番号45、glaBプロモーターは塩基番号1-1197、glaBオープンリーディングフレームは1198-2784、glaBターミネーターは2785-3481）のPCRによる増幅を試みた。プライマー(P23: 5’- TCTCAACCCAAGTAACGATGAAG -3’、配列番号４６)及びプライマー(P24: 5’- CTCGAGCATCCAAAATAAATAGC -3’、配列番号４７)を用いて、麹菌ゲノムDNAを鋳型としてLA-Taq（宝ホールディングス）を用いてPCR増幅した。
＜PCR条件＞
・96℃ (5分)で１サイクル
・96℃ (20秒), 60℃ (30秒), 72℃ (5分)で30サイクル
・72℃ (7分)で１サイクル
得られたPCR増幅産物はアガロースゲル電気泳動を行い、切り出しはQIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN)を用いた。当該断片は末端にアデニンを有しており、T-ベクターであるpGEM-T（プロメガ社）にDNA ligase（プロメガ社）を用いてライゲーションし、大腸菌E. coli JM109（宝バイオ）を形質転換した。その結果、glaB遺伝子がサブクローニングされたプラスミドpGB1を得ることができた。

得られたpGB1と、ANleu2がサブクローニングされたpANLAをコトランスフォーメーションにより麹菌ロイシン要求性変異株leu-5株を形質転換した。コトランスフォーメーションは、常法の形質転換のDNA供与のステップでpMB1とpANLAを等量形質転換することによって可能である。

得られた形質転換体6株のゲノムDNAを抽出して、それぞれ10μg をEcoRI消化後、アガロース電気泳動を行い、HybondN+メンブレンへ転写した。配列番号３７のglaBの全長をプローブとしてゲノムサザン解析を行った。その結果図８に示したように、コトランスフォーメーションを用いて、glaB遺伝子は最大３コピー形質転換されていた。次に得られた形質転換体のグルコアミラーゼ生産性を検討した。

本実施例で利用したglaBプロモーターは、固体培養特異的に発現するプロモーターである（特開2000-245465、特開平11-243965）。よって、70%精米の米麹固体培養を30-℃で７日間行った。得られた米麹10gを水50mlで室温３時間抽出濾過後、その抽出液のグルコアミラーゼ生産量を測定した。なおグルコアミラーゼ活性は、糖化力測定キット（キッコーマン）を用いた。またグルコアミラーゼの比活性は550 unit/mg-proteinを使用した（Appl. Microbiol. Biotechnol., 57: 131-137 (2001)を参照して比活性を算出した）。菌体外のグルコアミラーゼ生産量は図９で示したように、形質転換体A, B, C, D, E, F（図８のサザン解析の番号に対応した形質転換体）の固体培養における菌体外のグルコアミラーゼ生産量を検討した。最も生産量が高かった形質転換体B株は、培養担体1kg当たり2640mgで、対照株の6.9倍の生産量を示した。

よって、本宿主ベクター系を用いることで固体培養におけるタンパク質の遺伝子組み換え生産が可能であることが示された。

麹菌メチオニン要求性変異株met-30のpAOM1(metAを含む)による形質転換体のゲノムDNAのサザンブロット解析の結果を示す図である。 麹菌ヒスチジン要求性変異株his-4のpAOH1（hisAを含む）による形質転換体のゲノムDNAのサザンブロット解析の結果を示す図である。 麹菌ヒスチジン要求性変異株his-4のpANH1（AnhisA）による形質転換体のゲノムDNAのサザンブロット解析の結果を示す図である。 麹菌ロイシン要求性変異株leu-5のpANLA（ANleu2）による形質転換体のゲノムDNAのサザンブロット解析の結果を示す図である。 麹菌ロイシン要求性変異株leu-5のpANLB（ANleu2B）による形質転換体のゲノムDNAのサザンブロット解析の結果を示す図である。 麹菌ロイシン要求性変異株leu-5のpANLA（ANleu2）とpMB1のコトランスフォーメーションによる形質転換体のゲノムDNAのサザンブロット解析の結果を示す図である。 麹菌ロイシン要求性変異株leu-5のpANLA（ANleu2）とpMB1のコトランスフォーメーションによる形質転換体による液体培養におけるグルコアミラーゼ生産量の計時変化を示す図である。 麹菌ロイシン要求性変異株leu-5のpANLA（ANleu2）とpGB1のコトランスフォーメーションによる形質転換体のゲノムDNAのサザンブロット解析の結果を示す図である。 麹菌ロイシン要求性変異株leu-5のpANLA（ANleu2）とpGB1のコトランスフォーメーションによる形質転換体による固体培養におけるグルコアミラーゼ生産量を示す図である。

Claims (17)

1. アスペルギルス・オリザ（Aspergillus oryzae）のメチオニン要求性変異株。
2. 以下の(1)又は(2)のマーカー遺伝子。
   (1) 配列番号１で示される塩基配列からなるマーカー遺伝子。
   (2) 配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシスタチオニン-g-シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなるマーカー遺伝子。
3. 請求項２記載のマーカー遺伝子を含むベクター。
4. 下記の(a)又は(b)のベクターを用いて請求項１に記載のメチオニン要求性変異株を形質転換する工程と、請求項２に記載のマーカー遺伝子を指標にして形質転換体を選択する工程とを含む、形質転換体の製造方法。
   (a) 請求項３に記載のベクターであって、さらに目的遺伝子を含むもの
   (b) 請求項３に記載のベクター、及びこれとは異なるベクターであって目的遺伝子を含むもの
5. 請求項４の方法により得られる形質転換体。
6. アスペルギルス・オリザ（Aspergillus oryzae）のヒスチジン要求性変異株。
7. 以下の(3)又は(4)のマーカー遺伝子
   (3) 配列番号２で示される塩基配列からなるマーカー遺伝子。
   (4) 配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつホスホリボシル-5-アミノ-1-ホスホリボシル-4-イミダゾールカルボキシアミドイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなるマーカー遺伝子。
8. 以下の(5)又は(6)のマーカー遺伝子
   (5) 配列番号３で示される塩基配列からなるマーカー遺伝子。
   (6) 配列番号３で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつホスホリボシル-5-アミノ-1-ホスホリボシル-4-イミダゾールカルボキシアミドイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなるマーカー遺伝子。
9. 請求項７又は８に記載のマーカー遺伝子を含むベクター。
10. 下記の(c)又は(d)のベクターを用いて請求項６に記載のヒスチジン要求性変異株を形質転換する工程と、請求項７又は８に記載のマーカー遺伝子を指標にして形質転換体を選択する工程とを含む、形質転換体の製造方法。
    (c) 請求項９に記載のベクターであって、さらに目的遺伝子を含むもの
    (d) 請求項９に記載のベクター、及びこれとは異なるベクターであって目的遺伝子を含むもの
11. 請求項１０に記載の方法により得られる形質転換体。
12. 以下の(7)又は(8)のマーカー遺伝子
    (7) 配列番号４で示される塩基配列からなるマーカー遺伝子。
    (8) 配列番号４で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつb-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなるマーカー遺伝子。
13. 以下の(9)又は(10)のマーカー遺伝子
    (9) 配列番号５で示される塩基配列からなるマーカー遺伝子。
    (10) 配列番号５で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつb-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなるマーカー遺伝子。
14. 請求項１２又は請求項１３に記載のマーカー遺伝子を含むベクター。
15. 下記の(e)又は(f)のベクターを用いてアスペルギルス・オリザのロイシン要求性変異株を形質転換する工程と、請求項１２又は１３に記載のマーカー遺伝子を指標にして形質転換体を選択する工程とを含む、形質転換体の製造方法。
    (e) 請求項１４に記載のベクターであって、さらに目的遺伝子を含むもの
    (f) 請求項１４に記載のベクター、及びこれとは異なるベクターであって目的遺伝子を含むもの
16. 請求項１５に記載の方法により得られる形質転換体。
17. 請求項５、１１、又は１６に記載の形質転換体を培養する工程と、培養物から目的遺伝子がコードするタンパク質を回収する工程とを含むタンパク質の製造方法。

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