ES2216004T3 - Composiciones que se unen especificamente a celulas cancerosas colorectales y procedimientos de uso de las mismas. - Google Patents

Composiciones que se unen especificamente a celulas cancerosas colorectales y procedimientos de uso de las mismas.

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ES2216004T3 ES95900421T ES95900421T ES2216004T3 ES 2216004 T3 ES2216004 T3 ES 2216004T3 ES 95900421 T ES95900421 T ES 95900421T ES 95900421 T ES95900421 T ES 95900421T ES 2216004 T3 ES2216004 T3 ES 2216004T3
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Abstract

SE PRESENTAN COMPUESTOS CONJUGADOS QUE COMPRENDEN UNA ZONA DE UNION AL RECEPTOR ST Y UNA ZONA ACTIVA RADIOESTABLE. SE PRESENTAN COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE COMPRENDEN EL COMPUESTO CONJUGADO QUE COMPRENDE UNA ZONA DE UNION AL RECEPTOR ST Y UNA ZONA ACTIVA RADIOESTABLE O UNA ZONA DE UNION AL RECEPTOR ST Y UNA ZONA ACTIVA RADIOACTIVA. TAMBIEN SE PRESENTAN METODOS PARA TRATAR UN INDIVIDUO SOSPECHOSO DE SUFRIR DE CANCER COLORECTAL METASTATICO. SE PRESENTAN METODOS PARA FORMAR IMAGENES DE LAS CELULAS DEL CANCER COLORECTAL METASTATICO. SE PRESENTAN METODOS "IN VITRO", EQUIPOS Y REACTIVOS PARA DETERMINAR CUANDO UN INDIVIDUO TIENE O NO TIENE CELULAS DE CANCER COLORECTAL METASTATICO, PARA DETERMINAR CUANDO LAS CELULAS DEL TUMOR SON COLORECTALES EN ORIGEN O PARA ANALIZAR MUESTRAS DE TEJIDOS DEL TEJIDO DEL COLON PARA EVALUAR LA EXTENSION DE LA METASTASIS DE LAS CELULAS TUMORALES COLORECTALES

Description

Composiciones que se unen específicamente a células cancerosas colorrectales y procedimientos de uso de las mismas.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a compuestos que comprenden un resto ligando de receptor que se une al receptor de ST conjugado a un resto terapéutico o formador de imágenes y a usos en la detección y el tratamiento de tumores colorrectales, particularmente tumores metastatizados. La presente invención se refiere a composiciones y kits y a procedimientos de detección de células tumorales colorrectales metastatizadas en muestras, para determinar si un tumor es de origen colorrectal o no, y para evaluar la extensión de la actividad invasiva de las células tumorales colorrectales en muestras del colon. Esta solicitud se refiere a los documentos de EE.UU. número de serie 08/141.892 presentado el 26 de octubre de 1993 y número de serie 08/305.056 presentado el 13 de septiembre de 1994, cuyas descripciones se incorporan a la presente memoria por referencia.
Antecedentes de la invención
El cáncer colorrectal es el tercer neoplasma más común en el mundo. La tasa de mortalidad de cáncer de intestino grueso recién diagnosticado se aproxima al 50%, y ha habido pocas mejoras durante los últimos 40 años. La mayoría de esta mortalidad refleja metástasis locales, regionales y distantes.
La cirugía es el principal apoyo del tratamiento del cáncer colorrectal, pero la recurrencia es frecuente. El cáncer colorrectal se ha demostrado resistente a la quimioterapia, aunque se ha conseguido un éxito limitado utilizando una combinación de 5-fluorouracilo y levamisol. La cirugía ha tenido el mayor impacto sobre la supervivencia y, en algunos pacientes con enfermedad limitada, consigue una curación. Sin embargo, la cirugía elimina el tumor en grueso, dejando atrás enfermedad residual microscópica que en última instancia da como resultado la recrudescencia.
La detección temprana de la enfermedad primaria, metastática y recurrente puede tener un impacto significativo sobre el pronóstico de individuos que sufren cáncer colorrectal. El cáncer de intestino grueso diagnosticado en una etapa temprana tiene un resultado significativamente mejor que el diagnosticado a etapas más avanzadas. Similarmente, el diagnóstico de metástasis o enfermedad recurrente más temprano conlleva potencialmente un mejor pronós-
tico.
Aunque los agentes radioterapéuticos, agentes quimioterapéuticos y toxinas biológicas actuales son potentes citotoxinas, no discriminan entre células normales y malignas, produciendo efectos adversos y toxicidades limitantes de la dosis. Durante la pasada década, se ha empleado un nuevo enfoque para dirigir más específicamente agentes a células tumorales, implicando la conjugación de un agente activo con moléculas que se unen preferiblemente a antígenos que existen predominantemente en células tumorales. Estos conjugados pueden administrarse sistémicamente y se unen específicamente a las células tumorales diana. Teóricamente, el direccionamiento permite la captación por las células de los agentes citotóxicos a concentraciones que no producen toxicidades graves en tejidos normales. Además, la unión selectiva a las células tumorales diana facilita la detección de tumores ocultos y es por tanto útil para diseñar agentes formadores de imágenes. El direccionamiento molecular ha empleado predominantemente anticuerpos monoclonales generados ante antígenos expresados selectivamente en células tumorales.
La inmunoescintigrafía que utiliza anticuerpos monoclonales dirigidos a marcadores específicos de tumor se ha empleado para diagnosticar cáncer colorrectal. Los anticuerpos monoclonales contra antígeno carcinoembriónico (CEA) marcado con ^{99}tecnecio identificaron un 94% de los pacientes con tumores recurrentes. De forma similar, anticuerpos monoclonales anti-CEA marcados con ^{112}indio diagnosticaron exitosamente un 85% de los pacientes con carcinoma colorrectal recurrente que no se habían diagnosticado mediante las técnicas convencionales. Los anticuerpos marcados con ^{125}yodo han sido eficaces para localizar más de un 80% de las recurrencias confirmadas patológicamente mediante barrido de sonda gamma intraoperativa.
Se han empleado también anticuerpos monoclonales para dirigir agentes terapéuticos específicos en cáncer colorrectal. Los estudios preclínicos demostraron que los anticuerpos anti-CEA marcados con ^{90}itrio inhibían xenoinjertos de carcinoma de colon humano en ratones desnudos. Los anticuerpos generados ante células de cáncer colorrectal y acoplados a mitomicina C o neocarcinostatina demostraron un efecto antitumoral sobre xenoinjertos de cáncer de colon humano en ratones desnudos y sobre 3 pacientes con cáncer de colon. Se obtuvieron resultados similares en animales con anticuerpos monoclonales conjugados con la cadena A de toxina ricina.
Debido a la sensibilidad, especificidad y perfil de efectos adversos de los anticuerpos monoclonales, los resultados obtenidos utilizando compuestos terapéuticos basados en anticuerpos monoclonales han mostrado ser herramientas de direccionamiento menos que ideales. Aunque se han generado anticuerpos monoclonales ante antígenos expresados selectivamente en tumores, no se ha identificado ningún anticuerpo verdaderamente específico de cáncer. La mayoría de los antígenos expresados en células neoplásicas parece estar cuantitativamente aumentado en éstas en comparación con las células normales, pero los antígenos están sin embargo a menudo presentes en células normales. Por tanto, los anticuerpos ante dichos determinantes pueden reaccionar con tejidos no neoplásicos, dando como resultado toxicidades significativas. Además, los anticuerpos son moléculas relativamente grandes, y en consecuencia a menudo provocan una respuesta inmune en los pacientes. Estas respuestas inmunes pueden dar como resultado toxicidades significativas en los pacientes tras la reexposición a los agentes de direccionamiento, y pueden evitar el direccionamiento por el anticuerpo monoclonal debido a la formación de complejo inmune con degradación y excreción. Finalmente, la unión de anticuerpos a células tumorales puede ser lenta y los agentes dirigidos pueden liberarse a las células en cantidades insuficientes para conseguir la detección o citotoxicidad.
Continua la necesidad de composiciones que puedan dirigirse específicamente a células de cáncer colorrectal mestatatizadas. Existe la necesidad de agentes formadores de imágenes que puedan unirse específicamente a células de cáncer colorrectal metastatizadas. Existe la necesidad de procedimientos mejorados de formación de imágenes de células de cáncer colorrectal metastatizadas. Existe la necesidad de agentes terapéuticos que puedan unirse específicamente a células de cáncer colorrectal metastatizadas. Existe la necesidad de procedimientos mejorados de tratamiento de individuos que son sospechosos de sufrir células de cáncer colorrectal, especialmente individuos que son sospechosos de sufrir metástatis de células de cáncer colorrectal.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a compuestos conjugados que comprenden un resto de unión a receptor de ST y un resto activo radioestable.
La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, y un compuesto conjugado que comprende un resto de unión a receptor de ST y un resto activo radioestable.
La presente invención se refiere a un procedimiento de tratamiento de un individuo sospechoso de sufrir cáncer colorrectal mestatatizado, que comprende las etapas de administrar a dicho individuo una composición farmacéutica que comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto conjugado que comprende un resto de unión a receptor de ST y un resto activo radioestable.
La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y un compuesto conjugado que comprende un resto de unión a receptor de ST y un resto activo radiactivo, en la que el compuesto conjugado está presente en una cantidad eficaz para uso terapéutico o de diagnóstico en seres humanos que sufren cáncer colorrectal.
La presente invención se refiere a un procedimiento de formación de radioimágenes de células de cáncer colorrectal metastatizadas, que comprende las etapas de administrar en primer lugar a un individuo sospechoso de tener células de cáncer colorrectal metastatizadas una composición farmacéutica que comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y un compuesto conjugado que comprende un resto de unión a receptor de ST y un resto activo radiactivo, en el que el compuesto conjugado está presente en una cantidad eficaz para uso de diagnóstico en seres humanos que sufren cáncer colorrectal, y detectar después la localización y acumulación de radiactividad en el cuerpo del individuo.
La presente invención se refiere a un procedimiento de tratamiento de un individuo sospechoso de sufrir cáncer colorrectal metatatizado, que comprende las etapas de administrar a dicho individuo una composición farmacéutica que comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto conjugado que comprende un resto de unión a receptor de ST y un resto activo radiactivo.
La presente invención se refiere a procedimientos in vitro de determinación de si un individuo tiene o no células de cáncer colorrectal metastatizadas. La presente invención se refiere a procedimientos in vitro de examen de muestras de tejido no colorrectal y fluidos corporales de un individuo para determinar si la proteína receptor de ST, que es una proteína que es específica de células colorrectales incluyendo células tumorales colorrectales, se está expresando por células fuera del tracto colorrectal. La presencia de proteína receptor de ST, o de moléculas de ácido nucleico que son indicativas de la expresión de la proteína receptor de ST, es prueba de que el individuo está sufriendo cáncer colorrectal metastatizado.
La presente invención se refiere a procedimientos in vitro de determinación de si las células tumorales son de origen colorrectal o no. La presente invención se refiere a procedimientos in vitro de diagnóstico de si un individuo que sufre cáncer sufre o no cáncer colorrectal. La presente invención se refiere a procedimientos in vitro de examen de muestras de tumores de un individuo para determinar si una proteína receptor de ST, que es una proteína que es específica de células colorrectales incluyendo células tumorales colorrectales, se está expresando por las células tumorales o no. La presencia de proteína receptor de ST, o de moléculas de ácido nucleico que son indicativas de la expresión de la proteína receptor de ST, es prueba de que el individuo sufre cáncer colorrectal.
La presente invención se refiere a kits in vitro para la práctica de los procedimientos de la invención y a reactivos y composiciones útiles como componentes en dichos kits in vitro de la invención.
Descripción de las realizaciones preferidas de la invención
La invención se refiere a los documentos de EE.UU. número de serie 08/141.892 presentado el 26 de octubre de 1993 y número de serie 08/305.056 presentado el 13 de septiembre de 1994, cuyas descripciones se incorporan a la presente memoria como referencia.
Como se utiliza en la presente memoria, los términos "ST" y "ST nativa" se utilizan intercambiablemente, y pretenden indicar toxina termoestable (ST), que es un péptido producido por E. coli, así como otros organismos. Las ST son péptidos de origen natural que 1) se producen naturalmente en organismos, 2) se unen al receptor de ST y 3) activan la cascada de señales que media la diarrea inducida por ST.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "receptor de ST" se pretende que designe los receptores encontrados en células colorrectales, incluyendo células de cáncer colorrectal locales y metastatizadas, que se unen a ST. En individuos normales, los receptores de ST se encuentran exclusivamente en células del intestino, en particular en células del duodeno, intestino delgado (yeyuno e íleo), intestino grueso, colon (ciego, colon ascendente, colon transversal, colon descendente y colon sigmoideo) y recto.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "ligando de receptor de ST" pretende designar compuestos que se unen específicamente al receptor de ST. La ST es un ligando de receptor de ST.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "péptido de unión a receptor de ST" pretende designar ligandos de receptor de ST que son péptidos.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "péptidos ST" pretende designar péptidos de unión a receptor de ST seleccionados del grupo constituido por SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3, SEC Nº ID 5-54 y fragmentos y derivados de los mismos.
Como se utiliza en la presente memoria, el término "fragmento" se pretende que designe el péptido que a) tiene una secuencia aminoacídica idéntica a una porción de un péptido de unión de receptor de ST y b) que es capaz de unirse al receptor de ST.
Como se utiliza en la presente memoria, el término "derivado" se pretende que designe un péptido que a) tiene una secuencia aminoacídica sustancialmente idéntica al menos a una porción de un péptido de unión a receptor de ST y b) que es capaz de unirse al receptor de ST.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "sustancialmente idéntico" se pretende que designe una secuencia aminoacídica que es la misma que la secuencia aminoacídica de un péptido ST excepto porque algunos de los residuos se eliminan o sustituyen por aminoácidos conservativos o se insertan aminoácidos adicionales.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "agente activo" se pretende que designe compuestos que son agentes terapéuticos o agentes formadores de imágenes.
Como se utiliza en la presente memoria, el término "radioestable" se pretende que designe compuestos que no experimentan degradación radiactiva, concretamente compuestos que no son radiactivos.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "agente terapéutico" se pretende que designe compuestos quimioterapéuticos, toxinas, compuestos radioterapéuticos, agentes de direccionamiento o agentes de radiosensibilización.
Como se utiliza en la presente memoria, el término "quimioterapéutico" se pretende que designe compuestos que, cuando se ponen en contacto y/o se incorporan a una célula, producen un efecto sobre la célula que incluye causar la muerte de la célula, inhibir la división de la célula o inducir la diferenciación.
Como se utiliza en la presente memoria, el término "toxina" se pretende que designe compuestos que cuando se ponen en contacto con y/o se incorporan a una célula producen la muerte de la célula.
Como se utiliza en la presente memoria, el término "radioterapéutico" se pretende que designe radionucleidos que cuando se ponen en contacto con y/o se incorporan a una célula producen la muerte de la célula.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "agente de direccionamiento" se pretende que designe compuestos que pueden unirse a y/o reaccionar con otros compuestos. Los agentes de direccionamiento pueden utilizarse para liberar compuestos quimioterapéuticos, toxinas, enzimas, compuestos radioterapéuticos, anticuerpos o agentes formadores de imágenes a células que tienen agentes de direccionamiento asociados a ellos y/o para convertir o transformar de otro modo o potenciar los agentes activos coadministrados. Un agente de direccionamiento puede incluir un resto que constituye un primer agente que está localizado en la célula que, cuando se pone en contacto con un segundo agente cualquiera, se convierte en un tercer agente que tiene una actividad deseada o causa la conversión del segundo agente en un agente con una actividad deseada. El resultado es que el agente localizado facilita la exposición de un agente con una actividad deseada a la célula metastatizada.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "agente de radiosensibilización" se pretende que designe agentes que aumentan la susceptibilidad de las células a los efectos dañinos de la radiación ionizante. Un agente de radiosensibilización permite administrar menores dosis de radiación y seguir proporcionando una dosis terapéuticamente eficaz.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "agente formador de imágenes" se pretende que designe compuestos que pueden ser detectados.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "resto de unión a receptor de ST" se pretende que designe la porción de un compuesto conjugado que constituye un ligando de receptor de ST.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "resto activo" se pretende que designe la porción de un compuesto conjugado que constituye un agente activo.
Como se utiliza en la presente memoria, las expresiones "compuesto conjugado" y "composición conjugada" se utilizan intercambiablemente y se pretende que designen un compuesto que comprende un resto de unión a receptor de ST y un resto activo, y que es capaz de unirse al receptor de ST. Los compuestos conjugados según la presente invención comprenden una porción que constituye un ligando de receptor de ST y una porción que constituye un agente activo. Por tanto, los compuestos conjugados según la presente invención son capaces de unirse específicamente al receptor de ST e incluyen una porción que es un agente terapéutico o agente formador de imágenes. Las composiciones conjugadas pueden comprender reticulantes y/o moléculas que sirven como espaciadores entre los restos.
Como se utilizan en la presente memoria, los términos "reticulante", "agente reticulante", "agente de conjugación", "agente de acoplamiento", "reactivo de condensación" y "reticulante bifuncional" se utilizan intercambiablemente y se pretende que designen grupos moleculares que se utilizan para unir el ligando del receptor de ST y el agente activo para formar así el compuesto conjugado.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "cáncer colorrectal" es pretende que incluya la definición médica bien aceptada que define el cáncer colorrectal como una afección médica caracterizada por cáncer de las células del tracto intestinal por debajo del intestino delgado (concretamente el intestino grueso (colon), incluyendo ciego, colon ascendente, colon transversal, colon descendente y colon sigmoideo y recto). Adicionalmente, como se utiliza en la presente memoria, la expresión "cáncer colorrectal" se pretende que incluya además afecciones médicas que se caracterizan por el cáncer de células del duodeno e intestino delgado (yeyuno e íleo). La definición de cáncer colorrectal utilizada en la presente memoria es más extendida que la definición médica común, pero se proporciona como tal puesto que las células del duodeno e intestino delgado contienen también receptores de ST y son por tanto susceptibles de los procedimientos de la presente invención utilizando los compuestos de la presente invención.
Como se utiliza en la presente memoria, el término "metástasis" se pretende que designe el proceso en el que las células cancerosas originadas en un órgano o parte del cuerpo se relocalizan en otra parte del cuerpo y siguen replicándose. Las células metastatizadas forman posteriormente tumores que pueden metastatizar adicionalmente. La metástasis designa así la difusión del cáncer desde la parte del cuerpo en que aparece originalmente a otras partes del cuerpo. La presente invención se refiere a procedimientos de liberación de agentes activos a células de cáncer colorrectal metastatizadas.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "células de cáncer colorrectal metastatizadas" se pretende que designe células de cáncer colorrectal que han metastatizado; las células de cáncer colorrectal localizadas en una parte del cuerpo distinta de duodeno, intestino delgado (yeyuno e íleo), intestino grueso (colon), incluyendo ciego, colon ascendente, colon transversal, colon descendente y colon sigmoideo y recto.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "muestra no colorrectal" y "muestra extraintestinal" se utilizan intercambiablemente y pretenden designar una muestra de tejido o fluido corporal de una fuente distinta del tejido colorrectal. En algunas realizaciones preferidas, la muestra no colorrectal es una muestra de tejido tal como nódulos linfáticos. En algunas realizaciones preferidas, la muestra no colorrectal es una muestra de tejido extraintestinal que es un adenocarcinoma de origen no confirmado. En algunas realizaciones preferidas, la muestra no colorrectal es una muestra de sangre.
Como se utiliza en la presente memoria, "un individuo que sufre un adenocarcinoma de origen no confirmado" se pretende que designe un individuo que tiene un tumor en el que el origen no se ha identificado definitivamente.
Como se utiliza en la presente memoria, "un individuo sospechoso de ser susceptible de cáncer colorrectal metastatizado" se pretende que designe un individuo que tiene un riesgo particular de desarrollar cáncer colorrectal metastatizado. Son ejemplos de individuos con riesgo particular de desarrollar cáncer colorrectal metastatizado aquellos cuyo historial médico familiar indica una incidencia superior a la media de cáncer colorrectal entre los miembros de la familia y/o aquellos que han desarrollado ya cáncer colorrectal y se han tratado eficazmente, los que se enfrentan por lo tanto al riesgo de recaída y recurrencia.
La ST, cuando se produce por E. coli así como por otros organismos, es responsable de diarrea endémica en los países en desarrollo y de diarrea de los viajeros. La ST induce la secreción intestinal mediante la unión a receptores específicos, receptores de ST, en las membranas apicales del borde de cepillo de las células mucosas que recubren el tracto intestinal. La unión de ST a receptores de ST no es covalente y ocurre de manera dependiente de la concentración y de modo saturable. Una vez unida, los complejos ST-receptor ST parecen internalizarse por las células intestinales, concretamente transportarse de la superficie al interior de la célula. La unión de ST a receptores de ST desencadena una cascada de reacciones bioquímicas en la membrana apical que induce a las células intestinales a secretar fluidos y electrolitos, dando como resultado diarrea.
Los receptores de ST son únicos en que se localizan sólo en las membranas apicales del borde de cepillo de las células que recubren el tracto intestinal. Es más, no se encuentran en ningún otro tipo celular en mamíferos placentarios. Además, los receptores de ST se localizan casi exclusivamente en las membranas apicales, encontrándose pocos en las membranas basolaterales de los lados de las células intestinales.
Las células mucosas que recubren el intestino se unen entre sí mediante estrechas junturas que forman una barrera contra el paso de los contenidos intestinales a la corriente sanguínea y de los componentes de la corriente sanguínea al lumen intestinal. Por lo tanto, la localización apical de los receptores de ST aísla estos receptores del sistema circulatorio, de modo que puede considerarse que existen separadamente del resto del cuerpo; esencialmente "fuera" del cuerpo. Por lo tanto, el resto del cuerpo se considera "fuera" del tracto intestinal. Las composiciones administradas "fuera" del tracto intestinal se mantienen aparte y se segregan de las únicas células que expresan normalmente receptores de ST. A la inversa, las muestras de tejido tomadas de tejido fuera del tracto intestinal no contienen normalmente células que expresan receptores de ST.
En individuos que sufren cáncer colorrectal, las células cancerosas derivan a menudo de células que producen y presentan el receptor de ST, y estas células cancerosas siguen produciendo y presentando el receptor de ST en sus superficies celulares. Es más, las células T84, que son células de adenocarcinoma colónico humano aisladas de metástasis pulmonares, expresan receptores de ST en su superficie celular. De forma similar, las células HT29glu, que son células de adenocarcinoma colónico humano, expresan receptores de ST. Por tanto, en individuos que sufren cáncer colorrectal, algunas células cancerosas intestinales metastatizadas expresan receptores de ST.
Se acometió un esfuerzo por determinar la proporción de tumores colorrectales que tienen el receptor de ST. Se confirmó independientemente que vada uno de los tumores ensayados era cáncer colorrectal por técnicas estándar de patología quirúrgica. Cada uno de los tumores de cáncer colorrectal ensayados, incluyendo los tumores colorrectales locales y tumores colorrectales metastatizados (hígado, pulmón, nódulo linfático, peritoneo, ovarios) poseía receptores de ST. En cada caso, la afinidad y densidad de los receptores era susceptible de direccionamiento. Se encontró que las células normales de hígado, nódulo linfático, peritoneo, vesícula biliar, ovario, estómago, riñón y pulmón no poseían receptores de ST.
Cuando dichas células cancerosas metastatizan, las células cancerosas metastatizadas siguen produciendo y presentando el receptor de ST. La expresión de receptores de ST en la superficie de los tumores metastásicos proporciona una diana para la unión selectiva de composiciones conjugadas. Los receptores de ST permiten el direccionamiento absolutamente específico de compuestos terapéuticos y agentes de diagnóstico que están conjugados con ligandos de receptor de ST a células cancerosas colorrectales metastáticas.
Según algunas realizaciones de la invención, se proporcionan composiciones y procedimientos para detectar, formar imágenes o tratar tumores colorrectales en un individuo.
Las composiciones conjugadas de la presente invención son útiles para dirigir a células que recubren la pared intestinal interna, incluyendo aquellas células cancerosas derivadas de dichas células, particularmente células cancerosas metastatizadas derivadas de dichas células. Las composiciones conjugadas de la presente invención que se administran fuera del tracto gastrointestinal, tales como las administradas al sistema circulatorio, permanecerán segregadas de las células que recubren el tracto intestinal y se unirán sólo a las células fuera del tracto intestinal que derivan del tracto intestinal, tales como las células colorrectales metastatizadas. Las composiciones conjugadas no se unirán a células derivadas no colorrectales. Por tanto, los restos activos de las composiciones conjugadas administradas fuera del tracto intestinal se liberan a células que derivan del tracto intestinal tales como células colorrectales metastatizadas, pero no se liberarán a ninguna otra célula.
Las composiciones farmacéuticas terapéuticas y de diagnóstico de la presente invención incluyen compuestos conjugados dirigidos específicamente a la enfermedad metastática. Estos compuestos conjugados incluyen restos de unión a receptor de ST que no se unen a células de tejido normal en el cuerpo excepto a células del tracto intestinal, puesto que las células de otros tejidos no poseen receptores de ST. Al contrario que las células colorrectales normales y células de cáncer colorrectal localizadas, las células de cáncer colorrectal metastatizadas son accesibles a sustancias administradas fuera del tracto intestinal, por ejemplo administradas al sistema circulatorio. Los únicos receptores de ST en el tejido normal existen en las membranas apicales de células de la mucosa intestinal, y estos receptores están eficazmente aislados de los compuestos quimioterapéuticos cancerosos dirigidos y agentes formadores de imágenes administrados fuera del tracto intestinal por la barrera mucosa intestinal. Por tanto, las células colorrectales metastatizadas pueden dirigirse mediante compuestos conjugados de la presente invención introduciendo dichos compuestos fuera del tracto intestinal, tal como por ejemplo administrando composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos conjugados al sistema circulatorio.
Un experto en la técnica puede identificar fácilmente los individuos sospechosos de sufrir cáncer colorrectal y células colorrectales metastatizadas. En aquellos individuos diagnosticados con cáncer colorrectal, es una terapia estándar sospechar metástasis e intentar erradicar agresivamente las células metastatizadas. La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas y procedimientos para formar imágenes y diagnosticar así más definitivamente la metástasis. Además, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden agentes terapéuticos y procedimientos para dirigirse a y eliminar específicamente células de cáncer colorrectales. Además, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos terapéuticos y procedimientos para eliminar específicamente células de cáncer colorrectal.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden composiciones conjugadas de la presente invención pueden utilizarse para diagnosticar o tratar individuos que sufren tumores colorrectales localizados, es decir, tumores colorrectales primarios o no metastáticos si estos han penetrado en la membrana basal por debajo de la mucosa a la submucosa donde hay un abundante suministro sanguíneo al que tener acceso. La penetración en la submucosa supera la barrera mucosa, dando como resultado la capacidad de las composiciones conjugadas de introducirse en el sistema circulatorio para interaccionar con estos tumores.
La presente invención se basa en el uso de un resto de unión a receptor de ST en una composición conjugada. El resto de unión a receptor de ST es esencialmente una porción de la composición conjugada que actúa como ligando de receptor de ST y se une así específicamente a estos receptores. La composición conjugada incluye también un resto activo que está asociado al resto de unión a receptor de ST; siendo el resto activo un agente activo que es útil para formar imágenes de, dirigir a, neutralizar o matar la célula.
Según la presente invención, el resto de unión a receptor de ST es la porción de ligando de receptor de ST de una composición conjugada. En algunas realizaciones, el ligando de receptor de ST puede ser ST nativa.
La ST nativa se ha aislado de una variedad de organismos incluyendo E. coli, Yersinia, Enterobacter y otros. En la naturaleza, las toxinas se codifican generalmente en un plásmido que puede "saltar" entre diferentes especies. Se han reseñado diversas toxinas diferentes que aparecen en diferentes especies. Estas toxinas poseen todas una homología de secuencia significativa, todas se unen a receptores de ST y todas activan la guanilato ciclasa, produciendo diarrea.
La ST se ha tanto clonado como sintetizado mediante técnicas químicas. Las moléculas clonadas o sintéticas exhiben características de unión que son similares a la ST nativa. La ST nativa aislada de E. coli es de 18 ó 19 aminoácidos de longitud. El "fragmento" más pequeño de ST que retiene actividad es el péptido núcleo de 13 aminoácidos que se extiende hacia la terminación carboxilo desde la cisteína 6 a la cisteína 18 (de la forma de 19 aminoácidos). Se han generado análogos de ST mediante clonación y técnicas químicas. Pueden construirse fragmentos peptídicos pequeños de la estructura de la ST nativa que incluyen el determinante estructural que confiere actividad de unión.
La SEC Nº ID 1 da a conocer una secuencia nucleotídica que codifica la ST de 19 aminoácidos, designada como ST Ia, reseñada por So y McCarthy (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4011, que se incorpora a la presente memoria como referencia.
La secuencia aminoacídica de ST Ia se da a conocer en la SEC Nº ID 2.
La SEC Nº ID 3 da a conocer la secuencia aminoacídica de un péptido de 18 aminoácidos que exhibe actividad ST, designado ST I*, reseñado por Chan y Giannella (1981) J. Biol. Chem. 256: 7744, que se incorpora a la presente memoria como referencia.
La SEC Nº ID 4 da a conocer una secuencia nucleotídica que codifica ST de 19 aminoácidos, designada ST Ib, reseñada por Mosely et al. (1983) Infect. Immun. 39: 1167, que se incorpora a la presente memoria como referencia.
La secuencia aminoacídica de ST Ib se da a conocer en la SEC Nº ID 5.
Se ha identificado un péptido de 15 aminoácidos denominado guanilina que tiene aproximadamente 50% de homología de secuencia con ST en intestino de mamífero (Curie, M.G. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 947-951, que se incorpora a la presente memoria como referencia). La guanilina se une a receptores de ST y activa la guanilato ciclasa a un nivel de aproximadamente 10 a 100 veces menor que la ST nativa. La guanilina puede no existir en forma de un péptido de 15 aminoácidos en el intestino, sino en lugar de ello como parte de una proteína mayor en ese órgano. La secuencia aminoacídica de la guanilina de roedor se da a conocer en la SEC Nº ID 6.
La SEC Nº ID 7 es un fragmento de 18 aminoácidos de la SEC Nº ID 2. La SEC Nº ID 8 es un fragmento de 17 aminoácidos de la SEC Nº ID 2. La SEC Nº ID 9 es un fragmento de 16 aminoácidos de la SEC Nº ID 2. La SEC Nº ID 10 es un fragmento de 15 aminoácidos de la SEC Nº ID 2. La SEC Nº ID 11 es un fragmento de 14 aminoácidos de la SEC Nº ID 2. La SEC Nº ID 12 es un fragmento de 13 aminoácidos de la SEC Nº ID 2. La SEC Nº ID 13 es un fragmento de 18 aminoácidos de la SEC Nº ID 2. La SEC Nº ID 14 es un fragmento de 17 aminoácidos de la SEC Nº ID 2. La SEC Nº ID 15 es un fragmento de 16 aminoácidos de la SEC Nº ID 2. La SEC Nº ID 16 es un fragmento de 15 aminoácidos de la SEC Nº ID 2. La SEC Nº ID 17 es un fragmento de 14 aminoácidos de la SEC Nº ID 2.
La SEC Nº ID 18 es un fragmento de 17 aminoácidos de la SEC Nº ID 3. La SEC Nº ID 19 es un fragmento de 16 aminoácidos de la SEC Nº ID 3. La SEC Nº ID 20 es un fragmento de 15 aminoácidos de la SEC Nº ID 3. La SEC Nº ID 21 es un fragmento de 14 aminoácidos de la SEC Nº ID 3. La SEC Nº ID 22 es un fragmento de 13 aminoácidos de la SEC Nº ID 3. La SEC Nº ID 23 es un fragmento de 17 aminoácidos de la SEC Nº ID 3. La SEC Nº ID 24 es un fragmento de 16 aminoácidos de la SEC Nº ID 3. La SEC Nº ID 25 es un fragmento de 15 aminoácidos de la SEC Nº ID 2. La SEC Nº ID 26 es un fragmento de 14 aminoácidos de la SEC Nº ID 2.
La SEC Nº ID 27 es un fragmento de 18 aminoácidos de la SEC Nº ID 5. La SEC Nº ID 28 es un fragmento de 17 aminoácidos de la SEC Nº ID 5. La SEC Nº ID 29 es un fragmento de 16 aminoácidos de la SEC Nº ID 5. La SEC Nº ID 30 es un fragmento de 15 aminoácidos de la SEC Nº ID 5. La SEC Nº ID 31 es un fragmento de 14 aminoácidos de la SEC Nº ID 5. La SEC Nº ID 32 es un fragmento de 13 aminoácidos de la SEC Nº ID 3. La SEC Nº ID 33 es un fragmento de 18 aminoácidos de la SEC Nº ID 5. La SEC Nº ID 34 es un fragmento de 17 aminoácidos de la SEC Nº ID 5. La SEC Nº ID 35 es un fragmento de 16 aminoácidos de la SEC Nº ID 5. La SEC Nº ID 36 es un fragmento de 15 aminoácidos de la SEC Nº ID 5. La SEC Nº ID 37 es un fragmento de 14 aminoácidos de la SEC Nº ID 5.
La SEC Nº ID 27, SEC Nº ID 31, SEC Nº ID 36 y SEC Nº ID 37 se dan a conocer en Yoshimura, S., et al. (1985) FEBS Lett. 181: 138, que se incorpora a la presente memoria como referencia.
La SEC Nº ID 38, SEC Nº ID 39 y SEC Nº ID 40, que son derivadas de la SEC Nº ID 3, se dan a conocer en Waldman, S.A. y O'Hanley, P. (1989) Infect. Immun. 57: 2420, que se incorpora a la presente memoria como referencia.
La SEC Nº ID 41, SEC Nº ID 42, SEC Nº ID 43, SEC Nº ID 44 y SEC Nº ID 45, que son derivadas de la SEC Nº ID 3, se dan a conocer en Yoshimura, S., et al. (1985) FEBS Lett. 181: 138, que se incorpora a la presente memoria como referencia.
La SEC Nº ID 46 es un péptido de 25 aminoácidos derivado de Y. enterocolitica que se une al receptor de ST.
La SEC Nº ID 47 es un péptido de 16 aminoácidos derivado de V. cholerae que se une al receptorde ST. La SEC Nº ID 47 se reseña en Shimonishi, Y., et al. FEBS Lett. 215: 165, que se incorpora a la presente memoria como referencia.
La SEC Nº ID 48 es un péptido de 18 aminoácidos derivado de Y. enterocolitica que se une al receptor de ST. La SEC Nº ID 48 se reseñan por Okamoto, K., et al., Infec. Immun. 55: 2121, que se incorpora a la presente memoria como referencia.
La SEC Nº ID 49 es un derivado de la SEC Nº ID 5.
La SEC Nº ID 50, SEC Nº ID 51, SEC Nº ID 52 y SEC Nº ID 53 son derivados.
La SEC Nº ID 54 es la secuencia aminoacídica de guanilina de seres humanos.
En algunas realizaciones preferidas, los compuestos conjugados comprenden restos de unión a receptor de ST que comprenden secuencias aminoacídicas seleccionadas del grupo constituido por SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3, SEC Nº ID 5-54 y fragmentos y derivados de los mismos.
Los expertos en la técnica pueden diseñar y producir fácilmente derivados que tienen secuencias aminoacídicas sustancialmente idénticas de péptidos ST con deleciones y/o inserciones y/o sustituciones conservativas de aminoácidos. Por ejemplo, siguiendo las que se designan como reglas de Dayhof para la sustitución aminoacídica (Dayhof, M.D. (1978) Nat. Biomed. Res. Found., Washington DC, vol. 5, sup. 3), los residuos aminoacídicos en una secuencia peptídica pueden sustituirse con residuos aminoacídicos comparables. Dichas sustituciones son bien conocidas y se basan en las características de carga y estructurales de cada aminoácido. Los derivados incluyen fragmentos de péptidos de unión a receptor de ST con deleciones y/o inserciones y/o sustituciones conservativas.
En algunas realizaciones, los péptidos de unión a receptor de ST comprenden D-aminoácidos. Como se utiliza en la presente memoria, el término "péptidos D-aminoacídicos" se pretende que designe péptidos, fragmentos o derivados de unión al receptor de ST, que comprenden al menos uno y preferiblemente una pluralidad de D-aminoácidos, que son capaces de unirse al receptor de ST. El uso de péptidos D-aminoacídicos es deseable, ya que son menos vulnerables a la degradación y por lo tanto tienen una semivida más larga. Los péptidos D-aminoacídicos que comprenden todos en su mayoría o están constituidos por D-aminoácidos pueden comprender secuencias aminoacídicas en orden inverso a los péptidos de unión a receptor que se componen de L-aminoácidos.
En algunas realizaciones, los péptidos de unión a receptor de ST, incluyendo péptidos D-aminoacídicos, están conformacionalmente restringidos para presentar y mantener la conformación estructural apropiada para la unión al receptor de ST. Las composiciones pueden comprender residuos aminoacídicos adicionales requeridos para conseguir una conformación tridimensional apropiada, incluyendo residuos que facilitan la circularización o plegado deseados
Se prefiere que el ligando de receptor de ST utilizado como resto de unión a receptor de ST sea tan pequeño como sea posible. Por tanto, se prefiere que el ligando de receptor de ST sea un péptido pequeño, preferiblemente menor de 25 aminoácidos, más preferiblemente menor de 20 aminoácidos. En algunas realizaciones, el ligando de receptor de ST que constituye el resto de unión a receptor de ST de una composición conjugada es menor de 15 aminoácidos. Pueden utilizarse péptidos de unión a receptor de ST que comprenden menos de 10 aminoácidos y péptidos de unión a receptor de ST menores de 5 aminoácidos como restos de unión a ST según la presente invención. Está dentro del alcance de la presente invención incluir moléculas más grandes que sirven como restos de unión a receptor de ST incluyendo, pero sin limitación, moléculas tales como anticuerpos, FAb y F(Ab)2 que se unen específicamente al receptor de ST.
Puede utilizarse un ensayo para ensayar composiciones para determinar si son ligandos de receptor de ST o no, o para ensayar composiciones conjugadas para determinar si poseen actividad de unión a receptor de ST. Dichas composiciones que se unen específicamente a receptores de ST pueden identificarse mediante un ensayo de unión competitiva. El ensayo de unión competitiva es una técnica estándar en farmacología que puede realizarse fácilmente por los expertos en la técnica utilizando materiales de partida fácilmente disponibles. Los ensayos de unión competitiva, ensayos de unión a receptor de ST, se han mostrado eficaces para identificar composiciones que se unen específicamente a receptores de ST. Brevemente, el ensayo consiste en incubar una preparación de receptores de ST (por ejemplo membranas intestinales de intestino de rata, intestino humano, células T84) con una concentración constante (1 x 10^{-10} M a 5 x 10^{-10} M) de ^{126}I-ST (puede utilizarse cualquier ligando de receptor de ST tal como ST nativa de SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 o SEC Nº ID 5) y una concentración conocida de un compuesto de ensayo. Como control, se incuba una preparación duplicada de receptores de ST con una concentración duplicada de ^{125}I-ST en ausencia del compuesto de ensayo. Los ensayos se incuban hasta equilibrio (2 horas) y se cuantifica la cantidad de ^{126}I-ST unida a los receptores mediante técnicas estándar. Se mide la capacidad del compuesto de ensayo de unirse a receptores así como su capacidad de evitar (compitiendo con ella) la unión de ^{126}I-ST. Por tanto, en ensayos que contienen el compuesto de ensayo que se une al receptor, habrá menos radiactividad asociada a los receptores. Este ensayo, que es apropiado para determinar la capacidad de cualquier molécula de unirse a receptores de ST, es un ensayo de unión competitiva estándar que puede emplearse fácilmente por los expertos en la técnica utilizando materiales de partida fácilmente disponibles.
La ST puede aislarse de fuentes naturales utilizando técnicas estándar. Adicionalmente, los péptidos de unión a receptor de ST y composiciones conjugadas o porciones de las mismas que son péptidos pueden prepararse rutinariamente mediante cualquiera de las siguientes técnicas conocidas.
Los péptidos de unión a receptor de ST y composiciones conjugadas o porciones de las mismas que son péptidos pueden prepararse utilizando la técnica sintética en fase sólida inicialmente descrita por Merrifield en J. Am. Chem. Soc., 2149-2154 (1963). Pueden encontrarse otras técnicas de síntesis de péptidos por ejemplo en M. Bodanszky et al., (1976) Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 2ª ed.; Kent y Clark-Lewis en Synthetic Peptides in Biology and Medicine, pág. 295-358, eds. Alitalo, K., et al., Science Publishers, (Ámsterdam, 1985); así como otros trabajos de referencia conocidos por los expertos en la técnica. Puede encontrarse un sumario de técnicas de síntesis peptídica en J. Stuart y J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthelia, Pierce Chemical Company, Rockford, IL (1984), que se incorpora a la presente memoria como referencia. La síntesis de péptidos mediante procedimientos en solución puede utilizarse también, como se describe en "The Proteins", vol. II, 3ª ed., pág. 105-237, Neurath, H. et al., eds., Academic Press, Nueva York, NY (1976). Se encontrarán los grupos protectores adecuados para uso en dichas síntesis en los textos anteriores, así como en J.F.W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, Nueva York, NY (1973), que se incorpora a la presente memoria como referencia. En general, estos procedimientos sintéticos implican la adición secuencial de uno o más residuos aminoacídicos o residuos aminoacídicos protegidos a una cadena peptídica creciente. Normalmente, se protege el grupo amino o carboxilo del primer residuo aminoacídico mediante un grupo protector eliminable selectivamente adecuado. Se utiliza un grupo protector eliminable selectivamente diferente para aminoácidos que contienen un grupo lateral reactivo, tal como la lisina.
Utilizando una síntesis en fase sólida como ejemplo, el aminoácido protegido o derivatizado se une a un soporte sólido inerte a través de su grupo carboxilo o amino no protegido. El grupo protector del grupo amino o carboxilo se elimina después selectivamente y se mezcla el siguiente aminoácido en la secuencia que tiene el grupo complementario (amino o carboxilo) adecuadamente protegido y se hace reaccionar con el residuo ya unido al soporte sólido. El grupo protector del grupo amino o carboxilo se elimina después de este residuo aminoacídico recién añadido, y se añade después el siguiente aminoácido (adecuadamente protegido), y así. Después de haber ligado todos los aminoácidos deseados en la secuencia apropiada, se eliminan secuencialmente o simultáneamente cualquier grupo protector de grupo terminal y lateral restante (y el soporte sólido) para proporcionar el péptido final. El péptido de la invención está preferiblemente desprovisto de aminoácidos bencilados o metilbencilados. Dichos restos grupos protectores pueden utilizarse en el transcurso de la síntesis, pero se eliminan antes de utilizar los péptidos. Pueden ser necesarias reacciones adicionales, como se describen en otra parte, para formar enlaces intramoleculares para restringir la conformación.
Los péptidos de unión a receptor de ST y composiciones conjugadas o porciones de las mismas que son péptidos pueden prepararse también mediante técnicas de ADN recombinante. La provisión de una secuencia de ADN adecuada que codifica el péptido deseado permite la producción del péptido utilizando técnicas recombinantes actualmente conocidas en la técnica. La secuencia de codificación puede obtenerse de fuentes naturales o sintetizarse o construirse de otro modo utilizando materiales de partida ampliamente disponibles mediante procedimientos rutinarios. Cuando se prepara sintéticamente el ADN de codificación, pueden aprovecharse las preferencias de codón conocidas del pretendido hospedador en el que se ha de expresar el ADN.
Para producir un péptido de unión a receptor de ST que aparece en la naturaleza, un experto en la técnica puede, utilizando técnicas bien conocidas, obtener una molécula de ADN que codifica los péptidos de unión a receptor de ST del genoma del organismo que produce el péptido de unión al receptor de ST e insertar esa molécula de ADN en un vector de expresión disponible comercialmente para uso en sistemas de expresión bien conocidos.
Igualmente, un experto en la técnica puede, utilizando técnicas bien conocidas, combinar una molécula de ADN que codifica un péptido de unión a receptor de ST, tal como SEC Nº ID 1 y SEC Nº ID 4, que pueden obtenerse del genoma del organismo que produce la ST, con ADN que codifica una toxina, otro agente activo que es un péptido o, adicionalmente, cualquier otra secuencia aminoacídica que se desea adyacente a la secuencia aminoacídica del péptido de unión a receptor de ST en un solo péptido, e insertar esa molécula de ADN en un vector de expresión comercialmente disponible para uso en sistemas de expresión bien conocidos.
Por ejemplo, el plásmido pSE420 comercialmente disponible (Invitrogen, San Diego, CA) puede utilizarse para producción recombinante en E. coli. El plásmido pYES2 comercialmente disponible (Invitrogeno, San Diego, CA) puede utilizarse para la producción en cepas de levadura S. cerevisiae. El sistema de expresión en baculovirus completo MaxBac™ comercialmente disponible (Invitrogen, San Diego, CA) puede utilizarse para producción en células de insecto. El plásmido comercialmente disponible pcDNA I (Invitrogen, San Diego, CA) puede utilizarse para producción en células de mamífero tales como células de ovario de hámster chino.
Un experto en la técnica puede utilizar estos u otros vectores y sistemas de expresión comercialmente disponibles o producir vectores utilizando procedimientos bien conocidos y materiales de partida fácilmente disponibles. Los sistemas de expresión que contienen las secuencias de control necesarias, tales como promotores y señales de poliadenilación, y preferiblemente potenciadores, están fácilmente disponibles y son conocidos en la técnica para una variedad de hospedadores. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", 2ª ed., Cold Spring Harbor Press (1989). Por tanto, las proteínas deseadas pueden prepararse tanto en sistemas procarióticos como eucarióticos, dando como resultado un espectro de formas procesadas de la proteína.
El sistema procariótico más habitualmente utilizado sigue siendo E. coli, aunque son también útiles otros sistemas tales como B. subtilis y Pseudomonas. Las secuencias de control adecuadas para sistemas procarióticos incluyen tanto promotores constitutivos como inducibles, incluyendo el promotor lac, el promotor trp, promotores híbridos tales como el promotor tac, el promotor P1 del fago lambda. En general, pueden producirse proteínas extrañas en estos hospedadores en forma de proteínas de fusión o maduras. Cuando se producen las secuencias deseadas en forma de proteínas maduras, la secuencia producida puede precederse por una metionina que no se elimina necesariamente de forma eficaz. En consecuencia, los péptidos y proteínas reivindicados en la presente memoria pueden precederse por una Met N-terminal cuando se producen en bacterias. Además, pueden prepararse constructos en los que la secuencia de codificación del péptido está precedida por un péptido señal operativo que da como resultado la secreción de la proteína. Cuando se produce en hospedadores procarióticos de esta manera, la secuencia señal se elimina tras la secreción.
Están ahora disponibles una amplia variedad de hospedadores eucarióticos para la producción de proteínas extrañas recombinantes. Como en las bacterias, los hospedadores eucarióticos pueden transformarse con sistemas de expresión que producen la proteína deseada directamente, pero más habitualmente, se proporcionan secuencias señal para efectuar la secreción de la proteína. Los sistemas eucarióticos tienen la ventaja adicional de que son capaces de procesar intrones que pueden aparecer en secuencias genómicas que codifican proteínas de organismos superiores. Los sistemas eucarióticos proporcionan también una variedad de mecanismos de procesamiento que dan como resultado, por ejemplo, glicosilación, amidación carboxi-terminal, oxidación o derivatización de ciertos residuos aminoacídicos, control conformacional y demás.
Los sistemas eucarióticos utilizados habitualmente incluyen, pero sin limitación, levadura, células fúngicas, células de insecto, células de mamífero, células de ave y células de plantas superiores. Están disponibles promotores adecuados que son compatibles y operativos para uso en cada uno de estos tipos de hospedador, así como las secuencias de terminación y potenciadoras, como por ejemplo el promotor de baculovirus poliédrico. Como anteriormente, los promotores pueden ser constitutivos o inducibles. Por ejemplo, en sistemas de mamíferos, el promotor de metalotioneno de ratón puede inducirse mediante la adición de iones de metales pesados.
Los particulares para la construcción de sistemas de expresión adecuados para los hospedadores deseados son conocidos por los expertos en la técnica. Para la producción recombinante de la proteína, se liga adecuadamente el ADN que la codifica al vector de expresión de expresión de elección y después se utiliza para transformar el hospedador compatible, que se cultiva después y se mantiene en condiciones en las que tiene lugar la expresión del gen extraño. La proteína de la presente invención así producida se recupera del cultivo mediante lisado de las células o a partir del medio de cultivo según sea apropiado y conocido por los expertos en la técnica.
Un experto en la técnica puede, utilizando técnicas bien conocidas, aislar la proteína que se produce.
Según la presente invención, el resto activo puede ser un agente terapéutico o un agente formador de imágenes. Un experto en la técnica puede reconocer fácilmente las ventajas de ser capaz de dirigirse específicamente a células colorrectales mestastatizadas con un ligando de receptor de ST y conjugar dicho ligando con muchos agentes activos diferentes.
Los compuestos quimioterapéuticos útiles como restos activos que cuando se conjugan con un resto de unión a receptor de ST se liberan específicamente a células colorrectales metastatizadas, son típicamente entidades químicas pequeñas producidas mediante síntesis química. Los compuestos quimioterapéuticos incluyen fármacos citotóxicos y citostáticos.
Los compuestos quimioterapéuticos pueden incluir aquellos que tienen otros efectos sobre las células tales como la reversión del estado transformado a un estado diferenciado o aquellos que inhiben la replicación celular. Los ejemplos de compuestos quimioterapéuticos incluyen fármacos citotóxicos o citostáticos comunes tales como por ejemplo: metotrexato (ametopterina), doxorubicina (adrimicina), daunorubicina, citosinarabinósido, etopósido, 5-fluorouracilo, melfalano, clorambucilo y otras mostazas nitrogenadas (por ejemplo ciclofosfamida), cis-platino, vindesina (y otros alcaloides vinca), mitomicina y bleomicina. Otros compuestos quimioterapéuticos incluyen purotionina (oligopéptido de harina de cebada), macromomicina, derivados de 1,4-benzoquinona y Trenimon.
Las toxinas son útiles como restos activos. Cuando se conjuga una toxina con un resto de unión a receptor de ST, la composición conjugada se libera específicamente a una célula colorrectal metastatizada mediante el resto de unión a receptor de ST y el resto toxina mata la célula. Las toxinas son generalmente productos tóxicos complejos de diversos organismos incluyendo bacterias, plantas, etc. Los ejemplos de toxina incluyen, pero sin limitación: ricina, cadena A de ricina (toxina ricina), exotoxina de Pseudomonas (PE), toxina de difteria (DT), fosfolipasa C de Clostridium perfringens (PLC), ribonucleasa pancreática bovina (BPR), proteína antiviral de fitolaca (PAP), abrina, cadena A de abrina (toxina abrina), factor de veneno de cobra (CVF), gelonina (GEL), saporina (SAP), modecina, viscumina y volkensina. Como se discutió anteriormente, cuando se emplean toxinas proteicas con péptidos de unión a receptor de ST, pueden producirse composiciones conjugadas utilizando técnicas de ADN recombinante. Brevemente, puede construirse una molécula de ADN recombinante que codifica tanto el ligando de receptor de ST como la toxina a un gen quimérico. Cuando se expresa el gen quimérico, se produce una proteína de fusión que incluye un resto de unión a receptor de ST y un resto activo. Las toxinas proteicas son también útiles para formar compuestos conjugados con péptidos de unión al receptor de ST mediante enlaces no peptídicos.
Además, existen otros enfoques para utilizar agentes activos para el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, pueden producirse composiciones conjugadas que incluyen un resto de unión a ST y un resto activo que es una enzima activa. El resto de unión a ST localiza específicamente la composición conjugada a las células tumorales. Se administra al paciente un profármaco inactivo que puede convertirse por la enzima en un fármaco activo. El profámaco se convierte sólo en un fármaco activo por la enzima que está localizada en el tumor. Un ejemplo de un par enzima/profármaco incluye fosfatasa alcalina/etoposidofosfato. En dicho caso, la fosfatasa alcalina se conjuga con un ligando de unión a receptor de ST. El compuesto conjugado se administra y se localiza en la célula metastatizada. Tras el contacto con etoposidofosfato (el profármaco), el etoposidofosfato se convierte en etopósido, un fármaco quimioterapéutico que se incorpora a la célula cancerosa.
Los agentes de radiosensibiliación son sustancias que aumentan la sensibilidad de las células a la radiación. Los ejemplos de agentes de radiosensibilización incluyen nitromidazoles, metronidazol y misonidazol (véase: DeVita, V.T., Jr. en "Harrison's Principles of Internal Medicine", pág. 68, McGraw-Hill Book Co., N.Y. 1983, que se incorpora a la presente memoria como referencia). Se administra el compuesto conjugado que comprende un agente de radiosensibilización como resto activo y se localiza en la célula metastatizada. Tras la exposición del individuo a radiación, el agente de radiosensibilización se "excita" y causa la muerte de la célula.
Pueden utilizarse radionucleidos en composiciones farmacéuticas que son útiles para procedimientos de radioterapia o formación de imágenes.
Los ejemplos de radionucleidos útiles como toxinas en terapia de radiación incluyen: ^{47}Sc, ^{67}Cu, ^{90}Y, ^{109}Pd, ^{123}I, ^{125}I, ^{131}I, ^{186}Re, ^{188}Re, ^{199}Au, ^{211}At, ^{212}Pb y ^{212}B. Otros radionucleidos que se han utilizado por los expertos en la técnica incluyen: ^{32}P y ^{33}P, ^{71}Ge, ^{77}As, ^{103}Pb, ^{105}Rh, ^{111}Ag, ^{119}Sb, ^{121}Sn, ^{131}Cs, ^{143}Pr, ^{161}Tb, ^{177}Lu,^{191}Os, ^{193M}Pt, ^{197}Hg, todos emisores beta negativos y/o auger. Algunos radionucleidos preferidos incluyen: ^{90}Y, ^{131}I, ^{211}At y ^{212}Pb/^{212}Bi.
Según la presente invención, los restos activos pueden ser un agente formador de imágenes. Los agentes formadores de imágenes son procedimientos de diagnóstico útiles, así como procedimientos utilizados para identificar la localización de células metastatizadas. La formación de imágenes puede realizarse mediante muchos procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica, y el agente formador de imágenes apropiado útil en dichos procedimientos puede conjugarse con un ligando de receptor de ST mediante medios bien conocidos. Puede realizarse la formación de imágenes, por ejemplo, mediante radioescintigrafía, formación de imágenes por resonancia magnética nuclear (MRI) o tomografía computerizada (barrido por CT). Los agentes formadores de imágenes radionucleidos más habitualmente empleados incluyen yodo e indio radiactivos. La formación de imágenes por barrido por CT puede emplear un metal pesado tal como quelatos de hierro. El análisis por MRI puede emplear quelatos de gadolinio o manganeso. Adicionalmente, puede ser posible la tomografía por emisión de positrones (PET) utilizando emisores de positrones de oxígeno, nitrógeno, hierro, carbono o galio. Los ejemplos de radionucleidos útiles en procedimientos de formación de imágenes incluyen: ^{43}K, ^{52}Fe, ^{57}Co, ^{67}Cu, ^{67}Ga, ^{68}Ga, ^{77}Br, ^{81}Rb/^{81M}Kr, ^{87M}Sr, ^{99M}Tc, ^{111}In, ^{113M}In, ^{123}I, ^{125}I, ^{127}Cs, ^{129}Cs, ^{131}I, ^{132}I, ^{197}Hg, ^{203}Pb y ^{206}Bi.
Se prefiere que las composiciones conjugadas sean no inmunogénicas o inmunogénicas a un nivel muy bajo. En consecuencia, se prefiere que el resto de unión a receptor de ST sea un péptido o no péptido pequeño poco inmunogénico o no inmunogénico. Igualmente, se prefiere que el resto activo sea un péptido o no péptido pequeño poco inmunogénico o no inmunogénico. La ST nativa, que es un péptido pequeño, se ha mostrado que es poco inmunogénica. (Véase: Klipstein, F.A. et al., (1982) Infect. Immun. 37:550-557; Giannella, R.A. et al. (1981) Infect. Immun. 33:186; Burgess, M.N. et al. (1978) Infect. Immun. 21: 60; Evans, D.G. et al. (1973) Infect. Immun. 7:873; Gyles C.L. (1979) Ann. N.Y. Acad. Sci. 16:314; y Sack, R.B. (1975) Ann. Rev. Microbiol. 29:333). De forma similar, los fragmentos y derivados sustituidos de aminoácidos de ST nativa son poco inmunogénicos. En consecuencia, las composiciones conjugadas que incluyen toda o parte de la ST nativa como resto de unión a receptor de ST son generalmente poco inmunogénicas en la medida en que la ST nativa es poco inmunogénica.
Los ligandos de receptor de ST se conjugan para activar agentes mediante una variedad de técnicas bien conocidas fácilmente realizadas sin experimentación indebida por los expertos en la técnica. La técnica utilizada para conjugar el ligando de receptor de ST al agente activo depende de la naturaleza molecular del ligando de receptor de ST y del agente activo. Después de conjugar el ligando de receptor de ST y el agente activo para formar una sola molécula, pueden realizarse ensayos para asegurar que la molécula conjugada retiene las actividades de los restos. El ensayo de unión a receptor de ST descrito anteriormente puede realizarse utilizando el compuesto conjugado para ensayar si es capaz de unirse al receptor de ST. De forma similar, la actividad del resto activo pueden ensayarse utilizando diversos ensayos para cada tipo respectivo de agente activo. Los radionucleidos retienen su actividad, concretamente su radiactividad, independientemente de la conjugación. Con respecto a los agentes activos que son toxinas, fármacos y agentes de direccionamiento, pueden utilizarse ensayos estándar para demostrar la actividad de las formas no conjugadas de estos compuestos para confirmar que se ha retenido la actividad.
La conjugación puede conseguirse directamente entre el ligando de receptor de ST y el agente activo o ligamiento, pueden proporcionarse grupos moleculares intermedios entre el ligando de receptor de ST y el agente activo. Los reticulantes son particularmente útiles para facilitar la conjugación al proporcionar sitios de unión para cada resto. Los reticulantes pueden incluir grupos moleculares adicionales que sirven como espaciadores para separar las moléculas entre sí para evitar que interfieran con la actividad de la otra.
En algunas realizaciones preferidas, el péptido ligando de receptor de ST es SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3, SEC Nº ID 5-54 o fragmentos o derivados de los mismos. Se ha observado que la conjugación con estas moléculas se realiza preferiblemente en el extremo amino de cada péptido respectivo. En péptidos ligando de receptor de ST que comprenden secuencias D-aminoacídicas en el orden opuesto a SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3, SEC Nº ID 5-54, la conjugación se realiza preferiblemente en la terminación carboxi.
Un experto en la técnica puede conjugar un péptido ligado de receptor de ST a un fármaco quimioterapéutico utilizando técnicas bien conocidas. Por ejemplo, Magerstadt, M. "Antibody Conjugates and Malignant Disease". (1991) CRC Press, Boca Ratón, EE.UU., pág. 110-152), que se incorpora a la presente memoria memoria como referencia, muestra la conjugación de diversos fármacos citostáticos con aminoácidos de anticuerpos. Dichas reacciones pueden aplicarse a fármacos quimioterapéuticos conjugados con ligandos de receptor de ST, incluyendo péptidos de unión a receptor de ST, con un engarce apropiado. Los ligandos de receptor de ST que tienen un grupo amino libre tal como péptidos de unión a receptor de ST pueden conjugarse a agentes activos en ese grupo. La mayoría de los agentes quimioterapéuticos actualmente en uso para tratar cáncer poseen grupos funcionales que son susceptibles de reticulación química directamente con proteínas. Por ejemplo, están disponibles grupos amino libres en metotrexato, doxorubirina, daunorubicina, citosinarabinósido, cis-platino, vindesina, mitomicina y bleomicina, mientras que están disponibles grupos ácido carboxílico libres en metotrexato, melfalano y clorambucilo. Estos grupos funcionales, es decir amino y ácidos carboxílico libres, son dianas para una variedad de agentes reticulantes químicos homobifuncionales y heterobifuncionales que pueden reticular estos fármacos directamente al grupo amino libre único de la ST. Por ejemplo, un procedimiento para reticular ligandos de receptor de ST que tienen un grupo amino libre tal como péptidos de unión a receptor de ST, como por ejemplo SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3, SEC Nº ID 5-54, para activar agentes que tienen un grupo amino libre tales como metotrexato, doxorubicina, daunorubicina, citosinarabinósido, cis-platino, vindesina, mitomicina y bleomicina, o fosfatasa alcalina, o toxina basada en proteína o péptido, emplea ésteres succinimidilo homobifuncionales, preferiblemente con espaciadores de cadena carbonada tales como suberato de disuccinimidilo (Pierce Co., Rockford, IL). En el caso de que se requiera un compuesto conjugado escindible, se emplearía el mismo protocolo utilizando propionato de 3,3'-ditiobis(sulfosuccinimidilo); Pierce Co.
Para conjugar un péptido ligando de receptor de ST con un agente activo basado en péptido tal como una toxina, el ligando receptor de ST y la toxina pueden producirse en forma de una proteína de fusión única mediante síntesis peptídica estándar o tecnología de ADN recombinante, pudiendo realizarse rutinariamente ambas por los expertos en la técnica. Como alternativa, pueden producirse dos péptidos, el péptido ligando de receptor de ST y la toxina basada en péptido, y/o aislarse como péptidos separados y conjugarse utilizando reticulantes. Como con las composiciones conjugadas que contienen agentes quimioterapéuticos, la conjugación de los péptidos de unión a receptor de ST y toxinas puede explotar la capacidad de modificar el grupo amino libre único de un péptido de unión a receptor de ST evitando la función de unión a receptor de esta molécula.
Un experto en la técnica puede conjugar un péptido ligando de receptor de ST con un radionucleido utilizando técnicas bien conocidas. Por ejemplo, Magerstadt, M. (1991) "Antibody Conjugates and Malignant Disease", CRC Preess, Boca Ratón, FLA.; y Barchel, S.W. y Rhodes, B.H., (1983) "Radioimaging and Radiotherapy", Elsevier, NY, NY, incorporándose cada uno de ellos a la presente invención como referencia, muestran la conjugación de diversos radionucleidos terapéuticos y de diagnóstico con aminoácidos de anticuerpos. Dichas reacciones pueden aplicarse a radionucleidos conjugados con péptidos ligandos de receptor de ST o con ligandos de receptor de ST, incluyendo péptidos ligandos de receptor de ST, con un engarce apropiado.
La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos conjugados de la invención y vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables. La composición farmacéutica de la presente invención puede formularse por un experto en la técnica. Se describen vehículos farmacéuticos adecuados en "Remington's Pharmaceutical Sciences", A. Osol, un texto de referencia estándar en este campo, que se incorpora a la presente memoria como referencia. Al llevar a cabo los procedimientos de la presente invención, los compuestos conjugados de la presente invención pueden utilizarse solos o en combinación con otros agentes de diagnósitico, terapéuticos o adicionales. Dichos agentes adicionales incluyen excipientes tales como colorantes, agentes estabilizantes, agentes osmóticos y agentes antibacterianos.
Las composiciones conjugadas de la invención pueden estar formuladas, por ejemplo, en forma de solución, suspensión o emulsión en asociación con un vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable. Son ejemplos de dichos vehículos agua, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa y seroalbúmina humana al 5%. Pueden utilizarse también liposomas. El vehículo puede contener aditivos que mantienen la isotonicidad (por ejemplo cloruro de sodio, manitol) y la estabilidad química (por ejemplo tampones y conservantes). La formulación se esteriliza mediante técnicas utilizadas habitualmente. Por ejemplo, se prepara una composición parenteral adecuada para administración mediante inyección disolviendo 1,5% en peso de ingrediente activo en una solución de cloruro de sodio al 0,9%.
Las composiciones farmacéuticas según la presente invención pueden administrarse en forma de una monodosis o en dosis múltiples. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse en forma de agentes terapéuticos individuales o en combinación con otros agentes terapéuticos. Los tratamientos de la presente invención pueden combinarse con terapias convencionales, que pueden administrarse secuencial o simultáneamente.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse mediante cualquier medio que posibilite a la composición conjugada alcanzar las células diana. En algunas realizaciones, las vías de administración incluyen las seleccionadas del grupo constituido por administración intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, local al suministro sanguíneo del órgano en el que reside el tumor, o directamente al tumor mismo. La administración intravenosa es el modo de administración preferido. Puede conseguirse con la ayuda de una bomba de infusión.
La dosificación administrada varía dependiendo de factores tales como: la naturaleza del resto activo; la naturaleza de la composición conjugada; las características farmacodinámicas; su modo y vía de administración; la edad, salud y peso del receptor; la naturaleza y extensión de los síntomas; el tipo de tratamiento concurrente y la frecuencia de tratamiento.
Debido a que los compuestos conjugados están específicamente dirigidos a células con receptores de ST, los compuestos conjugados que comprenden compuestos quimioterapéuticos o toxinas se administran a dosis menores que aquellas que se utilizan cuando los compuestos quimioterapéuticos o toxinas se administran en forma de agentes activos no conjugados, preferiblemente en dosis que contienen hasta 100 veces menos agente activo. En algunas realizaciones, los compuestos conjugados que comprenden compuestos quimioterapéuticos o toxinas se administran en dosis que contienen 10-100 veces menos agente activo en forma de resto activo que la dosificación de compuesto quimioterapéutico o toxinas administrada en forma de agentes activos no conjugados. Para determinar la dosis apropiada, la cantidad de compuesto se mide preferiblemente en moles en lugar de en peso. De este modo, el peso variable de los diferentes restos de unión a ST no afecta al cálculo. Suponiendo una relación de uno a uno de resto de unión a ST a resto activo en las composiciones conjugadas de la invención, pueden administrarse menos moles de compuestos conjugados en comparación con los moles de compuestos no conjugados administrados, preferiblemente hasta 100 veces menos moles.
Típicamente, los conjugados quimioterapéuticos se administran por vía intravenosa en dosis múltiples divididas,
Se administran típicamente hasta 20 g IV/dosis de metotrexato en forma no conjugada. Cuando se administra metotrexato como resto activo en un compuesto conjugado de la invención, existe una reducción de dosis de 10 a 100 veces. Por tanto, suponiendo que cada compuesto conjugado incluye una molécula de metotrexato conjugada con un resto de unión a receptor de ST, de la cantidad total de compuesto conjugado administrado, está presente hasta aproximadamente 0,2-2,0 g de metotrexato, y por lo tanto administrado. En algunas realizaciones, de la cantidad total de compuesto conjugado administrado, está presente hasta aproximadamente 200 mg-2 g de metotrexato, y por lo tanto administrado.
El metotrexato tiene un peso molecular de 455. Un mol del conjugado péptido ST-metotrexato pesa entre aproximadamente 1755-2955 dependiendo del péptido ST utilizado. El intervalo de dosis eficaz para el conjugado péptido ST-metotrexato está entre aproximadamente 10 a 1000 mg. En algunas realizaciones, se administran dosificaciones de 50 a 500 mg de conjugado péptido ST-metotrexato. En algunas realizaciones, se administran dosificaciones de 80 a 240 mg de péptido ST-metotrexato.
La doxorubicina y daunorubicina pesan cada uno aproximadamente 535. Por tanto, los conjugados péptido ST-doxorubicina y péptido ST-daunorubicina tienen cada uno pesos moleculares de entre aproximadamente 1835-2553.5. Suponiendo que cada compuesto conjugado incluye una molécula de doxorubicina o daunorubicina conjugada con un resto de unión a receptor de ST, el intervalo de dosis eficaz para el conjugado péptido ST-daunorubicina o conjugado péptido ST-doxorubicina está entre aproximadamente 40 a 4000 mg. En algunas realizaciones, se administran dosificaciones de 100 a 1000 mg de conjugado péptido ST-doxorubicina o conjugado péptido ST-daunorubicina. En algunas realizaciones, se administran dosificaciones de 200 a 600 mg de conjugado péptido ST-doxorubicina o conjugado péptido ST-daunorubicina.
Los compuestos conjugados que contienen toxina se formulan para administración intravenosa. Utilizando este enfoque, se han administrado hasta 6 nanomoles/kg de peso corporal de toxina en forma de una monodosis con notables efectos terapéuticos en pacientes con melanoma (Spitler, L.E., et al., (1987) Cancer Res. 47:1717). En algunas realizaciones, pueden administrarse hasta aproximadamente 11 microgramos de compuesto conjugado péptido ST-toxina/kg de peso corporal para terapia.
Suponiendo que cada compuesto conjugado incluye una molécula de cadena A de toxina ricina conjugada con un resto de unión a receptor de ST, las composiciones conjugadas que comprenden la cadena A de toxina ricina se administran en dosis en las que la proporción en peso de cadena A de toxina ricina es de 1-500 \mug del peso total del compuesto conjugado administrado. En algunas realizaciones preferidas, se administran las composiciones conjugadas que comprenden la cadena A de toxina ricina en dosis en las que la proporción en peso de cadena A de toxina ricina es de 10-100 \mug del peso total del compuesto conjugado administrado. En algunas realizaciones preferidas, se administran composiciones conjugadas que comprenden la cadena A de toxina ricina en dosis en las que la proporción en peso de cadena A de toxina ricina es de 2-50 \mug del peso total del compuesto conjugado administrado. El peso molecular de la cadena A de toxina ricina es de 32.000. Por tanto, un compuesto conjugado que contiene cadena A de toxina ricina ligada a un péptido ST tiene un peso molecular de aproximadamente 33.300-34.500. El intervalo de dosis de dichos compuestos conjugados a administrar es de 1 a 500 \mug. En algunas realizaciones, se administran 100 a 100 \mug de dichos compuestos conjugados. En algunas realizaciones, se administran 20 a 50 \mug de dichos compuestos conjugados.
Suponiendo que cada compuesto conjugado incluye una molécula de cadena A de toxina de difteria conjugada con un resto de unión a receptor de ST, las composiciones conjugadas que comprenden la cadena A de toxina de difteria se administran en dosis en las que la proporción en peso de cadena A de toxina de difteria es de 1-500 \mug del peso total del compuesto conjugado administrado. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones conjugadas que comprenden cadena A de toxina de difteria se administran en dosis en las que la proporción en peso de cadena A de toxina de difteria es de 10-100 \mug del peso total del compuesto conjugado administrado. En algunas realizaciones preferidas, se administran las composiciones conjugadas que comprenden la cadena A de toxina de difteria en dosis en las que la proporción en peso de cadena A de toxina de difteria es de 40-80 \mug del peso total del compuesto conjugado administrado. El peso molecular de la cadena A de toxina de difteria es de 66.600. Por tanto, un compuesto conjugado que contiene la cadena A de difteria ligada a un péptido ST tiene un peso molecular de aproximadamente 67.900-69.100. El intervalo de dosis ensayado de dichos compuestos conjugados a administrar es de 1 a 500 \mug. En algunas realizaciones, se administran 10 a 100 \mug de dichos compuestos conjugados. En algunas realizaciones, se administran 40 a 80 \mug de dichos compuestos conjugados.
Suponiendo que cada compuesto conjugado incluye una molécula de exotoxina de Pseudomonas conjugada con un resto de unión a receptor de ST, las composiciones conjugadas que comprenden exotoxina de Pseudomonas se administran en dosis en las que la proporción en peso de exotoxina de Pseudomonas es de 0,01-100 \mug del peso total del compuesto conjugado administrado. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones conjugadas que comprenden exotoxina de Pseudomonas se administran en dosis en las que la proporción en peso de exotoxina de Pseudomonas es de 0,1-10 \mug del peso total del compuesto conjugado administrado. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones conjugadas que comprenden exotoxina de Pseudomonas se administran en dosis en las que la proporción en peso de exotoxina de Pseudomonas es de 0,3-2,2 \mug del peso total del compuesto conjugado administrado. El peso molecular de la exotoxina de Pseudomonas es de 22.000. Por tanto, un compuesto conjugado que contiene exotoxina de Pseudomonas ligada a un péptido ST tiene un peso molecular de aproximadamente 23.300-24.5000. El intervalo de dosis ensayado de dichos compuestos conjugados a administrar es de 0,01 a 100 \mug. En algunas realizaciones, se administran de 0,1 a 10 \mug de dichos compuestos conjugados. En algunas realizaciones, se administran de 0,3 a 2,2 \mug de dichos compuestos conjugados.
Para dosificar composiciones conjugadas que comprenden restos de unión a receptor de ST ligados a restos activos que son radioisótopos en composiciones farmacéuticas útiles como agentes formadores de imágenes, se supone que cada resto de unión a receptor de ST se liga a un resto activo radiactivo. La cantidad de radioisótopo a administrar depende del radioisótopo. Los expertos en la técnica pueden formular fácilmente la cantidad de compuesto conjugado a administrar basándose en la actividad específica y la energía de un radionucleido dado utilizado como resto activo. Típicamente, se administran 0,1-100 milicuries por dosis de agente formador de imágenes, preferiblemente 1-10 milicuries, lo más a menudo 2-5 milicuries. Por tanto, las composiciones farmacéuticas según la presente invención útiles como agentes formadores de imágenes que comprenden composiciones conjugadas que comprenden un resto de unión a receptor de ST y un resto radiactivo comprenden 0,10-100 milicuries, en algunas realizaciones preferiblemente 0,1-100 milicuries, en algunas realizaciones preferiblemente 1-10 milicuries, en algunas realizaciones preferiblemente 2-5 milicuries, en algunas realizaciones más preferiblemente 1-5 milicuries. Los ejemplos de dosificaciones incluyen: ^{131}I= entre aproximadamente 0,1-100 milicuries por dosis, en algunas realizaciones preferiblemente 1-10 milicuries, en algunas realizaciones 2-5 milicuries, y en algunas realizaciones aproximadamente 4 milicuries; ^{111}In= entre aproximadamente 0,1-100 milicuries por dosis, en algunas realizaciones preferiblemente 1-10 milicuries, en algunas realizaciones 1-5 milicuries, y en algunas realizaciones aproximadamente 2 milicuries; ^{99m}Tc= entre aproximadamente 0,1-100 milicuries por dosis, en algunas realizaciones preferiblemente 5-75 milicuries, en algunas realizaciones 10-50 milicuries, y en algunas realizaciones aproximadamente 27 milicuries. Dependiendo de la actividad específica del resto radiactivo y del peso del resto de unión a receptor de ST, la dosificación definida en peso varía. Los péptidos ST tienen pesos moleculares de entre aproximadamente 1300-2500. En la composición farmacéutica que comprende un péptido ST ligado a un solo ^{131}I, en la que la actividad específica del péptido ^{131}I-ST es de aproximadamente 2000 Ci/mmol, administrar una dosis de 0,01-100 milicuries es el equivalente de 0,1-100 \mug de péptido ^{131}I-ST, administrar una dosis de 1-10 milicuries es el equivalente de 1-10 \mug de péptido ^{131}I-ST, administrar una dosis de 2-5 milicuries es equivalente a proporcionar 2-5 \mug de péptido ^{131}I-ST y administrar una dosis de 1-5 milicuries es equivalente a proporcionar 1-5 \mug de péptido ^{131}I-ST. En la composición farmacéutica que comprende un péptido ST ligado a un solo ^{111}In, en la que la actividad específica del péptido ^{111}I-ST es de aproximadamente 1 Ci/mmol, administrar una dosis de 0,1-100 milicuries es el equivalente de 0,2-200 mg de péptido ^{111}In-ST, administrar una dosis de 1-10 milicuries es el equivalente de 2-20 mg de péptido ^{111}In-ST, administrar una dosis de 2-5 milicuries es equivalente a proporcionar 4-10 mg de péptido ^{111}In-ST y administrar una dosis de 1-5 milicuries es equivalente a proporcionar 2-10 mg de péptido ^{111}In-ST.
Para dosificar composiciones conjugadas que comprenden restos de unión a receptor de ST ligados a restos activos que son radioisótopos en composiciones farmacéuticas útiles como agentes terapéuticos, se supone que cada resto de unión a receptor de ST está ligado a un resto activo radiactivo. La cantidad de radioisótopo a administrar depende del radioisótopo. Los expertos en la técnica pueden formular fácilmente la cantidad de compuesto conjugado a administrar basándose en la actividad específica y la energía de un radionucleido dado utilizado como resto activo. Para compuestos terapéuticos que comprenden ^{131}I, es deseable entre 10-1000 nM, preferiblemente 50-500, más preferiblemente aproximadamente 300 nanomoles de ^{131}I en el tumor por gramo de tumor. Por tanto, si hay aproximadamente 1 g de tumor y aproximadamente 0,1% de la dosis administrada se une al tumor, se administran 0,5-100 mg de compuesto conjugado peptídico ^{131}I-ST. En algunas realizaciones, se administran 1 a 50 mg de compuesto conjugado peptídico ^{131}I-ST. En algunas realizaciones, se administran 5 a 10 mg de compuesto conjugado peptídico ^{131}I-ST. Wessels B.W. y R.D. Rogus (1984) Med. Phys. 11:638 y Kwok, C.S. et al. (1985) Med. Phys. 12:405, ambos incorporados a la presente memoria por referencia, dan a conocer detallados cálculos de la dosis para conjugados diagnósticos y terapéuticos que pueden utilizarse en la preparación de composiciones farmacéuticas de la presente invención que incluyen compuestos conjugados radiactivos.
Un aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento de tratamiento de individuos sospechosos de sufrir cáncer colorrectal metastatizado. Dichos individuos pueden tratarse mediante la administración al individuo de una composición farmacéutica que comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y un compuesto conjugado que comprende un resto de unión a receptor de ST y un resto activo, en el que la resto activo es un agente terapéutico radioestable. En algunas realizaciones de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y un compuesto conjugado que comprende un resto de unión a receptor de ST y un resto activo, en la que el resto activo es un agente activo radioestable y el resto de unión a receptor de ST es un péptido. En algunas realizaciones de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y un compuesto conjugado que comprende un resto de unión a receptor de ST y un resto activo, en la que el resto activo es un agente activo radioestable y el resto de unión a receptor de ST se selecciona del grupo constituido por: SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3, SEC Nº ID 5-54 y fragmentos y derivados de los mismos. En algunas realizaciones de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y un compuesto conjugado que comprende un resto de unión a receptor de ST y un resto activo, en la que el resto activo es un agente activo radioestable y el resto de unión a receptor de ST se selecciona del grupo constituido por: SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3, SEC Nº ID 5, SEC Nº ID 6 y SEC Nº ID 54. En algunas realizaciones de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y un compuesto conjugado que comprende un resto de unión a receptor de ST y un resto activo, en la que el resto activo es un agente terapéutico radioestable. En algunas realizaciones de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y un compuesto conjugado que comprende un resto de unión a receptor de ST y un resto activo, en la que el resto activo es un agente activo radioestable seleccionado del grupo constituido por: metotrexato, doxorubicina, daunorubicina, citosinarabinósido, etopósido, 5-fluorouracilo, melfalano, clorambucilo, cis-platino, vindesina, mitomicina, bleomicina, purotionina, macromomicina, derivados de 1,4-benzoquinona, Trenimon, ricina, cadena A de ricina, exotoxina de Pseudomonas, toxina de difteria, fosfolipasa C de Clostridium perfringens, ribonucleasa pancreática bovina, proteína antiviral de fitolaca, abrina, cadena A de abrina, factor de veneno de cobra, gelonina, saporina, modecina, viscumina, volkensina, fosfatasa alcalina, nitroimidazol, metronidazol y misonidazol. En algunas realizaciones de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y un compuesto conjugado que comprende un resto de unión a receptor de ST y un resto activo, en la que el resto de unión a receptor de ST se selecciona del grupo constituido por: SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3, SEC Nº ID 5-54 y fragmentos y derivados de los mismos, y el resto activo es un agente activo radioestable seleccionado del grupo constituido por: metotrexato, doxorubicina, daunorubicina, citosinarabinósido, etopósido, 5-fluorouracilo, melfalano, clorambucilo, cis-platino, vindesina, mitomicina, bleomicina, purotionina, macromicoina, derivados de 1,4-benzoquinona, Trenimon, ricina, cadena A de ricina, exotoxina de Pseudomonas, toxina de difteria, fosfolipasa C de Clostridium perfringens, ribonucleasa pancreática bovina, proteína antiviral de fitolaca, abrina, cadena A de abrina, factor de veneno de cobra, gelonina, saporina, modecina, viscumina, volkensina, fosfatasa alcalina, nitroimidazol, metronidazol y misonidazol. En algunas realizaciones de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y un compuesto conjugado que comprende un resto de unión a receptor de ST y un resto activo, en la que el resto activo es un agente activo radioestable seleccionado del grupo constituido por: metotrexato, doxorubicina, daunorubicina, citosinarabinósido, cis-platino, vindesina, mitomicina y bleomicina, fosfatasa alcalina, cadena A de ricina, exotoxina de Pseudomonas y toxina de difteria. En algunas realizaciones de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y un compuesto conjugado que comprende un resto de unión a receptor de ST y un resto activo, en la que el resto de unión a receptor de ST se selecciona del grupo constituido por: SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3, SEC Nº ID 5, SEC Nº ID 6 y SEC Nº ID 54, y el resto activo es un agente activo radioestable seleccionado del grupo constituido por: metotrexato, doxorubicina, daunorubicina, citosinarabinósido, cis-platino, vindesina, mitomicina y bleomicina, fosfatasa alcalina, cadena A de reicina, exotoxina de Pseudomonas y toxina de difteria. En algunas realizaciones de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y un compuesto conjugado radioestable descrito en el ejemplo 1. El individuo que se está tratando puede diagnosticarse que tiene cáncer colorrectal metastatizado o puede diagnosticarse que tiene cáncer colorrectal localizado, y puede experimentar el tratamiento de modo proactivo en el caso de que haya cierta metástasis todavía no detectada. La composición farmacéutica contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición conjugada. Una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad que es eficaz para causar un efecto citotóxico o citostático sobre células de cáncer colorrectal metastatizado sin causar efectos secundarios letales en el individuo.
Un aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento de tratamiento de individuos sospechosos de sufrir o que sufren cáncer colorrectal metastatizado. Dichos individuos pueden tratarse mediante la administración al individuo de un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y un compuesto conjugado que comprende un resto de unión a receptor de ST y un resto activo, en la que el resto activo es radiactivo. En algunas realizaciones de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y un compuesto conjugado que comprende un resto de unión a receptor de ST y un resto activo, en la que el resto activo es radiactivo y el resto de unión a receptor de ST es un péptido. En algunas realizaciones de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y un compuesto conjugado que comprende un resto de unión a receptor de ST y un resto activo, en la que el resto activo es radiactivo y el resto de unión al receptor de ST se selecciona del grupo constituido por: SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3, SEC Nº ID 5-54 y fragmentos y derivados de los mismos. En algunas realizaciones de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y un compuesto conjugado que comprende un resto de unión a receptor de ST y un resto activo, en la que el resto activo es radiactivo y el resto de unión a receptor de ST se selecciona del grupo constituido por: SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3, SEC Nº ID 5, SEC Nº ID 6 y SEC Nº ID 54. En algunas realizaciones de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y un compuesto conjugado que comprende un resto de unión a receptor de ST y un resto activo, en la que el resto activo es un agente radiactivo seleccionado del grupo constituido por: ^{47}Sc, ^{67}Cu, ^{90}Y, ^{109}Pd, ^{123}I, ^{125}I, ^{131}I, ^{186}Re, ^{188}Re, ^{199}Au, ^{211}At, ^{212}Pb, ^{212}B, ^{32}P y ^{33}P, ^{71}Ge, ^{77}As, ^{103}Pb, ^{105}Rh, ^{111}Ag, ^{119}Sb, ^{121}Sn, ^{131}Cs, ^{143}Pr, ^{161}Tb, ^{177}Lu,^{191}Os, ^{193M}Pt y ^{197}Hg. En algunas realizaciones de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y un compuesto conjugado que comprende un resto de unión a receptor de ST y un resto activo, en la que el resto de unión a receptor de ST se selecciona del grupo constituido por: SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3, SEC Nº ID 5-54 y fragmentos y derivados de los mismos y el resto activo es un agente radiactivo seleccionado del grupo constituido por: ^{47}Sc, ^{67}Cu, ^{90}Y, ^{109}Pd, ^{123}I, ^{125}I, ^{131}I, ^{186}Re, ^{188}Re, ^{199}Au, ^{211}At, ^{212}Pb, ^{212}B, ^{32}P y ^{33}P, ^{71}Ge, ^{77}As, ^{103}Pb, ^{105}Rh, ^{111}Ag, ^{119}Sb, ^{121}Sn, ^{131}Cs, ^{143}Pr, ^{161}Tb, ^{177}Lu,^{191}Os, ^{193M}Pt, ^{197}Hg,^{32}P y ^{33}P, ^{71}Ge, ^{77}As, ^{103}Pb, ^{105}Rh, ^{111}Ag, ^{119}Sb, ^{121}Sn, ^{131}Cs, ^{143}Pr, ^{161}Tb, ^{177}Lu,^{191}Os, ^{193M}Pt, ^{197}Hg, todos emisores beta negativos y/o auger. En algunas realizaciones de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y un compuesto conjugado que comprende un resto de unión a receptor de ST y un resto activo, en la que el resto activo es un agente radiactivo seleccionado del grupo constituido por: ^{47}Sc, ^{67}Cu, ^{90}Y, ^{109}Pd, ^{123}I, ^{125}I, ^{131}I, ^{186}Re, ^{188}Re, ^{199}Au, ^{211}At, ^{212}Pb, ^{212}B, ^{32}P y ^{33}P, ^{71}Ge, ^{77}As, ^{103}Pb, ^{105}Rh, ^{111}Ag, ^{119}Sb, ^{121}Sn, ^{131}Cs, ^{143}Pr, ^{161}Tb, ^{177}Lu,^{191}Os, ^{193}Pt y ^{197}Hg. En algunas realizaciones de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y un compuesto conjugado que comprende un resto de unión a receptor de ST y un resto activo, en la que el resto de unión a receptor de ST se selecciona del grupo constituido por: SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3, SEC Nº ID 5 y SEC Nº ID 54 y fragmentos y derivados de los mismos y el resto activo es un agente radiactivo seleccionado del grupo constituido por: ^{47}Sc, ^{67}Cu, ^{90}Y, ^{109}Pd, ^{123}I, ^{125}I, ^{131}I, ^{186}Re, ^{188}Re, ^{199}Au, ^{211}At, ^{212}Pb, ^{212}B, ^{32}P y ^{33}P, ^{71}Ge, ^{77}As, ^{103}Pb, ^{105}Rh, ^{111}Ag, ^{119}Sb, ^{121}Sn, ^{131}Cs, ^{143}Pr, ^{161}Tb, ^{177}Lu,^{191}Os, ^{193M}Pt, ^{197}Hg. En algunas realizaciones de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y un compuesto conjugado radiactivo descrito en el ejemplo 1. El individuo que se está tratando puede diagnosticarse que tiene cáncer colorrectal metastatizado o puede diagnosticarse que tiene cáncer colorrectal localizado, y puede experimentar el tratamiento de forma proactiva en el caso de que haya cierta metástasis aún no detectada. La composición farmacéutica contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición conjugada. Una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad que es eficaz para causar un efecto citotóxico o citostático sobre células de cáncer rectal metastatizado sin causar efectos secundarios letales sobre el individuo.
Un aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento de detección de células de cáncer colorrectal metastatizado en un individuo sospechoso de sufrir cáncer colorrectal metastatizado mediante la formación de radioimágenes. Dichos individuos puede diagnosticarse que sufren cáncer colorrectal metastatizado, y las células de cáncer colorrectal metastatizado pueden detectarse mediante la administración al individuo, preferiblemente mediante administración intravenosa, de una composición farmacéutica que comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y un compuesto conjugado que comprende un resto de unión a receptor de ST y un resto activo, en la que el resto activo es radiactivo, y detectando la presencia de una acumulación o agregación localizada de radiactividad, que indica la presencia de células con receptores de ST. En algunas realizaciones de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y un compuesto conjugado que comprende un resto de unión a receptor de ST y un resto activo, en la que el resto activo es radiactivo y el resto de unión a receptor de ST es un péptido. En algunas realizaciones de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y un compuesto conjugado que comprende un resto de unión a receptor de ST y un resto activo, en la que el resto activo es radiactivo y el resto de unión a receptor de ST se selecciona del grupo constituido por: SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3, SEC Nº ID 5-54 y fragmentos y derivados de los mismos. En algunas realizaciones de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y un compuesto conjugado que comprende un resto de unión a receptor de ST y un resto activo, en la que el resto activo es radiactivo y el resto de unión a receptor de ST se selecciona del grupo constituido por: SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3, SEC Nº ID 5 y SEC Nº ID 54. En algunas realizaciones de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y un compuesto conjugado que comprende un resto de unión a receptor de ST y un resto activo, en la que el resto activo es un agente radiactivo seleccionado del grupo constituido por: metales pesados radiactivos tales como quelatos de hierro, quelatos radiactivos de gadolinio o manganeso, emisores de positrones de oxígeno, nitrógeno, hierro, carbono o galio, ^{43}K, ^{52}Fe, ^{57}Co, ^{67}Cu, ^{67}Ga, ^{68}Ga, ^{77}Br, ^{83}Rb/^{81M}Kr, ^{87M}Sr, ^{99M}Tc, ^{111}In, ^{113M}In, ^{123}I, ^{125}I, ^{127}Cs, ^{129}Cs, ^{131}I, ^{132}I, ^{197}Hg, ^{203}Pb y ^{206}Bi. En algunas realizaciones de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y un compuesto conjugado que comprende un resto de unión a receptor de ST y un resto activo, en la que el resto de unión a receptor de ST se selecciona del grupo constituido por: SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3, SEC Nº ID 5-54 y fragmentos y derivados de los mismos y el resto activo es un agente radiactivo seleccionado del grupo constituido por: metales pesados radiactivos tales como quelatos de hierro, quelatos radiactivos de gadolinio o manganeso, emisores de positrones de oxígeno, nitrógeno, hierro, carbono o galio, ^{43}K, ^{52}Fe, ^{57}Co, ^{67}Cu, ^{67}Ga, ^{68}Ga, ^{77}Br, ^{83}Rb/^{81M}Kr, ^{87M}Sr, ^{99M}Tc, ^{111}In, ^{113M}In, ^{123}I, ^{125}I, ^{127}Cs, ^{129}Cs, ^{131}I, ^{132}I, ^{197}Hg, ^{203}Pb y ^{206}Bi. En algunas realizaciones de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y un compuesto conjugado que comprende un resto de unión a receptor de ST y un resto activo, en la que el resto activo es un agente radiactivo seleccionado del grupo constituido por: ^{43}K, ^{52}Fe, ^{57}Co, ^{67}Cu, ^{67}Ga, ^{68}Ga, ^{77}Br, ^{83}Rb/^{81M}Kr, ^{87M}Sr, ^{99M}Tc, ^{111}In, ^{113M}In, ^{123}I, ^{125}I, ^{127}Cs, ^{129}Cs, ^{131}I, ^{132}I, ^{197}Hg, ^{203}Pb y ^{206}Bi. En algunas realizaciones de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y un compuesto conjugado que comprende un resto de unión a receptor de ST y un resto activo, en la que el resto de unión a receptor de ST se selecciona del grupo constituido por: SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3, SEC Nº ID 5, SEC Nº ID 6 y SEC Nº ID 54, y el resto activo es un agente radiactivo seleccionado del grupo constituido por: ^{43}K, ^{52}Fe, ^{57}Co, ^{67}Cu, ^{67}Ga, ^{68}Ga, ^{77}Br, ^{83}Rb/^{81M}Kr, ^{87M}Sr, ^{99M}Tc, ^{111}In, ^{113M}In, ^{123}I, ^{125}I, ^{127}Cs, ^{129}Cs, ^{131}I, ^{132}I, ^{197}Hg, ^{203}Pb y ^{206}Bi. En algunas realizaciones de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y un compuesto conjugado radiactivo descrito en el ejemplo 1. El individuo que se está tratando puede diagnosticarse que tiene cáncer colorrectal mestatatizado o puede diagnosticarse que tiene cáncer colorrectal localizado, y puede experimentar el tratamiento de forma proactiva en el caso de que haya cierta metástasis todavía no detectada. La composición farmacéutica contiene una cantidad eficaz para diagnóstico de la composición conjugada. Una cantidad eficaz para diagnóstico es una cantidad que puede detectarse en un sitio en el cuerpo en el que se localizan células con receptores de ST sin causar efectos secundarios letales sobre el individuo.
Otro aspecto de la invención se refiere a composiciones conjugadas que comprenden un ligando de unión a receptor de ST y un agente activo. Por ejemplo, los liposomas son pequeñas vesículas compuestas por lípidos. Los fármacos pueden introducirse en el centro de estas vesículas. La corteza externa de estas vesículas comprende un ligando de unión a receptor de ST. "Liposomes", volúmenes 1, 2 y 3, CRC Press Inc., Boca Ratón, FLA, que se incorpora a la presente memoria como referencia, da a conocer la preparación de agentes activos encapsulados en liposomas que incluyen agentes directores que corresponden al ligando de receptor de ST en la corteza externa. Las composiciones no conjugadas que comprenden un ligando de receptor de ST en la matriz de un liposoma con un agente activo dentro incluyen aquellas composiciones en las que el ligando de receptor de ST se selecciona del grupo constituido por: SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3, SEC Nº ID 5-54 y fragmentos y derivados de los mismos, y el agente activo se selecciona del grupo constituido por: metotrexato, doxorubicina, daunorubicina, citosinarabinósido, etopósido, 5-fluorouracilo, melfalano, clorambucilo, cis-platino, vindesina, mitomicina, bleomicina, purotionina, macromomicina, derivados de 1,4-benzoquinona, Trenimon, ricina, cadena A de ricina, exotoxina de Pseudomonas, toxina de difteria, fosfolipasa C de Clostridium perfringens, ribonucleasa pancreática bovina, proteína antiviral de fitolaca, abrina, cadena A de abrina, factor de veneno de cobra, gelonina, saporina, modecina, viscumina, volkensina, fosfatasa alcalina, nitroimidazol, metronidazol y misonidazol.
Otro aspecto de la invención se refiere a composiciones no conjugadas y conjugadas que comprenden un ligando de receptor de ST utilizado para liberar moléculas de ácido nucleico terapéuticas a células que comprenden un receptor de ST, tales como células normales del tracto intestinal así como células de cáncer colorrectal metastatizado. En algunas realizaciones, el material genético se libera a células tumorales mestastatizadas para producir un antígeno que puede dirigirse por el sistema inmune o para producir una proteína que mata la célula o inhibe su proliferización. En algunas realizaciones, el ligando de receptor de ST se utiliza para liberar ácidos nucleicos que codifican moléculas de ácido nucleico que reemplazan genes endógenos defectivos o que codifican proteínas terapéuticas. En algunas realizaciones, el ligando de receptor de ST se utiliza así para liberar el agente activo específicamente a las células que recubren el tracto intestinal para tratar enfermedades específicas de este órgano. Según este aspecto de la invención, las composiciones comprenden moléculas de ácido nucleico que pueden reemplazar genes defectivos. En algunas realizaciones, las composiciones se utilizan en protocolos de terapia génica para liberar a individuos material genérico necesario y/o deseado para suplir una deficiencia genética.
En algunas realizaciones, el ligando de receptor de ST se combina con o se incorpora a un vehículo de liberación, convirtiendo así el vehículo de liberación en un vehículo de liberación dirigido específicamente. Por ejemplo, un péptido de unión a receptor de ST puede integrarse en la porción externa de una partícula viral haciendo a dicho virus un virus específico de célula portadora de receptor de ST. De forma similar, la proteína de recubrimiento de un virus puede modificarse por ingeniería genética de tal modo que se produce en forma de una proteína de fusión que incluye un péptido de unión a receptor de ST activo que se expone o está accesible de otro modo en el exterior de la partícula viral, haciendo a dicho virus un virus específico de célula portadora de receptor de ST. En algunas realizaciones, puede integrarse o incorporarse de otro modo un ligando de receptor de ST a los liposomas, en las que el ligando de receptor de ST se expone o está accesible de otro modo sobre el exterior de los liposomas, haciendo a dichos liposomas dirigidos específicamente a células portadoras de receptor de ST.
El agente activo en las composiciones conjugadas o no conjugadas según este aspecto de la invención es una molécula de ácido nucleico. El ácido nucleico puede ser ARN o preferiblemente ADN. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico es una molécula sin sentido o codifica una secuencia sin sentido cuya presencia en la célula inhibe la producción de una proteína indeseable. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico codifica una ribozima cuya presencia en la célula inhibe la producción de una proteína indeseable. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico codifica una proteína o péptido que se produce deseablemente en la célula. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico codifica una copia funcional de un gen que es defectivo en la célula diana. La molécula de ácido nucleico se liga operativamente preferiblemente a elementos reguladores necesarios para expresar la secuencia de codificación en la célula.
Los liposomas son vesículas pequeñas compuestas por lípidos. Los constructos genéticos que codifican proteínas que se desean expresar en células portadoras de receptor de ST se introducen en el centro de estas vesículas. La corteza externa de estas vesículas comprende un ligando de receptor de ST, en algunas realizaciones, preferiblemente un péptido ST. "Liposomes", volúmenes 1, 2 y 3, CRC Press Inc., Boca Ratón, FLA, que se incorpora a la presente memoria como referencia, da a conocer la preparación de agentes activos encapsulados en liposomas que incluyen anticuerpos en la corteza externa. En la presente invención, un ligando de receptor de ST tal como por ejemplo un péptido ST corresponde a los anticuerpos en la corteza externa. Las composiciones no conjugadas que comprenden un ligando de receptor de ST en la matriz de un liposoma con un agente activo dentro incluyen aquellas composiciones en las que el ligando de receptor de ST se selecciona del grupo constituido por: SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3, SEC Nº ID 5-54 y fragmentos y derivados de los mismos.
En una realización, se trata por ejemplo la fibrosis quística, una enfermedad genética en la que existe una mutación de un gen específico que codifica una proteína de transporte de cloruro que produce en última instancia anormalidades en la función de muchos sistemas, lo más notablemente en el tracto respiratorio e intestinal, mediante técnicas de terapia génica utilizando ligandos de receptor de ST para liberar el gen corrector a las células. La terapia actual se ha dirigido a reemplazar el gen mutante en el sistema respiratorio por el gen normal dirigiendo estos genes directamente a las células que recubren el tracto respiratorio utilizando virus que se unen sólo a esas células. De forma similar, el gen normal se empaqueta en liposomas dirigidos en su superficie por ligandos de receptor de ST y se liberan al tracto intestinal. Los ligandos de receptor de ST dirigen específicamente los liposomas que contienen el gen normal para corregir la lesión de fibrosis quística a las células específicas que recubren el tracto intestinal, del duodeno al recto. La captación de ese material genético por esas células debería dar como resultado la curación de la fibrosis quística en el tracto intestinal.
En otra realización, la liberación de copias normales del gen supresor de tumores p53 al tracto intestinal se consigue utilizando el ligando de receptor de ST para dirigir la terapia génica. Las mutaciones del gen supresor de tumores p53 parecen desempeñar un papel destacado en el desarrollo del cáncer colorrectal en el tracto intestinal. Un enfoque para combatir esta enfermedad es la liberación de copias normales de este gen al tracto intestinal a células que expresan formas mutantes de este gen. Los constructos genéticos que comprenden genes supresores de tumores p53 normales se incorporan a liposomas que comprenden un ligando de receptor de ST. La composición se libera al tracto intestinal. Los ligandos de unión a receptor de ST dirigen específicamente los liposomas que contienen el gen normal para corregir la lesión creada por la mutación del gen supresor p53 en células intestinales.
La preparación de constructos genéticos está dentro de las habilidades de los expertos en la técnica. La presente invención permite dirigir específicamente dicho constructo utilizando los ligandos de receptor de ST de la presente invención. Las composiciones de la invención incluyen un ligando de receptor de ST tal como un péptido ST asociado a un vehículo de liberación y un constructo génico que comprende una secuencia de codificación de una proteína cuya producción se desea en las células del tracto intestinal ligada a las secuencias reguladoras necesarias para la expresión en las células. Para la captación por las células del tracto intestinal, las composiciones se administran por vía oral o mediante enema, con lo que entran en el tracto intestinal y se ponen en contacto con células que comprenden receptores de ST. Los vehículos de liberación se asocian al receptor de ST en virtud del ligando del receptor de ST y el vehículo se internaliza en la célula o el agente activo/constructo genético se capta de otro modo por la célula. Una vez internalizado, el constructo puede proporcionar un efecto terapéutico sobre el individuo, Un experto en la técnica puede formular fácilmente dichas composiciones para administración oral o por enema y determinar la cantidad eficaz de dicha composición a administrar para tratar la enfermedad o trastorno.
Además de composiciones, sistemas, procedimientos y kits formadores de imágenes y terapéuticos, la presente invención se refiere a procedimientos, composiciones, kits y procedimientos útiles para el examen in vitro, diagnóstico y análisis del paciente y muestras del paciente. Las composiciones, kits y procedimientos de la invención útiles para el examen in vitro, diagnóstico y análisis del paciente y muestras del paciente pueden utilizarse para detectar la expresión de proteínas de receptor de ST en células, en donde la presencia de células que expresan receptor de ST es indicativa de metástasis de cáncer colorrectal. Además, la presente invención se refiere a procedimientos, composiciones y kits útiles en el examen in vitro, diagnóstico y análisis del paciente y muestras del paciente para detectar la expresión de proteína de receptor de ST en células, en donde la presencia de células que expresan receptor de ST indica y/o confirma que un tumor es de origen canceroso colorrectal. En un aspecto adicional de la invención, se proporcionan composiciones, kits y procedimientos que son útiles para visualizar células colorrectales. Dichas composiciones, kits y procedimientos de análisis de muestras de tejido del tejido de colon sirven para evaluar la extensión de la metástasis o la invasión de células tumorales colorrectales en la lámina propia.
El examen in vitro y las composiciones, procedimientos y kits de diagnóstico pueden utilizarse en la monitorización de individuos que están en grupos de alto riesgo de cáncer colorrectal tales como aquellos que se han diagnosticado con enfermedad localizada y/o enfermedad metastatizada y/o aquellos que están genéticamente ligados a la enfermedad. El examen in vitro y las composiciones, procedimientos y kits de diagnóstico pueden utilizarse en la monitorización de individuos que están experimentando y/o se han tratado por cáncer colorrectal localizado para determinar si el cáncer se ha metastatizado. El examen in vitro y las composiciones, procedimientos y kits de diagnóstico pueden utilizarse en la monitorización de individuos que están experimentando y/o se han tratado por cáncer colorrectal metastatizado para determinar si el cáncer metastatizado se ha eliminado. El examen in vitro y las composiciones, procedimientos y kits de diagnóstico pueden utilizarse en la monitorización de individuos que son susceptibles de otro modo, concretamente individuos que se han identificado como genéticamente predispuestos tales como por examen genético y/o historiales familiares. Los avances en la comprensión de la genética y los desarrollos en la tecnología, así como la epidemiología, permiten la determinación de la probabilidad y la evaluación de los riesgos que tiene un individuo de desarrollar cáncer colorrectal. Utilizando los historiales sanitarios familiares y/o examen genético, es posible estimar la probabilidad que tiene un individuo particular de desarrollar ciertos tipos de cáncer, incluyendo cáncer colorrectal. Aquellos individuos que se han identificado como predispuestos a desarrollar una forma particular de cáncer pueden monitorizarse o examinarse para detectar la evidencia de cáncer colorrectal metastatizado. Tras el descubrimiento de dicha evidencia, puede emprenderse un tratamiento temprano para combatir la enfermedad. En consecuencia, pueden identificarse los individuos que tienen riesgo de desarrollar cáncer colorrectal metastatizado y pueden aislarse muestras de dichos individuos. La invención es particularmente útil para monitorizar individuos que se ha identificado que tienen historiales familiares que incluyen parientes que han sufrido cáncer colorrectal. Igualmente, la invención es particularmente útil para monitorizar individuos que se ha diagnosticado que tienen cáncer colorrectal y, particularmente, aquellos que se han tratado y se les han extirpado tumores y/o han experimentado remisión de otro modo, incluyendo aquellos que se han tratado por cáncer colorrectal metastatizado.
El examen in vitro y las composiciones, procedimientos y kits de diagnóstico pueden utilizarse en el análisis de tumores. La expresión del receptor de ST es un marcador del tipo celular y permite la identificación del origen del adenocarcinoma de origen no confirmado como tumor colorrectal, así como permite confirmar un diagnóstico inicial de cáncer colorrectal. Los tumores que se cree que son de origen colorrectal pueden confirmarse como tales utilizando las composiciones, procedimientos y kits de la invención. La invención puede utilizarse para confirmar el diagnóstico de cáncer colorrectal confirmando que los tumores son de origen colorrectal. De forma similar, los tumores de origen desconocido pueden analizarse e identificarse como de origen colorrectal utilizando las composiciones, procedimientos y kits de la invención. La invención puede utilizarse para identificar tumores colorrectales en muestras de tumores extirpadas de individuos que sufren adenocarcinomas de origen no confirmado.
El examen in vitro y las composiciones, kits y procedimientos de diagnóstico de la invención pueden utilizarse para analizar muestras de tejido del tejido de colon para evaluar la extensión de la metástasis o la invasión de células tumorales colorrectales en la lámina propia. La lámina propia representa la barrera entre el tracto colorrectal y el resto del cuerpo; véase "Bailey's Textbook of Histology", 16ª edición, Coperhaven et al., 1975, Williams y Wilkens, Baltimore, MD, en la página 404, que se incorpora a la presente memoria como referencia. Al identificar la presencia de receptor de ST o ARNm que codifica proteína receptor de ST en células de la lámina propia, puede evaluarse y confirmarse la extensión de la invasión/infiltración de células tumorales colorrectales en tejido no colorrectal.
Según la invención, se proporcionan compuestos que se unen a proteína receptor de ST o ARNm que codifica el receptor. El tejido normal en el cuerpo no tiene receptores de ST ni ARNm que codifica receptores de ST excepto las células del tracto intestinal. Las células colorrectales metastatizadas pueden identificarse detectando en muestras no colorrectales receptores de ST o ARNm que codifica receptores de ST. La expresión del receptor de ST es un marcador del tipo celular y permite la identificación de la metástasis colorrectal en muestras extraintestinales. La proteína receptor de ST o ARNm que la codifica puede utilizarse para visualizar células derivadas de colorrectales de otras células del lumen para evaluar el nivel de invasión de las células tumorales colorrectales en la membrana basal.
En algunas realizaciones de la invención, pueden examinarse muestras de tejido no colorrectal y fluido o muestras de tumor para identificar la presencia o ausencia de proteína receptor de ST. Pueden realizarse técnicas tales como ensayos de unión de receptor de ST/ligando, ensayos ELISA y transferencias Western para determinar si el receptor de ST está presente en una muestra.
En algunas realizaciones de la invención, pueden examinarse muestras de tejido no colorrectal y fluido o muestras de tumor para identificar si la proteína receptor de ST se está expresando en células fuera del tracto colorrectal detectando la presencia o ausencia de ARNm que codifica la proteína receptor de ST. La presencia de ARNm que codifica la proteína receptor de ST o ADNc generado por la misma puede determinarse utilizando técnicas tales como amplificación por PCR, transferencias Northern (ARNm), transferencias Southern (ADNc) o hibridación de oligonucleótidos.
En algunas realizaciones de la invención, pueden examinarse células de muestras de tejido no colorrectal o muestras de tumor para identificar la presencia o ausencia de proteína receptor de ST. Pueden realizarse técnicas tales como unión de receptor de ST/ligando o transferencias de inmunohistoquímica en secciones de tejido para determinar si el receptor de ST está presente en una muestra.
En algunas realizaciones de la invención, pueden examinarse células de muestras de tejido no colorrectal o muestras de tumor para determinar si la proteína receptor de ST se está expresando en células fuera del tracto colorrectal detectando la presencia o ausencia de ARNm que codifica la proteína receptor de ST. La presencia de ARNm que codifica la proeína receptor de ST o ADNc generado por la misma en células de secciones de tejido puede determinarse utilizando técnicas tales como la hibridación in situ.
La presencia de receptor de ST en muestras de tejido no colorrectal y fluido o en células de muestras de tejido no colorrectal indica metástasis tumoral colorrectal. La presencia de receptor de ST en una muestra tumoral o en células tumorales indica que el tumor es de origen colorrectal. La presencia de ARNm que codifica receptor de ST en muestras de tejido no colorrectal y fluido o en células de muestras de tejido no colorrectal indica metástasis tumoral colorrectal. La presencia de ARNm que codifica receptor de ST en muestras tumorales y células tumorales indica que el tumor es de origen colorrectal.
Algunos aspectos de la presente invención se refieren a procedimientos y kits que se proporcionan para evaluar la migración metastática de células tumorales a la lámina propia, indicando el nivel de invasión de células tumorales colorrectales en la membrana basal. En algunas realizaciones de la invención, pueden aislarse muestras de tejido que incluyen secciones de lámina propia de individuos que están experimentando o recuperándose de cirugía para extirpar tumores colorrectales. El tejido se analiza para determinar la extensión de la invasión en la membrana basal de la lámina propia por células colorrectales neoplásicas. La identificación de la presencia o ausencia de la proteína receptor de ST confirma la evaluación de la migración de células tumorales a la membrana basal, indicando metástasis. Pueden realizarse técnicas tales como ensayos de unión de receptor de ST/ligando e inmunohistoquímica para determinar si el receptor de ST está presente en células en la muestra de tejido, lo que es indicativo de migración metastática. Como alternativa, en algunas realizaciones de la invención, se analizan muestras de tejido que incluyen la lámina propia para identificar si la proteína receptor de ST se está expresando en células en la muestra de tejido, lo que indica migración metastática, mediante la detección de la presencia o ausencia de ARNm que codifica la proteína receptor de ST. La presencia de ARNm que codifica la proteína receptor de ST o ADNc generado a partir de la misma puede determinarse utilizando técnicas tales como hibridación in situ.
Las muestras de tumores pueden identificarse como de origen colorrectal mediante la identificación de la expresión de receptores de ST utilizando los procedimientos de la invención. Las muestras de tumores extirpados de individuos que sufren adenocarcinomas de origen no confirmado pueden ensayarse para determinar si poseen o no proteína receptor de ST o ARNm que codifica proteína receptor de ST. Si la muestra se extrae del tracto intestinal, puede examinarse una sección de las células congeladas para determinar si las células tumorales expresan proteína receptor de ST. Si la muestra se extrae de tejido extraintestinal, puede examinarse una sección de las células congeladas para determinar si las células tumorales expresan proteína receptor de ST o la muestra puede homogeneizarse y ensayarse, ya que las células no cancerosas no poseerán receptor de ST y por lo tanto no presentarán fondo.
Pueden obtenerse muestras de tejido extirpado o material de biopsia incluyendo biopsia de aguja. La preparación de sección de tejido para patología quirúrgica puede congelarse y prepararse utilizando técnicas estándar. En ensayos de unión a ST en secciones de tejido, se añade la ST antes de fijar las células. Se realizan ensayos de inmunohistoquímica e hibridación in situ en secciones de tejido en células fijadas. Las muestras extraintestinales pueden homogeneizarse mediante técnicas estándar tales como sonicación, disrupción mecánica o lisis química tal como lisis con detergente. Se contempla también que las muestras tumorales en el cuerpo tales como muestras de sangre, orina, fluido linfático, fluido cerebroespinal, fluido amniótico, fluido vaginal, semen y heces pueden examinarse también para determinar si dichos tumores son de origen colorrectal.
Las muestras de tejido no colorrectal pueden obtenerse a partir de cualquier tejido excepto aquellos del tracto colorrectal, concretamente el tracto intestinal por debajo del intestino delgado (concretamente el intestino grueso (colon), incluyendo ciego, colon ascendente, colon transversal, colon descendente y colon sigmoideo, y recto) y adicionalmente el duodeno e intestino delgado (yeyuno e íleo). Las células de todos los tejidos excepto aquellos del tracto colorrectal no expresan el receptor de ST. Por tanto, si se detectan la proteína receptor de ST o ARNm que codifica la proteína receptor de ST en muestras no colorrectales, se indica la presencia de células de cáncer colorrectal metastático. En algunas realizaciones preferidas, las muestras de tejido son nódulos linfáticos.
Las muestras de tejido pueden obtenerse mediante técnicas quirúrgicas estándar incluyendo el uso de agujas de biopsia. Un experto en la técnica apreciará fácilmente la variedad de muestras de ensayo en las que puede examinarse la proteína receptor de ST y reconocerá procedimientos de obtención de muestras de tejido.
Las muestras de tejido pueden homogeneizarse o prepararse de otro modo para examinar la presencia de proteína receptor de ST mediante técnicas bien conocidas tales como sonicación, disrupción mecánica, lisis química tal como lisis por detergente o combinaciones de las mismas.
Los ejemplos de muestras de fluidos corporales incluyen sangre, orina, fluido linfático, fluido cerebroespinal, fluido amniótico, fluido vaginal y semen. En algunas realizaciones preferidas, se utiliza la sangre como muestra de fluido corporal. Las células pueden aislarse de muestras de fluido tal como mediante centrifugación. Un experto en la técnica apreciaría fácilmente la variedad de muestras de ensayo en las que pueden examinarse la proteína receptor de ST. Las muestras de ensayo pueden obtenerse mediante procedimientos tales como extracción de fluidos con una jeringuilla o mediante una torunda. Un experto en la técnica reconocería fácilmente otros procedimientos de obtención de muestras de ensayo.
En un ensayo que utiliza una muestra de sangre, el plasma sanguíneo puede separarse de las células sanguíneas. En el plasma sanguíneo puede examinarse la proteína receptor de ST, incluyendo proteína truncada, que se libera a la sangre cuando la proteína receptor de ST se escinde o se desprende de células tumorales colorrectales metastatizadas. En algunas realizaciones, se examina en fracciones de células sanguíneas la presencia de células tumorales colorrectales metastatizadas. En algunas realizaciones, se examinan los linfocitos presentes en la fracción celular sanguínea mediante el lisado de las células y la detección de la presencia de proteína receptor de ST o ARNm que codifica proteína receptor de ST, que puede estar presente como resultado de la presencia de alguna célula tumoral colorrectal metastatizada que puede haberse englobado por la célula sanguínea.
Para aspectos de la invención relacionados con el análisis del tejido del lumen, la invención es útil para evaluar el nivel de migración metastática de células tumorales colorrectales utilizando muestras de lumen tomadas de pacientes de cirugía en y cerca del sitio del tumor. Algunos aspectos de la invención proporcionan procedimientos de análisis de muestras de tejido que son secciones fijadas preparadas rutinariamente por los patólogos quirúrgicos para caracterizar y evaluar células. En algunas realizaciones, las células son de lámina propia y se analizan para determinar y evaluar la extensión de la metástasis de células tumorales colorrectales. La lámina propia representa la barrera entre el tracto colorrectal y el resto del cuerpo. Al indentificar la presencia de receptor de ST o ARNm que codifica proteína receptor de ST en células de la lámina propia, puede evaluarse la extensión de la invasión/infiltración de células tumorales colorrectales en tejido no colorrectal. En algunas realizaciones, las células se extraen en una biopsia o en forma de adenocarcinoma de origen desconocido y se analizan para determinar y evaluar si son células tumorales colorrectales. En algunas realizaciones, las células son de un tumor sospechoso de ser de origen colorrectal, y se utilizan el procedimiento y las composiciones y kits de la invención para confirmar la identidad del origen de las células tumorales.
Se extraen muestras de la lámina propia durante la cirugía de extracción de tumor colorrectal, tal como mediante resección o colonoscopia. La muestra que incluye células de membrana basal se congela. Si ha de realizarse un ensayo de unión a ST, se pone en contacto la ST marcada con la sección congelada y después las células se fijan y tiñen. Si ha de realizarse una inmunohistoquímica o hibridación in situ, la sección congelada se tiñe y después se realiza el ensayo. Los expertos en la técnica pueden aislar fácilmente muestras que incluyen porciones de lámina propia y fijarlas y teñirlas utilizando técnicas estándar. Al añadir la visualización proporcionada con una técnica de detección de receptor de ST, la sección puede analizarse más integralmente y puede determinarse el nivel de invasión de células colorrectales neoplásicas en la lámina propia. La presente invención puede utilizarse para analizar y evaluar la extensión de la progresión de tumores colorrectales localizados, es decir, tumores colorrectales primarios o no metastáticos, si estos han penetrado en la membrana basal por debajo de la mucosa a la submucosa.
Pueden utilizarse procedimientos de inmunoensayo para identificar individuos que sufren metástasis de cáncer colorrectal mediante la detección de la presencia de proteína receptor de ST en muestras de tejido no colorrectal o fluido corporal utilizando anticuerpos que se produjeron en respuesta a la exposición a proteína receptor de ST. Además, pueden utilizase procedimientos de inmunoensayo para identificar individuos que sufren cáncer colorrectal detectando la presencia de proteína receptor de ST en muestras de tumor utilizando anticuerpos que se produjeron en respuesta a la exposición a proteína receptor de ST.
Los anticuerpos son preferiblemente anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos se originan preferiblemente frente a proteína receptor de ST preparada en células humanas. Los anticuerpos se unen preferiblemente a un epítopo en el dominio extracelular de la proteína receptor de ST. Los inmunoensayos son bien conocidos y su diseño puede emprenderse rutinariamente por los expertos en la técnica. Los expertos en la técnica pueden producir anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a proteína receptor de ST y son útiles en los procedimientos y kits de la invención utilizando técnicas estándar y materiales de partida fácilmente disponibles. Las técnicas para producir anticuerpos monoclonales se exponen en Harlow, E. y D. Lane, (1988) "ANTIBODIES: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, que se incorpora a la presente memoria como referencia, y proporciona una guía detallada para la producción de hibridomas y anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a proteínas diana. Está dentro del alcance de la presente invención incluir Fab y F(ab)2 que se unen específicamente a receptor de ST en lugar de anticuerpos.
Brevemente, la proteína receptor de ST se inyecta en ratones. Se extrae el bazo del ratón, se aíslan células del bazo y se condensan con células de ratón inmortalizadas. Se cultivan las células híbridas, o hibridomas, y se seleccionan aquellas células que secretan anticuerpos. Los anticuerpos se analizan y, si se encuentra que se unen específicamente a proteína receptor de ST, se cultiva el hibridoma que los produce para producir un suministro continuo de anticuerpos específicos anti-proteína receptor de ST.
La presente invención se refiere a anticuerpos que se producen en respuesta a la exposición a proteína receptor de ST. Los anticuerpos son preferiblemente anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos se originan preferiblemente frente a proteína receptor de ST preparada en células humanas. En algunas realizaciones, los anticuerpos se unen específicamente al dominio extracelular de proteína receptor de ST. En algunas realizaciones, los anticuerpos se unen específicamente al dominio transmembrana. En algunas realizaciones, los anticuerpos se unen específicamente al dominio citoplasmático.
Los medios para detectar la presencia de una proteína en una muestra de ensayo son rutinarios y un experto en la técnica puede detectar la presencia o ausencia de una proteína o un anticuerpo utilizando procedimientos bien conocidos. Un procedimiento bien conocido de detección de la presencia de una proteína es un inmunoensayo. Un experto en la técnica puede apreciar fácilmente la multitud de formas de practicar un inmunoensayo para detectar la presencia de proteína receptor de ST en una muestra.
Según algunas realizaciones, los inmunoensayos comprenden permitir a las proteínas en la muestra unirse a un soporte en fase sólida tal como una superficie de plástico. Se añaden después anticuerpos detectables que se unen selectivamente a la proteína receptor de ST. La detección de anticuerpo detectable indica la presencia de proteína receptor de ST. El anticuerpo detectable puede ser un anticuerpo marcado o no marcado. El anticuerpo no marcado puede detectarse utilizando un segundo anticuerpo marcado que se une específicamente al primer anticuerpo o un segundo anticuerpo no marcado que puede detectarse utilizando la proteína A marcada, una proteína que compleja con anticuerpos. Se describen diversos procedimientos de inmunoensayo en "Immunoassays for the 80's", A. Voller et al., Eds., University Park, 1981, que se incorpora a la presente memoria por referencia.
Pueden realizarse inmunoensayos simples en los que se pone en contacto un soporte en fase sólida con la muestra de ensayo. Cualquier proteína presente en la muestra de ensayo se une al soporte de fase sólida y puede detectarse mediante una preparación de anticuerpo detectable específica. Dicha técnica es la esencia de la transferencia de mancha, transferencia Western y otros de dichos ensayos similares.
Otros inmunoensayos pueden ser más complicados, pero proporcionan resultados realmente excelentes. Los ensayos inmunométricos típicos y preferidos incluyen ensayos "directos" para la detección de una proteína en los que se pone en contacto un primer anticuerpo anti-proteína unido a un soporte de fase sólida con la muestra de ensayo. Después de un periodo de incubación adecuado, se lava el soporte de fase sólida para retirar la proteína no unida. Se añade después un segundo anticuerpo anti-proteína distinto que es específico de una porción de la proteína específica no reconocida por el primer anticuerpo. El segundo anticuerpo es preferiblemente detectable. Después de un segundo periodo de incubación para permitir al anticuerpo detectable complejarse con la proteína específica unida al soporte de fase sólida mediante el primer anticuerpo, se lava el soporte de fase sólida una segunda vez para retirar el anticuerpo detectable no unido. Como alternativa, el segundo anticuerpo puede no ser detectable. En este caso, se añade un tercer anticuerpo detectable al sistema, que se une al segundo anticuerpo. Este tipo de ensayo de unión "en sándwich directo" puede ser un ensayo simple sí/no para determinar si ha ocurrido la unión o puede hacerse cuantitativo comparando la cantidad de anticuerpo detectable con el obtenido en un control. Dichos ensayo "de dos sitios" o "sándwich" se describen por Wide, "Radioimmune Assay Method", Kirkham, Ed., E. & S. Livingstone, Edimburgo, 1970, pág. 199-206, que se incorpora a la presente memoria por referencia.
Otros tipos de ensayos inmunométricos son los denominados ensayos "simultáneos" e "inversos". Un ensayo simultáneo implica una sola etapa de incubación en la que el primer anticuerpo unido al soporte de fase sólida, el segundo anticuerpo detectable y la muestra de ensayo se añaden al mismo tiempo. Después de completar la incubación, se lava el soporte de fase sólida para retirar las proteínas no unidas. Se determina después la presencia de anticuerpo detectable asociado al soporte sólido como se haría en un ensayo "sándwich directo" convencional. El ensayo simultáneo puede adaptarse también de manera similar para la detección de anticuerpos en una muestra de ensayo.
El ensayo "inverso" comprende la adición por etapas de una solución de anticuerpo detectable a la muestra de ensayo seguido de un periodo de incubación y la adición de anticuerpo unido a un soporte de fase sólida después de un periodo de incubación adicional. El soporte de fase sólida se lava de manera convencional para retirar los complejos proteína/anticuerpo no unidos y el anticuerpo detectable no reaccionado. La determinación del anticuerpo detectable asociado al soporte de fase sólida se determina después como en los ensayos "simultáneo" y "directo". El ensayo inverso puede adaptarse también de manera similar para la detección de anticuerpos en una muestra de ensayo.
El primer componente del ensayo inmunométrico puede añadirse a nitrocelulosa u otro soporte de fase sólida que es capaz de inmovilizar proteínas. El primer componente para determinar la presencia de receptor de ST en una muestra de ensayo es anticuerpo anti-receptor de ST. Por "soporte de fase sólida" o "soporte" se indica cualquier material capaz de unir proteínas. Los soportes de fase sólida bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nailon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La naturaleza del soporte puede ser soluble en cierta medida o insoluble con los fines de la presente invención. La configuración del soporte puede ser esférica, como en una perla, o cilíndrica, como en la superficie interna de un tubo de ensayo o la superficie externa de una varilla. Como alternativa, la superficie puede ser plana tal como una lámina, tira de ensayo, etc. Los expertos en la técnica conocerán muchos otros "soportes de fase sólida" adecuados para unir proteínas o serán capaces de determinar los mismos mediante el uso de experimentación rutinaria. Es un soporte de fase sólida preferido una placa de cultivo de microvaloración de 96 pocillos.
Para detectar la presencia de proteína receptor de ST, se utilizan anticuerpos anti-receptor de ST detectables. Son bien conocidos diversos procedimientos para la detección de anticuerpos.
Un procedimiento en el que los anticuerpos pueden marcarse detectablemente es mediante el ligamiento de anticuerpos a una enzima y utilizando posteriormente los anticuerpos en un inmunoensayo enzimático (EIA) o ensayo de inmunosorción ligado a enzimas (ELISA), tal como un ELISA de captura. La enzima, cuando se expone posteriormente a su sustrato, reacciona con el sustrato y genera un resto químico que puede detectarse, por ejemplo por medios espectrofotométricos, fluorométricos o visuales. Las enzimas que pueden utilizarse para marcar detectablemente anticuerpos incluyen, pero sin limitación, malato deshidrogenasa, nucleasa de estafilococo, delta-5-esteroide isomerasa, deshidrogenasa de alcohol de levadura, alfa-glicerofosfato deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolinesterasa. Un experto en la técnica reconocería fácilmente otras enzimas que pueden utilizarse también.
Otro procedimiento con el que los anticuerpos pueden marcarse detectablemente es mediante isótopos radiactivos y el uso posterior en un radioinmunoensayo (RIA) (véase por ejemplo Work, T.S. et al., "Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology", North Holland Publishing Company, NY, 1978, que se incorpora a la presente memoria por referencia). El isótopo radiactivo puede detectarse por medios tales como el uso de un contador gamma o un contador de centelleo o mediante autorradiografía. Los isótopos que son particularmente útiles con los fines de la presente invención son ^{3}H, ^{125}I, ^{131}I, ^{35}S y ^{14}C. Preferiblemente, ^{125}I es el isótopo. Un experto en la técnica reconocería fácilmente otros radioisótopos que pueden utilizarse también.
También es posible marcar el anticuerpo con un compuesto fluorescente. Cuando el anticuerpo marcado fluorescente se expone a luz de longitud de onda apropiada, su presencia puede detectarse debido a su fluorescencia. Entre los compuestos marcadores fluorescentes más habitualmente utilizados están isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina. Un experto en la técnica reconocería fácilmente otros compuestos fluorescentes que pueden utilizarse también.
Los anticuerpos pueden marcarse detectablemente también utilizando metales emisores de fluorescencia tales como ^{152}Eu, u otros de la serie lantánida. Estos metales pueden unirse a anticuerpo específico de proteína utilizando grupos quelantes de metal tales como ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) o ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Un experto en la técnica reconocería fácilmente otros metales emisores de fluorescencia así como otros grupos quelantes de metal que pueden utilizarse también.
El anticuerpo puede marcarse detectablemente también acoplándolo a un compuesto quimioluminiscente. La presencia del anticuerpo marcado quimioluminiscente se determina detectando la presencia de luminiscencia que surge durante el transcurso de una reacción química. Son ejemplos de compuestos marcados quimioluminiscentes particularmente útiles luminol, isoluminol, éster de acridinio teromático, imidazol, sal de acridinio y éster oxalato. Un experto en la técnica reconocería fácilmente otros compuestos luminiscentes que pueden utilizarse también.
Igualmente, puede utilizarse un compuesto bioluminiscente para marcar anticuerpos. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia encontrada en sistemas biológicos en los que una proteína catalítica aumenta la eficacia de la reacción quimioluminiscente. La presencia de una proteína bioluminiscente se determina detectando la presencia de luminiscencia. Son importantes compuestos bioluminiscentes con fines de marcaje luciferina, luciferasa y aequorina. Un experto en la técnica reconocería fácilmente otros compuestos bioluminiscentes que pueden utilizarse también.
La detección de anticuerpo específico de proteína, fragmentos o derivados, puede realizarse mediante un contador de centelleo si, por ejemplo, el marcaje detectable es un emisor gamma radiactivo. Como alternativa, la detección puede realizarse mediante un fluorómetro si, por ejemplo, el marcaje es un material fluorescente. En el caso de un marcaje enzimático, la detección puede realizarse mediante procedimientos colorimétricos que emplean un sustrato para la enzima. La detección puede realizarse también mediante comparación visual de la extensión de la reacción enzimática de un sustrato en comparación con patrones preparados similarmente. Un experto en la técnica reconocería fácilmente otros procedimientos apropiados de detección que pueden utilizarse también.
La actividad de unión de un lote dado de anticuerpos puede determinarse según procedimientos bien conocidos. Los expertos en la técnica serán capaces de determinar las condiciones de ensayo operativas y óptimas para cada determinación empleando experimentación rutinaria.
Pueden realizarse controles positivos y negativos en los que se añaden cantidades conocidas de proteína receptor de ST y proteína no receptor de ST, respectivamente, a ensayos que se están realizando en paralelo con el ensayo de muestra. Un experto en la técnica tendría los conocimientos necesarios para realizar los controles apropiados.
La proteína receptor de ST puede producirse en forma de reactivo para controles positivos rutinariamente. Un experto en la técnica apreciaría las diferentes maneras en que la proteína receptor de ST puede producirse y aislarse.
Una "composición de anticuerpo" designa el anticuerpo o anticuerpos necesarios para la detección de la proteína. Por ejemplo, la composición de anticuerpo utilizada para la detección de receptor de ST en una muestra de ensayo comprende un primer anticuerpo que se une a proteína receptor de ST así como un segundo o tercer anticuerpo detectable que se une al primer o segundo anticuerpo, respectivamente.
Para examinar en una muestra de ensayo la presencia de proteína receptor de ST, puede realizarse un ensayo inmunométrico estándar tal como el descrito a continuación. Se añade un primer anticuerpo anti-proteína receptor de ST, que reconoce una porción específica del receptor de ST tal como la porción extracelular o citoplasmática, a una placa de cultivo de microvaloración de 96 pocillos en un volumen de tampón. La placa de cultivo se incuba durante un periodo de tiempo suficiente para que ocurra la unión y posteriormente se lava con PBS para retiar el anticuerpo no unido. La placa de cultivo se bloquea después con una solución de PBS/BSA para evitar que las proteínas de la muestra se unan no específicamente a la placa de cultivo de microvaloración. Se añade posteriormente la muestra de ensayo a los pocillos y se incuba la placa de cultivo durante un periodo de tiempo suficiente para que ocurra la unión. Se lavan los pocillos con PBS para retirar la proteína no unida. Se añaden a los pocillos anticuerpos anti-receptor de ST marcados, que reconocen porciones del receptor de ST no reconocidas por el primer anticuerpo. La placa de cultivo se incuba durante un periodo de tiempo suficiente para que ocurra la unión y posteriormente se lava con PBS para retirar el anticuerpo anti-receptor de ST marcado no unido. La cantidad de anticuerpo anti-receptor de ST marcado y unido se determina posteriormente mediante técnicas estándar.
Los kits que son útiles para la detección de receptor de ST en una muestra de ensayo comprenden un envase que comprende anticuerpos anti-receptor de ST y un envase o envases que comprenden controles. Los controles incluyen una muestra de control que no contiene proteína receptor de ST y/o otra muestra de control que contiene proteína receptor de ST. Los anticuerpos anti-receptor de ST utilizados en el kit son detectables, tales como por estar marcados detectablemente. Si el anticuerpo anti-ST detectable no está marcado, puede detectarse mediante segundos anticuerpos o proteína A, por ejemplo, que puede proporcionarse además en algunos kits en envases separados. Los componentes adicionales en algunos kits incluyen soporte sólido, tampón e instrucciones para llevar a cabo el ensayo. Los anticuerpos anti-receptor de ST utilizados en el kit se unen preferiblemente a un epítopo en el dominio extracelular de la proteína receptor de ST.
El inmunoensayo es útil para detectar receptor de ST en muestras de tejido homogeneizado y muestras de fluido corporal, incluyendo la porción plasmática o células en la muestra de fluido.
Pueden utilizarse transferencias Western en procedimientos de identificación de individuos que sufren metástasis de cáncer colorrectal mediante la detección de la presencia de proteína receptor de ST en muestras de tejido no colorrectal o fluido corporal. Las transferencias Western pueden utilizarse también para detectar la presencia de proteína receptor de ST en muestras tumorales de un individuo que sufre cáncer para identificar y/o confirmar que el tumor es de origen colorrectal. Las transferencias Western utilizan anticuerpos anti-receptor de ST detectables para unirse a cualquier receptor de ST presente en una muestra e indicar así la presencia del receptor en la muestra.
Las técnicas de transferencia Western, que se describen en Sambrook, J. et al., (1989) "Molecular cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, que se incorpora a la presente memoria como referencia, son similares a los inmunoensayos, siendo la diferencia esencial que antes de la exposición de la muestra a los anticuerpos, las proteínas en las muestras se separan mediante electroforesis en gel y las proteínas separadas se ensayan después con anticuerpos. En algunas realizaciones preferidas, la matriz es una matriz de gel SDS-PAGE y las proteínas separadas en la matriz se transfieren a un vehículo tal como papel de filtro antes de sondear con anticuerpos. Los anticuerpos anti-receptor de ST descritos anteriormente son útiles en procedimientos de transferencia Western.
Generalmente, las muestras se homogeneizan y las células se lisan utilizando detergentes tales como Triton X. El material se separa después mediante técnicas estándar en Sambrook, J. et al., (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
Los kits que son útiles para la detección de receptor de ST en una muestra de ensayo mediante transferencia Western comprenden un envase que comprende anticuerpos anti-receptor de ST y un envase o envases que contienen controles. Los controles incluyen una muestra control que no contiene proteína receptor de ST y/o otra muestra control que contenía proteína receptor de ST. Los anticuerpos anti-receptor de ST utilizados en el kit son detectables, tal como por estar marcados detectablemente. Si el anticuerpo anti-ST detectable no está marcado, puede detectarse mediante segundos anticuerpos o proteína A, que por ejemplo puede proporcionarse también en algunos kits en envases separados. Los componentes adicionales en algunos kits incluyen instrucciones para llevar a cabo el ensayo. Los anticuerpos del kit se unen preferiblemente al dominio extracelular de la proteína receptor de ST.
Las transferencias Western son útiles para detectar el receptor de ST en muestras de tejido homogeneizado y en muestras de fluidos corporales, incluyendo la porción plasmática o células en la muestra de fluido.
Los ensayos de unión a ST pueden utilizarse en procedimientos de identificación de individuos que sufren metástasis de cáncer colorrectal mediante la detección de la presencia de proteína receptor de ST en muestras de tejido no colorrectal o fluido corporal. Los ensayos de unión a ST pueden utilizarse también en procedimientos para detectar la presencia de proteína receptor de ST en una muestra tumoral de un individuo que sufre cáncer para identificar y/o confirmar que el tumor es de origen colorrectal. El ensayo de unión a receptor de ST utiliza un ligando de receptor de ST detectable para unirse a cualquier receptor de ST presente e indicar por tanto la presencia del receptor en una muestra.
En algunas realizaciones, el ligando de receptor de ST puede ser ST nativa. En algunas realizaciones, el ligando de receptor de ST puede ser un péptido de unión a receptor de ST. En algunas realizaciones, el ligando de receptor de ST puede ser un péptido ST.
El ensayo de unión a receptor de ST, descrito anteriormente, puede realizarse fácilmente por los expertos en la técnica utilizando materiales de partida fácilmente disponibles. Los ensayos de unión a receptor de ST pueden realizarse de una variedad de formas, pero cada una identifica esencialmente si está presente o no una proteína receptor de ST en una muestra determinando si un ligando de receptor de ST detectable se une o no a un receptor en una muestra. Brevemente, el ensayo consiste en incubar una muestra con una concentración constante de un ligando de ST tal como 1 x 10^{-10} M a 5 x 10^{-5} M de ^{125}I-ST. Como control, se incuban una preparación por duplicado de una muestra conocida por contener receptores de ST con una concentración por duplicado de ^{125}I-ST. Los ensayos se incuban hasta equilibrio (por ejemplo 2 horas) y la muestra se analiza para determinar si se une o no ^{125}I-ST al material en la muestra. Se pasa la ^{125}I-ST/muestra a través de un filtro que es capaz de permitir pasar la ^{125}I-ST a su través pero no es capaz de permitir pasar el receptor de ST a su través. Por tanto, si está presente receptor de ST en la muestra, se unirá a la ^{125}I-ST que se atrapará entonces por el filtro. La detección de ^{125}I-ST en el filtro indica la presencia de receptor de ST en la muestra. En algunas realizaciones preferidas, el filtro es papel de filtro de vidrio Whitman GFB. Los controles incluyen utilizar muestras que son conocidas por contener receptores de ST, por ejemplo membranas intestinales de intestino de rata, intestino humano, células T84, proteína receptor de ST aislada o células que expresan secuencias nucleotídicas clonadas que codifican proteína receptor de ST.
Además de estar conjugada a ^{125}I, la ST puede ser detectable mediante su unión a otros radionucleidos tales como ^{43}K, ^{52}Fe, ^{57}Co, ^{67}Cu, ^{67}Ga, ^{68}Ga, ^{77}Br, ^{81}Rb/^{81}Kr, ^{87M}Sr, ^{99M}Tc, ^{111}In, ^{113M}In, ^{123}I, ^{125}I, ^{127}Cs, ^{129}Cs, ^{131}I, ^{132}I, ^{197}Hg, ^{203}Pb y ^{206}Bi, ^{47}Sc, ^{67}Cu, ^{90}Y, ^{109}Pd, ^{123}I, ^{125}I, ^{131}I, ^{186}Re, ^{188}Re, ^{199}Au, ^{211}At, ^{212}Pb, ^{212}B, ^{32}P y ^{33}P, ^{71}Ge, ^{77}As, ^{103}Pb, ^{105}Rh, ^{111}Ag, ^{119}Sb, ^{121}Sn, ^{131}Cs, ^{143}Pr, ^{161}Tb, ^{177}Lu,^{191}Os, ^{193M}Pt, ^{197}Hg o mediante su unión a otros marcajes tales como fluoresceína o enzimas. Cada uno de los medios de marcaje descritos anteriormente para marcar detectablemente anticuerpos puede adaptarse para marcar ligandos de receptor de ST, y se considera que se describen como tales en la presente memoria.
Los kits incluyen envases que comprenden ligando de receptor de ST detectable junto con envases que tienen controles positivos y/o negativos, concretamente muestras que contienen receptor de ST y muestras que no contienen receptor de ST, respectivamente. El ligando de receptor de ST detectable está preferiblemente marcado. El ligando de receptor de ST está preferiblemente radiomarcado, preferiblemente radiomarcado con ^{125}I. El ligando de receptor de ST detectable es preferiblemente un péptido de unión al receptor de ST. El péptido de unión al receptor de ST detectable es preferiblemente un péptido ST. En algunas realizaciones preferidas, el péptido ST se selecciona del grupo constituido por: SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3, SEC Nº ID 5, SEC Nº ID 6 y SEC Nº ID 54. Los componentes adicionales en algunos kits incluyen soporte sólido, tampón e instrucciones para llevar a cabo el ensayo.
El ensayo de unión al receptor de ST es útil para detectar receptor de ST en muestras de tejido homogeneizadas y muestras de fluido corporal, incluyendo la porción plasmática o células en la muestra de fluido.
Además de la detección de la proteína receptor de ST, aspectos de la presente invención incluyen diversos procedimientos de determinación de si una muestra contiene células que expresan receptor de ST mediante análisis molecular basado en la secuencia. Están disponibles diversos procedimientos diferentes para hacer esto, incluyendo estos utilizar la tecnología de reacción en cadena con polimerasa (PCR), utilizar la tecnología de transferencia Northern, hibridación con oligonucleótidos y tecnología de hibridación in situ.
La invención se refiere a sondas oligonucleotídicas y a cebadores utilizados en los procedimientos de identificación de ARNm que codifica receptor de ST y a kits de diagnóstico que comprenden dichos componentes.
Los procedimientos basados en la secuencia de ARNm para determinar si una muestra presenta ARNm que codifica receptor de ST incluyen, pero sin limitación, tecnología de reacción en cadena con polimerasa, tecnología de transferencia Northern y Southern, tecnología de hibridación in situ y tecnología de hibridación de oligonucleótidos.
Los procedimientos descritos en la presente memoria se pretende que ejemplifiquen cómo puede practicarse la presente invención y no se pretende que limiten el alcance de la invención. Se contempla que puede emplearse otra metodología basada en la secuencia para detectar la presencia de ARNm específico que codifica receptor de ST en muestras no colorrectales según la invención.
Un procedimiento preferido para detectar ARNm que codifica receptor de ST en material genético derivado de muestras no colorrectales utiliza tecnología de reacción en cadena con polimerasa (PCR). La tecnología PCR se practica rutinariamente por los expertos en la técnica, y sus usos en diagnóstico son bien conocidos y aceptados. Se dan a conocer procedimientos para practicar la tecnología de PCR en "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", Innis, M.A. et al., Eds. Academic Press, Inc., San Diego, CA (1990), que se incorpora a la presente memoria como referencia. Se dan a conocer aplicaciones de la tecnología de PCR en "Polymerase Chain Reaction", Erlich, H.A. et al., Eds. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), que se incorpora a la presente memoria como referencia. Las patentes de EE.UU. nº 4.683.202, 4.683.195, 4.965.188 y 5.075.216, que se incorporan a la presente memoria como referencia, describen procedimientos para realizar PCR. La PCR puede practicarse rutinariamente utilizando el kit GENE AMP RNA PCR de Perkin Elmer Cetus, nº part. N808-0017.
La tecnología de PCR recombinante permite la rápida generación de múltiples copias de secuencias de ADN proporcionando cebadores 5' y 3' que hibridan con secuencias presentes en una molécula de ARN o ADN, y proporcionando además nucleótidos libres y una enzima que rellena las bases complementarias de la secuencia nucleotídica entre los cebadores con los nucleótidos libres para producir una cadena complementaria de ADN. La enzima rellenará las secuencias complementarias adyacentes a los cebadores. Si ambos cebadores 5' y 3' hibridan con secuencias nucleotídicas en el mismo fragmento pequeño de ácido nucleico, da como resultado la amplificación exponencial de un producto de tamaño específico bicatenario. Si sólo un único cebador hibrida con el fragmento de ácido nucleico, la amplificación lineal produce productos monocatenarios de longitud variable.
Los cebadores de PCR pueden diseñarse rutinariamente por los expertos en la técnica utilizando la información de la secuencia. La secuencia nucleotídica que codifica proteína de receptor de ST es bien conocida, tal como en la patente de EE.UU. nº 5.237.051 y F.J. Sauvage et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:17912-17918, que se incorporan a la presente memoria por referencia. Para realizar este procedimiento, es extrae ARN de células de una muestra y se ensaya o se utiliza para preparar ADNc utilizando procedimientos bien conocidos y materiales de partida fácilmente disponibles.
Los expertos en la técnica pueden preparar fácilmente cebadores de PCR. Un conjunto de cebadores contiene generalmente dos cebadores. Cuando se realiza una PCR en ARNm extraído o ADNc generado a partir del mismo, si el ARN, o ADNc que codifica proteína receptor de ST está presente, se harán múltiples copias del ARNm o ADNc. Si no está presente, la PCR no generará un producto detectable discreto. Los cebadores son generalmente fragmentos de 8-50 nucleótidos, preferiblemente aproximadamente 15-35 nucleótidos, más preferiblemente 18-28 nucleótidos, que son idénticos o complementarios y por lo tanto hibridan con el ARNm o ADNc generado a partir del mismo que codifica proteína receptor de ST. En realizaciones preferidas, los cebadores son cada uno fragmentos de 15-35 nucleótidos, más preferiblemente 18-28 nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotídica que codifica proteína receptor de ST como se describe en la patente de EE.UU. 5.237.051 y F.J. Sauvage et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:17912-17918. El cebador debe hibridar con la secuencia a amplificar. Los cebadores típicos son de 18-28 nucleótidos de longitud y tienen generalmente una composición de 50% a 60% de G+C. El cebador completo es preferiblemente complementario de la secuencia con la que debe hibridar. Preferiblemente, los cebadores generan productos de PCR de 100 pares de bases a 2000 pares de bases. Sin embargo, es posible generar productos de 50 hasta 10 kb y más. Si se utiliza ARNm como molde, los cebadores deben hibridar con secuencias de ARNm. Si se utiliza ADNc como molde, los cebadores deben hibridar con secuencias de ADNc. El dominio extracelular es la porción más exclusiva de la proteína receptor de ST. Al menos un cebador hibrida con una secuencia nucleotídica que corresponde al dominio extracelular de la proteína receptor de ST.
En algunas realizaciones preferidas, el cebador PCR 5' se diseña basándose en los nucleótidos 15-41 de la secuencia de codificación del receptor de ST como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.237.051. En algunas realizaciones preferidas, el cebador PCR 5' se diseña basándose en los nucleótidos 20-40 de la secuencia de codificación del receptor de ST como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.237.051. En algunas realizaciones preferidas, el cebador PCR 5' se diseña basándose en los nucleótidos 25-43 de la secuencia de codificación del receptor de ST como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.237.051. En algunas realizaciones preferidas, el cebador PCR 5' se diseña basándose en los nucleótidos 40-62 de la secuencia de codificación del receptor de ST como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.237.051. En algunas realizaciones preferidas, el cebador PCR 5' se diseña basándose en los nucleótidos 350-375 de la secuencia de codificación del receptor de ST como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.237.051. En algunas realizaciones preferidas, el cebador PCR 5' se diseña basándose en los nucleótidos 290-308 de la secuencia de codificación del receptor de ST como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.237.051. En algunas realizaciones preferidas, el cebador PCR 5' se diseña basándose en los nucleótidos 121-141 de la secuencia de codificación del receptor de ST como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.237.051. En algunas realizaciones preferidas, el cebador PCR 5' se diseña basándose en los nucleótidos 171-196 de la secuencia de codificación del receptor de ST como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.237.051.
El ARNm o ADNc se combina con los cebadores, nucleótidos libres y enzima siguiendo protocolos estándar de PCR. La mezcla experimenta una serie de cambios de temperatura. Si el ARNm o ADNc que codifican el receptor de ST están presentes, es decir, si ambos cebadores hibridan con secuencias en la misma molécula, la molécula que comprende los cebadores y las secuencias complementarias intervinientes se amplificará exponencialmente. El ADN amplificado puede detectarse fácilmente mediante una variedad de medios bien conocidos. Si no está presente ARNm ni ADNc que codifica el receptor de ST, no se amplificará exponencialmente ningún producto de PCR. La tecnología de PCR proporciona por lo tanto un procedimiento extremadamente fácil, directo y fiable de detección de ARNm que codifica proteína receptor de ST en una muestra.
El producto de PCR puede detectarse mediante diversos medios bien conocidos. El procedimiento preferido para detectar la presencia de ADN amplificado es separar el material de reacción PCR mediante electroforesis en gel y teñir el gel con bromuro de etidio para visualizar el ADN amplificado si está presente. Se aplica al gel preferiblemente un patrón de tamaño del tamaño esperado del ADN amplificado como control.
En algunos casos, tales como cuando se recuperan cantidades inusualmente pequeñas de ARN y sólo se generan pequeñas cantidades de ADNc a partir del mismo, es deseable o necesario realizar una reacción PCR sobre el primer producto de reacción PCR. Es decir, si es difícil detectar las cantidades de ADN amplificado producidas por la primera reacción, puede realizarse una segunda PCR para hacer múltiples copias de las secuencias de ADN del primer ADN amplificado. Se utiliza un conjunto anidado de cebadores en la segunda reacción PCR. El conjunto anidado de cebadores híbrida con secuencias cadena abajo del cebador 5' y cadena arriba del cebador 3' utilizado en la primera reacción.
La presente invención incluye oligonucleótidos que son útiles como cebadores para realizar procedimientos de PCR para amplificar ARNm o ADNc que codifica proteína receptor de ST.
Según la invención, pueden ensamblarse kits de diagnóstico que son útiles para practicar procedimientos de detección de la presencia de ARNm o ADNc que codifica receptor de ST en muestras no colorrectales. Dichos kits de diagnóstico comprenden oligonucleótidos que son útiles como cebadores para realizar procedimientos de PCR. Se prefiere que los kits de diagnóstico según la presente invención comprendan un envase que comprende un marcador de tamaño para procesar como patrón en un gel utilizado para detectar la presencia del ADN amplificado. El marcador de tamaño es del mismo tamaño que el ADN generado por los cebadores en presencia del ARNm o ADNc que codifica el receptor de ST.
Los ensayos de PCR son útiles para detectar ARNm que codifica receptor de ST en muestras de tejido homogeneizado y células en muestras de fluido corporal. Se contempla que la PCR en la porción de plasma de una muestra de fluido podría utilizarse para detectar ARNm que codifica proteína receptor de ST.
Otro procedimiento de determinación de si una muestra contiene células que expresan receptor de ST es mediante análisis de transferencia Northern del ARNm extraído de una muestra no colorrectal. Las técnicas para realizar análisis de transferencia Northern son bien conocidas por los expertos en la técnica, y se describen en Sambrook, J. et al., (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. La extracción de ARNm, separación electroforética del ARNm, transferencia, preparación de sonda e hibridación son todas técnicas bien conocidas que pueden realizarse rutinariamente utilizando material de partida fácilmente disponible.
El ARNm se extrae utilizando columnas de poli-DT y el material se separa mediante electroforesis y, por ejemplo, se transfiere a papel de nitrocelulosa. Pueden utilizarse sondas marcadas preparadas a partir de un fragmento o fragmentos específicos aislados para visualizar la presencia de un fragmento complementario fijado al papel. Las sondas útiles para identificar ARNm en una transferencia Northern tienen una secuencia nucleotídica que es complementaria del ARNm transcrito del gen que codifica la proteína receptor de ST. Los expertos en la técnica podrían utilizar la información de la secuencia de la patente de EE.UU. nº 5.237.051 y F.J. Sauvage et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:17912-17918 para diseñar dichas sondas o para aislar y clonar el gen o ADNc de receptor de ST que puede utilizarse como sonda. Las sondas hibridan preferiblemente con la porción de ARNm que corresponde al dominio extracelular de la proteína receptor de ST. En realizaciones preferidas, las sondas son clones completos o fragmentos de la molécula de ácido nucleico que comprenden la secuencia nucleotídica que codifica proteína receptor de ST como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.237.051 y F.J. Sauvage et al., 1991, J. Biol. Chem. Dichas sondas son fragmentos de al menos 15 nucleótidos, preferiblemente 30-200, más preferiblemente 40-100 nucleótidos, y pueden ser la secuencia de codificación completa de los receptores de ST, más preferiblemente fragmentos de 18-28 nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotídica que codifica la proteína receptor de ST como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.237.051 y F.J. Sauvage et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:17912-17918. Una sonda preferida híbrida con el ARNm que codifica la proteína receptor de ST del nucleótido 50 al nucleótido 90.
Según la invención, pueden ensamblarse kits de diagnóstico que son útiles para practicar procedimientos de detección de la presencia de ARNm que codifica receptor de ST en muestras no colorrectales mediante análisis de transferencia Northern. Dichos kits de diagnóstico comprenden oligonucleótidos que son útiles como sondas para hibridar con el ARNm. Las sondas pueden estar radiomarcadas. Se prefiere que los kits de diagnóstico según la presente invención comprendan un envase que comprende un marcador de tamaño para procesar como patrón en un gel. Se prefiere que los kits de diagnóstico según la presente invención comprendan un envase que comprende un control positivo que hibridará con la sonda.
El análisis de transferencia Northern es útil para detectar ARNm que codifica receptor de ST en muestras de tejido homogeneizado y células en muestras de fluido corporal. Se contempla que la PCR en la porción de plasma de una muestra de fluido podría utilizarse para detectar ARNm que codifica proteína receptor de ST.
Otro procedimiento de detección de la presencia de ARNm que codifica proteína receptor de ST es mediante tecnología de hibridación de oligonucleótidos. La tecnología de hibridación de oligonucleótidos es bien conocida por los expertos en la técnica. Brevemente, se utilizan sondas detectables que contienen una secuencia nucleotídica específica que hibridará con la secuencia nucleotídica de ARNm que codifica proteína receptor de ST. Se fija el ARN o ADNc preparado a partir de ARNm de una muestra habitualmente a un papel de filtro o similar. Se añaden las sondas y se mantienen en condiciones que permiten la hibridación sólo si las sondas complementan completamente el material genético fijado. Las condiciones son suficientemente rigurosas para separar por lavado las sondas en las que sólo híbrida una porción de la sonda con el material fijado. La detección de la sonda en el filtro lavado indica secuencias complementarias.
Las sondas útiles en los ensayos de oligonucleótidos tienen al menos 18 nucleótidos de ADN complementario y pueden ser tan grandes como una secuencia complementaria completa de ADNc de receptor de ST. En algunas realizaciones preferidas, las sondas de la invención son de 30-200 nucleótidos, preferiblemente 40-100 nucleótidos. Las sondas contienen preferiblemente una secuencia que es complementaria de la porción que codifica el dominio extracelular del receptor de ST.
Un experto en la técnica, utilizando la información de secuencia dada a conocer en la patente de EE.UU. 5.237.051 y F.J. Sauvage et al. J. Biol. Chem. 266:17912-17918, puede diseñar sondas que son completamente complementarias de las secuencias de ARNm pero no con las secuencias de ADN genómico. Las condiciones de hibridación pueden optimizarse rutinariamente para minimizar la señal de fondo mediante hibridación no completamente complementaria. Las sondas hibridan preferiblemente con la porción de ARNm que incluye una secuencia nucleotídica que corresponde al dominio extracelular de la proteína receptor de ST. Las sondas hibridan preferiblemente con la porción de ARNm que corresponde al dominio extracelular de la proteína receptor de ST. En realizaciones preferidas, las sondas son clones completos o fragmentos de la molécula de ácido nucleico que comprenden la secuencia nucleotídica que codifica proteína receptor de ST como se describe en la patente de EE.UU. 5.237.051 y F.J. Sauvage et al. J. Biol. Chem. Dichas sondas son fragmentos de al menos 15 nucleótidos, preferiblemente 30-200, más preferiblemente 40-100 nucleótidos, y pueden ser la secuencia de codificación completa de receptores de ST, más preferiblemente fragmentos de 18-28 nucleótidos de la molécula de ácido nucleico, que comprende la secuencia nucleotídica que codifica proteína receptor de ST como se describe en la patente de EE.UU. 5.237.051 y F.J. Sauvage et al. J. Biol. Chem. 266:17912-17918. Una sonda preferida hibrida con el ARNm que codifica proteína receptor de ST del nucleótido 50 al nucleótido 90.
La presente invención incluye oligonucleótidos marcados que son útiles como sondas para realizar hibridación de oligonucleótidos. Es decir, son completamente complementarios de las secuencias de ARNm pero no con las secuencias genómicas. Por ejemplo, la secuencia de ARNm incluye porciones codificadas por diferentes exones. Las sondas marcadas de la presente invención se marcan con nucleótidos radiomarcados o son detectables de otro modo mediante sistemas de detección no radiactiva fácilmente disponibles.
Según la invención, pueden ensamblarse kits de diagnóstico que son útiles para practicar procedimientos de hibridación de oligonucleótidos de la invención. Dichos kits de diagnóstico comprenden un oligonucleótido marcado que codifica porciones de receptor de ST codificado por diferentes exones. Se prefiere que las sondas marcadas de los kits de diagnóstico de oligonucleótidos según la presente invención estén marcadas con un radionucleótido. Los kits de diagnóstico basados en la hibridación de oligonucleótidos según la invención comprenden preferiblemente muestras de ADN que representan controles positivos y negativos. Una muestra de ADN de control positivo es aquella que comprende una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia nucleotídica que es completamente complementaria de las sondas del kit de tal modo que las sondas hibridarán con la molécula en las condiciones de ensayo. Una muestra de ADN de control negativo es aquella que comprende al menos una molécula de ácido nucleico cuya secuencia nucleotídica es parcialmente complementaria de las secuencias de la sonda del kit. En las condiciones de ensayo, la sonda no hibridará con la muestra de ADN de control negativo. Los expertos en la técnica podrían utilizar la información de secuencia de la patente de EE.UU. nº 5.237.051 y F.J. Sauvage et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:17912-17918 para diseñar dichas sondas o para aislar y clonar el gen o ADNc de receptor de ST que puede utilizarse como sonda. Tanto la cadena de codificación como su cadena complementaria pueden utilizarse como sonda.
Las técnicas de hibridación de oligonucleótidos son útiles para detectar ARNm que codifica receptor de ST en muestras de tejido homogeneizado y células en muestras de fluido corporal. Se contempla que la PCR en la porción plasmática de una muestra de fluido podría utilizarse para detectar ARNm que codifica proteína receptor de ST.
La presente invención se refiere a kits in vitro para la evaluación de muestras de tejido para determinar el nivel de metástasis y a reactivos y composiciones útiles para practicar la misma.
En algunas realizaciones de la invención, pueden aislarse muestras de tejido que incluyen porciones de la lámina propia de individuos que experimentan o se recuperan de cirugía para extirpar tumores colorrectales, incluyendo resección o colonoscopia. El tejido se analiza para identificar la presencia o ausencia de proteína receptor de ST. Pueden realizarse técnicas tales como ensayos de unión de receptor de ST/ligando e inmunohistoquímica para determinar si el receptor de ST está presente en células en la muestra de tejido, lo que es indicativo de migración metastática. Como alternativa, en algunas realizaciones de la invención, se analizan muestras de tejido para identificar si la proteína receptor de ST se está expresando en células de la muestra de tejido, lo que indica migración metastática, mediante la detección de la presencia o ausencia de ARNm que codifica la proteína receptor de ST. La presencia de ARNm que codifica la proteína receptor de ST o ADNc generado a partir del mismo puede determinarse utilizando técnicas tales como hibridación in situ, inmunohistoquímica y ensayo de unión de ST in situ.
La presente invención se refiere a kits in vitro para la evaluación de muestras de tumores para determinar si son o no de origen colorrectal, y a reactivos y composiciones útiles para practicar los mismos. En algunas realizaciones de la invención, pueden aislarse muestras tumorales de individuos que experimentan o se recuperan de cirugía para extirpar tumores en el colon, tumores en otros órganos o material de biopsia. La muestra tumoral se analiza para identificar la presencia o ausencia de proteína receptor de ST. Pueden realizarse técnicas tales como ensayos de unión de receptor de ST/ligando e inmunohistoquímica para determinar si el receptor de ST está presente en células de la muestra tumoral, lo que es indicativo de origen colorrectal. Como alternativa, en algunas realizaciones de la invención, se analizan muestras de tejido de lumen para identificar si se está expresando proteína receptor de ST en células de la muestra tumoral, lo que indica origen colorrectal, detectando la presencia o ausencia o ARNm que codifica la proteína receptor de ST. La presencia de ARNm que codifica proteína receptor de ST o ADNc generado por el mismo puede determinarse utilizando técnicas tales como hibridación in situ, inmunohistoquímica y ensayo de unión a ST in situ.
La tecnología de hibridación in situ es bien conocida por los expertos en la técnica. Brevemente, se fijan células y se añaden sondas detectables que contienen una secuencia nucleotídica específica de las células fijadas. Si las células contienen secuencias nucleotídicas complementarias, las sondas, que pueden detectarse, hibridarán con ellas.
Las sondas útiles en ensayos de oligonucleótidos tienen al menos 18 nucléotidos de ADN complementario y pueden ser tan grandes como una secuencia complementaria completa de ARNm de receptor de ST. En algunas realizaciones preferidas, las sondas de la invención son de 30-200 nucleótidos, preferiblemente 40-100 nucleótidos. Las sondas contienen preferiblemente una secuencia que es complementaria de la porción que codifica el dominio extracelular del receptor de ST.
Un experto en la técnica, utilizando la información de secuencia dada a conocer en la patente de EE.UU. nº 5.237.051 y F.J. Sauvage et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:17912-17918, puede diseñar sondas útiles en la tecnología de hibridación in situ para identificar células que expresan receptor de ST. Las sondas hibridan preferiblemente con una secuencia nucleotídica que corresponde al dominio extracelular de la proteína receptor de ST. Las condiciones de hibridación pueden optimizarse rutinariamente para minimizar la señal de fondo por hibridación no totalmente complementaria. Las sondas hibridan preferiblemente con la porción del ARNm que incluye una secuencia nucleotídica que corresponde al dominio extracelular de la proteína receptor de ST. Las sondas hibridan preferiblemente con la porción del ARNm que corresponde al dominio extracelular de la proteína receptor de ST. En realizaciones preferidas, las sondas son clones completos o fragmentos de la molécula de ácido nucleico que comprenden la secuencia nucleotídica que codifica proteína receptor de ST como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.237.051 y F.J. Sauvage et al., 1991, J. Biol. Chem. Dichas sondas son fragmentos de al menos 15 nucleótidos, preferiblemente 30-200, más preferiblemente 40-100 nucleótidos, y pueden ser la secuencia de codificación completa de receptores de ST, más preferiblemente fragmentos de 18-28 nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotídica que codifica proteína receptor de ST como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.237.051 y F.J. Sauvage et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:17912-17918. Una sonda preferida hibrida con el ARNm que codifica proteína receptor de ST del nucleótido 50 al nucleótido 90.
Las sondas son completamente complementarias y no hibridan bien con secuencias parcialmente complementarias. Para la hibridación in situ según la invención, se prefiere que las sondas sean detectables por fluorescencia. Un procedimiento común es marcar la sonda con nucleótido modificado con biotina y detectar después con avidina marcada fluorescentemente. Por tanto, la sonda no tiene que estar marcada por sí misma con un compuesto fluorescente, sino que puede detectarse posteriormente con un marcador fluorescente.
La presente invención incluye oligonucleótidos marcados que son útiles como sondas para realizar hibridación de oligonucleótidos. Es decir, son completamente complementarios de secuencias de ARNm pero no de secuencias genómicas. Por ejemplo, la secuencia de ARNm incluye porciones codificadas por diferentes exones. Las sondas marcadas de la presente invención se marcan con nucleótidos radiomarcados o son detectables de otro modo mediante sistemas de detección no radiactiva fácilmente disponibles.
La presente invención se refiere a sondas útiles para hibridación in situ para identificar células que expresan proteína receptor de ST.
Las células se fijan y se añaden las sondas al material genético. Las sondas hibridarán con la secuencia de ácido nucleico complementaria presente en la muestra. Utilizando un microscopio fluorescente, las sondas pueden visualizarse mediante sus marcadores fluorescentes.
Según la invención, pueden ensamblarse kits de diagnóstico que son útiles para practicar procedimientos de hibridación in situ de la invención y son completamente complementarios de secuencias de ARNm pero no de secuencias genómicas. Por ejemplo, la secuencia de ARNm incluye porciones codificadas por diferentes exones. Se prefiere que las sondas marcadas de los kits de diagnóstico in situ según la presente invención estén marcados con un marcador fluorescente.
Los expertos en la técnica pueden analizar las células fijadas para caracterizar el nivel de migración metastática de las células de cáncer de colon. El marcaje de células derivadas de colon permite un análisis mejorado.
Las técnicas de inmunohistoquímica pueden utilizarse para identificar y teñir esencialmente células con receptor de ST. Dicha "tinción" permite el análisis de la migración metastática. Se ponen en contacto anticuerpos anti-receptor de ST tales como los descritos anteriormente con células fijadas, y el receptor de ST presente en las células reacciona con los anticuerpos. Los anticuerpos se marcan detectablemente o se detectan utilizando un segundo anticuerpo marcado o proteína A para teñir las células.
Pueden realizarse ensayos de unión de ST en lugar de inmunohistoquímica, excepto porque la sección celular se congela primero, después se realiza en el ensayo de unión de ST y después se fijan las células.
Las técnicas descritas en la presente memoria para evaluar secciones tumorales pueden utilizarse también para analizar secciones de tejido para muestras de nódulos linfáticos, así como otros tejidos, para identificar la presencia de células tumorales colorrectales. Las muestras pueden prepararse y "teñirse" para detectar la expresión de receptor de ST.
Los siguientes ejemplos son ilustrativos pero no se pretende que sean limitantes de la presente invención.
Ejemplos Ejemplo 1
Los siguientes son compuestos representativos según la presente invención. Siempre que se indique a continuación, la referencia a una serie de compuestos se proporciona por eficacia, y se pretende nombrar cada compuesto en la serie incluyendo todos los compuestos en orden numérico, tal como por ejemplo "3-D1 a 3-D16" se pretende que indique los compuestos 3-D1, 3-D2, 3-D3, 3-D4, 3-D5, 3-D6, 3-D7, 3-D8, 3-D9, 3-D10, 3-D11, 3-D12, 3-D13, 3-D14, 3-D15 y 3-D16. Igualmente, siempre que se indique a continuación, la referencia a una serie de SEC Nº ID se proporciona por eficacia, y se pretende nombrar cada SEC Nº ID en la serie incluyendo todas las SEC Nº ID en orden numérico, tal como por ejemplo SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54 se pretende que designe la SEC Nº ID 5, SEC Nº ID 6, SEC Nº ID 7, SEC Nº ID 8, SEC Nº ID 9, SEC Nº ID 10, SEC Nº ID 11, SEC Nº ID 12, SEC Nº ID 13, SEC Nº ID 14, SEC Nº ID 15, SEC Nº ID 16, SEC Nº ID 17, SEC Nº ID 18, SEC Nº ID 19, SEC Nº ID 20, SEC Nº ID 21, SEC Nº ID 22, SEC Nº ID 23, SEC Nº ID 24, SEC Nº ID 25, SEC Nº ID 26, SEC Nº ID 27, SEC Nº ID 28, SEC Nº ID 29, SEC Nº ID 30, SEC Nº ID 31, SEC Nº ID 32, SEC Nº ID 33, SEC Nº ID 34, SEC Nº ID 35, SEC Nº ID 36, SEC Nº ID 37, SEC Nº ID 38, SEC Nº ID 39, SEC Nº ID 40, SEC Nº ID 41, SEC Nº ID 42, SEC Nº ID 43, SEC Nº ID 44, SEC Nº ID 45, SEC Nº ID 46, SEC Nº ID 47, SEC Nº ID 48, SEC Nº ID 49, SEC Nº ID 50, SEC Nº ID 51, SEC Nº ID 52, SEC Nº ID 53 y SEC Nº ID 54. De forma similar, siempre que se indique a continuación, la referencia a una serie de compuestos se proporciona por eficacia, y se pretende nombrar cada compuesto en la serie incluyendo todos los compuestos en orden numérico, tal como por ejemplo "5-AP a 54-AP" se pretende que designe los compuestos 5-AP, 6-AP, 7-AP, 8-AP, 9-AP,10-AP, 11-AP, 12-AP,13-AP, 14-AP, 15-AP, 16-AP,17-AP, 18-AP, 19-AP, 20-AP, 21-AP, 22-AP, 23-AP, 24-AP, 25-AP, 26-AP, 27-AP, 28-AP, 29-AP, 30-AP, 31-AP, 32-AP, 33-AP, 34-AP, 35-AP, 36-AP, 37-AP, 38-AP, 39-AP, 40-AP, 41-AP, 42-AP, 43-AP, 44-AP, 45-AP, 46-AP, 47-AP, 48-AP, 49-AP, 50-AP, 51-AP, 52-AP, 53-AP y 54-AP.
El compuesto 2-D1 comprende metotrexato (ametopterina) conjugado con la SEC Nº ID 2.
El compuesto 2-D2 comprende doxorubicina (adrimicina) conjugada con la SEC Nº ID 2.
El compuesto 2-D3 comprende daunorubicina conjugada con la SEC Nº ID 2.
El compuesto 2-D4 comprende citosinarabinósido conjugado con la SEC Nº ID 2.
El compuesto 2-D5 comprende etopósido conjugado con la SEC Nº ID 2.
El compuesto 2-D6 comprende 5-fluorouracilo conjugado con la SEC Nº ID 2.
El compuesto 2-D7 comprende melfalano conjugado con la SEC Nº ID 2.
El compuesto 2-D8 comprende clorambucilo conjugado con la SEC Nº ID 2.
El compuesto 2-D9 comprende ciclofosfamida conjugada con la SEC Nº ID 2.
El compuesto 2-D10 comprende cis-platino conjugado con la SEC Nº ID 2.
El compuesto 2-D11 comprende vindesina conjugada con la SEC Nº ID 2.
El compuesto 2-D12 comprende mitomicina conjugada con la SEC Nº ID 2.
El compuesto 2-D13 comprende bleomicina conjugada con la SEC Nº ID 2.
El compuesto 2-D14 comprende purotionina conjugada con la SEC Nº ID 2.
El compuesto 2-D15 comprende macromomicina conjugada con la SEC Nº ID 2.
El compuesto 2-D16 comprende Trenimon conjugada con la SEC Nº ID 2.
Los compuestos 3-D1 a 3-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 3-D1 a 3-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 3 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 5-D1 a 5-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 5-D1 a 5-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 5 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 6-D1 a 6-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 6-D1 a 6-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 6 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 7-D1 a 7-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 7-D1 a 7-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 7 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 8-D1 a 8-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 8-D1 a 8-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 8 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 9-D1 a 9-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 9-D1 a 9-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 9 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 10-D1 a 10-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 10-D1 a 10-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 10 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 11-D1 a 11-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 11-D1 a 11-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 11 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 12-D1 a 12-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 12-D1 a 12-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 12 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 13-D1 a 13-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 13-D1 a 13-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 13 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 14-D1 a 14-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 14-D1 a 14-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 14 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 15-D1 a 15-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 15-D1 a 15-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 15 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 16-D1 a 16-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 16-D1 a 16-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 16 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 17-D1 a 17-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 17-D1 a 17-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 17 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 18-D1 a 18-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 18-D1 a 18-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 18 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 19-D1 a 19-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 19-D1 a 19-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 19 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 20-D1 a 20-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 20-D1 a 20-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 20 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 21-D1 a 21-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 21-D1 a 21-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 21 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 22-D1 a 22-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 22-D1 a 22-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 22 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 23-D1 a 23-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 23-D1 a 23-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 23 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 24-D1 a 24-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 24-D1 a 24-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 24 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 25-D1 a 25-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 25-D1 a 25-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 25 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 26-D1 a 26-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 26-D1 a 26-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 26 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 27-D1 a 27-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 27-D1 a 27-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 27 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 28-D1 a 28-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 28-D1 a 28-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 28 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 29-D1 a 29-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 29-D1 a 29-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 29 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 30-D1 a 30-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 30-D1 a 30-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 30 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 31-D1 a 31-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 31-D1 a 31-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 31 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 32-D1 a 32-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 32-D1 a 32-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 32 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 33-D1 a 33-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 33-D1 a 33-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 33 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 34-D1 a 34-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 34-D1 a 34-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 34 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 35-D1 a 35-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 35-D1 a 35-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 35 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 36-D1 a 36-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 36-D1 a 36-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 36 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 37-D1 a 37-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 37-D1 a 37-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 37 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 38-D1 a 38-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 38-D1 a 38-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 38 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 39-D1 a 39-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 39-D1 a 39-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 39 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 40-D1 a 40-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 40-D1 a 40-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 40 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 41-D1 a 41-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 41-D1 a 41-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 41 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 42-D1 a 42-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 42-D1 a 42-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 42 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 43-D1 a 43-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 43-D1 a 43-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 43 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 44-D1 a 44-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 44-D1 a 44-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 44 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 45-D1 a 45-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 45-D1 a 45-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 45 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 46-D1 a 46-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 46-D1 a 46-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 46 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 47-D1 a 47-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 47-D1 a 47-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 47 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 48-D1 a 48-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 48-D1 a 48-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 48 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 49-D1 a 49-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 49-D1 a 49-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 49 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 50-D1 a 50-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 50-D1 a 50-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 50 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 51-D1 a 51-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 51-D1 a 51-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 51 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 52-D1 a 52-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 52-D1 a 52-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 52 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 53-D1 a 53-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 53-D1 a 53-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 53 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 54-D1 a 54-D16 son iguales a los compuestos 2-D1 a 2-D16, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 54-D1 a 54-D16 comprenden cada uno la SEC Nº ID 54 como resto de unión al receptor de ST.
El compuesto 2-T1 comprende ricina conjugada con la SEC Nº ID 2.
El compuesto 2-T2 comprende cadena A de ricina (toxina ricina) conjugada con la SEC Nº ID 2.
El compuesto 2-T3 comprende exotoxina de Pseudomonas conjugada (PE) con la SEC Nº ID 2.
El compuesto 2-T4 comprende toxina de difteria (DT) conjugada con la SEC Nº ID 2.
El compuesto 2-T5 comprende fosfolipasa C de Clostridium perfringens (PLC) conjugada con la SEC Nº ID 2.
El compuesto 2-T6 comprende ribonucleasa pancreática bovina (BPR) conjugada con la SEC Nº ID 2.
El compuesto 2-T7 comprende proteína antiviral de fitolaca (PAP) conjugada con la SEC Nº ID 2.
El compuesto 2-T8 comprende abrina conjugada con la SEC Nº ID 2.
El compuesto 2-T9 comprende cadena A de abrina conjugada con la SEC Nº ID 2.
El compuesto 2-T10 comprende factor de veneno de cobre (CVF) conjugado con la SEC Nº ID 2.
El compuesto 2-T11 comprende gelonina (GEL) conjugada con la SEC Nº ID 2.
El compuesto 2-T12 comprende saporina (SAP) conjugada con la SEC Nº ID 2.
El compuesto 2-T13 comprende modecina conjugada con la SEC Nº ID 2.
El compuesto 2-T14 comprende viscumina conjugada con la SEC Nº ID 2.
El compuesto 2-T15 comprende volkensina conjugada con la SEC Nº ID 2.
Los compuestos 3-T1 a 3-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 3-T1 a 3-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 3 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 5-T1 a 5-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 5-T1 a 5-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 5 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 6-T1 a 6-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 6-T1 a 6-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 6 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 7-T1 a 7-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 7-T1 a 7-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 7 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 8-T1 a 8-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 8-T1 a 8-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 8 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 9-T1 a 9-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 9-T1 a 9-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 9 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 10-T1 a 10-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 10-T1 a 10-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 10 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 11-T1 a 11-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 11-T1 a 11-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 11 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 12-T1 a 12-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 12-T1 a 12-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 12 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 13-T1 a 13-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 13-T1 a 13-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 13 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 14-T1 a 14-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 14-T1 a 14-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 14 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 15-T1 a 15-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 15-T1 a 15-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 15 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 16-T1 a 16-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 16-T1 a 16-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 16 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 17-T1 a 17-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 17-T1 a 17-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 17 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 18-T1 a 18-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 18-T1 a 18-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 18 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 19-T1 a 19-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 19-T1 a 19-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 19 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 20-T1 a 20-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 20-T1 a 20-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 20 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 21-T1 a 21-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 21-T1 a 21-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 21 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 22-T1 a 22-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 22-T1 a 22-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 22 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 23-T5 a 23-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 23-T1 a 23-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 23 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 24-T1 a 24-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 24-T1 a 24-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 24 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 25-T1 a 25-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 25-T1 a 25-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 25 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 26-T1 a 26-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 26-T1 a 26-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 26 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 27-T1 a 27-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 27-T1 a 27-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 27 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 28-T1 a 28-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 28-T1 a 28-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 28 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 29-T1 a 29-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 29-T1 a 29-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 29 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 30-T1 a 30-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 30-T1 a 30-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 30 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 31-T1 a 31-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 31-T1 a 31-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 31 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 32-T1 a 32-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 32-T1 a 32-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 32 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 33-T1 a 33-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 33-T1 a 33-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 33 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 34-T1 a 34-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 34-T1 a 34-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 34 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 35-T1 a 35-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 35-T1 a 35-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 35 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 36-T1 a 36-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 36-T1 a 36-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 36 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 37-T1 a 37-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 37-T1 a 37-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 37 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 38-T1 a 38-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 38-T1 a 38-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 38 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 39-T1 a 39-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 39-T1 a 39-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 39 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 40-T1 a 40-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 40-T1 a 40-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 40 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 41-T1 a 41-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 41-T1 a 41-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 41 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 42-T1 a 42-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 42-T1 a 42-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 42 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 43-T1 a 43-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 43-T1 a 43-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 43 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 44-T1 a 44-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 44-T1 a 44-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 44 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 45-T1 a 45-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 45-T1 a 45-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 45 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 46-T1 a 46-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 46-T1 a 46-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 46 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 47-T1 a 47-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 47-T1 a 47-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 47 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 48-T1 a 48-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 48-T1 a 48-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 48 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 49-T1 a 49-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 49-T1 a 49-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 49 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 50-T1 a 50-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 50-T1 a 50-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 50 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 51-T1 a 51-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 51-T1 a 51-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 51 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 52-T1 a 52-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 52-T1 a 52-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 52 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 53-T1 a 53-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 53-T1 a 53-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 53 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 54-T1 a 54-T15 son iguales que los compuestos 2-T1 a 2-T15, respectivamente, excepto porque en lugar de comprender la SEC Nº ID 2 como resto de unión al receptor de ST, los compuestos 54-T1 a 54-T15 comprenden cada uno la SEC Nº ID 54 como resto de unión al receptor de ST.
Los compuestos 2-AP, 3-AP y 5-AP a 54-AP designan los 51 compuestos conjugados que comprenden fosfatasa alcalina conjugada con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-NIZ, 3-NIZ y 5-NIZ a 54-NIZ designan los 51 compuestos conjugados que comprenden nitroimidazol conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-MEZ, 3-MEZ y 5-MEZ a 54-MEZ designan los 51 compuestos conjugados que comprenden metronidazol conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-MIS, 3-MIS y 5-MIS a 54-MIS designan los 51 compuestos conjugados que comprenden misonidazol conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-47Sc, 3-47Sc y 5-47Sc a 54-47Sc designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{47}Sc conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-67Cu, 3-67 Cu y 5-67Cu a 54-67Cu designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{67}Cu conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-90Y, 3-90Y y 5-90Y a 54-90Y designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{90}I conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-109Pd, 3-109Pd y 5-109Pd a 54-109PdSc designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{109}Pd conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-123I, 3-123I y 5-123I a 54-123I designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{1232}I conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-125I, 3-125I y 5-125I a 54-125I designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{125}I conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-131I, 3-131I y 5-131I a 54-131I designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{131}I conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-132I, 3-132I y 5-132I a 54-132I designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{132}I conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-186Re, 3-186Re y 5-186Re a 54-186Re designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{186}Re conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-188Re, 3-188Re y 5-188Re a 54-188Re designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{188}Re conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-199Au, 3-199Au y 5-199Au a 54-199Au designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{199}Au conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-4211At, 3-211At y 5-211At a 54-211At designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{211}At conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-212Pb, 3-212Pb y 5-212Pb a 54-212Pb designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{212}Pb conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-212Bi, 3-212Bi y 5-212Bi a 54-212Bi designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{212}Bi conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-203Pb, 3-203Pb y 5-203Pb a 54-203Pb designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{203}Pb conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-206Bi, 3-206Bi y 5-206Bi a 54-206Bi designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{206}Bi conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-32P, 3-32P y 5-32P a 54-32P designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{32}P conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-33P, 3-33P y 5-33P a 54-33P designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{33}P conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-71Ge, 3-71Ge y 5-71Ge a 54-71Ge designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{71}Ge conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-77As, 3-77As y 5-77As a 54-77As designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{77}As conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-103Pd, 3-103Pd y 5-103Pd a 54-103Pd designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{103}Pd conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-105Rh, 3-105Rh y 5-105Rh a 54-105Rh designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{105}Rh conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-111Ag, 3-111Ag y 5-111Ag a 54-111Ag designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{111}Ag conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-119Sb, 3-119Sb y 5-119Sb a 54-119Sb designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{119}Sb conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-121Sn, 3-121Sn y 5-121Sn a 54-121Sn designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{121}Sn conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-131Cs, 3-131Cs y 5-131Cs a 54-131Cs designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{131}Cs conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-127Cs, 3-127Cs y 5-127Cs a 54-127Cs designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{127}Cs conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-129Cs, 3-129Cs y 5-129Cs a 54-129Cs designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{129}Cs conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-143Pr, 3-143Pr y 5-143Pr a 54-143Pr designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{143}Pr conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-161Tb, 3-161Tb y 5-161Tb a 54-161Tb designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{161}Tb conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-177Lu, 3-177Lu y 5-177Lu a 54-177Lu designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{177}Lu conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-191Os, 3-191Os y 5-191Os a 54-191Os designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{191}Os conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-193mPt, 3-193mPt y 5-193mPt a 54-193mPt designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{193M}Pt conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-197Hg, 3-197Hg y 5-197Hg a 54-197Hg designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{197}Hg conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-43K, 3-43K y 5-43K a 54-43K designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{43}K conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-52Fe, 3-52Fe y 5-52Fe a 54-52Fe designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{52}Fe conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-57Co, 3-57Co y 5-57Co a 54-57Co designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{57}Co conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-67Ga, 3-67Ga y 5-67Ga a 54-67Ga designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{67}Ga conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-68Ga, 3-68Ga y 5-68Ga a 54-68Ga designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{68}Ga conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-77Br, 3-77Br y 5-77Br a 54-77Br designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{77}Br conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-81Rb, 3-81Rb y 5-81Rb a 54-81Rb designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{81}Rb conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-81mKr, 3-81mKr y 5-81mKr a 54-81mKr designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{81m}Kr conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-87mSr, 3-87mSr y 5-87mSr a 54-87mSr designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{87m}Sr conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-99mTc, 3-99mTc y 5-99mTc a 54-99mTc designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{99m}Tc conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-111In, 3-111In y 5-111In a 54-111In designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{111}In conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos 2-113mIn, 3-113mIn y 5-113mIn a 54-113mIn designan los 51 compuestos conjugados que comprenden ^{113m}In conjugado con la SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5 a SEC Nº ID 54, respectivamente.
Los compuestos descritos en este ejemplo se combinan con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable para producir composiciones farmacéuticas según la presente invención. Los compuestos radioestables descritos en la presente memoria son útiles en composiciones farmacéuticas como compuestos terapéuticos en el tratamiento de individuos sospechosos de sufrir cáncer colorrectal metastatizado, incluyendo el tratamiento de individuos diagnosticados con cáncer colorrectal localizado, en forma de un compuesto profiláctico/terapéutico antes de que la metástasis pueda detectarse fácilmente. Cuando están presentes en cantidades terapéuticamente eficaces, los compuestos radiactivos descritos en la presente memoria son útiles en composiciones farmacéuticas como agentes terapéuticos en el tratamiento de individuos sospechosos de sufrir cáncer colorrectal metastatizado, incluyendo el tratamiento de individuos diagnosticados con cáncer colorrectal localizado, en forma de un compuesto profiláctico/terapéutico antes de que la metástasis pueda detectarse fácilmente. Cuando están presentes en cantidades eficaces para diagnóstico, los compuestos radiactivos descritos en la presente memoria son útiles en composiciones farmacéuticas como agentes formadores de imágenes en el diagnóstico e identificación de cáncer colorrectal metastatizado en individuos.
Ejemplo 2
Un procedimiento para reticular ligandos de receptor de ST que tienen un grupo amino libre tal como péptidos de unión a receptor de ST, como por ejemplo SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 5-54, con agentes activos que tienen un grupo amino libre tal como metotrexato, doxorubicina, daunorubicina, citosinarabinósido, cis-platino, vindesina, mitomicina y bleomicina, o fosfatasa alcalina, o toxina basada en proteína o péptido, emplea ésteres de succinimidilo homobifuncionales, preferiblemente con espaciadores de cadena carbonada tales como suberato de disuccinimidilo (Pierce Co., Rockford, IL). Este enfoque de derivatización de grupo amino se ha empleado con éxito para reticular ST nativa con biotina y, en última instancia, con grandes perlas de agarosa de tamaño a escala micrométrica, conservando la función de la ST nativa (Hughes, M. et al. (1991) Biochem. 30:10738; Hakki, S., et al. (1993) Int. J. Biochem. 25:557; Almenoff, J.S., et al. (1992) Mol. Micro. 8:865; cada uno de los cuales se incorpora a la presente memoria como referencia.
Se incuba un ligando de unión a ST con el grupo amino libre, tal como un péptido de unión a receptor de ST, en presencia del agente reticulante químico y un agente activo que tiene un grupo amino libre en cantidades equimolares a temperatura ambiente durante 15-30 min. La incubación se termina separando los reactantes mediante cromatografía de permeación en gel por HPLC. Esta técnica separa los compuestos conjugados de los agentes activos libres, los ligandos de unión a ST libres, los conjugados agente activo-agente activo y los conjugados ligando de unión a ST-ligando de unión a ST. Se obtienen preparaciones homogéneas de conjugado mediante sus grupos amino libres y con una relación molar preferida de 1:1. Como se indica anteriormente, complejar el grupo amino libre de un péptido ST conserva la función de unión a receptor.
Ejemplo 3
En el caso de que se requiera un compuesto conjugado escindible, puede emplearse el mismo protocolo descrito anteriormente utilizando propionato de 3,3'-ditiobis(sulfosuccinimidilo) (SPDP); Pierce, IL. El SPDP forma un grupo sulfhidrilo que puede utilizarse para conjugar un compuesto con otro grupo amino libre. Por ejemplo, los péptidos ST tales como SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3, SEC Nº ID 5-54 se derivatizan utilizando procedimientos establecidos que emplean 3-(2-piridiltio)propionato de N-succinimidilo (SPDP, Pharmacia-LKB, NJ). El péptido ST se incuba con un exceso molar de 5 veces de SPDP durante 30 minutos a temperatura ambiente. El conjugado ST-tiopropionato de piridilo se separa de los reactivos no reaccionados mediante cromatografía de permeación en gel por HPLC. Se prepara un agente activo con un grupo amino libre, tal como una toxina basada en proteína, para conjugación mediante la reducción con ditiotreitol durante 4 horas a temperatura ambiente. Se incuba el agente activo reducido con un exceso molar de 2 veces de conjugado ligando de receptor de ST-PDP a pH 8,00 durante 36 horas a 4ºC. El compuesto conjugado se purifica de los agentes no reaccionados mediante cromatografía de permeación en gel por
HPLC.
Este protocolo para la conjugación es particularmente útil para conjugar péptidos ST con cadenas A de toxina de difteria y exotoxina de Pseudomonas así como cadenas A de toxina ricina (Magerstadt, M. "Antibody Conjugates and Malignant Disease". (1991) CRC Press, Boca Ratón, EE.UU., pág. 110-152; Cawley, D.B. et al. (1980) Cell 22:563; Cumber, A.J. et al. (1985) Meth. Enz. 112:207; Gros, O. (1985) J. Immunol. Meth. 81:283; Worrell, N.R., et al., (1986) "Anti-Cancer Drug Design" 1: 179; Thorpe, P.E. et al. (1987) Cancer Res. 47:5924, cada uno de los cuales se incorpora a la presente memoria como referencia).
Ejemplo 4
Los agentes activos con un grupo amino libre pueden derivatizarse con SPDP como se describe anteriormente y conjugarse con un ligando de ST que tiene un grupo amino libre y que se ha modificado con el éster succinimidilo del ácido yodoacético (Pierce Co., Rockford, IL) (Magerstadt, M. "Antibody Conjugates and Malignant Disease". (1991) CRC Press, Boca Ratón; Cumber, A.J. et al. (1985) Meth. Enz. 112:20, que se incorporan a la presente memoria como referencia). La conjugación se basa en la reacción selectiva de los grupos yodoacetilo introducidos en la terminación amino del ligando de ST con los grupos tiol introducidos en el agente activo. Como con el protocolo anterior, este procedimiento evita la formación de homopolímeros. Sin embargo, el producto se conjuga mediante un enlace tioéter central que no puede reducirse.
Ejemplo 5
Pueden conjugarse un ligando de receptor de ST con un grupo amino libre y agentes activos con grupos amino libres mediante un enlace disulfuro utilizando iminotiolano (Pierce, Rockford, IL) (Fitzgerald, D.J.P. et al. (1983) Cell 32:607; Magerstadt, M. (1991) "Antibody Conjugates and Malignant Disease", CRC Press, Boca Ratón; Bjorn, M.J. et al., (1985) Cancer Res. 45:1214; Bjorn, M.J. et al. (1986) Cancer Res. 46:3262, que se incorporan a la presente memoria como referencia). El ligando de receptor de ST con un grupo amino libre se derivatiza en la terminación amino con iminotiolano y el agente activo se derivatiza con SPDP como se describe anteriormente. La reacción del ligando de receptor de ST derivatizado con iminotiolano con agente activo derivatizado con SPDP da como resultado la conjugación mediante un enlace disulfuro reducible. Además, el iminotiolano proporciona la versatilidad para conjugar estas proteínas mediante enlaces distintos de disulfuros. Por tanto, la derivatización de agentes activos con el agente heterobifuncional sulfosuccinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano (Pierce, Rockford, IL) y la reacción con ligando de receptor de ST derivatizado con iminotiolano conjugará estos péptidos sin la formación de
disulfuros.
Ejemplo 6
Los compuestos conjugados según la invención que comprenden un resto activo que es un agente terapéutico inhiben específicamente células T84 in vitro. Pueden utilizarse los siguientes protocolos para demostrar que los compuestos conjugados según la invención que comprenden un resto activo que es quimioterapéutico o una toxina inhiben específicamente células T84 in vitro. La inhibición de las células T84 se evalúa mediante la determinación de los efectos de los compuestos conjugados sobre la capacidad de las células T84 de incorporar ^{35}S-leucina a la proteína, ^{3}H-timidina al ADN y de formar colonias. La evaluación de la síntesis de proteína y ADN son técnicas clásicas para determinar la citotoxicidad de compuestos conjugados in vitro. Se mide la inhibición de la síntesis de proteína porque las toxinas utilizadas como restos activos son inhibidores específicos de este proceso. Por lo tanto, estos ensayos son la medida más sensible de si los compuestos conjugados se unen a y se internalizan en células T84. Se mide la inhibición de la síntesis de ADN porque algunos compuestos quimioterapéuticos inhiben la síntesis de ADN, y además es un ensayo de citotoxicidad que se correlaciona estrechamente con la supervivencia reproductiva de las células en cultivo. La citotoxicidad, o la disrupción de los procesos metabólicos celulares normales, puede no correlacionarse siempre directamente con la supervivencia celular. Por lo tanto, la evaluación de la formación de colonias mide directamente la capacidad de los agentes experimentales de reducir la supervivencia de las células tumorales, lo que se correlaciona estrechamente con el impacto de los agentes terapéuticos sobre la viabilidad tumoral in vivo. Los controles incluyen realizar el mismo ensayo utilizando la forma no conjugada del agente activo y la forma no conjugada del ligando de receptor de ST, que comprende el compuesto no conjugado en lugar del compuesto conjugado. Se comparan los resultados obtenidos en los ensayos de muestras y ensayos de control.
Se evalúa en los compuestos conjugados su capacidad de inhibir la síntesis de proteína y ADN in vitro y de inhibir la supervivencia y la proliferación mediante la medida de la formación de colonias en cultivos monocapa mediante protocolos establecidos (Wilson, A.P. (1987) "Cytotoxicity and viability assays, Animal Cell Culture: A Practical Approach". Freshney, R.I., ed., pág. 183-216, IRL Press, Oxford, que se incorpora a la presente memoria por referencia).
Para evaluar la capacidad de un compuesto conjugado de inhibir la síntesis de proteína in vitro, las células se siembran en 200 \mul de medio a una densidad subconfluente de 1-2 x 10^{5} y se permiten agregar para formar una monocapa celular en división durante 12 horas a 37ºC. Posteriormente, se reemplaza el medio por 200 \mul de medio fresco que contiene la concentración apropiada de compuestos conjugados y las células se incuban a 37ºC durante diversos intervalos de tiempo. Al final del periodo de incubación indicado, las células se lavan dos veces con medio y se incuban a 37ºC en 0,5 ml de medio exento de metionina suplementado con 0,5 \muCi de L^{35}S-metionina (800 Ci/mmol). Después de la incubación durante otras 2 horas a 37ºC, el medio se aspira, las células se lavan dos veces con medio que contiene 1 mg/ml de metionina, y después se precipitan en TCA al 12% enfriado con hielo. Se cuantifica la radiactividad recuperada en los precipitados de TCA mediante centrifugación por espectroscopía de centelleo líquido. En estos estudios, las células se mantienen en crecimiento logarítmico y los ensayos se realizan utilizando pocillos por triplicado. Los datos se expresan como un porcentaje de la síntesis de proteína observada en presencia de agentes experimentales en comparación con células no tratadas.
Para evaluar la capacidad de un compuesto conjugado de inhibir la síntesis de ADN in vitro, se siembran células en forma de una monocapa subconfluyente y se incuban con agentes experimentales como se describen anteriormente. Al final del periodo de incubación, las células se lavan dos veces y se incuban a 37ºC en medio que contiene 2,5 \muCi de ^{3}H-timidina (5 Ci/mmol). Después de la incubación durante otra hora, las células se procesan con TCA, se recuperan los precipitados y se cuantifica la radiactividad como se describe anteriormente. Como anteriormente, las células se mantienen en crecimiento logarítmico y los ensayos se realizan por triplicado. Los datos se expresan como un porcentaje de la síntesis de ADN observada en presencia de agentes experimentales en comparación con las células no tratadas.
Para evaluar la capacidad de un compuesto conjugado de inhibir la supervivencia y proliferación mediante la medida de la formación de colonias en cultivo monocapa, se siembran células en forma de una monocapa subconfluente en matraces de 25 cm^{3} y se dejan agregar como se describe anteriormente. El medio se reemplaza por otro que contiene diversas concentraciones de agentes experimentales y se incuba con células durante diversos intervalos de tiempo. Al final de la incubación, las células se recuperan en forma de una suspensión celular individual mediante tripsinación y se vuelven a sembrar a una densidad que proporcionará 100-200 colonias por placa de cultivo de 6 cm. Las células se permiten crecer durante 7 días, después se fijan en metanol, se tiñen con violeta cristal al 1%, y se cuantifica el número de colonias. Los ensayos se realizan por duplicado y los datos se expresan como un porcentaje de la formación de colonias observada en presencia de agentes experimentales en comparación con células no tratadas. Los resultados en laboratorio han demostrado que las células T84 pueden disponerse en suspensiones celulares individuales utilizando tripsina (10 \mug/ml) con una eficacia de sembrado de un 40% y un tiempo de duplicación de 18 horas.
Ejemplo 7
Puede añadirse yodo radiactivo tal como ^{123}I, ^{125}I, ^{131}I y ^{132}I a un péptido de unión a receptor de ST tal como un péptido ST utilizando un protocolo estándar bien conocido por los expertos en la técnica (Thompson, M. et al. (1985) Analytical Biochemistry 148:26, que se incorpora a la presente memoria como referencia). El yodo radiactivo se conjuga directamente con un péptido ST tal como SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 o SEC Nº ID 5 en la tirosina 5, tirosina 4 o tirosina 3, respectivamente.
Brevemente, el péptido ST se produce en bacterias. Por ejemplo, se hace crecer la cepa 431 de E. coli en cultivo y se secreta ST en este cultivo. El medio de cultivo se purifica después utilizando técnicas rutinarias. Puede prepararse también ST mediante síntesis en fase sólida como se ha hecho anteriormente, utilizando técnicas estándar. (Dreyfus, L. et al., (1983) Infec. Immun. 42:539, que se incorpora a la presente memoria como referencia.
Se hacen reaccionar 10 \mug de péptido ST con 2 milicuries de INa radiactivo (Amersham Corporation, Massachusetts) en presencia de Iodobeads (BioRad Laboratories, CA) y beta-D-glucosa. Se hacen reaccionar éstas durante 30 minutos, después de lo cual los productos se someten a cromatografía en un cartucho en fase inversa Sepak (Millipore Corp., MA) seguido de separación en una columna C18 en fase inversa por HPLC utilizando un gradiente de 20-25% de acetonitrilo. Las composiciones conjugadas, que comprenden SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 o SEC Nº ID 5 con el yodo radiactivo unido a la tirosina 4, eluyen a los 45 min. Estas moléculas retienen una actividad bioquímica y farmacológica completa.
Ejemplo 8
Se conjuga directamente ^{125}I con un péptido ST tal como SEC Nº ID 13 en la tirosina 4.
La SEC Nº ID 13 se produce mediante síntesis en fase sólida como se describe anteriormente. Se hacen reaccionar 10 \mug de SEC Nº ID 13 con 2 milicuries de ^{125}INa (Amersham Corporation, Massachusetts) en presencia de Iodobeads (BioRad Laboratories, CA) y beta-D-glucosa. Se hacen reaccionar éstas durante 30 minutos, después de lo cual se someten los productos a cromatografía en un cartucho en fase inversa Sepak (Millipore Corp., MA) seguido de separación en una columna C18 en fase inversa por HPLC utilizando un gradiente de 20-25% de acetonitrilo. El conjugado ^{125}I-SEC Nº ID 13 con el yodo radiactivo unido a la tirosina 4 eluye a los 45 min. Esta molécula retiene una actividad bioquímica y farmacológica completa.
La dosificación de yodo radiactivo para la formación de imágenes de diagnóstico requiere típicamente aproximadamente 4 milicuries/paciente (Steinstraber, A. et al. (1988), J. Nucl. Med. 29:875; Wessels, B.W. y Rogus, R.D. (1984) Med. Phys. 11:638; Kwok, C.S. et al. (1985) Med. Phys. 12:405). Para proteínas marcadas con una actividad específica de 2000 curies/mmol, tales como el péptido ST, esto requeriría aproximadamente 10 \mug de péptido marcado inyectado por vía intravenosa por paciente para la formación de imágenes de diagnóstico.
Ejemplo 9
Se conjuga ^{131}I directamente con un péptido ST tal como SEC Nº ID 13 en la tirosina 4.
La SEC Nº ID 13 se produce mediante síntesis en fase sólida como se describe anteriormente. Se hacen reaccionar 10 \mug de SEC Nº ID 13 con 10 milicuries de ^{131}INa (Amersham Corporation, Massachusetts) en presencia de Iodobeads (BioRad Laboratories, CA) y beta-D-glucosa. Se hacen reaccionar éstas durante 30 minutos, después de lo cual los productos se someten a cromatografía en un cartucho en fase inversa Sepak (Millipore Corp., MA) seguido de separación en una columna C18 en fase inversa por HPLC utilizando un gradiente de acetonitrilo de 20-25%. El conjugado ^{131}I-SEC Nº ID 13 con el yodo radiactivo unido a la tirosina 4 eluye a los 45 min. Esta molécula retiene una actividad bioquímica y farmacológica completa.
Típicamente, para anticuerpos radioyodados (PM= 160.000 Da), se requieren aproximadamente 150 nanomoles de proteína (24 miligramos) marcada con una actividad específica de 10.000 curies/mmol por gramo de tumor por paciente (Humm, J.L. (1986) J. Nucl. Med. 27:1490). Por tanto, para proteínas marcadas con una actividad específica de 2.000 curies/mmol, con un peso molecular de 2.000 Da, tales como el péptido ST, se requerirían aproximadamente 3 mg por gramo de tumor por paciente para infusión intravenosa.
Ejemplo 10
En algunas realizaciones, el acoplamiento de ligandos de receptor de ST que tienen un grupo amino libre, particularmente péptidos de unión a receptor de ST tales como péptidos ST, y agentes activos con un grupo amino libre tal como toxinas basadas en proteína, se realiza introduciendo un puente disulfuro entre las 2 moléculas. Esta estrategia es particularmente útil para conjugar péptidos ST, puesto que la terminación amino libre se ha mostrado que es útil como punto de conjugación sin afectar a la actividad de unión a ST. Esta estrategia es particularmente útil para conjugar toxinas basadas en proteína, puesto que la terminación amino libre está disponible en dichas moléculas, y para algunos compuestos conjugados, lo más destacadamente conjugados de RTA, se ha demostrado que un puente disulfuro que pueda reducirse para proporcionar proteínas separadas es importante en la construcción de quimeras funcionales dirigidas por anticuerpos monoclonales (Magerstadt, M. "Antibody Conjugates and Malignant Disease". (1991) CRC Press, Boca Ratón; Bjorn, M.J. et al., (1985) Cancer Res. 45:1214; Bjorn, M.J. et al. (1986) Cancer Res. 46:3262; Masuho, Y. et al. (1982) J. Biochem. 91:1583, que se incorporan cada uno a la presente memoria por referencia). Aunque algunas toxinas pueden acoplarse a péptidos ST utilizando agentes de reticulación que no dan como resultado un puente disulfuro reducible entre los componentes individuales, pero retienen la citotoxicidad funcional, la toxina cadena A de ricina requiere un disulfuro reducible para citotoxicidad, mientras que por ejemplo la exotoxina de Pseudomonas no.
El acoplamiento disulfuro se consigue utilizando procedimientos establecidos que emplean el agente heterobifuncional 3-(2-piridiltio)propionato de N-succinimidilo (SPDP, Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ) (Magerstadt, M. "Antibody Conjugates and Malignant Disease". (1991) CRC Press, Boca Ratón; Cawley, D.B. et al. (1980) Cell 22:563; Cumber, A.J. et al. (1985) Meth. Enz. 112:207; Gros, O. (1985) J. Immunol. Meth. 81:283; Worrell, N.R., et al., (1986) "Anti-Cancer Drug Design" 1:19; Thorpe, P.E. et al. (1987) Cancer Res. 47:5924, cada uno de los cuales se incorpora a la presente memoria por referencia).
En algunas realizaciones, las toxinas que incluyen las cadenas A de toxina ricina desglicosilada (RTA; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), toxina A de difteria (DTA; Calbiochem, La Jolla, CA) y exotoxina de Pseudomonas (PEA) se conjugan con péptidos ST para producir composiciones conjugadas según la presente invención utilizando este procedimiento. Se emplea RTA desglicosilada puesto que la forma glicosilada de esta toxina exhibe unión no específica a células hepáticas. La DTA se prepara a partir de la toxina de difteria mediante un procedimiento establecido (Michel, A. y Drykx, J. (1975) Biochem. Biophys. Acta 365:15; Cumber, A.J. et al. (1985) Meth. Enz. 112:207, ambos incorporados a la presente memoria por referencia).
En algunas realizaciones, los péptidos ST se conjugan con toxinas mediante este procedimiento. Por ejemplo, el péptido ST de SEC Nº ID 3, que se produce como se describe anteriormente (véase Dreyfus, L. et al. (1983) Infec. Immun. 42: 539, que se incorpora a la presente memoria como referencia).
Las toxinas se preparan para acoplamiento mediante reducción con ditiotreitol 0,1 M (DTT) durante 4 horas a temperatura ambiente en Tris-HCl 0,4 M, pH 8,0 y EDTA 1 mM. Las toxinas reducidas se desalan en una columna Sephadex G-25 equilibrada en tampón TES y se mezclan con un exceso molar de 2 veces de ST-PDP. Las reacciones se ajustan a pH 8,0 con TES y se incuban a 4ºC durante 36 horas. Los conjugados péptido ST-toxina se purifican de los productos no reaccionados y homopolímeros de péptidos ST y toxinas mediante filtración en gel en Sephadex G-75 en TES 20 mM, pH 8,0 que contiene NaCl 0,1 M. En las fracciones cromatográficas se monitoriza mediante SDS-PAGE en geles de poliacrilamida al 10% en condiciones no reductoras la presencia de conjugados 1:1 de péptidos ST y toxinas. Además, estos conjugados se analizan mediante SDS-PAGE al 10% en condiciones reductoras para asegurar que la ST y las citotoxinas se acoplan mediante un puente disulfuro reducible. Las concentraciones molares del conjugado se calculan cuantificando la radiactividad en estas muestras.
Se utilizan trazas de ST marcada con ^{125}I en la tirosina 4 (10 Ci/mmol) para seguir al conjugado a través de las diversas etapas de separación y cromatográficas y para posibilitar el cálculo de la relación molar de ST a citotoxina en el conjugado purificado final. Las trazas de ST marcadas con ^{125}I se derivatizan incubando 1 mg/ml con un exceso molar de 5 veces de SPDP durante 30 min a temperatura ambiente en tampón fosfato de Na, pH 7,4. El conjugado de ST-tiopropionato de piridilo (ST-PDP) se purifica de agente de reticulación no reaccionado mediante cromatografía en Sephadex G-25 equilibrada con tampón N-Tris 20 mM - ácido (hidroximetil)metil-2-aminoetanosulfónico (TES), pH 7,4. La conservación de la unión a receptor de los péptidos ST conjugados en membranas intestinales humanas se determina en ensayos competitivos de concentraciones crecientes de ST-PDP y ^{125}I-ST (5 x 10^{-10} M) para asegurar que este proceso no destruye la función de ligando de receptor de ST.
El protocolo de acoplamiento anterior tiene diversas ventajas para conjugar las diversas toxinas. En primer lugar, introduce un puente disulfuro reducible en la composición conjugada, importante para la citotoxicidad de RTA. Además, esta técnica evita la exposición del péptido ST a una reducción cuantitativa con DTT, lo que podría romper sus 3 enlaces disulfuro intracatenarios importantes para la actividad de unión a receptor. Además, hay un solo grupo disponible en la terminación amino del péptido ST para derivatización con SPDP, y los experimentos previos han demostrado que la derivatización de ese grupo cancela las propiedades de unión del ligando. Por lo tanto, no son posibles otras configuraciones para la conjugación que podrían dar como resultado la inactivación de la ST. Además, la PEA requiere preactivación con DTT para conseguir la citotoxicidad óptima que se conseguirá utilizando el protocolo anterior.
Para producir un compuesto conjugado funcional que comprende una toxina, es esencial que se conserven la unión a receptor y las actividades enzimáticas de los restos a lo largo del proceso de conjugación. Por lo tanto, una vez se obtienen dichos compuestos conjugados, se ensaya la conservación de esas funciones. La actividad de unión a receptor de ST de los compuestos conjugados se examina en ensayos de unión competitiva, como se describen anteriormente. En estos estudios, se incuban concentraciones crecientes de los compuestos conjugados con una concentración constante (5 x 10^{-10} M) de ^{125}I-ST y membranas intestinales (50-100 \mug de proteína) hasta conseguir el equilibrio. Incubaciones paralelas contienen ST no marcada en exceso (5 x 10^{-7} M) para evaluar la unión no específica. El desplazamiento competitivo dependiente de la concentración de la ST radiomarcada mediante compuestos conjugados se compara con el desplazamiento competitivo conseguido por la ST nativa. Se emplean curvas de desplazamiento para estimar la afinidad de cada compuesto conjugado (K_{D}) y se compara con la afinidad de la ST nativa medida mediante esta técnica. Los estudios de control incluyen evaluar la capacidad de las toxinas no conjugadas de competir con ST nativa por la unión a receptor. Estos estudios establecen que se conserva la función de unión de ST en el constructo conjugado.
Se evalúa también la conservación de la actividad de la toxina en compuestos conjugados. PEA y DTA inducen toxicidad catalizando la ADP-ribosilación dependiente de NAD del factor de elongación 2 (EF2), inhibiendo la síntesis de proteína. Se evalúa la actividad ADP-ribosil transferasa utilizando un ensayo establecido (Chung, D.W. y Collier, R.J., Infect. Immun. 16:832; Fitzgerald, D.J.P. (1987) Meth. Enz. 151: 139, que se incorporan ambos a la presente memoria por referencia). Las reacciones se realizan en Tris-HCl 30 mM, pH 8,2, que contiene DTT 40 mM, 50 mCi de ^{14}C-NAD, y 20 \mul de lisado de reticulocito de conejo que contiene factor de elongación 2 (EF-2; Promega, Madison, WI) en un volumen total de 500 \mul. Las reacciones se inician mediante la adición de lisado, se incuban durante 30 minutos a 37ºC, y se terminan mediante la adición de TCA al 12% enfriado con hielo. Se cuantifica la radiactividad en los precipitados de proteína recogidos mediante centrifugación mediante espectroscopía de centelleo líquido. Se compara la capacidad de los compuestos conjugados que comprenden DTA o PEA de catalizar la transferencia de la ADP-ribosa marcada a EF-2 con la catalizada por cantidades similares de toxinas no conjugadas. Los experimentos de control incluyen examinar la capacidad de toxinas no conjugadas o ST de catalizar la transferencia de ADP-ribosa y los efectos de la ST sobre la actividad enzimática de citotoxinas no conjugadas.
La RTA inhibe la síntesis de proteína inactivando catalíticamente la subunidad ribosomal 60S. La actividad catalítica de los compuestos conjugados que comprenden RTA se evalúa mediante su capacidad de inhibir la síntesis de proteína en ensayos exentos de células utilizando procedimientos establecidos (Leonard, J.E. et al. (1985) Cancer Res. 45:5263, que se incorpora a la presente memoria por referencia). Los ensayos contienen 35 \mul de lisados de reticulocito de conejo tratados con nucleasa, 1 \mul de aminoácidos 1 mM mixtos deficientes en metionina, 2 \mul de ARN de virus de mosaico de bromo (Promega, Madison, WI) a 0,5 \mug/\mul, 7 \mul de agua estéril o solución de conjugado y 5 \muCi de ^{35}S-metionina en un volumen total de 50 \mul. Las reacciones se iniciarán mediante la adición del lisado, se incuban a 30ºC durante 30 minutos, y se terminan mediante el uso de la adición de TCA al 12%. Se cuantifica la radiactividad en los precipitados de proteína recogidos mediante centrifugación mediante espectroscopía de centelleo líquido. Los experimentos de control incluyen examinar la capacidad de la RTA no conjugada o el péptido ST de inhibir la síntesis de proteína exenta de célula y los efectos del péptido ST sobre la actividad inhibidora de la citotoxina no conjugada.
Ejemplo 11
El metotrexato se liga a la SEC Nº ID 12 mediante ésteres de succinimidilo reticulantes homobifuncionales con espaciadores largos de cadena carbonada tales como suberato de disuccinimidilo (Pierce, IL). La SEC Nº ID 12 se incuba en presencia del agente reticulante químico y metotrexato en cantidades equimolares a temperatura ambiente durante 15-30 minutos. La incubación se termina mediante la separación de los reactantes por cromatografía de permeación en gel por HPLC. Esta técnica separa los conjugados de metotrexato/SEC Nº ID 12 del fármaco libre, péptido ST libre, conjugados fármaco-fármaco y conjugados péptido ST-péptido ST. Se obtienen preparaciones homogéneas de conjugados SEC Nº ID 12-metotrexato acoplados mediante sus grupos amino libres y con una relación molar preferida de 1:1. Complejar el grupo amino libre de ST conserva la función de unión a receptor.
Ejemplo 12
Se acopla ^{111}In a la SEC Nº ID 37 con grupos amino funcionales utilizando un quelante. El péptido ST tiene una función amino libre en la terminación amino que puede modificarse sin alterar la actividad de unión a receptor de ST del péptido ST. El ^{111}In se quela rápida y fuertemente por EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) o DTPA (ácido dietilentriaminopentaacético). Se prefiere DTPA frente a EDTA porque este último puede ser más inestable in vivo. El ^{111}In-DTPA se convierte en un éster mixto de N-hidroxisuccinimida que es reactivo con grupos amino libres, se mezcla con ST y los productos de reacción, incluyendo ^{111}In-SEC Nº ID 37, se separan por HPLC (Bremer, K.H. y Schwarz, A. (1987) en "Safety and Efficacy of Radiopharmaceuticals". Kristensen, K. y Norbygaard, E., Eds. Martinius Nijhoff, Dordrecht, Holanda, pág. 43; Krejcarek, G.E. y Tucker, K.L. (1977) Biochem. Biophys. Res. Commun. 77:581; Paxton, R.J. et al. (1985) Cancer Res. 45:5694; Richardson, A.P. et al. (1986) Nucl. Med. Biol. 14:569, que se incorporan cada uno a la presente memoria por referencia.
Ejemplo 13
El ^{99m}Tc puede conjugarse a la SEC Nº ID 46 utilizando un enfoque que es similar al del indio. Por tanto, el tecnecio puede quelarse por DTPA, que se convierte en un anhídrido tal como anhídrido de N-hidroxisuccinimida, y hacerse reaccionar con la SEC Nº ID 46. El conjugado ST-tecnecio puede separarse después utilizando HPLC (Magerstadt, M. (1991) "Antibody Conjugates and Malignant Disease", CRC Press, Boca Ratón; Eckelman, W.C. y Paik, C.H. (1986) Nucl. Med. Biol. 14:569).
Ejemplo 14
Se prepara la cadena A de toxina de difteria (DTA) a partir de toxina nativa de difteria mediante técnicas estándar. La SEC Nº ID 22 se acopla a 3-(2-piridiltio)propionato de N-succinimidilo (SPDP, Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ) y se purifica el conjugado SEC Nº ID 22-PDP por HPLC mediante procedimientos establecidos. Se reduce la DTA con ditiotreitol y se incuba con la SEC Nº ID 22-PDP. Se purifica la DTA-SEC nº ID 22 después de la conjugación utilizando HPLC.
Ejemplo 15
Se prepara exotoxina de Pseudomonas a partir de fuentes nativas mediante técnicas estándar. La SEC Nº ID 54 se acopla a 3-(2-piridiltio)propionato de succinimidilo (SPDP, Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ) y el conjugado SEC Nº ID 54-PDP se purifica por HPLC mediante procedimientos establecidos. Se reduce la exotoxina de Pseudomonas con ditiotreitol y se incuba con SEC Nº ID 54-PDP. La exotoxina de Pseudomonas-SEC Nº ID 54 se purifica después de la conjugación utilizando HPLC.
Ejemplo 16
Se liga doxorubicina a la SEC Nº ID 54 mediante ésteres de succinimidilo reticulantes homobifuncionales con espaciadores largos de cadena carbonada tales como suberato de disuccinimidilo (Pierce, IL). La SEC Nº ID 54 se incuba en presencia del agente reticulante químico y doxorubicina en cantidades equimolares a temperatura ambiente durante 15-30 minutos. La incubación se termina separando los reactantes mediante cromatografía de permeación en gel por HPLC. Esta técnica separa los conjugados de doxorubicina/SEC Nº ID 54 de la doxorubicina libre, el péptido ST libre, los conjugados fármaco-fármaco y los conjugados péptido ST-péptido ST. Se obtienen preparaciones homogéneas de conjugados SEC Nº ID 54-doxorubicina acoplados mediante sus grupos amino libres y con una relación molar preferida de 1:1. La complejación del grupo amino libre de la ST conserva la función de unión a receptor.
Ejemplo 17
Se liga la daunorubicina a la SEC Nº ID 32 mediante ésteres de succinimidilo reticulantes homobifuncionales con espaciadores largos de cadena carbonada tales como suberato de disuccinimidilo (Pierce, IL). La SEC Nº ID 32 es incuba en presencia del agente reticulante químico y daunorubicina en cantidades equimolares a temperatura ambiente durante 15-30 minutos. La incubación se termina separando los reactantes mediante cromatografía de permeación en gel por HPLC. Esta técnica separa los conjugados daunorubicina/SEC Nº ID 54 de la daunorubicina libre, el péptido ST libre, los conjugados fármaco-fármaco y los conjugados péptido ST-péptido ST. Se obtienen preparaciones homogéneas de conjugados SEC Nº ID 54-daunorubicina acoplados mediante sus grupos amino libres y con una relación molar preferida de 1:1. La complejación del grupo amino libre de la ST conserva a función de unión a receptor.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
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(i)
SOLICITANTE: Waldman, Scott. A.
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(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Composiciones que se unen específicamente a células cancerosas colorrectales y procedimientos de uso de las mismas
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(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 54
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(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
REMITENTE: Woodcock Washburn Kurtz Mackiewicz & Norris
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(B)
CALLE: One Liberty Place, 46th Floor
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(C)
CIUDAD: Filadelfia
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(D)
ESTADO: Pensilvania
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(E)
PAÍS: EE.UU.
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(F)
CÓDIGO POSTAL: 19103
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(v)
FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA
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(A)
TIPO DE MEDIO: disquete
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(B)
ORDENADOR: compatible con PC de IBM
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(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
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(D)
SOFTWARE: WordPerfect 5.0
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(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
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(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
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(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
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(C)
CLASIFICACIÓN:
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(vii)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
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(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 08/141.892
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 26 de octubre de 1993
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 08/305.056
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 13 de septiembre de 1994
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL REPRESENTANTE/AGENTE:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE: DeLuca, Mark
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 33.229
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/AGENTE: TJU-1360
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: 215-568-3100
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TELEFAX: 215-568-3439
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 1:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 57 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: ambas
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
RASGOS:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1..57
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAC AAC ACA TTT TAC TGC TGT GAA CTT TGT TGT AAT CCT GCC 
\hfill
48
\sa{Asn Asn Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala}
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGT GCT GGA TGT TAT 
\hfill
57
\sac{Cys Ala Gly Cys Tyr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 2:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Asn Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly Cys}
\sac{Tyr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 3:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Tyr Pro Ala Cys Ala Gly Cys Asn}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 4:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 57 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: ambas
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
RASGOS:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1..57
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAT AGT AGC AAT TAC TGC TGT GAA TTG TGT TGT AAT CCT GCT 
\hfill
48
\sa{Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala}
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGT AAC GGG TGC TAT 
\hfill
57
\sac{Cys Asn Gly Cys Tyr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 5:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Asn Gly Cys}
\sac{Tyr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 6:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Asn Thr Cys Glu Ile Cys Ala Tyr Ala Ala Cys Thr Gly Cys}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 7:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Asn Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly Cys}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 8:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly Cys}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 9:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly Cys}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 10:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly Cys}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 11:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly Cys}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 12:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly Cys}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 13:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly Cys Tyr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 14:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly Cys Tyr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 15:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly Cys Tyr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 16:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly Cys Tyr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 17:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly Cys Tyr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 18:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Tyr Pro Ala Cys Ala Gly Cys}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 19:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Tyr Pro Ala Cys Ala Gly Cys}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 20:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Tyr Pro Ala Cys Ala Gly Cys}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 21:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Tyr Pro Ala Cys Ala Gly Cys}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 22:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Cys Glu Leu Cys Cys Tyr Pro Ala Cys Ala Gly Cys}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 23:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Tyr Pro Ala Cys Ala Gly Cys Asn}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 24:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Tyr Pro Ala Cys Ala Gly Cys Asn}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 25:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Tyr Pro Ala Cys Ala Gly Cys Asn}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 26:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Cys Glu Leu Cys Cys Tyr Pro Ala Cys Ala Gly Cys Asn}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 27:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 28:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 29:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 30:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 31:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 32:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 33:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Thr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 34:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 35:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 36:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 37:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 37:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 38:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 38:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly Cys Tyr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 39:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 39:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Ala Pro Ala Cys Ala Gly Cys Tyr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 40:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 40:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Ala Ala Cys Ala Gly Cys Tyr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 41:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 41:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly Cys}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 42:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 42:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly Cys Tyr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 43:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 43:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly Cys}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 44:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 44:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly Cys Tyr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 45:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 45:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly Cys}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 46:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 46:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Ala Cys Asp Pro Pro Ser Pro Pro Ala Glu Val Cys Cys Asp Val Cys Cys}
\sac{Asn Pro Ala Cys Ala Gly Cys}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 47:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 47:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Asp Cys Cys Ile Cys Cys Asn Pro Ala Cys Phe Gly Cys Leu Asn}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 48:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 48:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ser Asp Trp Asp Cys Cys Asp Val Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly Cys}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 49:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 49:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Ley Cys Cys Tyr Pro Ala Cys Thr Gly Cys}
\sac{Tyr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 50:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 50:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Cys Asp Val Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 51:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 51:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Cys Asp Val Cys Cys Tyr Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 52:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 52:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Cys Asp Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly Cys Tyr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 53:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 53:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Cys Gln Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 54:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 54:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gly Thr Cys Glu Ile Cys Ala Tyr Ala Ala Cys Thr Gly Cys}

Claims (17)

1. Un compuesto conjugado que comprende:
a) un resto de unión a receptor de toxina termoestable en forma de péptido, anticuerpo, Fab o F(Ab)_{2}; y
b) un resto activo;
en el que dicho resto activo es un agente activo radioestable.
2. El compuesto de la reivindicación 1, en el que dicho resto de unión a receptor de toxina termoestable se selecciona del grupo constituido por: SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3, SEC Nº ID 5-54 y fragmentos y derivados de los mismos, en el que dichos fragmentos y derivados son péptidos capaces de unirse al receptor de toxina termoestable, dichos fragmentos tienen una secuencia aminoacídica idéntica a una porción de un péptido de unión a receptor de toxina termoestable y dichos derivados tienen una secuencia aminoacídica que es la misma que la secuencia aminoacídica de al menos una porción de un péptido de toxina termoestable excepto porque algunos de los residuos están eliminados o sustituidos por aminoácidos conservativos o se insertan aminoácidos adicionales.
3. El compuesto de la reivindicación 1, en el que dicho resto activo es un agente terapéutico.
4. El compuesto de la reivindicación 1, en el que dicho resto activo se selecciona del grupo constituido por: metotrexato, doxorubicina, daunorubicina, citosinarabinósido, etopósido, 5-fluorouracilo, melfalano, clorambucilo, cis-platino, vindesina, mitomicina, bleomicina, purotionina, macromomicina, derivados de 1,4-benzoquinona, trenimon, ricina, cadena A de ricina, exotoxina de Pseudomonas,toxina de difteria, fosfolipasa C de Clostridium perfringens, ribonucleasa pancreática bovina, proteína antiviral de fitolaca, abrina, cadena A de abrina, factor de veneno de cobra, gelonina, saporina, modecina, viscumina, volkensina, fosfatasa alcalina, nitroimidazol, metronidazol y misonidazol.
5. Una composición farmacéutica que comprende:
a) un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, y
b) un compuesto conjugado según la reivindicación 1.
6. Uso de un compuesto conjugado según la reivindicación 1 para la fabricación de una composición farmacéutica para tratar un individuo diagnosticado con, o sospechoso de, sufrir cáncer colorrectal metastatizado.
7. Una composición farmacéutica que comprende:
a) un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, y
b) un compuesto conjugado que comprende:
i)
un resto de unión a receptor de toxina termoestable, péptido, anticuerpo, Fab o F(Ab)_{2}; y
ii)
un resto activo; en el que dicho resto activo es un agente activo radioestable y dicho compuesto conjugado está presente en una cantidad eficaz para uso terapéutico o de diagnóstico en seres humanos que sufren cáncer colorrectal.
8. La composición farmacéutica de la reivindicación 7, en la que dicho resto activo se selecciona del grupo constituido por:^{47}Sc, ^{67}Cu, ^{90}Y, ^{109}Pd, ^{123}I, ^{125}I, ^{131}I, ^{186}Re, ^{188}Re, ^{199}Au, ^{211}At, ^{212}Pb, ^{212}B, ^{32}P y ^{33}P, ^{71}Ge, ^{77}As, ^{103}Pb, ^{105}Rh, ^{111}Ag, ^{119}Sb, ^{121}Sn, ^{131}Cs, ^{143}Pr, ^{161}Tb, ^{177}Lu,^{191}Os, ^{193M}Pt, ^{197}Hg, ^{43}K, ^{52}Fe, ^{57}Co, ^{67}Ga, ^{68}Ga, ^{77}Br, ^{81}Rb/^{81M}Kr, ^{87M}Sr, ^{99M}Tc, ^{111}In, ^{113M}In, ^{127}Cs, ^{129}Cs, ^{203}Pb y ^{206}Bi.
9. La composición farmacéutica de la reivindicación 7, en la que dicho resto de unión a receptor de toxina termoestable se selecciona del grupo constitutido por: SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3, SEC Nº ID 5-54 y fragmentos y derivados de los mismos, en la que dichos fragmentos y derivados son péptidos capaces de unirse al receptor de toxina termoestable, dichos fragmentos tienen una secuencia aminoacídica idéntica a una porción de un péptido de unión a receptor de toxina termoestable y dichos derivados tienen una secuencia aminoacídica que es la misma que la secuencia aminoacídica de al menos una porción de un péptido de toxina termoestable excepto porque algunos de los residuos están eliminados o sustituidos por aminoácidos conservativos o se insertan aminoácidos adicionales.
10. Uso de un compuesto conjugado que comprende:
a) un resto de unión a receptor de toxina termoestable, péptido, anticuerpo, Fab o F(Ab)_{2}; y
b) un resto activo;
en el que dicho resto activo es un agente activo radioestable y dicho compuesto conjugado está presente en una cantidad eficaz para uso terapéutico o de diagnóstico en un ser humano que sufre cáncer colorrectal en la fabricación de una composición farmacéutica para uso de diagnóstico.
11. Uso de un compuesto conjugado que comprende:
a) un resto de unión a receptor de toxina termoestable, péptido, anticuerpo, Fab o F(Ab)_{2}; y
b) un resto activo;
en el que dicho resto activo es un agente activo radioestable y dicho compuesto conjugado está presente en una cantidad eficaz para uso terapéutico o de diagnóstico en un ser humano que sufre cáncer colorrectal en la fabricación de una composición farmacéutica para uso terapéutico.
12. Una composición farmacéutica que comprende:
a) un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, y
b) una composición que comprende:
i)
un ligando de receptor de toxina termoestable, péptido, anticuerpo, Fab o F(Ab)_{2}; y
ii)
una molécula de ácido nucleico;
para la aportación de una molécula de ácido nucleico a las células del tracto intestinal de un individuo.
13. Un procedimiento in vitro de determinación de si un individuo tiene células de cáncer colorrectal metastatizado, que comprende las etapas de analizar una muestra de tejido extraintestinal o fluido corporal de un individuo para determinar si la proteína receptor de toxina termoestable se está expresando por células en dicha muestra.
14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que la expresión de dicha proteína receptor de toxina termoestable por dichas células se determina mediante el ensayo seleccionado de: inmunoensayo, en el que dicha muestra se pone en contacto con anticuerpos detectables que se unen específicamente a receptor de toxina termoestable; ensayo de unión a receptor de toxina termoestable, en el que dicha muestra se pone en contacto con ligando de receptor de toxina termoestable marcado; reacción en cadena con polimerasa, en la que dicha muestra se pone en contacto con cebadores que amplifican selectivamente el ARNm o ADNc que codifica proteína receptor de toxina termoestable.
15. Un procedimiento in vitro de determinación de si una célula tumoral es una célula tumoral colorrectal, que comprende las etapas de determinar si dicha célula tumoral expresa proteína receptor de toxina termoestable.
16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que se determina la expresión de dicha proteína receptor de toxina termoestable por dichas células mediante el ensayo seleccionado de: inmunoensayo, en el que dicha célula tumoral se pone en contacto con anticuerpos detectables que se unen específicamente a receptor de toxina termoestable; ensayo de unión a receptor de toxina termoestable, en el que dicha célula tumoral se pone en contacto con ligando de receptor de toxina termoestable marcado; reacción en cadena con polimerasa, en la que dicha célula tumoral se pone en contacto con cebadores que amplifican selectivamente el ARNm o ADNc que codifica proteína receptor de toxina termoestable.
17. Un kit para determinar si una muestra contiene una célula de cáncer colorrectal que comprende: un primer envase que comprende anticuerpos que se unen a proteína receptor de toxina termoestable y un segundo envase que comprende una proteína receptor de toxina termoestable aislada; o un primer envase que comprende un ligando de receptor de toxina termoestable detectable y un segundo envase que comprende una proteína receptor de toxina termoestable aislada; o un primer envase que comprende un conjunto de cebadores de PCR, en el que una reacción PCR que usa dicho conjunto de cebadores amplifica una molécula de ADN a partir de un sustrato de ARNm que codifica proteína receptor de toxina termoestable o un conjunto de cebadores que amplifica una molécula de ADN a partir de un sustrato de ADNc de ARNm que codifica una molécula de proteína receptor de toxina termoestable y un segundo envase que comprende una molécula de ADN de tamaño igual a la molécula de ADN que se amplifica por PCR utilizando dicho primer cebador de PCR y dicho segundo cebador de PCR y dicho ARNm o dicho ADNc; o un primer envase que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia idéntica y/o complementaria del ARNm o ADNc que codifica proteína receptor de toxina termoestable y un segundo envase que comprende una molécula de ácido nucleico que hibrida con la molécula de ácido nucleico de dicho primer envase.
ES95900421T 1993-10-26 1994-10-26 Composiciones que se unen especificamente a celulas cancerosas colorectales y procedimientos de uso de las mismas. Expired - Lifetime ES2216004T3 (es)

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