CN107190031A - 一种应用海藻糖合成酶催化合成海藻糖的新工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种应用海藻糖合成酶催化合成海藻糖的新工艺。将包含海藻糖合成酶基因的大肠杆菌基因工程菌接种至自诱导培养基中诱导产酶，获取发酵液；用磷酸盐缓冲液配制麦芽糖溶液，将该溶液直接流加入发酵液中继续发酵；发酵和酶催化反应偶联进行，后分离、干燥获得海藻糖晶体。采用本发明的工艺，在发酵和酶催化偶联的过程中，省去了处理发酵液的制酶工序，缩短了生产时间，实现了部分副产物葡萄糖被菌体有效利用，提高了麦芽糖转化率，转化率可达90.1%。并且全细胞可进行重复多次催化。

Description

一种应用海藻糖合成酶催化合成海藻糖的新工艺
技术领域
本发明涉及一种应用海藻糖合成酶催化合成海藻糖的新工艺，属于功能糖醇合成技术领域。
背景技术
海藻糖(Trehalose)又名罩糖，是一种由葡萄糖分子以α，α-1，1-糖昔键相连而成的非还原性二糖，它广泛地存在于微生物、虾类、昆虫、脊椎动物以及植物等之中。海藻糖对于生物体及生物大分子、生物膜等都具有良好的非特异性保护作用，使得细胞对不良环境条件(如高温、冷冻、脱水、高渗透压等)具有高效的抗逆性，因此被誉为"生命之糖"。此外，海藻糖还具有性质稳定、甜度低、人类吸收缓慢以及不形成龋齿的特点。因此，海藻糖被广泛应用于食品、医药、化妆品等精细化学品领域之中。
海藻糖的商品化制备始于20世纪40年代捷克用酒精从面包酵母中提取海藻糖。现代的制备方法主要包括化学合成法、微生物发酵法、酶转化法。其中，化学合成法产率低，分离困难，难以工业化；微生物发酵法转化率较低，发酵副产物较多，使得海藻糖的提取、精制困难。酶转化法是目前海藻糖生产的主要途径，许多生物体内部有合成海藻糖的酶系，可以利用基因工程手段高效表达出来，利用这些酶与底物进行催化反应，可以大规模的生产海藻糖。1995年，日本首次实现了酶法制备海藻糖的大规模生产，使海藻糖的价格大幅下降。但是，海藻糖合酶属于胞内酶，酶法生产海藻糖过程中通常要破碎菌体，提取与纯化海藻糖合成酶系，而在破碎及纯化过程中容易造成酶的损失，这无疑加大了企业的生产成本。
利用全细胞催化合成海藻糖可以免去细胞破碎工序，提高酶的稳定性和利用率，得到高纯度的产物，从而降低生产成本。但是，由于微生物细胞膜的通透性屏障，使反应底物和产物难以自由出入细胞，生物催化的效率明显低于纯酶催化反应体系。解决这个技术问题的关键是通过对细胞进行通透性处理，增强胞内酶的使用率，从而提高海藻糖在反应体系中的浓度。
现有技术中，提高细胞通透性的处理方法主要包括以超声法、冻融法为物理法；有机溶剂和表面活性剂等化学法。
物理法的技术原理为通过造成目标细胞细胞壁以及细胞膜的结构性损伤未提高其通透性。例如，文献通过冻干法来破坏细胞的分子结构，可以有效增加细胞的通透性，提高酶的催化活力。(薛璐，马莺.透性化海藻糖合酶的研究[J].食品与发酵工业，2001，28(1)：16-18.)物理法提高通透性的技术缺陷为工业放大过程比较困难，实际生产中采用物理法提高通透性的技术有待设计与检验。
化学法的技术原理为渗透剂透过细胞壁后与细胞膜的脂质反应，通过破坏蛋白质的氢键使之变性，从而破坏细胞的结构和流动性，使细胞膜失去原有的对胞内外物质的传递调控能力。化学法添加的试剂多为毒性极强的有机试剂，例如，甲苯，二甲基亚砜，十六炕基三甲基澳化镜等等。因此，化学法中有毒试剂的残留会给用于食材的海藻糖生产带来极大的安全隐患，而且有机试剂的残留也会给海藻糖的下游分离纯化生产带来极大压力，不利于成本的降低。另外，化学法在增强细胞通透性的同时，还会造成酶的破坏。
自诱导(auto-induction)是最早由纽约厄普顿的布鲁克黑文国家实验室的Studier等提出的一种利用培养基中碳源转换而诱导外源基因表达的方法，即首先以葡萄糖为碳源支持大肠杆菌生长至饱和，待葡萄糖消耗殆尽，培养基中另一种成分乳糖在lacY与lacZ的基因产物透过酶(lactose permease)和β-半乳糖苷酶(galactosidase)的协助下，乳糖穿过细胞膜并部分转化为异乳糖开启T7表达系统的方法。乳糖除了作为诱导物之外，其代谢产物葡萄糖和半乳糖(半乳糖在gal操纵子的作用下也将转化成葡萄糖)也可作为细菌生长的碳源。与传统的IPTG(异丙基白D硫代半乳糖苷)诱导方法相比，在接种之后自诱导表达过程不需要对细胞的生长情况进行监测，从而减少了在培养过程中对培养物的处理，极大地方便了高通量筛选。而且，以价格低廉、无毒的乳糖替代价格高昂的IPTG可以大大地降低生产的成本，在重组蛋白的发酵生产中有着重要的意义。
利用自诱导基培养发酵得到大肠杆菌细胞。在催化的过程中，无需经过外源处理，自诱导培养基培养出来的细胞在磷酸盐缓冲体系下即可以进行全细胞催化底物反应。
本发明将磷酸盐缓冲液配制麦芽糖溶液直接流加入自诱导培养基的发酵液中，偶联发酵和酶催化，省去了处理发酵液的中间过程，缩短了生产时间，实现了部分副产物葡萄糖被菌体有效利用，提高了麦芽糖转化率，完成了海藻糖的高效催化。目前，此种偶联发酵和酶催化过程，有效利用副产物，提高底物转化率的研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种应用海藻糖合成酶催化合成海藻糖的新工艺。本发明的工艺不仅偶联发酵和酶催化，省去了处理发酵液的中间过程，缩短了生产时间，降低了生产成本，而且实现了部分副产物葡萄糖被菌体有效利用，提高了麦芽糖转化率，完成了海藻糖的高效催化，从而进一步降低海藻糖的生产成本。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
将包含海藻糖合成酶基因的大肠杆菌基因工程菌接种至自诱导培养基中诱导产酶，获取发酵液；用磷酸盐缓冲液配制麦芽糖溶液，将该溶液直接流加入发酵液中继续发酵；发酵和酶催化反应偶联进行，得到富含海藻糖的液体，后分离干燥获得海藻糖晶体。
具体的，本发明所述的工艺，包括如下步骤：
(1)将包含海藻糖合成酶基因的大肠杆菌基因工程菌接种至自诱导培养基中诱导产酶，获取发酵液；其中，所述大肠杆菌基因工程菌中包含的海藻糖合成酶基因来源于灰产色链霉菌Streptomycesgriseochromogenes；
(2)待步骤(1)中的发酵液中菌体生长接近稳定时，将磷酸盐缓冲液配置的麦芽糖底物直接流加到发酵液中，获取混合液体；
(3)步骤(2)中的混合液体继续发酵，并偶联酶催化过程，后分离干燥获得海藻糖晶体。
优选的，上述步骤(2)中，用磷酸盐缓冲液配制质量浓度为10％麦芽糖溶液，将磷酸盐缓冲液配置的麦芽糖溶液按发酵液：麦芽糖溶液＝1：1的体积比流加到发酵液中，获取混合液体。
优选的，上述步骤(3)中，催化反应的反应条件为温度30℃，搅拌转速100-200rpm，反应10-20h。
优选的，所述磷酸盐缓冲液配制方法为：A液：称取NaH2PO4·2H2O 6.24g，蒸馏水溶解，定容至1L，获取0.04mol/LNaH2PO4；B液：称取Na2HPO4·12H2O14.32g，蒸馏水溶解，定容至1L，获取0.04mol/LNa2HPO4；A液与B液混合，调节PH至7.4，获取0.04mol/LpH 7.4磷酸盐缓冲液。
优选的，所述步骤(1)中，在将大肠杆菌基因工程菌接种至诱导培养基前，还包括活化步骤，具体为：
(1)采用划线法于加氨苄的固体LB培养基上培养大肠杆菌基因工程菌，获得大肠杆菌单菌落；挑取单菌落接种于加氨苄的LB液体培养基活化菌种，活化培养条件为37℃，200rpm，培养时间8-12h；
(2)取所述活化的菌种按接种量1.5％(V/V)接种到加氨苄的LB培养基继续活化，活化培养条件为37℃，200rpm，培养时间8-12h。
取步骤(2)中活化的菌种按体积比1.5％(V/V)的接种量将菌种接种到自诱导培养基发酵罐中，诱导产酶至菌体生长接近稳定，培养条件为37℃，200rpm，获得发酵液。
优选的，所述加氨苄的固体LB培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化纳10g/L，氨苄抗生素0.1g/L，琼脂20g/L；所述加氨苄的液体LB培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，氨苄抗生素0.1g/L。
所述自诱导发酵培养基配方为：甘油5g/L、Na2HPO46g/L、K2HPO43g/L、NH4Cl 1g/L、NaCl 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、大豆蛋白胨10g/L，氨苄抗生素0.1g/L。
现有技术中，发酵和酶催化是两个独立的部分，中间过程复杂繁琐，酶催化所得副产物葡萄糖也得不到有效利用，还增加了下游分离成本。而本发明发现将磷酸盐缓冲液配制麦芽糖溶液直接流加入自诱导培养基的发酵液中，发酵和酶催化可以偶联进行，省去了处理发酵液的中间过程，缩短了生产时间，实现了部分副产物葡萄糖被菌体有效利用，进一步提高了麦芽糖转化率，完成了海藻糖的高效催化。
通过本发明的技术方案即可实现海藻糖合成效率的提高和生产成本的降低。发酵和酶催化偶联，部分副产物葡萄糖被菌体有效利用，打破酶催化的可逆反应的平衡，使得反应进一步向着产物生产的方向进行被认为是最直接的原因。
本发明的有益效果在于：
使用本发明的工艺，偶联了自诱导培养基发酵和酶催化过程，省去了处理发酵液的中间过程，简化了操作，缩短了生产时间，是一种高效的催化工艺。
使用本发明的工艺来进行催化合成海藻糖，部分葡萄糖副产物可以被菌体有效利用，减少了副产物的排放，降低了下游分离成本，提高了麦芽糖底物的转化率，底物在30℃反应16-20h底物的转化率可达到90.1％，相对于现有技术，是一种简单、高效、经济、绿色的催化过程。
使用本发明的工艺与物理法相比，操作方式简便，对仪器设备要求不高，能够进行规模化生产；与化学法相比，增加了生产过程的安全性，杜绝了毒物残留，减小了海藻糖分离纯化的压力。
使用本发明的工艺对产品的品质影响微乎其微，对环境绿色友好，不会造成环境污染。
具体实施方式
实施例1
本实施例说明菌种的来源。
本专利所用的菌种为包含来源于灰产色链霉菌Streptomycesgriseochromogenes的海藻糖合成酶基因的大肠杆菌基因工程菌，其中大肠杆菌基因工程菌构建方式采用专利CN201210160403中所述的方法，对构建的大肠杆菌基因工程菌编号为BL21-tre1(已在发明人的在先专利CN201310112536中公开)。
实施例2
本实施例说明偶联自诱导培养基和酶催化过程，菌体有效利用部分葡萄糖副产物，高效合成海藻糖的具体合成步骤以及合成效果。
取实施例1中所获得BL21-tre1菌株用于海藻糖合成催化。
具体步骤如下：
(1)采用划线法于加氨苄的固体LB培养基上培养大肠杆菌基因工程菌获得大肠杆菌单菌落。其中加氨苄的固体培养基的配方为：蛋白胨10g/L，酵母5g/L，氯化钠10g/L，氨苄抗生素0.1g/L，琼脂20g/L。具体的操作过程为，按要求配制培养基，将配制好的培养基于121℃下灭菌30min，待冷却后倒平板，采用划线法接种，于恒温培养箱中培养获取大肠杆菌单菌落。
(2)挑取上述单菌落接种于加氨苄的LB液体培养基活化菌种活化培养条件为37℃，200rpm，培养时间8-12h。其中加氨苄的LB液体培养配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，氨苄抗生素0.1g/L。按照上述要求配制好培养基后，分装于250ml摇瓶中，装液量为50ml，将配制好的培养基于121℃下灭菌30min，冷却至室温，于无菌条件挑取单菌落接种于摇瓶中活化菌种。
(3)取第(2)步中活化的菌种按接种量1.5％(V/V)接种到加氨苄的自诱导培养基继续活化。其中加氨苄的自诱导培养基配方为：甘油5g/L、Na2HPO46g/L、K2HPO43g/L、NH4Cl1g/L、NaCl 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、大豆蛋白胨10g/L，氨苄抗生素0.1g/L。按照上述要求配制好培养基后，分装于250ml摇瓶中，装液量为50ml，将配制好的培养基于121℃下灭菌30min，冷却至室温。
本实施例中，采取5L发酵罐来培养菌体。待灭菌结束冷却至室温后，取活化的菌种按接种量1.5％(V/V)接种到加氨苄的自诱导培养基发酵罐中。保持培养条件为37℃，搅拌转速200rpm，通气量为2vvm，诱导产酶，培养至菌体生长接近稳定。
(4)将磷酸盐缓冲液配置的麦芽糖底物直接流加到发酵液中，获取混合液体；
(5)步骤(4)中的混合液体继续发酵，并偶联酶催化过程，后分离干燥获得海藻糖晶体。
磷酸盐缓冲液配制的具体步骤为，A液：称取NaH2PO4·2H2O 6.24g，蒸馏水溶解，定容至1L，获取0.04mol/LNaH2PO4；B液：称取Na2HPO4·12H2O 14.32g，蒸馏水溶解，定容至1L，获取0.04mol/LNa2HPO4；A液与B液混合，调节PH至7.4，获取0.04mol/LpH 7.4磷酸盐缓冲液。
用磷酸盐缓冲液配制质量浓度为10％麦芽糖溶液，按体积比为步骤(4)所述发酵液：麦芽糖溶液为1：1进行催化反应，反应条件为30℃，搅拌转速为100-200rpm，16-20h获得富含海藻糖的混合溶液。
用高效液相色谱法测定体系中的海藻糖浓度，并计算海藻糖的转化率，以此来评价细胞的催化活性。其中，色谱柱为AlltimaAmino 100A 5u柱(4.6mm×250mm)；流动相为75％,乙腈/25％H2O。
(6)分离干燥获得海藻糖纯品。
经过测算，结果显示利用偶联自诱导培养基发酵和酶催化催化合成海藻糖的方法，部分副产物葡萄糖被菌体有效利用，细胞对麦芽糖的的转化率为90.1％。
通过此试验发现，此偶联方法操作步骤简易，生产时间短，副产物被有效利用，底物转化率高。

Claims (8)

1.一种应用海藻糖合成酶催化合成海藻糖的新工艺，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将包含海藻糖合成酶基因的大肠杆菌基因工程菌接种至自诱导培养基中诱导产酶，获取发酵液；其中，所述大肠杆菌基因工程菌中包含的海藻糖合成酶基因来源于灰产色链霉菌Streptomycesgriseochromogenes；
(2)待步骤(1)中的发酵液中菌体生长接近稳定时，将磷酸盐缓冲液配置的麦芽糖底物直接流加到发酵液中，获取混合液体；
(3)步骤(2)中的混合液体继续发酵，并偶联酶催化过程，后分离干燥获得海藻糖晶体。
2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述步骤(2)中，用磷酸盐缓冲液配制质量浓度为10％麦芽糖溶液，将磷酸盐缓冲液配置的麦芽糖溶液按发酵液：麦芽糖溶液＝1：1的体积比流加到发酵液中，获取混合液体。
3.根据权利要求1或2所述的工艺，其特征在于，所述步骤(3)中，催化反应的反应条件为温度30℃，搅拌转速100-200rpm，反应16-20h。
4.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液配制方法为：A液：称取NaH2PO4·2H2O 6.24g，蒸馏水溶解，定容至1L，获取0.04mol/LNaH2PO4；B液：称取Na2HPO4·12H2O 14.32g，蒸馏水溶解，定容至1L，获取0.04mol/LNa2HPO4；A液与B液混合，调节PH至7.4，获取0.04mol/LpH 7.4磷酸盐缓冲液。
5.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述步骤(1)中，在将大肠杆菌基因工程菌接种至自诱导培养基前，还包括活化步骤，具体为：
(1)采用划线法于加氨苄的固体LB培养基上培养大肠杆菌基因工程菌，获得大肠杆菌单菌落；挑取单菌落接种于加氨苄的LB液体培养基活化菌种，活化培养条件为37℃，200rpm，培养时间8-12h；
(2)取所述活化的菌种按接种量1.5％(V/V)接种到加氨苄的LB培养基继续活化，活化培养条件为37℃，200rpm，培养时间8-12h。
6.根据权利要求5所述的工艺，其特征在于，所述加氨苄的固体LB培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化纳10g/L，氨苄抗生素0.1g/L，琼脂20g/L；
所述加氨苄的液体LB培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，氨苄抗生素0.1g/L。
7.根据权利要求5所述的工艺，其特征在于，取步骤(2)中活化的菌种按体积比1.5％(V/V)的接种量将菌种接种到自诱导培养基发酵罐中，诱导产酶至菌体生长接近稳定，培养条件为37℃，200rpm，获得发酵液。
8.根据权利要求1或7所述的工艺，其特征在于，所述自诱导培养基配方为：甘油5g/L、Na2HPO46g/L、K2HPO43g/L、NH4Cl 1g/L、NaCl 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、大豆蛋白胨10g/L，氨苄抗生素0.1g/L。
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