CN107988283A - 一种采用微通道反应器制备海藻糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种采用微通道反应器制备海藻糖的方法。本发明中以麦芽糖为反应物，以海藻糖合酶为催化剂，在微反应器中连续化进行酶催化反应生成海藻糖。本发明通过选用易得低廉的原料和催化剂，选择合适的反应温度和流速，在连续流反应中，反应时间大大缩短，显著提高反应效率和生产效率。
Description
技术领域
本发明为酶工程技术领域，涉及利用酶催化底物生成海藻糖的方法。
背景技术
海藻糖（Trehalose）是由两个葡萄糖分子以α，α-1，1-糖苷键构成的一种非还原性二糖，无色无嗅，具有很强的热稳定性、酸稳定性和化学稳定性，对蛋白质、核酸、细胞膜等活体成分有很强的稳定作用，素有“生命之糖”的美誉，在活体受到外界压力（干燥、冻结、渗透压等）时有保护作用，是唯一被美国FDA认证为安全的功能性低聚糖。
海藻糖制取上存在困难，因此该糖价格较高，且生产量低，远不能满足市场需求。各国科学家一致认为生产海藻糖的经济方法是利用海藻糖合酶转化廉价的麦芽糖底物一步生成海藻糖，但近十年来产海藻糖合酶(trehalose synthase，Tres)菌株难以实现发酵生产海藻糖的经济目标。宿玲恰等人使用海藻糖合酶催化麦芽糖生产海藻糖，初始底物浓度为100g/L，pH 7.5，加酶量为15 U/g麦芽糖，在40℃下，150 r/min反应24 h，转化率达到最高值，为49.0%（基因组学与应用生物学,2015,34(07):1461-1467）。在该方法中，酶的催化效率低，反应时间长且海藻糖合酶不能被重复利用，这些不足限制了海藻糖的生产效率。因此，急需在此催化新体系基础上寻找一种制备海藻糖更加高效的新技术。
连续流管式微反应器（Continuous-flow microreactor）是一种连续流动的管道式反应器，其反应空间的尺寸数量级一般为微米甚至纳米。自20世纪90年代中期微反应器技术兴起以来，由于其独特的特色和优势迅速成为研究热点，在生物催化领域中得到了越来越多的应用。与常规反应器相比，连续流管式微反应器具有比表面积大，传质、传热效率高、便于放大等优点，因此具有高速混合、高效传热、易于过程控制、几乎无放大效应和参与反应的反应物存留量小而被快速消耗等方面表现出超常的能力。王俊等人构建了连续流微通道式反应器内橙皮苷酶选择性催化水解芦丁合成异槲皮苷的新方法。研究微通道长度、酶浓度、底物浓度及温度等因素对酶促反应的影响。当芦丁浓度0.1g/L、酶浓度0.1g/mL、温度40℃、流速2μL/min时，异槲皮苷最大得率为99.9%，与间歇式反应器相比，反应时间由10h骤减至30min（CN103627756A）。
本发明利用微反应器法催化生产海藻糖，有利于提高酶促反应效率，缩短反应时间，减少耗能，且操作简单，易于工业化制备高纯度的海藻糖。为推动其在食品、药品、化妆品等领域的应用具有十分重要的意义。
发明内容
本发明需要解决的技术问题在于解决现有方法中，海藻糖合成过程中，反应速率低，耗时长级难以连续化生产的问题。
为了解决本发明的技术问题，本发明提供的技术方案为：
一种采用微通道反应器制备海藻糖的方法，其中，以麦芽糖溶液为底物，海藻糖合酶溶液为催化剂，在微通道反应器中连续混合反应生成含海藻糖的溶液。
本发明所述的方法，其中，所述微通道反应器至少含用于输送麦芽糖溶液的输送装置A，用于输送海藻糖合酶的输送装置B，输送装置A、B分别连接输送通道，混合器与两个输送通道联通；混合器末端设一条微通道反应器，微通道反应器中的反应液通过出样口进入收集器；输送通道分别设进样口；其中，进样输送通道与出样通道成Y型。
本发明所述的方法，其中，所述微反应器微混合器内径为0.1～10mm，微通道的内径为0.1～10mm，长度为0.1～10m。
本发明所述的方法，其中，所述底物添加的流速为0.1～4000μL/min 。
本发明所述的方法，其中，反应的温度为20-60℃。
本发明所述的方法，其中，所述麦芽糖底物溶液为浓度为10～300g/L，且溶液pH为7。
本发明所述的方法，其中，所述海藻糖合酶浓度为0.1～10mg/mL。
本发明所述的方法，其中，所述底物与酶在微反应器中的停留时间为0.1～24h。
本发明的有益效果在于：
本发明选择利用微反应器法酶促合成海藻糖，将传统反应时间由20h缩减为120min，转化率即可达到81.5%，大大减少了耗能，反应效率大大提高；生产过程由间隙式操作变为连续操作，可以持续生产。此外，本发明采用的装置结构简单，只需简单的将数目放大即可等比例的扩大生产能力，具有良好的工业化应用前景，可以满足迅速发展的工业需要。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
以PBS缓冲液配制pH为7，浓度为50g/L的麦芽糖溶液作为底物溶液，置于微量注射泵A中；以蒸馏水配制浓度为1mg/mL的海藻糖合酶溶液，置于微量注射泵B中。将配制好的底物和酶液分别以100μL/min和0.5μL/min的流速从进样口泵入预热好的微混合器中，充分混合后泵入微通道反应器内反应，微反应器设有依次连接的进样口、微混合器、微管道和出样口，反应器的两个进样口端分别与微量注射泵A、B连接，反应器的出样口端与收集器连接。该微反应器的温度控制在60℃，内径为2mm，长度为0.2m。反应液在反应器中停留5min后通过出样口流入收集器，用HPLC检测反应液中海藻糖的转化率为5.0%。
实施例2
以PBS缓冲液配制pH为7，浓度为200g/L的麦芽糖溶液作为底物溶液，置于微量注射泵A中；以蒸馏水配制浓度为2mg/mL的海藻糖合酶溶液，置于微量注射泵B中。将配制好的底物和酶液分别以50μL/min和1μL/min的流速从进样口泵入预热好的微混合器中，充分混合后泵入微通道反应器内反应，微反应器设有依次连接的进样口、微混合器、微管道和出样口，反应器的两个进样口端分别与微量注射泵A、B连接，反应器的出样口端与收集器连接。该微反应器的温度控制在50℃，内径为2mm，长度为0.3m。反应液在反应器中停留15min后通过出样口流入收集器，用HPLC检测反应液中海藻糖的转化率为22.7%。
实施例3
以PBS缓冲液配制pH为7，浓度为300g/L的麦芽糖溶液作为底物溶液，置于微量注射泵A中；以蒸馏水配制浓度为4mg/mL的海藻糖合酶溶液，置于微量注射泵B中。将配制好的底物和酶液分别以100μL/min和3μL/min的流速从进样口泵入预热好的微混合器中，充分混合后泵入微通道反应器内反应，微反应器设有依次连接的进样口、微混合器、微管道和出样口，反应器的两个进样口端分别与微量注射泵A、B连接，反应器的出样口端与收集器连接。该微反应器的温度控制在30℃，内径为2mm，长度为1.1m。反应液在反应器中停留30min后通过出样口流入收集器，用HPLC检测反应液中海藻糖的转化率为51.2%。
实施例4
以PBS缓冲液配制pH为7，浓度为300g/L的麦芽糖溶液作为底物溶液，置于微量注射泵A中；以蒸馏水配制浓度为8mg/mL的海藻糖合酶溶液，置于微量注射泵B中。将配制好的底物和酶液分别以100μL/min和2μL/min的流速从进样口泵入预热好的微混合器中，充分混合后泵入微通道反应器内反应，微反应器设有依次连接的进样口、微混合器、微管道和出样口，反应器的两个进样口端分别与微量注射泵A、B连接，反应器的出样口端与收集器连接。该微反应器的温度控制在40℃，内径为2mm，长度为5.0m。反应液在反应器中停留120min后通过出样口流入收集器，用HPLC检测反应液中海藻糖的转化率为81.5%。
实施例5
以PBS缓冲液配制pH为7，浓度为150g/L的麦芽糖溶液作为底物溶液，置于微量注射泵A中；以蒸馏水配制浓度为2mg/mL的海藻糖合酶溶液，置于微量注射泵B中。将配制好的底物和酶液分别以500μL/min和7.5μL/min的流速从进样口泵入预热好的微混合器中，充分混合后泵入微通道反应器内反应，微反应器设有依次连接的进样口、微混合器、微管道和出样口，反应器的两个进样口端分别与微量注射泵A、B连接，反应器的出样口端与收集器连接。该微反应器的温度控制在20℃，内径为2mm，长度为2.0m。反应液在反应器中停留60min后通过出样口流入收集器，用HPLC检测反应液中海藻糖的转化率为30.1%。
实施例6
以PBS缓冲液配制pH为7，浓度为250g/L的麦芽糖溶液作为底物溶液，置于注射泵A中；以蒸馏水配制浓度为5mg/mL的海藻糖合酶溶液，置于注射泵B中。将配制好的底物和酶液分别以2000μL/min和10μL/min的流速从进样口泵入预热好的微混合器中，充分混合后泵入微通道反应器内反应，微反应器设有依次连接的进样口、微混合器、微管道和出样口，反应器的两个进样口端分别与泵A、B连接，反应器的出样口端与收集器连接。该微反应器的温度控制在45℃，内径为10mm，长度为10m。反应液在反应器中停留20h后通过出样口流入收集器，用HPLC检测反应液中海藻糖的转化率为49%。
实施例7
以PBS缓冲液配制pH为7，浓度为300g/L的麦芽糖溶液作为底物溶液，置于注射泵A中；以蒸馏水配制浓度为10mg/mL的海藻糖合酶溶液，置于注射泵B中。将配制好的底物和酶液分别以1000μL/min和5μL/min的流速从进样口泵入预热好的微混合器中，充分混合后泵入微通道反应器内反应，微反应器设有依次连接的进样口、微混合器、微管道和出样口，反应器的两个进样口端分别与泵A、B连接，反应器的出样口端与收集器连接。该微反应器的温度控制在35℃，内径为7mm，长度为3m。反应液在反应器中停留7h后通过出样口流入收集器，用HPLC检测反应液中海藻糖的转化率为38.9%。
实施例8
以PBS缓冲液配制pH为7，浓度为10g/L的麦芽糖溶液作为底物溶液，置于注射泵A中；以蒸馏水配制浓度为0.1mg/mL的海藻糖合酶溶液，置于注射泵B中。将配制好的底物和酶液分别以200μL/min和10μL/min的流速从进样口泵入预热好的微混合器中，充分混合后泵入微通道反应器内反应，微反应器设有依次连接的进样口、微混合器、微管道和出样口，反应器的两个进样口端分别与泵A、B连接，反应器的出样口端与收集器连接。该微反应器的温度控制在45℃，内径为10mm，长度为3m。反应液在反应器中停留70min后通过出样口流入收集器，用HPLC检测反应液中海藻糖的转化率为26.1%。
Claims (8)
1.一种采用微通道反应器制备海藻糖的方法，其特征在于，以麦芽糖溶液为底物，海藻糖合酶溶液为催化剂，在微通道反应器中连续混合反应生成含海藻糖的溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微通道反应器至少含用于输送麦芽糖溶液的输送装置A，用于输送海藻糖合酶的输送装置B，输送装置A、B分别连接输送通道，混合器与两个输送通道联通；混合器末端设一条微通道反应器，微通道反应器中的反应液通过出样口进入收集器；输送通道分别设进样口；其中，进样输送通道与出样通道成Y型。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微反应器微混合器内径为0.1～10mm，微通道的内径为0.1～10mm，长度为0.1～10m。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述底物添加的流速为0.1～3000μL/min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，反应的温度为20-60℃。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述麦芽糖底物溶液质量浓度为10～300g/L，且溶液pH为7。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述海藻糖合酶质量浓度为0.1～10mg/mL。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述底物与酶在微反应器中的停留时间为0.1～24h。
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2018
- 2018-01-30 CN CN201810087177.8A patent/CN107988283A/zh active Pending
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