CN105142664A - 投予抗gcc抗体-药物结合物和dna破坏剂来治疗癌症 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗胃肠癌的方法。特定来说，本发明提供通过投予包含抗GCC抗体分子的免疫偶联物与DNA破坏剂的组合来治疗胃肠癌的方法。

Description

投予抗GCC抗体-药物结合物和DNA破坏剂来治疗癌症
序列表
本申请案含有序列表，其已以ASCII格式以电子方式提交并以引用方式全文并入本文中。所述ASCII拷贝于2014年2月20日创建，命名为M2051-7034WO_SL.txt，且大小为75,817个字节。
相关申请案
本申请案主张于2013年2月28日提出申请的美国临时申请案第61/770,802号和于2013年10月18日提出申请的美国临时申请案第61/892,854号的权益；这些美国临时申请案的全部内容以引用方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及肿瘤学领域并提供治疗癌症(例如胃肠癌)的方法。更特定来说，本发明涉及治疗癌症(例如胃肠癌)的方法，其是通过投予通过可裂解连接体与单甲基奥里斯他汀E(monomethylauristatinE)结合的抗GCC抗体分子与DNA破坏剂的组合来实现。本发明还提供包含通过可裂解连接体与单甲基奥里斯他汀E结合的抗GCC抗体分子与DNA破坏剂的组合的医药组合物和试剂盒。
背景技术
胃肠癌包括结肠、直肠、胃、胰脏、食道、肛门、胆囊、肝和胆管的肿瘤。结肠直肠癌、胃癌和胰脏癌为美国最常见的胃肠癌。每年超过275,000个人诊断有胃肠癌，且将近136,000个死于这些疾病。美国癌症学会(AmericanCancerSociety)估计2009年胃肠癌占所有新癌症诊断的19％且占所有癌症死亡的24％以上。
已使用许多化学治疗剂来治疗患有胃肠癌的患者。然而，在结肠直肠癌、胃癌和胰脏癌的许多病例中出现抗药性妨碍成功治疗。大多数胃肠癌死亡是由化学疗法抗性(“化学抗性”)细胞转移扩散到肝和其它器官导致，且因此转移仍为较差预后指标。抗药性的两种主要形式为内生性抗性(其中未预先治疗的肿瘤细胞固有地对化学治疗剂不敏感)和获得性抗性(其中经治疗肿瘤细胞在药物暴露后变得不敏感)。迄今为止，许多研究小组已研究各种抗药性机制，以期克服化学疗法中的此主要障碍。研究者已确定，由于获得性抗药性涉及宿主因素以及遗传和后生变化以及许多分子事件，因此其是多因性的。抗性自身可归因于药物积累降低、细胞内药物分布改变、药物-标靶相互作用减少、去毒反应增加、细胞周期失调、受损DNA修复增加和凋亡反应减少。
克服化学抗性仍为一种治疗挑战。
鸟苷酸环化酶C(GCC)是用于维持肠液、电解质体内恒定和细胞增殖的跨膜细胞表面受体，例如参见卡里瑟斯(Carrithers)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)100:3018-3020(2003)。GCC表达于内衬于小肠、大肠和直肠中的粘膜细胞处(卡里瑟斯等人，结肠与直肠疾病(DisColonRectum)39:171-181(1996))。在肠上皮细胞的肿瘤性转化后维持GCC表达，其中在所有原发性和转移性结肠直肠肿瘤(卡里瑟斯等人，结肠与直肠疾病39:171-181(1996)；布克(Buc)等人，欧洲癌症护理杂志(EurJCancer)41:1618-1627(2005)；卡里瑟斯等人，肠胃病学(Gastroenterology)107:1653-1661(1994))、大部分原发性和转移性胃肿瘤和食道肿瘤以及原发性和转移性胰脏癌的亚群中表达。
GCC是因其在大部分胃肠恶性肿瘤中的解剖上分区的表面表达而发现新的靶向治疗剂的有吸引力的标靶。美国公开专利申请案第US2011/0110936号描述抗GCC抗体-药物结合物(“ADC”；有时在本文中称为“免疫结合物”)，已显示所述结合物在源自转移性结肠直肠癌患者的原发性人类肿瘤移出物的小鼠异种移植物模型中具有单一药剂活性。
发明内容
现已发现具有通过可裂解连接体(例如蛋白酶可裂解连接体)与强效微管抑制剂单甲基奥里斯他汀E(MMAE)结合的抗GCC抗体分子并与DNA破坏剂组合投予的免疫结合物提供针对胃肠恶性肿瘤的协同活性。意外地，所述抗GCC免疫结合物使胃肠肿瘤对DNA破坏剂活性敏感，无论当单独投予时肿瘤对所述免疫结合物的敏感性如何。所述组合疗法以协同方式减小肿瘤体积，且还在与任一药剂单独的活性相比出乎意料长的时段内防止肿瘤再生长，且为对作为单一药剂的免疫结合物活性具有抗性(无论所述抗性是固有的还是获得性的)的肿瘤提供有吸引力的治疗选择。
在一方面中，本发明涉及治疗癌症(例如胃肠癌)的方法，其是通过向需要所述治疗的个体投予包含通过蛋白酶可裂解连接体与强效微管抑制剂单甲基奥里斯他汀E(MMAE)结合的抗GCC抗体分子的免疫结合物与DNA破坏剂的组合来实现。免疫结合物和DNA破坏剂中的每一者是以在组合使用所述两种药剂时在治疗上有效的量投予。在某些实施例中，欲通过本文所提供方法治疗的癌症(例如胃肠癌)是对包含通过蛋白酶可裂解连接体与MMAE结合的抗GCC抗体分子的免疫结合物的活性具有抗性或难治性者。
在本发明的一实施例中，与DNA破坏剂组合投予的免疫结合物具有下式I-5：
或其医药上可接受的盐，其中：
Ab是抗GCC抗体分子，且
m为1到8的整数。在本发明的实施例中，m为3到5的整数。在特定实施例中，m为约4。
在某些实施例中，式(I-5)的免疫结合物包含抗GCC抗体分子，其包括：
a)三个包含以下氨基酸序列的重链互补决定区(CDR)：
VHCDR1GYYWS(SEQIDNO:25)；
VHCDR2EINHRGNTNDNPSLKS(SEQIDNO:26)；和
VHCDR3ERGYTYGNFDH(SEQIDNO:27)；
和
b)三个包含以下氨基酸序列的轻链CDR：
VLCDR1RASQSVSRNLA(SEQIDNO:28)；
VLCDR2GASTRAT(SEQIDNO:29)；和
VLCDR3QQYKTWPRT(SEQIDNO:30)。
在一些实施例中，抗GCC抗体分子是含有包含SEQIDNO:20的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQIDNO:18的氨基酸序列的重链可变区的抗体分子。在一些实施例中，抗GCC抗体分子是含有包含SEQIDNO:20的氨基酸序列的轻链可变区、轻链k恒定区或其片段、包含SEQIDNO:18的氨基酸序列的重链可变区和重链IgG1或IgG2恒定区或其片段的抗体分子。
在一实施例中，所述抗GCC抗体分子是本文中所描述的5F9抗体分子。
与式(I-5)的免疫结合物组合投予的DNA破坏剂可为拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、烷化剂、类烷化剂、蒽环、DNA嵌入剂、DNA小沟烷化剂或抗代谢剂。包括本发明免疫结合物和DNA破坏剂的组合疗法可对癌症具有治疗协同作用，并减少与这些化学治疗剂有关的副作用。
适用于本发明方法的拓扑异构酶I抑制剂的实例包括(但不限于)伊立替康(irinotecan)、拓扑替康(topotecan)、喜树碱(camptothecin)、SN-38、片螺素D(lamellarinD)和其任何类似物、衍生物或代谢物。
适用于本发明方法的拓扑异构酶II抑制剂的实例包括(但不限于)依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、安吖啶(amsacrine)和米托蒽醌(mitoxantrone)和其任何类似物、衍生物或代谢物。
烷化剂是具有用烷基取代氢离子的能力的多官能化合物。烷化剂的实例包括(但不限于)双氯乙胺(氮芥，例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、环磷酰胺、依弗酰胺(ifosfamide)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、美法仑(melphalan)、尿嘧啶氮芥)、氮杂环丙烷(例如噻替哌(thiotepa))、烷基烷烃磺酸盐(例如白消安(busulfan))、亚硝酸脲(例如卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、链脲霉素(streptozocin)、司莫司汀(semustine)、乌拉莫司汀(uramustine))、非经典烷化剂(六甲蜜胺(altretamine)、达卡巴嗪(dacarbazine)和丙卡巴肼(procarbazine))和铂化合物(卡铂(carboplatin)和顺铂(cisplatin))。这些化合物与磷酸盐、氨基、羟基、硫氢基、羧基和咪唑基团反应。在生理条件下，这些药物电离并产生正离子，所述正离子附接到易感核酸和蛋白质，从而导致细胞周期停滞和/或细胞死亡。适用于本发明方法的烷化剂的其它实例包括(但不限于)丝裂霉素C(mitomycinC)、二溴甘露醇、四硝酸酯、米托唑胺(mitozolomide)、替莫唑胺(temozolomide)和其任何类似物、衍生物或代谢物。
适用于本发明方法的类烷化剂的实例包括(但不限于)铂化合物，例如顺铂、卡铂、奈达铂(nedaplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、沙铂(satraplatin)、三铂(triplatin)和其任何类似物、衍生物或代谢物。
适用于本发明方法的蒽环的实例包括(但不限于)道诺霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)、戊柔比星(valrubicin)和其任何类似物、衍生物或代谢物。
适用于本发明方法的DNA嵌入剂和自由基发生剂的实例包括(但不限于)博来霉素(bleomycin)。
适用于本发明方法的DNA小沟烷化剂的实例包括(但不限于)多卡米星(duocarmycin)和其任何类似物或衍生物，例如于以下专利中描述的那些：美国专利第5,101,038号；第5,641,780号；第5,187,186号；第5,070,092号；第5,703,080号；第5,070,092号；第5,641,780号；第5,101,038号；第5,084,468号；第5,739,350号；第4,978,757号；第5,332,837号；第4,912,227号；第5,985,908号；第6,060,608号；第6,262,271号；第6,281,354号；第6,310,209号；第6,486,326号；和第6,548,530号；PCT公开案第WO96/10405号；第WO97/32850号；第WO97/45411号；第WO98/52925号；第WO99/19298号；第WO99/29642号；第WO01/83482号；第WO97/12862号；第WO03/022806号；和第WO04/101767号；和公开的欧洲申请案0537575A1，其每一者的内容均以引用方式全文并入本文中；和吡咯并苯并二氮呯化合物(“PBD”)，例如于以下专利中描述的那些：WO2000/012508、WO2011/130598、WO2011/130616、WO2005/085251、WO2010/043880、WO2012/003266、WO2000/012506、WO2005/023814，其每一者的内容均以引用方式全文并入本文中。
抗代谢剂是一组干扰对癌细胞的生理和增殖至关重要的代谢过程的药物。增殖活跃的癌细胞要求连续合成大量核酸、蛋白质、脂质和其它至关重要的细胞成份。许多抗代谢物抑制嘌呤或嘧啶核苷的合成或抑制DNA复制的酶。一些抗代谢物还干扰核糖核苷和RNA的合成和/或氨基酸代谢以及蛋白质合成。通过干扰至关重要的细胞成份的合成，抗代谢物可延迟或阻止癌细胞的生长。适用于本发明方法的抗代谢剂的实例包括(但不限于)氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷(5-FUdR)、甲氨蝶呤、甲酰四氢叶酸、羟基脲、硫鸟嘌呤(6-TG)、巯嘌呤(6-MP)、阿糖胞苷(cytarabine)、喷司他汀(pentostatin)、磷酸氟达拉滨(fludarabinephosphate)、克拉屈滨(cladribine，2-CDA)、天冬酰胺酶、吉西他滨(gemcitabine)、卡培他滨(capecitibine)、硫唑嘌呤、胞嘧啶甲氨蝶呤、甲氧苄啶(trimethoprim)、乙胺嘧啶、培美曲塞(pemetrexed)和其任何类似物、衍生物或代谢物。
在一些实施例中，胃肠癌是表达GCC的胃肠癌。表达GCC的胃肠癌的实例包括(但不限于)原发性或转移性结肠直肠癌、原发性或转移性胃癌、原发性或转移性胰脏癌和原发性或转移性食道癌。在某些实施例中，胃肠癌对当以单一药剂形式投予时的式(I-5)的免疫结合物具有抗性。
在一特定实施例中，本发明涉及通过向需要所述治疗的个体投予式(I-5)的免疫结合物与DNA破坏剂的组合来治疗胃肠癌的方法，其中所述抗GCC抗体分子是本文中所描述的抗GCC抗体分子(例如5F9)，且m为3到5的整数(例如4)，其中所述DNA破坏剂是拓扑异构酶I抑制剂，且其中免疫结合物和拓扑异构酶I抑制剂中的每一者是以当组合使用所述两种药剂时在治疗上有效的量投予。
在另一特定实施例中，本发明涉及通过向需要所述治疗的个体投予式(I-5)的免疫结合物与拓扑异构酶I抑制剂的组合来治疗胃肠癌的方法，其中所述抗GCC抗体分子是本文中所描述的抗GCC抗体分子(例如5F9)，且m为3到5的整数(例如4)，其中所述拓扑异构酶I抑制剂是伊立替康，且其中免疫结合物和伊立替康中的每一者是以当组合使用所述两种药剂时在治疗上有效的量投予。
在另一特定实施例中，本发明涉及通过向需要所述治疗的个体投予式(I-5)的免疫结合物与伊立替康的组合来治疗原发性或转移性结肠直肠癌的方法，其中所述抗GCC抗体分子是本文中所描述的抗GCC抗体分子(例如5F9)，且m为3到5的整数(例如4)，其中免疫结合物和伊立替康中的每一者是以当组合使用所述两种药剂时在治疗上有效的量投予。在特定实施例中，免疫结合物和伊立替康包含于相伴或依序投予的单独调配物中。
在另一特定实施例中，本发明涉及通过向需要所述治疗的个体投予式(I-5)的免疫结合物与类烷化剂的组合来治疗胃肠癌的方法，其中所述抗GCC抗体分子是本文中所描述的抗GCC抗体分子(例如5F9)，且m为3到5的整数(例如4)，其中免疫结合物和类烷化剂中的每一者是以当组合使用所述两种药剂时在治疗上有效的量投予。例如，所述类烷化剂是顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂、沙铂或三铂。
在特定实施例中，本发明涉及通过向需要所述治疗的个体投予式(I-5)的免疫结合物与顺铂或奥沙利铂的组合来治疗原发性或转移性结肠直肠癌的方法，其中所述抗GCC抗体分子是本文中所描述的抗GCC抗体分子(例如5F9)，且m为3到5的整数(例如4)，其中免疫结合物和顺铂或奥沙利铂中的每一者是以当组合使用所述两种药剂时在治疗上有效的量投予。在特定实施例中，免疫结合物和顺铂或奥沙利铂包含于相伴或依序投予的单独调配物中。
在另一实施例中，本发明涉及通过向需要所述治疗的个体投予式(I-5)的免疫结合物与抗代谢物的组合来治疗胃肠癌的方法，其中所述抗GCC抗体分子是本文中所描述的抗GCC抗体分子(例如5F9)，且m为3到5的整数(例如4)，其中免疫结合物和抗代谢物中的每一者是以当组合使用所述两种药剂时在治疗上有效的量投予。例如，所述抗代谢物是氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷(5-FUdR)、甲氨蝶呤、甲酰四氢叶酸、羟基脲、硫鸟嘌呤(6-TG)、巯嘌呤(6-MP)、阿糖胞苷、喷司他汀、磷酸氟达拉滨、克拉屈滨(2-CDA)、天冬酰胺酶、吉西他滨、卡培他滨、硫唑嘌呤、胞嘧啶甲氨蝶呤、甲氧苄啶、乙胺嘧啶或培美曲塞。
在一特定实施例中，本发明涉及通过向需要所述治疗的个体投予式(I-5)的免疫结合物与5-氟尿嘧啶的组合来治疗原发性或转移性结肠直肠癌的方法，其中所述抗GCC抗体分子是本文中所描述的抗GCC抗体分子(例如5F9)，且m为3到5的整数(例如4)，其中免疫结合物和5-氟尿嘧啶中的每一者是以当组合使用所述两种药剂时在治疗上有效的量投予。在特定实施例中，免疫结合物和5-氟尿嘧啶包含于相伴或依序投予的单独调配物中。
在另一特定实施例中，本发明涉及通过向需要所述治疗的个体投予式(I-5)的免疫结合物与吉西他滨的组合来治疗原发性或转移性胰脏癌的方法，其中所述抗GCC抗体分子是本文中所描述的抗GCC抗体分子(例如5F9)，且m为3到5的整数(例如4)，其中免疫结合物和吉西他滨中的每一者是以当组合使用所述两种药剂时在治疗上有效的量投予。在特定实施例中，免疫结合物和吉西他滨包含于相伴或依序投予的单独调配物中。
在本发明的实施例中，免疫结合物的抗GCC抗体分子是单克隆抗体或其抗原结合片段。在另一实施例中，免疫结合物的抗GCC抗体分子是IgG1或IgG2抗体。在另一实施例中，免疫结合物的抗GCC抗体分子包含人类或人类源轻链和重链可变区框架。在特定实施例中，本发明的抗GCC抗体分子是经分离的单克隆IgG1抗体或其抗原结合片段，其包含人类或人类源轻链和重链可变区框架。
在某些实施例中，相伴投予免疫结合物和DNA破坏剂。在其它某些实施例中，依序投予免疫结合物和DNA破坏剂。可以单独调配物形式投予免疫结合物和DNA破坏剂。另一选择为，将免疫结合物和DNA破坏剂共调配为治疗上有效总量的每一药剂的单一剂型。
在一实施例中，在某一时期内每三周一次投予免疫结合物，与在(例如)相同时期内每周一次、每周两次或每周三次投予的DNA破坏剂组合。
在一实施例中，在某一时期内每三周一次投予免疫结合物，与在(例如)相同时期内每三周一次投予的DNA破坏剂组合。
在一实施例中，在某一时期内每三周一次投予免疫结合物，与在(例如)相同时期内的每周期间3天给药/4天停药投予的DNA破坏剂组合。
在一实施例中，在某一时期内每三周一次投予免疫结合物，与在(例如)相同时期内的每周期间2天给药/5天停药投予的DNA破坏剂组合。
在另一实施例中，在某一时期内每两周一次投予免疫结合物，与在(例如)相同时期内每周两次或三次投予的DNA破坏剂组合。
在另一实施例中，在某一时期内每周一次投予免疫结合物，与在(例如)相同时期内每周两次投予的DNA破坏剂组合。
在另一实施例中，在某一时期内每周一次投予免疫结合物，与在(例如)相同时期内每周的第1天和第3天投予的DNA破坏剂组合。
在另一实施例中，在某一时期内每周一次投予免疫结合物，与在(例如)相同时期内每周三次投予的DNA破坏剂组合。
在另一实施例中，在某一时期内每周一次投予免疫结合物，与在(例如)相同时期的第一周期间一次投予的DNA破坏剂组合。
在另一实施例中，在某一时期内每周一次投予免疫结合物，与在(例如)相同时期的第一周和第二周期间每周一次投予的DNA破坏剂组合。
在一实施例中，在某一时期内每周一次投予免疫结合物，与在(例如)相同时期内的每周期间3天给药/4天停药投予的DNA破坏剂组合。
在一实施例中，在某一时期内每周一次投予免疫结合物，与在(例如)相同时期内的每周期间2天给药/5天停药投予的DNA破坏剂组合。
在一实施例中，在某一时期内每周一次投予免疫结合物，与在(例如)相同时期内每三周一次投予的DNA破坏剂组合。
在另一实施例中，DNA破坏剂的给药时间表与免疫结合物的给药时间表在每周的至少一天重叠。在其它实施例中，DNA破坏剂的给药时间表与免疫结合物的给药时间表不重叠，使得在一周中的不同天投予每一药剂。
在一方面中，本发明涉及包含至少一种用于治疗需要所述治疗的个体的癌症(例如胃肠癌)的药剂的试剂盒。在一实施例中，所述试剂盒含有包含式(I-5)的免疫结合物的药剂和关于投予所述免疫结合物与选自以下的DNA破坏剂的组合的说明书：拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、烷化剂、类烷化剂、蒽环、DNA嵌入剂、DNA小沟烷化剂或抗代谢物。在实施例中，所述DNA破坏剂是本文中所描述的DNA破坏剂。在某些实施例中，所述试剂盒含有包含式(I-5)的免疫结合物的药剂和关于投予所述免疫结合物与拓扑异构酶I抑制剂的组合来治疗胃肠癌的说明书。在特定实施例中，用于与所述免疫结合物组合投予的拓扑异构酶I抑制剂是伊立替康。例如，所述试剂盒包括包含式(I-5)的免疫结合物的药剂，其中所述抗GCC抗体分子是本文中所描述的抗GCC抗体分子(例如5F9)，且m为3到5的整数(例如4)；和关于投予所述免疫结合物与伊立替康的组合来治疗胃肠癌(例如结肠直肠癌)的说明书。在一些实施例中，所述说明书包括本文中所描述的剂量或给药时间表。在一些实施例中，所述试剂盒进一步包括伊立替康。
在另一某实施例中，所述试剂盒含有包含式(I-5)的免疫结合物的药剂和关于投予所述免疫结合物与类烷化剂的组合来治疗胃肠癌的说明书。在特定实施例中，用于与所述免疫结合物组合投予的类烷化剂是顺铂或奥沙利铂。例如，所述试剂盒包括包含式(I-5)的免疫结合物的药剂，其中所述抗GCC抗体分子是本文中所描述的抗GCC抗体分子(例如5F9)，且m为3到5的整数(例如4)；和关于投予所述免疫结合物与顺铂或奥沙利铂的组合来治疗胃肠癌(例如结肠直肠癌)的说明书。在一些实施例中，所述说明书包括本文中所描述的剂量或给药时间表。在一些实施例中，所述试剂盒进一步包括顺铂或奥沙利铂。
在另一某实施例中，所述试剂盒含有包含式(I-5)的免疫结合物的药剂和关于投予所述免疫结合物与抗代谢剂的组合来治疗胃肠癌的说明书。在特定实施例中，用于与所述免疫结合物组合投予的抗代谢物是5-氟尿嘧啶。例如，所述试剂盒包括包含式(I-5)的免疫结合物的药剂，其中所述抗GCC抗体分子是本文中所描述的抗GCC抗体分子(例如5F9)，且m为3到5的整数(例如4)；和关于投予所述免疫结合物与5-氟尿嘧啶的组合来治疗胃肠癌(例如结肠直肠癌)的说明书。在一些实施例中，所述说明书包括本文中所描述的剂量或给药时间表。在一些实施例中，所述试剂盒进一步包括5-氟尿嘧啶。
在另一某实施例中，所述试剂盒含有包含式(I-5)的免疫结合物的药剂和关于投予所述免疫结合物与抗代谢剂的组合来治疗胃肠癌的说明书。在特定实施例中，用于与所述免疫结合物组合投予的抗代谢物是吉西他滨。例如，所述试剂盒包括包含式(I-5)的免疫结合物的药剂，其中所述抗GCC抗体分子是本文中所描述的抗GCC抗体分子(例如5F9)，且m为3到5的整数(例如4)；和关于投予所述免疫结合物与吉西他滨的组合来治疗胰脏癌的说明书。在一些实施例中，所述说明书包括本文中所描述的剂量或给药时间表。在一些实施例中，所述试剂盒进一步包括吉西他滨。
在一些方面中，本发明提供治疗结肠直肠癌的方法，其包含向需要所述治疗的患者投予式(I-5)的免疫结合物：
或其医药上可接受的盐，其中Ab是抗GCC抗体分子，其包含a)三个包含以下氨基酸序列的重链互补决定区(CDR)：VHCDR1GYYWS(SEQIDNO:25)；VHCDR2EINHRGNTNDNPSLKS(SEQIDNO:26)；和VHCDR3ERGYTYGNFDH(SEQIDNO:27)；和b)三个包含以下氨基酸序列的轻链CDR：VLCDR1RASQSVSRNLA(SEQIDNO:28)；VLCDR2GASTRAT(SEQIDNO:29)；和VLCDR3QQYKTWPRT(SEQIDNO:30)，例如5F9，且其中m为1到8的整数(例如3到5)；与伊立替康的组合，其中免疫结合物和伊立替康的量在组合使用时在治疗上有效(例如协同的)。结肠直肠癌可对单独免疫结合物具有强到中等或强的敏感性，或可对单独免疫结合物具有抗性。结肠直肠癌可具有相对较高、中等或较低的GCC抗原密度。
在一些方面中，本发明提供治疗结肠直肠癌的方法，其包含向需要所述治疗的患者投予式(I-5)的免疫结合物：
或其医药上可接受的盐，其中Ab是抗GCC抗体分子，其包含a)三个包含以下氨基酸序列的重链互补决定区(CDR)：VHCDR1GYYWS(SEQIDNO:25)；VHCDR2EINHRGNTNDNPSLKS(SEQIDNO:26)；和VHCDR3ERGYTYGNFDH(SEQIDNO:27)；和b)三个包含以下氨基酸序列的轻链CDR：VLCDR1RASQSVSRNLA(SEQIDNO:28)；VLCDR2GASTRAT(SEQIDNO:29)；和VLCDR3QQYKTWPRT(SEQIDNO:30)，例如5F9，且其中m为1到8的整数(例如3到5)；与顺铂的组合，其中免疫结合物和顺铂的量在组合使用时在治疗上有效(例如累加的)。结肠直肠癌可对单独免疫结合物具有强敏感性。结肠直肠癌可具有相对较高的GCC抗原密度。
在一些方面中，本发明提供治疗结肠直肠癌的方法，其包含向需要所述治疗的患者投予式(I-5)的免疫结合物：
或其医药上可接受的盐，其中Ab是抗GCC抗体分子，其包含a)三个包含以下氨基酸序列的重链互补决定区(CDR)：VHCDR1GYYWS(SEQIDNO:25)；VHCDR2EINHRGNTNDNPSLKS(SEQIDNO:26)；和VHCDR3ERGYTYGNFDH(SEQIDNO:27)；和b)三个包含以下氨基酸序列的轻链CDR：VLCDR1RASQSVSRNLA(SEQIDNO:28)；VLCDR2GASTRAT(SEQIDNO:29)；和VLCDR3QQYKTWPRT(SEQIDNO:30)，例如5F9，且其中m为1到8的整数(例如3到5)；与5-氟尿嘧啶的组合，其中免疫结合物和5-氟尿嘧啶的量在组合使用时在治疗上有效(例如协同的)。结肠直肠癌可对单独免疫结合物具有强到中等的敏感性。结肠直肠癌可具有较低的GCC抗原密度。
在一些方面中，本发明提供治疗胰脏癌的方法，其包含向需要所述治疗的患者投予式(I-5)的免疫结合物：
或其医药上可接受的盐，其中Ab是抗GCC抗体分子，其包含a)三个包含以下氨基酸序列的重链互补决定区(CDR)：VHCDR1GYYWS(SEQIDNO:25)；VHCDR2EINHRGNTNDNPSLKS(SEQIDNO:26)；和VHCDR3ERGYTYGNFDH(SEQIDNO:27)；和b)三个包含以下氨基酸序列的轻链CDR：VLCDR1RASQSVSRNLA(SEQIDNO:28)；VLCDR2GASTRAT(SEQIDNO:29)；和VLCDR3QQYKTWPRT(SEQIDNO:30)，例如5F9，且其中m为1到8的整数(例如3到5)；与吉西他滨的组合，其中免疫结合物和吉西他滨的量在组合使用时在治疗上有效(例如累加的)。结肠直肠癌可对单独免疫结合物具有敏感性。
本文所提到的所有出版物、专利申请案、专利和其它参考文献均以引用方式全文并入本文中。
从以下描述、附图和权利要求书将明了本文中所揭示的本发明优势和特征。此外，应理解本文中所描述的各个实施例的特征并不彼此排斥，且可以各种组合和排列存在。
附图说明
图1绘示根据q14d时间表用5F9vc-MMAF、5F9-DM1和5F9-DM4治疗的携带293-GCC2号的SCID小鼠中的肿瘤生长。
图2绘示用0.9％NaCl；40mg/kg的209抗体；或10mg/kg或40mg/kg的5F9抗体治疗的小鼠在接种后第41天的肺重量。
图3绘示用5F9抗体治疗的携带CT26-hGCC肿瘤的小鼠的存活曲线。
图4绘示测试GCC直系同源物的抗体交叉反应性的ELISA结合分析。
图5A到5E是绘示于源自经GCC转染的HEK293细胞的肿瘤异种移植物(图5A)和源自mCRC患者样品的原发性人类肿瘤异种移植物(图5B到5E)中的宽范围GCC表达的免疫组织化学载玻片。
图6A到6E是绘示源自具有不同GCC抗原密度水平的mCRC患者样品的不同肿瘤异种移植物模型中通过具有通过蛋白酶可裂解连接体与强效微管抑制剂MMAE结合的抗GCCmAb的免疫结合物诱导的活体内抗肿瘤活性的图表。图6A绘示具有中等到较高GCC表达量的原发性人类肿瘤异种移植物(PHTX-09c)中的活体内抗肿瘤活性；图6B绘示具有中等GCC表达量的原发性人类肿瘤异种移植物(PHTX-17c)中的活体内抗肿瘤活性；图6C和6D绘示在不同剂量的免疫结合物和给药时间表下也具有中等GCC表达量的原发性人类肿瘤异种移植物(PHTX-11c)中的活体内抗肿瘤活性；图6E绘示具有较低的GCC表达的原发性人类肿瘤异种移植物(PHTX-21c)中的活体内抗肿瘤活性。
图7A绘示PHTX-11c原发性人类mCRC肿瘤异种移植物模型中的GCC的免疫组织化学检测；图7B绘示PHTX-11c模型中的具有通过蛋白酶可裂解连接体与MMAE结合的抗GCCmAbz的免疫结合物在投予所述免疫结合物后第7天的免疫组织化学检测。
图8A是绘示用具有通过蛋白酶可裂解连接体与MMAE结合的抗GCCmAb的免疫结合物和DNA破坏剂(CPT-11)(每一药剂单独和以组合形式)治疗的PHTX-09c原发性人类mCRC肿瘤异种移植物模型中的平均体重变化百分比的图表；图8B是绘示PHTX-09c模型中由免疫结合物和DNA破坏剂(CPT-11)(每一者单独和以组合形式)诱导的抗肿瘤活性的图表；图8C是绘示在用免疫结合物和DNA破坏剂(每一者单独和以组合形式)治疗后PHTX-09c模型中的肿瘤再生长的图表。
图9A是绘示用具有通过蛋白酶可裂解连接体与MMAE结合的抗GCCmAb的免疫结合物和DNA破坏剂(CPT-11)(每一药剂单独和以组合形式)治疗的PHTX-21c原发性人类mCRC肿瘤异种移植物模型中的平均体重变化百分比的图表；图9B是绘示PHTX-21c模型中由免疫结合物和DNA破坏剂(CPT-11)(每一者单独和以组合形式)诱导的抗肿瘤活性的图表；图9C是绘示在用免疫结合物和DNA破坏剂(每一者单独和以组合形式)治疗后PHTX-21c模型中的肿瘤再生长的图表。
图10A是绘示用具有通过蛋白酶可裂解连接体与MMAE结合的抗GCCmAb的免疫结合物和DNA破坏剂(CPT-11)(每一药剂单独和以组合形式)治疗的PHTX-17c原发性人类mCRC肿瘤异种移植物模型中的平均体重变化百分比的图表；图10B是绘示PHTX-17c模型中由免疫结合物和DNA破坏剂(CPT-11)(每一者单独和以组合形式)诱导的抗肿瘤活性的图表；图10C是绘示在用免疫结合物和DNA破坏剂(每一者单独和以组合形式)治疗后PHTX-17c模型中的肿瘤再生长的图表。
图11A是绘示用具有通过蛋白酶可裂解连接体与MMAE结合的抗GCCmAb的免疫结合物和DNA破坏剂(CPT-11)(每一药剂单独和以组合形式)治疗的PHTX-11c原发性人类mCRC肿瘤异种移植物模型中的平均体重变化百分比的图表；图11B是绘示PHTX-11c模型中由免疫结合物和DNA破坏剂(CPT-11)(每一者单独和以组合形式)诱导的抗肿瘤活性的图表；图11C是绘示在用免疫结合物和DNA破坏剂(每一者单独和以组合形式)治疗后PHTX-11c模型中的肿瘤再生长的图表。
图12A是绘示用具有通过蛋白酶可裂解连接体与MMAE结合的抗GCCmAb的免疫结合物和DNA破坏剂(顺铂)(每一药剂单独和以组合形式)治疗的PHTX-09c原发性人类mCRC肿瘤异种移植物模型中的平均体重变化百分比的图表；图12B是绘示PHTX-09c模型中由免疫结合物和DNA破坏剂(顺铂)(每一者单独和以组合形式)诱导的抗肿瘤活性的图表；图12C是绘示在用免疫结合物和DNA破坏剂(顺铂)(每一者单独和以组合形式)治疗后PHTX-09c模型中的肿瘤再生长的图表。
图13A是绘示用具有通过蛋白酶可裂解连接体与MMAE结合的抗GCCmAb的免疫结合物和DNA破坏剂(5-FU)(每一药剂单独和以组合形式)治疗的PHTX-21c原发性人类mCRC肿瘤异种移植物模型中的平均体重变化百分比的图表；图13B是绘示PHTX-21c模型中由免疫结合物和DNA破坏剂(5-FU)(每一者单独和以组合形式)诱导的抗肿瘤活性的图表；图13C是绘示在用免疫结合物和DNA破坏剂(5-FU)(每一者单独和以组合形式)治疗后PHTX-21c模型中的肿瘤再生长的图表。
图14是绘示各种胰脏肿瘤微阵列上针对GCC表达筛选的样品间的合并/总计H评分分布的图表。
图15A是绘示PHTX-249a原发性人类胰脏肿瘤异种移植物模型中由3.75mg/kg和7.5mg/kg的通过蛋白酶可裂解连接体与MMAE结合的抗GCCmAb诱导的抗肿瘤活性的图表(所述研究中包括用不含MMAE且非GCC靶向的ADC治疗的对照组)。图15B是绘示PHTX-215a原发性人类胰脏肿瘤异种移植物模型中由3.75mg/kg和7.5mg/kg的通过蛋白酶可裂解连接体与MMAE结合的抗GCCmAb诱导的抗肿瘤活性的图表(所述研究中包括用不含MMAE且非GCC靶向的ADC治疗的对照组)。
图16A是绘示由通过蛋白酶可裂解连接体与MMAE结合的抗GCCmAb和吉西他滨(每一者单独以单一药剂形式和以组合形式)以不同浓度和给药时间表诱导的抗肿瘤活性的比较的条形图；图16B是绘示PHTX-249a原发性人类胰脏肿瘤异种移植物模型中由通过蛋白酶可裂解连接体与MMAE结合的抗GCCmAb和吉西他滨(每一者单独以单一药剂形式和以组合形式)诱导的抗肿瘤活性的图表；图16C是绘示PHTX-215a原发性人类胰脏肿瘤异种移植物模型中由通过蛋白酶可裂解连接体与MMAE结合的抗GCCmAb和吉西他滨(每一者单独以单一药剂形式和以组合形式)诱导的抗肿瘤活性的图表。
具体实施方式
本发明提供用于治疗癌症(例如胃肠癌)的新组合疗法。特定来说，本发明提供治疗罹患胃肠癌的患者的方法，其包含向所述患者投予包括通过蛋白酶可裂解连接体与MMAE结合的抗GCC抗体分子的免疫结合物与DNA破坏剂的组合，其中每一药剂是以治疗上有效的总量使用。尽管所述免疫结合物和DNA破坏剂各自可证明以单一药剂形式在治疗某些胃肠癌类型和一定数量的患者中有效，但已意外地发现利用本发明抗GCC免疫结合物与DNA破坏剂的组合疗法提供个别地利用任一药剂未实现的益处。本发明还提供包括本发明抗GCC免疫结合物和DNA破坏剂的医药组合物和试剂盒。
如上文所描述，化学抗性是胃肠癌治疗中公认的问题。特定来说，由于结肠直肠癌对微管破坏剂的固有或获得性化学抗性，所述药剂在治疗结肠直肠癌方面的成功有限。MMAE是强效微管抑制剂。本发明者已发现，与其它微管破坏剂一样，当MMAE以经设计以通过靶向GCC来特异性靶向结肠直肠癌细胞的免疫结合物形式使用时，某些结肠直肠肿瘤类型似乎对MMAE的微管抑制活性具有抗性。意外地，本发明者已发现当以单一药剂形式使用时具有少许活性到无活性的相同抗GCC免疫结合物使MMAE难治性结肠直肠肿瘤对DNA破坏剂活性敏感。本文中显示，抗GCC免疫结合物和DNA破坏剂的组合与任一药剂单独在不同肿瘤异种移植物模型中的活性相比具有改良的抗肿瘤活性，尽管在不同模型中的GCC表达量类似，但所述模型对呈单一药剂形式的免疫结合物呈现不同程度的敏感性。
鸟苷酸环化酶C
鸟苷酸环化酶C(GCC)(还称为STAR、ST受体、GUC2C和GUCY2C)是用于维持肠液、电解质体内恒定和细胞增生的跨膜细胞表面受体(卡里瑟斯等人，美国国家科学院院刊100:3018-3020(2003)；曼恩(Mann)等人，生物化学与生物物理学研究通讯(BiochemBiophysResCommun)239:463-466(1997)；皮塔里(Pitari)等人，美国国家科学院院刊100:2695-2699(2003))；基因库(GenBank)登录号NM_004963，其每一者以引用方式并入本文中)。此功能是通过结合鸟苷素来调介(韦根(Wiegand)等人，欧洲生化学会联合会快报(FEBSLett.)311:150-154(1992))。GCC还是热稳定性肠毒素(ST，例如具有NTFYCCELCCNPACAGCY(即SEQIDNO:1)的氨基酸序列)的受体，热稳定性肠毒素是由大肠杆菌(E.coli)以及其它传染性生物体产生的肽(饶M.C.(Rao,M.C.)Ciba基金会学术讨论会(CibaFound.Symp.)112:74-93(1985)；克诺普F.C.(KnoopF.C.)和欧文斯M.(Owens,M.)药理和毒理方法杂志(J.Pharmacol.Toxicol.Methods)28:67-72(1992))。ST与GCC的结合激活信号级联，从而导致肠道疾病，例如腹泻。
人类GCC的核苷酸序列(基因库登录号NM_004963)：
人类GCC的氨基酸序列(基因肽登录号NP_004954)：
GCC蛋白具有一些普遍接受的结构域，其每一者均向GCC分子提供可分离功能。GCC的各部分包括SEQIDNO:3的氨基酸残基1到约残基23或残基1到约残基21的信号序列(用于将蛋白质引导到细胞表面)(经切除用于成熟，从而产生SEQIDNO:3的约氨基酸残基22或24到1073的功能性成熟蛋白)、SEQIDNO:3的约氨基酸残基24到约残基420或约残基54到约残基384的用于配体(例如鸟苷素或ST)结合的细胞外结构域、SEQIDNO:3的约氨基酸残基431到约残基454或约残基436到约残基452的跨膜结构域、SEQIDNO:3的约氨基酸残基489到约残基749或约残基508到约残基745的经预测具有酪氨酸激酶活性的激酶同源结构域，和SEQIDNO:3的约残基750到约残基1007或约残基816到约残基1002的鸟苷酸环化酶催化结构域。优选地，抗GCC抗体分子结合到GCC的细胞外结构域。
在一些实施例中，抗GCC抗体分子可结合人类GCC。在一些实施例中，本发明抗GCC抗体分子可抑制配体(例如鸟苷素或热稳定性肠毒素)与GCC的结合。在其它实施例中，本发明抗GCC抗体分子不抑制配体(例如鸟苷素或热稳定性肠毒素)与GCC的结合。定义和方法
除非另有定义，否则结合本发明使用的科学和技术术语具有所属领域技术人员通常理解的含义。通常，与本文中所描述的细胞和组织培养、分子生物学以及蛋白质和寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交连用的命名法和其技术是本技术领域中已知的那些。基因库或基因肽登录号和有用核酸和肽序列可参见由国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologicalInformation，马里兰州贝塞斯达)维护的网站。对重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化和转染(例如电穿孔、脂转染)使用标准技术。酶促反应和纯化技术是根据制造商的说明书来执行，或以本技术领域内常规方法来执行，或如本文所述来执行。以上技术和程序通常是根据本技术领域内已知的方法(例如如各种一般和更具体参考文献中所描述)来执行，贯穿本说明书引用并论述所述参考文献。例如，参见萨布鲁克(Sambrook)等人，分子克隆实验指南(MolecularCloning:ALaboratoryManual)(第3版，冷泉港实验室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress)，纽约州冷泉港(2000))，或通常参见哈洛,E.(Harlow,E)和兰,D.(Lane,D.)(1988)抗体实验技术指南(Antibodies:ALaboratoryManual)，冷泉港实验室出版社，纽约州冷泉港。与本文中所描述的分析化学、合成有机化学以及医学和医药化学连用的命名法和其实验室程序和技术为本技术领域内已知。对化学合成、化学分析、医药制备、调配和递送和患者治疗使用标准技术。此外，除非上下文另外需要，否则单数术语将包括复数形式且复数术语将包括单数。
本文所使用的术语“抗体分子”是指抗体、抗体肽或免疫球蛋白或前述中的任一者(例如抗体)的抗原结合片段。抗体分子包括单链抗体分子，例如scFv，例如参见博德(Bird)等人，(1988)科学(Science)242:423-426；和休斯顿(Huston)等人，(1988)美国国家科学院院刊85:5879-5883)；和单一结构域抗体分子，例如参见WO9404678。尽管不属于术语“抗体分子”，但本发明还包括“抗体类似物”、其它基于非抗体分子蛋白质的支架，例如使用CDR提供特异性抗原结合的融合蛋白和/或免疫结合物。
“抗GCC抗体分子”是指与GCC(例如人类GCC)相互作用或识别其、例如结合(例如特异性结合)到其的抗体分子(即抗体、抗体肽、免疫球蛋白或前述中任一者的抗原结合片段)。实例性抗GCC抗体分子汇总于表1和2中。实例性抗GCC抗体包含表1的抗体的氨基酸序列，且可在任何适宜细胞系(例如哺乳动物细胞系，例如人类细胞系、NSO细胞系或CHO细胞系)中制得。实例性抗GCC抗体可包含表2中所列示的可变区。实例性抗GCC抗体还可包含表5中所列示的CDR。
本文所使用的术语“抗体”、“抗体肽”或“免疫球蛋白”是指单链、双链和多链蛋白质和糖蛋白。术语抗体包括多克隆、单克隆、嵌合、CDR移植和人类或人类化抗体，其全部更详细地论述于本文其它地方。所述术语还包括骆驼科(camelid)抗体(例如参见US2005/0037421)和纳米抗体(例如IgNAR(鲨鱼抗体)，例如参见WO03/014161)。术语“抗体”还包括合成和经遗传改造的变体。
本文所使用的术语抗体的“抗体片段”或“抗原结合片段”是指(例如)Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、单链抗体、功能性重链抗体(纳米抗体)以及抗体的对至少一个所需表位具有特异性且与完整抗体竞争特异性结合的任何部分(例如具有足够CDR序列且具有足够框架序列以特异性结合到表位的片段)。例如，抗原结合片段可竞争结合到结合衍生出所述片段的抗体的表位。此和类似上下文中所使用的衍生并不暗示衍生的任何特定方法或过程，但可仅指序列类似性。抗原结合片段可通过重组技术或通过酶促或化学裂解完整抗体来产生。术语抗原结合片段当用于具有轻链和重链的抗体的单链(例如重链)时意味着，所述链的片段足以使得当与另一条链(例如轻链)的完整可变区配对时，其结合将允许为利用整个重链和轻链可变区所见结合的至少25％、50％、75％、85％或90％。)
本文所使用的术语“CDR的抗原结合群集”或“多个足以允许结合的CDR”(和类似语言)是指一条链(例如重链)的足够CDR，使得当置于框架中并与另一条链的完整可变区或另一条链的可变区的具有类似长度且具有相同数量CDR的部分配对时，例如所述轻链结合将允许为利用整个重链和轻链可变区所见结合的(例如)至少25％、50％、75％、85％或90％。
本文所使用的术语“人类抗体”包括具有衍生自人类种系免疫球蛋白序列的序列的抗体，例如衍生自具有人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠(例如经XENOMOUSETM遗传改造的小鼠(阿布格尼克斯(Abgenix)，加利福尼亚州费利蒙))的抗体、人类噬菌体展示文库、人类骨髓瘤细胞或人类B细胞。
本文所使用的术语“人类化抗体”是指衍生自非人类抗体(例如啮齿类动物(例如鼠类))且保留或实质上保留亲代抗体的抗原结合性质但在人类中具有较少免疫原性的抗体。本文所使用的人类化打算包括去免疫化抗体。通常，人类化抗体包括非人类CDR以及人类或人类源框架区和恒定区。
本文所使用的术语“经修饰”抗体是指通过重组方式制备、表达、产生或分离的抗体，例如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体、自重组、组合抗体文库分离的抗体、分离自人类免疫球蛋白基因转基因动物(例如小鼠、绵羊或山羊)的抗体或通过涉及将人类免疫球蛋白基因序列剪接到其它DNA序列的任何其它方式来制备、表达、产生或分离的抗体。所述经修饰抗体包括人类化、CDR移植(例如具有来自第一抗体的CDR和来自不同来源(例如第二抗体或共有框架)的框架区的抗体)、嵌合、活体外生成(例如通过噬菌体展示)的抗体，且可任选地包括源自人类种系免疫球蛋白序列或人类免疫球蛋白基因或已通过涉及将人类免疫球蛋白基因序列剪接到替代免疫球蛋白序列的任何方式制备、表达、产生或分离的抗体的可变区或恒定区。在实施例中，经修饰抗体分子包括具有相对于参照抗体的序列变化的抗体分子。
术语“单特异性抗体”是指对特定表位展示单一结合特异性和亲和力的抗体或抗体制剂。此术语包括“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”。
术语“双特异性抗体”或“双功能抗体”是指对两个表位展示双重结合特异性的抗体，其中每一结合位点不同且识别不同表位。
术语“非结合抗体”和“裸抗体”可互换使用，以指未与非抗体部分(例如治疗剂或标记)结合的抗体分子。
术语“免疫结合物”、“抗体结合物”、“抗体药物结合物”和“ADC”可互换使用，且是指与非抗体部分(例如治疗剂或标记)结合的抗体分子。
术语“药剂”在本文中用于表示从生物材料制得的化学化合物、化学化合物的混合物、生物大分子或提取物。术语“治疗剂”是指具有生物活性的药剂。
术语“抗癌剂”或“化学治疗剂”在本文中用于指具有抑制人类中赘瘤、特定来说恶性(癌性)病灶(例如癌、肉瘤、淋巴瘤或白血病)的发生或进展的功能性质的药剂。抑制转移或血管形成常为抗癌剂或化学治疗剂的性质。化学治疗剂可为细胞毒性剂或细胞抑制剂。术语“细胞抑制剂”是指抑制或阻抑细胞生长和/或细胞繁殖的药剂。
“细胞毒性剂”是指主要通过直接干扰细胞功能来引起细胞死亡的化合物，包括(但不限于)烷化剂、肿瘤坏死因子抑制剂、嵌入剂、微管抑制剂、激酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂和拓扑异构酶抑制剂。本文所使用的“毒性有效负载”是指当递送到细胞时造成细胞死亡的足量细胞毒性剂。毒性有效负载的递送可通过投予足量的包含本发明的抗体或抗原结合片段和细胞毒性剂的免疫结合物来实现。毒性有效负载的递送还可通过投予足量的包含细胞毒性剂的免疫结合物来实现，其中所述免疫结合物包含识别并结合本发明的抗体或抗原结合片段的二级抗体或其抗原结合片段。
本文所使用的片语“衍生自指定序列”或“对其具有特异性”的序列是指包含与(例如)指定序列的邻接区域相应(即一致或互补)的具有大约至少6个核苷酸或至少2个氨基酸、至少约9个核苷酸或至少3个氨基酸、至少约10个到12个核苷酸或4个氨基酸或至少约15个到21个核苷酸或5个到7个氨基酸的邻接序列的序列。在某些实施例中，所述序列包含所有的指定核苷酸或氨基酸序列。所述序列可如通过本技术领域内已知的技术测定与特定序列所独有的序列区域互补(在多核苷酸序列的情形下)或一致。可衍生出序列的区域包括(但不限于)编码特异性表位的区域、编码CDR的区域、编码框架序列的区域、编码恒定结构域区域的区域、编码可变结构域区域的区域以及非翻译和/或非转录区域。所衍生序列将不必在物理上衍生自研究中所关注的序列，但可以任何方式生成，包括(但不限于)基于由衍生出多核苷酸的区域中的碱基序列提供的信息的化学合成、复制、反转录或转录。因此，其可代表原始多核苷酸的有义或反义定向。另外，与指定序列的区域相应的区域的组合可以本技术领域内已知的方式修饰或组合以符合预期用途。例如，序列可包含两个或更多个各包含指定序列的一部分的邻接序列，且杂有与指定序列不一致但打算代表源自指定序列的序列的区域。关于抗体分子，“从其衍生”包括与比较抗体功能上或结构上相关的抗体分子，例如“从其衍生”包括具有类似或实质上相同的序列或结构(例如具有相同或类似的CDR、框架或可变区)的抗体分子。关于抗体的“从其衍生”还包括残基，例如一或多个，例如2个、3个、4个、5个、6个或更多个残基，其可邻接或可不邻接，但是根据比较序列的编号方案或与其一般抗体结构的同源性或三维近似性(即在CDR或框架区内)定义或鉴别。术语“从其衍生”并不限于物理上从其衍生，但包括通过任何方式(例如通过使用来自比较抗体的序列信息来设计另一抗体)的生成。
本文所使用片语“由……编码”是指编码多肽序列的核酸序列，其中所述多肽序列或其一部分含有来自由所述核酸序列编码的多肽的至少3个到5个氨基酸、至少8个到10个氨基酸或至少15个到20个氨基酸的氨基酸序列。
两个序列之间的“同源性”的计算可如下来执行。出于最佳比较目的，比对各序列(例如可在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一或二者中引入间隔以实现最佳比对，且出于比较目的可忽视非同源序列)。参照序列的出于比较目的比对的长度为所述参照序列长度的至少30％、40％或50％、至少60％或至少70％、80％、90％、95％、100％。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中占据一位置的氨基酸残基或核苷酸与第二序列中的相应位置相同时，则所述分子在所述位置处一致(本文所使用的氨基酸或核酸“一致性”等效于氨基酸或核酸“同源性”)。两个序列之间的一致性百分比随所述序列共享的一致位置数而变化，其中考虑为实现两个序列最佳比对而需要引入的间隔数和各间隔长度。
两个序列之间的序列比较和同源性百分比测定可使用数学算法实现。两个氨基酸序列之间的同源性百分比可使用本技术领域内已知的任何方法测定。例如，内德勒曼(Needleman)和文施(Wunsch)，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:444-453(1970)的已纳入GCG软件包中的GAP程序中的算法，其使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵和16、14、12、10、8、6或4的间隔权重和1、2、3、4、5或6的长度权重。两个核苷酸序列之间的同源性百分比还可使用GCG软件包(阿克赛勒里公司(Accelerys,Inc.)，加利福尼亚州圣地牙哥)中的GAP程序并使用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或80的间隔权重和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定。用于测定同源性的实例性参数集合是Blossum62评分矩阵以及12的间隔罚分、4的间隔延伸罚分和5的框移间隔罚分。
本文所使用的术语“在严格条件下杂交”描述用于杂交和洗涤的条件。执行杂交反应的指导可参见分子生物学实验手册(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，纽约州约翰威立公司(JohnWiley&Sons,N.Y.)(1989),6.3.1-6.3.6。在所述参考文献中描述水性和非水性方法且可使用任一方法。本文所提到的具体杂交条件如下：1)在约45℃下于6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中的低严格杂交条件，然后至少在50℃下于0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤两次(对于低严格条件可将洗涤温度增加到55℃)；2)在约45℃下于6×SSC中的中等严格杂交条件，然后在60℃下于0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤一或多次；3)在约45℃下于6×SSC中的高严格杂交条件，然后在65℃下于0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤一或多次；和4)极高严格杂交条件为在65℃下的0.5M磷酸钠、7％SDS，然后在0.2×SSC、1％SDS和65℃下洗涤一或多次。极高严格条件(4)常为优选条件，且为除非另有规定否则应使用的条件。
应理解，本发明的抗体和其抗原结合片段可具有额外保守或非必需氨基酸取代，所述取代对多肽功能无实质性影响。无论特定取代是否具有耐受性(即是否不会不利地影响所需生物性质(例如结合活性))可如鲍伊,JU(Bowie,JU)等人，科学247:1306-1310(1990)或帕德兰(Padlan)等人，美国实验生物学学会联合会杂志(FASEBJ.)9:133-139(1995)中所阐述来确定。“保守性氨基酸取代”是氨基酸残基经具有类似侧链的氨基酸残基置换者。具有类似侧链的氨基酸残基的家族已在本技术领域内经定义。这些家族包括具有以下侧链的氨基酸：碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-具支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
“非必需”氨基酸残基是可从结合剂(例如抗体)的野生型序列改变而不废止或不实质上改变生物活性的残基，而“必需”氨基酸残基导致此一变化。在抗体中，必需氨基酸残基可为特异性决定残基(SDR)。
本文所使用的术语“经分离”是指从其原始环境(例如，若其为天然材料，则为天然环境)去除的材料。例如，活动物中所存在的天然多核苷酸或多肽并非分离的，但从天然系统中的一些或所有共存材料分离的相同多核苷酸或DNA或多肽是分离的。所述多核苷酸可为载体的一部分，和/或所述多核苷酸或多肽可为包含含有所述多核苷酸或多肽的经分离细胞或所培养细胞的组合物(例如混合物、溶液或悬浮液)的一部分，且因所述载体或组合物并非其天然环境的一部分而仍为分离的。
本文所使用的术语“经纯化产物”是指已从通常与产物联结的细胞成份和/或从所关注样品中可存在的其它细胞类型分离的产物制剂。
本文所使用的术语“表位”是指能够特异性结合到抗体的蛋白质决定子。表位决定簇通常是由分子的化学活性表面基团(例如，氨基酸或糖侧链)组成，且通常具有特定三维结构特性以及特定电荷特性。一些表位为线性表位，而其它表位为构象表位。线性表位为其中邻接氨基酸一级序列包含所识别表位的表位。线性表位通常包括至少3个、且更通常至少5个、例如约8个到约10个邻接氨基酸。构象表位可由至少两种情况产生，例如：a)仅以某些蛋白质构象暴露到抗体结合的线性序列，例如取决于配体结合或取决于通过信号传导分子的修饰(例如磷酸化)；或b)来自蛋白质的一个以上部分或在多亚单元蛋白质中来自一个以上亚单元的结构特征的组合，其中所述特征在3维空间中紧密靠近足以参与结合。
本文所使用的“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgM或IgGl)。
本文中所使用的术语“可检测剂”、“标记”或“经标记”用于指将可检测标记物纳于多肽或糖蛋白上。标记多肽和糖蛋白的各种方法为本技术领域内已知且可使用。用于多肽的标记的实例包括(但不限于)以下：放射性同位素或放射性核素(例如铟(111In)、碘(131I或125I)、钇(90Y)、镥(177Lu)、锕(225Ac)、铋(212Bi或213Bi)、硫(35S)、碳(14C)、氚(3H)、铑(188Rh)、锝(99mTc)、镨或磷(32P)、或正电子发射型放射性核素，例如碳-11(11C)、钾-40(40K)、氮-13(13N)、氧-15(15O)、氟-18(18F)和碘-121(121I))、荧光标记(例如FITC、玫瑰红(rhodamine)、镧系元素磷光体)、酶促标记(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光生物素基(其可通过经标记抗生物素蛋白(例如含有链霉抗生物素部分和荧光标记物的分子)或可通过光学或量热方法检测的酶促活性来检测)和由二级报道基因识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、针对二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在一些实施例中，通过各种长度的间隔臂附接标记以减少潜在的空间位阻。
本文中所使用的“特异性结合”、“特异性地结合”或“结合特异性”对于抗GCC抗体分子来说意指，所述抗体分子以比其结合到非GCC蛋白(例如BSA)高的亲和力结合到GCC(例如人类GCC蛋白)。通常，抗GCC分子对非GCC蛋白(例如BSA)的Kd将为其对GCC(例如人类GCC蛋白)的Kd的2倍以上、10倍以上、100倍以上、1,000倍以上、104倍以上、105倍以上或106倍以上。在Kd测定中，对GCC和非GCC蛋白(例如BSA)的Kd应在相同条件下获得。
本文所使用的术语“治疗(treat或treatment)”定义为向个体(例如患者)投予抗GCC抗体分子或向来自个体的经分离组织或细胞投予(例如通过施加)并将其返回给所述个体。抗GCC抗体分子可单独投予或与第二药剂组合投予。治疗可为治愈、愈合、缓和、缓解、改变、补救、改善、减轻、改良或影响病症、所述病症的症状或患所述病症(例如癌症)的倾向。尽管不希望受限于理论，但认为治疗造成活体外或活体内抑制、摘除或杀伤细胞或以其它方式降低细胞(例如异常细胞)调介病症(例如如本文中所描述病症(例如癌症))的能力。
本文所使用的术语“个体”打算包括哺乳动物、灵长类动物、人类和非人类动物。例如，个体可为患有癌症(例如胃肠源(例如结肠癌))、癌症(例如胃肠源(例如结肠癌))的症状的患者(例如人类患者或兽类患者)(其中至少一些细胞表达GCC)或具有癌症(例如胃肠源(例如结肠癌))的倾向的患者(其中至少一些细胞表达GCC)。除非另有所述，否则本发明的术语“非人类动物”包括所有非人类脊椎动物，例如非人类哺乳动物和非哺乳动物，例如非人类灵长类动物、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。在实施例中，个体不包括小鼠、大鼠、兔或山羊中的一或多者或全部。
如本文中所使用，抗GCC抗体分子“有效”或“足以”治疗病症的量或“治疗有效量”或“治疗足够量”是指抗体分子在向个体单一或多个剂量投予后有效治疗细胞(例如癌细胞(例如GCC表达肿瘤细胞))或延长治愈、缓和、缓解或改良患有本文中所描述病症的个体超过在不存在所述治疗的情况下所预期者的量。本文中所使用的“抑制肿瘤或癌症的生长”是指减缓、中断、阻止或终止其生长和/或转移且不必指示肿瘤生长的总消除。
本文中所使用的“GCC”(还称为“STAR”、“GUC2C”、“GUCY2C”或“ST受体”蛋白)是指哺乳动物GCC，优选地人类GCC蛋白。人类GCC是指SEQIDNO:3中所显示的蛋白质和其天然等位基因蛋白质变体。SEQIDNO:3中的等位基因可由SEQIDNO:2中所显示的GCC核酸序列编码。其它变体为本技术领域内已知。例如，参见登录号Ensp0000261170、Ensembl数据库、欧洲生物信息研究所(EuropeanBioinformaticsInstitute)和韦尔科姆基金会桑格研究所(WellcomeTrustSangerInstitute)，其在残基281处具有亮氨酸；公开的美国专利申请案第US20060035852号的SEQIDNO:14；或基因库登录号AAB19934。通常，天然等位基因变体具有与SEQIDNO:3的GCC序列具有至少95％、97％或99％一致性的氨基酸序列。转录物编码1073个氨基酸的蛋白质产物，且描述于基因库登录号：NM_004963中。GCC蛋白的特征为跨膜细胞表面受体蛋白，且认为在维持肠液、电解质体内恒定和细胞增殖中起关键作用。
除非另有所述，否则术语“烷基”是指具有约1个到约20个碳原子(和其中的碳原子范围和具体数量的所有组合和子组合)的饱和直链或具支链烃，其中约1个到约8个碳原子为优选的。烷基的实例为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、第二丁基、叔丁基、正戊基、2-戊基、3-戊基、2-甲基-2-丁基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、3-甲基-2-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-1-丁基、1-己基、2-己基、3-己基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、3-甲基-3-戊基、2-甲基-3-戊基、2,3-二甲基-2-丁基和3,3-二甲基-2-丁基。
烷基(无论单独还是作为另一基团的一部分)可称为“经取代”。经取代烷基是经一或多个基团、优选地1个到3个基团(和任何选自卤素的额外取代基)取代的烷基，所述一或多个基团包括(但不限于)-卤素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-SR’、-SO3R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、＝O、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN，其中每一R’独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基，且其中所述-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基和-C2-C8炔基可任选地进一步经一或多个基团取代，所述一或多个基团包括(但不限于)-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-卤素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R”、-OC(O)R”、-C(O)OR”、-C(O)NH2、-C(O)NHR”、-C(O)N(R”)2、-NHC(O)R”、-SR”、-SO3R”、-S(O)2R”、-S(O)R”、-OH、-N3、-NH2、-NH(R”)、-N(R”)2和-CN，其中每一R”独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基。
除非另有所述，否则术语“烯基”和“炔基”是指具有约2个到约20个碳原子(和其中的碳原子范围和具体数量的所有组合和子组合)的直链和具支链碳链，其中约2个到约8个碳原子为优选的。烯基链在链中具有至少一个双键，且炔基链在链中具有至少一个三键。烯基的实例包括(但不限于)亚乙基或乙烯基、烯丙基、-1-丁烯基、-2-丁烯基、-异丁烯基、-1-戊烯基、-2-戊烯基、-3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基和-2,3-二甲基-2-丁烯基。炔基的实例包括(但不限于)炔系、炔丙基、乙炔基、丙炔基、-1-丁炔基、-2-丁炔基、-1-戊炔基、-2-戊炔基和-3-甲基-1丁炔基。
与烷基一样，烯基和炔基可经代。“经取代”烯基或炔基是经一或多个基团、优选地1个到3个基团(和任何选自卤素的额外取代基)取代者，所述一或多个基团包括(但不限于)-卤素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-SR’、-SO3R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、＝O、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN，其中每一R’独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基，且其中所述-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基和-C2-C8炔基可任选地进一步经一或多个取代基取代，所述一或多个取代基包括(但不限于)-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-卤素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2C8炔基)、-芳基、-C(O)R”、-OC(O)R”、-C(O)OR”、-C(O)NH2、-C(O)NHR”、-C(O)N(R”)2、-NHC(O)R”、-SR”、-SO3R”、-S(O)2R”、-S(O)R”、-OH、-N3、-NH2、-NH(R”)、-N(R”)2和-CN，其中每一R”独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基。
除非另有所述，否则术语“亚烷基”是指如下饱和的具支链或直链烃基：具有约1个到约20个碳原子(和其中的碳原子范围和具体数量的所有组合和子组合)，其中约1个到约8个碳原子为优选的，且具有两个通过从亲代烷烃的相同或两个不同碳原子去除两个氢原子衍生的单价基团中心。典型亚烷基包括(但不限于)亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基、亚庚基、亚辛基、亚壬基、亚癸基、1,4-亚环己基等。亚烷基(无论单独还是作为另一基团的一部分)可任选地经一或多个基团、优选地1个到3个基团(和任何选自卤素的额外取代基)取代，所述一或多个基团包括(但不限于)-卤素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-SR’、-SO3R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、＝O、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN，其中每一R’独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基，且其中所述-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基和-C2-C8炔基可任选地进一步经一或多个取代基取代，所述一或多个取代基包括(但不限于)-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-卤素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R”、-OC(O)R”、-C(O)OR”、-C(O)NH2、-C(O)NHR”、-C(O)N(R”)2、-NHC(O)R”、-SR”、-SO3R”、-S(O)2R”、-S(O)R”、-OH、-N3、-NH2、-NH(R”)、-N(R”)2和-CN，其中每一R”独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基。
除非另有所述，否则术语“亚烯基”是指含有至少一个碳-碳双键的任选地经取代的亚烷基。例如，实例性亚烯基包括亚乙烯基(-CH＝CH-)和亚丙烯基(-CH＝CHCH2-)。
除非另有所述，否则术语“亚炔基”是指含有至少一个碳-碳三键的任选地经取代的亚烷基。例如，实例性亚炔基包括乙炔(-C≡C-)、炔丙基(-CH2C≡C-)和4-戊炔基(-CH2CH2CH2C≡CH-)。
除非另有所述，否则术语“芳基”是指通过从亲代芳香族环系统的单一碳原子去除一个氢原子衍生的具有6个到20个碳原子(和其中的碳原子范围和具体数量的所有组合和子组合)的单价芳香族烃基。一些芳基在实例性结构中表示为“Ar”。典型芳基包括(但不限于)衍生自苯、经取代苯、苯基、萘、蒽、联苯等的基团。
芳基(无论单独还是作为另一基团的一部分)可任选地经一或多个、优选地1个到5个或甚至1个到2个基团取代，所述一或多个基团包括(但不限于)-卤素、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-SR’、-SO3R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-NO2、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN，其中每一R’独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基，且其中所述-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)和-芳基可任选地进一步经一或多个取代基取代，所述一或多个取代基包括(但不限于)-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-卤素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R”、-OC(O)R”、-C(O)OR”、-C(O)NH2、-C(O)NHR”、-C(O)N(R”)2、-NHC(O)R”、-SR”、-SO3R”、-S(O)2R”、-S(O)R”、-OH、-N3、-NH2、-NH(R”)、-N(R”)2和-CN，其中每一R”独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基。
除非另有所述，否则术语“亚芳基”是指为二价(即通过从亲代芳香族环系统的同一或两个不同碳原子去除两个氢原子衍生)且可呈以下结构中所显示的邻位、间位或对位构形的任选地经取代的芳基，其中苯基作为实例性芳基：
典型“-(C1-C8亚烷基)芳基”、“-(C2-C8亚烯基)芳基”和“-(C2-C8亚炔基)芳基”包括(但不限于)苄基、2-苯基乙-1-基、2-苯基乙烯-1-基、萘基甲基、2-萘基乙-1-基、2-萘基乙烯-1-基、萘并苄基、2-萘并苯基乙-1-基等。
除非另有所述，否则术语“杂环”是指具有3个到14个环原子(还称为环成员)(和其中的碳原子和杂原子的范围和具体数量的所有组合和子组合)的单环、双环或多环系统，其中至少一个环中的至少一个环原子是选自N、O、P或S的杂原子。杂环可具有1个到4个独立地选自N、O、P或S的环杂原子。杂环中的一或多个N、C或S原子可经氧化。单环杂环优选地具有3个到7个环成员(例如2个到6个碳原子和1个到3个独立地选自N、O、P或S的杂原子)，且双环杂环优选地具有5个到10个环成员(例如4个到9个碳原子和1个到3个独立地选自N、O、P或S的杂原子)。包括所述杂原子的环可为芳香族环或非芳香族环。除非另有所述，否则杂环可在任何杂原子或碳原子处与其侧基附接，从而得到稳定结构。
杂环基团(无论单独还是作为另一基团的一部分)可任选地经一或多个基团、优选地1个到2个基团取代，所述一或多个基团包括(但不限于)-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-卤素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-SR’、-SO3R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN，其中每一R’独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基，且其中所述-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基和-芳基可任选地进一步经一或多个取代基取代，所述一或多个取代基包括(但不限于)-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-卤素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R”、-OC(O)R”、-C(O)OR”、-C(O)NH2、-C(O)NHR”、-C(O)N(R”)2、-NHC(O)R”、-SR”、-SO3R”、-S(O)2R”、-S(O)R”、-OH、-N3、-NH2、-NH(R”)、-N(R”)2和-CN，其中每一R”独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或芳基。
除非另有所述，否则术语“碳环”是指具有3个到14个环原子(和其中的碳原子范围和具体数量的所有组合和子组合)的饱和或不饱和非芳香族单环、双环或多环系统，其中所有环原子均为碳原子。单环碳环优选地具有3个到6个环原子、仍更优选地5个或6个环原子。双环碳环优选地具有7个到12个例如排列为双环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系统的环原子或9个或10个排列为双环[5,6]或[6,6]系统的环原子。例如，术语“碳环”包括与芳基环稠合的单环碳环(例如与苯环稠合的单环碳环)。碳环优选地具有3个到8个碳环原子。
碳环基团(无论单独还是作为另一基团的一部分)可任选地经(例如)一或多个基团、优选地1个或2个基团(和任何选自卤素的额外取代基)取代，所述一或多个基团包括(但不限于)-卤素、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-SR’、-SO3R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、＝O、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN，其中每一R’独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基，且其中所述-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)和-芳基可任选地进一步经一或多个取代基取代，所述一或多个取代基包括(但不限于)-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-卤素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R”、-OC(O)R”、-C(O)OR”、-C(O)NH2、-C(O)NHR”、-C(O)N(R”)2、-NHC(O)R”、-SR”、-SO3R”、-S(O)2R”、-S(O)R”、-OH、-N3、-NH2、-NH(R”)、-N(R”)2和-CN，其中每一R”独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基。
单环碳环取代基的实例包括-环丙基、-环丁基、-环戊基、-1-环戊-1-烯基、-1-环戊-2-烯基、-1-环戊-3-烯基、环己基、-1-环己-1-烯基、-1-环己-2-烯基、-1-环己-3-烯基、-环庚基、-环辛基、-1,3-环己二烯基、-1,4-环己二烯基、-1,3-环庚二烯基、-1,3,5-环庚三烯基和-环辛二烯基。
“碳环基”(无论单独使用还是作为另一基团的一部分使用)是指如上文所定义为二价(即通过从亲代碳环系统的同一或两个不同碳原子去除两个氢原子来衍生)的任选地经取代的碳环基团。
除非上下文另有指示，否则连字符(-)指定与侧接分子的附接点。因此，术语“-(C1-C8亚烷基)芳基”或“-C1-C8亚烷基(芳基)”是指如本文所定义的C1-C8亚烷基，其中亚烷基在所述亚烷基的任一碳原子处与侧接分子附接，且键结到亚烷基的碳原子的氢原子中的一者经如本文所定义的芳基置换。
分子中特定位置处的任一取代基或变量的定义打算独立于其在所述分子中其它处的定义。应理解，本发明化合物上的取代基和取代模式可由所属领域技术人员进行选择，以提供在化学上稳定且可容易通过本技术领域内已知的技术以及本文中所述的那些方法合成的化合物。
缩写“AFP”是指二甲基缬氨酸-缬氨酸-多拉异亮氨酸(dolaisoleuine)-多拉脯氨酸(dolaproine)-苯丙氨酸-对苯二胺(参见下式(XVIII))。
缩写“MMAE”是指单甲基奥里斯他汀E(参见下式(XIII))。
缩写“AEB”是指通过使奥里斯他汀E与对乙酰基苯甲酸反应产生的酯(参见下式(XXII))。
缩写“AEVB”是指通过使奥里斯他汀E与苯甲酰基戊酸反应产生的酯(参见下式(XXIII))。
缩写“MMAF”是指单甲基奥里斯他汀F(参见下式(XXI))。
抗体
在某些方面中，本文中所描述的方法、试剂盒和组合物包括本文中所描述的抗GCC抗体分子，例如具有表1到6中所汇总的一或多个特征的抗GCC抗体分子。
在优选实施例中，抗GCC抗体分子是抗体5F9，即包含表3中所提供的可变轻链和可变重链的氨基酸序列的抗体。抗体5F9可由杂交瘤5F9(PTA-8132)或另一适宜细胞系(例如哺乳动物细胞系，例如人类细胞系、NSO细胞系或CHO细胞系)产生。在其它优选实施例中，抗GCC抗体分子衍生自抗体5F9。
在实施例中，抗GCC抗体分子将对GCC具有如(例如)通过直接结合或竞争结合分析测量的在本文中所描述范围内的亲和力。在实施例中，抗GCC抗体分子具有小于1×10-6M、小于1×10-7M、小于1×10-8M、小于1×10-9M、小于1×10-10M、小于1×10-11M、小于1×10-12M或小于1×10-13M的Kd。在实施例中，抗体分子是IgG或抗原结合其片段，且具有小于1×10-6M、小于1×10-7M、小于1×10-8M或小于1×10-9M的Kd。在实施例中，抗GCC抗体分子(例如5F9抗体或从其衍生的抗体)具有约80pM到约200pM、优选地约100pM到约150pM或约120pM的Kd。在实施例中，抗GCC抗体分子(例如5F9抗体或从其衍生的抗体)具有约0.9M-1s-1到约1.25×105M-1s-1、优选地约1.1×105M-1s-1的ka。在实施例中，抗体分子是ScFv，且具有小于1×10-6M、小于1×10-7M、小于1×10-8M、小于1×10-9M、小于1×10-10M、小于1×10-11M、小于1×10-12M或小于1×10-13M的Kd。
在一些实施例中，抗体分子是免疫结合物的一部分，且例如免疫结合物可在结合到GCC后引起细胞反应并内化以将药剂递送到其所结合的GCC表达细胞。
在一些实施例中，本发明的抗GCC抗体分子可阻断配体与GCC的结合。
在实施例中，抗GCC抗体分子不能显示与大鼠GCC和小鼠GCC中的一或两者的实质性交叉反应。
天然哺乳动物抗体结构单位是以四聚体为代表。每一四聚体由两个多肽链对构成，每一对具有一条“轻链”(约25kDa)和一条“重链”(约50kDa到70kDa)。每一链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的具有约100个到110个或更多个氨基酸的可变区。每一链的羧基末端部分界定主要负责效应功能的恒定区。人类轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，且将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区是由约12个或更多个氨基酸的“J”区接合，其中重链还包括约10个氨基酸的“D”区。通常参见基础免疫学(FundamentalImmunology)，第7章(保罗W.(Paul,W.)编辑，第2版，纽约州瑞文出版社(RavenPress,N.Y.)(1989))。每一轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点。抗GCC抗体分子的优选同种型为IgG免疫球蛋白，其可分类为四个子类，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，其具有不同的γ重链。大部分治疗抗体为IgG1类型的人类、嵌合或人类化抗体。在特定实施例中，抗GCC抗体分子具有IgG1同种型。
每一轻链和重链对的可变区形成抗原结合位点。因此，完整IgG抗体具有两个相同的结合位点。然而，双功能或双特异性抗体为人工杂合构筑体，其具有两个不同的重链/轻链对，从而产生两个不同的结合位点。
所述链均呈现由三个超变区(还称为互补决定区或CDR)接合的相对保守的框架区(FR)的相同通用结构。每一对的两个链的CDR通过框架区进行比对，从而使能够结合到特异性表位。轻链和重链二者从N末端到C末端包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。氨基酸在各结构域中的分配是按照所关注免疫蛋白质的卡巴序列(KabatSequencesofProteinsofImmunologicalInterest)(国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)，马里兰州贝塞斯达(1987和1991))或乔西亚(Chothia)和赖斯克(Lesk)，分子生物学杂志196:901-917(1987)；乔西亚等人，自然(Nature)342:878-883(1989)的定义。如本文中所使用，CDR是针对每一重链(HCDR1、HCDR2、HCDR3)和轻链(LCDR1、LCDR2、LCDR3)来提到。
抗GCC抗体分子可包含本文中所描述抗体的重链和轻链中的一或二者的所有CDR或CDR抗原结合子集。例如，抗GCC抗体分子可包含氨基酸序列，包括表3和表5中所描述的可变区和/或CDR。抗GCC抗体分子的额外描述参见国际申请案WO2011/050242，其以引用方式全文并入本文中。
因此，在实施例中，抗体分子包括以下中的一或两者：
(a)表5的一个、两个、三个或抗原结合数量的轻链CDR(LCDR1、LCDR2和/或LCDR3)。在各实施例中，CDR可包含如下LCDR1-3中的一或多者或全部的氨基酸序列：LCDR1或其中1个到7个氨基酸经保守取代的经修饰LCDR1；LCDR2或其中一或两个氨基酸经保守取代的经修饰LCDR2；或LCDR3或其中一或两个氨基酸经保守取代的经修饰LCDR3；和
(b)表5的一个、两个、三个或或抗原结合数量的重链CDR(HCDR1、HCDR2和/或HCDR3)。在各实施例中，CDR可包含如下HCDR1-3中的一或多者或全部的氨基酸序列：HCDR1或其中一或多个氨基酸经保守取代的经修饰HCDR1；HCDR2或其中1个到4个氨基酸经保守取代的经修饰HCDR2；或HCDR3或其中一或两个氨基酸经保守取代的经修饰HCDR3。
用于产生抗GCC抗体的有用免疫原包括GCC(例如人类GCC)表达细胞(例如肿瘤细胞系，例如T84细胞或新鲜或冷冻结肠肿瘤细胞；表达GCC的重组细胞)；GCC表达细胞的膜部分(例如结肠肿瘤细胞系，例如T84细胞或新鲜或冷冻结肠肿瘤细胞；表达GCC的重组细胞，例如表达全长GCC或其部分的HT-29-GCC2号细胞，例如表达包含GCC细胞外结构域(例如SEQIDNO:61)的部分的CHOGCC27号细胞)；经分离或经纯化的GCC，例如人类GCC蛋白(例如经生物化学分离的GCC，例如分离自胃肠肿瘤细胞或表达GCC或其变体的重组细胞)或其部分(例如GCC的细胞外结构域、GCC的激酶同源结构域或GCC的鸟苷酸环化酶催化结构域，或与其部分相对应的肽，例如包含SEQIDNO:3的至少约8个、10个、12个、14个、16个、20个、24个、28个或32个氨基酸残基)；或包含SEQIDNO:16或包含其成熟部分且不含信号序列(即不含SEQIDNO:16的氨基酸残基1到约21或23)的免疫原，例如成熟TOK107-hIgG蛋白质，SEQIDNO:62。
抗GCC抗体分子的表位可存在于SEQIDNO:3的残基1到50或其结合本发明抗GCC抗体分子的片段(例如其5F9结合片段)内，或包括来自SEQIDNO:3的残基1到50或其结合本发明抗GCC抗体分子的片段(例如其5F9结合片段)的残基。所述片段可包含SEQIDNO:3的残基1到25、5到30、10到35、15到40、20到45、25到50、5到45、10到40、15到35、20到30或33到50。在一些实施例中，抗GCC抗体分子(例如5F9抗体)的表位是进一步包含GCC氨基酸序列中一或多个超过残基50的额外氨基酸残基(即选自SEQIDNO:3的约残基50到1073)的构象表位。
在另一实施例中，抗GCC抗体分子的表位可存在于SEQIDNO:5内或SEQIDNO:3的残基271到300内或其结合本发明抗GCC抗体分子的片段内，或包括来自SEQIDNO:5或SEQIDNO:3的残基271到300或其结合本发明抗GCC抗体分子的片段的残基。所述片段可包含SEQIDNO:3的残基281到290或SEQIDNO:3的残基281到290(其中残基281是亮氨酸)或SEQIDNO:3的残基281到300或残基271到290。在一些实施例中，抗GCC抗体分子的表位是进一步包含GCC氨基酸序列中一或多个选自(例如)SEQIDNO:3的约残基1到270和/或约301到1073的额外氨基酸残基(即非SEQIDNO:5残基)的构象表位。
在实施例中，抗GCC抗体分子具有一或多个以下性质：
a)其与表1和2中所汇总的上述抗GCC抗体分子中的一者(例如5F9)竞争结合，例如结合到细胞表面GCC或经纯化GCC；
b)其与表1和2中所汇总的上述抗GCC抗体分子中的一者(例如5F9)结合到GCC上的相同或实质上相同的表位。在实施例中，所述抗体结合相同表位，如通过一或多个肽阵列分析或通过结合到细胞表面或膜制剂上表达的截短突变体、嵌合体或点突变体来测定，例如如本文中所描述的那些分析；
c)其结合到与表1和2中所汇总的上述抗GCC抗体分子中的一者(例如5F9)的表位共同具有至少1个、2个、3个、4个、5个、8个、10个、15个或20个邻接氨基酸残基的表位；
d)其结合人类GCC中由本发明抗GCC抗体结合的区域，其中所述区域(例如细胞外或细胞质区域)的长度为10个到15个、10个到20个、20个到30个或20个到40个残基，且结合是通过(例如)结合到截短突变体来测定；在实施例中，所述抗GCC抗体分子结合人类GCC的细胞外区域。在实施例中，抗GCC抗体分子可结合细胞外结构域的通过SEQIDNO:3的氨基酸残基24到420界定的人类GCC部分。在实施例中，抗GCC抗体分子可结合SEQIDNO:3的氨基酸残基931到954处的鸟苷酸环化酶特征位点；或
e)其结合到本文中所描述的参照表位。
在实施例中，抗GCC抗体分子结合ILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTLS(SEQIDNO:5)的GCC序列。
在实施例中，抗GCC抗体分子结合FAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDV(SEQIDNO:6)的GCC序列。
在实施例中，所述抗体分子结合构象表位。在其它实施例中，抗体分子结合线性表位。
抗GCC抗体分子可为多克隆抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、嵌合抗体(参见美国专利第6,020,153号)或人类或人类化抗体或其抗体片段或衍生物。本发明中还涵盖前述中任一者的合成和经遗传改造的变体(参见美国专利第6,331,415号)。单克隆抗体可通过多种技术来产生，包括常规鼠类单克隆抗体方法，例如科勒(Kohler)和米尔斯坦(Milstein)，自然256:495(1975)的标准体细胞杂交技术。通常参见哈洛,E.和兰,D.(1988)抗体实验技术指南，冷泉港实验室出版社，纽约州冷泉港。关于产生抗GCC抗体的额外细节提供于国际申请案WO2011/050242中，其以引用方式全文并入本文中。
在实施例中，对于治疗应用，本发明抗体是人类或人类化抗体。人类或人类化抗体的优势在于其潜在地降低或消除所述抗体在宿主接受者中的免疫原性，从而容许增加生物可用度和降低不利免疫反应的可能性，因此潜在地使能够进行多次抗体投予。
经修饰抗体包括人类化、嵌合或CDR移植抗体。关于产生人类或人类化抗GCC抗体的细节提供于(例如)国际申请案WO2011/050242中，其以引用方式全文并入本文中。
在一些实施例中包括IgG2重链恒定区和κ轻链恒定区的人类5F9抗体可由杂交瘤5F9(还称为杂交瘤46.5F9.8.2，其于2007年1月10日代表千禧医药公司(MillenniumPharmaceuticalsInc.)，兰斯多恩街40号，马萨诸塞州剑桥，02139，美国以登录号PTA-8132保藏于美国菌种保存中心(AmericanTypeCultureCollection)，10801，林奇堡大学(UniversityBoulevard)，维吉尼亚州马纳萨斯，20110，美国)来产生。(根据国际承认用于专利程序目的的微生物保藏布达佩斯条约(BudapestTreatyontheInternationalRecognitionoftheDepositofMicroorganismsforthePurposesofPatentProcedure)并满足其要求进行保藏。)抗体5F9还可由其它细胞系(例如哺乳动物细胞系，例如人类细胞系、NSO细胞系或CHO细胞系)(参见实例4)来产生。如本文中所描述，杂交瘤5F9产生IgG2κ抗体。然而，IgG2区域可经(例如)IgG1区域置换以产生5F9IgG1抗体。
人类恒定区基因的序列可参见卡巴等人，(1991)所关注免疫蛋白质的序列(SequencesofProteinsofImmunologicalInterest)，N.I.H.出版号91-3242。人类C区域基因容易从已知克隆获得。同种型的选择将由所需效应功能(例如补体固定或抗体依赖性细胞毒性的活性)指导。同种型可为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在特定实施例中，本发明抗体分子为IgG1和IgG2。可使用人类轻链恒定区κ或λ中的任一者。然后通过常规方法表达嵌合、人类化抗体。
在一些实施例中，本发明抗GCC抗体分子可将抗体依赖性细胞毒性(ADCC)引入GCC表达细胞(例如肿瘤细胞)。具有IgG1和IgG3同种型的抗体由于其结合Fc受体的能力可用于引发抗体依赖性细胞毒性能力方面的效应功能。具有IgG2和IgG4同种型的抗体由于其结合Fc受体的能力较低可用于使ADCC反应最小化。在相关实施例中，可通过(例如)经修饰真核细胞系的生长进行Fc区中的取代或抗体的糖基化组合物的变化，以增强Fc受体识别、结合和/或调介抗GCC抗体结合的细胞的细胞毒性的能力(例如参见美国专利第7,317,091号、第5,624,821号和包括WO00/42072、席尔斯(Shields)等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)276:6591-6604(2001)、拉扎尔(Lazar)等人，美国国家科学院院刊103:4005-4010(2006)、萨同(Satoh)等人，生物疗法专家评论6:1161-1173(2006)的出版物)。在某些实施例中，抗体或抗原结合片段(例如人类源抗体，即人类抗体)可包括改变或调整功能(例如效应功能)的氨基酸取代或置换。例如，人类源的恒定区(例如γ1恒定区、γ2恒定区)可经设计以减少补体激活和/或Fc受体结合。(例如，参见美国专利第5,648,260号(温特(Winter)等人)、第5,624,821号(温特等人)和第5,834,597号(提搜(Tso)等人)，其整个教示内容以引用方式并入本文中。)优选地，人类源的恒定区的含有所述氨基酸取代或置换的氨基酸序列在人类源的未改变恒定区的氨基酸序列的全长上具有至少约95％一致性，更优选地在人类源的未改变恒定区的氨基酸序列的全长上具有至少约99％一致性。
人类化抗体可使用(例如CDR移植)方法来制得。生成所述人类化抗体的技术为本技术领域内已知。通常，人类化抗体是通过以下方式来产生：获得结合到GCC的抗体的编码可变重链和可变轻链序列的核酸序列，鉴别可变重链和可变轻链序列中的互补决定区或“CDR”，并将CDR核酸序列移植于人类框架核酸序列上。(例如，参见美国专利第4,816,567号和第5,225,539号)。可测定CDR和框架残基的定位(参见卡巴,E.A.等人，(1991)所关注免疫蛋白质的序列，第5版，美国卫生与公众服务部(U.S.DepartmentofHealthandHumanServices)，NIH出版号91-3242和乔西亚,C.等人，分子生物学杂志196:901-917(1987))。本文中所描述的实例性抗GCC抗体分子具有表5和6中所列示的CDR氨基酸序列和编码CDR的核酸序列。在一些实施例中，可将来自表5和6的序列纳入识别GCC的分子中用于本文中所描述的治疗或诊断方法。所选择的人类框架是适于活体内投予者，此意味着其在投予条件下在合理风险-益处比内优选地不呈现免疫原性。例如，此一测定可通过活体内使用所述抗体的先前实验和氨基酸类似性研究进行。适宜框架区可选自如下人类源抗体：其在供体抗体(例如抗GCC抗体分子)的等效部分(例如框架区)的氨基酸序列内的框架区长度上具有至少约65％氨基酸序列一致性，且优选地至少约70％、80％、90％或95％氨基酸序列一致性。氨基酸序列一致性可使用适宜氨基酸序列比对算法(例如CLUSTALW)使用预设参数来测定。(汤普森J.D.(ThompsonJ.D.)等人，核酸研究(NucleicAcidsRes.)22:4673-4680(1994)。)
在其它实施例中，通过CDR移植抗体减少免疫原性反应可通过CDR中氨基酸残基的变化(例如缺失、取代)来实现(克什米尔(Kashmiri)等人，方法(Methods)36:25-34(2005)、美国专利第6,818,749号、谭(Tan)等人，免疫学杂志(J.Immunol.)169:1119-1125(2006))。例如，优选地不改变涉及与抗原接触的位置的残基。通常，所述残基SDR处于在抗体间展示较高可变性程度的位置中。通过(例如)Clustal方法(希金斯D.G.(HigginsD.G.)等人，酶学方法(Meth.Enzymol.)266:383-402(1996))从抗GCC抗体分子(例如本文中所描述抗体)衍生的共有序列(例如SEQIDNO:63-68)有助于鉴别SDR。在本文中所描述的人类抗GCC抗体分子中，SDR是以下各项：重链CDR1的至少第一个残基或在一些实施例中前四个残基；重链CDR2的至少N末端部分，例如前7个、10个或13个残基；重链CDR3的几乎全部；轻链CDR1的C末端部分，例如在6个、8个或9个残基之后；轻链CDR2的约第一个、中间和/或最后一个残基；和轻链CDR3的大部分，或至少在两个或三个残基之后。因此，为在抗GCC抗体分子的人类化或修饰后维持与GCC蛋白的结合，抗GCC抗体分子的CDR中的所述SDR残基不如CDR的其它残基或框架区中的残基适于(例如)从鼠类残基变成人类共有残基。相反地，可有利地将非人类(例如鼠类)CDR中的残基变成人类CDR(例如本文中所描述抗GCC抗体分子的CDR(例如表5中所列示的序列))中所共有的残基。例如，丝氨酸可代表重链CDR1的C末端的人类残基，和/或酪氨酸可代表重链CDR1的第二和/或第三残基的人类残基；重链CDR2可以S-(L/V)-K-(S/G)(SEQIDNO:7)结尾来代表人类CDR；为代表人类CDR3，在重链CDR3中的4个到6个残基后可存在甘氨酸和/或在6个到9个残基后可存在天冬氨酸；轻链CDR1可以(K/R)-(A/S)-SQS-(V/L)-(S/L)(SEQIDNO:8)开始来代表人类CDR；轻链CDR2可在第三残基中具有丝氨酸和/或在第五残基中具有精氨酸来代表人类CDR；和/或轻链CDR3可在第二残基中具有谷氨酰胺和/或在第三残基中具有酪氨酸或丝氨酸来代表人类CDR。
不为完整抗体的抗GCC抗体还可用于本发明。所述抗体可衍生自本文中所描述抗体中的任一者。此类型的有用抗体分子包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，即包含两个通过二硫桥在铰链区连接的Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单一臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)由VH结构域组成的dAb片段(沃德(Ward)等人，自然341:544-546(1989))；(vii)由VHH结构域组成的单一结构域功能性重链抗体(称为纳米抗体)，例如参见科提兹-雷塔莫佐(Cortez-Retamozo)等人，癌症研究(CancerRes.)64:2853-2857(2004)和其中所引用的参考文献；和(vii)经分离CDR，例如一或多个连同足够框架一起提供抗原结合片段的经分离CDR。此外，尽管Fv片段的两个结构域(VL和VH)是由单独基因编码，但可使用重组方法通过合成连接体将所述两个结构域接合在一起，所述合成连接体使其能够以其中VL和VH区配对形成单价分子的单一蛋白链(称为单链Fv(scFv))制得(例如，参见博德等人，科学242:423-426(1988)；和休斯顿等人，美国国家科学院院刊85:5879-5883(1988)。所述单链抗体还打算涵盖于术语抗体的“抗原结合部分”内。使用所属领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，且筛选以与完整抗体相同的方式使用的片段。抗体片段(例如Fv、F(ab’)2和Fab)可通过裂解完整蛋白质(例如通过蛋白酶或化学裂解)来制备。
实施例包括包含足够CDR(例如来自表5的所有六种CDR)以允许结合到细胞表面GCC的抗体分子。
在实施例中，CDR(例如所有HCDR或所有LCDR或所有六种CDR)包埋于人类或人类源框架区中。人类框架区的实例包括人类种系框架序列、已亲和力成熟(活体内或活体外)的人类种系序列或合成人类序列(例如共有序列)。在实施例中，重链框架是IgG1或IgG2框架。在实施例中，轻链框架是κ框架。
抗GCC抗体分子可包含上述人类杂交瘤、选定淋巴球或鼠类抗体中的一者的重链和轻链中的一或两者的可变区的全部或抗原结合片段。
在实施例中，(a)的轻链氨基酸序列与(a)(i-ii)中所提到的参照氨基酸序列中的一者可相差多达1个、2个、3个、4个、5个、10个或15个残基。在实施例中，所述差异为保守取代。在实施例中，所述差异出现在框架区中。在实施例中，(b)的重链氨基酸序列与(b)(i-ii)中所提到的参照氨基酸序列中的一者可相差1个、2个、3个、4个、5个、10个或15个残基。在实施例中，所述差异为保守取代。在实施例中，所述差异出现在框架区中。
在实施例中，抗GCC抗体分子包含以下中的一或两者：
(a)(i)来自表3的轻链可变区氨基酸序列(例如SEQIDNO:20)或(ii)由来自表4的核苷酸序列编码的轻链可变区氨基酸(例如SEQIDNO:19)的全部或抗原结合片段的轻链氨基酸序列；和
(b)(i)来自表3的重链可变区氨基酸序列(例如SEQIDNO:18)或(ii)由来自表4的核苷酸序列编码的重链氨基酸序列(例如SEQIDNO:17)的全部或抗原结合片段的重链氨基酸序列。
在实施例中，抗GCC抗体分子包含以下中的一或两者：
a)与本发明抗GCC抗体分子(例如上述人类杂交瘤、选定淋巴球或鼠类抗体中的一者)的轻链可变区具有至少85％、90％、95％、97％或99％同源性的轻链可变区或其抗原结合片段；和
(b)与本发明抗GCC抗体分子(例如上述人类杂交瘤、选定淋巴球或鼠类抗体中的一者)的重链可变区具有至少85％、90％、95％、97％或99％同源性的重链可变区或其抗原结合片段。
实例性抗体的轻链和重链可变区的氨基酸序列可参见表3。
在实施例中，所述抗GCC抗体分子是5F9抗体分子且包括以下中的一或两者：a)来自SEQIDNO:32的重链恒定区的全部或片段；和b)来自SEQIDNO:34的轻链恒定区的全部或片段。
在另一实施例中，所述抗GCC抗体分子是Abx-229抗体分子且包括以下中的一或多者：a)来自SEQIDNO:46的重链可变区的全部或GCC结合片段；和b)来自SEQIDNO:48的轻链可变区的全部或GCC结合片段。
在一方法中，编码重链和轻链J区域的共有序列可用于设计用作引物以将有用限制位点引入J区域中用于V区域区段与人类C区域区段的后续连接的寡核苷酸。C区域cDNA可通过定点诱变来修饰以将限制位点置于人类序列中的类似位置处。
表达载体包括质粒、反转录病毒、粘粒、YAC、EBV源游离基因体等。合适的载体是编码功能完整的人类CH或CL免疫球蛋白序列者，其中改造适当限制位点以使得可容易插入并表达任何VH或VL序列。在所述载体中，剪接常发生在所插入J区域中的剪接供体位点与在人类C区域前面的剪接受体位点之间，且还发生在出现在人类CH外显子内的剪接区域中。适宜表达载体可含有多个组份，例如，复制起点、可选标记基因、一或多个表达控制元件(例如转录控制元件(例如启动子、增强子、终止子))和/或一或多个翻译信号、信号序列或前导序列等。多腺苷酸化和转录终止发生在编码区域下游的天然染色体位点处。所得嵌合抗体可接合到任何强启动子。可使用的适宜载体的实例包括适于哺乳动物宿主并基于病毒复制系统的那些，例如猿猴病毒40(SV40)、劳斯肉瘤病毒(Roussarcomavirus，RSV)、腺病毒2、牛乳头状瘤病毒(BPV)、乳多泡病毒BK突变体(BKV)或小鼠和人类巨细胞病毒(CMV)和鼠类莫洛尼氏白血病病毒(moloneymurineleukemiavirus，MMLV)、天然Ig启动子等。多种适宜载体为本技术领域内已知，包括维持呈单一拷贝或多个拷贝或(例如)通过LTR或通过经多个整合位点改造的人工染色体变得整合到宿主细胞染色体中的载体(林登鲍姆(Lindenbaum)等人，核酸研究32:e172(2004)；肯纳德(Kennard)等人，生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)2009年5月20日在线)。适宜载体的额外实例列示于下一部分中。
因此，本发明提供表达载体，其包含编码如下的核酸：抗体、抗体的抗原结合片段(例如人类、人类化、嵌合抗体或前述中任一者的抗原结合片段)、抗体链(例如重链、轻链)或结合GCC蛋白的抗体链的抗原结合部分。
于真核宿主细胞中的表达是有用的，这是因为所述细胞比原核细胞更可能组装并分泌经正确折叠且具有免疫活性的抗体。然而，由于不正确折叠而无活性的任何所产生抗体可根据已知方法复性(金姆(Kim)和鲍德温(Baldwin)，“小蛋白质的折叠反应中的具体中间体和蛋白质折叠机制(SpecificIntermediatesintheFoldingReactionsofSmallProteinsandtheMechanismofProteinFolding)”，生物化学年鉴(Ann.Rev.Biochem.)51，第459页到第489页(1982))。宿主细胞将可能产生完整抗体的各部分，例如轻链二聚体或重链二聚体，所述二聚体也为本发明的抗体同系物。
应了解，所生成的抗体不需初始具有特定所需同种型，而相反地所生成的抗体可具有任何同种型。例如，由5F9杂交瘤(ATCC保藏编号PTA-8132)产生的抗体具有IgG2同种型。其后可使用本技术领域内已知的常规技术将抗体的同种型转换成(例如)IgG1或IgG3以当抗体结合细胞上的GCC时引发ADCC反应。所述技术尤其包括使用直接重组技术(例如参见美国专利第4,816,397号)、细胞-细胞融合技术(例如参见美国专利第5,916,771号)。在细胞-细胞融合技术中，制备具有存在任何所需同种型的重链的骨髓瘤或其它细胞系，且制备具有轻链的另一骨髓瘤或其它细胞系。其后可融合所述细胞，且可分离表达完整抗体的细胞系。
在某些实施例中，GCC抗体分子是人类抗GCCIgG1抗体。由于所述抗体具有与GCC分子的所需结合，所述抗体中的任一者可容易地经同种型转换以生成(例如)人类IgG4同种型，而仍具有相同可变区(其在某种程度上定义抗体的特异性和亲和力)。因此，当生成满足上文所论述的所需“结构”属性的抗体候选物时，其通常可提供有通过同种型转换而需要的至少某些额外“功能”属性。
在实施例中，可变区或其抗原结合片段可与其经生成所具有的恒定区以外的恒定区(或其片段)(例如来自另一抗体的恒定区(或其片段))偶合或与合成恒定区(或其片段)偶合。在实施例中，所述恒定区是IgG1或IgG2恒定区(或其片段)。可在可变区或恒定区中进行序列变化，以改变抗体分子的效应活性。
其它治疗剂的设计和生成
本文中所产生并表征的针对GCC的抗体提供促进包括除抗体以外的其它抗体、其它拮抗剂或化学部分的其它治疗方式的设计。所述方式包括(但不限于)具有类似结合活性或功能性的抗体、先进抗体治疗剂(例如双特异性抗体、免疫结合物和经放射性标记的治疗剂)、肽治疗剂(特定来说细胞内抗体)的生成和小分子。此外，如上文所论述，本发明抗体的效应功能可通过同种型转换成IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA1、IgA2、IgE或IgM来改变用于各种治疗用途。
关于双特异性抗体，可生成包含以下的双特异性抗体：(i)两个抗体，一个对GCC具有特异性且另一个对结合在一起的第二分子具有特异性，(ii)单一抗体，其具有一个对GCC具有特异性的链和对第二分子具有特异性的第二链，或(iii)单链抗体，其对GCC和另一分子具有特异性。可使用已知技术生成所述双特异性抗体。
另外，还可制备“κ抗体”(Ill.等人，“具有双链和单链可变区二者的性质的杂合免疫球蛋白结构域的设计和构筑(Designandconstructionofahybridimmunoglobulindomainwithpropertiesofbothheavyandlightchainvariableregions)”蛋白质工程(ProteinEng)10:949-57(1997))、“微抗体”(马丁(Martin)等人，欧洲分子生物学学会杂志(EMBOJ)13:5303-9(1994)、美国专利第5,837,821号)、“双链抗体”(霍利格(Holliger)等人，美国国家科学院院刊90:6444-6448(1993))或“双特异性单链分子(Janusins)”(唐耐科(Traunecker)等人，欧洲分子生物学学会杂志10:3655-3659(1991)和唐耐科等人，国际癌症杂志(IntJCancer)增刊7:51-52(1992))。
多肽
在另一实施例中，本发明涉及代表本文中所描述抗体分子的多肽序列。
本发明涉及代表本发明抗体的多肽以及所述多肽的片段、类似物和衍生物。所述多肽可为重组多肽、天然产生的多肽或合成多肽。本发明多肽的片段、衍生物或类似物可为其中一或多个氨基酸残基经保守或非保守氨基酸残基(优选地保守氨基酸残基)取代者，且所述经取代氨基酸残基可或可不为由遗传密码编码者；或其可为其中一或多个氨基酸残基包括取代基者；或其可为其中多肽与另一化合物(例如延长多肽半衰期的化合物(例如，聚乙二醇))融合者；或其可为其中额外氨基酸与多肽(例如前导或分泌序列或纯化多肽或前蛋白序列所采用的序列)融合者。所述片段、衍生物和类似物在本发明范围内。在各种方面中，本发明多肽可为经部分纯化或经纯化的产物。
多肽可具有与本文中所描述抗体的氨基酸序列(例如表2或3中所汇总)一致或由于一或多个氨基酸取代而相差微小变异的氨基酸序列。所述变异可为通常在约1个到5个氨基酸范围内的“保守变化”，其中经取代氨基酸具有类似结构或化学性质，例如用异亮氨酸置换亮氨酸或用丝氨酸置换苏氨酸；用精氨酸或组氨酸置换赖氨酸。相比之下，变异可包括非保守变化，例如用色氨酸置换甘氨酸。类似微小变异还可包括氨基酸缺失或插入或二者。可使用本技术领域内已知的计算机程序(例如DNASTAR软件(DNASTAR公司，威斯康辛州麦迪逊))发现确定哪些或多少氨基酸残基可经取代、插入或缺失而不改变生物或免疫活性的指导。
在额外方面中，所述抗体分子包含由具有ATCC登录号PTA-8132的DNA编码的抗体的轻链可变区氨基酸序列的氨基酸序列。在其它额外方面中，所述抗体分子包含由具有ATCC登录号PTA-8132的DNA编码的抗体的重链可变区序列的氨基酸序列。
如所了解，本发明抗体可表达于除杂交瘤细胞系以外的细胞系中。编码特定抗体的cDNA或基因组克隆的序列可用于适宜哺乳动物或非哺乳动物宿主细胞。转化可通过任何用于将多核苷酸引入宿主细胞中的已知方法进行，所述方法包括(例如)将多核苷酸封装于病毒(或病毒载体)中并用病毒(或载体)转导宿主细胞，或通过本技术领域内已知用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞中的转染程序，例如葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸囊封于脂质体中和DNA分子的直接显微注射。所使用的转化程序取决于欲转化的宿主。用于将异源多核苷酸酸引入哺乳动物细胞中的方法为本技术领域内已知，并包括(但不限于)葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、粒子轰击、将多核苷酸囊封于脂质体中、肽结合物、树枝状聚合物和直接向细胞核中显微注射DNA。
融合蛋白和免疫结合物
本文中所描述的抗GCC抗体可通过任何适宜方法(例如化学偶合、遗传融合、非共价联结或其它方式)功能连接到一或多个非抗体分子实体。
可产生融合蛋白，其中如本文中所描述的抗GCC抗体分子和非抗体部分是单一连续多肽链的组份。非抗体部分可参照抗体部分定位于N末端、C末端或内部。例如，一些实施例可通过将编码免疫球蛋白序列的核酸插入适宜表达载体(例如pET载体(例如pET-15b，诺维真(Novagen))、噬菌体载体(例如pCNATAB5E，非墨西(Pharmacia))或其它载体(例如pRIT2T蛋白质A融合载体，非墨西))中来产生。所得构筑体可经表达以产生包含非抗体部分(例如组氨酸标签、E标签或蛋白质AIgG结合结构域)的抗体链。融合蛋白可使用任何适宜技术进行分离或回收，例如使用适宜亲和矩阵的色谱(例如参见分子生物学实验手册(奥苏伯尔,F.M(Ausubel,F.M)等人编辑，第2卷，增刊26，第16.4.1页到第16.7.8页(1991))。
本发明提供引导到细胞中并在实施例中内化到其中的抗GCC抗体分子。其能够将治疗剂或可检测剂递送到表达GCC的细胞上或其中，但不递送到不表达所述标靶的细胞上或其中。因此，本发明还提供包含与治疗剂或可检测剂结合的如本文中所描述的抗GCC抗体分子的免疫结合物。在实施例中，免疫结合物对GCC的亲和力为未经结合抗体的亲和力的至少10％、25％、50％、75％、80％、90％或95％。此可使用细胞表面GCC或经分离GCC来测定。在实施例中，抗GCC抗体分子(例如免疫结合物)具有如通过本文中所描述分析测定小于1,000pM、500pM、250pM、100pM或50pM的LD50。
抗GCC抗体分子可利用本技术领域内已知的技术来修饰以充当免疫结合物。例如参见维泰塔(Vitetta)当代免疫(ImmunolToday)14:252(1993)。还参见美国专利第5,194,594号。经放射性标记的抗体的制备还可容易地利用本技术领域内已知的技术制备。例如参见荣汉斯(Junghans)等人，癌症化学疗法和生物疗法(CancerChemotherapyandBiotherapy)655-686(第2版，察夫纳(Chafner)和隆戈(Longo)编辑，立品寇特瑞文出版社(LippincottRaven)(1996))。还参见美国专利第4,681,581号、第4,735,210号、第5,101,827号、第5,102,990号(美国再发证专利第35,500号)、第5,648,471号和第5,697,902号。
在一些实施例中，抗体分子和非抗体部分是通过连接体来连结。在所述实施例中，免疫结合物是由式(I)代表：
其中，
Ab是本文中所描述的抗GCC抗体分子；
X是连结Ab和Z的部分，例如本文中所描述连接体在共价连接到Ab和Z中的一或两者后的其余部分；
Z是治疗剂或标记；且
m在约1到约15的范围内。
变量m代表式(I)免疫结合物中每个抗体分子的-X-Z部分的数量。在各个实施例中，m在1到8、1到7、1到6、1到5、1到4、1到3或1到2的范围内。在一些实施例中，m在2到8、2到7、2到6、2到5、2到4或2到3的范围内。在其它实施例中，m为1、2、3、4、5或6。在包含多个式(I)免疫结合物的组合物中，m为每个Ab的-X-Z部分的平均数，还称为平均载药量(在其中所述组合物包含多个免疫结合物的实例中，m可为除整数以外的数值(例如为所述多个结合物间的平均数)。平均载药量可在每个Ab1个到约15个-X-Z部分的范围内。在一些实施例中，当m代表平均载药量时，m为约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7或约8。在实例性实施例中，m为约2到约8。在另一实施例中，m为约4。在另一实施例中，m为约2。
每个Ab的-X-Z部分的平均数可通过常规方式(例如质谱法、ELISA分析和HPLC)来表征。还可测定免疫结合物就m来说的定量分布。在一些情况下，分离、纯化和表征如与具有其它载药量的免疫结合物不同的均质免疫结合物(其中m为某一值)可通过诸如反相HPLC或电泳等方式来实现。
用于制备免疫结合物的多种适宜连接体(例如用于将抗体分子连结到治疗剂或标记的异双功能试剂)和方法为本技术领域内已知。(例如参见查理(Chari)等人，癌症研究(CancerResearch)52:127-131(1992)。)所述连接体可在(例如)生理条件下(例如在细胞内条件下)为可裂解的，使得所述连接体的裂解将药物(治疗剂或标记)释放于细胞内环境中。在其它实施例中，所述连接体为不可裂解的，且通过(例如)抗体降解释放药物。
所述连接体可键结到抗体部分上的化学反应性基团，例如键结到游离氨基、亚氨基、羟基、硫醇或羧基(例如键结到N末端或C末端、键结到一或多个赖氨酸残基的ε氨基、一或多个谷氨酸或天冬氨酸残基的游离羧酸基团或键结到一或多个半胱氨酰残基的巯基)。结合所述连接体的位点可为抗体部分的氨基酸序列中的天然残基，或可通过(例如)DNA重组技术(例如通过将半胱氨酸或蛋白酶裂解位点引入氨基酸序列中)或通过蛋白质生物化学(例如还原、pH调节或蛋白质水解)将其引入抗体部分中。
在某些实施例中，使为连接体(X)的前体的中间体与药物(Z)在适当条件下反应。在某些实施例中，在药物和/或中间体上使用反应性基团。随后使药物与中间体间的反应产物或所衍生药物与抗体分子在适当条件下反应。
免疫结合物可通过采用所属领域技术人员所熟知的方法从反应物纯化，例如柱色谱(例如亲和色谱、离子交换色谱、凝胶过滤、疏水相互作用色谱)、透析、渗滤或沉淀。免疫结合物可通过采用所属领域技术人员所熟知的方法来评价，例如SDS-PAGE、质谱法或毛细管电泳。
在一些实施例中，连接体可通过存在于细胞内环境中(例如，在溶酶体或胞内体或胞膜窖内)的裂解剂裂解。
在其它具体实施例中，连接体是丙二酸酯连接体(约翰逊(Johnson)等人，1995，抗癌研究(AnticancerRes.)15:1387-93)、马来酰亚氨基苯甲酰基连接体(劳(Lau)等人，1995，生物有机化学与医药化学通讯(BioorgMedChem.)3(10)：1299-1304)或3’-N-酰胺类似物(劳等人，1995，生物有机化学与医药化学通讯3(10):1305-12)。
可与本发明组合物和方法一起使用的多种实例性连接体描述于WO2004-010957、美国公开案第20060074008号、美国公开案第20050238649号和美国公开案第20060024317号(其每一者以引用方式全文并出于所有目的并入本文中)中。
能够用于使抗体分子与治疗剂或标记偶合的连接体的实例包括(例如)马来酰亚氨基己酰基(mc)；马来酰亚氨基己酰基-对-氨基苄基氨基甲酸酯；马来酰亚氨基己酰基-肽-氨基苄基氨基甲酸酯连接体，例如马来酰亚氨基己酰基-L-苯丙氨酸-L-赖氨酸-对-氨基苄基氨基甲酸酯和马来酰亚氨基己酰基-L-缬氨酸-L-瓜氨酸-对-氨基苄基氨基甲酸酯(vc)；3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀酰亚氨基酯(还称为4-(2-吡啶基二硫代)戊酸N-琥珀酰亚氨基酯或SPP)；4-琥珀酰亚氨基-氧基羰基-2-甲基-2-(2-吡啶基二硫代)-甲苯(SMPT)；3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀酰亚氨基酯(SPDP)；4-(2-吡啶基二硫代)丁酸N-琥珀酰亚氨基酯(SPDB)；2-亚氨基硫硫杂环戊烷；S-乙酰基琥珀酸酐；二硫化氨基甲酸苄基酯；碳酸酯；腙连接体；N-(α-马来酰亚氨基乙酰氧基)琥珀酰亚胺酯；N-[4-(对叠氮基水杨酸基酰胺基)丁基]-3’-(2’-吡啶基二硫代)丙酰胺(AMAS)；N-[β-马来酰亚氨基丙基氧基]琥珀酰亚胺酯(BMPS)；[N-ε-马来酰亚氨基己酰基氧基]琥珀酰亚胺酯(EMCS)；N-[γ-马来酰亚氨基丁酰基氧基]琥珀酰亚胺酯(GMBS)；琥珀酰亚氨基-4-[N-马来酰亚氨基甲基]环己烷-1-羧基-[6-酰胺基己酸酯](LC-SMCC)；6-(3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰胺基)己酸琥珀酰亚氨基酯(LC-SPDP)；间马来酰亚氨基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)；[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸N-琥珀酰亚氨基酯(SIAB)；4-[N-马来酰亚氨基甲基]环己烷-1-甲酸琥珀酰亚氨基酯(SMCC)；N-琥珀酰亚氨基3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰胺基(SPDP)；[N-ε-马来酰亚氨基己酰基氧基]磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-EMCS)；N-[γ-马来酰亚氨基丁酰基氧基]磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-GMBS)；6-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯酰胺基]己酸4-磺基琥珀酰亚氨基酯)(磺基-LC-SMPT)；6-(3’-[2-吡啶基二硫代]-丙酰胺基)己酸磺基琥珀酰亚氨基酯(磺基-LC-SPDP)；间马来酰亚氨基苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-MBS)；[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸N-磺基琥珀酰亚氨基酯(磺基-SIAB)；4-[N-马来酰亚氨基甲基]环己烷-1-甲酸磺基琥珀酰亚氨基酯(磺基-SMCC)；4-[对马来酰亚氨基苯基]丁酸磺基琥珀酰亚氨基酯(磺基-SMPB)；乙二醇-双(琥珀酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)(EGS)；酒石酸二琥珀酰亚氨基酯(DST)；1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)；二亚乙基三胺-五乙酸(DTPA)；和硫脲连接体。
在一些实施例中，连接体-X-具有式-Aa-Ww-Yy-，且式(I)免疫结合物的特征在于式(II)：
其中，
Ab是本文中所描述的抗GCC抗体分子；
-A-是延伸物单元(Stretcherunit)；
a为0或1；
每一-W-独立地为氨基酸单元；
w为在0到12的范围内的整数；
-Y-是自牺牲(self-immolative)间隔子单元；
y为0、1或2；
Z是治疗剂或标记；且
m在约1到约15的范围内。
延伸物单元(A)当存在时能够将Ab单元连接到氨基酸单元(-W-)(若存在)、间隔子单元(-Y-)(若存在)；或治疗剂或标记(Z)。可天然或通过化学操作存在于抗GCC抗体分子上的有用官能团包括(但不限于)巯基、氨基、羟基、碳水化合物的变旋异构羟基和羧基。适宜官能团为巯基和氨基。在一实例中，巯基可通过还原抗GCC抗体分子的分子内二硫键来生成。在另一实施例中，巯基可通过使抗GCC抗体分子的赖氨酸部分的氨基与2-亚氨基硫杂环戊烷(特劳特试剂(Traut’sreagent))或其它巯基生成试剂反应来生成。在某些实施例中，所述抗GCC抗体分子是重组抗体，且经改造以携带一或多个赖氨酸。在某些其它实施例中，重组抗GCC抗体分子经改造以携带额外巯基，例如额外半胱氨酸。
在一实施例中，延伸物单元与Ab单元的硫原子形成键。硫原子可源自Ab的巯基。此实施例的代表性延伸物单元绘示于式(IIIa)和(IIIb)的方括弧内，其中Ab-、-W-、-Y-、-Z、w和y如上文所定义，且Ra选自-C1-C10亚烷基-、-C2-C10亚烯基-、-C2-C10亚炔基-、-碳环基-、-O-(C1-C8亚烷基)-、O-(C2-C8亚烯基)-、-O-(C2-C8亚炔基)-、-亚芳基-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-、-C2-C10亚烯基-亚芳基、-C2-C10亚炔基-亚芳基、-亚芳基-C1-C10亚烷基-、-亚芳基-C2-C10亚烯基-、-亚芳基-C2-C10亚炔基-、-C1-C10亚烷基-(碳环基)-、-C2-C10亚烯基-(碳环基)-、-C2-C10亚炔基-(碳环基)-、-(碳环基)-C1-C10亚烷基-、-(碳环基)-C2-C10亚烯基-、-(碳环基)-C2-C10亚炔基、杂环-、-C1-C10亚烷基-(杂环)-、-C2-C10亚烯基-(杂环)-、-C2-C10亚炔基-(杂环)-、-(杂环)-C1-C10亚烷基-、-(杂环)-C2-C10亚烯基-、-(杂环)-C2-C10亚炔基-、-(CH2CH2O)r-或-(CH2CH2O)r-CH2-，且r为在1到10范围内的整数，其中所述烷基、烯基、炔基、亚烷基、亚烯基、亚炔基、芳基、碳环、碳环基、杂环和亚芳基(无论单独还是作为另一基团的一部分)任选地经取代。在一些实施例中，所述烷基、烯基、炔基、亚烷基、亚烯基、亚炔基、芳基、碳环、碳环基、杂环和亚芳基(无论单独还是作为另一基团的一部分)未经取代。在一些实施例中，Ra选自-C1-C10亚烷基-、-碳环基-、-O-(C1-C8亚烷基)-、-亚芳基-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-(碳环基)-、-(碳环基)-C1-C10亚烷基-、-C3-C8杂环-、-C1-C10亚烷基-(杂环)-、-(杂环)-C1-C10亚烷基-、-(CH2CH2O)r-和-(CH2CH2O)r-CH2-；且r为在1到10范围内的整数，其中所述亚烷基未经取代，且所述基团的其余部分任选地经取代。
从所有实例性实施例应理解，甚至在不明确表示时，可将1个到15个药物部分连接到Ab(m＝1到15)。
说明性延伸物单元具有式(IIIa)，其中Ra是-(CH2)5-：
应注意，在整个本申请案中，除非上下文另有指示，否则下式中的S部分是指Ab单元的硫原子。
氨基酸单元(-W-)当存在时将延伸物单元连接到间隔子单元(若存在间隔子单元)，将延伸物单元连接到药物部分(若不存在间隔子单元)，且将Ab单元连接到治疗剂或标记部分(若不存在延伸物单元和间隔子单元)。
Ww-可为(例如)单肽、二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽单元。
在某些实施例中，氨基酸单元可包含天然氨基酸。在其它实施例中，氨基酸单元可包含非天然氨基酸。说明性Ww单元是由式(VII)代表：
其中Rc和Rd如下：
在氨基酸单元的一方面中，氨基酸单元是缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)。在另一方面中，氨基酸单元是苯丙氨酸-赖氨酸(即fk)。在氨基酸单元的另一方面中，氨基酸单元是N-甲基缬氨酸-瓜氨酸。在另一方面中，氨基酸单元是5-氨基缬草酸、均苯丙氨酸赖氨酸、四异喹啉甲酸酯赖氨酸、环己基丙氨酸赖氨酸、异哌啶甲酸赖氨酸、β-丙氨酸赖氨酸、甘氨酸丝氨酸缬氨酸谷氨酰胺和异哌啶甲酸。
当存在氨基酸单元时，间隔子单元(-Y-)当存在时将氨基酸单元连接到治疗剂或标记部分(-Z-)。另一选择为，当不存在氨基酸单元时，间隔子单元将延伸物单元连接到治疗剂或标记部分。当不存在氨基酸单元和延伸物单元二者时，间隔子单元也将治疗剂或标记部分连接到Ab单元。
间隔子单元具有两种通用类型：非自牺牲的或自牺牲的。非自牺牲间隔子单元是其中在氨基酸单元从抗体-药物结合物裂解(特定来说酶促裂解)后间隔子单元的一部分或全部仍结合到治疗剂或标记部分者。非自牺牲间隔子单元的实例包括(但不限于)(甘氨酸-甘氨酸)间隔子单元和甘氨酸间隔子单元(二者均绘示于方案图1中)(参见下文)。当含有甘氨酸-甘氨酸间隔子单元或甘氨酸间隔子单元的结合物经受酶(例如肿瘤细胞相关蛋白酶、癌细胞相关蛋白酶或淋巴球相关蛋白酶)的酶促裂解时，甘氨酸-甘氨酸-Z部分或甘氨酸-Z部分从Ab-Aa-Ww-裂解。
另一选择为，含有自牺牲间隔子单元的结合物可释放-Z。如本文所使用的术语“自牺牲间隔子”是指能够将两个隔开的化学部分共价连接在一起形成稳定三联分子的双官能化学部分。若其与第一部分的键裂解，则其将自发地与第二化学部分分离。
在一些实施例中，-Yy-是对氨基苄基醇(PAB)单元(参见方案图2和3)，其亚苯基部分经Qn取代，其中Q是-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-卤素、-硝基或-氰基；且n为在0到4范围内的整数。烷基、烯基和炔基(无论单独还是作为另一基团的一部分)可任选地经取代。
在一些实施例中，-Y-是PAB基团，其通过PAB基团的氨基氮原子连接到-Ww-并通过碳酸酯、氨基甲酸酯或醚基团直接连结到-Z。
自牺牲间隔子的其它实例包括(但不限于)与PAB基团电子上类似的芳香族化合物，例如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(黑伊(Hay)等人，1999，生物有机化学与医药化学通讯9:2237)和邻-或对-氨基苄基缩醛。可使用在酰胺键水解后经受环化的间隔子，例如经取代和未经取代的4-氨基丁酸酰胺(罗德里格斯(Rodrigues)等人，1995，化学与生物学(ChemistryBiology)2:223)、经适当取代的双环[2.2.1]和双环[2.2.2]环系统(斯托姆(Storm)等人，1972，美国化学会志(J.Amer.Chem.Soc.)94:5815)和2-氨基苯基丙酸酰胺(阿姆斯伯里(Amsberry)等人，1990，有机化学杂志(J.Org.Chem.)55:5867)。在甘氨酸的α位经取代的含胺药物的消除(金斯伯里(Kingsbury)等人，1984，欧洲医药化学杂志(J.Med.Chem.)27:1447)也为自牺牲间隔子的实例。
在一些实施例中，-Z部分相同。在另一实施例中，-Z部分不同。
在一方面中，间隔子单元(-Yy-)是由式(X)代表：
其中Q是-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-卤素、-硝基或-氰基；且m为在0到4范围内的整数。烷基、烯基和炔基(无论单独还是作为另一基团的一部分)可任选地经取代。
在一组选定实施例中，式(I)和(II)的结合物为：
其中w和y各自为0、1或2：
其中w和y各自为0；
其中Aa、Ww、Yy、Z和Ab具有上文所提供的含义。
式(I)中的变量Z为治疗剂或标记。治疗剂可为发挥所需生物作用的任何药剂。在一些实施例中，所述治疗剂使细胞对第二治疗方式(例如化学治疗剂、辐射疗法、免疫疗法)敏感。
在一些实施例中，治疗剂是细胞抑制剂或细胞毒性剂。实例包括(但不限于)抗代谢物(例如氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷(5-FUdR)、甲氨蝶呤、甲酰四氢叶酸、羟基脲、硫鸟嘌呤(6-TG)、巯嘌呤(6-MP)、阿糖胞苷、喷司他汀、磷酸氟达拉滨、克拉屈滨(2-CDA)、天冬酰胺酶、吉西他滨、卡培他滨、硫唑嘌呤、胞嘧啶甲氨蝶呤、甲氧苄啶、乙胺嘧啶或培美曲塞)；烷化剂(例如美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、噻替哌、依弗酰胺、卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、链脲霉素、达卡巴嗪、丝裂霉素C、环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、乌拉莫司汀、二溴甘露醇、四硝酸酯、丙卡巴肼、六甲蜜胺、米托唑胺或替莫唑胺)；类烷化剂(例如顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂、沙铂或三铂)；DNA小沟烷化剂(例如多卡米星(例如CC-1065)和其任何类似物或衍生物；吡咯并苯并二氮呯或其任何类似物或衍生物)；蒽环(例如道诺霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、或戊柔比星)；抗生素(例如放线菌素D(dactinomycin)、博来霉素、光辉霉素(mithramycin)、安曲霉素(anthramycin)、链佐霉素(streptozotocin)、短杆菌肽D(gramicidinD)、丝裂霉素(例如丝裂霉素C)；卡奇霉素(calicheamicin)；抗有丝分裂剂(例如包括类美登素(maytansinoid)、奥里斯他汀、尾海兔素(dolastatin)、念珠藻素(cryptophycin)、长春花生物碱(vincaalkaloid)(例如长春新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞滨(vinorelbine))、紫杉烷(taxane)(例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)或新颖紫杉烷(例如参见于2001年5月31日公布的国际专利公开案第WO01/38318号))、图布莱森(tubulysin)和秋水仙素(colchicine)；拓扑异构酶抑制剂(例如伊立替康、拓扑替康、喜树碱、依托泊苷、替尼泊苷、安吖啶或米托蒽醌)；和蛋白酶体抑制剂(例如肽基酉朋酸)。关于各种治疗剂与抗GCC抗体的结合的额外信息参见国际申请案WO2011/050242，其以引用方式全文并入本文中。
尾海兔素和奥里斯他汀免疫结合物
在一些其它实施例中，治疗剂为尾海兔素。在一些实施例中，治疗剂是奥里斯他汀，例如奥里斯他汀E(在本技术领域内还称为尾海兔素-10的衍生物)或其衍生物。在一些实施例中，治疗剂是选自式(XIII)到(XXIII)的化合物的化合物或其医药上可接受的盐形式：
奥里斯他汀化合物和其与抗体结合的方法描述于(例如)托利亚(Doronina)等人，自然生物技术(NatureBiotech.)，21:778-784(2003)；汉布里特(Hamblett)等人，临床癌症研究(Clin.CancerRes.)，10:7063-7070(2004)；卡特(Carter)和森特(Senter)，癌症杂志(CancerJ.)，14154-169(2008)；美国专利第7,498,298号、第7,091,186号、第6,884,869号；第6,323,315号；第6,239,104号；第6,034,065号；第5,780,588号；第5,665,860号；第5,663,149号；第5,635,483号；第5,599,902号；第5,554,725号；第5,530,097号；第5,521,284号；第5,504,191号；第5,410,024号；第5,138,036号；第5,076,973号；第4,986,988号；第4,978,744号；第4,879,278号；第4,816,444号；和第4,486,414号；美国专利公开案第20090010945号、第20060074008号、第20080300192号、第20050009751号、第20050238649号和第20030083236号；和国际专利公开案第WO04/010957号和第WO02/088172号中，其每一者以引用方式全文并出于所有目的并入本文中。
奥里斯他汀可为(例如)奥里斯他汀E与酮酸间形成的酯。例如，可使奥瑞斯他汀E与对乙酰基苯甲酸或苯甲酰戊酸反应以分别产生AEB和AEVB。其它典型奥里斯他汀包括奥里斯他汀苯丙氨酸苯二胺(AFP；(XVIII))、单甲基奥里斯他汀E(MMAE；(XIII))和单甲基奥里斯他汀F(MMAF；(XXI))。
已显示奥里斯他汀干扰微管动力学以及细胞核和细胞分裂并具有抗癌活性。用于本发明的奥里斯他汀结合微管蛋白，且可对GCC表达细胞系发挥细胞毒性或细胞抑制作用。确定化合物是否结合微管蛋白的方法为本技术领域内已知。例如，参见穆勒(Muller)等人，分析化学(Anal.Chem)2006,78,4390-4397；哈默尔(Hamel)等人，分子药理学(MolecularPharmacology)，199547:965-976；和哈默尔等人，生物化学杂志，1990265:28,17141-17149。出于本发明的目的，可测定化合物对微管蛋白的相对亲和力。本发明的一些优选奥里斯他汀结合微管蛋白的亲和力在MMAE对微管蛋白的结合亲和力的1/10(较弱亲和力)到MMAE对微管蛋白的结合亲和力的10倍、20倍或甚至100倍(较高亲和力)的范围内。
有多种本技术领域内已知可用于测定奥里斯他汀或所得免疫结合物对所需细胞系是否发挥细胞抑制或细胞毒性作用的不同分析。例如，免疫结合物的细胞毒性或细胞抑制活性可通过以下方式来测量：使表达免疫结合物的标靶蛋白质的哺乳动物细胞暴露于细胞培养基中；将细胞培养约6小时到约5天的时期；并测量细胞活力。可使用基于细胞的活体外分析测量免疫结合物的活力(增殖)、细胞毒性和凋亡诱导(含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶激活)。
为测定免疫结合物是否发挥细胞抑制作用，可使用胸苷纳入分析。例如，可将96孔板的5,000个细胞/孔的密度的表达标靶抗原的癌细胞培养72小时时期，并在72小时时期的最后8小时期间暴露于0.5μCi3H-胸苷下。在存在和不存在免疫结合物的情况下测量3H-胸苷到培养细胞中的纳入。
为测定细胞毒性，可测量坏死或凋亡(程序性细胞死亡)。坏死通常是通过质膜渗透性的升高、细胞的溶胀和质膜的破裂来实现。凋亡的特征通常在于膜起泡、细胞质凝聚和内源性内切酶激活。对癌细胞的这些作用中的任一者的测定指示免疫结合物可用于治疗癌症。
细胞活力可通过测定细胞中染料(例如中性红、台酚蓝或ALAMARTM蓝)的摄取来测量(例如参见佩奇(Page)等人，1993，国际肿瘤学杂志(Intl.J.Oncology)3:473-476)。在此一分析中，于含有染料的培养基中培育细胞，洗涤细胞，并用分光光度计测量剩余染料(反映染料的细胞摄取)。还可使用蛋白质结合染料磺基玫瑰红B(SRB)测量细胞毒性(斯基汉(Skehan)等人，1990，美国国立癌症研究所杂志(J.Natl.CancerInst.)82:1107-12)。
另一选择为，使用四唑鎓盐(例如MTT或WST)通过检测活细胞而非死细胞进行针对哺乳动物细胞存活和增殖的定量比色分析(例如参见莫斯曼(Mosmann)，1983，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)65:55-63)。
可通过测量(例如)DNA断裂对凋亡进行定量。可使用商业光度测定方法进行DNA断裂的活体外定测量定。所述分析的实例(包括TUNEL(其检测于断裂DNA中的经标记核苷酸纳入)和基于ELISA的分析)描述于生物化学杂志(Biochemica)，1999，第2期，第34页到第37页(罗氏分子生物化学(RocheMolecularBiochemicals))中。
凋亡还可通过测量细胞的形态学变化来测定。例如，与坏死一样，质膜完整性的损失可通过测量某些染料(例如荧光染料，例如吖啶橙或溴乙啶)的摄取来测定。用于测量凋亡细胞数的方法已由杜克(Duke)和科恩(Cohen)的免疫学实验指南(CurrentProtocolsinImmunology)(科林根(Coligan)等人编辑，1992，第3.17.1页到第3.17.16页)描述。还可用DNA染料(例如吖啶橙、溴乙啶或碘丙啶)标记细胞，并观察细胞的染色质凝聚和沿内核膜的着边。可经测量以确定凋亡的其它形态学变化包括(例如)细胞质凝聚、膜起泡增加和细胞收缩。
可在培养物的附接和“漂浮”区室二者中测量凋亡细胞的存在。例如，两种区室可通过以下方式来收集：去除上清液、用胰蛋白酶处理所附接细胞、在离心洗涤步骤(例如以2000rpm进行10分钟)后合并所述制剂并检测凋亡(例如通过测量DNA断裂)。(例如参见匹萨(Piazza)等人，1995，癌症研究55:3110-16)。
可在动物模型中测试或验证免疫结合物的作用。所属领域技术人员已知多个已确定的动物癌症模型，可使用其任一者来分析免疫结合物的效力。所述模型的非限制性实例描述于下文。此外，检查免疫结合物的活体内效力的小动物模型可通过将人类肿瘤细胞系移植到适当的免疫缺陷型啮齿类动物品系(例如无胸腺裸小鼠或SCID小鼠)中来产生。
在一些实施例中，式(I)中的变量-Z是式(X-A)或式(X-B)的奥里斯他汀部分：
其中，在每一位置处独立地：
波形线指示键；
R2是-C1-C20烷基、-C2-C20烯基或-C2-C20炔基；
R3是-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基、碳环、-C1-C20亚烷基(碳环)、-C2-C20亚烯基(碳环)、-C2-C20亚炔基(碳环)、-芳基、-C1-C20亚烷基(芳基)、-C2-C20亚烯基(芳基)、-C2-C20亚炔基(芳基)、-杂环、-C1-C20亚烷基(杂环)、-C2-C20亚烯基(杂环)、或-C2-C20亚炔基(杂环)；
R4是-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基、碳环、-C1-C20亚烷基(碳环)、-C2-C20亚烯基(碳环)、-C2-C20亚炔基(碳环)、-芳基、-C1-C20亚烷基(芳基)、-C2-C20亚烯基(芳基)、-C2-C20亚炔基(芳基)、-杂环、-C1-C20亚烷基(杂环)、-C2-C20亚烯基(杂环)、或-C2-C20亚炔基(杂环)；
R5是-H或-C1-C8烷基；
或R4和R5共同形成碳环，并具有式-(CRaRb)s-，其中Ra和Rb独立地为-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基或-碳环，且s为2、3、4、5或6；
R6为-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基或-C2-C20炔基；
R7是-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基、-碳环、-C1-C20亚烷基(碳环)、-C2-C20亚烯基(碳环)、-C2-C20亚炔基(碳环)、-芳基、-C1-C20亚烷基(芳基)、-C2-C20亚烯基(芳基)、-C2-C20亚炔基(芳基)、杂环、-C1-C20亚烷基(杂环)、-C2-C20亚烯基(杂环)或-C2-C20亚炔基(杂环)；
每一R8独立地为-H、-OH、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基、-O-(C1-C20烷基)、-O-(C2-C20烯基)、-O-(C1-C20炔基)或-碳环；
R9为-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基或-C2-C20炔基；
R19为-芳基、-杂环或-碳环；
R20为-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基、-碳环、-O-(C1-C20烷基)、-O-(C2-C20烯基)、-O-(C2-C20炔基)或OR18，其中R18为-H、羟基保护基团或直接键，其中OR18代表＝O；且
R21为-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基或-C2-C20炔基、-芳基、-杂环或-碳环。
式(X-A)的奥里斯他汀包括其中所述烷基、烯基、炔基、亚烷基、亚烯基、亚炔基、芳基、碳环和杂环基团未经取代的那些。
式(X-A)的奥里斯他汀包括其中R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9基团未经取代且R19、R20和R21基团任选地如上文所描述经取代的那些。
式(X-A)的奥里斯他汀包括那些其中：
R2是-C1-C8烷基；
R3、R4和R7独立地选自-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基、单环C3-C6碳环、-C1-C20亚烷基(单环C3-C6碳环)、-C2-C20亚烯基(单环C3-C6碳环)、-C2-C20亚炔基(单环C3-C6碳环)、-C6-C10芳基、-C1-C20亚烷基(C6-C10芳基)、-C2-C20亚烯基(C6-C10芳基)、-C2-C20亚炔基(C6-C10芳基)、-杂环、-C1-C20亚烷基(杂环)、-C2-C20亚烯基(杂环)或-C2-C20亚炔基(杂环)；其中所述烷基、烯基、炔基、亚烷基、亚烯基、亚炔基、碳环、芳基和杂环基团任选地经取代；
R5是-氢；
R6是-C1-C8烷基；
每一R8独立地选自-OH、-O-(C1-C20烷基)、-O-(C2-C20烯基)或-O-(C2-C20炔基)，其中所述烷基、烯基和炔基任选地经取代；
R9是-氢或-C1-C8-烷基；
R19是任选地经取代的苯基；
R20是OR18；其中R18是H、羟基保护基团或直接键，其中OR18代表＝O；
R21选自-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基或-碳环；其中所述烷基、烯基、炔基和碳环基团任选地经取代；或其医药上可接受的盐形式。
式(X-A)的奥里斯他汀包括那些其中：
R2是甲基；
R3是-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基或-C2-C8炔基，其中所述烷基、烯基和炔基任选地经取代；
R4是-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、单环C3-C6碳环、-C6-C10芳基、-C1-C8亚烷基(C6-C10芳基)、-C2-C8亚烯基(C6-C10芳基)、-C2-C8亚炔基(C6-C10芳基)、-C1-C8亚烷基(单环C3-C6碳环)、-C2-C8亚烯基(单环C3-C6碳环)、-C2-C8亚炔基(单环C3-C6碳环)；其中所述烷基、烯基、炔基、亚烷基、亚烯基、亚炔基、芳基和碳环基团(无论单独还是作为另一基团的一部分)任选地经取代；
R5是H；R6是甲基；
R7是-C1-C8烷基、-C2-C8烯基或-C2-C8炔基；
每一R8是甲氧基；
R9是-氢或-C1-C8-烷基；
R19是苯基；
R20是OR18；其中R18是-H、羟基保护基团或直接键，其中OR18代表＝O；
R21是甲基；或其医药上可接受的盐形式。
式(X-A)的奥里斯他汀包括那些其中：R2是甲基；R3是H或C1-C3烷基；R4是C1-C5烷基；R5是H；R6是甲基；R7是异丙基或第二丁基；R8是甲氧基；R9是氢或C1-C8烷基；R19是苯基；R20是OR18；其中R18是H、羟基保护基团或直接键，其中OR18代表＝O；且R21是甲基；或其医药上可接受的盐形式。
式(X-A)的奥里斯他汀包括那些其中：R2是甲基或C1-C3烷基；R3是H或C1-C3烷基；R4是C1-C5烷基；R5是H；R6是C1-C3烷基；R7是C1-C5烷基；R8是C1-C3烷氧基；R9是氢或C1-C8烷基；R19是苯基；R20是OR18；其中R18是H、羟基保护基团或直接键，其中OR18代表＝O；且R21是C1-C3烷基；或其医药上可接受的盐形式。
在式(II)免疫结合物的优选实施例中，当Z是式(X-A)的奥里斯他汀分子，w为在1到12、优选地2到12范围内的整数，y为1或2，且a优选地为1。
说明性治疗剂(-Z)包括具有以下结构的那些：
在一些实施例中，治疗剂并非TZT-1027。在一些实施例中，治疗剂并非奥里斯他汀E、尾海兔素10或奥里斯他汀PE。
在一些实施例中，奥里斯他汀分子通过含有马来酰亚胺部分(例如马来酰亚氨基己酰基部分)的连接体连接到抗体分子上的半胱氨酸部分。
在一些其它实施例中，奥里斯他汀分子使用连结到奥里斯他汀分子上的单甲基氨基的异双功能连接体与抗体偶合。在一些实施例中，所述连接体包含可裂解部分(例如肽部分)和自牺牲对氨基苄基氨基甲酸酯间隔子。实例性连接体包括马来酰亚氨基己酰基(mc)、马来酰亚氨基己酰基-L-苯丙氨酸-L-赖氨酸-对-氨基苄基氨基甲酸酯和马来酰亚氨基己酰基-L-缬氨酸-L-瓜氨酸-对-氨基苄基氨基甲酸酯(vc)。
在某些实施例中，式(I)的免疫结合物的特征在于式Ab-(vc-MMAF)m(式(I-4))；Ab-(vc-MMAE)m(式(I-5))；Ab-(mc-MMAE)m(式(I-6))；或Ab-(mc-MMAF)m(式(I-7))，其中Ab是如本文所描述的抗GCC抗体分子，S是抗体的硫原子，且m具有上文针对式(I)所描述的各值和优选值。在某些实施例中，m为1到约5的整数。
在一些实施例中，式(I-4)、(I-5)、(I-6)或(I-7)中的变量Ab是具有表1到6中所汇总的一或多个特征的抗体分子。在某些实施例中，变量Ab是5F9抗体分子或Abx-229抗体分子。
在一些实施例中，式(I-4)、(I-5)、(I-6)或(I-7)中的变量m是在约2到约10、约6到约8或约4到约6的范围内。
在某些特定实施例中，本发明涉及式(I-4)、(I-5)、(I-6)或(I-7)的免疫结合物，其中Ab是5F9抗体分子且m为约4。
本文所揭示的免疫结合物可用于改变给定生物反应。治疗剂不应理解为限于经典化学治疗剂。例如，治疗剂可为具有所需生物活性的核酸、蛋白质或多肽。例如，抗体分子可与可干扰基因表达的反义分子、siRNA分子、shRNA分子或miRNA分子结合，从而产生所需生物作用。
本文所描述的抗GCC抗体分子还可与前药或前药激活剂结合。
医药组合物
在另一方面中，本发明特征为组合物(例如医药上可接受的组合物)、包含所述组合物的试剂盒和使用所述组合物的方法。所述组合物可包括与医药上可接受的载剂调配在一起的如本文中所描述的抗GCC抗体分子或其免疫结合物。在实施例中，抗GCC抗体分子是具有表1到6中所汇总的实例性特征者。
如本文所使用的“医药上可接受的载剂”包括任何和所有溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂和生理上相容的类似试剂。载剂可适于静脉内、肌内、皮下、非经肠、直肠、脊椎或表皮投予(例如通过注射或输注)。医药组合物可包括一或多种额外赋形剂，例如盐、缓冲液、张力改变剂、冻干保护剂、非离子型清洁剂、表面活性剂和防腐剂。
组合物可呈多种形式。这些形式包括(例如)液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液(例如，可注射和可输注溶液)、分散液或悬浮液、脂质体和栓剂。优选形式取决于预期投予模式和治疗应用。一些典型组合物呈打算用于非经肠投予(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌内)的可注射或可输注溶液形式。在一些实施例中，组合物是通过静脉内输注或注射来投予。在其它实施例中，组合物是通过肌内或皮下注射来投予。
如本文所使用的片语“非经肠投予”和“以非经肠方式投予”意指除经肠和局部投予以外的投予模式，通常是通过注射且包括(但不限于)静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心脏内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
在一些实施例中，医药组合物在制造和储存条件下无菌且稳定。可将组合物调配成溶液、微乳液、分散液、脂质体、微球体或其它适于高抗体浓度的规则结构。无菌可注射溶液可通过以下方式来制备：将所需量活性化合物(例如抗体、抗体部分或免疫结合物)纳入具有上文所列举成份中的一者或组合(根据需要)的适宜溶剂中，随后进行灭菌(例如通过过滤)。通常，通过将活性化合物纳入含有基本分散介质和来自上文所列举的那些的所需其它成份的无菌媒剂中来制备分散液。在使用无菌粉末来制备无菌可注射溶液的情形中，所提供的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其可从预先经无菌过滤的溶液产生由活性成份加上任一额外的所需成份构成的粉末。可通过(例如)使用诸如卵磷脂等包衣、通过维持所需粒径(在分散剂情形下)和通过使用表面活性剂来维持溶液的恰当流动性。通过向组合物中纳入延迟吸收的药剂(例如，单硬脂酸盐和明胶)可使可注射组合物的吸收延长。
本文所描述的抗体分子和免疫结合物可通过本技术领域内已知的多种方法来投予，但对于许多治疗应用来说，投予途径/模式是静脉内注射或输注。如所属领域技术人员应了解，投予途径和/或模式可视所需结果而变化。在某些实施例中，活性化合物可用可防止所述化合物快速释放的载剂(例如受控释放调配物，包括植入物、经皮贴剂和微囊化递送系统)来制备。可使用生物可降解的生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备所述调配物的许多方法已获得专利权或通常为所属领域技术人员已知。例如参见持续和受控释放药物递送系统(SustainedandControlledReleaseDrugDeliverySystems)，J.R.罗宾逊(J.R.Robinson)编辑，马塞尔德克尔公司(MarcelDekker,Inc.)，纽约，1978。
在某些实施例中，本文所描述的抗GCC抗体分子或免疫结合物可经口投予，例如利用惰性稀释剂或可吸收食用载剂投予。化合物(和其它成份，若需要)还可包封于硬壳或软壳明胶胶囊中、压制成锭剂、口颊锭、口含锭、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、薄片等。为通过除非经肠投予以外的途径投予本文中所描述的抗体分子或免疫结合物，可能需要用材料包覆所述化合物或与其共投予所述化合物以防止其失活。
治疗性组合物可利用本技术领域内已知的医学装置投予。例如，可将医药制剂置于装置(例如含有一或多个剂量的气密或液密容器)内。递送装置的实例包括(但不限于)小瓶、套管、针、滴袋和管线。本发明还提供将本文所描述的抗体分子或免疫结合物置于此一装置中的方法。
在一些实施例中，本发明提供本文所描述的调配于脂质体组合物中的抗GCC抗体分子或免疫结合物。在一些实施例中，脂质体包覆有抗体分子。在一些所述实施中，脂质体填充有治疗剂。脂质体递送可允许递送未连接到抗体的药剂(例如治疗剂)。此方法可用于递送不适于与抗体分子交联的药剂(例如治疗剂)，或应使欲隔绝或与非标靶细胞接触的药剂(例如治疗剂)最小化。在特定实施例中，脂质体填充有细胞抑制剂或细胞毒性剂。在某些特定实施例中，治疗剂选自由类美登素、奥里斯他汀、尾海兔素、多卡米星、念珠藻素、紫杉烷、DNA烷化剂、卡奇霉素和前述的衍生物组成的群组。在其它实施例中，脂质体填充有包含RNA干扰分子(例如反义分子、siRNA、hsRNA或miRNA分子，其能够减少GCC表达细胞中的GCC表达或另一基因(例如致癌基因)的表达)的核酸序列。在一些其它实施例中，脂质体包覆或填充有包含抗GCC抗体分子和治疗剂或标记的免疫结合物。
可对剂量方案加以调节以提供最佳所需反应(例如，治疗反应)。例如，可投予本文所描述的抗GCC抗体分子或免疫结合物的单一浓注，可随时间投予数个分开剂量，或可根据治疗情况紧急状态所指示按比例减少或增加剂量。将非经肠组合物调配成单位剂型尤其有利于方便投予和剂量一致性。如本文所使用的“单位剂型”是指适宜作为单位剂量用于欲治疗个体的物理离散单位；各单位含有经计算以产生所需治疗作用的预定量的活性化合物与所需医药载剂。本发明单位剂型的规格依赖于且直接取决于下列因素：(a)活性化合物的独特特征和欲实现的特定治疗作用，和(b)复合此一活性化合物以治疗个体敏感性的技术中所固有的限制条件。
本发明的抗GCC抗体分子或免疫结合物的治疗上或预防上有效量的实例性、非限制性范围为0.1mg/kg到20mg/kg或1mg/kg到10mg/kg。在一特定实施例中，本发明的抗GCC抗体分子或免疫结合物的治疗上或预防上有效量是在大约1.8mg/kg到3.5mg/kg的范围内或为所述范围间的任何具体值，例如1.8mg/kg、1.9mg/kg、2.0mg/kg、2.1mg/kg、2.2mg/kg、2.3mg/kg、2.4mg/kg、2.5mg/kg、2.6mg/kg、2.7mg/kg、2.8mg/kg、2.9mg/kg、3.0mg/kg、3.1mg/kg、3.2mg/kg、3.3mg/kg、3.4mg/kg或3.5mg/kg。在一些实施例中，抗GCC抗体分子或其免疫结合物是以高到足以实现与第二治疗剂(例如DNA破坏剂)的协同作用的剂量投予。应注意，剂量值可随欲缓解病状的类型和严重性而变化。应进一步了解，对于任一特定个体来说，应根据个体需要和投予组合物或监督组合物投予的个人的专业判断随时间调节具体剂量方案，且本文所述剂量范围仅为举例说明且并非打算限制所主张组合物的范围或实践。
本发明的医药组合物可包括“治疗有效”量的本发明抗GCC抗体分子或免疫结合物。“治疗有效”量是指在所需时期内以所需剂量有效地实现所需治疗作用的量。抗体分子或免疫结合物的治疗有效量可根据诸如下列因素而变化：个体的疾病状态、年龄、性别和体重、以及抗体分子或免疫结合物于所述个体内引发所需反应的能力。治疗有效量还为抗体分子或免疫结合物的治疗有益作用胜过其任何毒性或有害作用的量。相对于未治疗的个体，“治疗上有效剂量”优选地将所治疗个体的可测量参数(例如肿瘤负荷和/或肿瘤生长速率)抑制至少约20％、至少约40％、至少约60％且在一些实施例中至少约80％。可在预测于人类肿瘤中的效力的动物模型系统中评价化合物抑制可测量参数(例如癌症)的能力。另一选择为，组合物的此性质可通过所属领域技术人员已知的分析检查化合物的抑制能力(例如活体外抑制)来评价。
在另一方面中，本发明特征为组合物，例如医药上可接受的组合物，其包括与额外治疗剂和医药上可接受的载剂调配在一起的如本文中所描述的抗GCC抗体分子或其免疫结合物。抗GCC抗体分子或其免疫结合物和额外治疗剂在组合使用时是以治疗上有效量提供。在某些实施例中，额外治疗剂是DNA破坏剂，包括(例如)拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、烷化剂、类烷化剂、蒽环、DNA嵌入剂、DNA小沟烷化剂和抗代谢物。各所述DNA破坏剂的特定实例描述于本文中。抗GCC抗体分子可为具有表1到6中所汇总的实例性特征者。
在某些实施例中，本发明特征为医药上可接受的组合物，其包括如本文中所描述的式(I-4)、(I-5)、(I-6)或(I-7)的免疫结合物和拓扑异构酶I抑制剂，其中本文中所描述的变量Ab是例如具有表1到6中的一或多者中所描述的实例性特征的抗GCC抗体分子，其中免疫结合物和拓扑异构酶I抑制剂中的每一者是以治疗上有效总量存在。例如(但不限于)，医药上可接受的组合物包括式I-5的免疫结合物和伊立替康，其中变量Ab是5F9抗体分子且m为约4。
在某些实施例中，本发明的免疫结合物可与DNA破坏剂的组合调配成单位剂量形式以便于投予和剂量一致性。如本文所使用的表述“单位剂型”是指适于欲治疗患者的药剂的物理离散单位。然而，应理解，本发明组合物的总日用量应由主治医生在合理医学判断范围内确定。在特定实施例中，免疫结合物和DNA破坏剂的单位剂型为适于非经肠投予的液体溶液或悬浮液。在另一特定实施例中，免疫结合物和DNA破坏剂的单位剂型是冻干的且在再悬浮(例如于医药上可接受的载剂中)后适于非经肠投予。用于非经肠投予的单位剂型可在安瓿或多剂量容器中。
包含如本文中所描述的抗GCC抗体分子或免疫结合物的试剂盒也在本发明范围内。进一步包括含有包含抗GCC抗体分子或免疫结合物的脂质体组合物的试剂盒。试剂盒可包括一或多种其它要素，包括：使用说明书；其它试剂，例如标记、治疗剂或可用于使抗体与标记或治疗剂螯合或以其它方式偶合的药剂或放射保护组合物；用于制备供投予抗体的装置或其它材料；医药上可接受的载剂；和用于向个体投予用于(例如)治疗或诊断用途的装置或其它材料。使用说明书可包括用于抗GCC抗体分子或其它分子(例如肽)的活体外(例如在样品中，例如来自患有癌症的患者的生检或细胞)或活体内检测GCC的诊断应用的说明书。说明书可包括关于治疗应用的指导，包括建议在(例如)患有癌症(例如胃肠源癌症，例如结肠癌、胃癌、食道癌)的患者中的投予剂量和/或模式。其它说明书可包括关于抗体与治疗剂偶合或关于从(例如)未反应结合组份纯化所结合抗体的说明书。如上文所论述，试剂盒可包括标记，例如上文所描述的任一标记。如上文所论述，试剂盒可包括治疗剂，例如本文所描述的治疗剂。在一些应用中，抗体将与其它组份(例如螯合剂或标记或治疗剂，例如放射性同位素，例如钇或镥)反应。在所述情形下，试剂盒可包括实施反应的反应器皿或用于从起始材料或反应中间体分离最终产物的分离装置(例如色谱柱)中的一或多者。
试剂盒可进一步含有至少一种额外试剂(例如诊断或治疗剂，例如本文所描述的诊断或治疗剂)和/或一或多种额外抗GCC抗体分子或免疫结合物，其适宜时调配于一或多种单独医药制剂中或调配成单一剂型。
在某些实施例中，试剂盒含有如本文所描述特征在于式(I-4)、(I-5)、(I-6)或(I-7)的免疫结合物，其中变量Ab是具有表1到6中所汇总的实例性特征的抗GCC抗体分子；和关于治疗应用的说明书，其包括在(例如)患有癌症(例如胃肠源的原发性或转移性癌症，例如结肠癌、胃癌、胰脏癌或食道癌)的患者中投予免疫结合物与DNA破坏剂的组合的建议剂量和/或模式。任选地，试剂盒进一步含有与免疫结合物组合使用的DNA破坏剂的单独医药制剂。适于与免疫结合物组合使用的DNA破坏剂的实例包括(例如)拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、烷化剂、类烷化剂、蒽环、DNA嵌入剂、DNA小沟烷化剂和抗代谢物，且各所述DNA破坏剂的特定实例描述于本文中。例如(但不限于)，试剂盒含有如本文中所描述的式(I-5)免疫结合物的医药制剂，其中变量Ab是5F9抗体分子且m为约4；和关于治疗应用的说明书，其包括投予免疫结合物与拓扑异构酶I抑制剂(例如伊立替康)的组合的建议剂量和/或模式。任选地，试剂盒进一步含有与免疫结合物组合使用的拓扑异构酶I抑制剂的单独医药制剂。
作为另一实例(但不限于)，试剂盒可含有式(I-5)免疫结合物的医药制剂，其中变量Ab是5F9抗体分子且m为约4；和DNA破坏剂，例如拓扑异构酶I抑制剂(例如伊立替康)或DNA小沟烷化剂(例如多卡米星(例如CC-1065)或其任何类似物或衍生物；吡咯并苯并二氮呯或其任何类似物或衍生物)，其中免疫结合物和DNA破坏剂经共调配(例如单一剂型)；和关于治疗应用的说明书，其包括于(例如)患有癌症(例如胃肠源的原发性或转移性癌症，例如结肠癌、胃癌、胰脏癌或食道癌)的患者中的给药时间表和投予模式。
所提供试剂盒可包括用于向患者投予的具有治疗性放射性同位素的螯合剂结合的蛋白质或肽。试剂盒可包括(i)含有螯合剂结合抗体的小瓶，(ii)含有用于稳定经放射性标记的抗体并向患者投予其的调配缓冲液的小瓶，和(iii)关于执行放射性标记程序的说明书。试剂盒提供在良好条件(例如如说明书中所推荐)下使螯合剂结合抗体于放射性同位素或其盐中暴露足量时间。产生具有足够纯度、特异性活性和结合特异性的经放射性标记的抗体。可将经放射性标记的抗体于(例如)调配缓冲液中稀释到适当浓度，并在进行或不进行进一步纯化的情况下直接投予患者。螯合剂结合抗体可以冻干形式供应。
用途
本文所描述的抗GCC抗体分子具有活体外和活体内治疗和预防效用。例如，可向培养中的细胞中(例如活体外或离体)投予所这些抗体分子，或于个体中(例如活体内)投予以治疗、预防和/或诊断多种病症。
本文中所描述的抗体分子和免疫结合物可调节GCC蛋白的活性或功能，例如配体结合(例如ST或鸟苷素的结合)、GCC调介的信号转导、维持肠液、电解质体内恒定、细胞内钙释放(钙通量)、细胞分化、细胞增殖或细胞激活。
在一方面中，本发明特征为杀伤GCC表达细胞、抑制或调节其生长或干扰其代谢的方法。在一实施例中，本发明提供抑制GCC调介的细胞信号传导的方法或杀伤细胞的方法。所述方法可利用表达GCC的任何细胞或组织来使用，例如癌性细胞(例如来自胃肠系统癌症(例如结肠癌、胃癌、胰脏癌或食道癌)的细胞)或转移性病灶。GCC表达细胞的非限制性实例包括T84人类结肠腺癌细胞、新鲜或冷冻的结肠肿瘤细胞和包含编码GCC的重组核酸或其部分的细胞。
本发明方法包括使细胞与有效量(即足以抑制GCC调介的细胞信号传导的量或足以杀伤细胞的量)的如本文中所描述的抗GCC抗体分子或其免疫结合物接触的步骤。可对培养中的GCC表达细胞上使用所述方法，例如活体外、离体或原位。例如，可于培养基中活体外培养表达GCC的细胞(例如通过肿瘤或转移性病灶的生检收集的细胞；来自已确定癌细胞系的细胞；或重组细胞)，且接触步骤可通过将抗GCC抗体分子或免疫结合物添加到培养基中来实现。在杀伤细胞的方法中，所述方法包含使用裸抗GCC抗体分子或包含抗GCC抗体分子和细胞毒性剂(例如DNA破坏剂)的免疫结合物。所述方法将杀伤表达GCC的细胞，包括(特定来说)表达GCC的肿瘤细胞(例如结肠肿瘤细胞)。
本发明的抗GCC抗体分子于表达GCC的细胞中结合到所述抗原的细胞外结构域或其部分。因此，当实践本发明方法来杀伤和/或阻抑癌性细胞时，抗体分子结合到所有所述细胞，而非仅结合到所固定的细胞或细胞内抗原结构域原本暴露于细胞外环境中的细胞。因此，抗体分子的结合集中在存在表达GCC的细胞(不管这些细胞经固定还是未经固定、有活力还是坏死)的区域。另外或另一选择为，抗GCC抗体分子结合到GCC并在结合表达GCC的细胞后与所述抗原一起内化。
表7指示经确认在结合GCC后内化的抗体分子。此抗体在(例如)连接到细胞毒性部分时可用于治疗用途。
所述方法还可于个体中所存在的细胞上执行，作为活体内方案的一部分。在一实施例中，个体是人类个体。另一选择为，个体可为表达与本文中所揭示的抗GCC抗体分子交叉反应的GCC抗原的非人类哺乳动物。在某些实施例中，个体是具有所移植人类组织的非人类哺乳动物(即异种移植物模型)。可向人类个体投予抗GCC抗体分子或其免疫结合物与DNA破坏剂的组合用于治疗目的。还可向表达与抗体交叉反应的GCC样抗原的非人类哺乳动物(例如灵长类动物、猪、大鼠或小鼠)投予抗GCC抗体分子或免疫结合物与DNA破坏剂的组合用于兽医目的或作为人类疾病的动物模型(例如源自转移性结肠直肠癌患者的原发性人类肿瘤移出物的异种移植物模型)。动物模型可用于评价本文中所描述的抗GCC抗体或免疫结合物和本文中所描述的DNA破坏剂组合的治疗效力(例如测试投予的剂量和时程)。对于活体内实施例，接触步骤是于个体中实现，并包括在有效地容许抗体分子结合到细胞上所表达的GCC的细胞外结构域和治疗细胞二者的条件下向个体投予抗GCC抗体分子或其免疫结合物与DNA破坏剂的组合。在一些实施例中，所述疗法导致一或多种来自本文列表1的治疗作用，例如协同作用、在结束投予后防止肿瘤再生长或对肿瘤对免疫结合物或DNA破坏剂的抗性的作用中的一或多者。
在一些实施例中，免疫结合物(例如式(I-5)免疫结合物，任选地含有包含表5的CDR的Ab)与DNA破坏剂的组合产生列表1的治疗作用中的一或多者(例如2者、3者、4者、5者、6者、7者、8者或9者，例如全部)：
(a)相对于单独免疫结合物或DNA破坏剂的作用产生协同反应，其中所述反应任选地为肿瘤生长抑制(TGI)或肿瘤生长延迟(TGD)(例如防止肿瘤生长或再生长)；
(b)相对于单独免疫结合物或DNA破坏剂产生累加反应，其中所述反应任选地为TGI或TGD(例如防止肿瘤生长或再生长)；
(c)产生在结束免疫结合物、DNA破坏剂或二者的投予后持续至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周或10周或更长时间的TGI或TGD(例如防止肿瘤生长或再生长)；
(d)于展示相对较高、中等或较低的GCC抗原密度的癌症中导致TGI或TGD(例如防止肿瘤生长或再生长)，例如协同TGI或TGD；
(e)于当单独投予(即作为单一药剂治疗剂)时对免疫结合物展示强、中等到强或中等敏感性的癌症中导致协同TGI或TGD(例如防止肿瘤生长或再生长)；
(f)于当单独投予(即作为单一药剂治疗剂)时对免疫结合物展示抗性的癌症中导致TGI或TGD(例如防止肿瘤生长或再生长)；
(g)于当单独投予(即作为单一药剂治疗剂)时对DNA破坏剂展示敏感性的癌症中导致协同TGI或TGD(例如防止肿瘤生长或再生长)；
(h)于当单独投予(即作为单一药剂治疗剂)时对DNA破坏剂展示抗性的癌症中导致TGI或TGD(例如防止肿瘤生长或再生长)；和
(i)在投予所述疗法后抑制肿瘤生长。
在一实施例中，本发明提供治疗癌症的方法，其是通过向需要所述治疗的患者投予抗GCC抗体分子或包含抗GCC抗体分子和细胞毒性剂的免疫结合物与DNA破坏剂的组合来实现。所述方法可用于(例如)治疗包括至少一些表达GCC抗原的细胞的任何癌性病症。如本文所使用的术语“癌症”打算包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移性组织或经恶性转化的细胞、组织或器官(不管何种组织病理类型或侵袭阶段)。术语“癌症”和“肿瘤”可互换使用(例如当在治疗方法的上下文中使用时，“癌症治疗”和“肿瘤治疗”具有相同含义)。
在实施例中，所述治疗足以减少或抑制个体肿瘤的生长、减少或抑制在投予所述治疗后个体肿瘤的再生长、减少转移性病灶的数量或减小其大小、减少肿瘤负载、减少原发性肿瘤负载、减少侵袭、延长存活时间或维持或改良生活质量。
癌性病症的实例包括(但不限于)实体肿瘤、软组织肿瘤和转移性病灶。实体肿瘤的实例包括各种器官系统(例如影响结肠的那些)的恶性肿瘤，例如肉瘤、腺癌和癌。腺癌包括恶性肿瘤，例如肺非小细胞癌。还可使用本发明的方法和组合物治疗或预防上述癌症的转移性病灶。在一些实施例中，欲治疗的癌症为胃肠系统的癌症(例如原发性或转移性结肠直肠癌、胃癌、胰脏癌或食道癌)。在一些实施例中，所述疗法产生一或多种来自本文列表1的对上述癌症类型中的一者的治疗作用，例如以下中的一或多者：(a)协同作用，(c)在结束投予后防止肿瘤再生长，或对肿瘤对免疫结合物(f)或DNA破坏剂(h)的抗性的作用，或(i)在投予所述疗法后抑制肿瘤生长。
在一实施例中，所述癌症是结肠直肠癌，例如结肠直肠腺癌、结肠直肠平滑肌肉瘤、结肠直肠淋巴瘤、结肠直肠黑色素瘤或结肠直肠神经内分泌肿瘤。在特定实施例中，所述癌症是转移性结肠癌。在另一实施例中，所述癌症是胃癌(例如胃腺癌、淋巴瘤或肉瘤)或其转移。在另一实施例中，所述癌症是食道癌(例如食道的鳞状细胞癌或腺癌)。在一些实施例中，所述疗法产生一或多种来自本文列表1的对上述癌症类型中的一者的治疗作用，例如以下中的一或多者：(a)协同作用，(c)在结束投予后防止肿瘤再生长，对肿瘤对免疫结合物(f)或DNA破坏剂(h)的抗性的作用，或(i)在投予所述疗法后抑制肿瘤生长。
本发明方法可用于治疗任何阶段或子分类的相关病症。例如，方法可用于治疗早期或晚期结肠癌或阶段0、I、IIA、IIB、IIIA、IIIB、IIIC和IV中的任一者的结肠癌。
在一些实施例中，治疗癌症(例如原发性或转移性结肠直肠癌、胃癌、胰脏癌或食道癌)的方法包含向需要所述治疗的患者投予本文中所描述的裸抗GCC抗体分子。在其它实施例中，所述方法包含投予包含本文中所描述的抗GCC抗体分子和细胞毒性剂的免疫结合物与DNA破坏剂的组合。在一些所述实施中，免疫结合物的特征在于如本文中所描述的式(I)。在某些实施例中，免疫结合物的特征在于如本文中所描述的式(I-1)、(I-2)、(I-3)、(I-4)、(I-5)、(I-6)或(I-7)。在特定实施例中，免疫结合物的特征在于式(I)、(I-1)、(I-2)、(I-3)、(I-4)、(I-5)、(I-6)或(I-7)，其中变量Ab是具有表1到6中所汇总的特征的抗体分子。在某些实施例中，变量Ab是5F9抗体分子。在某些特定实施例中，免疫结合物的特征在于式(I-5)或(I-6)，其中变量Ab是本文中所描述的抗GCC抗体分子，例如5F9抗体分子。在一些实施例中，所述疗法产生一或多种来自本文列表1的治疗作用，例如以下中的一或多者：(a)协同作用，(c)在结束投予后防止肿瘤再生长，对肿瘤对免疫结合物(f)或DNA破坏剂(h)的抗性的作用，或(i)在投予所述疗法后抑制肿瘤生长。
投予抗体分子和免疫结合物的方法描述于上文。所用分子的适宜剂量将取决于个体的年龄和体重以及所用的特定化合物。
在一些实施例中，以治疗周期形式投予抗GCC抗体分子或免疫结合物和DNA破坏剂。“治疗周期”是由治疗期(在此期间如上文所描述投予抗GCC抗体分子或免疫结合物和DNA破坏剂)、然后停药期(在此期间不投予抗GCC抗体分子或免疫结合物或DNA破坏剂)组成。可视需要重复所述治疗周期以实现所需作用。在一些实施例中，所需作用是一或多种来自本文列表1的治疗作用，例如以下中的一或多者：(a)协同作用，(c)在结束投予后防止肿瘤再生长，对肿瘤对免疫结合物(f)或DNA破坏剂(h)的抗性的作用，或(i)在投予所述疗法后抑制肿瘤生长。
本文中所描述的疗法(例如抗GCC免疫结合物与DNA破坏剂的组合)可与其它疗法组合使用。例如，所述组合疗法可包括本发明组合物与一或多种额外治疗剂(例如一或多种抗癌剂(例如细胞毒性剂或细胞抑制剂)、激素治疗、疫苗和/或其它免疫疗法)共调配和/或共投予。在其它实施例中，抗GCC免疫结合物与DNA破坏剂的组合是与其它治疗性治疗方式(包括手术、辐射、低温手术和/或热疗法)组合投予。所述组合疗法可有利地利用较低剂量的所投予治疗剂，由此避免与各种单一疗法相关的可能毒性或并发症。所述组合疗法还可克服和/或预防对常规治疗方案的化学抗性。
如本文所使用的“组合”投予意指，在个体罹患病症期间将两种(或更多种)不同治疗递送到个体，例如在个体已经诊断患有病症之后并在病症已治愈或消除之前递送所述两种或更多种治疗剂。在一些实施例中，一种治疗在开始递送第二种时仍进行递送，以使得存在重叠。此在本文中有时称为“同时”或“相伴”或“并行递送”。在其它实施例中，一种治疗在开始递送另一种治疗之前结束递送。此在本文中有时称为“相继”或“依序递送”。在任一情形的实施例中，所述治疗因组合投予而更有效。例如，第二种治疗更有效，例如利用较少第二治疗即可见等效作用，或与在不存在第一治疗的情况下投予第二治疗时可见相比，第二治疗在更大程度上减轻症状，或利用第一治疗可见类似情况。在一些实施例中，递送使得症状或与病症相关的其它参数的减轻程度比利用在不存在另一种治疗的情况下递送一种治疗所观察到的减轻程度更高。两种治疗剂的作用可部分累加、完全累加或超过累加(即协同的)。递送可使得当递送第二治疗时仍可检测所递送的第一治疗的作用。
在一些实施例中，与另一治疗剂(例如化学治疗剂)组合使用抗GCC抗体分子或其免疫结合物(例如式(I-5)的免疫结合物，其中抗GCC抗体任选地包含表5的CDR)。DNA破坏化学治疗剂的非限制性实例包括拓扑异构酶I抑制剂(例如伊立替康、拓扑替康、SN-38、片螺素D或喜树碱)；拓扑异构酶II抑制剂(例如依托泊苷、替尼泊苷、安吖啶或米托蒽醌)；蒽环(例如道诺霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星或戊柔比星)；烷化剂(例如美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、噻替哌、依弗酰胺、卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、链脲霉素、达卡巴嗪、丝裂霉素C、环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、乌拉莫司汀、二溴甘露醇、四硝酸酯、丙卡巴肼、六甲蜜胺、米托唑胺或替莫唑胺)；类烷化剂(例如顺铂、奥沙利铂、卡铂、奈达铂、沙铂或三铂)；DNA嵌入剂和自由基发生剂(例如博来霉素)；DNA小沟烷化剂(例如多卡米星(例如CC-1065)和其类似物或衍生物；吡咯并苯并二氮呯或其任何类似物或衍生物)；和抗代谢物(例如氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷(5-FUdR)、甲氨蝶呤、甲酰四氢叶酸、羟基脲、硫鸟嘌呤(6-TG)、巯嘌呤(6-MP)、阿糖胞苷、喷司他汀、磷酸氟达拉滨、克拉屈滨(2-CDA)、天冬酰胺酶、吉西他滨、卡培他滨、硫唑嘌呤、胞嘧啶甲氨蝶呤、甲氧苄啶、乙胺嘧啶或培美曲塞)。在一些实施例中，所述疗法产生一或多种来自本文列表1的治疗作用，例如以下中的一或多者：(a)协同作用，(c)在结束投予后防止肿瘤再生长，对肿瘤对免疫结合物(f)或DNA破坏剂(h)的抗性的作用，或(i)在投予所述疗法后抑制肿瘤生长。
在一些实施例中，与伊立替康组合投予免疫结合物，且产生协同效力。
在一些实施例中，与5-氟尿嘧啶组合投予免疫结合物，且产生协同效力。
在一些实施例中，与伊立替康组合投予免疫结合物来治疗对单独免疫结合物具有抗性的癌症，且产生治疗效力。
破坏细胞复制的化学治疗剂(即微管解聚合或稳定剂)包括(但不限于)：紫杉烷，例如太平洋紫杉醇、多西他赛和相关类似物；长春花生物碱，例如长春花碱、长春新碱、长春瑞滨、长春地辛和长春氟宁和相关类似物；埃博霉素(epothilone)，例如埃博霉素B、伊沙匹隆(ixabepilone)和相关类似物；软海绵素(halichondrin)，例如软海绵素B和相关类似物；秋水仙素位点结合剂，例如秋水仙素；沙利度胺(thalidomide)、雷那度胺(lenalidomide)和相关类似物(例如CC-5013和CC-4047)；蛋白质酪氨酸激酶抑制剂(例如甲磺酸伊马替尼(imatinibmesylate)和吉非替尼(gefitinib))；蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米(bortezomib))；NF-κB抑制剂，包括IκB激酶的抑制剂；结合到在癌症中过度表达的蛋白质且由此下调细胞复制的抗体(例如曲妥珠单抗(trastuzumab)、利妥昔单抗(rituximab)、西妥昔单抗(cetuximab)和贝伐珠单抗(bevacizumab))；和已知于癌症中上调、过度表达或激活的蛋白质或酶的其它抑制剂(其抑制下调细胞复制)。
与本发明的抗GCC抗体分子或免疫结合物组合的治疗剂或治疗方式的选择将取决于欲治疗的病症和所述病症对特定治疗剂的敏感性。额外药剂或治疗方式可包括(例如)针对所治疗适应症的标准批准疗法。例如，当使用抗GCC抗体分子或其免疫结合物(例如式(I-5)的免疫结合物)治疗结肠癌时，其可与(例如手术；辐射疗法)组合使用；与以下共投予：5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他滨、甲酰四氢叶酸、伊立替康(CPT-11)、奥沙利铂、顺铂、贝伐珠单抗、西妥昔单抗或帕尼单抗(panitumub)或上文所列示药剂中的任一者的组合(例如奥沙利铂/卡培他滨(XELOX)、5-氟尿嘧啶/甲酰四氢叶酸/奥沙利铂(FOLFOX)、5-氟尿嘧啶/甲酰四氢叶酸/伊立替康(FOLFIRI)、FOLFOX加贝伐珠单抗或FOLFIRI加贝伐珠单抗。作为额外实例，当使用抗GCC抗体分子或其免疫结合物(例如式(I-5)免疫结合物)治疗胰脏癌时，其可与吉西他滨组合使用(例如共投予)。在一些实施例中，所述疗法产生一或多种来自本文列表1的治疗作用，例如以下中的一或多者：(a)协同作用，(c)在结束投予后防止肿瘤再生长，对肿瘤对免疫结合物(f)或DNA破坏剂(h)的抗性的作用，或(i)在投予所述疗法后抑制肿瘤生长。
已展示，某些胃肠肿瘤固有地对某些化学治疗剂(例如微管破坏剂太平洋紫杉醇和长春新碱)具有抗性或获得对其的抗性。目前，紫杉烷已不能在结肠直肠癌(CRC)的II期试验中展示显著临床益处(例如参见斯万顿(Swanton)等人，细胞周期(CellCycle.)2006年4月；5(8):818-23)。不希望受理论限制，此疾病中染色体不稳定的高发生率以及纺锤体查核点调控剂在活体内的变化可解释与用于CRC的基于紫杉烷的疗法相关的令人失望的结果。将另一强效微管破坏剂MMAE用于若干目前处于各种癌症治疗的临床研究中的靶向治疗剂中，包括目前处于结肠直肠癌治疗的I期调查中的与MMAE结合的抗GCC抗体分子。下文实例6在若干源自原发性人类结肠直肠肿瘤的肿瘤异种移植物模型中展示对包含与MMAE(强效微管抑制剂)结合的本发明抗GCC分子的免疫结合物的敏感性。实例6还在至少一种源自原发性人类结肠直肠肿瘤的肿瘤异种移植物模型中展示对相同抗GCCmAb-MMAE免疫结合物的化学抗性。意外地，抗GCCmAb-MMAE免疫结合物和DNA破坏剂的共投予使难治性肿瘤模型对DNA破坏剂的抗肿瘤活性敏感。
因此，本发明提供治疗胃肠癌的方法，其是通过投予特征在于如本文中所描述的式(I-4)、(I-5)、(I-6)或(I-7)的免疫结合物与DNA破坏剂的组合来实现，其中变量Ab是本文中所描述的抗体分子，例如具有表1到6中所汇总特征中的一或多者的抗体分子。在一些实施例中，所述疗法产生一或多种来自本文列表1的治疗作用，例如以下中的一或多者：(a)协同作用，(c)在结束投予后防止肿瘤再生长，对肿瘤对免疫结合物(f)或DNA破坏剂(h)的抗性的作用，或(i)在投予所述疗法后抑制肿瘤生长。
在特定实施例中，与DNA破坏剂组合投予的免疫结合物的特征在于式(I-5)。例如(但不限于)，本发明提供治疗原发性或转移性结肠直肠癌、胃癌、胰脏癌或食道癌的方法，其是通过共投予式(I-5)的免疫结合物和拓扑异构酶I抑制剂来实现，其中变量Ab是本文中所描述的抗GCC抗体分子(例如5F9抗体分子)，且m为约4，其中免疫结合物和拓扑异构酶I抑制剂中的每一者是以治疗上有效总量投予。在特定实施例中，拓扑异构酶I抑制剂是伊立替康，且式(I-5)的免疫结合物是与伊立替康组合投予来治疗原发性或转移性结肠直肠癌。在一些实施例中，所述疗法产生一或多种来自本文列表1的治疗作用，例如以下中的一或多者：(a)协同作用，(c)在结束投予后防止肿瘤再生长，对肿瘤对免疫结合物(f)或DNA破坏剂(h)的抗性的作用，或(i)在投予所述疗法后抑制肿瘤生长。
本发明进一步提供治疗原发性或转移性结肠直肠癌、胃癌、胰脏癌或食道癌的方法，其是通过共投予式(I-5)的免疫结合物和类烷化剂来实现，其中变量Ab是本文中所描述的抗GCC抗体分子(例如5F9抗体分子)，且m为约4，其中免疫结合物和类烷化剂中的每一者是以治疗上有效总量投予。在特定实施例中，所述类烷化剂是奥沙利铂或顺铂，且式(I-5)的免疫结合物是与奥沙利铂或顺铂组合投予来治疗原发性或转移性结肠直肠癌。在一些实施例中，所述疗法产生一或多种来自本文列表1的治疗作用，例如以下中的一或多者：(a)协同作用，(c)在结束投予后防止肿瘤再生长，对肿瘤对免疫结合物(f)或DNA破坏剂(h)的抗性的作用，或(i)在投予所述疗法后抑制肿瘤生长。
本发明甚至进一步提供治疗原发性或转移性结肠直肠癌、胃癌、胰脏癌或食道癌的方法，其是通过共投予式(I-5)的免疫结合物和抗代谢物来实现，其中变量Ab是本文中所描述的抗GCC抗体分子(例如5F9抗体分子)，且m为约4，其中免疫结合物和抗代谢物中的每一者是以治疗上有效总量投予。在特定实施例中，所述抗代谢物是吉西他滨，且式(I-5)的免疫结合物是与吉西他滨组合投予来治疗原发性或转移性胰脏癌。在一些实施例中，所述疗法产生一或多种来自本文列表1的治疗作用，例如以下中的一或多者：(a)协同作用，(c)在结束投予后防止肿瘤再生长，对肿瘤对免疫结合物(f)或DNA破坏剂(h)的抗性的作用，或(i)在投予所述疗法后抑制肿瘤生长。
本发明的免疫结合物(例如式(I-5)的免疫结合物，任选地包含表5的CDR)可与DNA破坏剂以单独调配物或以单一剂型投予。在一实施例中，当以单独剂型投予时，可在投予DNA破坏剂之前、同时或之后投予免疫结合物。在另一实施例中，当以单独剂型投予时，可在DNA破坏剂之前投予一或多个剂量的免疫结合物。在另一实施例中，当以单独剂型投予时，可在免疫结合物之前投予一或多个剂量的DNA破坏剂。在一些实施例中，所述疗法产生一或多种来自本文列表1的治疗作用，例如以下中的一或多者：(a)协同作用，(c)在结束投予后防止肿瘤再生长，或对肿瘤对免疫结合物(f)或DNA破坏剂(h)的抗性的作用，或(i)在投予所述疗法后抑制肿瘤生长。
在本发明的方法中，可在向患有胃肠癌的患者投予DNA破坏剂之前(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周前)、与其相伴或在其之后(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周后)投予如本文中所描述的免疫结合物。在一些实施例中，在同一次患者拜访中投予免疫结合物和DNA破坏剂。在一些实施例中，所述疗法产生一或多种来自本文列表1的治疗作用，例如以下中的一或多者：(a)协同作用，(c)在结束投予后防止肿瘤再生长，对肿瘤对免疫结合物(f)或DNA破坏剂(h)的抗性的作用，或(i)在投予所述疗法后抑制肿瘤生长。
在一些实施例中，按顺序且在时间间隔内向患者(例如哺乳动物，例如人类)投予免疫结合物(例如式(I-5)的免疫结合物，任选地包含具有表5的CDR的Ab)和DNA破坏剂，使得本文中所提供的第一药剂可与第二药剂一起起作用以提供比以其它方式投予其时更大的益处。例如，免疫结合物和DNA破坏剂可同时或以任一顺序在不同时间点依序投予；然而，若不同时投予，则其应在时间上足够接近地投予以提供所需治疗或预防作用。在一实施例中，免疫结合物和DNA破坏剂在重叠时间处发挥其作用。在一些实施例中，免疫结合物和DNA破坏剂各自以任何适当形式并通过任何适宜途径单独投予。在其它实施例中，免疫结合物和DNA破坏剂可以单一剂型同时投予。在一些实施例中，所述疗法产生一或多种来自本文列表1的治疗作用，例如以下中的一或多者：(a)协同作用，(c)在结束投予后防止肿瘤再生长，对肿瘤对免疫结合物(f)或DNA破坏剂(h)的抗性的作用，或(i)在投予所述疗法后抑制肿瘤生长。
在一些实施例中，向患者相伴投予各治疗过程，即仍在时间间隔内单独投予个别剂量的免疫结合物和DNA破坏剂，使得两种药剂可一起起作用。换言之，即使不同时或不在同一天期间投予所述治疗剂，仍相伴实施所述给药方案。在一些实施例中，所述疗法产生一或多种来自本文列表1的治疗作用，例如以下中的一或多者：(a)协同作用，(c)在结束投予后防止肿瘤再生长，对肿瘤对免疫结合物(f)或DNA破坏剂(h)的抗性的作用，或(i)在投予所述疗法后抑制肿瘤生长。
在一些实施例中，向患者周期性投予免疫结合物(例如式(I-5)的免疫结合物，任选地包含具有表5的CDR的Ab)和DNA破坏剂。周期性疗法涉及将第一药剂(例如第一预防剂或治疗剂)投予一段时间，然后将第二药剂和/或第三药剂(例如第二和/或第三预防剂或治疗剂)投予一段时间，和重复此依序投予。周期性疗法可减少对所述疗法中的一或多者的抗性的发生，避免或减少所述疗法中的一者的副作用和/或改良所述治疗的效力。在一些实施例中，所述疗法产生一或多种来自本文列表1的治疗作用，例如以下中的一或多者：(a)协同作用，(c)在结束投予后防止肿瘤再生长，对肿瘤对免疫结合物(f)或DNA破坏剂(h)的抗性的作用，或(i)在投予所述疗法后抑制肿瘤生长。
在一些实施例中，然后在投予药剂的治疗期之后为特定持续时间的不向患者投予治疗剂的非治疗期。然后在此非治疗期之后可为一系列相同或不同频率持续相同或不同时间长度的后续治疗期和非治疗期。在一些实施例中，治疗期与非治疗期交替进行。应理解，周期性疗法中的治疗期可持续到患者实现完全反应或部分反应为止，可在此时间点终止治疗。另一选择为，周期性疗法中的治疗期可持续到患者实现完全反应或部分反应为止，在此时间点治疗期可持续特定周期数。在一些实施例中，治疗期的长度可为特定周期数，不管患者反应如何。在一些其它实施例中，治疗期的长度可持续到患者复发为止。在一些实施例中，所述疗法产生一或多种来自本文列表1的治疗作用，例如以下中的一或多者：(a)协同作用，(c)在结束投予后防止肿瘤再生长，对肿瘤对免疫结合物(f)或DNA破坏剂(h)的抗性的作用，或(i)在投予所述疗法后抑制肿瘤生长。
应了解，这些治疗剂(例如式(I-5)的免疫结合物，任选地包含具有表5的CDR的Ab；和/或DNA破坏剂)中的任一者可投予的频率可为在以下时期内一次或一次以上：约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约20天、约28天、约1周、约2周、约3周、约4周、约1个月、约每2个月、约每3个月、约每4个月、约每5个月、约每6个月、约每7个月、约每8个月、约每9个月、约每10个月、约每11个月、约每年、约每2年、约每3年、约每4年或约每5年。在一些实施例中，所述疗法产生一或多种来自本文列表1的治疗作用，例如以下中的一或多者：(a)协同作用，(c)在结束投予后防止肿瘤再生长，对肿瘤对免疫结合物(f)或DNA破坏剂(h)的抗性的作用，或(i)在投予所述疗法后抑制肿瘤生长。
例如，本发明的免疫结合物(例如式(I-5)的免疫结合物，任选地包含具有表5的CDR的Ab)可与DNA破坏剂组合每周一次、每周两次、每两周、每三周或每月投予指定时期。在某些实施例中，DNA破坏剂具有不同于免疫结合物的给药时间表的给药时间表。例如，可每周一次或每三周一次投予免疫结合物，且DNA破坏剂可具有如下给药时间表：其中可在指定治疗期内每天投予一定量的DNA破坏剂并持续2天、然后是持续5天的非治疗期(2天给药/5天停药)。在另一实施例中，可每周一次或每三周一次投予免疫结合物，且DNA破坏剂可具有如下给药时间表：其中可在指定治疗期期间在3天时期内每天投予一定量的DNA破坏剂，然后是持续4天的非治疗期(3天给药/4天停药)。在另一实施例中，可每周一次或每三周一次投予免疫结合物，且DNA破坏剂可具有如下给药时间表：其中可在指定治疗期期间每周两次投予DNA破坏剂。在另一实施例中，可每周一次或每三周一次投予免疫结合物，且DNA破坏剂可具有如下给药时间表：其中可在指定治疗期期间每两周一次投予DNA破坏剂。在另一实施例中，可每周一次或每三周一次投予免疫结合物，且DNA破坏剂可具有如下给药时间表：其中可在指定治疗期期间在每周的第1天和第3天投予DNA破坏剂。在一些实施例中，所述疗法产生一或多种来自本文列表1的治疗作用，例如以下中的一或多者：(a)协同作用，(c)在结束投予后防止肿瘤再生长，对肿瘤对免疫结合物(f)或DNA破坏剂(h)的抗性的作用，或(i)在投予所述疗法后抑制肿瘤生长。
在某些实施例中，利用如本文中所描述的免疫结合物(例如式(I-5)的免疫结合物，任选地包含表5的CDR)治疗允许以比实现类似的肿瘤质量降低或肿瘤生长延迟原本所需要的频率低的频率投予DNA破坏剂。例如，在一些实施例中，将免疫结合物和DNA破坏剂添加到治疗方案中使DNA破坏剂的投予频率与单独DNA破坏剂的投予频率相比减少至少约1天、2天、3天、4天、5天、1周、2周或3周。因此，可以(例如)不高于每2天、每3天、每4天、每5天、每1周、每2周、每3周、每4周或每5周的频率向患者投予DNA破坏剂。在一些实施例中，所述疗法产生一或多种来自本文列表1的治疗作用，例如以下中的一或多者：(a)协同作用，(c)在结束投予后防止肿瘤再生长，对肿瘤对免疫结合物(f)或DNA破坏剂(h)的抗性的作用，或(i)在投予所述疗法后抑制肿瘤生长。
可在免疫结合物(例如式(I-5)的免疫结合物，任选地包含表5的CDR)之前、与免疫结合物相伴、同时或在免疫结合物之后投予DNA破坏剂。
在一实施例中，组合投予是根据3周或4周剂量时间表进行，其中每周一次投予第一剂量的免疫结合物(例如式(I-5)的免疫结合物，任选地包含具有表5的CDR的Ab)并持续3周或4周，与在所述3周或4周时期内每周两次投予DNA破坏剂组合(例如在每周的第1天投予免疫结合物且在每周的第1天和第2天投予DNA破坏剂，使得第1天的免疫结合物和第1天的DNA破坏剂在同一天实质上同时或相伴进行)。在一些实施例中，所述疗法产生一或多种来自本文列表1的治疗作用，例如以下中的一或多者：(a)协同作用，(c)在结束投予后防止肿瘤再生长，对肿瘤对免疫结合物(f)或DNA破坏剂(h)的抗性的作用，或(i)在投予所述疗法后抑制肿瘤生长。
在另一实施例中，组合投予是根据4周剂量时间表进行，其中在所述4周时间表时期内每两周投予第一剂量的免疫结合物(例如式(I-5)的免疫结合物，任选地包含具有表5的CDR的Ab)，与在所述4周时间表内每周两次投予DNA破坏剂组合(例如在所述4周时间表内在第1天和第14天投予免疫结合物且在每周的第1天和第2天投予DNA破坏剂)。在一些实施例中，所述疗法产生一或多种来自本文列表1的治疗作用，例如以下中的一或多者：(a)协同作用，(c)在结束投予后防止肿瘤再生长，对肿瘤对免疫结合物(f)或DNA破坏剂(h)的抗性的作用，或(i)在投予所述疗法后抑制肿瘤生长。
在另一实施例中，所述投予是根据3周剂量时间表进行，其中在所述3周时间表内在第1天开始投予一次免疫结合物(例如式(I-5)的免疫结合物，任选地包含表5的CDR)且然后为20天的非治疗，与每周两次投予DNA破坏剂组合，例如在所述3周时间表内在第1天投予免疫结合物且然后为20天的非治疗，且在每周的第1天和第2天投予DNA破坏剂。在一些实施例中，所述疗法产生一或多种来自本文列表1的治疗作用，例如以下中的一或多者：(a)协同作用，(c)在结束投予后防止肿瘤再生长，对肿瘤对免疫结合物(f)或DNA破坏剂(h)的抗性的作用，或(i)在投予所述疗法后抑制肿瘤生长。
在另一实施例中，所述投予是根据3周剂量时间表进行，其中在所述3周时间表内在第1天开始投予一次免疫结合物(例如式(I-5)的免疫结合物，任选地包含表5的CDR)且然后是20天的非治疗，与每周3次投予DNA破坏剂组合，例如在所述3周时间表内在第1天投予免疫结合物且然后是20天的非治疗，且在每周的第1天、第2天和第3天投予DNA破坏剂。在一些实施例中，所述疗法产生一或多种来自本文列表1的治疗作用。
在另一实施例中，所述投予是根据3周剂量时间表进行，其中在所述3周时间表内每周一次投予免疫结合物(例如式(I-5)的免疫结合物，任选地包含具有表5的CDR的Ab)，与在每周的第1天和第2天投予DNA破坏剂组合。在一些实施例中，所述疗法产生一或多种来自本文列表1的治疗作用。
在另一实施例中，所述投予是根据3周剂量时间表进行，其中在所述3周时间表内每周一次投予免疫结合物(例如式(I-5)的免疫结合物，任选地包含具有表5的CDR的Ab)，与在每周的第1天、第2天和第3天投予DNA破坏剂组合。在一些实施例中，所述疗法产生一或多种来自本文列表1的治疗作用。
在另一实施例中，所述投予是根据3周剂量时间表进行，其中在所述3周时间表内每周一次投予免疫结合物(例如式(I-5)的免疫结合物，任选地包含具有表5的CDR的Ab)，与在第一周的第1天投予DNA破坏剂组合。在一些实施例中，所述疗法产生一或多种来自本文列表1的治疗作用。
在另一实施例中，所述投予是根据3周剂量时间表进行，其中在所述3周时间表内每周一次投予免疫结合物(例如式(I-5)的免疫结合物，任选地包含具有表5的CDR的Ab)，与在第一周和第二周的每周的第1天投予DNA破坏剂组合。在一些实施例中，所述疗法产生一或多种来自本文列表1的治疗作用。
在另一实施例中，所述投予是根据3周剂量时间表进行，其中在所述3周时间表内每周一次投予免疫结合物(例如式(I-5)的免疫结合物，任选地包含具有表5的CDR的Ab)，与在每周的第1天和第3天投予DNA破坏剂组合。在一些实施例中，所述疗法产生一或多种来自本文列表1的治疗作用。
在一些实施例中，免疫结合物(例如式(I-5)的免疫结合物，任选地包含具有表5的CDR的A)和DNA破坏剂各自以所述药剂以单一药剂形式使用时常用的剂量和时间表投予。在一些其它实施例中，当相伴投予免疫结合物和DNA破坏剂时，所述药剂中的一或两者可有利地以低于当所述药剂以单一药剂形式使用时所通常投予的剂量的剂量投予，使得所述剂量降到引发不利副作用的阈值以下。在一些实施例中，所述疗法产生一或多种来自本文列表1的治疗作用，例如以下中的一或多者：(a)协同作用，(c)在结束投予后防止肿瘤再生长，对肿瘤对免疫结合物(f)或DNA破坏剂(h)的抗性的作用，或(i)在投予所述疗法后抑制肿瘤生长。
免疫结合物和DNA破坏剂的组合的治疗有效量或适宜剂量取决于多种因素，包括以下性质：欲治疗病状的严重性、特定抑制剂、投予途径和个别患者的年龄、体重、一般健康状况和反应。在某些实施例中，适宜剂量水平为如通过患有细胞增生病症的患者中增加的皮肤有丝分裂指数或肿瘤有丝分裂细胞中降低的染色体比对和纺锤体两极性或有效暴露的其它标准量度所测量实现有效暴露者。在某些实施例中，适宜剂量水平为如通过肿瘤消退或疾病进展的其它标准量度(无进展存活期或总体存活期)所测量实现治疗反应者。在其它实施例中，适宜剂量水平为实现此治疗反应且还使与治疗剂的投予相关的任何副作用最小化者。
当与DNA破坏剂组合投予时，单一或分开或多个剂量形式的免疫结合物的适宜日剂量通常可在单一药剂形式的最大耐受剂量的约10％到约120％范围内。在某些实施例中，适宜剂量为单一药剂形式的最大耐受剂量的约20％到约100％。在一些其它实施例中，适宜剂量为单一药剂形式的最大耐受剂量的约25％到约90％。在一些其它实施例中，适宜剂量为单一药剂形式的最大耐受剂量的约30％到约80％。在一些其它实施例中，适宜剂量为单一药剂形式的最大耐受剂量的约40％到约75％。在一些其它实施例中，适宜剂量为单一药剂形式的最大耐受剂量的约45％到约60％。在其它实施例中，适宜剂量为单一药剂形式的最大耐受剂量的约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约105％、约110％、约115％或约120％。在一些实施例中，所述疗法产生一或多种来自本文列表1的治疗作用，例如以下中的一或多者：(a)协同作用，(c)在结束投予后防止肿瘤再生长，对肿瘤对免疫结合物(f)或DNA破坏剂(h)的抗性的作用，或(i)在投予所述疗法后抑制肿瘤生长。
应理解，可在白天或晚上的任何时间投予适宜剂量的免疫结合物。在一些实施例中，在早上投予适宜剂量的免疫结合物。在一些其它实施例中，在晚上投予适宜剂量的免疫结合物。在一些其它实施例中，在早上和晚上投予适宜剂量的免疫结合物。
当与本发明的抗GCC免疫结合物组合投予时，单一或分开或多个剂量形式的DNA破坏剂的适宜日剂量通常可在单一药剂形式的最大耐受剂量的约10％到约120％范围内。在某些实施例中，适宜剂量为单一药剂形式的最大耐受剂量的约20％到约100％。在一些其它实施例中，适宜剂量为单一药剂形式的最大耐受剂量的约25％到约90％。在一些其它实施例中，适宜剂量为单一药剂形式的最大耐受剂量的约30％到约80％。在一些其它实施例中，适宜剂量为单一药剂形式的最大耐受剂量的约40％到约75％。在一些其它实施例中，适宜剂量为单一药剂形式的最大耐受剂量的约45％到约60％。在其它实施例中，适宜剂量为单一药剂形式的最大耐受剂量的约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约105％、约110％、约115％或约120％。在一些实施例中，所述疗法产生一或多种来自本文列表1的治疗作用，例如以下中的一或多者：(a)协同作用，(c)在结束投予后防止肿瘤再生长，对肿瘤对免疫结合物(f)或DNA破坏剂(h)的抗性的作用，或(i)在投予所述疗法后抑制肿瘤生长。
因此，在一些实施例中，本发明提供向有需要的患者投予免疫结合物(例如式(I-5)的免疫结合物，任选地包含具有表5的CDR的Ab)与一定剂量的伊立替康的组合(例如以治疗癌症，例如结肠癌)。伊立替康的剂量可为(例如)约10mg/kg、15mg/kg或30mg/kg(例如对于向小鼠投予)或约0.81mg/kg、1.2mg/kg或2.4mg/kg(例如对于向人类投予)或这些值±10％、±20％、±30％、±40％或±50％中的任一者。在一些实施例中，伊立替康是以约0.4mg/kg到3.0mg/kg、0.4mg/kg到0.6mg/kg、0.6mg/kg到0.8mg/kg、0.8mg/kgmg/kg到1.0mg/kg、1.0mg/kg到1.2mg/kg、1.2mg/kg到1.5mg/kg、1.5mg/kg到2.0mg/kg、2.0mg/kg到2.5mg/kg、2.5mg/kg到3.0mg/kg或这些下界和/或上界±10％、±20％、±30％、±40％或±50％中的任一者的剂量范围投予。当计算每单位时间的剂量时还可考虑投予的定时。在一些实施例中，伊立替康是以根据2天给药/5天停药时间表10mg/kg(即2.9mg/kg/天)的剂量；根据2天给药/5天停药时间表15mg/kg(即4.3mg/kg/天)的剂量；或根据每周一次30mg/kg(即也4.3mg/kg/天)的剂量或这些值±10％、±20％、±30％、±40％或±50％中的任一者投予(例如向小鼠投予)。在一些实施例中，伊立替康是以根据2天给药/5天停药时间表0.81mg/kg(即0.24mg/kg/天)的剂量；根据2天给药/5天停药时间表1.2mg/kg(即0.35mg/kg/天)的剂量；或每周一次2.4mg/kg(即0.35mg/kg/天)的剂量或这些值±10％、±20％、±30％、±40％或±50％中的任一者投予(例如向人类投予)。在一些实施例中，伊立替康是以约0.1mg/kg/天到0.5mg/kg/天、0.1mg/kg/天到0.2mg/kg/天、0.2mg/kg/天到0.3mg/kg/天、0.3mg/kg/天到0.4mg/kg/天、0.2mg/kg/天到0.4mg/kg/天或0.4mg/kg/天到0.5mg/kg/天或这些下界和/或上界±10％、±20％、±30％、±40％或±50％中的任一者的剂量范围投予。在一些实施例中，伊立替康是以80mg/m2到200mg/m2、例如80mg/m2到180mg/m2、80mg/m2到150mg/m2、90mg/m2到120mg/m2、小于120mg/m2或这些下界和/或上界±10％、±20％、±30％、±40％或±50％中的每一者的剂量投予；任选地根据第1天、第8天、第15天、第22天的时间表以及使得下一周期在第43天开始的停药时间表或第1天、第15天和第29天的时间表以及使得下一周期在第43天开始的停药时间表进行。在一些实施例中，所述疗法产生一或多种来自本文列表1的治疗作用，例如以下中的一或多者：(a)协同作用，(c)在结束投予后防止肿瘤再生长，对肿瘤对免疫结合物(f)或DNA破坏剂(h)的抗性的作用，或(i)在投予所述疗法后抑制肿瘤生长。
在其它实施例中，本发明提供向有需要的患者投予免疫结合物(例如式(I-5)的免疫结合物，任选地包含具有表5的CDR的Ab)与指定剂量的顺铂的组合(例如以治疗癌症，例如结肠癌)。例如，在一些实施例中，顺铂是以约4.0mg/kg或6.0mg/kg(例如向小鼠投予)或这些值±10％、±20％、±30％、±40％或±50％中的任一者的剂量投予。顺铂还可以约0.33mg/kg或0.49mg/kg(例如向人类投予)或这些值±10％、±20％、±30％、±40％或±50％中的任一者的剂量投予。因此，在一些实施例中，顺铂可以约0.1mg/kg到0.6mg/kg、0.1mg/kg到0.2mg/kg、0.2mg/kg到0.3mg/kg、0.3mg/kg到0.4mg/kg、0.4mg/kg到0.5mg/kg、或0.5mg/kg到0.6mg/kg或这些下界和/或上界±10％、±20％、±30％、±40％或±50％中的任一者的剂量范围投予。当计算每单位时间的剂量时还可考虑投予的定时。例如，在一些实施例中，顺铂是以每周一次4.0mg/kg(即0.57mg/kg/天)；每周两次4.0mg/kg(即0.29mg/kg/天)；每周一次6.0mg/kg(即0.86mg/kg/天)；或每两周一次6.0mg/kg(即0.43mg/kg/天)或这些值±10％、±20％、±30％、±40％或±50％中的任一者的剂量投予(例如向小鼠投予)。在某些实施例中，顺铂是以每周一次0.33mg/kg(即0.046mg/kg/天)；每两周一次0.33mg/kg(即0.023mg/kg/天)；每周一次0.49mg/kg(即0.070mg/kg/天)；或每两周一次0.49mg/kg(即0.035mg/kg/天)或这些值±10％、±20％、±30％、±40％或±50％中的任一者的剂量投予(例如向人类投予)。因此，在一些实施例中，顺铂是以约0.01mg/kg/天到0.08mg/kg/天、0.01mg/kg/天到0.02mg/kg/天、0.2mg/kg/天到0.4mg/kg/天、0.4mg/kg/天到0.6mg/kg/天、0.2mg/kg/天到0.6mg/kg/天或0.06mg/kg/天到0.08mg/kg/天或这些下界和/或上界±10％、±20％、±30％、±40％或±50％中的任一者的剂量范围投予。在一些实施例中，顺铂是以30mg/m2到120mg/m2、例如30mg/m2到100mg/m2、40mg/m2到70mg/m2、50mg/m2到70mg/m2、小于100mg/m2或这些下界和/或上界±10％、±20％、±30％、±40％或±50％中的任一者的剂量并任选地根据每三周一次或每月一次的时间表投予。在一些实施例中，所述疗法产生一或多种来自本文列表1的治疗作用，例如以下中的一或多者：(a)协同作用，(c)在结束投予后防止肿瘤再生长，对肿瘤对免疫结合物(f)或DNA破坏剂(h)的抗性的作用，或(i)在投予所述疗法后抑制肿瘤生长。
在其它实施例中，本发明提供向有需要的患者投予免疫结合物(例如式(I-5)的免疫结合物，任选地包含具有表5的CDR的Ab)与指定剂量的5-氟尿嘧啶(5-FU)的组合(例如以治疗癌症，例如结肠癌)。例如，在一些实施例中，5-FU是以约15mg/kg或25mg/kg(例如向小鼠投予)或这些值±10％、±20％、±30％、±40％或±50％中的任一者的剂量投予。5-FU还可以约1.2mg/kg或2.0mg/kg(例如向人类投予)或这些值±10％、±20％、±30％、±40％或±50％中的任一者的剂量投予。因此，在一些实施例中，5-FU是以约0.8mg/kg/天到2.4mg/kg/天、0.8mg/kg到1.0mg/kg、1.0mg/kg到1.2mg/kg、1.2mg/kg到1.4mg/kg、1.0mg/kg到1.4mg/kg、1.4mg/kg到1.6mg/kg、1.6mg/kg到1.8mg/kg、1.8mg/kg到2.0mg/kg、2.0mg/kg到2.2mg/kg、1.8mg/kg到2.2mg/kg或2.2mg/kg到2.4mg/kg或这些下界和/或上界±10％、±20％、±30％、±40％或±50％中的任一者的剂量范围投予。当计算每单位时间的剂量时还可考虑投予的定时。例如，在一些实施例中，5-FU是以根据3天给药/4天停药的给药时间表15mg/kg(即6.4mg/kg/天)或根据3天给药/4天停药的给药时间表25mg/kg(例如10.7mg/kg/天)或这些值±10％、±20％、±30％、±40％或±50％中的任一者的剂量投予(例如向小鼠投予)。在某些实施例中，5-FU是以根据3天给药/4天停药的给药时间表1.2mg/kg(即0.51mg/kg/天)或根据3天给药/4天停药的给药时间表2.0mg/kg(例如0.86mg/kg/天)或这些值±10％、±20％、±30％、±40％或±50％中的任一者的剂量投予(例如向人类投予)。因此，在一些实施例中，5-FU是以0.3mg/kg/天到0.5mg/kg/天、0.5mg/kg/天到0.7mg/kg天、0.7mg/kg/天到0.9mg/kg/天、0.9mg/kg/天到1.1mg/kg/天、0.4mg/kg/天到0.6mg/kg/天、0.7mg/kg/天到1.0mg/kg/天或0.3mg/kg/天到1.1mg/kg/天或这些下界和/或上界±10％、±20％、±30％、±40％或±50％中的任一者的剂量范围投予。在一些实施例中，5-FU是以3mg/kg到12mg/kg、例如3mg/kg到9mg/kg、例如3mg/kg到6mg/kg、例如小于6mg/kg或这些下界和/或上界±10％、±20％、±30％、±40％或±50％中的任一者的剂量范围并任选地根据4天给药和然后在第6天、第8天、第10天和第12天所给的额外投予的时间表投予。在一些实施例中，5-FU是以200mg/m2到700mg/m2、例如200mg/m2到600mg/m2、300mg/m2到600mg/m2、300mg/m2到500mg/m2、小于600mg/m2或500mg/m2或这些下界和/或上界±10％、±20％、±30％、±40％或±50％中的任一者的剂量并任选地根据第1天、第8天、第15天和第29天的时间表以及使得下一周期在第43天开始的停药时间表或根据第1天、第2天、第14天、第15天、第29天和第30天的时间表以及使得下一周期在第43天开始的停药时间表投予。在一些实施例中，所述疗法产生一或多种来自本文列表1的治疗作用，例如以下中的一或多者：(a)协同作用，(c)在结束投予后防止肿瘤再生长，对肿瘤对免疫结合物(f)或DNA破坏剂(h)的抗性的作用，或(i)在投予所述疗法后抑制肿瘤生长。
在其它实施例中，本发明提供向有需要的患者投予免疫结合物(例如式(I-5)的免疫结合物，任选地包含表5的CDR)与指定剂量的吉西他滨的组合(例如以治疗癌症，例如胰脏癌)。例如，在一些实施例中，吉西他滨是以约15mg/kg或20mg/kg(例如向小鼠投予)或这些值±10％、±20％、±30％、±40％或±50％中的任一者的剂量投予。在一些实施例中，吉西他滨是以约1.2mg/kg或1.6mg/kg或这些值±10％、±20％、±30％、±40％或±50％中的任一者的剂量投予(例如向人类投予)。因此，在一些实施例中，吉西他滨是以约0.8mg/kg到2.0mg/kg、0.8mg/kg到1.0mg/kg、1.0mg/kg到1.2mg/kg、1.2mg/kg到1.4mg/kg、1.0mg/kg到1.4mg/kg、1.4mg/kg到1.6mg/kg、1.6mg/kg到1.8mg/kg、1.4mg/kg到1.8mg/kg或1.8mg/kg到2.0mg/kg或这些下界和/或上界±10％、±20％、±30％、±40％或±50％中的任一者的剂量范围投予。当计算每单位时间的剂量时还可考虑投予的定时。例如，在一些实施例中，吉西他滨是以每周两次15mg/kg(即4.3mg/kg/天)或每周两次20mg/kg(即5.7mg/kg/天)或这些值±10％、±20％、±30％、±40％或±50％中的任一者的剂量投予(例如向小鼠投予)。吉西他滨还可以每周两次1.2mg/kg(即0.34mg/kg/天)或每周两次1.6mg/kg(即0.48mg/kg/天)或这些值±10％、±20％、±30％、±40％或±50％中的任一者的剂量投予(例如向人类投予)。因此，在一些实施例中，吉西他滨是以0.1mg/kg/天到0.3mg/kg/天、0.3mg/kg/天到0.5mg/kg/天、0.4mg/kg/天到0.6mg/kg/天、0.5mg/kg/天到0.7mg/kg/天、0.2mg/kg/天到0.6mg/kg/天或0.1mg/kg/天到0.7mg/kg/天或这些下界和/或上界±10％、±20％、±30％、±40％或±50％中的任一者的剂量范围投予。在一些实施例中，吉西他滨可以700mg/m2到1300mg/m2、例如800mg/m2到1250mg/m2、例如800mg/m2到1000mg/m2、例如小于1000mg/m2或这些下界和/或上界±10％、±20％、±30％、±40％或±50％中的任一者的剂量并任选地根据每周一次并持续7周的时间表、然后1周的停药时间表、任选地然后每周一次的周期并持续3周投予。在一些实施例中，所述疗法产生一或多种来自本文列表1的治疗作用，例如以下中的一或多者：(a)协同作用，(c)在结束投予后防止肿瘤再生长，对肿瘤对免疫结合物(f)或DNA破坏剂(h)的抗性的作用，或(i)在投予所述疗法后抑制肿瘤生长。
应理解，可在白天或晚上的任何时间投予适宜剂量的DNA破坏剂。在一些实施例中，在早上投予适宜剂量的DNA破坏剂。在一些实施例中，在晚上投予适宜剂量的DNA破坏剂。在一些其它实施例中，在早上和晚上投予适宜剂量的DNA破坏剂。
在一些实施例中，在投予第一量的DNA破坏剂的第一治疗期之后可为投予相同或不同量的相同或不同DNA破坏剂的另一治疗期。众多种治疗剂与本发明的免疫结合物和DNA破坏剂的组合组合可具有治疗上相关的额外益处。可使用包含本文中所描述的免疫结合物和DNA破坏剂与一或多种其它治疗剂的组合疗法，以：例如，1)增强本发明方法和/或一或多种其它治疗剂的治疗作用；2)减少本发明方法和/或一或多种其它治疗剂所呈现的副作用；和/或3)减少免疫结合物和DNA破坏剂和/或一或多种其它治疗剂的有效剂量。例如，所述治疗剂可与本文中所描述的免疫结合物和DNA破坏剂组合以抑制不需要的细胞生长，例如导致不需要的良性病状或肿瘤生长的不适当细胞生长。在一些实施例中，所述疗法产生一或多种来自本文列表1的治疗作用，例如以下中的一或多者：(a)协同作用，(c)在结束投予后防止肿瘤再生长，对肿瘤对免疫结合物(f)或DNA破坏剂(h)的抗性的作用，或(i)在投予所述疗法后抑制肿瘤生长。
与本文中所描述的免疫结合物和DNA破坏剂进一步组合使用的治疗剂的实例包括(但不限于)抗增生剂、抗癌剂、抗生物素剂、激素剂、植物源药剂和生物剂。
抗生物素剂是一组以与抗生素类似的方式产生作为对天然产物的修饰的药物。抗生物素剂的实例包括(但不限于)蒽环(例如多柔比星、道诺霉素、表柔比星、伊达比星和蒽醌)、丝裂霉素C、博来霉素、放线菌素D、普卡霉素(plicatomycin)。这些抗生物素剂通过靶向不同的细胞组份来干扰细胞生长。例如，通常认为蒽环干扰DNA拓扑异构酶II在具有转录活性的DNA区域中的作用，此导致DNA链切断。通常认为博来霉素螯合铁并形成活化络合物，然后使活化络合物结合到DNA的碱基，从而造成链切断和细胞死亡。除免疫结合物和DNA破坏剂以外包括抗生物素剂的组合疗法可对癌症具有治疗协同作用并减少与这些化学治疗剂有关的副作用。
激素剂是一组调控其标靶器官的生长和发育的药物。大多数激素剂为性类固醇和其衍生物和其类似物，例如雌激素、雄激素和黄体素。这些激素剂可充当性类固醇的受体的拮抗剂以下调重要基因的受体表达和转录。所述激素剂的实例是合成雌激素(例如乙烯雌酚)、抗雌激素(例如他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、氟羟甲基睾酮(fluoxymesterone)和雷洛昔芬(raloxifene))、抗雄激素(比卡鲁胺(bicalutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和氟他胺(flutamide))、芳香酶抑制剂(例如胺鲁米特(aminoglutethimide)、阿那曲唑(anastrozole)和四唑)、酮康唑(ketoconazole)、乙酸戈舍瑞林(goserelinacetate)、亮丙瑞林(leuprolide)、乙酸甲地孕酮(megestrolacetate)和米非司酮(mifepristone)。除免疫结合物和DNA破坏剂以外包括激素剂的组合疗法可对癌症具有治疗协同作用并减少与这些化学治疗剂有关的副作用。
植物源药剂是一组源自植物或基于药剂的分子结构经修饰的药物。植物源药剂的实例包括(但不限于)长春花生物碱(例如长春新碱、长春花碱、长春地辛、长春利定(vinzolidine)和长春瑞滨)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)(例如依托泊苷(VP-16)和替尼泊苷(VM-26))和紫杉烷(例如太平洋紫杉醇和多西他赛)。这些植物源药剂通常用作结合到微管蛋白并抑制有丝分裂的抗有丝分裂剂。认为诸如依托泊苷等鬼臼毒素通过与拓扑异构酶II相互作用来干扰DNA合成，从而导致DNA链切断。除免疫结合物和DNA破坏剂以外包括植物源药剂的组合疗法可对癌症具有治疗协同作用并减少与这些化学治疗剂有关的副作用。
生物剂是一组当单独使用或与化学疗法和/或放射疗法组合使用时引发癌症/肿瘤消退的生物分子。生物剂的实例包括(但不限于)免疫调节蛋白(例如细胞因子)、针对肿瘤抗原的单克隆抗体、肿瘤阻抑基因和癌症疫苗。除免疫结合物和DNA破坏剂以外包括生物剂的组合疗法可对癌症具有治疗协同作用，增强患者对致肿瘤信号的免疫反应，并减少与此化学治疗剂相关的潜在副作用。
在另一方面中，本发明特征为如本文中所描述的抗GCC免疫结合物(例如式(I-5)的免疫结合物，任选地包含具有表5的CDR的Ab)与DNA破坏剂的组合于制造药剂的用途。在实施例中，所述药剂可用于治疗癌症，例如胃肠癌，例如原发性或转移性结肠直肠癌、胃癌、胰脏癌或食道癌。在一些实施例中，所述药剂包含具有表1到6中所汇总的一或多个特征的抗GCC抗体分子。在一些实施例中，所述药剂包含5F9抗体分子。在一些实施例中，所述药剂具有产生一或多种来自本文列表1的治疗作用的性质，例如以下中的一或多者：(a)协同作用，(c)在结束投予后防止肿瘤再生长，对肿瘤对免疫结合物(f)或DNA破坏剂(h)的抗性的作用，或(i)在投予所述疗法后抑制肿瘤生长。
在一些方面中，本发明特征为包含具有表1到6中所汇总的一或多个特征的抗GCC抗体分子的免疫结合物于制造进一步含有DNA破坏剂的药剂的用途。此一药剂可用于治疗癌症，包括(但不限于)胃肠癌，例如结肠直肠癌、胃癌、胰脏癌或食道癌。在一实施例中，所述药剂的免疫结合物的特征在于式(I-5)，其中Ab是本文中所描述的抗GCC抗体分子，例如5F9抗体分子，且m为约4，且所述药剂的DNA破坏剂是拓扑异构酶I抑制剂，例如伊立替康。在另一实施例中，所述药剂的免疫结合物的特征在于式(I-5)，其中Ab是本文中所描述的抗GCC抗体分子，例如5F9抗体分子，且m为约4，且所述药剂的DNA破坏剂是蒽环，例如顺铂或奥沙利铂。在另一实施例中，所述药剂的免疫结合物的特征在于式(I-5)，其中Ab是本文中所描述的抗GCC抗体分子，例如5F9抗体分子，且m为约4，且所述药剂的DNA破坏剂是抗代谢物，例如吉西他滨。在一些实施例中，所述药剂具有产生一或多种来自本文列表1的治疗作用的性质，例如以下中的一或多者：(a)协同作用，(c)在结束投予后防止肿瘤再生长，对肿瘤对免疫结合物(f)或DNA破坏剂(h)的抗性的作用，或(i)在投予所述疗法后抑制肿瘤生长。
基于肿瘤的GCC表达和/或抗GCC免疫结合物敏感性调整抗GCC疗法
本文中所描述的方法可用于表达GCC的癌症上。在一些实施例中，所述方法可包括检测GCC的存在，例如以检测生物样品中GCC的存在或检测个体中GCC的存在或分布，例如使用抗GCC抗体(例如经标记的抗GCC抗体)或配体(例如肽配体，例如结合到GCC的经标记的肽配体)进行。如本文所使用的术语“检测”涵盖定量或定性检测。如本文中所使用的检测GCC或GCC蛋白意指检测完整的GCC蛋白或检测GCC蛋白的包含检测抗GCC抗体分子或GCC结合配体所结合的表位的部分。在一些实施例中，所述方法包括检测标靶肿瘤上的GCC含量，且抗肿瘤疗法是基于检测步骤的结果进行选择。在一些实施例中，所述方法包括获得关于个体中的GCC表达量的信息和基于所述信息选择抗肿瘤疗法。在一些实施例中，所述方法包括治疗患有表达GCC的癌症的个体。关于使用抗GCC抗体检测肿瘤上的GCC表达的额外细节参见国际申请案WO2013/163633，其以引用的方式全文并入本文中。
在一些实施例中，用于检测肿瘤上的GCC表达的抗体是具有本文表22的VH或VL序列的抗体，或具有一或多个(例如6个)来自本文表22的VH或VL序列内的CDR(例如本文表24中所述的那些CDR)的抗体。例如，所述抗体可包含抗GCC兔mAbMIL-44-148-2或其部分。
因此，在另一方面中，所述方法可包括检测GCC蛋白，例如检测GCC表达细胞或组织，例如肿瘤细胞或具有表达GCC的细胞的肿瘤。所述方法包含：使材料(例如细胞或组织，例如表达GCC的肿瘤的样品)与抗GCC抗体分子(例如本文中所描述的抗GCC抗体分子)或GCC结合配体在允许在抗GCC抗体分子或配体与GCC蛋白间形成络合物的条件下接触；和检测抗体分子或配体与GCC蛋白间络合物的形成，从而检测GCC蛋白的存在，例如以检测GCC表达细胞或肿瘤。
在某些实施例中，所述组织包括以相对于其它组织(例如诸如B细胞和/或B细胞相关组织等其它组织)较高的水平表达GCC的正常和/或癌性组织。
在另一方面中，本文中所描述的方法可包括在活体外(例如于来自肿瘤组织、来自个体的生物样品中，例如组织生检)或活体内(例如通过个体中的活体内成像)检测GCC蛋白的存在。所述方法包含：(i)使样品与抗GCC抗体分子或GCC结合配体接触或向个体投予抗GCC抗体分子或GCC结合配体；和(ii)检测抗GCC抗体分子或配体与GCC蛋白间络合物的形成。络合物形成指示GCC的存在或含量。所述方法任选地进一步包含利用本文中所描述的免疫结合物与DNA破坏剂的组合治疗个体，例如如下文所描述。
在实施例中，比较样品或个体中所检测的络合物含量与参照值(例如GCC的络合物形成或含量的值)。在实施例中，超过参照值的GCC含量指示GCC介导的病症并就利用本文中所描述的免疫结合物和DNA破坏剂的适宜治疗方案指导内科医师。
在实施例中，所述方法包含使参照样品(例如对照样品(例如对照生物样品，例如血浆、组织、生检)或对照个体))与抗GCC抗体分子或GCC结合配体接触，和比较其中所检测的络合物含量与所述样品或个体中所检测的含量。
个体或样品中的GCC抗原密度可分类为(以递减顺序)高、相对较高、中等或低。GCC抗原密度可通过任何适宜方法来测量。例如，可使用H评分方法；此方法描述于以下各段和国际申请案WO/2013/163633中，所述申请案以引用的方式全文并入本文中。作为另一实例，一或多个患者肿瘤中的GCC抗原密度可通过活体内检测方法(例如通过投予与可检测标记结合的抗GCC抗体并利用诸如MRI等成像系统检测结合物)来测定。在某些实施例中，样品或个体中所检测的抗原密度是使用半定量IHC评分系统(例如如本文实例3和5中所描述)来描述。例如，在一些实施例中，4+的IHC评分分类为高GCC抗原密度，2到3+的IHC评分分类为相对较高的GCC抗原密度，2+的IHC评分分类为中等GCC抗原密度，且1+的IHC评分分类为低GCC抗原密度。应理解，还可使用其它方法测定个体或样品中的GCC抗原密度。
为计算H评分，可如下执行染色。将样品与抗GCC抗体一起培育过夜。此程序可使用TechMate500或TechMate1000(罗氏诊断(RocheDiagnostics))完全自动化。染色后，通过醇系列到无水乙醇使载玻片脱水，然后进行二甲苯冲洗。用玻璃盖玻片和CytoSeal将载玻片永久地盖上盖玻片。在显微镜下检查载玻片来评估染色。阳性染色是由棕色(DAB-HRP)反应产物的存在指示。苏木精对比染色提供蓝色核染色以评估细胞和组织形态。
可对经染色细胞上如下执行H评分方法。提供肿瘤内的细胞百分数(0到100)和在0到3+范围内的染色强度。例如，提供强度为0、0.5、1、2和3的评分。根据标记物，0.5染色可评分为阳性或阴性，且反映针对标记物的较浅但可察觉的染色。为获得H评分，将肿瘤细胞百分数乘以各强度并加在一起：
H评分＝(肿瘤％*1)+(肿瘤％*2)+(肿瘤％*3)。例如，若肿瘤为20％阴性(0)、30％+1、10％+2、40％+3，则H评分为170。
若100％的肿瘤细胞标记有3+强度，则根据亚细胞定位(即顶端或细胞质)最大H评分为300(100％*+3)。在一些实施例中，例如作为对照，不使用单独的总H评分来比较样品，但除了审查细胞在每一强度下的百分数的细分(break-down)以外还对其进行评价。例如，90的评分可代表90％以1+强度染色的肿瘤细胞或30％3+强度的细胞。这些样品具有相同的H评分，但极为不同的GCC表达。欲在每一强度下评分的细胞百分数可有所不同，但通常以10％的增量评分；然而，单一组份的较小评分百分数还可估计为1％和5％，以证明存在一定程度的染色。对于GCC，可考虑顶端染色用于在小量增量(例如1％和5％)下评价。
可使用H评分方法对GCC的不同亚细胞定位进行评分。这些方法包括细胞质染色和顶端相关染色。通常观察到细胞质染色模式为遍及肿瘤细胞细胞质的弥散。然而，在一些情形下细胞质染色有多种变化形式，其包括强球状染色或点状染色、粗颗粒状染色。强球状染色可评分为3+细胞质染色。点状染色与顶端染色相关，且并不针对此类型的细胞质染色给出单独评分。当存在管腔时，观察到GCC顶端染色。所观察到的其它GCC染色模式包括膜样非管腔染色(一例)和肿瘤管腔内存在的细胞外染色。在正常结肠组织中，染色通常为顶端染色以及弥散细胞质染色。
由于可获得细胞质和顶端GCC表达二者的H评分，故可捕获所有数据，且在一些情况下，可通过使用顶端和细胞质GCC表达二者的和生成总计H评分。在所述情况下，总计评分的最大H评分变成600(300顶端+300细胞质)。
在实施例中，比较来自个体的样品或个体中的GCC含量与参照含量(例如对照材料(例如与个体细胞相同的组织来源的正常细胞或具有与此一正常细胞相当的GCC含量的细胞)中的GCC含量)。所述方法可包含(例如)响应GCC的检测量，提供病症的诊断、预后、治疗效力评价或分期。与对照材料相比样品或个体中的GCC含量较高指示与增加的GCC表达相关的病症的存在。与对照材料相比样品或个体中的GCC含量较高还可指示治疗效力的相对缺乏、相对较差的预后或疾病的后期。GCC含量还可用于评价或选择未来治疗，例如需要或多或少积极的治疗或需要从一种治疗方案切换成另一种。
GCC含量还可用于选择或评价患者。
肿瘤对抗GCC免疫结合物(例如免疫结合物(I-5)，例如包含具有表5的CDR的Ab)的反应性可指导治疗内科医师确定适当的抗肿瘤疗法，例如利用免疫结合物(I-5)(例如包含具有表5的CDR的Ab)与DNA破坏剂的组合的疗法。本文实例5揭示测量肿瘤对免疫结合物疗法的反应性的方法，且本文实例6揭示对抗GCC免疫结合物具有不同敏感性程度的肿瘤的适当治疗模式。
肿瘤或癌细胞对给定治疗剂(例如免疫结合物或DNA破坏剂)的敏感性或抗性可分类为(以递减顺序)强、中等到强、中等或具抗性。敏感性可通过任何适宜方法来测定。例如，在一些实施例中，“强抗肿瘤活性”或“强敏感性”是指如本文实例5中所显示当利用5F9vcMMAE治疗PHTX-09c细胞时所观察到的至少大致抗肿瘤活性程度；“中等到强”抗肿瘤活性或敏感性是指当利用5F9vcMMAE治疗PHTX-21c细胞时所观察到的大致抗肿瘤活性程度；“中等抗肿瘤活性”或“中等敏感性”是指当利用5F9vcMMAE治疗PHTX-17c细胞时所观察到的大致抗肿瘤活性程度；且“具抗性”是指当利用5F9vcMMAE治疗PHTX-11c细胞时所观察到的大致抗肿瘤活性程度或小于所述程度。作为另一实例，药物敏感性可使用细胞培养分析来测定，其中向相关癌细胞(例如从癌症患者的肿瘤进行生检的细胞)投予所关注药物，并测定细胞毒性活性。作为另一实例，对治疗剂的肿瘤敏感性可通过监测个体对所述药剂的反应性来测定，例如通过在将患者置于利用所述药剂的疗法的同时在不同时间点使肿瘤大小可视化来测定。应理解，其它方法也可用于测定个体或样品对免疫结合物或DNA破坏剂的敏感性。
在一些方面中，本发明提供测试肿瘤对抗GCC疗法(例如(I-5)的免疫结合物)的敏感性以鉴别敏感性(例如强敏感性、强到中等敏感性、中等敏感性或具抗性)的方法。
例如，在实施例中，肿瘤细胞在其表面上表达大量GCC的患者可视为利用毒素结合的抗GCC抗体分子治疗的良好候选人。在实施例中，肿瘤细胞在其表面上表达少量GCC的患者可为组合抗GCC抗体分子与另一治疗方法(例如DNA破坏剂)的候选人。在另一实例中，可调节抗GCC抗体分子的剂量以反映肿瘤细胞表面上所表达的GCC分子数。在其肿瘤细胞表面上具有大量GCC分子的患者可利用比具有少量GCC分子的患者低的剂量来治疗。活体内检测GCC表达肿瘤细胞的存在可允许鉴别表达GCC的原发性肿瘤已转移到其中的组织。关于组织已转移的知识可产生肿瘤疗法的靶向应用。
如上文所论述，抗GCC抗体分子和GCC结合配体容许评估正常与肿瘤性组织中GCC蛋白的存在，由此可评估疾病的存在或其严重性、疾病进展和/或疗法的效力。例如，可监测疗法(例如利用诸如(I-5)等免疫结合物与DNA破坏剂的组合的疗法)，并评估效力。在一实例中，可在从患有细胞增生疾病(例如结肠癌、胃癌和食道癌)的个体获得的第一样品中检测和/或测量GCC蛋白，且可起始疗法。稍后，可从所述个体获得第二样品，且可检测和/或测量所述样品中的GCC蛋白。第二样品中所检测或测量的GCC蛋白的量的降低可指示治疗效力。
抗GCC抗体序列
通过若干方法生成抗GCC抗体，如实例中更详细论述。首先使用生成完整人类IgG2抗体的转基因小鼠、利用阿布格尼克斯(Abgenix)XENOMOUSE转基因技术生成一种特定抗GCC抗体(命名为“5F9”)，并使用杂交瘤技术进行分离。(随后在CHO细胞中产生抗体5F9，如本文实例4中所描述。)使用生成完整人类IgG2抗体的转基因小鼠生成人类mAbAbx-229。使用阿布格尼克斯SLAM技术分离单一抗体。使用这些抗体制备完整人类IgG1抗体。通过ELISA和流式细胞术(FCM)测试抗体对GCC的特异性。
下表1汇总用于制备抗体分子5F9的方法、用于生成所述抗体的免疫原、所使用的动物、来源、物种和同种型分离物。
表1
Ab 免疫原 动物 来源 物种 同种型
5F9 TOK107-hIg XenoMouse 杂交瘤 人类 IgG2,k
测定轻链和重链可变区的序列。(表2)。5F9抗GCC抗体的重链和轻链中的每一者的可变区的氨基酸和核酸序列分别显示于表3和4中。5F9抗GCC抗体的重链和轻链的CDR中的每一者的氨基酸和核酸序列分别显示于表5和6中。
CDR的测序允许测定可充当毒素结合位点的残基的丰度。抗原结合区域中未配对的游离半胱氨酸可为奥里斯他汀的结合位点，且赖氨酸可为美登素的结合位点。毒素与CDR的氨基酸的结合会产生改变抗体对GCC的结合亲和力的问题。因此，在实施例中，CDR缺乏可与治疗剂结合的氨基酸。
表2.单克隆抗体的可变区的SEQIDNO.
表3.mAb可变区的氨基酸序列
表4.mAb可变区的核酸序列
表5：CDR的氨基酸序列
表6.CDR的核酸序列
如上文所描述产生含有mAb5F9的重链和轻链二者的编码序列的表达载体。
通过以下实例说明本发明，其不应理解为进一步限制本发明。
实例
实例1：抗GCC抗体的生成和表征
如下执行用于免疫和筛选的GCC蛋白的生成。通过将编码包含以下GCC序列(信号序列和细胞外结构域)的序列的GCC基因的一部分亚克隆到表达载体中来制备GCC抗原。
MKTLLLDLALWSLLFQPGWLSFSSQVSQNCHNGSYEISVLMMGNSAFAEPLKNLEDAVNEGLEIVRGRLQNAGLNVTVNATFMYSDGLIHNSGDCRSSTCEGLDLLRKISNAQRMGCVLIGPSCTYSTFQMYLDTELSYPMISAGSFGLSCDYKETLTRLMSPARKLMYFLVNFWKTNDLPFKTYSWSTSYVYKNGTETEDCFWYLNALEASVSYFSHELGFKVVLRQDKEFQDILMDHNRKSNVIIMCGGPEFLYKLKGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTLSPGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKIFLENGENITTPKFAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTKKYKVLLTYDTHVNKTYPVDMSPTFTWKNSKL(SEQIDNO:16)
表达载体(pLKTOK107)提供C末端IgG1Fc区以与GCC序列融合。此载体包含具有IgG1铰链的外显子、CH2和CH3结构域，将其突变以从外显子中的CH1片段消除半胱氨酸。此IgG1Fc区在赖氨酸235和甘氨酸237处进一步突变成丙氨酸。所述构筑体于经SV40T-抗原的基因转染的人类胎肾(HEK)293细胞中重组表达为与C末端人类IgG1Fc融合的分泌型GCC序列(SEQIDNO:3的氨基酸残基24到430)。通过蛋白质A色谱和粒径排阻色谱纯化称为TOK107-hIg(替代名称为hGCC-ECD/hIgG1Fc，SEQIDNO:62)的蛋白质。
GCC抗原还通过以下方式来制备：将以上融合蛋白亚克隆到诸如pLKTOK111等表达载体中，此允许鼠类IgG2a跨膜区域融合到C末端上。当此构筑体重组表达于CHO细胞中时，在细胞表面上检测到GCC细胞外结构域。当将pLKTOK111载体与包含鼠类CD79a(MB-1)和CD79b(B29)的pLKTOK123共转染时，实现GCC-Ig融合蛋白(SEQIDNO:61)的高细胞表面表达。使用来自此转染(CHO-GCC27号)的克隆27号作为免疫原。还使用HT-29-GCC2号细胞作为免疫原。
对于通过ELISA筛选杂交瘤上清液和经纯化mAb，将编码GCC融合构筑体的核酸克隆到pCMV1表达载体(西格玛)中。纯化标签：还将FLAG标签(在N末端)和His标签(在C末端)克隆到所述构筑体中。将融合蛋白构筑体转染到293细胞中，表达，且经抗M2-琼脂糖亲和柱(西格玛)纯化重组蛋白。
试剂和细胞系.从ATCC获得HEK293细胞、CHO和T84人类结肠癌细胞并根据ATCC方案进行维持。
小鼠：从塔康农场公司(TaconicFarms,Inc.，纽约州日耳曼敦)购得4到6周龄的雌性C57BL/6小鼠用于生成鼠类杂交瘤。从阿布格尼克斯公司(加利福尼亚州费利蒙)获得户内喂养到4到6周龄并产生人类IgG2抗体的Xenomice用于生成人类杂交瘤。获得所有动物并根据千禧医药公司的实验动物照护与使用委员会的指南维持。
细胞系：用于功能性分析的细胞系是GCC转染细胞和载体对照HEK293或HT29细胞的细胞对。在EF-1α启动子或空载体(pLKTOK4)的控制下用全长GCC转染HT29细胞，并在G418中进行选择。已确认当与ST肽(1-18或5-18)接触时，这些细胞中的GCC具有cGMP反应。在CMV启动子或空载体(pN8mycSV40)的控制下用全长GCC转染HEK293细胞，并在杀稻瘟菌素中进行选择。这些细胞中的GCC具有myc标签。针对最高GCC表达所选择的克隆是293-GCC2号、HT29-GCC2号和HT29-GCC5号。还使用HT29-GCC2号作为免疫原用于生成抗GCC抗体分子。额外GCC表达细胞是CT26细胞。为研发表达GCC的CT26细胞系，使用pTOK58D载体。将全长GCC克隆到常用于重链克隆的位点中，且将荧光素酶克隆到常用于轻链克隆的位点中。在转染到CT26细胞中后，确认GCC和荧光素酶二者的独立表达。GCC的表面表达是通过流式细胞术使用5F9抗体来确认。选择克隆32号用于进一步研究。
T84结肠癌细胞系内源性表达GCC。广泛细胞系组中的GCC的Taqman分析揭露T84是唯一一种表达GCC的mRNA的细胞系。在T84细胞的细胞沉淀上利用GCC选择性mAb针对GCC的染色显示显著的GCC蛋白表达。
利用经放射性标记的配体(ST-毒素)对GCC受体含量的定量表明293-GCC2号细胞比T84细胞表达更多GCC，而HT29-GCC2号或5号每个细胞表达最少GCC分子。
人类mAb的生成.对XENOMOUSE遗传改造小鼠(阿布格尼克斯，加利福尼亚州费利蒙)(8到10周龄)进行免疫以产生人类单克隆抗体。参见孟德斯(Mendez)等人，自然遗传学(NatureGenetics)15:146-156(1997)、格林(Green)和雅各博维奇(Jakobovits)实验医学杂志(J.Exp.Med.)188:483-495(1998)。采用若干种免疫方案。在一种方案中，将100微克的人类GC-C细胞外结构域/人类Ig融合蛋白(TOK107-hIg)悬浮于杜贝克氏磷酸盐缓冲盐水(Dulbecco’sphosphatebufferedsaline，PBS；GIBCO，纽约州格兰德岛(GrandIsland，NY))中，并利用等体积的弗式完全佐剂(completeFreund’sadjuvant，西格玛化学公司(SigmaChemicalCo.)，密苏里州圣路易斯)乳化。通过在三个皮下位点、尾巴底部和一个腹膜内(i.p.)位点注射乳液对XENOMOUSETM进行免疫。在初始免疫后14天，利用于弗式不完全佐剂中的50μgTOK107-hIg给予小鼠加强免疫。血清测试指示效价不足，故在数周停药期后，给予50μg人类TOK107-hIg的第二次加强。2周后，从尾静脉收集少量血液，并通过ELISA滴定对TOK107-Ig的血清活性，且通过FACS滴定对HT29-GCC2号细胞的血清活性。当小鼠效价通过ELISA超过1:24,300或通过FACS超过1:500时，选择其用于融合。在此次加强后近3个月，利用107个HT-292号细胞对小鼠进行加强，并在第二天利用50μgTOK107-hIg进行加强，二者均于弗式不完全佐剂中。利用此方案免疫的小鼠产生5F9和1D2人类抗GCC抗体分子。利用此方案免疫的小鼠产生5F9和1D2人类抗GCC抗体分子。
4天后，对小鼠实施安乐死，并制备脾细胞悬浮液，且用PBS洗涤用于融合。通过结合TOK107-hIg与非GCC抗原相比的ELISA测试融合细胞的特异性结合到GCC的抗体的产生，或通过结合到T84细胞或HT-29克隆2号细胞与载体对照相比并与非GCC表达MCF-7细胞相比的FACS测试融合细胞的特异性结合到IgG的Fc区的抗体的产生。使用ELISA或通过FACS使用IgG或IgM特异性二级抗体测定同种型。利用此方案免疫的小鼠产生5F9人类抗GCC抗体分子。
产生人类mAb的杂交瘤：对脾细胞计数，并以2:1的脾:骨髓瘤比与不能分泌重链或轻链免疫球蛋白链的SP2/0骨髓瘤细胞(ATCC编号CRL8-006，马里兰州罗克韦尔)混合。根据标准程序在12个96孔组织培养板中于HAT选择培养基中利用聚乙二醇1450(ATCC)融合细胞。在融合后10天与21天之间，杂交瘤群落变得可见，且收获培养物上清液，然后通过ELISA和FACS进行筛选。
通过ELISA分析mAb.利用50μl/孔的2μg/mlTOK107-hIg溶液(0.1μg/孔)涂布高蛋白质结合96孔EIA板(康宁公司(Costar/Corning,Inc.)，纽约州康宁)，并在4℃下培育过夜。抽吸过量溶液，并将各板用PBS/0.05％吐温20(Tween-20)(3次)洗涤，然后在室温(RT)下用1％牛血清白蛋白(BSA，部分V，西格玛化学公司，密苏里州)封阻1hr以抑制非特异性结合。去除BSA溶液，并添加50μl/孔来自每一融合板孔的杂交瘤上清液。然后在37℃下将各板培育45min，并用PBS/0.05％吐温20洗涤3次。将于1％BSA/PBS中1:4000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)结合的山羊抗小鼠或抗人类IgGF(ab)2(H&L)(杰克森研究实验室公司(JacksonResearchLaboratories,Inc.)，宾夕法尼亚州西格罗夫)添加到每一孔中，且然后在37℃下将各板培育45min。洗涤后，添加50μl/孔的ABTS溶液(兹迈德(Zymed)，加利福尼亚州南旧金山)。在Vmax微量滴定板读数器(分子装置公司(MolecularDevicesCorp.)，加利福尼亚州森尼维尔)上评估阳性孔在405nm下的绿色强度。然后将所有给出阳性反应的杂交瘤孔扩增到24孔培养物，通过有限稀释进行亚克隆，并通过ELISA和FACS进行分析。进一步扩增三种产量最高的亚克隆。
通过流式细胞术分析mAb.在ELISA筛选的同时，对所有融合板上清液进行流式细胞术(FACS)筛选。使HT-29克隆2号或未经转染的HT-29细胞于T225烧瓶(康宁公司，纽约州康宁)中的补充有10％胎牛血清(GIBCO)的DMEM(GIBCO)中生长。使用Versene(GIBCO)将细胞从烧瓶表面脱离，收集，并用DMEM洗涤两次，然后用1％BSA/PBS溶液洗涤一次。将细胞再悬浮于1％BSA/PBS中，且将2×106个细胞添加到V底96孔板(科士达(Costar))的每一孔中并以2500RPM离心5min.(洗涤)。丢弃洗涤溶液，且添加50μl/孔来自每一融合板孔洗涤液的上清液。施加板密封剂(Linbro/MP生物医学有限公司(Linbro/MPBiomedicals,LLC)，俄亥俄州索伦)，且然后将各板温和地涡旋以使细胞再悬浮并使其与上清液混合，且在4℃下(在冰上)培育30min。然后用冷1％BSA/PBS(3次)洗涤各板，且在4℃下(在冰上在黑暗中)将1:50稀释的50μl/孔FITC结合的驴抗小鼠IgGF(Ab)2(H&L)或FITC结合的山羊抗人类IgGF(Ab)2(H&L)(杰克森)添加到每一孔中并保持30min.。将板在冷1％BSA/PBS中再次洗涤3次，并在冷1％多聚甲醛(西格玛)/PBS中进行固定。将细胞转移到排管(科士达)中，并在FACScalibur流式细胞仪(碧迪医疗(BectonDickenson)，加利福尼亚州圣荷西)上进行分析。然后将任何显示正向位移的杂交瘤孔扩增到24孔培养物，通过有限稀释进行亚克隆。
内化分析.在GCC表达细胞和载体对照细胞二者中使用免疫荧光显微术测试抗GCC抗体分子的内化。使细胞在盖玻片上生长，并置于冰上10分钟，然后在冰上与10μg/ml抗体一起在冷培养基中培育20分钟。对于内化，将含有抗体的培养基更换为新鲜培养基，且使细胞移位到37℃并保持2小时至3小时或维持在冰上。在室温下于PBS中冲洗和于4％多聚甲醛中短暂固定后，在0/5％TRITONX-100中使细胞透化15min。使用荧光标记的抗IgG抗体通过激光扫描共聚显微镜测定测试抗体的定位。抗体分子在冰上时定位到GCC表达细胞的细胞表面。在37℃下培育后，5F9在细胞膜内显示点状染色，此指示内化。利用载体细胞未检测到内化。
抗GCC抗体分子的性质的汇总.表7汇总5F9mAb的活体外性质。(T84＝人类结肠肿瘤细胞，MCF7＝人类乳房肿瘤细胞，WB＝西方墨点(westernblot)，IP＝免疫沉淀，IHC＝免疫组织化学；内化使用T84细胞，与MCF-7细胞相比)。
表7.抗GCC抗体分子的性质
另外，测试5F9抗体分子抑制GCC表达细胞中ST肽诱导的钙离子通量的能力。在50nMST存在下在抗GCC抗体分子存在或不存在下在HT29-GCC18号细胞中执行cGMP分析。5F9对钙离子通量存在剂量依赖性抑制。
抗GCC抗体分子的相对亲和力的估计.根据针对TOK107-hIg的ELISA测量并通过利用GCC表达细胞的FACS测量估计5F9抗GCC抗体分子的相对亲和力(EC50；半数最大结合的抗体浓度)。下表展示结果。
表8.抗GCC抗体分子的EC50
抗体 EC50，TOK107-hIg，M EC50，细胞，M
5F9 3.65×10-8 1.24×10-9
抗GCC抗体分子的亲和力的测量.在22℃下使用BIACORETMT100系统(GE医疗(GEHealthcare)，新泽西州皮斯卡特维)测量抗GCC5F9抗体的亲和力。
步骤1：将MAb5F9(制剂A)于10mM乙酸钠(pH4.0)中稀释到20μg/mL，且将参照5F9MAb(制剂B)于10mM乙酸钠(pH4.0)中稀释到10μg/mL。使用标准胺偶合将每一mAb共价固定化到若干CM4BIACORE芯片。对于所制备的每一CM4芯片，使制剂A5F9以约75RU到100RU固定化于两个流动池上，而使制剂B5F9以约70RU到80RU固定化到一个流动池。使用每一CM4芯片的剩余第四个流动池作为参照流动池。
步骤2：使用皮斯(Pace)等人，蛋白质科学(ProteinScience)，4:2411(1995)以及皮斯和葛林斯力(Grimsley)，蛋白质科学实验室指南(CurrentProtocolsinProteinScience)3.1.1-3.1.9(2003)所详述的方法测定GCC-ECD-Fc(TOK107-hIg)的原液浓度。
步骤3：对于步骤1中所描述的每一所制备CM4芯片，以202nM到1.6nM(2×连续稀释)的浓度范围注射GCC-ECD-Fc并持续2分钟，然后进行7分钟解离。一式三份随机注射样品，其中散置数个缓冲液注射周期用于双重参照。为获得更显著的解离速率衰减数据，以2分钟注射和4小时解离时间执行额外的三次101nMGCC-ECD-Fc注射和额外的三次缓冲液注射。所有实验均使用100μL/min的流速，且利用10mM甘氨酸-HCl(pH2.0)的20秒脉冲使所有表面再生。所有样品均是在电泳缓冲液中制备，所述缓冲液为Hepes缓冲盐水、0.005％聚山梨醇酯20(pH7.4，HBS-P)且添加有100μg/mL的BSA。
步骤4：利用Scrubber2.0软件(生物学软件(BioLogicSoftware)，澳大利亚坎贝尔)处理所有感测图(表面电浆子共振对时间的图)数据，并使用CLAMPTM软件整体拟合到包括质量输送常数km项的1:1相互作用模型(米什卡(Myszka)和莫顿(Morton)，生物化学科学趋势(TrendsBiochem.Sci.)23:149-150(1998))。
1:1模型提供对数据的极良好拟合，只要使mAb固定化水平保持低到足以使源自感测图数据的整体分析的Rmax对于每一表面至少低于12RU即可。在大多数情形下，两个制剂A5F9表面中的一者具有对于可靠动力学测量来说过低(低于2RU)的Rmax。然而，只要可能时同时拟合来自相同CM4芯片的GCC-ECD-Fc与制剂A5F9结合的两个流动池的数据。当制备产生较高Rmax(>12RU)的mAb表面时，感测图明确显示络合物动力学，且因此1:1模型较差地拟合数据。此并不意外，这是因为以下事实：GCC-ECD-Fc是二价构筑体，且较高表面密度的经固定化mAb最可能增加GCC-ECD-Fc积极结合到表面的可能性。此研究所报道的复本仅包括很好拟合到1:1相互作用模型的那些数据。制剂A5F9和制剂B参照mAb的所有复本的所得KD和速率常数分别列示于表9和表10中。
表9：GCC-Fc与经固定化制剂A5F9mAb的结合
表10：GCC-Fc与经固定化制剂B5F9mAb的结合
毒素与抗体的结合
奥里斯他汀.可使用公开的程序(例如托利亚等人，自然生物技术，21:778-784(2003))执行通过奥里斯他汀的结合。概言之，将奥里斯他汀连接到抗体链的半胱氨酸。先通过还原抗体分子中的二硫键来实现与半胱氨酸的连接。对还原过程的控制力求将所述还原限制于一些(但不必全部)链间二硫键。因此，奥里斯他汀能够在游离半胱氨酸处结合。在淬灭结合反应后去除反应副产物且缓冲液交换成所需调配物。
简言之，在37℃下预平衡7.6mg/mL的抗GCC抗体分子，且然后添加15％体积的500mM硼酸钠(pH8.0)以将pH提高到7.5到8.0。所述溶液还含有1mMDTPA。通过添加每摩尔抗GCC抗体分子2.6当量的三(2-羧基乙基)膦(TCEP)并在37℃下搅拌来部分还原抗体。28分钟后，将经还原的抗GCC抗体分子的溶液置于冰上，然后立刻用4.8摩尔当量到4.9摩尔当量(相对于抗GCC抗体分子)的药物连接体(例如mc-vc-MMAF或mc-vc-MMAE或mc-MMAF)于DMSO中的20.5mM溶液处理。引入额外DMSO以使所述混合物达10体积％DMSO。将所述反应混合物在冰上搅拌约90分钟，然后用5倍摩尔过量的N-乙酰基半胱氨酸(相对于mc-vc-MMAF)处理。通过切向流过滤、先浓缩到约10mg/mL、然后利用约10个渗滤体积的PBS渗滤来分离所述结合物。所得抗体药物结合物具有每个抗体约4个药物-连接体单元的平均载药量。为方便起见，在以下实例和附图中，以以下缩写格式提到奥里斯他汀免疫结合物(不管载药量如何)：“Ab-vc-MMAF”是指与mc-vc-MMAF结合的抗GCC抗体分子；“Ab-vc-MMAE”是指与mc-vc-MMAE结合的抗GCC抗体分子；且“Ab-mc-MMAF”是指与mc-MMAF结合的抗GCC抗体分子。以相同格式提到包含特异性抗GCC抗体分子的免疫结合物，例如5F9-vc-MMAF、5F9-vc-MMAE和5F9-mc-MMAF。
为制备平均载药量为每个抗体约两个药物-连接体单元的抗体药物结合物，通过将TCEP的量减少50％来修改所述方案(上文)。药物连接体的量也减少50％。相应抗体药物结合物缩写为Ab-vc-MMAF(2)。
5F9vcMMAE的制备
使用与上文所述的一般方法类似的方法，使用本文中所描述的vc(Val-Cit)连接体使5F9mAb与命名为MMAE(式(XIII))的奥里斯他汀衍生物结合，以产生命名为5F9vcMMAE的免疫结合物。如先前所描述完成vc连接体与MMAE(西雅图遗传学公司(SeattleGenetics,Inc.)，华盛顿州巴萨尔)的结合(例如参见US2006/0074008)。
简言之，利用0.3M磷酸氢二钠将5F9mAb于100mM乙酸盐(pH5.8)中的17.8mg/mL溶液调节到pH8，从而产生11.3mg/ml的最终mAb浓度。然后，添加DTPA以于所述反应混合物中达1mM最终浓度。然后通过添加2.28摩尔当量的TCEP(相对于mAb的摩尔数)部分还原mAb，且然后在37℃下搅拌1.5小时。然后将经部分还原的mAb溶液冷却到4℃，且添加4.4摩尔当量的vcMMAE(相对于抗体的摩尔数)于DMSO中的20.3mM溶液。将所述混合物在22℃下搅拌30分钟，然后在添加5摩尔当量的N-乙酰基半胱氨酸(相对于vcMMAE的摩尔数)后再搅拌15分钟。通过利用10个渗滤体积的PBS(pH7.4)对免疫结合物的超滤/渗滤去除过量的经淬灭vcMMAE和其它反应组份。所得免疫结合物命名为5F9vcMMAE且具有下式：
其中Ab是5F9mAb，且m为1到8。平均载药量(m)为约3.6。在包含多个结合物的组合物中，附接到抗体的MMAE分子的平均数为3.6。
细胞毒性分析.为测量每一抗体结合、内化和杀伤标靶表达细胞的能力，执行细胞毒性分析。在此分析中，将细胞与各种浓度的未经结合的一级抗GCC抗体和固定浓度的无毒的DM1结合的抗人类Fc二级抗体(间接细胞毒性)或与各种浓度的毒素结合的抗GCCmAb(直接细胞毒性)一起培育。培育4天后通过WST分析测量细胞活力。人类抗GCC抗体对293-GCC2号细胞的相对效能显示于表8中，且使用DM1结合的小鼠抗人类IgGmAb来测定(从克隆HP607(CRL1753,ATCC)纯化MAH-IgG)。5F9和229为LD50为26pM和78pM的最强效抗GCCmAb。尽管本文中未显示，但误差通常在这些平均值的20％内，如通过复本范围或>2个复本的标准偏差所测量。
表11.抗GCC抗体对293-GCC2号细胞的细胞毒性分析结果
抗GCC Ab LD50(pM)
5F9 26
细胞表面结合.通过在间接免疫荧光分析中使用流式细胞术来评价未经结合的5F9或与奥里斯他汀结合的5F9的结合。将1×106个细胞/孔平铺于V底96孔板中，并与1μg/ml到0.001μg/ml的连续抗体稀释物一起在冰上培育1小时。用冷PBS中的3％FBS将细胞洗涤两次，并与1:200小鼠抗人类PEIgG(南方生物技术有限公司(SouthernBiotech)2043-09)一起在冰上培育1小时。再次洗涤细胞，并通过流式细胞术在BDFACSCantoII流式细胞仪上进行分析。使用FACSCantoII系统软件分析数据，且确定平均荧光强度。
与GCC截短突变体的细胞表面结合.生成GCCECD的截短突变体(FL成熟肽和8种截短(Δ1-32、Δ1-49、Δ1-94、Δ1-128、Δ1-177、Δ1-226、Δ1-279、Δ1-229和Δ1-379)，呈加FLAG标签的构筑体(pFLAG-CMV-3)形式，代表大约50个氨基酸缺失增量。于293细胞中表达构筑体，然后于经GCCECD突变体转染的293细胞的溶解物中通过抗GCC抗体分子进行免疫沉淀并针对FLAG表位进行西方墨点。抗体5F9结合具有Δ1-32突变的细胞，而不结合具有Δ1-49突变的细胞。当在氨基酸33到50之间截短蛋白质时，5F9与GCC的结合有所损失，此表明此区域参与5F9与其于GCC上的结合表位的识别。然而，由于大鼠和小鼠GCC序列与此区域中的人类GCC一致，且5F9不结合小鼠或大鼠GCC，故5F9抗体可能结合通过人类GCC的氨基酸33到50的存在所形成的构象表位。
实例2.毒素-连接体选择/ADC表征
在抗体药物结合物(ADC)策略(即高度强效的毒素与抗体的结合)中，毒素的细胞毒性可以标靶特异性方式针对肿瘤，从而将毒素递送到抗原表达肿瘤细胞而不影响正常组织中的抗原阴性细胞，由此减少全身性毒性。以与抗GCCmAb的ADC形式评价奥里斯他汀(尾海兔素10的类似物)和美登素类毒素。这些毒素均为微管聚合的抑制剂，用作抗有丝分裂剂。使细胞与游离毒素接触的测试指示游离毒素的细胞毒性在具有GCC表达的细胞与不具GCC的对照细胞之间无区别。在HT29-载体对HT29-GCC5号细胞中，这些游离毒素对293-载体、293-GCC2号细胞是强效的，如表12中所显示。
表12.游离毒素的细胞毒性
使不同毒素与抗体结合的化学过程有所不同且影响连接体稳定性。连接体稳定性通过影响血液或非标靶组织中的药物释放与肿瘤处的药物释放来影响治疗窗口。理想的ADC连接体在血液中时具有高稳定性，但在标靶介导的细胞进入后有效释放。
奥里斯他汀
评价三个奥里斯他汀-连接体对。为首先在活体外评价这些结合物且然后确定何种毒素-连接体用于大规模活体内研究，使5F9与vcMMAE、vcMMAF和mcMMAF(20mg/结合物)结合。
奥里斯他汀是与天然产物尾海兔素10相关的合成毒素。MMAE和MMAF有微妙差别，其中MMAF形式在R2位置具有羧酸基团，从而减少作为游离毒素的细胞渗透性和效能。MMAE是Pgp药物泵底物，而MMAF不是。
通过部分抗体还原过程、与马来酰亚氨基药物衍生物反应、利用过量半胱氨酸淬灭、浓缩和缓冲液交换成PBS来使奥里斯他汀与链间半胱氨酸结合。奥里斯他汀可附接有在细胞摄取后裂解的组织自溶酶B敏感性二肽连接体或不可裂解连接体。
在vc单甲基奥里斯他汀连接体中，缬氨酸瓜氨酸二肽连接是通过氨基甲酸对氨基苄基酯(PAB)基团附接到药物并通过马来二酰亚氨基己酰基结合基团附接到抗体。内化后，二肽连接体是通过溶酶体蛋白酶组织自溶酶B裂解，PAB基团自我破坏，并释放游离毒素。此连接体经设计以维持血清稳定性，同时使通过组织自溶酶B的细胞内药物释放最大化。
奥里斯他汀还可通过直接附接到马来酰亚氨基结合基团的不可裂解连接体(例如MMAF)连接到抗体，且无肽酶敏感性连接体。MC结合的ADC也在标靶介导的细胞杀伤方面有效。
认为不可裂解的奥里斯他汀结合物的药物释放机制是通过溶酶体中的一般抗体降解。通过LC/MS研究已报道Ab-mcMMAF结合物释放呈单一半胱氨酸加合物形式的毒素。
抗体药物结合物的结合
所有5F9抗体药物结合物同样结合到293-GCC2号细胞。表10显示在渐增浓度293-GCC2号细胞下5F9结合物的平均荧光强度。其它研究确定，5F9-SPDB-DM4结合物以浓度依赖性方式结合293-GCC2号细胞，而209-SPDB-DM4抗体不结合。
表13.来自5F9和5F9结合物于293GCC2号细胞中的结合分析的MFI的图表：
在经GCC核酸转染并针对GCC表达选择的多种细胞的直接细胞毒性分析中测试5F9-奥里斯他汀毒素结合物。GCC的表面表达量的调查发现293GCC2号细胞表达大量GCC；HT292号和CT262.5号细胞以中等到较低的量表达GCC；CT2632号细胞以高水平表达GCC；且HT29GCC5号和HT29GCC18号表达少量GCC。表11显示产生三种奥里斯他汀结合物在细胞表达标靶中或在野生型细胞或载体对照细胞中的细胞毒性数据的多个研究的汇编。在5F9结合的毒素的所有情形下均观察到对293GCC2号细胞的标靶增强的杀伤，其中当相对于MMAE使用MMAF时窗口大大增加。MMAF的可裂解和不可裂解两种形式具有类似效能。作为阴性对照，还利用sc209抗体制备抗体药物结合物，sc209抗体为针对不相关标靶产生的人类IgG1单克隆抗体，且对GCC无反应性。在293细胞模型和HT29细胞模型中，利用209ADC对5F9vcMMAFADC的直接细胞毒性分析显示标靶增强的细胞杀伤。5F9结合的毒素活性在细胞系中的比较指示细胞毒性程度与细胞所表达的GCC量具有一定相关性。这些数据表明，至少一些表达最多GCC的细胞系比表达较少量GCC的细胞更易受结合物的细胞毒性活性影响。关于每个细胞的相对GCC数参见实例1。细胞毒性程度差异的另一因素可能为结合物的内化或细胞内处理的差异，其可在野生型细胞系中有所变化。
表14.抗GCC奥里斯他汀ADC的细胞毒性.
若这些效能在活体内转化且在mcMMAF与vcMMAF之间效力相等，则mcMMAF的所预测MTD较高可表明此结合物的治疗窗口较大。
实例3：活体内评价
肿瘤模型：
在小鼠异种移植物模型中评价5F9ADC的活体内细胞毒性。利用HT29-GCC5号和18号细胞系进行初始活体内工作。还测试293-GCC2号细胞系的活体内生长，并研发为可连续移植的套针模型。
为解决异种移植物模型中的GCC表达量是否与患有转移性结肠癌的患者中的GCC表达量相关的问题，通过异种移植物组织、人类原发性结肠肿瘤和转移的IHC分析比较GCC表达量。将一组新鲜冷冻细胞系和组织用于通过IHC利用针对GCC3G1的小鼠mAb进行的GCC定量。对于IHC定量，使用半定量0到3评分系统进行评分。若肿瘤模型GCC含量≤临床GCC含量，则建模将可能为准确的或高估临床上所需要的暴露。若肿瘤模型GCC含量>临床GCC含量，则建模可低估临床上所需要的暴露。
虽然转移性样品中的GCC表达存在一些可变性，但通过HT29-GCC5号和18号细胞的表达在许多转移性样品的范围内。通过IHC，HT29-GCC5号和18号细胞上的GCC染色等于或低于转移性细胞上的GCC染色。此数据表明肿瘤模型是以于metCRC的临床样品中所见的水平相当的水平表达GCC。
表16代表在192小时时间点收获的各种组织的闪烁计数，且代表三个动物的平均值。相对于HT29-载体肿瘤，5F9优先在HT29-GCC5号肿瘤中积累，而209不显示显著不同的积累。此结果支持，可预期5F9抗体药物结合物在GCC表达肿瘤中积累。在所评价的其它所有组织中，5F9对mAb209的抗体积累程度的差异极小。
经放射性标记的5F9于携带HT29-GCC5号和HT29-载体肿瘤的小鼠中的活体内分布
在携带肿瘤的小鼠中执行放射成像研究，以评价抗GCC抗体5F9和阴性对照抗体sc209(靶向不相关细胞表面标靶的人类IgG1单克隆抗体)的肿瘤靶向和活体内生物分布。使用DTPA作为双功能螯合剂用111In放射性标记所述抗体。利用GCC(-)和GCC(+)肿瘤二者的鼠类双肿瘤模型研究活体内性质(包括肿瘤靶向和在正常组织中随时间的生物分布)。获得活体内图像(SPECT/CT)，且使用组织放射活性计数补充空间分辨率。
使皮下肿瘤在裸小鼠中生长，其中HT29-载体肿瘤在右边且HT29-GCC5号肿瘤在左边。以0.3mCi＝15μg/动物投用抗体。每组有三只动物，且在1h、24h、48h、72h、120h和192h时收获各组。
来自192h组动物的组织的调查指示5F9和209二者在大部分正常组织(例如血液、心脏、胃、小肠、大肠、肌肉和皮肤)中和HT29-载体对照肿瘤中积累到类似程度。Ab209在肝中积累的水平略高于5F9的水平，且5F9在肺、脾和肾中积累到略高于209的水平。在HT29-GCC5号肿瘤中，5F9优先以209积累含量的2倍以上的含量积累。此结果支持，可预期5F9抗体药物结合物在GCC表达肿瘤中积累。
为理解肿瘤中的抗体积累的动力学，获得每一抗体在整个研究中所有时间点的肿瘤数据。唯一显示积累的组织为于GCC表达肿瘤中的5F9抗体。所有其它组织中的放射性活性程度保持相对平坦，其中在5F9程度与209程度之间存在少许差异。5F9优先在HT29-GCC5号肿瘤中积累，而209不显示任何积累。此结果支持，可预期5F9抗体药物结合物在GCC表达肿瘤中积累。
表16.经111In标记的GCC特异性mAb而非对照mAb到表达GCC的肿瘤的积累.
平均ID 5F9％ 平均ID对照IgG％
1hr 2.816+/-0.133 2.494+/-0.167
24hr 3.057+/-0.107 3.010+/-0.630
72hr 4.485+/-1.029 3.564+/-0.152
120hr 5.162+/-1.012 3.412+/-0.048
192hr 6.550+/-1.015 2.782+/-0.085
经放射性标记的5F9于GCC表达肿瘤中经7天的积累支持每周一次给药时间表。
于HT29-GCC5号s.c.肿瘤中的先导性效力研究
在携带HT29-GCC5号肿瘤的小鼠中执行研究以确定有效结合物和剂量方案。以单一或多个剂量向小鼠给药。这些研究确定，以较高量的毒素结合物(例如根据q3d×5时间表150μg/kg5F9vcMMAF)过于频繁给药存在毒性。另一研究确定，q14d×5时间表在此模型中过于不频繁以致于不允许一些毒素结合物相对于对照显示显著效力。另外，在此模型中利用类美登素-抗体结合物的PD研究展示仅利用DM4毒素而非DM1毒素的剂量依赖性磷酸化组蛋白积累。在此模型中的另一研究显示非GCC特异性209-毒素结合物的一些肿瘤生长抑制。这些结果表明需要评价其它活体内模型。
在携带293-GCC2号肿瘤的小鼠中利用5F9ADC的PK/PD研究.
替代肿瘤模型使用293-GCC2号细胞。在携带293-GCC2号肿瘤的小鼠中执行针对5F9ADC的PD研究。利用单一剂量的5F9vcMMAF以75μg/kg或150μg/kg向小鼠给药，且在1hr直到4天的时间点处采集血清用于磷酸化组蛋白H3的PD分析来测试毒素对肿瘤细胞的抗有丝分裂作用。通过肿瘤的石蜡包埋切片的抗体(阿珀斯特生物技术公司(UpstateBiotechnology)，纳米利泼(nowMillipore)，马萨诸塞州比尔里卡)染色检测磷酸化组蛋白H3。表17中的数据显示每一ADC使得肿瘤中的pH3阳性细胞群显著增加，此指示其每一者以75μg/kg和150μg/kg毒素剂量当量均能够到达肿瘤并对肿瘤细胞具有所需抗有丝分裂作用。
表17.如通过在单一iv剂量的5F9ADC后细胞在有丝分裂方面的停滞(pH3阳性肿瘤细胞％)评估的PD反应.
类似研究测量利用5F9vcMMAF、5F9-SPDB-DM4和5F9-SMCC-DM1治疗的携带293-GCC2号肿瘤的小鼠中的磷酸化组蛋白含量。利用单一剂量以150μg/kg向小鼠给药，且在1hr直到21天的时间点处采集血清用于总抗体和毒素结合的抗体二者的PK分析。293-GCC2号肿瘤中磷酸化组蛋白H3阳性细胞的百分数响应所有三种ADCS而增加：5F9vcMMAF、5F9-SMCC-DM1和5F9-SPDB-DM4。最大磷酸化组蛋白H3含量与基线相比增加3倍到5倍，其中在注射后24小时具有峰值。
在293-GCC2号s.c.肿瘤中利用5F9vcMMAF和5F9-DMx的效力研究
以两种剂量(75μg/kg和150μg/kg毒素)根据q14d×5时间表测试5F9-SPDB-DM4、5F9-SMCC-DM1和5F9vcMMAF在293-GCC2号肿瘤模型中的效力。具体来说，此研究包括经媒剂治疗的对照、Sc209-DM1(150μg/kgDM1当量)、Sc209-DM4(150μg/kgDM4当量)、Sc209-vcMMAF(150μg/kgMMAF当量)、5F9-DM1(150μg/kgDM1当量)、5F9-DM1(75μg/kgDM1当量)、5F9-DM4(150μg/kgDM4eg)、5F9-DM4(75μg/kgDM4当量)、5F9-vcMMAF(150μg/kgMMAF当量)和5F9-vcMMAF(75μg/kgMMAF当量)。使用携带293-GCC2号细胞的泰克尼克(Taconic)雌性小鼠(10只小鼠/组)。
图1绘示根据q14d时间表用5F9vc-MMAF、5F9-DM1和5F9-DM4治疗的携带293-GCC2号的SCID小鼠中的肿瘤生长。利用5F9-SPDB-DM4在293-GCC2号模型中观察到剂量依赖性效力，而209-SPDB-DM4对照没有任何作用。5F9-SMCC-DM1也有效，然而不如150μg/kg的5F9-SPDB-DM4有效。5F9vcMMAF(75μg/kg和150μg/kg)最有效，然而209vcMMAF也具有一些活性。因此，在这些剂量和时间表下，5F9-SPDB-DM4与其对照结合物具有最大有效差别。
在293-GCC2号s.c.肿瘤中利用5F9vcMMAF和5F9-DMx的效力研究
以两种剂量(75μg/kg和150μg/kg毒素)根据q7d×5时间表测试5F9-SPDB-DM4和5F9-SMCC-DM1在293-GCC2号肿瘤模型中的效力。具体来说，此研究包括经媒剂治疗的对照、5F9单独(15mg/kg)、DM1(300μg/kg)、DM4(300μg/kg)、Sc209-DM1(150μg/kgDM1当量)、Sc209-DM4(150μg/kgDM4当量)、Sc209-vcMMAF(150μg/kgMMAF当量)、5F9-DM1(150μg/kgDM1当量)、5F9-DM1(75μg/kgDM1当量)、5F9-DM4(150μg/kgDM4当量)和5F9-DM4(75μg/kgDM4当量)。使用携带293-GCC2号细胞的泰克尼克雌性小鼠(10只小鼠/组)。
在293GCC2号肿瘤中利用奥里斯他汀结合物的效力研究
用5F9与vcMMAE、vcMMAF或mcMMAF的结合物以三种剂量治疗携带293GCC2号肿瘤的SCID小鼠，与209与这些毒素或游离毒素的结合物或媒剂对照进行比较。根据q7d×4时间表iv投予各剂量。在第3天、第7天、第10天、第13天和第17天收获肿瘤。用对照试剂治疗的小鼠中的肿瘤展示体积持续增加。用5F9奥里斯他汀结合物治疗的肿瘤显示此肿瘤生长的剂量依赖性和时间依赖性抑制。表18提供结果汇总(TGI＝肿瘤生长抑制，T/C＝治疗/对照，TGD＝肿瘤生长延迟，CR/PR＝完全反应/部分反应；p值＝判断统计学显著性的量度，NS＝不显著)。
表18.携带293GCC2号肿瘤的小鼠中的奥里斯他汀ADC的分析.
组 TGI T/C TGD CR/PR P值
209-vcMMAE 300μg/kg 24.5 0.76 0.9 0 0.38>0.05NS
209-vcMMAF 150μg/kg 29.4 0.71 1.4 0 0.27>0.05NS
209-mcMMAE 150μg/kg 36.5 0.63 1.4 0 0.15>0.05NS
游离MMAE 300μg/kg 35.6 0.64 2 0 0.18>0.05NS
游离mcMMAF 150μg/kg -3.4 1.03 -1.3 0 0.73>0.05NS
5F9-vcMMAE 300μg/kg 96.9 0.03 9/10PR <0.001
5F9-vcMMAE 150μg/kg 83.5 0.17 2/10PR <0.01
5F9-vcMMAF 150μg/kg 97 0.03 9/10PR <0.001
5F9-mcMMAF 150μg/kg 97 0.03 9/10PR <0.001
5F9-vcMMAE 75μg/kg 54.5 0.45 4.4 0.01<p<0.05
5F9-vcMMAF 75μg/kg 88.5 0.12 6/10PR <0.001
5F9-mcMMAF 75μg/kg 87.5 0.13 7/10PR ＝0.001
5F9-vcMMAF 37.5μg/kg 65.2 0.35 7.1 ＝0.01
5F9-mcMMAF 37.5μg/kg 63.6 0.36 5.8 ＝0.01
根据q7d时间表，这些ADC中的所有三者在293GCC2号模型中是有效的。5F9-vcMMAF和5F9-mcMMAF比5F9-vcMMAE更强效，此与活体内PD(pHisH3)和活体外细胞毒性数据相关。
在T84s.c.肿瘤中利用5F9vcMMAF和5F9-DMx的效力研究
以两种剂量(75μg/kg和150μg/kg毒素)根据q7d×5时间表测试5F9-SPDB-DM4和5F9-SMCC-DM1在T84肿瘤模型中的效力。具体来说，此研究包括经媒剂治疗的对照、5F9单独(15mg/kg)、DM1(300μg/kg)、DM4(300μg/kg)、Sc209-DM1(150μg/kgDM1当量)、Sc209-DM4(150μg/kgDM4当量)、Sc209-vcMMAF(150μg/kgMMAF当量)、5F9-DM1(150μg/kgDM1当量)、5F9-DM1(75μg/kgDM1当量)、5F9-DM4(150μg/kgDM4当量)和5F9-DM4(75μg/kgDM4当量)。使用携带T84细胞的泰克尼克雌性小鼠(10只小鼠/组)。(“Sc209-[毒性]”或“209-[毒性]”是指在本文中所描述研究中用作对照的非GCC靶向ADC)。
ADC在原发性肿瘤模型中的抗肿瘤活性
实施两个类似研究，以测定5F9-vcMMAE的活体内抗肿瘤活性，并比较在各种剂量和给药时间表下在PHTX-9c原发性人类结肠肿瘤异种移植物小鼠中5F9-vcMMAE与游离毒素MMAE和非GCCvcMMAE抗体毒素结合物(209-vcMMAE)的抗肿瘤活性，并测定治疗后的再生长动力学。对雌性CB-17SCID小鼠(8周龄)皮下(SC)接种到具有PHTX-9c肿瘤片段(2mm×2mm)的侧腹中。使用游标卡尺每周两次监测肿瘤生长，且使用式(0.5×[长度×宽度2])计算平均肿瘤体积。当平均肿瘤体积达到大约150mm3(研究A)或160mm3(研究B)时，将动物随机分成治疗组(对于研究A来说n＝10/组且对于研究B来说n＝9/组)。
以如下方式治疗(研究A)小鼠：根据每周一次(QW)给药时间表(3个剂量)利用0.938mg/kg、1.875mg/kg、3.75mg/kg或7.5mg/kg5F9-vcMMAE静脉内(IV)治疗20天，或根据QW(每周一次)时间表利用包括媒剂(0.9％盐水)、0.075mg/kg或0.15mg/kgMMAE的对照IV治疗20天，或根据QW给药时间表利用1.875mg/kg或3.75mg/kg209-vcMMAEIV治疗20天。在第二研究(研究B)中，以如下方式治疗小鼠：根据QW时间表(3个剂量)利用0.938mg/kg、1.875mg/kg、3.75mg/kg、7.5mg/kg或10.0mg/kg5F9-vcMMAEIV治疗20天，或根据每周两次(BIW)时间表(6个剂量)利用3.75mg/kgIV治疗20天，或利用包括媒剂、7.5mg/kg或10mg/kg209-vcMMAE的对照治疗20天，或根据QW时间表利用0.135mg/kg或0.18mg/kgMMAEIV投予20天。在QW时间表的第1天、第8天和第15天和BIW时间表的第1天、第4天、第8天、第11天、第15天和第18天投予各剂量。通过以下原理计算游离MMAE的剂量以匹配免疫结合物剂量中的MMAE量：MMAE的当量剂量为MLN0264剂量的1.8％。连接体+MMAE的当量剂量为5F9-vcMMAE剂量的4％。这些计算是基于平均3.9个MMAE分子/抗体和150kD的游离抗体分子量。实际抗体分子量将因糖基化程度而略有不同。
每周两次测量肿瘤体积和体重，并持续超过治疗期，以测量再生长动力学，如通过肿瘤生长延迟(TGD)来证明。持续进行肿瘤体积测量直到肿瘤体积达到治疗组内的单一小鼠体重的10％为止，此时终止所述组。在第20天测定肿瘤生长抑制(TGI)的百分数([对照组的平均肿瘤体积-治疗组的平均肿瘤体积]/对照组的平均肿瘤体积；T/C比)。使用双尾韦尔奇(Welch)t-测试比较治疗组间的T/C比与对照组的T/C比。由于若一个肿瘤达到大小极限(大约1000mm3)则终止整个组，故可不能计算平均再生长缓慢的组的TGD。
使用线性混合作用消退模型评估在治疗组的各对之间肿瘤生长趋势随时间的差异。这些模型解释在多个时间点处测量每一动物的事实。针对每一比较拟合单独模型，且使用来自模型的预测值计算每一治疗组的曲线下面积(AUC)。然后计算AUC相对于参照组的降低百分比(dAUC)。统计学上显著的P值(<0.05)表明两个治疗组随时间的趋势不同。结果汇总于下表19和20中。
在两个研究中在所有5F9-vcMMAE治疗组中均观察到抗肿瘤活性，且显示所述作用为剂量依赖性的。两个研究的结果相当。在根据QW时间表用0.938mg/kg5F9-vcMMAEIV治疗的小鼠中，与媒剂组相比TGI为20.7％到21.4％，p值为<0.05。在根据QW时间表IV投予的1.875mg/kg治疗组中，TGI为41.3％到44.7％，p值为<0.001。在根据QW时间表IV投予的3.75mg/kg治疗组中，与媒剂组相比TGI为65.3％到65.7％(p<0.001)。以7.5mg/kgIVQW投予的5F9-vcMMAE产生84.1％到84.3％的TGI(p<0.001)，且10mg/kgIVQW(仅研究B)产生91.2％的TGI(p<0.001)。当根据BIW时间表(S)IV投予3.75mg/kg时，观察到显著抑制，其中TGI为84.9％(p<0.001)。
在7.5mg/kg和10.0mg/kg的较高209-vcMMAE剂量下观察到中等抗肿瘤活性，其中TGI分别为35.7％和45.4％(p<0.001)，但低剂量的209-vcMMAE(1.875mg/kg和3.75mg/kg)不呈现抑制(p>0.05)。通过高209-vcMMAE观察到的抗肿瘤活性可能归因于免疫结合物的MMAE部分的非特异性活性。
投予游离毒素MMAE产生混合结果：IVQW投予的0.075mg/kg、0.135mg/kg和0.15mg/kg不产生肿瘤生长抑制(p>0.05)，但IVQW投予0.18mg/kg产生50.4％的TGI(p<0.001)。
在治疗期期间观察到的最大的最大体重损失为在研究B的游离毒素0.18mg/kgMMAE组和同一研究的0.938mg/kg5F9-vcMMAE组中第7天的2.3％。此指示所述药物耐受良好。
超过治疗期仍持续进行肿瘤体积测量直到肿瘤体积达到治疗组内单一小鼠体重的10％，且然后终止治疗组。在这些研究中，肿瘤再生长似乎为剂量依赖性的。
表19.SCID小鼠中的原发性人类结肠肿瘤异种移植物的治疗的研究A结果.
表20.SCID小鼠中的原发性人类结肠肿瘤异种移植物的治疗的研究B结果.
在CT26hGCC/luc32号播散性模型(balb/c小鼠)中利用裸5F9抗hGCC抗体的先导性效力研究
此模型测试裸抗体结合到循环中的GCC表达肿瘤细胞和预防新肿瘤产生的能力。通过i.v.利用CT26hGCC/luc32号细胞以1×105个/小鼠和5×105个/小鼠对雌性balb/c小鼠接种。向对照组投予媒剂0.9％NaCl和非特异性抗体(裸209)用于与投予裸5F9比较。两种抗体经改造(在pLKTOK58载体中)以具有IgG1同种型，故在结合到细胞表面抗原(即针对5F9的GCC和针对209的不相关标靶)后其Fc区可引发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性反应。在通过i.v.利用一次/周i.v×4(q7d×4)的给药时间表接种的前一天开始给药。通过Xenogen成像系统每周两次监测肿瘤生长。也每周两次监测体重和存活二者。在此研究结束时获取肺重量和包括MRI图像的图像。
如图2中所显示，5F9组(40mg/kg和10mg/kg；1×105个/小鼠)显示效力(在接种后第34天：T/C(治疗/对照)为0.04到0.05)。与209组相比5F9组的T/C在接种后第34天为0.18到0.14。与0.9％NaCl(生理盐水)组相比20940mg/kg组的T/C为0.64。在5×105组中利用5F9未见益处。
在此研究结束时每一组的肺重量显示于图3中。T测试：媒剂相对于20940mg/kgP＝0.4；媒剂相对于5F940mg/kgP<0.05；媒剂相对于5F910mg/kgP<0.01。对肺的目测确认，5F9-治疗组中的肿瘤结节少于媒剂或209-治疗组。小鼠的活体内MRI显示在媒剂治疗小鼠中大量肺肿瘤渗出到周围组织和心脏移位。在5F940mg/kg治疗小鼠中，看见正常肺呈现且无肿瘤的证据。
存活曲线显示于图4中。观察到利用5F9治疗组(1×105)的存活显著增加，且在5F910mg/kg与40mg/kg组之间无差别。
实例4：生成抗体产生细胞系
为生成以>600mg/L的生产率表达5F9的稳定CHO细胞系克隆，通过将轻链可变区(SEQIDNO:19)和重链可变区(SEQIDNO:17)亚克隆到含有WT人类IgG1Fc和新霉素抗性基因的pLKTOK58表达载体中来生成5F9的表达载体。5F9可变区-IgG1融合产物的表达处在EF-1a启动子的控制下。
抗GCC人类单克隆抗体5F9可变区的克隆和测序
从人类杂交瘤46.5F9亚克隆8.2分离(凯杰(Qiagen)的RNeasy试剂盒)总RNA。此杂交瘤携带轻链的“标准”公开κ恒定区(基因库登录号AW383625或BM918539)和重链的“标准”公开IgG2恒定区(基因库登录号BX640623或AJ294731)。通过传统方法(自然方法(NatureMethods)2,629-630(2005))合成5’race-ready多聚G尾cDNA。从cDNA通过5’race使用多聚C锚定寡聚糖与特异性针对κ恒定区的反向引物的组合PCR扩增轻链可变区。利用特异性针对IgG2恒定区的反向引物与特异性针对已知重链前导序列的正向引物的多个组合扩增重链可变区。对PCR产物进行克隆(InvitrogenTM，生命技术公司(LifeTechnologies,Inc.))，并利用M13F和M13R引物测序。
携带抗GCC人类单克隆抗体5F9的哺乳动物表达载体的构筑
构筑携带5F9轻链和重链可变区的哺乳动物表达载体以生成产生CHO细胞系。对于天然构筑体，将5F9轻链和重链的可变区亚克隆到pLKTOK58D(美国专利申请案第20040033561号)中。此载体携带两种哺乳动物选择标记物：新霉素抗性和DHFR/甲氨蝶呤(用于扩增)。所述载体允许从串联EF1α启动子共表现轻链和重链二者，所述串联EF1α启动子各自位于载体的前导序列-κ恒定区和前导序列-IgG1(野生型Fc)恒定区的上游。对于亚克隆，从序列经确认的TOPO克隆利用含有独特限制位点的基因特异性引物PCR扩增轻链和重链的可变区以定向克隆到载体的各别前导序列-κ和前导序列-IgG1区域的接点中。引物的序列如下(5F9可变区特异性序列呈粗体)：
天然5F9轻链前导序列可变引物：
正向NotI
5’ataagaatGCGGCCGCCTCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGC AACAGCTACAGGTGTCCACTCC -3’(SEQIDNO:21)
反向BsiWI
5’-GCCACCGTACG -3’(SEQIDNO:22)
天然5F9重链前导序列可变引物
正向EcoRI
5’ccgGAATTCCTCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGC TACAGGTGTCCACTCC -3’(SEQIDNO:23)
反向Blpl
5’-GGAGGCTGAGC -3’(SEQIDNO:24)
通过轻链和重链二者的双链DNA测序确定克隆。
使用两种转染方法将构筑体引入CHO细胞中：传统MPI方法和Crucell方法。利用天然5F9构筑体使用传统MPI方法起始CHO细胞转染。使用线性化和非线性化DNA并利用电穿孔或Lipopfectamine2000CD转染。通过于G418、非核苷培养基和5nM甲氨蝶呤中选择生成大约30个稳定库。基于抗体产生量的FMAT分析，选择3个稳定库用于克隆。具有最高产量的库分泌12.2μg/ml抗体。这3个库已经冷冻。
可评价CrucellSTAR元件以制备含有STAR元件的5F9表达载体。
5F9/hIgG1重链核苷酸序列为：
GAATTCCTCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTTTGGTGGGTCTTTCAGTGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGGAAATCAATCATCGTGGAAACACCAACGACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCGCCCTGAAGCTGAGTTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCTGTTTATTACTGTGCGAGAGAACGTGGATACACCTATGGTAACTTTGACCACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCAGCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAATAGGGATAACAGGGTAATACTAGAG(SEQIDNO:31)
5F9/hIgG1重链蛋白质序列为：
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVFGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHRGNTNDNPSLKSRVTISVDTSKNQFALKLSSVTAADTAVYYCARERGYTYGNFDHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:32)
5F9/hκ轻链核苷酸序列为：
GCGGCCGCCTCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGAAACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGAATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCGGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATAAAACCTGGCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAACGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGTCTAGA(SEQIDNO:33)
5F9/hκ轻链蛋白质序列为：
MGWSCIILFLVATATGVHSEIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSRNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTIGSLQSEDFAVYYCQQYKTWPRTFGQGTNVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQIDNO:34)
将5F9的下文所列示的重链和轻链核酸序列插入pTOK58D载体中：
atgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacaggtgtccactccgaaatagtgatgacgcagtctccagccaccctgtctgtgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagaaacttagcctggtatcagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatggtgcatccaccagggccactggaatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagagttcactctcaccatcggcagcctgcagtctgaagattttgcagtttattactgtcagcagtataaaacctggcctcggacgttcggccaagggaccaacgtggaaatcaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgaccctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag(SEQIDNO:35)
atgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacaggtgtccactcccaggtgcagctacagcagtggggcgcaggactgttgaagccttcggagaccctgtccctcacctgcgctgtctttggtgggtctttcagtggttactactggagctggatccgccagcccccagggaaggggctggagtggattggggaaatcaatcatcgtggaaacaccaacgacaacccgtccctcaagagtcgagtcaccatatcagtagacacgtccaagaaccagttcgccctgaagctgagttctgtgaccgccgcggacacggctgtttattactgtgcgagagaacgtggatacacctatggtaactttgaccactggggccagggaaccctggtcaccgtcagctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaataa(SEQIDNO:36)
将下文编码Abx-229重链和轻链序列的序列插入pTOK58D载体中：
atggagtttgggctgagctggctttttcttgtggctattttaaaaggtgtccagtgtgaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttagccgctatgccatgaactgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaggtattagtgggagtggtggtaggacatactacgcagactccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaattccaagaacacactatatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtatattactgtgcgaaagatcgcgatttttggagtggtccatttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtcagctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaataa(SEQIDNO:37)
atgaggctccctgctcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccactggagaaatagtgatgacgccgtcttcagccaccctgtctgtgtctccaggggagagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagtagaaacttagcctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatggtgcatccaccagggccactggtatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagaattcactctcaccatcagcagcctgcagtctgaagattttgcagtttattactgtcaccagtatagtaactggatgtgcagttttggccaggggaccaagctggagatcaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgaccctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag(SEQIDNO:38)
实例5：原发性人类转移性结肠直肠肿瘤中的GCC表达
研发兔单克隆抗GCC抗体(在本文中称为MIL-44-148-2)以定量评价雌性SCID小鼠中的四种源自mCRC患者样品的不同原发性人类肿瘤异种移植物(“PHTX”)(在本文中称为PHTX-09c、PHTX-21cm、PHTX-17c和PHTX-11c)中的GCC表达。使用先前确认具有较高的GCC表达量的源自GCC转染细胞系的肿瘤异种移植物模型(HEK293-GCC2号)作为对照。
使用艾必通(Epitomics)的服务(加利福尼亚州伯灵格姆)生成针对如下重组蛋白的抗GCC兔单克隆抗体：组合与其中两个突变Fc受体结合区域(FcR)经突变以防止Fc受体结合的小鼠IgG2aFc区(mIgG2aFcRmutII)融合的人类GCC的细胞外区域。在艾必通通过融合来自经免疫兔的分离B细胞与艾必通的专门融合伴侣细胞系生成真正的兔-兔杂交瘤(参见美国专利7,402,409；7,429,487；7,462,697；7,575,896；7,732,168；和8,062,867)。通过ELISA和流式细胞术(FCM)测试并确认抗体对GCC的特异性。通过ELISA和流式细胞术(FCM)测试并确认抗GCC抗体的特异性。筛选若干克隆用于免疫组织化学，且选择具有最优活性的MIL-44-148-2克隆。
测定轻链和重链可变区的序列。下表21是MIL-44-148-2抗GCC抗体的可变区的SEQIDNO的汇总。重链和轻链中每一者的可变区的氨基酸和核酸序列分别显示于表22和23中。
MIL-44-148-2抗体的重链和轻链的CDR中的每一者的氨基酸和核酸序列分别显示于表24和25中。
表21：抗GCC兔mAb的重链和轻链的SEQIDNO的汇总
mAb IgG链 核酸SEQ ID NO 氨基酸SEQ ID NO
MIL-44-148-2H2 重链 39 40
MIL-44-148-2L5 轻链 41 42
MIL-44-148-2H2核酸(SEQIDNO:39)
ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTCAGTCAGTGAAGGAGTCCGGGGGAGGCCTCTTCAAGCCAACGGATACCCTGACACTCACCTGCACCGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGTCATAGAATGAACTGGGTCCGCCAGACTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGCAATCATTACTCATAATAGTATCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAAGCCGATCCACCATCACCAGAAACACCAGCGAGAACACGGTGACTCTGAAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACTTATTTCTGTGCCAGAGAGGATAGTATGGGGTATTATTTTGACTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCCTCA
GGGCAACCTAAGGCTCCATCAGTCTTCCCACTGGCCCCCTGCTGCGGGGACACACCCAGCTCCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGGTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTCGGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACGTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAAGCCCACGTGCCCACCCCCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGGCCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAATGA
MIL-44-148-2H2氨基酸(SEQIDNO:40)
METGLRWLLLVAVLKGVQCQSVKESGGGLFKPTDTLTLTCTVSGFSLSSHRMNWVRQTPGKGLEWIAIITHNSITYYASWAKSRSTITRNTSENTVTLKMTSLTAADTATYFCAREDSMGYYFDLWGPGTLVTISSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK
MIL-44-148-2L5核酸(SEQIDNO:41)
ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCTGTGGAGGTAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAGTAACTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCCAAGCCCCTGATCTACAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGGTTCAGAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGTGGCGTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAGCAGACTTATACTAATAATCATCTTGATAATGGTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAA
GGTGATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCTACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAGAGTACACCTGCAGGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGGTGACTGTTAG
MIL-44-148-2L5氨基酸(SEQIDNO:42)
MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCAYDMTQTPASVEVAVGGTVTIKCQASQSISNWLAWYQQKPGQSPKPLIYRASTLASGVSSRFRGSGSGTQFTLTISGVECADAATYYCQQTYTNNHLDNGFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCRVTQGTTSVVQSFNRGDC
表22：抗GCC兔mAb的mAb可变区的氨基酸序列
表23：抗GCC兔mAb的mAb可变区的核酸序列
表24：抗GCC兔mAb的CDR的氨基酸序列
mAb IgG SEQ ID NO: 氨基酸序列
MIL-44-148-2-H2 VH CDR1 49 SHRMN
MIL-44-148-2-H2 VH CDR2 50 IITHNSITYYASWAKS
MIL-44-148-2-H2 VH CDR3 51 EDSMGYYFDL
MIL-44-148-2-L5 VK CDR1 52 QASQSISNWLA
MIL-44-148-2-L5 VK CDR2 53 RASTLAS
MIL-44-148-2-L5 VK CDR3 54 QQTYTNNHLDNG
表25：抗GCC兔mAb的CDR的核酸序列
利用MIL-44-148-2的免疫组织化学
对5μm厚切片评估原发性人类肿瘤异种移植物的经福尔马林(Formalin)固定且石蜡包埋(FFPE)的组织中的GCC蛋白含量，并在闻他纳医疗系统(VentanaMedicalSystems)(亚利桑那州图森)Discovery自动化染色器上与MIL-44-148-2抗体(3.5μg/mL)一起培育1小时。利用兔抗山羊二级抗体(载体实验室(VectorLaboratories))使抗体生物素化，并利用3,3’-二氨基贝斯丁(3,3’-diaminobexidine，DAB)衬底定位系统(闻他纳医疗系统)显影。利用苏木精对载玻片进行对比染色，并使用艾贝欧全像扫描系统(Aperiowholeslidescanningsystem)成像。
图5A到5E绘示各种肿瘤异种移植物模型中IHC分析的结果。如图5A到5E中所显示，GCC含量在原发性人类肿瘤异种移植物间有所不同，其中评分在源自HEK293-GCC肿瘤异种移植物的细胞中为4+，在源自mCRC患者的各种PHTX肿瘤异种移植物中为1+、2+和2到3+。
测试不同浓度的5F9vcMMAE免疫结合物在四种原发性人类肿瘤异种移植物模型中的单一药剂抗肿瘤活性，以探究GCC表达量在肿瘤敏感性方面是否起作用。使用利用针对不相关标靶产生且与GCC无交叉反应性的人类IgG1单克隆抗体制备的基于MMAE的抗体药物结合物(在图6A到6E中称为209-vcMMAE)作为阴性对照。还使用游离MMAE作为阴性对照。各种异种移植物模型中的5F9vcMMAE剂量范围、给药时间表和相应效力的汇总显示于下表26中(T/C＝肿瘤/对照的体积)。
表26：原发性人类肿瘤异种移植物模型中的5F9vcMMAE活体内效力研究
各种异种移植物模型中的单一药剂活体内活性的结果绘示于图6A到6E中。如图6A中所显示，在如上文所描述的IHC分析中所展示具有相对较高的GCC抗原密度(评分2到3+)的PHTX-09c模型中可见在1.875mg/kg到10mg/kg范围内的剂量下(在第1天、第8天和第15天I.V.投予QW×3周)5F9vcMMAE诱导的强抗肿瘤活性。如图6A中进一步显示，免疫结合物的抗肿瘤活性在给药后(在第15天的最后一次剂量)在7.5mg/kg和10mg/kg含量下再维持3周。肿瘤直到大约第40天才开始再生长。
在PHTX-17c模型中在0.9375mg/kg到10mg/kg范围内的剂量下(在第1天、第8天和第15天I.V.投予QW×3周)可见对5F9vcMMAE免疫结合物的中等敏感性(图6B)，所述模型具有中等GCC抗原密度(IHC评分2+)。
还在PHTX-21c模型中在3.75mg/kg到10mg/kg范围内的剂量下(在第1天、第8天、第15天和第22天I.V.投予QW×4)可见中等到强的活体内抗肿瘤活性(图6E)，所述模型在考虑到其较低的抗原表达量时有点意外(IHC评分1+)。如图6E中所显示，3.75mg/kg和10mg/kg剂量有效地防止给药时间表期间的肿瘤生长。意外地，抗肿瘤活性在给药后(在第22天的最后一次剂量)在7.5mg/kg含量下再维持7周到8周，且在给药后在10mg/kg含量下维持超过15周的出乎意料甚至更长的时间。
相比之下，PHTX-11c模型相对地对在1.875mg/kg到7.5mg/kg范围内的剂量下(在第1天、第8天和第15天I.V.投予QW×3周)的免疫结合物具有抗性，尽管所述模型具有中等GCC表达量(IHC评分2+)。如图6C中所显示，在QW×3给药时间表期间或在给药后未观察到抗肿瘤活性。以较高浓度每周两次投予并不显示抗肿瘤效力的任何改良(图6D)。
图7A显示在PHTX-11c模型中的GCC染色且图7B显示MLN0264染色(二者均为IHC)，且可看出染色模式重叠。因此，确认5F9vcMMAE免疫结合物在难治性PHTX-11c模型中结合到GCC。还评估血清对肿瘤中的游离MMAE含量以确保5F9vcMMAE免疫结合物正由肿瘤处理(即免疫结合物正经内化且MMAE正经裂解)。MMAE难治性PHTX-11c模型以及敏感性PHTX-09c和HEK293GCC2号模型中的游离MMAE血清和肿瘤含量的比较显示于下表27中。确认在给药期间和给药后肿瘤内药物的存在。另外，此肿瘤模型中的游离MMAE含量与对免疫结合物具有敏感性的肿瘤异种移植物模型中所见的含量相同。这些结果展示对于5F9vcMMAE具有难治性的临床前模型(例如PHTX-11c模型)有效地结合并处理抗GCCADC。
表27
在对5F9vcMMAE免疫结合物的肿瘤敏感性中还将致癌突变状态考虑为潜在因素。所测试的各种异种移植物模型的基因型显示于下表28中。表29汇总各种肿瘤异种移植物模型的抗原密度、突变状态、给药方案和活体内效力。尽管如图6A到6D中所展示对5F9vcMMAE免疫结合物的敏感性似乎部分地由抗原密度驱动，但其似乎不依赖于致癌突变状态。应注意，难治性PHTX-11c模型呈现与敏感性PHTX-09c和PHTX17c模型不同的KRAS突变。不希望受任何理论限制，在KRAS中的密码子12突变与密码子61突变之间无已知生物差别，且本发明者已展示具有这些突变的细胞在活体外细胞毒性分析中对5F9vcMMAE免疫结合物具有敏感性。
表28：肿瘤异种移植物模型的突变状态
PHTX-09c PHTX-11c PHTX-27c PHTX-21c
p110 WT WT WT 545E＞K/E
BRAF WT WT WT 600V＞E/V
EGFR WT WT WT WT
AKT WT WT WT WT
KRAS 12G＞D/G 61Q＞H 12G＞G/C WT
NRAS WT WT WT WT
HRAS WT WT WT WT
P53 120K＞E 273R＞C WT WT
总之，5F9vcMMAE诱导的抗肿瘤活性似乎部分地取决于肿瘤中的抗原密度。显示具有高GCC抗原密度的异种移植物肿瘤模型(293HEKGCC2号和PHTX-09c)对免疫结合物具有高度敏感性，而相比之下具有较低抗原密度值的异种移植物模型具有中等敏感性，PHTX-11c模型(其对免疫结合物具有抗性，尽管确认结合到肿瘤内的GCC和免疫结合物的有效肿瘤处理)除外。进一步探究PHTX-11c模型中的抗性机制。
表29：GCC抗原密度、突变状态、给药时间表和活体内效力的汇总
实例6：抗GCC免疫结合物和CPT-11(伊立替康)的组合投予的活体内评价
此研究的目的是评价在实例5中所描述的四种原发性人类肿瘤异种移植物模型(PHTX-09c、PHTX-21c、PHTX-17c和PHTX-11c)中由组合投予5F9vcMMAE免疫结合物(在本文中还称为“MLN0264”)和CPT-11(拓扑异构酶I抑制剂，还称为伊立替康或)诱导的活体内抗肿瘤活性。如以下实施所述研究。
向携带PHTX-09Cs.c异种移植物的雌性CB-17SCID小鼠静脉内投予的5F9vcMMAE和CPT-11的抗肿瘤活性(研究编号CPGC-11-EF07)
如实例5中所展示，PHTX-09c模型对各种浓度的5F9vcMMAE免疫结合物的单一药剂活性具有高度敏感性。此研究的目标是评价5F9vcMMAE免疫结合物与CPT-11的组合。更具体来说，此研究的目的是评价在CB17SCID小鼠中的PHTX-09cs.c.异种移植物中，根据每周一次给药时间表以1.875mg/kg和3.75mg/kg静脉内投予5F9vcMMAE与根据2天给药/5天停药的给药时间表以10mg/kg静脉内投予CPT-11的组合的抗肿瘤活性。根据表30制备剂量调配物。研究设计显示于表31中。
表30：剂量调配物的制备
表31：CPGC-11-EF07研究设计
每一治疗组的终点为a)肿瘤体积达到10％体重；或b)体重损失>20％。研究起始日期的预计肿瘤体积为200mm3。
不早于给药前1天，对所有动物称重并精确到克，且分组。在每次投予前将给药溶液涡旋，以确保正确递送化合物。动物接受使用25号到30号、1/2英寸到3/4英寸长的1cc注射器I.V.投予的大约0.1ml剂量。基于20克的平均体重向动物给药。
每周两次使用游标卡尺(0.01mm)获得肿瘤体积测量。使用下式计算肿瘤体积：
V＝W2×L/2(V＝肿瘤体积，W＝沿肿瘤短轴测量的宽度，L＝沿肿瘤短轴测量的长度)。还每周两次使用梅特勒天平(Mettlerscale)(0.1gm)获取体重测量。
评价肿瘤生长抑制(TGI)％和肿瘤生长延迟(TGD)方面的效力。在任一天(当对照治疗组的最大肿瘤体积(MTV)达到最大允许肿瘤体积时)使用下式评估TGI：TGI＝100-[治疗MTV/对照MTV]×100。
通过计算T-C来评估TGD，其中T＝治疗组肿瘤达到预定大小的平均时间(天)，且其中C＝对照组肿瘤达到预定大小(例如1,000mm3)的平均时间(天)。
如图8A中所显示，各剂量在所有治疗组中均耐受良好。各个治疗组的平均肿瘤体积曲线显示于图8B中。停止给药后的肿瘤再生长动力学显示于图8C中。研究结果汇总于表32中。
表32：CPGC-11-EF07研究的结果
使用混合作用线性消退模型对CPGC-11-EF07研究执行纵向分析，以部分确定5F9vcMMAE免疫结合物和CPT-11的组合抗肿瘤效力为累加的还是协同的。所有肿瘤值(肿瘤体积或光子通量)在log10转化之前均加1。在治疗组间比较这些值，以评估随时间的趋势的差异是否在统计学上显著。为比较治疗组的各对，使用最大概似法将以下混合作用线性消退模型拟合到数据：
其中Yijk是在第i次治疗中第k个动物在第j个时间点处的log10肿瘤值，
Yi0k是在第i次治疗中第k个动物的第0天(基线)log10肿瘤值，天数j是中位数居中的时间点且(与天数2 j一起)作为连续变量来处理，且eijk是残余误差。使用空间幂次律共变数矩阵解释对同一动物随时间的重复测量。若相互作用术语以及天数2 j术语在统计学上不显著，则将其去除。
使用概似比测试评估一对给定的治疗组是否呈现在统计学上显著的差异。比较完整模型的-2log概似与无任何治疗项者(简化模型)，且使用卡方测试来测试所述值的差异。测试的自由度计算为完整模型的自由度与简化模型的自由度间的差异。
从以上模型获得log肿瘤值的预测差异(Yijk-Yi0k，其可解释为log10(相对于第0天的倍数变化))来计算每一治疗组的平均AUC值。然后将dAUC值计算为：
此假定AUCctl为正数。在AUCctl为负数的情况下，使上式乘以-1。
对于协同作用分析，使用log肿瘤值的观察差异计算每一动物的AUC值。在从所述研究去除治疗组中的动物的情况下，将最后观察的肿瘤值转入所有后续时间点。使用来自上文所描述的成对模型的预测值计算对照组或媒剂组的AUC。为解决关于组合治疗的作用相对于个别治疗为协同的、累加的还是次累加的问题，计算以下统计数据：
协同作用评分＝平均值(FracA)+平均值(FracB)-平均值(FracAB))*100(6)
其中Ak和Bk是个别治疗组中的第k个动物，且ABk是组合治疗组中的第k个动物。AUCctl是对照组的模型预测AUC，且作为无可变性的常数来处理。若协同作用评分小于0，则认为组合治疗的作用为协同的，若协同作用评分等于0，则为累加的，且若协同作用评分大于0，则为次累加的。协同作用评分的标准误计算为组A、B和AB间的平方标准误差的和的平方根。使用韦尔奇-萨特思韦特等式(Welch-Satterthwaiteequation)估计自由度。通过用协同作用评分除以其标准误差来计算P值，并利用上文计算的自由度针对t-分布(双尾)进行测试。
考虑到此研究的探究性质，多重比较不存在预定调节并检查终点。所有<0.05的P值在此分析中均称为在统计学上显著。
表33是组符号的注释表。表34列示成对比较的结果。dAUC是治疗中所观察到的AUC相对于参照组的降低百分比。负dAUC解释为AUC相对于参照的增加。重要的是不仅评价P值，且还评价dAUC。与显著P值、但小dAUC值比较可能并不感兴趣。
表35列示协同作用分析。统计学上显著的负协同作用评分指示协同组合(“Syn.”)。统计学上显著的正协同作用评分指示次累加或拮抗组合(“Antag.”)。统计学上不显著的评分应视为累加的(“Add.”)。
表33：注释表
表34：成对比较的结果
表35：组合分析的结果
如表35中所显示，使用QW×3周I.V.投予3.75mg/kg剂量的免疫结合物和在第1天和第2天I.V.投予10mg/kg剂量的CPT-11(2天给药、5天停药的时间表)的给药方案实现协同活性。I.V.QW投予1.875mg/kg较低剂量的免疫结合物与根据2天停药、5天停药的时间表I.V.投予10mg/kgCPT-11并持续3周的组合产生累加作用。
如图8B和8C中所显示，5F9vcMMAE免疫结合物和CPT-11二者在PHTX-09c模型(证明具有相对较高的GCC抗原密度(IHC评分2到3+)的模型)中分别具有强和中等的单一药剂活性。意外地，每一药剂的个别效力可通过在利用次最优浓度的免疫结合物的给药方案下组合投予两种药剂来进一步改良。免疫结合物和CPT-11的组合起作用以防止肿瘤在组合给药方案期间生长并进一步防止肿瘤在停止给药(第15天的最后一次剂量)后再生长并再持续3周到4周。
向携带PHTX-21Cs.c.异种移植物的雌性CB-17SCID小鼠静脉内投予的MLN0264、CPT-11的抗肿瘤活性(研究编号CPGC-11-04)
如实例5中所展示，PHTX-21c模型对各种浓度的5F9vcMMAE免疫结合物的单一药剂活性具有中等敏感性，尽管所述模型具有较低GCC抗原密度值(IHC评分1+)。此研究的目标是评价5F9vcMMAE和CPT-11在PHTX-21c模型中的抗肿瘤活性。如上文所描述的CPGC-11-07研究中所展示，I.V.QW投予3.75mg/kg剂量的免疫结合物与根据2天给药、5天停药的时间表I.V.投予10mg/kg剂量的CPT-11的组合产生协同活性。应用从CPGC-11-07研究学到的知识并探究CPT-11的额外给药方案，在PHTX-21c模型中评价根据QW给药时间表以3.75mg/kgI.V.投予5F9vcMMAE与以10mg/kg或15mg/kg根据2天给药/5天停药的给药时间表和根据30mg/kg每周一次时间表投予CPT-11的组合。根据表36制备剂量调配物。研究设计显示于表37中。
表36：剂量调配物的制备
通过1:1稀释30mg/kg给药溶液制备15mg/kg给药溶液。通过2:1稀释15mg/kg给药溶液制备10mg/kg给药溶液。
表37：CPGC-11-EF04研究设计
每一治疗组的终点为a)肿瘤体积达到10％体重；或b)体重损失>20％。研究起始日期的预计肿瘤体积为200mm3。
不早于给药前1天，对所有动物称重并精确到克，且分组。在每次投予前将给药溶液涡旋，以确保正确递送化合物。动物接受使用27号到30号、1/2英寸到3/4英寸长的1cc注射器I.V.投予的大约0.1ml剂量。基于18.6克的平均体重向动物给药。
每周两次使用游标卡尺(0.01mm)获得肿瘤体积测量。使用下式计算肿瘤体积：
V＝W2×L/2(V＝肿瘤体积，W＝沿肿瘤短轴测量的宽度，L＝沿肿瘤短轴测量的长度)。还每周两次使用梅特勒天平(0.1gm)获取体重测量。
评价肿瘤生长抑制(TGI)％和肿瘤生长延迟(TGD)方面的效力。在任一天(当对照治疗组的最大肿瘤体积(MTV)达到最大允许肿瘤体积时)使用下式评估TGI：TGI＝100-[治疗MTV/对照MTV]×100。
通过计算T-C来评估TGD，其中T＝治疗组肿瘤达到预定大小(例如1,000mm3)的平均时间(天)，且其中C＝对照组肿瘤达到预定大小的平均时间(天)。
如图9A中所显示，各剂量在所有治疗组中均耐受良好。各个治疗组的平均肿瘤体积曲线显示于图9B中。如图8B中所显示，免疫结合物以单一药剂形式在3.75mg/kg剂量下具有相对较低的抗肿瘤活性，而CPT-11在所投予的两个较低剂量下具有中等到高的单一药剂活性。肿瘤再生长动力学曲线显示于图9C中。如图9B和9C中所显示，组合治疗组与10mg/kg和15mg/kgCPT-11组之间在给药期间的肿瘤体积和肿瘤再生长在给药后达到1000mm3的预定体积的天数方面无差异。两种给药方案不仅有效地防止给药期间的肿瘤生长，且还意外地诱导给药后的肿瘤体积降低(参见图9B)。两种给药方案还有效地防止肿瘤在给药后再生长并再持续5周。肿瘤直到大约第50天才开始再生长。研究结果汇总于表38中。
表38：CPGC-11-EF04研究的结果
使用混合作用线性消退模型对CPGC-11-EF04研究执行纵向分析，以部分地确定5F9vcMMAE免疫结合物和CPT-11的组合抗肿瘤效力为累加的还是协同的。所有肿瘤值(肿瘤体积或光子通量)在log10转化之前均加1。在治疗组间比较这些值，以评估随时间的趋势的差异是否在统计学上显著。为比较治疗组的各对，使用最大概似法将以下混合作用线性消退模型拟合到数据：
其中Yijk是在第i次治疗中第k个动物在第j个时间点处的log10肿瘤值，
Yi0k是在第i次治疗中第k个动物的第0天(基线)log10肿瘤值，天数j是中位数居中的时间点且(与天数2 j一起)作为连续变量来处理，且eijk是残余误差。使用空间幂次律共变数矩阵解释对同一动物随时间的重复测量。若相互作用术语以及天数2 j术语在统计学上不显著，则将其去除。
使用概似比测试评估一对给定的治疗组是否呈现在统计学上显著的差异。比较完整模型的-2log概似与无任何治疗项者(简化模型)，且使用卡方测试来测试所述值的差异。测试的自由度计算为完整模型的自由度与简化模型的自由度间的差异。
从以上模型获得log肿瘤值的预测差异(Yijk-Yi0k，其可解释为log10(相对于第0天的倍数变化))来计算每一治疗组的平均AUC值。然后将dAUC值计算为：
此假定AUCctl为正数。在AUCctl为负数的情况下，使上式乘以-1。
对于协同作用分析，使用log肿瘤值的观察差异计算每一动物的AUC值。在从所述研究去除治疗组中的动物的情况下，将最后观察的肿瘤值转入所有后续时间点。使用来自上文所描述的成对模型的预测值计算对照组或媒剂组的AUC。为解决关于组合治疗的作用相对于个别治疗剂为协同的、累加的还是次累加的问题，计算以下统计数据：
协同作用评分＝(平均值(FracA)+平均值(FracB)-平均值(FracAB))*100(6)
其中Ak和Bk是个别治疗组中的第k个动物，且ABk是组合治疗组中的第k个动物。AUCctl是对照组的模型预测AUC，且作为无可变性的常数来处理。协同作用评分的标准误差计算为组A、B和AB间的平方标准误差的和的平方根。使用韦尔奇-萨特思韦特等式估计自由度。执行假设测试以确定协同作用评分是否不同于O。通过用协同作用评分除以其标准误差来计算P值，并利用上文计算的自由度针对t-分布(双尾)进行测试。
将所述作用分类成四种不同类别。若协同作用评分小于0，则认为其为协同的，且若协同作用评分并非在统计学上不同于0，则为累加的。若协同作用评分大于0，但所述组合的平均AUC低于两种单一药剂治疗中的最低平均AUC，则所述组合为次累加的。若协同作用评分大于0，且所述组合的平均AUC大于单一药剂治疗中的至少一者的平均AUC，则所述组合为拮抗的。
区间分析(若要求)涉及与另一治疗组和时间间隔相比的指定治疗组和时间间隔。对于给定组、时间间隔和动物，通过下式估计每天的肿瘤生长速率
速率＝100*(10ΔY/Δt-1)(7)
其中ΔY是log10肿瘤体积在所关注间隔内的差异，且Δt是时间间隔的长度。若缺失一或两个时间点，则忽略所述动物。然后使用变异数不等的双侧非成对t-测试比较动物间的平均速率。
考虑到此研究的探究性质，多重比较不存在预定调节并检查终点。所有<0.05的P值在此分析中均称为在统计学上显著。
表39是组符号的注释表。表40列示成对比较的结果。dAUC是治疗中所观察到的AUC相对于参照组的降低百分比。负dAUC解释为AUC相对于参照的增加。重要的是不仅评价P值，且还评价dAUC。与显著P值、但小dAUC值比较可能并不感兴趣。
表41列示协同作用分析。统计学上显著的负协同作用评分指示协同组合(“Syn.”)。当所述组合比表现得最好的单一药剂表现得更好(即具有较低AUC)时，统计学上显著的正协同作用评分指示次累加组合(“Sub-add”)。当所述组合比表现得最好的单一药剂表现得差时，统计学上显著的正协同作用评分指示拮抗组合(“Antag.”)。统计学上不显著的评分应视为累加的(“Add.”)。
表39：注释表
表40：成对比较的结果
表41：组合分析的结果
如表41中所显示，在MLN02643.75mg/kgQWCPT-1110mg/kgD1,D2/周(组E)和ML02643.75mg/kgQWCPT-1115mg/kgD1,D2/周(组F)治疗组之间实现协同活性。使用CPT-11的替代时间表(每周一次，如与每周第1天和第2天相对)的第三治疗组G可见累加作用。不希望受任何理论限制，此替代给药时间表可对所述组合的累加与协同作用具有影响在此治疗组中CPT-11的剂量也较高。
总之，5F9vcMMAE免疫结合物与CPT-11的组合根据每周第1天和第2天给药时间表在不同给药量下在低抗原表达PHTX-21c模型中的作用意外地良好。药剂的组合不仅防止给药期间的肿瘤生长，且还不可预测地减小给药后的肿瘤大小。所述组合还防止停止给药后的肿瘤再生长并持续出乎意料长的时期。如本文中所展示，5F9vcMMAE免疫结合物起作用以使肿瘤对DNA破坏活性敏感，从而使得所述两种药剂的组合在次最优剂量下以协同方式起作用。
向携带PHTX-17Cs.c.异种移植物的雌性CB-17SCID小鼠静脉内投予的MLN0264、CPT-11的抗肿瘤活性(研究编号CPGC-11-EF06)
如上文所描述，上文显示组合投予5F9vcMMAE免疫结合物和CPT-11在两种对免疫结合物的单一药剂活性具有中等到高的敏感性但具有极为不同的GCC抗原含量的原发性人类肿瘤异种移植物模型(PHTX-09c，其具有IHC评分2到3+；PHTX-21c，其具有IHC评分1+)中具有协同活性。此研究的目标是评价在具有中等GCC抗原密度值并对单独免疫结合物具有中等敏感性的模型中的组合活性。如实例5中所显示，PHTX-17c模型呈现中等抗原表达(IHC评分2+)，并对5F9vcMMAE免疫结合物的单一药剂活性呈现中等敏感性。因此，PHTX-17c模型用于评价根据QW给药时间表以3.75mg/kgI.V.投予5F9vcMMAE与根据2天给药/5天停药给药时间表以10mg/kg或15mg/kgI.V.投予CPT-11的组合。根据表42制备剂量调配物。研究设计显示于表43中。
表42：剂量调配物的制备
通过1:1稀释30mg/kg给药溶液制备15mg/kg给药溶液。通过2:1稀释15mg/kg给药溶液制备10mg/kg给药溶液。
表43：CPGC-11-EF06研究设计
每一治疗组的终点为a)肿瘤体积达到10％体重；或b)体重损失>20％。研究起始日期的预计肿瘤体积为200mm3。
不早于给药前1天，对所有动物称重并精确到克，且分组。在每次投予前将给药溶液涡旋，以确保正确递送化合物。动物接受使用25号到30号、1/2英寸到3/4英寸长的1cc注射器I.V.投予的大约0.1ml剂量。基于20.5克的平均体重向动物给药。
每周两次使用游标卡尺(0.01mm)获得肿瘤体积测量(0.01mm)。使用下式计算肿瘤体积：
V＝W2×L/2(V＝肿瘤体积，W＝沿肿瘤短轴测量的宽度，L＝沿肿瘤短轴测量的长度)。还每周两次使用梅特勒天平(0.1gm)获取体重测量。
评价肿瘤生长抑制(TGI)％和肿瘤生长延迟(TGD)方面的效力。在任一天(当对照治疗组的最大肿瘤体积(MTV)达到最大允许肿瘤体积时)使用下式评估TGI：TGI＝100-[治疗MTV/对照MTV]×100。
通过计算T-C来评估TGD，其中T＝治疗组肿瘤达到预定大小(例如1,000mm3)的平均时间(天)，且其中C＝对照组肿瘤达到预定大小的平均时间(天)。
如图10A中所显示，各剂量在所有治疗组中均耐受良好。各个治疗组的平均肿瘤体积曲线显示于图10B中。停止给药后的肿瘤再生长动力学显示于图10C中。如图10C中所显示，CPT-1110mg/kg与15mg/kg组合治疗组之间无差异；两者均防止肿瘤在给药后再生长并持续额外3周+。研究结果汇总于表44中。
表44：CPGC-11-EF06研究的结果
如先前参照上文CPGC-11-EF07研究所描述使用混合作用线性消退模型对CPGC-11-EF06研究执行纵向分析，以部分地确定5F9vcMMAE免疫结合物和CPT-11的组合抗肿瘤效力为累加的还是协同的。
表45是组符号的注释表。表46列示成对比较的结果。dAUC是治疗中所观察到的AUC相对于参照组的降低百分比。负dAUC解释为AUC相对于参照的增加。重要的是不仅评价P值，且还评价dAUC。与显著P值、但小dAUC值比较可能并不感兴趣。
表47列示协同作用分析。统计学上显著的负协同作用评分指示协同组合(“Syn.”)。统计学上显著的正协同作用评分指示次累加或拮抗组合(“Antag.”)。统计学上不显著的评分应视为累加的(“Add.”)。
表45：注释表
表46：成对比较的结果
表47：组合分析的结果
如表47中所显示，在所有三种组合治疗组间实现累加活性。
总之，具有中等GCC抗原密度值(IHC评分2+)并对以单一药剂形式投予时的5F9vcMMAE免疫结合物具有中等敏感性的PHTX-17c模型还对组合投予免疫结合物与CPT-11展示中等敏感性，这是因为所述组合治疗为累加的，而非利用PHTX-09c和PHTX-21c模型(二者均对免疫结合物具有中等到高的敏感性但分别具有较高和较低的GCC抗原表达量)所见的协同作用。
向携带PHTX-11cs.c.异种移植物的雌性CB-17SCID小鼠静脉内投予的MLN0264、CPT-11的抗肿瘤活性(研究编号CPGC-12-EF01)
如上文所描述，上文显示组合投予5F9vcMMAE免疫结合物和CPT-11在两种对免疫结合物的单一药剂活性具有中等到高的敏感性但具有极为不同的GCC抗原含量的原发性人类肿瘤异种移植物模型(PHTX-09c，其具有IHC评分2到3+；PHTX-21c，其具有IHC评分1+)中具有协同活性，但在对免疫结合物具有中等敏感性并具有中等GCC抗原密度值的模型(PHTX-17c，其具有IHC评分2+)中具有累加活性。此研究的目标是探究在具有中等GCC抗原密度值但对单独免疫结合物具有抗性的模型中的组合活性。如实例5中所显示，PHTX-11c模型呈现中等抗原表达(IHC评分2+)，但对5F9vcMMAE免疫结合物的单一药剂活性具有抗性(图6C和6D))。因此，PHTX-11c模型用于评价以7.5mg/kg的剂量开始I.V.QW投予5F9vcMMAE与以10mg/kg、15mg/kg根据2天给药/5天停药的给药时间表并以30mg/kgQW投予CPT-11组合的组合疗法。根据表48制备剂量调配物。研究设计显示于表49中。
表48：剂量调配物的制备
通过1:1稀释30mg/kg给药溶液制备15mg/kg给药溶液。通过2:1稀释15mg/kg给药溶液制备10mg/kg给药溶液。
表49：CPGC-12-EF01研究设计
每一治疗组的终点为a)肿瘤体积达到10％体重；或b)体重损失>20％。研究起始日期的预计肿瘤体积为200mm3。
不早于给药前1天，对所有动物称重并精确到克，且分组。在每次投予前将给药溶液涡旋，以确保正确递送化合物。动物接受使用25号到30号、1/2英寸到3/4英寸长的1cc注射器I.V.投予的大约0.1ml剂量。基于20.1克的平均体重向动物给药。
每周两次使用游标卡尺(0.01mm)获得肿瘤体积测量(0.01mm)。使用下式计算肿瘤体积：
V＝W2×L/2(V＝肿瘤体积，W＝沿肿瘤短轴测量的宽度，L＝沿肿瘤短轴测量的长度)。还每周两次使用梅特勒天平(0.1gm)获取体重测量。
评价肿瘤生长抑制(TGI)％和肿瘤生长延迟(TGD)方面的效力。在任一天(当对照治疗组的最大肿瘤体积(MTV)达到最大允许肿瘤体积时)使用下式评估TGI：TGI＝100-[治疗MTV/对照MTV]×100。
通过计算T-C来评估TGD，其中T＝治疗组肿瘤达到预定大小的平均时间(天)，且其中C＝对照组肿瘤达到预定大小(例如1,000mm3)的平均时间(天)。
如图11A中所显示，各剂量在所有治疗组中均耐受良好。各个治疗组的平均肿瘤体积曲线显示于图11B中。肿瘤再生长动力学显示于图11C中。
如图11B中所显示，单独免疫结合物在7.5mg/kg高剂量下具有极低活性，且在所投予的三种不同剂量下利用单独CPT-11所见的活性存在极少差异。然而，与10mg/kg和15mg/kg的CPT-11二者的组合治疗均完全抑制给药期间的肿瘤生长，且进一步防止停止给药后的肿瘤再生长并持续额外6周到7周。肿瘤直到大约第60天才开始再生长。研究结果汇总于表50中。
表50：CPGC-12-EF01研究的结果
使用混合作用线性消退模型对CPGC-12-EF01研究执行纵向分析，以部分地确定5F9vcMMAE免疫结合物和CPT-11的组合抗肿瘤效力为累加的还是协同的。所有肿瘤值(肿瘤体积或光子通量)在log10转化之前均加1。在治疗组间比较这些值，以评估随时间的趋势的差异是否在统计学上显著。为比较治疗组的各对，使用最大概似法将以下混合作用线性消退模型拟合到数据：
其中Yijk是在第i次治疗中第k个动物在第j个时间点处的log10肿瘤值，
Yi0k是在第i次治疗中第k个动物的第0天(基线)log10肿瘤值，天数j是中位数居中的时间点且(与天数2 j一起)作为连续变量来处理，且eijk是残余误差。使用空间幂次律共变数矩阵解释对同一动物随时间的重复测量。若相互作用术语以及天数2 j术语在统计学上不显著，则将其去除。
使用概似比测试评估一对给定的治疗组是否呈现在统计学上显著的差异。比较完整模型的-2log概似与无任何治疗项者(简化模型)，且使用卡方测试来测试所述值的差异。测试的自由度计算为完整模型的自由度与简化模型的自由度间的差异。
从以上模型获得log肿瘤值的预测差异(Yijk-Yi0k，其可解释为log10(相对于第0天的倍数变化))来计算每一治疗组的平均AUC值。然后将dAUC值计算为：
此假定AUCctl为正数。在AUCctl为负数的情况下，使上式乘以-1。
对于协同作用分析，使用log肿瘤值的观察差异计算每一动物的AUC值。在从所述研究去除治疗组中的动物的情况下，将最后观察的肿瘤值转入所有后续时间点。使用来自上文所描述的成对模型的预测值计算对照组或媒剂组的AUC。为解决关于组合治疗的作用相对于个别治疗剂为协同的、累加的还是次累加的问题，计算以下统计数据：
协同作用评分＝(平均值(FracA)+平均值(FracB)-平均值(FracAB))*100(6)
其中Ak和Bk是个别治疗组中的第k个动物，且ABk是组合治疗组中的第k个动物。AUCctl是对照组的模型预测AUC，且作为无可变性的常数来处理。协同作用评分的标准误差计算为组A、B和AB间的平方标准误差的和的平方根。使用韦尔奇-萨特思韦特等式估计自由度。通过用协同作用评分除以其标准误差来计算P值，并利用上文计算的自由度针对t-分布(双尾)进行测试。
将所述作用分类成四种不同类别。若协同作用评分小于0，则认为其为协同的，且若协同作用评分并非在统计学上不同于0，则为累加的。若协同作用评分大于0，但所述组合的平均AUC低于两种单一药剂治疗中的最低平均AUC，则所述组合为次累加的。若协同作用评分大于0，且所述组合的平均AUC大于单一药剂治疗中的至少一者的平均AUC，则所述组合为拮抗的。区间分析(若要求)涉及与另一治疗组和时间间隔相比的指定治疗组和时间间隔。对于给定组、时间间隔和动物，通过下式估计每天的肿瘤生长速率
速率＝100*(10ΔY/Δt-1)(7)
其中ΔY是log10肿瘤体积在所关注间隔内的差异，且Δt是时间间隔的长度。若缺失一或两个时间点，则忽略所述动物。然后使用变异数不等的双侧非成对t-测试比较动物间的平均速率。
考虑到此研究的探究性质，多重比较不存在预定调节并检查终点。所有<0.05的P值在此分析中均称为在统计学上显著。
表51是组符号的注释表。表52列示成对比较的结果。dAUC是治疗中所观察到的AUC相对于参照组的降低百分比。负dAUC解释为AUC相对于参照的增加。重要的是不仅评价P值，且还评价dAUC。与显著P值、但小dAUC值比较可能并不感兴趣。
表53列示协同作用分析。统计学上显著的负协同作用评分指示协同组合(“Syn.”)。当所述组合比表现得最好的单一药剂表现得更好(即具有较低AUC)时，统计学上显著的正协同作用评分指示次累加(“Sub-add”)组合。当所述组合比表现得最好的单一药剂表现得差时，统计学上显著的正协同作用评分指示拮抗组合(“Antag.”)。统计学上不显著的评分应视为累加的(“Add.”)。
表51：注释表
表52：成对比较的结果
表53：组合分析的结果
如表53中所显示，组合活性在MLN02647.5mg/kgQWCPT-1110mg/kgD1,d2/周(治疗组E)中为协同的，且在其它两个组合治疗组(组F和G)中为累加的。应注意，协同作用分析仅考虑肿瘤体积/肿瘤生长抑制。其不考虑肿瘤生长延迟。如图11C中所显示，利用10mg/kg和15mg/kg的CPT-11与7.5mg/kg的5F9vcMMAE免疫结合物活性的组合可见显著的肿瘤再生长延迟(约80天)。因此，图11C中所显示的肿瘤再生长动力学表明两个治疗组E和F的协同活性。考虑到针对两个治疗组E和F所观察的意外的肿瘤生长延迟长度和图11C中所显示的相应曲线的类似性，将使用与上文所描述的统计方法不同的统计方法再评估治疗组F的协同作用分析。治疗组G(MLN02647.5mg/kgQWCPT-1130mg/kgD1/周)使用一次/周给药时间表，与治疗组E和F的每周第1天和第2天的时间表相对。不希望受任何理论限制，此替代给药时间表刻对此治疗组的累加与协同作用具有影响。
总之，具有中等GCC抗原密度(IHC评分2+)但对以单一药剂形式投予时的5F9vcMMAE免疫结合物具有抗性的PHTX-11c模型在多个给药方案下对组合疗法具有意外的敏感性、特定来说在延迟的肿瘤再生长方面。尽管其对免疫结合物的单一药剂活性具有抗性，但免疫结合物有效地使肿瘤对DNA破坏剂活性敏感。如上文所提到，重复协同作用分析以确认对延长的肿瘤再生长延迟所见的协同活性。
总之，本文中所描述的活体内组合研究展示，抗GCC免疫结合物与CPT-11的组合以协同方式起作用来抑制肿瘤生长，而与对单独免疫结合物的肿瘤敏感性和GCC抗原密度无关。抗肿瘤活性甚至在停止给药后维持意外长的时期。在每一所评价临床前模型中，在每一药剂的次最优剂量下实现协同或增强活性，此证明抗GCC免疫结合物与CPT-11的组合提供优于投予任一单独药剂的治疗益处。预期在这些临床前模型中所见的协同或增强作用可转化到临床模型中。所述组合为癌症对单独免疫结合物具有抗性的患者提供有希望的治疗替代方案。
实例7：抗GCC免疫结合物与顺铂的组合投予的活体内评价
此研究的目的是评价在实例5中所描述的源自mCRC的PHTX-09c原发性人类肿瘤异种移植物(“PHTX”)中通过组合投予5F9vcMMAE免疫结合物(在本文中有时称为“MLN0264”)和顺铂所诱导的活体内抗肿瘤活性。以下执行所述研究。
向携带PHTX-09cs.c.异种移植物的雌性CB-17SCID小鼠静脉内投予的5F9vcMMAE和顺铂的抗肿瘤活性(研究编号CPGC-11-EF05)
如实例5中所展示，PHTX-09c模型对各种浓度的5F9vcMMAE免疫结合物的单一药剂活性具有高度敏感性。此研究的目标是评价5F9vcMMAE免疫结合物与顺铂的组合。更具体来说，此研究的目的是评价在CB17SCID小鼠中的PHTX-09cs.c.异种移植物中，根据每周一次给药时间表以1.875mg/kg和3.75mg/kg投予5F9vcMMAE与根据每周或每两周一次的给药时间表以4mg/kg和6mg/kg静脉内(IV)或腹膜内(IP)投予顺铂的组合的抗肿瘤活性。根据表54制备剂量调配物。研究设计显示于表55中。
表54：剂量调配物的制备
表55：CPGC-11-EF05研究设计
每一治疗组的终点为a)肿瘤体积达到10％体重；或b)体重损失>20％。研究起始日期的预计肿瘤体积为200mm3。
不早于给药前1天，对所有动物称重并精确到克，且分组。在每次投予前将给药溶液涡旋，以确保正确递送化合物。动物接受使用27号到30号、1/2英寸到3/4英寸长的1cc注射器I.V.投予的大约0.1ml剂量。基于20.9克的平均体重向动物给药。
每周两次使用游标卡尺(0.01mm)获得肿瘤体积测量。使用下式计算肿瘤体积：
V＝W2×L/2(V＝肿瘤体积，W＝沿肿瘤短轴测量的宽度，L＝沿肿瘤短轴测量的长度)。还每周两次使用梅特勒天平(0.1gm)获取体重测量。
评价肿瘤生长抑制(TGI)％和肿瘤生长延迟(TGD)；治疗对对照肿瘤达到最终研究体积的天数差异)方面的效力。
在任一天(当对照治疗组的最大肿瘤体积(“MTV”)达到最大允许肿瘤体积时)使用下式评估TGI：TGI＝100-[治疗MTV/对照MTV]×100。
通过计算T-C来评估TGD，其中T＝治疗组肿瘤达到预定大小的平均时间(天)，且其中C＝对照组肿瘤达到预定大小(例如1,000mm3)的平均时间(天)。
概言之，i.v.给药途径经测定耐受优于i.p.给药。如图12A中所显示，剂量在所有组合治疗组中均耐受良好，且组合治疗的耐受优于单独顺铂(其中可见体重损失>15％)的耐受。每周一次以4mg/kg投予的顺铂可耐受2个剂量，每周一次以6mg/kg投予的顺铂仅可耐受1个剂量。各个治疗组的平均肿瘤体积曲线显示于图12B中。
使用混合作用线性消退模型对CPGC-11-EF05研究执行纵向分析，以部分地确定5F9vcMMAE免疫结合物和顺铂的组合抗肿瘤效力为累加的还是协同的。所有肿瘤值(肿瘤体积或光子通量)在log10转化之前均加1。在治疗组间比较这些值，以评估随时间的趋势的差异是否在统计学上显著。为比较治疗组的各对，使用最大概似法将以下混合作用线性消退模型拟合到数据：
其中Yijk是在第i次治疗中第k个动物在第j个时间点处的log10肿瘤值，
Yi0k是在第i次治疗中第k个动物的第0天(基线)log10肿瘤值，天数j是中位数居中的时间点且(与天数2 j一起)作为连续变量来处理，且eijk是残余误差。使用空间幂次律共变数矩阵解释对同一动物随时间的重复测量。若相互作用术语以及天数2 j术语在统计学上不显著，则将其去除。
使用概似比测试评估一对给定的治疗组是否呈现在统计学上显著的差异。比较完整模型的-2log概似与无任何治疗项者(简化模型)，且使用卡方测试来测试所述值的差异。测试的自由度计算为完整模型的自由度与简化模型的自由度间的差异。
从以上模型获得log肿瘤值的预测差异(Yijk-Yi0k，其可解释为log10(相对于第0天的倍数变化))来计算每一治疗组的平均AUC值。然后将dAUC值计算为：
此假定AUCctl为正数。在AUCctl为负数的情况下，使上式乘以-1。
对于协同作用分析，使用log肿瘤值的观察差异计算每一动物的AUC值。在从所述研究去除治疗组中的动物的情况下，将最后观察的肿瘤值转入所有后续时间点。使用来自上文所描述的成对模型的预测值计算对照组或媒剂组的AUC。以下定义协同作用的量度：
协同作用评分＝(平均值(FracA)+平均值(FracB)-平均值(FracAB))*100(6)
其中Ak和Bk是个别治疗组中的第k个动物，且ABk是组合治疗组中的第k个动物。AUCctl是对照组的模型预测AUC，且作为无可变性的常数来处理。协同作用评分的标准误差计算为组A、B和AB间的平方标准误差的和的平方根。使用韦尔奇-萨特思韦特等式估计自由度。执行假设测试以确定协同作用评分是否不同于0。通过用协同作用评分除以其标准误差来计算P值，并利用上文计算的自由度针对t-分布(双尾)进行测试。
将所述作用分类成四种不同类别。若协同作用评分小于0，则认为其为协同的，且若协同作用评分并非在统计学上不同于0，则为累加的。若协同作用评分大于0，但所述组合的平均AUC低于两种单一药剂治疗剂中的最低平均AUC，则所述组合为次累加的。若协同作用评分大于0，且所述组合的平均AUC大于单一药剂治疗剂中的至少一者的平均AUC，则所述组合为拮抗的。
区间分析(若要求)涉及与另一治疗组和时间间隔相比的指定治疗组和时间间隔。对于给定组、时间间隔和动物，通过下式估计每天的肿瘤生长速率
速率＝100*(10ΔY/Δt-1)(7)
其中ΔY是log10肿瘤体积在所关注间隔内的差异，且Δt是时间间隔的长度。若缺失一或两个时间点，则忽略所述动物。然后使用变异数不等的双侧非成对t-测试比较动物间的平均速率。
考虑到此研究的探究性质，多重比较不存在预定调节并检查终点。所有<0.05的P值在此分析中均称为在统计学上显著。
表56是组符号的注释表。表57列示成对比较的结果。dAUC是治疗中所观察到的AUC相对于参照组的降低百分比。负dAUC解释为AUC相对于参照的增加。重要的是不仅评价P值，且还评价dAUC。与显著P值、但小dAUC值比较可能并不感兴趣。
表58列示协同作用分析。统计学上显著的负协同作用评分指示协同组合(“Syn.”)。当所述组合比表现得最好的单一药剂表现得更好(即具有较低AUC)时，统计学上显著的正协同作用评分指示次累加组合(“Sub-add”)。当所述组合比表现得最好的单一药剂表现得差时，统计学上显著的正协同作用评分指示拮抗组合(“Antag.”)。统计学上不显著的评分应视为累加的(“Add.”)。
表56：注释表
表57成对比较的结果
表58：组合分析的结果
如表58中所显示，使用ML02643.75mg/kg顺铂6mg/kgD1第1周(治疗组F)以及ML02643.75mg/kg顺铂4mg/kgD1第1周和第2周(治疗组G)的给药方案实现协同活性。使用较低剂量的免疫结合物(1.875mg/kg)与顺铂6mg/kgD1第1周(治疗组E)的组合可见累加活性。
如图12B中所显示，在所有组合组中可见改良的抗肿瘤活性，其中在治疗组F和G中可见协同活性。如图12C中所显示，利用4mg/kg和6mg/kg的顺铂治疗与3.75mg/kg的5F9vcMMAE免疫结合物活性的组合可见显著的肿瘤再生长延迟(约50天)。
总之，如上文所描述的IHC分析(评分2到3+)中所展示具有相对较高的GCC抗原密度且对以单一药剂形式投予时的各种浓度的5F9vcMMAE免疫结合物具有高敏感性的PHTX-09c模型对以所测试免疫结合物的较高剂量(3.75mg/kg)与顺铂的不同剂量和给药时间表的组合组合投予免疫结合物和顺铂展示协同敏感性。
实例8：抗GCC免疫结合物和5-氟尿嘧啶的组合投予的活体内评价
此研究的目的是评价在实例5中所描述的源自mCRC的PHTX-21c原发性人类肿瘤异种移植物(“PHTX”)中通过组合投予5F9vcMMAE免疫结合物(在本文中有时称为“MLN0264”)和5-氟尿嘧啶(5-FU)所诱导的活体内抗肿瘤活性。以下实施所述研究。
向携带PHTX-21Cs.c.异种移植物的雌性CB-17SCID小鼠静脉内投予的MLN0264和5-氟尿嘧啶的抗肿瘤活性(研究编号CPGC-11-EF01)
如实例5中所展示，PHTX-21c模型对各种浓度的5F9vcMMAE免疫结合物的单一药剂活性具有中等敏感性，尽管所述模型具有较低的GCC抗原密度值(IHC评分1+)。此研究的目标是评价5F9vcMMAE和5-氟尿嘧啶(5-FU)在PHTX-21c模型中的抗肿瘤活性。评价根据每周一次给药时间表以3.75mg/kg和7.5mg/kg投予5F9vcMMAE与根据3天给药/4天停药的给药时间表以15mg/kg和25mg/kgIV投予4周5-FU的组合。使用具有非特异性针对GCC的抗体的vc-MMAE免疫结合物(称为209-vcMMAE)作为对照。根据表59制备剂量调配物。研究设计显示于表60中。
表59：剂量调配物的制备
通过1:1稀释7.5mg/kg给药溶液来制备3.75mg/kg给药溶液。
通过3:2稀释25mg/kg给药溶液来制备15mg/kg给药溶液。
表60：CPGC-11-EF01研究设计
每一治疗组的终点为a)肿瘤体积达到10％体重；或b)体重损失>20％。研究起始日期的预计肿瘤体积为200mm3。
不早于给药前1天，对所有动物称重并精确到克，且分组。在每次投予前将给药溶液涡旋，以确保正确递送化合物。动物接受使用27号到30号、1/2英寸到3/4英寸长的1cc注射器I.V.投予的大约0.1ml剂量。基于19.5克的平均体重向动物给药。
每周两次使用游标卡尺(0.01mm)获得肿瘤体积测量。使用下式计算肿瘤体积：
V＝W2×L/2(V＝肿瘤体积，W＝沿肿瘤短轴测量的宽度，L＝沿肿瘤短轴测量的长度)。还每周两次使用梅特勒天平(0.1gm)获取体重测量。
评价肿瘤生长抑制(TGI)％和肿瘤生长延迟(TGD)方面的效力。在任一天(当对照治疗组的最大肿瘤体积(MTV)达到最大允许肿瘤体积时)使用下式评估TGI：TGI＝100-[治疗MTV/对照MTV]×100。
通过计算T-C来评估TGD，其中T＝治疗组肿瘤达到预定大小(例如1,000mm3)的平均时间(天)，且其中C＝对照组肿瘤达到预定大小的平均时间(天)。
如图13A中所显示，各剂量在所有治疗组中均耐受良好。各个治疗组的平均肿瘤体积曲线显示于图13B中。如图8B中所显示，5F9-vcMMAE免疫结合物以单一药剂形式在3.75mg/kg剂量下具有相对较低的抗肿瘤活性，5-FU在15mg/kg和25mg/kg二者下的单一药剂抗肿瘤活性类似，各自还具有相对较低的抗肿瘤活性。意外地，3.75mg/kg的免疫结合物与25mg/kg的5-FU在治疗过程期间完全消灭肿瘤体积。
肿瘤再生长动力学曲线显示于图13C中。如图13C中所显示，本文中所描述利用3.75mg/kg的免疫结合物和25mg/kg5-FU的组合治疗方案不仅有效地防止给药期间的肿瘤生长，且还防止给药后的肿瘤再生长并持续额外45周。肿瘤直到大约第50天才开始再生长。
使用上文实例7中所描述的方法使用混合作用线性消退模型对CPGC-11-EF01研究执行纵向分析，以部分地确定5F9vcMMAE免疫结合物和5-FU的组合抗肿瘤效力为累加的还是协同的。
表61是组符号的注释表。表62列示成对比较的结果。dAUC是治疗中所观察到的AUC相对于参照组的降低百分比。负dAUC解释为AUC相对于参照的增加。重要的是不仅评价P值，且还评价dAUC。与显著P值、但小dAUC值比较可能并不感兴趣。
表63列示协同作用分析。统计学上显著的负协同作用评分指示协同组合(“Syn.”)。当所述组合比表现得最好的单一药剂表现得更好(即具有较低AUC)时，统计学上显著的正协同作用评分指示次累加组合(“Sub-add”)。当所述组合比表现得最好的单一药剂表现得差时，统计学上显著的正协同作用评分指示拮抗组合(“Antag.”)。统计学上不显著的评分应视为累加的(“Add.”)。
表61：注释表
图1：不同组的结果
表62：成对比较的结果
表63：组合分析的结果
如表63中所显示，在MLN02643.75mg/kg和5-FU25mg/kg治疗组中实现协同活性。
实例9：人类胰脏肿瘤微阵列和临床样品中的GCC表达
使用基于上文实例5中所描述的IHC分析的自动化方案评价源自胰脏癌患者样品的原发性人类肿瘤异种移植物(PHTX)在雌性SCID小鼠中和购自商业来源(例如美国普迈(USBioMax)和泮托米(Pantomics))的胰脏肿瘤微阵列(TMA)中的GCC表达。这些肿瘤涵盖一系列肿瘤等级。还通过IHC在从专门CRO(括泰克(QualTek))的组织数据库获得的人类胰脏肿瘤样品中评估GCC表达。
从各种组织样品制备4微米切片。通过二甲苯、然后梯度乙醇系列到蒸馏水的4分钟、5分钟变化对组织切片进行脱蜡。在黑色(Black)和戴克(Decker)蒸汽机的上部室中的毛细管间隙中利用SHIER2溶液使用蒸汽热诱导表位恢复(SHIER)并持续20分钟。
表69A：IHC程序
表69B：抗体反应性规格单
所属领域技术人员可认识到一级抗体增强剂可为具有与MIL-44-148-2或MIL-44-67兔mAb(兔IgG)相同的同种型的于除兔以外的物种(例如人类、大鼠、山羊、小鼠等)中产生的抗兔二级抗体或适于扩增MIL-44信号的类似试剂。
以上方案使用MIL-44-148-2在1.0μg/ml下的过夜抗体培育与基于非生物素的过氧化酶检测(购自赛默飞(Thermo)/实验室视觉(LabVision)的超视试剂盒)并使用DAB作为色素原。使用TechMate500或TechMate1000(罗氏诊断)使此程序完全自动化。染色后，通过乙醇系列列到无水乙醇、然后二甲苯冲洗使载玻片脱水。用玻璃盖玻片和CytoSeal将载玻片永久地盖上盖玻片。在显微镜下检查载玻片来评估染色。阳性染色是由棕色(DAB-HRP)反应产物的存在指示。苏木精对比染色提供蓝色核染色以评估细胞和组织形态。
将H评分方法用于定量GCC表达。H评分方法提供最优数据解析以确定染色的强度和肿瘤百分数在肿瘤类型内和其间的变异。其还提供用于确定阳性染色的阈值的良好手段。在此方法中，提供染色强度在0到3+范围内的肿瘤内的细胞百分数(0到100)。使用本发明方法，提供强度为0、0.5、1、2和3的评分。根据标记物，0.5染色可评分为阳性或阴性，且反映针对标记物的较浅但可察觉的染色。为获得H评分，将肿瘤细胞百分数乘以各强度并加在一起：
H评分＝(肿瘤％*1)+(肿瘤％*2)+(肿瘤％*3)。例如，若肿瘤为20％阴性(0)、30％+1、10％+2、40％+3，则H评分为170。
若100％的肿瘤细胞标记有3+强度，则根据亚细胞定位(即顶端或细胞质)最大H评分为300(100％*+3)。首先，作为对照，不使用单独的总H评分来比较样品，但除了审查细胞在每一强度下的百分数的细分以外还对其进行评价。例如，90的评分可代表90％以1+强度染色的肿瘤细胞或30％3+强度的细胞。这些样品具有相同的H评分，但极为不同的GCC表达。欲在每一强度下评分的细胞百分数可有所不同，但通常以10％的增量评分；然而，单一组份的较小评分百分数还可估计为1％和5％，以证明存在一定程度的染色。对于GCC，可考虑顶端染色用于在小量增量(例如1％和5％)下评价。
使用H评分方法对GCC的两种不同亚细胞定位进行评分。这些方法包括细胞质染色和顶端相关染色。通常观察到细胞质染色模式为遍及肿瘤细胞细胞质的弥散。然而，在一些情形下细胞质染色有多种变化形式，其包括强球状染色或点状染色、粗颗粒状染色。强球状染色评分为3+细胞质染色。点状染色与顶端染色相关，且并不针对此类型的细胞质染色给出单独评分(对于点状染色n＝4个样品)。当存在管腔时，观察到GCC顶端染色。所观察到的其它GCC染色模式包括膜样非管腔染色(一例)和肿瘤管腔内存在的细胞外染色。在正常结肠组织中，染色通常为顶端染色以及弥散细胞质染色。
由于获得细胞质和顶端GCC表达二者的H评分，且由于未知一种定位类型是否比另一种对GCC靶向疗法的效力更重要，故捕获所有数据，且在一些情况下，通过使用顶端和细胞质GCC表达二者的和生成总计H评分在所述情况下，总计评分的最大H评分变成600(300顶端+300细胞质)。
筛选总共218个原发性和转移性胰脏肿瘤。137个表达GCC，其中58个样品的合并的细胞质和顶端H评分≥100。137个GCC阳性样品的H评分的图解汇总显示于图14中。
实例10：抗GCC免疫结合物与吉西他滨的组合投予的活体内评价
此研究的目的是评价在小鼠胰脏癌异种移植物原发性人类肿瘤移出物(PHTX)模型中通过组合投予5F9vcMMAE免疫结合物(在本文中有时称为“MLN0264”)和吉西他滨所诱导的活体内抗肿瘤活性。这些模型包括来自具有野生型和突变体KRAS的患者的肿瘤组织。通过冠军肿瘤学(ChampionsOncology)(新泽西州哈肯萨克)使用其CTG平台生成5种胰脏PHTX。内部研发2种PHTX模型。使用上文所描述的自动化IHC分析在7种PHTX模型中的每一者中评价GCC表达。5种冠军模型(CTG模型)和2种内部模型(PHTX模型)的GCCIHCH评分显示于表70中。
表70：在来自冠军的胰脏PHTX模型中的GCC表达
在所有7种胰脏皮下异种移植物小鼠模型中实施单一药剂5F9vcMMAE免疫结合物的活体内抗肿瘤研究。向动物投予媒剂、0.135mg/kg每周一次(QW)的游离MMAE、7.5mg/kgQW的非GCC靶向ADC或3.75mg/kg或7.5mg/kgQW的5F9vcMMAE。PHTX-215Pa和PHTX-249Pa模型中的免疫结合物的单一药剂活性的结果分别显示于图15A和15B中。
如图15A中所显示，在PHTX-215Pa模型(KRASwt)中截至第22天7.5mg/kg的5F9vcMMAE免疫结合物相对于5F9vcMMAE免疫结合物的游离MMAE(3.75mg/kg)产生显著较高的肿瘤生长抑制(TGI)。此包括在8只动物中的3只中的肿瘤消退。7.5mg/kg剂量的5F9vcMMAE还导致延迟的肿瘤再生长。类似地，如图15B中所显示，在PHTX-249Pa模型中，截至第21天单一药剂5F9vcMMAE免疫结合物相对于媒剂或游离MMAE显示显著TGI。在PHTX-249Pa模型(KRASG12D)中截至第20天到第22天7.5mg/kg的5F9vcMMAE显著优于3.75mg/kg的剂量。表71汇总在所有7种胰脏肿瘤异种移植物模型间的单一药剂5F9vcMMAE活性的TGI数据。
表71：在胰脏PHTX模型中的单一药剂抗肿瘤活性
在携带PHTX-249Pas.c.异种移植物的雌性CB-17SCID小鼠中静脉内投予的5F9vcMMAE免疫结合物和吉西他滨的抗肿瘤活性(研究编号CPGC-13-EF05和CPGC-13-EF08)
此研究的目标是测定根据每周一次(QW)时间表静脉内投予7.5mg/kg的5F9vcMMAE免疫结合物与15mg/kg和20mg/kg每周两次(BIW)的吉西他滨或在每周第1天和第3天15mg/kg的吉西他滨的组合在CB17SCIDF小鼠中的PHTX-249Pas.c异种移植物中的协同作用或累加抗肿瘤活性。使用具有非特异性针对GCC的抗体的vc-MMAE免疫结合物(称为209-vcMMAE)作为对照。根据表71A和表71B制备剂量调配物。研究设计显示于表72A和72B中。
表71A：剂量调配物的制备-研究CPGC-13-EF05
吉西他滨原液浓度是38mg/ml。
表71B：剂量调配物的制备-研究CPGC-13-EF08
基于19.7gBW，MLN0264原液浓度是8.13mg/ml，用于40只小鼠，总共需要将5.19mgMLN0264和726.9μl原液制成3273.1μlNS。
吉西他滨：基于19.7gBW，原液浓度是38mg/ml，用于34只小鼠，总共需要10.047mg。将264.4μl储备吉西他滨制成3135.6μlNS。
表72A：CPGC-13-EF05的研究设计
表72B：CPGC-13-EF08的研究设计
每一治疗组的终点为a)肿瘤体积达到10％体重；或b)体重损失>20％。研究起始日期的预计肿瘤体积为200mm3。
第D0天是治疗的第一天。不早于给药前1天，对所有动物称重并精确到克，且分组。在每次投予前将给药溶液涡旋，以确保正确递送化合物。动物接受使用27号到30号、1/2英寸到3/4英寸长的1cc注射器I.V.投予的大约0.1ml剂量。基于19.7克的平均体重向动物给药。
每周两次使用游标卡尺(0.01mm)获得肿瘤体积测量。使用下式计算肿瘤体积：
V＝W2×L/2(V＝肿瘤体积，W＝沿肿瘤短轴测量的宽度，L＝沿肿瘤短轴测量的长度)。还每周两次使用梅特勒天平(0.1gm)获取体重测量。
评价肿瘤生长抑制(TGI)％和肿瘤生长延迟(TGD)方面的效力。在任一天(当对照治疗组的最大肿瘤体积(MTV)达到最大允许肿瘤体积时)使用下式评估TGI：TGI＝100-[治疗MTV/对照MTV]×100。当肿瘤体积达到约230mm3时，对动物进行治疗。
通过计算T-C来评估TGD，其中T＝治疗组肿瘤达到预定大小(例如1,000mm3)的平均时间(天)，且其中C＝对照组肿瘤达到预定大小的平均时间(天)。
来自PHTX-249Pa模型中所测试的各种给药时间表和浓度的结果的比较显示于图16A中。PHTX-249Pa模型中的各个治疗组的平均肿瘤体积曲线显示于图16B中。值得注意的是，利用5F9vcMMAE免疫结合物加在第1天和第3天15mg/kg的吉西他滨的组合，7只动物中的3只存在肿瘤消退，而利用单一药剂吉西他滨或7.5mg/kg的单一药剂免疫结合物未见任何肿瘤消退。相应肿瘤生长延迟为70.5天和17天。所有剂量均耐受良好。
使用实例7中所描述的方法使用混合作用线性消退模型对CPGC-13-EF05和CPGC-13-EF08研究执行纵向分析，以部分地确定5F9vcMMAE免疫结合物和吉西他滨的组合抗肿瘤效力为累加的还是协同的。表72A和72B是组符号的注释表。表73A和73B列示成对比较的结果。dAUC是治疗中所观察到的AUC相对于参照组的降低百分比。负dAUC解释为AUC相对于参照的增加。重要的是不仅评价P值，且还评价dAUC。与显著P值、但小dAUC值比较可能并不感兴趣。
表74A和74B列示协同作用分析。统计学上显著的负协同作用评分指示协同组合(“Syn.”)。当所述组合比表现得最好的单一药剂表现得更好(即具有较低AUC)时，统计学上显著的正协同作用评分指示次累加组合(“Sub-add”)。当所述组合比表现得最好的单一药剂表现得差时，统计学上显著的正协同作用评分指示拮抗组合(“Antag.”)。统计学上不显著的评分应视为累加的(“Add.”)。
表72A：CPGC-13-EF05研究的注释表
表72B：CPGC-13-EF08研究的注释表
表73A：CPGC-13-EF05研究的成对比较的结果
表73B：CPGC-13-EF08研究的成对比较的结果
表74A：CPGC-13-EF05研究的组合分析的结果
表74B：CPGC-13-EF08研究的组合分析的结果
如表74A和74B中所显示，在所有组合治疗组间均可见累加活性。
在携带PHTX-215Pas.c.异种移植物的雌性CB-17SCID小鼠中静脉内投予的5F9vcMMAE免疫结合物和吉西他滨的抗肿瘤活性(研究编号CPGC-13-EF10)
此研究的目标是测定根据QW时间表3.75mg/kg和7.5mg/kg的MLN0264与根据第1天、第3天时间表15mg/kg的吉西他滨的组合在CB17SCIDF小鼠中的PHTX-215Pas.c异种移植物中的协同作用和累加抗肿瘤活性。根据表75制备剂量调配物。研究设计显示于表76中。
表75：剂量调配物的制备
表76：CPGC-13-EF10研究设计
每一治疗组的终点为a)肿瘤体积达到10％体重；或b)体重损失>20％。研究起始日期的预计肿瘤体积为200mm3。
第D0天是治疗的第一天。不早于给药前1天，对所有动物称重并精确到克，且分组。在每次投予前将给药溶液涡旋，以确保正确递送化合物。动物接受使用27号到30号、1/2英寸到3/4英寸长的1cc注射器I.V.投予的大约0.1ml剂量。基于19.4克的平均体重向动物给药。
每周两次使用游标卡尺(0.01mm)获得肿瘤体积测量。使用下式计算肿瘤体积：
V＝W2×L/2(V＝肿瘤体积，W＝沿肿瘤短轴测量的宽度，L＝沿肿瘤短轴测量的长度)。还每周两次使用梅特勒天平(0.1gm)获取体重测量。
评价肿瘤生长抑制(TGI)％和肿瘤生长延迟(TGD)方面的效力。在任一天(当对照治疗组的最大肿瘤体积(MTV)达到最大允许肿瘤体积时)使用下式评估TGI：TGI＝100-[治疗MTV/对照MTV]×100。当肿瘤体积达到约230mm3时，对动物进行治疗。
通过计算T-C来评估TGD，其中T＝治疗组肿瘤达到预定大小(例如1,000mm3)的平均时间(天)，且其中C＝对照组肿瘤达到预定大小的平均时间(天)。
PHTX-215Pa模型中的各个治疗组的平均肿瘤体积曲线显示于图16C中。如图16C中所显示，在PHTX-215模型中5F9vcMMAE免疫结合物与吉西他滨的组合还导致增强的TGI和肿瘤消退。值得注意的是，利用免疫结合物加在第1天和第3天15mg/kg的吉西他滨的组合所有8只动物存在肿瘤消退(TGI93％)，而利用单一药剂吉西他滨未见任何肿瘤消退(TGI69％)。相应肿瘤生长延迟为60.4天和22.7天。所有剂量均耐受良好。
使用实例7中所描述的方法使用混合作用线性消退模型对CPGC-13-EF10研究执行纵向分析，以部分地确定5F9vcMMAE免疫结合物和吉西他滨的组合抗肿瘤效力为累加的还是协同的。表77A是组符号的注释表。表77B列示成对比较的结果。dAUC是治疗中所观察到的AUC相对于参照组的降低百分比。负dAUC解释为AUC相对于参照的增加。重要的是不仅评价P值，且还评价dAUC。与显著P值、但小dAUC值比较可能并不感兴趣。
表77C列示协同作用分析。统计学上显著的负协同作用评分指示协同组合(“Syn.”)。当所述组合比表现得最好的单一药剂表现得更好(即具有较低AUC)时，统计学上显著的正协同作用评分指示次累加组合(“Sub-add”)。当所述组合比表现得最好的单一药剂表现得差时，统计学上显著的正协同作用评分指示拮抗组合(“Antag.”)。统计学上不显著的评分应视为累加的(“Add.”)。
表77A：注释表
表77B：成对比较
表77C：协同作用分析
如表77中所显示，在组合治疗组间可见累加活性。
总之，这些数据指示5F9vcMMAE免疫结合物在表达GCC的胰脏癌异种移植物模型中展示抗肿瘤活性。免疫结合物与吉西他滨的组合与任一单独单一药剂相比在表达GCC的胰脏癌异种移植物模型中展示增强的抗肿瘤活性。这些数据表明免疫结合物以单一药剂形式和与吉西他滨组合可作为患有胰脏癌的患者的潜在疗法适用于临床调查。
尽管已参照本发明所提供的实施例显示并描述本发明，但所属领域技术人员应理解，可在不背离随附权利要求书中所涵盖的本发明范围下对其形式和细节作出各种改变。

Claims (123)

1.一种治疗胃肠癌的方法，所述方法包含向需要所述治疗的患者投予式(I-5)的免疫结合物：
或其医药上可接受的盐，其中Ab是抗GCC抗体分子或其抗原结合片段，且其中m为1到8的整数；
与DNA破坏剂的组合，其中所述免疫结合物和所述DNA破坏剂的量在组合使用时在治疗上有效。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗GCC抗体分子包含：
a)三个重链互补决定区CDR，其包含以下氨基酸序列：
VHCDR1GYYWS(SEQIDNO:25)；
VHCDR2EINHRGNTNDNPSLKS(SEQIDNO:26)；和
VHCDR3ERGYTYGNFDH(SEQIDNO:27)；
和
b)三个轻链CDR，其包含以下氨基酸序列：
VLCDR1RASQSVSRNLA(SEQIDNO:28)；
VLCDR2GASTRAT(SEQIDNO:29)；和
VLCDR3QQYKTWPRT(SEQIDNO:30)。
3.根据权利要求1所述的方法，其中m为3到5。
4.根据权利要求3所述的方法，其中m为约4。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述胃肠癌是GCC表达癌症。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述胃肠癌对所述免疫结合物在以单一药剂形式投予时的活性具有抗性。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述胃肠癌选自由以下组成的群组：结肠直肠癌、胃癌、胰脏癌和食道癌或其转移。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA破坏剂选自由以下组成的群组：拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、烷化剂、类烷化剂、蒽环、DNA嵌入剂、DNA小沟烷化剂和抗代谢物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述DNA破坏剂是拓扑异构酶I抑制剂、蒽环或抗代谢物。
10.根据权利要求8所述的方法，DNA破坏剂是选自由伊立替康、拓扑替康和喜树碱组成的群组的拓扑异构酶I抑制剂。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述拓扑异构酶I抑制剂是伊立替康。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述胃肠癌是原发性或转移性结肠直肠癌。
13.根据权利要求8所述的方法，其中所述DNA破坏剂是选自由以下组成的群组的类烷化剂：顺铂、奥沙利铂、卡铂、奈达铂、沙铂和三铂。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述类烷化剂是顺铂。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述胃肠癌是原发性或转移性结肠直肠癌。
16.根据权利要求8所述的方法，其中所述DNA破坏剂是选自由以下组成的群组的抗代谢物：氟尿嘧啶5-FU、氟尿苷5-FUdR、甲氨蝶呤、甲酰四氢叶酸、羟基脲、硫鸟嘌呤6-TG、巯嘌呤6-MP、阿糖胞苷、喷司他汀、磷酸氟达拉滨、克拉屈滨2-CDA、天冬酰胺酶、吉西他滨、卡培他滨、硫唑嘌呤、胞嘧啶甲氨蝶呤、甲氧苄啶、乙胺嘧啶和培美曲塞。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述抗代谢物是吉西他滨。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述胃肠癌是原发性或转移性胰脏癌。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述抗代谢物是5-氟尿嘧啶。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述胃肠癌是原发性或转移性结肠直肠癌。
21.根据权利要求1所述的方法，其中相伴投予所述免疫结合物和所述DNA破坏剂。
22.根据权利要求1所述的方法，其中依序投予所述免疫结合物和所述DNA破坏剂。
23.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫结合物和所述DNA破坏剂包含于单独调配物中。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗GCC抗体分子是单克隆抗体或其抗原结合片段。
25.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗GCC抗体分子是IgG1抗体。
26.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗GCC抗体分子进一步包含人类或人类源轻链和重链可变区框架。
27.一种治疗原发性或转移性结肠直肠癌的方法，所述方法包含向需要所述治疗的患者投予式(I-5)的免疫结合物：
或其医药上可接受的盐，其中Ab是抗GCC抗体分子或其抗原结合片段，且m为1到8的整数；
与拓扑异构酶I抑制剂的组合，其中所述免疫结合物和拓扑异构酶I抑制剂的量在组合使用时在治疗上有效。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述抗GCC抗体分子包含：
a)三个重链互补决定区CDR，其包含以下氨基酸序列：
VHCDR1GYYWS(SEQIDNO:25)；
VHCDR2EINHRGNTNDNPSLKS(SEQIDNO:26)；和
VHCDR3ERGYTYGNFDH(SEQIDNO:27)；
和
b)三个轻链CDR，其包含以下氨基酸序列：
VLCDR1RASQSVSRNLA(SEQIDNO:28)；
VLCDR2GASTRAT(SEQIDNO:29)；和
VLCDR3QQYKTWPRT(SEQIDNO:30)。
29.根据权利要求27所述的方法，其中m为3到5。
30.根据权利要求27所述的方法，其中m为约4。
31.根据权利要求27所述的方法，其中所述原发性或转移性结肠直肠癌是GCC表达癌症。
32.根据权利要求27所述的方法，其中所述癌症对所述免疫结合物在以单一药剂形式投予时的活性具有抗性。
33.根据权利要求27所述的方法，其中所述拓扑异构酶I抑制剂选自由伊立替康、拓扑替康和喜树碱组成的群组。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述拓扑异构酶I抑制剂是伊立替康。
35.根据权利要求27所述的方法，其中相伴投予所述免疫结合物和拓扑异构酶I抑制剂。
36.根据权利要求27所述的方法，其中依序投予所述免疫结合物和拓扑异构酶I抑制剂。
37.根据权利要求27所述的方法，其中所述免疫结合物和拓扑异构酶I抑制剂包含于单独调配物中。
38.根据权利要求27所述的方法，其中所述抗GCC抗体分子是单克隆抗体或其抗原结合片段。
39.根据权利要求27所述的方法，其中所述抗GCC抗体分子是IgG1抗体。
40.根据权利要求27所述的方法，其中所述抗GCC抗体分子进一步包含人类或人类源轻链和重链可变区框架。
41.一种治疗原发性或转移性结肠直肠癌的方法，所述方法包含向需要所述治疗的患者投予式(I-5)的免疫结合物：
或其医药上可接受的盐，其中Ab是抗GCC抗体分子或其抗原结合片段，且m为1到8的整数；
与类烷化剂的组合，其中所述免疫结合物和类烷化剂的量在组合使用时在治疗上有效。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述抗GCC抗体分子包含：
a)三个重链互补决定区CDR，其包含以下氨基酸序列：
VHCDR1GYYWS(SEQIDNO:25)；
VHCDR2EINHRGNTNDNPSLKS(SEQIDNO:26)；和
VHCDR3ERGYTYGNFDH(SEQIDNO:27)；和
b)三个轻链CDR，其包含以下氨基酸序列：
VLCDR1RASQSVSRNLA(SEQIDNO:28)；
VLCDR2GASTRAT(SEQIDNO:29)；和
VLCDR3QQYKTWPRT(SEQIDNO:30)。
43.根据权利要求41所述的方法，其中m为3到5。
44.根据权利要求41所述的方法，其中m为约4。
45.根据权利要求41所述的方法，其中所述原发性或转移性结肠直肠癌是GCC表达癌症。
46.根据权利要求41所述的方法，其中所述癌症对所述免疫结合物在以单一药剂形式投予时的活性具有抗性。
47.根据权利要求41所述的方法，其中所述类烷化剂选自由以下组成的群组：奥沙利铂、顺铂、卡铂、奈达铂、沙铂和三铂。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述类烷化剂是顺铂。
49.根据权利要求41所述的方法，其中相伴投予所述免疫结合物和类烷化剂。
50.根据权利要求41所述的方法，其中依序投予所述免疫结合物和类烷化剂。
51.根据权利要求41所述的方法，其中所述免疫结合物和类烷化剂包含于单独调配物中。
52.根据权利要求41所述的方法，其中所述抗GCC抗体分子是单克隆抗体或其抗原结合片段。
53.根据权利要求41所述的方法，其中所述抗GCC抗体分子是IgG1抗体。
54.根据权利要求41所述的方法，其中所述抗GCC抗体分子进一步包含人类或人类源轻链和重链可变区框架。
55.一种治疗原发性或转移性结肠直肠癌的方法，所述方法包含向需要所述治疗的患者投予式(I-5)的免疫结合物：
或其医药上可接受的盐，其中Ab是抗GCC抗体分子或其抗原结合片段，且m为1到8的整数；
与抗代谢剂的组合，其中所述免疫结合物和抗代谢剂的量在组合使用时在治疗上有效。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述抗GCC抗体分子包含：
a)三个重链互补决定区CDR，其包含以下氨基酸序列：
VHCDR1GYYWS(SEQIDNO:25)；
VHCDR2EINHRGNTNDNPSLKS(SEQIDNO:26)；和
VHCDR3ERGYTYGNFDH(SEQIDNO:27)；和
b)三个轻链CDR，其包含以下氨基酸序列：
VLCDR1RASQSVSRNLA(SEQIDNO:28)；
VLCDR2GASTRAT(SEQIDNO:29)；和
VLCDR3QQYKTWPRT(SEQIDNO:30)。
57.根据权利要求55所述的方法，其中m为3到5。
58.根据权利要求55所述的方法，其中m为约4。
59.根据权利要求55所述的方法，其中所述原发性或转移性结肠直肠癌是GCC表达癌症。
60.根据权利要求55所述的方法，其中所述癌症对所述免疫结合物在以单一药剂形式投予时的活性具有抗性。
61.根据权利要求55所述的方法，其中所述抗代谢剂选自由以下组成的群组：氟尿嘧啶5-FU、氟尿苷5-FUdR、甲氨蝶呤、甲酰四氢叶酸、羟基脲、硫鸟嘌呤6-TG、巯嘌呤6-MP、阿糖胞苷、喷司他汀、磷酸氟达拉滨、克拉屈滨2-CDA、天冬酰胺酶、吉西他滨、卡培他滨、硫唑嘌呤、胞嘧啶甲氨蝶呤、甲氧苄啶、乙胺嘧啶和培美曲塞。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述抗代谢剂是5-氟尿嘧啶。
63.根据权利要求58所述的方法，其中相伴投予所述免疫结合物和抗代谢剂。
64.根据权利要求55所述的方法，其中依序投予所述免疫结合物和抗代谢剂。
65.根据权利要求55所述的方法，其中所述免疫结合物和抗代谢剂包含于单独调配物中。
66.根据权利要求55所述的方法，其中所述抗GCC抗体分子是单克隆抗体或其抗原结合片段。
67.根据权利要求55所述的方法，其中所述抗GCC抗体分子是IgG1抗体。
68.根据权利要求55所述的方法，其中所述抗GCC抗体分子进一步包含人类或人类源轻链和重链可变区框架。
69.一种治疗原发性或转移性胰脏癌的方法，所述方法包含向需要所述治疗的患者投予式(I-5)的免疫结合物：
或其医药上可接受的盐，其中Ab是抗GCC抗体分子或其抗原结合片段，且m为1到8的整数；
与抗代谢物的组合，其中所述免疫结合物和抗代谢物的量在组合使用时在治疗上有效。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述抗GCC抗体分子包含：
a)三个重链互补决定区CDR，其包含以下氨基酸序列：
VHCDR1GYYWS(SEQIDNO:25)；
VHCDR2EINHRGNTNDNPSLKS(SEQIDNO:26)；和
VHCDR3ERGYTYGNFDH(SEQIDNO:27)；和
b)三个轻链CDR，其包含以下氨基酸序列：
VLCDR1RASQSVSRNLA(SEQIDNO:28)；
VLCDR2GASTRAT(SEQIDNO:29)；和
VLCDR3QQYKTWPRT(SEQIDNO:30)。
71.根据权利要求69所述的方法，其中m为3到5。
72.根据权利要求69所述的方法，其中m为约4。
73.根据权利要求69所述的方法，其中所述原发性或转移性胰脏癌是GCC表达癌症。
74.根据权利要求69所述的方法，其中所述抗代谢物是选自由以下组成的群组：氟尿嘧啶5-FU、氟尿苷5-FUdR、甲氨蝶呤、甲酰四氢叶酸、羟基脲、硫鸟嘌呤6-TG、巯嘌呤6-MP、阿糖胞苷、喷司他汀、磷酸氟达拉滨、克拉屈滨2-CDA、天冬酰胺酶、吉西他滨、卡培他滨、硫唑嘌呤、胞嘧啶甲氨蝶呤、甲氧苄啶、乙胺嘧啶和培美曲塞。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述抗代谢物是吉西他滨。
76.根据权利要求73所述的方法，其中相伴投予所述免疫结合物和抗代谢物。
77.根据权利要求69所述的方法，其中依序投予所述免疫结合物和抗代谢物。
78.根据权利要求69所述的方法，其中所述免疫结合物和抗代谢物包含于单独调配物中。
79.根据权利要求69所述的方法，其中所述抗GCC抗体分子是单克隆抗体或其抗原结合片段。
80.根据权利要求69所述的方法，其中所述抗GCC抗体分子是IgG1抗体。
81.根据权利要求69所述的方法，其中所述抗GCC抗体分子进一步包含人类或人类源轻链和重链可变区框架。
82.一种试剂盒，其包含式(I-5)的免疫结合物：
或其医药上可接受的盐，其中Ab是包含以下的抗GCC抗体：
a)三个重链互补决定区CDR，其包含以下氨基酸序列：
VHCDR1GYYWS(SEQIDNO:25)；
VHCDR2EINHRGNTNDNPSLKS(SEQIDNO:26)；和
VHCDR3ERGYTYGNFDH(SEQIDNO:27)；和
b)三个轻链CDR，其包含以下氨基酸序列：
VLCDR1RASQSVSRNLA(SEQIDNO:28)；
VLCDR2GASTRAT(SEQIDNO:29)；和
VLCDR3QQYKTWPRT(SEQIDNO:30)，
或其抗原结合片段，且其中m为约4；和关于投予所述免疫结合物与DNA破坏剂的组合用于治疗胃肠癌的说明书。
83.根据权利要求82所述的试剂盒，其中所述胃肠癌是GCC表达癌症。
84.根据权利要求82所述的试剂盒，其中所述胃肠癌对所述免疫结合物在以单一药剂形式投予时的活性具有抗性。
85.根据权利要求82所述的试剂盒，其中所述胃肠癌选自由以下组成的群组：结肠直肠癌、胃癌、胰脏癌和食道癌或其转移。
86.根据权利要求82的试剂盒，其进一步包含选自由以下组成的群组的DNA破坏剂：拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、烷化剂、类烷化剂、蒽环、DNA嵌入剂、DNA小沟烷化剂和抗代谢物。
87.根据权利要求86所述的试剂盒，其中所述DNA破坏剂是拓扑异构酶I抑制剂、类烷化剂或抗代谢物。
88.根据权利要求86所述的试剂盒，其中所述DNA破坏剂是选自由伊立替康、拓扑替康和喜树碱组成的群组的拓扑异构酶I抑制剂。
89.根据权利要求88所述的试剂盒，其中所述拓扑异构酶I抑制剂是伊立替康。
90.根据权利要求89所述的试剂盒，其中所述胃肠癌是原发性或转移性结肠直肠癌。
91.根据权利要求82所述的试剂盒，其中所述DNA破坏剂是选自由以下组成的群组的类烷化剂：顺铂、奥沙利铂、卡铂、奈达铂、沙铂和三铂。
92.根据权利要求91所述的试剂盒，其中所述类烷化剂是顺铂。
93.根据权利要求92所述的试剂盒，其中所述胃肠癌是原发性或转移性结肠直肠癌。
94.根据权利要求82所述的试剂盒，其中所述DNA破坏剂是选自由以下组成的群组的抗代谢物：氟尿嘧啶5-FU、氟尿苷5-FUdR、甲氨蝶呤、甲酰四氢叶酸、羟基脲、硫鸟嘌呤6-TG、巯嘌呤6-MP、阿糖胞苷、喷司他汀、磷酸氟达拉滨、克拉屈滨2-CDA、天冬酰胺酶、吉西他滨、卡培他滨、硫唑嘌呤、胞嘧啶甲氨蝶呤、甲氧苄啶、乙胺嘧啶和培美曲塞。
95.根据权利要求94所述的试剂盒，其中所述抗代谢物是5-氟尿嘧啶。
96.根据权利要求95所述的试剂盒，其中所述胃肠癌是原发性或转移性结肠直肠癌。
97.根据权利要求94所述的试剂盒，其中所述抗代谢物是吉西他滨。
98.根据权利要求97所述的试剂盒，其中所述胃肠癌是原发性或转移性胰脏癌。
99.根据权利要求1中任一权利要求所述的方法，其中所述免疫结合物和所述DNA破坏剂的投予产生协同效力。
100.根据权利要求27所述的方法，其中所述免疫结合物和所述拓扑异构酶I抑制剂的投予产生协同效力。
101.根据权利要求41所述的方法，其中所述免疫结合物和所述类烷化剂的投予产生协同效力。
102.根据权利要求55所述的方法，其中所述免疫结合物和所述抗代谢物的投予产生协同效力。
103.根据权利要求69所述的方法，其中所述癌症是对所述免疫结合物在以单一药剂形式投予时的活性具有抗性。
104.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症具有相对较高或中等的GCC抗原密度。
105.根据权利要求27所述的方法，其中所述癌症具有相对较高或中等的GCC抗原密度。
106.根据权利要求41所述的方法，其中所述癌症具有相对较高或中等的GCC抗原密度。
107.根据权利要求55所述的方法，其中所述癌症具有相对较高或中等的GCC抗原密度。
108.根据权利要求69所述的方法，其中所述癌症具有相对较高或中等的GCC抗原密度。
109.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症具有低GCC抗原密度。
110.根据权利要求27所述的方法，其中所述癌症具有低GCC抗原密度。
111.根据权利要求41所述的方法，其中所述癌症具有低GCC抗原密度。
112.根据权利要求55所述的方法，其中所述癌症具有低GCC抗原密度。
113.根据权利要求69所述的方法，其中所述癌症具有低GCC抗原密度。
114.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含测定所述癌症的GCC抗原密度的步骤。
115.根据权利要求27所述的方法，其进一步包含测定所述癌症的GCC抗原密度的步骤。
116.根据权利要求41所述的方法，其进一步包含测定所述癌症的GCC抗原密度的步骤。
117.根据权利要求55所述的方法，其进一步包含测定所述癌症的GCC抗原密度的步骤。
118.根据权利要求69所述的方法，其进一步包含测定所述癌症的GCC抗原密度的步骤。
119.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含测定所述癌症对单独的所述免疫结合物的敏感性的步骤。
120.根据权利要求27所述的方法，其进一步包含测定所述癌症对单独的所述免疫结合物的敏感性的步骤。
121.根据权利要求41所述的方法，其进一步包含测定所述癌症对单独的所述免疫结合物的敏感性的步骤。
122.根据权利要求55所述的方法，其进一步包含测定所述癌症对单独的所述免疫结合物的敏感性的步骤。
123.根据权利要求69所述的方法，其进一步包含测定所述癌症对单独的所述免疫结合物的敏感性的步骤。
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