ES2347249T3 - Una proteina implicada en el cancer de ovario. - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo anti-CDCP1 o fragmento de éste de unión a epítopo, para usarse en el tratamiento y/o profilaxis del cáncer de ovario o el cribado de y/o diagnóstico o pronóstico del cáncer de ovario.
Description
Una proteína implicada en el cáncer de
ovario.
La presente invención se refiere a agentes tales
como anticuerpos para el tratamiento y/o profilaxis del cáncer de
ovario que comprende tomar como diana el polipéptido CDCP1, tales
como inhibidores de la actividad del polipéptido, a métodos para la
identificación de los mismos y al uso de CDCP1 en el tratamiento y/o
diagnóstico del cáncer de ovario.
El cáncer de ovario es el más mortal de los
cánceres ginecológicos presentando inicialmente aproximadamente el
70% de los que padecen el cáncer de ovario epitelial más común la
enfermedad en estadio tardío en el que el cáncer puede haberse
diseminado desde los ovarios a otros órganos pélvicos y abdominales
o nódulos linfáticos en la pelvis, ingle o abdomen (Estadio III) o
se ha diseminado hacia fuera al hígado o fuera del abdomen, lo más
común hacia el recubrimiento que está alrededor de los pulmones. La
proporción de supervivencia de dichos pacientes se reduce
significativamente comparada con aquellos que presentan la
enfermedad en un estadio más temprano. El cáncer de ovario se ha
tratado generalmente con quimioterapia basada en cisplatino y a
menudo recurre debido a resistencia adquirida al cisplatino
(Yahata, H. et al., 2002, J. Cancer Res. Clin. Oncol.
128:621-6), de ahí la necesidad de nuevos fármacos y
nuevas dianas terapéuticas. También existe una necesidad de nuevos
marcadores del cáncer de ovario ya que los marcadores actuales
carecen de la sensibilidad y especificidad adecuadas para ser
aplicables a grandes poblaciones (Rai, A. et al., 2002, Arch.
PathoL Lab. Med. 126:1518-26).
Así, existen necesidades importantes de nuevos
agentes terapéuticos para el tratamiento del cáncer de ovario.
Además, existe una necesidad clara de identificar nuevas proteínas
asociadas al cáncer de ovario para usarlas como biomarcadores
sensibles y específicos para el diagnóstico del cáncer de ovario en
sujetos vivos.
Un ácido nucleico que codifica un polipéptido
que comparte 834 aminoácidos de los 836 aminoácidos con CDCP1 se
describe en WO 02/70539, US2002/0142003 y WO 02/04508, de los que
los dos últimos describen una implicación potencial de ese
polipéptido en los cánceres de pulmón y colon.
La presente invención se basa en el
descubrimiento de que CDCP I representa una diana terapéutica nueva
para el tratamiento y/o profilaxis del cáncer de ovario.
De acuerdo con esto, la invención proporciona un
anticuerpo anti-CDCP1 o fragmento de éste
funcionalmente activo, para el tratamiento y/o profilaxis del
cáncer de ovario o el cribado y/o diagnóstico o pronóstico del
cáncer de ovario.
En un aspecto adicional, la invención
proporciona un polipéptido CDCP1 para el tratamiento y/o profilaxis
del cáncer de ovario.
El término "polipéptidos" incluye péptidos,
polipéptidos y proteínas. Estos términos se utilizan de modo
intercambiable, a menos que se indique lo contrario.
Así, la invención también proporciona el uso de
un anticuerpo, que interacciona con o modula la expresión o
actividad de un polipéptido CDCP1 para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento y/o profilaxis del cáncer de
ovario.
Lo más preferiblemente, el agente para usarse en
el tratamiento y/o profilaxis del cáncer de ovario es un anticuerpo
que interacciona con (es decir, se une a o reconoce) o modula la
actividad de un polipéptido CDCP1. De acuerdo con esto, se
proporciona el uso de un anticuerpo que interacciona con un
polipéptido CDCP1 para usarse en la fabricación de un medicamento
para usarse en el tratamiento y/o profilaxis del cáncer de ovario.
También se proporciona un método de tratamiento y/o profilaxis del
cáncer de ovario en un sujeto, que comprende administrar a dicho
sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo que
interacciona con CDCP1. En una realización, puede usarse un
anticuerpo que interacciona con un polipéptido CDCP1 para mediar la
citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y la
citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). En dicho caso, el
anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo desnudo de longitud
completa. En otro aspecto de la invención, puede usarse un
anticuerpo que interacciona con polipéptidos CDCP1 para inhibir la
actividad de dichos polipéptidos.
Los anticuerpos más preferidos son anticuerpos
que interaccionan específicamente con un polipéptido CDCP1.
Interaccionar (por ejemplo, reconocer o unirse) específicamente
significa que los anticuerpos tienen una mayor afinidad por los
polipéptidos CDCP1 que por otros polipéptidos.
Puede usarse un anticuerpo, conjugado
opcionalmente con un resto terapéutico, terapéuticamente solo o en
combinación con uno o más factores citotóxicos y/o
citoquina(s). En particular, los anticuerpos CDCP1 pueden
conjugarse con un agente terapéutico, tal como un agente
citotóxico, un radionúclido o resto de fármaco para modificar una
respuesta biológica dada. El agente terapéutico no debe
interpretarse limitado a los agentes químicos terapéuticos
clásicos. Por ejemplo, el agente terapéutico puede ser un resto de
fármaco que puede ser una proteína o polipéptido que posea una
actividad biológica deseada. Estos restos pueden incluir, por
ejemplo y sin limitación, una toxina, tal como abrina, ricina A, la
exotoxina de Pseudomonas o la toxina de la difteria, una proteína,
tal como el factor de necrosis tumoral,
\alpha-interferón,
\beta-interferón, el factor del crecimiento
nervioso, el factor del crecimiento derivado de plaquetas o el
activador del plasminógeno tisular, un agente trombótico o un
agente antiangiogénico, por ejemplo, angiostatina o endostatina, o
un modificador de la respuesta biológica, tal como una linfoquina,
interleuquina-1 (IL-1),
interleuquina-2 (IL-2),
interleuquina-6 (IL-6), el factor
estimulante de colonias de macrófagos granulocitos
(GM-CSF), el factor estimulante de colonias de
granulocitos (G-CSF), el factor del crecimiento
nervioso (NGF) u otro factor del crecimiento.
Los agentes terapéuticos también incluyen
citotoxinas o agentes citotóxicos incluyendo cualquier agente que
es perjudicial para (p. ej. mata) las células. Los ejemplos incluyen
taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina,
mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina,
colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracindiona,
mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D,
1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína,
tetracaína, lidocaína, propranolol, y puromicina y sus análogos u
homólogos. Los agentes terapéuticos también incluyen, pero no se
limitan a antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato,
6-mercaptopurina, 6-tioguanina,
citarabina, 5-fluorouracil descarbazina), agentes
alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa cloranbucilo,
melfalano, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclotosfamida,
busulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, y
cis-diclorodiamina-platino (II)
(DDP), cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina
(antes denominada daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (por
ejemplo, dactinomicina (antes denominada actinomicina), bleomicina,
mitramicina, antramicina (AMC), caliqueamicinas o duocarmicinas), y
agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina).
Otros restos terapéuticos pueden incluir
radionúclidos tales como ^{111}In y ^{90}Y, Lu^{177},
Bismuto^{213}, Californio^{252}, Iridio^{192} y
Tungsteno^{188}/Renio^{188}; o fármacos, tales como, pero sin
limitarse a alquilfosfocolinas, inhibidores de la topoisomerasa I,
taxoides y suramina.
Las técnicas para conjugar dichos agentes
terapéuticos con anticuerpos son muy conocidas en la técnica (véase,
p. ej., Amon et al., "Monoclonal Antibodies For
Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal
Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al., eds., 1985 p.
243-56, ed. Alan R. Liss, Inc; Hellstrom et
al., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug
Delivery, 2a Ed., Robinson et al., eds., 1987, p.
623-53, Marcel Dekker, Inc.; Thorpe, "Antibody
Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en
Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications;
Pinchera et al., 1985, eds., p. 475-506;
"Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use
Of Radiolabelled Antibody In Cancer Therapy", en Monoclonal
Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al.
(eds.), 1985, p. 303-16, Academic Press; Thorpe
et al., 1982 "The Preparation And Cytotoxic Properties Of
Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev.,
62:119-58 y Dubowchik et al., 1999,
Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123).
Los anticuerpos para usarse en la invención
incluyen análogos y derivados que están modificados, por ejemplo
pero sin limitación, por la unión covalente de cualquier tipo de
molécula. Preferiblemente dicha unión no afecta la unión
inmunoespecífica. En un aspecto, puede conjugarse un anticuerpo con
un segundo anticuerpo para formar un heteroconjugado de anticuerpo
(véase US 4.676.980).
En otras realizaciones, la invención proporciona
el uso terapéutico de proteínas de fusión de los anticuerpos (o
fragmentos de estos funcionalmente activos), por ejemplo pero sin
limitación, cuando el anticuerpo o fragmento de éste se fusiona a
través de un enlace covalente (p. ej. un enlace peptídico),
opcionalmente en el extremo N terminal o C terminal, a una
secuencia de aminoácidos de otra proteína (o parte de ésta;
preferiblemente una parte de al menos 10, 20 ó 50 aminoácidos de la
proteína). Preferiblemente, el anticuerpo, o su fragmento, se une a
la otra proteína en el N-terminal del dominio
constante del anticuerpo. En otro aspecto, una proteína de fusión
de anticuerpo puede facilitar la reducción o purificación de un
polipéptido como se describe en la presente memoria, incrementar la
vida media in vivo, e incrementar la administración de un
antígeno a través de una barrera epitelial al sistema inmune.
Cuando la proteína de fusión es un fragmento de
anticuerpo unido a una molécula efectora o informadora, ésta puede
prepararse por procedimientos químicos o de ADN recombinante
estándar. Un grupo efector preferido es una molécula de polímero,
que puede unirse al fragmento Fab modificado para incrementar su
vida media in vivo.
La molécula de polímero puede ser, en general,
un polímero sintético o natural, por ejemplo una cadena sustituida
opcionalmente lineal o ramificada de polialquileno, polialquenileno
o polioxialquileno o un polisacárido ramificado o no ramificado, p.
ej. un homo o hetero polisacárido.
Los sustituyentes opcionales concretos que
pueden estar presentes en los polímeros sintéticos mencionados
anteriormente incluyen uno o más grupos hidroxi, metilo o
metoxi.
Los ejemplos concretos de polímeros sintéticos
incluyen poli(etilenglicol), poli(propilenglicol) y
poli(alcohol vinílico) de cadena lineal o ramificada
opcionalmente sustituidos, o derivados de estos, en especial
poli(etilenglicol) opcionalmente sustituido, tal como
metoxipoli(etilenglicol) o derivados de éste.
Los polímeros naturales particulares incluyen
lactosa, amilosa, dextrano, glucógeno o derivados de estos.
"Derivados" tal y como se usa en la
presente memoria se pretende que incluya derivados reactivos, por
ejemplo grupos reactivos selectivos tiol tales como maleimidas y
semejantes. El grupo reactivo puede unirse directamente o a través
de un segmento conector al polímero. Se apreciará que el resto de
dicho grupo será parte en algunos casos del producto como grupo
conector entre el fragmento de anticuerpo y el polímero.
El tamaño del polímero puede variarse según se
desee, pero estará generalmente en un intervalo de peso molecular
medio de 500Da a 50.000Da, preferiblemente de 5.000 a 40.000Da y más
preferiblemente de 25.000 a 40.000Da. El tamaño del polímero puede
seleccionarse en particular tomando como base el uso pretendido del
producto. Así, por ejemplo, cuando se pretende que el producto deje
la circulación y penetre en un tejido, por ejemplo para uso en el
tratamiento de un tumor, puede ser ventajoso usar un polímero de
bajo peso molecular, por ejemplo con un peso molecular de
aproximadamente 5.000Da. Para las aplicaciones en las que el
producto permanece en la circulación, puede ser ventajoso usar un
polímero de alto peso molecular, por ejemplo que tenga un peso
molecular en el intervalo de 25.000Da a 40.000Da.
Los polímeros particularmente preferidos
incluyen un polímero polialquileno, tal como
poli(etilenglicol) o, especialmente, un
metoxipoli(etilenglicol) o un derivado de éste, y
especialmente con un peso molecular en el intervalo de
aproximadamente 25.000Da a aproximadamente 40.000Da.
Cada molécula de polímero unida al fragmento de
anticuerpo modificado puede unirse covalentemente al átomo de
azufre de un resto de cisteína localizado en el fragmento. La unión
covalente será generalmente un enlace disulfuro o, en particular,
un enlace azufre-carbono.
Cuando se desee, el fragmento de anticuerpo
puede tener una o más moléculas efectoras o informadoras unidas a
él. Las moléculas efectoras o informadoras pueden unirse al
fragmento de anticuerpo a través de cualquier grupo funcional de la
cadena lateral de aminoácidos o aminoácido terminal localizado en el
fragmento, por ejemplo cualquier grupo amino, imino, hidroxilo o
carboxilo libre.
Un polímero activado puede usarse como material
de partida en la preparación de polímero-fragmentos
de anticuerpo modificados como se ha descrito anteriormente. El
polímero activado puede ser cualquier polímero que contenga un
grupo reactivo tiol tal como un ácido o éster
\alpha-halocarboxílico, p. ej. yodoacetamida, una
imida, p. ej. maleimida, una vinil sulfona o un disulfuro. Dichos
materiales de partida pueden obtenerse comercialmente (por ejemplo
de Nektar Therapeutics, Inc (Huntsville, AL), o pueden prepararse a
partir de materiales de partida disponibles comercialmente usando
procedimientos químicos convencionales.
Pueden usarse procedimientos químicos o de ADN
recombinante estándar en los que el fragmento de anticuerpo se une
bien directamente o a través de un agente de acoplamiento a la
molécula efectora o informadora bien antes o después de la reacción
con el polímero activado según sea apropiado. Los procedimientos
químicos particulares incluyen, por ejemplo, los descritos en WO
93/06231, WO 92/22583, WO 90/09195, WO 89/01476, WO 99/15549 y WO
03/031581. Alternativamente, cuando la molécula efectora o
informadora es una proteína o polipéptido, la unión puede
conseguirse usando procedimientos de ADN recombinante, por ejemplo
como se describe en WO 86/01533 y EP 0392745.
Los más preferiblemente, los anticuerpos se unen
a restos de poli(etilenglicol) (PEG). Preferiblemente, un
fragmento Fab modificado está PEGilado, es decir tiene PEG
(poli(etilenglicol)) unido covalentemente a él, p. ej. según
el método descrito en EP 0948544 [véase también
"Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and
Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum
Press, Nueva York, "Poly(ethyleneglycol) Chemistry and
Biological Applications", 1997, J. Milton Harris y S. Zalipsky
(eds), American Chemical Society, Washington DC y "Bioconjugation
Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998,
M. Aslam y A. Dent, Grove Publishers, Nueva York; Chapman, A.,
2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 2002,
54:531-545]. En una realización, un fragmento Fab'
modificado con PEG tiene un grupo maleimida unido covalentemente a
un único grupo tiol en una región bisagra modificada. Puede unirse
un resto de lisina al grupo maleimida. A cada uno de los grupos
amino del resto de lisina puede unirse un polímero
metoxipoli(etilenglicol) que tiene un peso molecular de
aproximadamente 20.000 Da. El peso molecular total de la molécula
efectora completa puede ser por lo tanto aproximadamente 40.000
Da.
Los polipéptidos CDCP1 o las células que
expresan dichos polipéptidos pueden usarse para producir
anticuerpos, p. ej. que reconocen específicamente dichos
polipéptidos CDCP1. Los anticuerpos generados frente a un
polipéptido CDCP1 pueden obtenerse administrando los polipéptidos a
un animal, preferiblemente un animal no humano, usando protocolos
muy conocidos y rutinarios.
Los anticuerpos anti-CDCP1
incluyen fragmentos funcionalmente activos, derivados o análogos y
pueden ser, pero no se limitan a, anticuerpos policlonales,
monoclonales, bi-, tri- o tetravalentes, anticuerpos humanizados o
quiméricos, anticuerpos monocatenarios, fragmentos Fab, fragmentos
Fab' y Fab'_{2}, fragmentos producidos por una biblioteca de
expresión Fab, anticuerpos anti-idiotípicos
(anti-Id) y fragmentos de unión al epítopo de
cualquiera de los anteriores. Los anticuerpos humanizados son
moléculas de anticuerpo procedentes de una especie no humana que
tienen una o más regiones determinantes de la complementariedad
(CDR) procedentes de una especie no humana, y una región marco
procedente de una molécula de inmunoglobulina humana (véase, p. ej.
US 5.585.089). Los anticuerpos incluyen moléculas de inmunoglobulina
y porciones inmunológicamente activas de moléculas de
inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión
al antígeno que se une a un antígeno de forma específica. Las
moléculas de inmunoglobulina de la invención pueden ser de cualquier
clase (p. ej. IgG, IgE, IgM, IgD e IgA) o subclase de molécula de
inmunoglobulina.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Pueden prepararse anticuerpos monoclonales por
cualquier método conocido en la técnica, tal como la técnica de
hibridoma (Kohler y Milstein, 1975, Nature,
256:495-497), la técnica de trioma, la técnica de
hibridoma de linfocito B humano (Kozbor et al., 1983,
Immunology Today, 4:72), y la técnica de
hibridoma-EBV (Cole et al., Monoclonal
Antibodies and Cancer Therapy, p. 77-96, Alan R.
Liss, Inc., 1985).
Los anticuerpos quiméricos son aquellos
anticuerpos codificados por genes de inmunoglobulina que se han
modificado genéticamente de forma que los genes de la cadena ligera
y pesada están compuestos por segmentos de genes de inmunoglobulina
que pertenecen a diferentes especies. Es probable que estos
anticuerpos quiméricos sean menos antigénicos. Pueden prepararse
anticuerpos bivalentes por los métodos conocidos en la técnica
(Milstein et al., 1983, Nature,
305:537-539; WO 93/08829; Traunecker et al.,
1991, EMBO J., 10:3655-3659). Los
anticuerpos bi-, tri- y tetravalentes pueden comprender múltiples
especificidades o pueden ser mono específicos (véase por ejemplo WO
92/22853). Los anticuerpos para usarse en la invención pueden
generarse usando métodos de anticuerpos de linfocito único basados
en la clonación molecular y expresión de ADNc de región variable de
inmunoglobulina generados a partir de linfocitos únicos que se
seleccionaron para la producción de anticuerpos específicos tales
como se describen en Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 93(15):7843-7848 y en
WO92/02551.
Los anticuerpos para usarse en la presente
invención también pueden generarse usando varios métodos de
exposición de fagos conocidos en la técnica e incluyen los
descritos por Brinkman et al. (in J. Immunol. Methods, 1995,
182: 41-50), Ames et al. (J. Immunol Methods,
1995, 184:177-186), Kettleborough et al.
(Eur. J. Immunol. 1994, 24:952-958), Persic et
al. (Gene, 1997 187 9-18), Burton et al.
(Advances in Immunology, 1994, 57:191-280) y WO
90/028 09; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO
95/15982; WO 95/20401; y US 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484;
5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908;
5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 y 5.969.108. Las
técnicas para la producción de anticuerpos monocatenarios, tales
como los descritos en US 4.946.778, también pueden adaptarse para
producir anticuerpos monocatenarios frente a polipéptidos CDCP1.
Además pueden emplearse ratones transgénicos u otros organismos,
incluyendo otros mamíferos, para expresar los anticuerpos
humanizados.
Los polipéptidos CDCP1 pueden usarse para la
identificación de agentes para usarse en los métodos de tratamiento
y/o profilaxis según la invención.
Un aspecto adicional de la invención proporciona
métodos para cribar agentes anti-cáncer de ovario,
en los que el agente es un anticuerpo o fragmento de éste
funcionalmente activo, que interacciona con un polipéptido CDCP1
que comprende:
- (a)
- poner en contacto dicho polipéptido con un anticuerpo candidato; y
- (b)
- determinar si el anticuerpo se une o no específicamente a dicho polipéptido.
\vskip1.000000\baselineskip
Preferiblemente, la determinación de una
interacción entre el agente candidato y el polipéptido CDCP1
comprende detectar cuantitativamente la unión del agente candidato
y dicho polipéptido
Además se proporciona un método de cribado para
un agente anti-cáncer de ovario, en el que dicho
agente comprende un anticuerpo o un fragmento de éste
funcionalmente activo, que modula la expresión o actividad de un
polipéptido CDCP1 que comprende:
- (i)
- comparar la expresión o actividad de dicho polipéptido en presencia de un agente candidato con la expresión o actividad de dicho polipéptido en ausencia del agente candidato o en presencia de un agente control; y
- (ii)
- determinar si el agente candidato causa que cambie la expresión o actividad de dicho polipéptido.
\vskip1.000000\baselineskip
Preferiblemente, la expresión y/o actividad de
un polipéptido CDCP1 se compara con un intervalo de referencia
predeterminado o control.
Más preferiblemente, el método comprende además
seleccionar un agente, que interacciona con un polipéptido CDCP1 o
que es capaz de modular la interacción, expresión o actividad de un
polipéptido CDCP1, para un ensayo adicional para usarse en el
tratamiento y/o profilaxis del cáncer de ovario. Será evidente para
un experto en la técnica que los métodos de cribado anteriores
también son apropiados para el cribado de agentes
anti-cáncer de ovario que interaccionan con o
modulan la expresión o actividad de una molécula de ácido nucleico
de CDCP1.
La invención también proporciona ensayos para
usarse en el descubrimiento de fármacos con el fin de identificar o
verificar la eficacia de agentes para el tratamiento y/o profilaxis
del cáncer de ovario. Los agentes identificados usando estos
métodos pueden usarse como agentes directores para el descubrimiento
de fármacos, o usarse terapéuticamente. La expresión de un
polipéptido CDCP1 puede ensayarse, por ejemplo, por inmunoensayos,
electroforesis en gel seguida de visualización, detección de ARNm o
actividad de un polipéptido CDCP1 o cualquier otro método que
aparece en la presente memoria o conocido para los expertos en la
técnica. Dichos ensayos pueden usarse para cribar agentes
candidatos, en la monitorización clínica o en el desarrollo de
fármacos.
\global\parskip1.000000\baselineskip
En una realización, los agentes que
interaccionan con (p. ej. se unen a) un polipéptido CDCP1 se
identifican en un ensayo basado en células en el que una población
de células que expresa un polipéptido CDCP1 se pone en contacto con
un agente candidato y se determina la capacidad del agente candidato
para interaccionar con el polipéptido. Preferiblemente, la
capacidad de un agente candidato para interaccionar con un
polipéptido CDCP1 se compara con un intervalo de referencia o
control. En otra realización, una primera y una segunda población
de células que expresan un polipéptido CDCP1 se ponen en contacto
con un agente candidato o un agente control y se determina la
capacidad del agente candidato para interaccionar con el polipéptido
comparando la diferencia en la interacción entre el agente
candidato y el agente control. Si se desea, este tipo de ensayo
puede usarse para cribar una pluralidad (por ejemplo, una
biblioteca) de agentes candidatos usando una pluralidad de
poblaciones de células que expresan un polipéptido CDCP1. Si se
desea, este ensayo puede utilizarse para cribar una pluralidad (por
ejemplo, una biblioteca) de agentes candidatos. La célula puede ser,
por ejemplo, de origen procariota (p. ej. E. coli) o de
origen eucariota (p. ej. levadura o mamífero). Además, las células
pueden expresar el polipéptido CDCP1 endógenamente o pueden
modificarse por ingeniería genética para expresar el polipéptido.
En algunas realizaciones, un polipéptido CDCP1 o el agente candidato
se marca, por ejemplo, con un marcador radiactivo (tal como
^{32}P, ^{35}S o ^{125}I) o un marcador fluorescente (tal
como isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina,
ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído o
fluorescamina) para permitir la detección de una interacción entre
un polipéptido y un agente candidato.
Las interacciones de un agente (p. ej. que se
une) con un polipéptido CDCP1 se identifican en un sistema de
ensayo sin células en el que una muestra que expresa un polipéptido
CDCP1 se pone en contacto con un agente candidato y se determina la
capacidad del agente candidato para interaccionar con el
polipéptido. Preferiblemente, la capacidad de un agente candidato
para interaccionar con un polipéptido CDCP1 se compara con un
intervalo de referencia o control. En una realización preferida,
una primera y una segunda muestra que comprenden polipéptido CDCP1
nativo o recombinante se ponen en contacto con un agente candidato o
un agente control y se determina la capacidad del agente candidato
para interaccionar con el polipéptido comparando la diferencia en la
interacción entre el agente candidato y el agente control. Si se
desea, este ensayo puede emplearse para cribar una pluralidad (por
ejemplo, una biblioteca) de agentes candidatos usando una pluralidad
de muestras de polipéptidos CDCP1. Preferiblemente, en primer lugar
el polipéptido se inmoviliza, por ejemplo, poniendo en contacto el
polipéptido con un anticuerpo inmovilizado que lo reconozca
específicamente y se una a él, o poniendo en contacto una
preparación purificada de polipéptido con una superficie diseñada
para unir proteínas. El polipéptido puede estar parcial o
totalmente purificado (por ejemplo, estar parcial o totalmente
exento de otros polipéptidos) o ser parte de un lisado de células.
Además, el polipéptido puede ser una proteína de fusión que
comprende el polipéptido CDCP1 o una parte de éste biológicamente
activa y un dominio tal como
glutationina-S-transferasa.
Alternativamente, el polipéptido puede biotinilarse usando técnicas
muy conocidas por los expertos en la técnica (por ejemplo, el kit
de biotinilación de Pierce Chemicals; Rockford, IL). La capacidad
del agente candidato para interaccionar con el polipéptido puede
duplicarse por métodos muy conocidos por los expertos en la
técnica.
En una realización, se usa un polipéptido CDCP1
como una "proteína cebo" en un ensayo de dos híbridos o ensayo
de tres híbridos para identificar otras proteínas que se unen a o
interaccionan con el polipéptido CDCP1 (véase p. ej. US 5.283.317;
Zervos et al., 1993, Cell 72:223-232; Madura
et al. 1993, J. Biol. Chem. 268:12046-12054;
Bartel et al., 1993, Bio/Techniques
14:920-924; Iwabuchi et al., 1993, Oncogene
8:1693-1696; y WO 94/10300). Como apreciarán los
expertos en la técnica, dichas proteínas de unión probablemente
también están implicadas en la propagación de señales por un
polipéptido CDCP1. Por ejemplo, pueden ser elementos situados antes
o después de una ruta de señalización que implica un polipéptido
CDCP1. Alternativamente, los polipéptidos que interaccionan con un
polipéptido CDCP1 pueden identificarse aislando un complejo proteico
que comprende un polipéptido CDCP1 (dicho polipéptido puede
interaccionar directamente o indirectamente con uno o más
polipéptidos distintos) e identificando las proteínas asociadas
usando métodos conocidos en la técnica tales como espectrometría de
masas o transferencia Western (para ejemplos véanse Blackstock, W.
& Weir, M. 1999, Trends in Biotechnology, 17:
121-127; Rigaut, G. 1999, Nature Biotechnology, 17:
1030-1032; Husi, H. 2000, Nature Neurosci.
3:661-669; Ho, Y. et al., 2002, Nature,
415:180-183; Gavin, A. et al., 2002, Nature,
415: 141-147).
En todos los casos, la capacidad del agente
candidato para interaccionar directamente o indirectamente con el
polipéptido CDCP1 puede determinarse por métodos conocidos por los
expertos en la técnica. Por ejemplo pero sin limitación, la
interacción entre un agente candidato y un polipéptido CDCP1 puede
determinarse por citometría de flujo, un ensayo de centelleo, un
ensayo de actividad, espectrometría de masas, microscopía,
inmunoprecipitación o análisis de transferencia western.
En otra realización más, los agentes que
interaccionan de manera competitiva con (es decir, se unen de manera
competitiva a) un polipéptido CDCP1 se identifican en un ensayo de
unión competitiva y se determina la capacidad del agente candidato
para interaccionar con el polipéptido CDCP1. Preferiblemente, la
capacidad de un agente candidato para interaccionar con un
polipéptido CDCP1 se compara con un intervalo de referencia o
control. En una realización preferida, una primera y una segunda
población de células que expresan tanto un polipéptido CDCP1 como
una proteína que se sabe que interacciona con el polipéptido CDCP1
se ponen en contacto con un agente candidato o un agente control.
La capacidad del agente candidato para interaccionar de manera
competitiva con el polipéptido CDCP1 se determina comparando la
interacción en la primera y segunda población de células. En otra
realización, una segunda población alternativa o una población
adicional de células puede ponerse en contacto con un agente que se
sabe que interacciona de manera competitiva con un polipéptido
CDCP1. Alternativamente, se identifican los agentes que
interaccionan de manera competitiva con un polipéptido CDCP1 en un
sistema de ensayo sin células poniendo en contacto una primera y
una segunda muestra que comprende un polipéptido CDCP1 y una
proteína que se sabe que interacciona con el polipéptido CDCP1 con
un agente candidato o un agente control. La capacidad del agente
candidato para interaccionar de manera competitiva con el
polipéptido CDCP1 se determina comparando la interacción en la
primera y segunda muestra. En otra realización, una segunda muestra
alternativa o una muestra adicional que comprende un polipéptido
CDCP1 puede ponerse en contacto con un agente que se sabe que
interacciona de manera competitiva con un polipéptido CDCP1. En
cualquier caso, el polipéptido CDCP1 y la proteína que se sabe que
interacciona pueden expresarse de manera natural o pueden expresarse
de manera recombinante; el agente candidato puede añadirse
exógenamente, o puede expresarse de manera natural o
recombinante.
En otra realización, los agentes que modulan la
interacción entre un polipéptido CDCP1 y otro agente, por ejemplo
pero sin limitación, una proteína, pueden identificarse en un ensayo
basado en células poniendo en contacto las células que expresan un
polipéptido CDCP1 en presencia de un agente que interacciona
conocido y un agente candidato modulador y seleccionando el agente
candidato que modula la interacción. Alternativamente, los agentes
que modulan una interacción entre un polipéptido CDCP1 y otro
agente, por ejemplo pero sin limitación una proteína, pueden
identificarse en un sistema de ensayo sin células poniendo en
contacto el polipéptido con un agente que se sabe que interacciona
con el polipéptido en presencia de un agente candidato. Un agente
modulador puede actuar como un anticuerpo, un cofactor, un
inhibidor, un activador o tener un efecto antagonista o agonista en
la interacción entre un polipéptido CDCP1 y un agente conocido. Como
se ha indicado anteriormente, la capacidad del agente conocido para
interaccionar con un polipéptido CDCP1 puede determinarse por
métodos conocidos en la técnica. Estos ensayos, ya sean basados en
células o sin células, pueden usarse para cribar una pluralidad (p.
ej. una biblioteca) de agentes candidatos.
En otra realización, se usa un sistema de ensayo
basado en células para identificar agentes capaces de modular (es
decir, estimular o inhibir) la actividad de un polipéptido CDCP1. De
acuerdo con esto, la actividad de un polipéptido CDCP1 se mide en
una población de células que expresa de manera natural o
recombinante un polipéptido CDCP1, en presencia de un agente
candidato. Preferiblemente, la actividad de un polipéptido CDCP1 se
compara con un intervalo de referencia o control. En una
realización preferida, la actividad de un polipéptido CDCP1 se mide
en una primera y una segunda población de células que expresan de
manera natural o recombinante un polipéptido CDCP1, en presencia de
agente o ausencia de un agente candidato (p. ej. en presencia de un
agente control) y se compara la actividad del polipéptido CDCP1. El
agente candidato puede identificarse como un modulador de la
actividad de un polipéptido CDCP1 tomando como base esta
comparación. Alternativamente, la actividad de un polipéptido CDCP1
puede medirse en un sistema de ensayo sin células en el que el
polipéptido CDCP1 es natural o recombinante. Preferiblemente, la
actividad de un polipéptido CDCP1 se compara con un intervalo de
referencia o control. En una realización preferida, la actividad de
un polipéptido CDCP1 se mide en una primera y una segunda muestra
en presencia o ausencia de un agente candidato y se compara la
actividad del polipéptido CDCP1. El agente candidato puede
identificarse como un modulador de la actividad de un polipéptido
CDCP1 tomando como base esta comparación.
La actividad de un polipéptido CDCP1 puede
evaluarse detectando su efecto en un efector situado más abajo, por
ejemplo pero sin limitación, el nivel o actividad de un segundo
mensajero (p. ej. AMPc, Ca^{2+} intracelular, diacilglicerol,
IP_{3}, etc.), detectando la actividad catalítica o enzimática,
detectando la inducción de un gen informador (p. ej. luciferasa) o
detectando una respuesta celular, por ejemplo, proliferación,
diferenciación o transformación según sea apropiado como es
conocido por los expertos en la técnica (para técnicas de medida de
actividad véase p. ej. US 5.401.639). El agente candidato puede
identificarse como un modulador de la actividad de un polipéptido
CDCP1 comparando los efectos del agente candidato con el agente
control. Los agentes control adecuados incluyen PBS o disolución
salina normal.
En otra realización, pueden identificarse los
agentes tales como una enzima, o una parte de ésta biológicamente
activa, que es responsable de la producción o degradación de un
polipéptido CDCP1 o es responsable de la modificación posterior a
la traducción de un polipéptido CDCP1. En un cribado primario, se
ponen en contacto polipéptidos CDCP1 sustancialmente puros,
expresados de manera nativa o recombinante, ácidos nucleicos o
extractos celulares u otra muestra que comprende polipéptidos o
ácidos nucleicos CDCP1 expresados de manera nativa o recombinante
con una pluralidad de agentes candidatos (por ejemplo pero sin
limitación, una pluralidad de agentes presentados como una
biblioteca) que pueden ser responsables del procesamiento de un
polipéptido o ácido nucleico CDCP1, con el fin de identificar
dichos agentes. La capacidad del agente candidato para modular la
producción, degradación o modificación posterior a la traducción de
un polipéptido o ácido nucleico CDCP1 puede determinarse por métodos
conocidos para los expertos en la técnica, incluyendo pero sin
limitación, citometría de flujo, radiomarcaje, un ensayo de
quinasa, un ensayo de fosfatasa, inmunoprecipitación y análisis por
transferencia Western, o análisis por transferencia Northern.
En otra realización más, las células que
expresan un polipéptido CDCP1 se ponen en contacto con una
pluralidad de agentes candidatos. La capacidad de dicho agente para
modular la producción, degradación o modificación posterior a la
traducción de un polipéptido CDCP1 puede determinarse por métodos
conocidos por los expertos en la técnica, como se ha descrito
anteriormente.
En una realización, los agentes que modulan la
expresión de un polipéptido CDCP1 (p. ej. que lo regulan a la baja)
se identifican en un sistema de ensayo basado en células. De acuerdo
con esto, una población de células que expresan un polipéptido o
ácido nucleico CDCP1 se pone en contacto con un agente candidato, y
se determina la capacidad del agente candidato para alterar la
expresión del polipéptido o ácido nucleico CDCP1 mediante una
comparación con un intervalo de referencia o control. En otra
realización, una primera y una segunda población de células que
expresan un polipéptido CDCP1 se ponen en contacto con un agente
candidato o un agente control, y se determina la capacidad del
agente candidato para alterar la expresión del polipéptido o ácido
nucleico CDCP1 comparando la diferencia en el nivel de expresión
del polipéptido o ácido nucleico CDCP1 entre la primera y la
segunda población de células. En una realización más, la expresión
del polipéptido o ácido nucleico CDCP1 en la primera población
puede compararse además con un intervalo de referencia o control. Si
se desea, este ensayo puede usarse para cribar una pluralidad (por
ejemplo, una biblioteca) de agentes candidatos. La célula puede
ser, por ejemplo, de origen procariota (p. ej. E. coli) o de
origen eucariota (p. ej. levadura o mamífero). Además, las células
pueden expresar un polipéptido o ácido nucleico CDCP1 endógenamente
o pueden modificarse por ingeniería genética para expresar un
polipéptido o ácido nucleico CDCP1. La capacidad de los agentes
candidatos para alterar la expresión de un polipéptido o ácido
nucleico CDCP1 puede determinarse por métodos conocidos por los
expertos en la técnica, por ejemplo, y sin limitación, por
citometría de flujo, radiomarcaje, un ensayo de centelleo,
inmunoprecipitación, análisis de transferencia Western o análisis de
transferencia Northern.
Los agentes que modulan la expresión de un
polipéptido o ácido nucleico CDCP1 pueden identificarse en un modelo
animal. Los ejemplos de animales adecuados incluyen, pero no se
limitan a ratones, ratas, conejos, monos, cobayas, perros y gatos.
Preferiblemente, el animal usado representa un modelo de cáncer de
ovario. De acuerdo con esto, se administra a un primer y segundo
grupo de mamíferos un agente candidato o un agente control y se
determina la capacidad del agente candidato para modular la
expresión del polipéptido o ácido nucleico CDCP1 comparando la
diferencia en el nivel de expresión entre el primer y segundo grupo
de mamíferos. Cuando se desee, los niveles de expresión de los
polipéptidos o ácidos nucleicos CDCP1 en el primer y segundo grupo
de mamíferos pueden compararse con el nivel del polipéptido o ácido
nucleico CDCP1 en un grupo control de mamíferos. El agente
candidato o un agente control pueden administrarse a través de
medios conocidos en la técnica (por ejemplo, por vía oral, rectal o
parenteral, tal como por vía intraperitoneal o intravenosa). Los
cambios en la expresión de un polipéptido o ácido nucleico pueden
evaluarse mediante los métodos indicados anteriormente. En una
realización particular, una cantidad terapéuticamente eficaz de un
agente puede determinarse monitorizando una mejora o mejoría en los
síntomas de la enfermedad, para retrasar la aparición o detener la
progresión de la enfermedad, por ejemplo pero sin limitación, una
reducción del tamaño del tumor. Pueden utilizarse técnicas
conocidas por los médicos familiarizados con el cáncer de ovario
para determinar si un agente candidato ha alterado uno o más
síntomas asociados con la enfermedad.
Como se discute en la presente memoria, los
agentes que interaccionan con un polipéptido CDCP1 encuentran uso
en el tratamiento y/o profilaxis del cáncer de ovario. Para este
uso, los agentes se administrarán, en general, en forma de una
composición farmacéutica.
Así, según la invención se proporciona una
composición farmacéutica que comprende un agente que interacciona
con un polipéptido CDCP1 y un diluyente, excipiente y/o vehículo
farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas
también pueden encontrar uso como una vacuna y pueden comprender
componentes adicionales aceptables para uso en vacunas y pueden
comprender adicionalmente uno o más adyuvantes adecuados como
conocen los expertos en la técnica.
Más adelante, determinados agentes para usarse
en la invención, polipéptidos CDCP1 para usarse en el tratamiento
y/o profilaxis se refieren como "agentes activos". Cuando en la
presente memoria se hace referencia a un método para tratar o
prevenir una enfermedad o condición usando un agente activo concreto
o una combinación de agentes, se entenderá que dicha referencia
pretende incluir el uso de este agente activo o combinación de
agentes en la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o
profilaxis de la enfermedad o condición.
La composición se suministra habitualmente como
parte de una composición farmacéutica estéril que normalmente
incluye un vehículo farmacéuticamente aceptable. Esta composición
puede estar en cualquier forma adecuada (dependiendo del método
deseado de administración a un paciente).
Los agentes activos de la invención pueden
administrarse a un sujeto por cualquiera de las rutas usadas
convencionalmente para la administración de fármacos, por ejemplo,
se pueden administrar por vía parenteral, oral, tópica (incluyendo
bucal, sublingual o transdérmica) o por inhalación. La vía más
adecuada para la administración en cualquier caso concreto
dependerá del agente activo particular, el sujeto, y la naturaleza y
gravedad de la enfermedad y la condición física del sujeto.
Los agentes activos pueden administrarse en
combinación, p. ej., de manera simultánea, secuencial o separada,
con uno o más compuestos adicionales terapéuticamente activos, p.
ej. anti-tumorales.
Las composiciones farmacéuticas pueden
presentarse, de modo conveniente, en formas de dosificación
unitarias que contengan una cantidad predeterminada de un agente
activo de la invención por dosis. Esta unidad puede contener, por
ejemplo, pero sin limitación, de 750 mg/kg a 0,1 mg/kg dependiendo
de la condición que se va a tratar, la vía de administración, y la
edad, peso y condición del sujeto.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables para
su uso en la invención pueden adoptar una amplia variedad de formas
dependiendo, por ejemplo, de la vía de administración.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para
la administración parenteral pueden prepararse como disoluciones o
suspensiones de los agentes activos de la invención en agua, de
forma adecuada mezclada con un tensioactivo, tal como
hidroxipropilcelulosa. También se pueden preparar dispersiones en
glicerol, polietilenglicoles líquidos, y mezclas de los mismos en
aceites. Bajo las condiciones normales de almacenamiento y uso,
estas preparaciones contienen un conservante para impedir el
crecimiento de microorganismos.
Las formas farmacéuticas adecuadas para el uso
inyectable incluyen disoluciones estériles acuosas y no acuosas
para inyección, que pueden contener antioxidantes, tampones,
bacteriostáticos y solutos que hacen a la composición isotónica con
la sangre del receptor destinado, y suspensiones estériles acuosas y
no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes
espesantes. Se pueden preparar disoluciones, dispersiones y
suspensiones extemporáneas para inyección a partir de polvos,
gránulos y comprimidos estériles.
Las composiciones farmacéuticas pueden
administrarse con dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por
ejemplo, en una realización preferida, una composición farmacéutica
de la invención puede administrarse con un dispositivo de inyección
hipodérmica sin agujas, tales como los dispositivos descritos en US
5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824; ó
4.596.556. Los ejemplos de implantes y módulos muy conocidos útiles
en la presente invención incluyen: US 4.487.603, que describe una
bomba de microinfusión implantable para dispensar una medicación a
una velocidad controlada; US 4.486.194, que describe un dispositivo
terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; US
4.447.233, que describe una bomba de infusión de medicación para
administrar medicación a una velocidad de infusión precisa; US
4.447.224, que describe un aparato de infusión implantable de flujo
variable para una administración continua del fármaco; US 4.439.196,
que describe un sistema de administración osmótico de un fármaco
que tiene compartimentos de múltiples cámaras; y US 4.475.196, que
describe un sistema de administración osmótico de un fármaco. Los
expertos en la técnica conocen muchos otros de estos implantes,
sistemas de administración y módulos.
En determinadas realizaciones, las composiciones
farmacéuticas de la invención pueden formularse para asegurar una
administración apropiada in vivo. Por ejemplo, la barrera
hematoencefálica excluye muchos compuestos altamente hidrofílicos y
puede ser preferible administrar las composiciones farmacéuticas en
liposomas. Así, en una realización de la invención los agentes
activos de la invención se formulan en liposomas; en una realización
más preferida, los liposomas incluyen un resto de direccionamiento.
En una realización más preferida, los compuestos terapéuticos en
liposomas se administran por inyección en bolo a un sitio próximo al
tumor. Para métodos de fabricar liposomas véanse, p. ej. US
4.522.811; 5.374.548; y 5.399.331. Los liposomas pueden comprender
uno o más restos que se transportan selectivamente a células u
órganos específicos, incrementando así la administración dirigida
del fármaco (véase, p. ej. Ranade, VV. 1989, J. Clin. Pharmacol.
29:685). Los restos de direccionamiento ejemplares incluyen folato
o biotina (véase p. ej. la Patente U.S. 5.416.016.); manósidos
(Umezawa et al., 1988, Biochem. Biophys. Res. Commun.
153:1038); anticuerpos (Bloeman, PG. et al., 1995, FEBS Lett.
357:140; M. Owais et al., 1995, Antimicrob. Agents
Chemother. 39:180); receptor de la proteína A tensioactivo (Briscoe
et al., 1995, Am. J. Physiol. 1233:134), diferentes especies
de los cuales pueden comprender las formulaciones de las
invenciones, así como componentes de las moléculas inventadas; p120
(Schreier et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:9090); véanse
también Keinanen, K. & Laukkanen, ML. 1994, FEBS Lett. 346:123;
Killion, JJ. & Fidler, IJ. 1994, Immunomethods 4:273. Las
composiciones se pueden presentar en recipientes de dosis unitaria o
de dosis múltiple, por ejemplo en ampollas y viales sellados y,
para mejorar la estabilidad, se pueden almacenar en un estado
secado por congelación (liofilizado) que requiere sólo la adición
del vehículo líquido estéril, por ejemplo agua para inyecciones,
inmediatamente antes de su uso. El vehículo líquido estéril se puede
suministrar en un vial o ampolla independiente, y puede ser un
disolvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo,
agua, etanol, poliol (p.ej. glicerol, propilenglicol y
polietilenglicol líquido), mezclas adecuadas de los mismos, y
aceites vegetales. Ventajosamente, en el vehículo líquido estéril se
pueden incluir agentes tales como un anestésico local, agentes
conservantes y tampones.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para
la administración tópica se pueden formular como pomadas, cremas,
suspensiones, lociones, polvos, disoluciones, pastas, geles, vendas
impregnadas, pulverizadores, aerosoles o aceites, dispositivos
transdérmicos, polvos para empolvar y similares. Estas composiciones
pueden prepararse mediante métodos convencionales que contengan el
agente activo. Por tanto, también pueden comprender vehículos y
aditivos convencionales compatibles, tales como conservantes,
disolventes para ayudar a la penetración del fármaco, emolientes en
cremas o pomadas, y etanol o alcohol oleílico para lociones. Tales
vehículos pueden estar presentes de aproximadamente 1% a
aproximadamente 98% de la composición. De forma más habitual,
formarán hasta aproximadamente 80% de la composición. Sólo como
ilustración, una crema o pomada se prepara mezclando cantidades
suficientes de un material hidrófilo y agua, conteniendo entre
aproximadamente 5-10% en peso del compuesto, en
cantidades suficientes para producir una crema o pomada que tenga la
consistencia deseada.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para
la administración transdérmica se pueden presentar como parches
discretos destinados a permanecer en íntimo contacto con la
epidermis del receptor durante un periodo de tiempo prolongado. Por
ejemplo, el agente activo puede administrarse desde el parche
mediante iontoforesis.
Para aplicaciones a tejidos externos, por
ejemplo la boca y la piel, las composiciones se aplican
preferiblemente como una pomada o crema tópica. Cuando se formula
en una pomada, el agente activo puede emplearse con una base de
pomada parafínica o miscible en agua. Alternativamente, el agente
activo puede formularse en una crema con una base de crema de
aceite en agua o una base de agua en aceite.
La dosificación de un agente activo que se va a
administrar variará según el agente activo concreto, el sujeto, y
la naturaleza y gravedad de la enfermedad y la condición física del
sujeto, y la vía de administración seleccionada; un experto en la
técnica puede determinar con facilidad la dosificación apropiada.
Para el tratamiento y/o la profilaxis del cáncer de ovario en seres
humanos y animales, pueden administrarse a los pacientes (por
ejemplo, sujetos humanos) composiciones farmacéuticas que comprendan
anticuerpos a unas dosificaciones terapéutica o profilácticamente
eficaces (p. ej. unas dosificaciones que den como resultado la
inhibición del crecimiento de un tumor y/o la inhibición de la
migración de la célula tumoral) usando cualquier vía de
administración apropiada, tal como una inyección y otras vías de
administración conocidas en la técnica para los productos clínicos
basados en anticuerpos.
Las composiciones pueden contener de 0,1% en
peso, preferiblemente de 10-60% o más en peso, del
agente activo de la invención, dependiendo del método de
administración.
Un experto en la técnica reconocerá que la
cantidad óptima y la distribución de las dosificaciones individuales
de un agente activo de la invención serán determinadas por la
naturaleza y grado de la condición que se va a tratar, la forma,
vía y sitio de la administración, y la edad y condición del sujeto
particular que se está tratando y que, en último término, será un
médico quien determine las dosificaciones apropiadas que deben
usarse. Esta dosificación puede repetirse tan a menudo como se
considere apropiado. Si se producen efectos secundarios, la
cantidad y/o frecuencia de la dosificación puede alterarse o
reducirse, según la práctica clínica normal.
Los polipéptidos CDCP1 también pueden usarse en
el tratamiento y/o profilaxis del cáncer de ovario. De acuerdo con
esto, se proporciona un método para el tratamiento y/o profilaxis
del cáncer de ovario que comprende administrar una cantidad
terapéuticamente eficaz de una composición que comprende un
polipéptido CDCP1, preferiblemente como una vacuna. También se
proporciona el uso de un polipéptido CDCP1 para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento y/o profilaxis del cáncer de
ovario. Cuando se proporcionan para usarse con los métodos de la
invención, CDCP1 se proporcionan preferiblemente en forma aislada.
Más preferiblemente, los polipéptidos CDCP1 se han purificado al
menos hasta algún grado. Los polipéptidos CDCP1 también pueden
producirse usando métodos recombinantes, se producen sintéticamente
o se producen por una combinación de estos métodos. Los
polipéptidos CDCP1 pueden proporcionarse en forma sustancialmente
pura, es decir hasta un grado sustancial, sin otras proteínas.
Los polipéptidos CDCP1 recombinantes pueden
prepararse por procesos muy conocidos en la técnica a partir de
células anfitrionas modificadas por ingeniería genética que
comprenden sistemas de expresión. De acuerdo con esto, la presente
invención también se refiere a sistemas de expresión que comprenden
un polipéptido CDCP1 o ácido nucleico CDCP1, a células anfitrionas
que están modificadas por ingeniería genética con dichos sistemas
de expresión y a la producción de polipéptidos CDCP1 por técnicas
recombinantes. Los sistemas de traducción sin células también
pueden emplearse para producir polipéptidos recombinantes (p. ej.
lisado de reticulocitos de conejo, lisado de germen de trigo,
SP6/T7 in vitro T&T y RTS 100 E. Coli HY kits de
transcripción y traducción de Roche Diagnostics Ltd., Lewes, UK y
el Sistema acoplado Transcripción/Traducción TNT Quick de Promega
UK, Southampton, UK.
Para la producción del polipéptido CDCP1
recombinante, las células anfitrionas pueden modificarse por
ingeniería genética para incorporar sistemas de expresión o partes
de estos para los ácidos nucleicos CDCP1. Dicha incorporación puede
realizarse usando métodos muy conocidos en la técnica, tales como,
transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por
DEAD-dextrano, transvección, microinyección,
transfección catiónica mediada por lípidos, electroporación,
transducción, carga de raspaduras, introducción o infección
balística (véanse p. ej. Davis et al., Basic Methods in
Molecular Biology, 1986 y Sambrook et al., Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbour laboratory Press,
Cold Spring Harbour, NY, 1989).
Los ejemplos representativos de células
anfitrionas incluyen células bacterianas p. ej. células de E.
Coli, Streptococci, Staphylococci, Streptomyces y Bacillus
subtilis; células fúngicas, tales como células de levadura y
células de Aspergillus; células de insecto tales como células
de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células de
animales tales como células CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, HEK 293, BHK
y melanoma de Bowes; y células de plantas.
Puede usarse una amplia variedad de sistemas de
expresión, tales como y sin limitación, sistemas cromosómicos,
episomales y derivados de virus, p. ej. vectores derivados de
plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de transposones, de
episomas de levaduras, de elementos de inserción, de elementos
cromosómicos de levaduras, de virus tal como baculovirus, virus
papova tal como SV40, virus vaccinia, adenovirus, virus de la peste
aviar, virus de la pseudorabia y retrovirus, y vectores derivados
de combinaciones de estos, tales como los derivados de elementos
genéticos de plásmidos y bacteriófagos, tales como cósmidos y
fagémidos. Los sistemas de expresión pueden contener regiones de
control que regulan así como suscitan la expresión. Generalmente,
puede usarse cualquier sistema o vector que es capaz de mantener,
propagar o expresar un ácido nucleico para producir un polipéptido
en un anfitrión. La secuencia de ácido nucleico apropiada puede
insertarse en un sistema de expresión por cualquier variedad de
técnicas muy conocidas y rutinarias, tales como las mostradas en
Sambrook et al., supra. Las señales de secreción apropiadas
pueden incorporarse en el polipéptido CDCP1 para permitir la
secreción de la proteína traducida en el lumen del retículo
endoplásmico, el espacio periplásmico o el entorno extracelular.
Estas señales pueden ser endógenas al polipéptido CDCP1 o pueden ser
señales heterólogas.
Si se quiere expresar un polipéptido CDCP1 para
usarse en ensayos de cribado basados en células, se prefiere que el
polipéptido se produzca en la superficie celular. En este evento,
las células pueden recogerse antes de usarse en el ensayo de
cribado. Si el polipéptido CDCP1 se secreta en el medio, el medio
puede recuperarse con el fin de aislar dicho polipéptido. Si se
produce intracelularmente, las células deben lisarse en primer
lugar antes de que se recupere el polipéptido CDCP1.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Los polipéptidos CDCP1 pueden recuperarse y
purificarse a partir de cultivos celulares recombinantes o a partir
de otras fuentes biológicas por métodos muy conocidos incluyendo,
precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción ácida,
cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de
fosfocelulosa, cromatografía de afinidad, cromatografía de
interacción hidrofóbica, cromatografía de hidroxilapatito,
cromatografía de tamiz molecular, métodos de centrifugación,
métodos de electroforesis y cromatografía de lectina. En una
realización, se usa una combinación de estos métodos. En otra
realización, se usa cromatografía líquida de alto rendimiento. En
una realización adicional, puede usarse un anticuerpo que se una
específicamente a un polipéptido CDCP1 para mermar una muestra que
comprende un polipéptido CDCP1 de dicho polipéptido o para purificar
dicho polipéptido. Pueden usarse técnicas muy conocidas en la
técnica para replegamiento para regenerar las conformaciones nativas
o activas de los polipéptidos CDCP1 cuando los polipéptidos se han
desnaturalizado durante el aislamiento y/o purificación. En el
contexto de la presente invención, los polipéptidos CDCP1 pueden
obtenerse a partir de una muestra biológica de cualquier fuente,
tal como y sin limitación, una muestra de tejido de ovario u otra
muestra de tejido.
Los polipéptidos CDCP1 pueden estar en la forma
de una proteína "madura" o pueden ser parte de una proteína
mayor tal como una proteína de fusión. A menudo es ventajoso incluir
una secuencia adicional de aminoácidos que contiene secuencias
secretoras o líder, una secuencia de pre-, pro- o
prepro-proteína, o una secuencia que ayude en la
purificación tal como una etiqueta de afinidad, por ejemplo, pero
sin limitación, restos múltiples de histidina, una etiqueta FLAG,
etiqueta HA o etiqueta myc. También puede usarse una secuencia
adicional que puede proporcionar estabilidad durante la producción
recombinante. Dichas secuencias pueden eliminarse opcionalmente
según se requiera mediante la incorporación de una secuencia
escindible como una secuencia adicional o una parte de ésta. Así,
un polipéptido CDCP1 puede fusionarse a otros restos incluyendo
otros polipéptidos. Dichas secuencias adicionales y etiquetas de
afinidad son muy conocidas en la técnica.
Las sustituciones de aminoácidos pueden ser
conservativas o semi-conservativas como se conoce en
la técnica y preferiblemente no afectan significativamente la
actividad deseada del polipéptido. Las sustituciones pueden ser
naturales o pueden introducirse por ejemplo usando mutagénesis (p.
ej. Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551). Así,
los aminoácidos glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina
pueden sustituirse a menudo unos con otros (aminoácidos que tienen
cadenas laterales alifáticas). De estas sustituciones posibles, se
prefiere que la glicina y la alanina se usen para sustituirse una
por la otra (ya que tienen cadenas laterales relativamente cortas)
y que valina, leucina e isoleucina se usen para sustituirse una por
la otra (ya que tienen cadenas laterales alifáticas mayores que son
hidrofóbicas). Otros aminoácidos que pueden sustituirse a menudo
uno por otro incluyen pero no se limitan a:
- \bullet
- fenilalanina, tirosina y triptófano (aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas);
- \bullet
- lisina, arginina e histidina (aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas);
- \bullet
- aspartato y glutamato (aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas);
- \bullet
- asparagina y glutamina (aminoácidos que tienen cadenas laterales amida);
- \bullet
- cisteína y metionina (aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre); y
- \bullet
- ácido aspártico y ácido glutámico pueden sustituirse por fosfo-serina y fosfo-treonina, respectivamente (aminoácidos con cadenas laterales ácidas).
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización particular, el o los
aminoácidos sustituidos no afectan significativamente la actividad
del polipéptido CDCP1 y pueden seleccionarse específicamente para
dar lugar a una actividad negativa dominante del péptido. En otra
realización, el o los aminoácidos sustituidos pueden seleccionarse
específicamente para dar lugar al polipéptido constitutivamente
activo.
Las modificaciones incluyen modificaciones
naturales tales como y sin limitación, modificaciones posteriores a
la traducción y también modificaciones no naturales tales como las
que pueden introducirse por mutagénesis.
Preferiblemente, un derivado de un polipéptido
CDCP1 tiene al menos 70% de identidad con la secuencia de
aminoácidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO:1), más
preferiblemente tiene al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al
menos 90%, al menos 95% o al menos 98% de identidad. El porcentaje
de identidad es un concepto muy conocido en la técnica y puede
calcularse usando, por ejemplo pero sin limitación, el programa
informático BLAST^{TM} disponible en NCBI (Altschul, S.F. et
al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W.
& States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272.
Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol.
266:131-141; Altschul, S.F. et al., 1997,
Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. &
Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656).
Un fragmento de un polipéptido CDCP1 también
puede usarse en los métodos de la invención e incluye un fragmento
de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID
NO: 1, que tiene al menos 70% de homología sobre la longitud del
fragmento. Preferiblemente, dichos fragmentos tienen una longitud de
al menos 10 aminoácidos, preferiblemente tienen una longitud de al
menos 20, al menos 30, al menos 50 o al menos 100 aminoácidos. Un
fragmento tiene al menos 70% de identidad sobre su longitud respecto
a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO:
1), más preferiblemente tiene al menos 75%, al menos 80%, al menos
85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 98% de identidad.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Cuando un polipéptido CDCP1 es el agente activo
de una composición farmacéutica para usarse en el tratamiento y/o
profilaxis del cáncer de ovario, preferiblemente se usan
polipéptidos CDCP1 recombinantes. En una realización particular, un
polipéptido CDCP1 fusionado con otro polipéptido, tal como el
dominio proteico de transducción de la proteína HIV/Tat que
facilita la entrada de la proteína de fusión en una célula (Asoh, S.
et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
99:17107-17112), se proporciona para usarse en la
fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o profilaxis
del cáncer de ovario.
En otro aspecto, la detección de un polipéptido
CDCP1 en un sujeto con cáncer de ovario puede usarse para
identificar en particular una población de pacientes apropiada para
el tratamiento según los métodos de la invención.
De acuerdo con esto, la presente invención
proporciona un método de cribado y/o diagnóstico o pronóstico del
cáncer de ovario en un sujeto, y/o monitorización de la eficacia de
la terapia del cáncer de ovario, que comprende la etapa de detectar
y/o cuantificar en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto un
polipéptido CDCP1. El polipéptido CDCP1 para usarse en el método de
cribado y/o diagnóstico preferiblemente:
- (a)
- comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1;
- (b)
- es un derivado que tiene una o más sustituciones, modificaciones, deleciones o inserciones de aminoácidos respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 que retiene la actividad de CDCP1; o
- (c)
- es un fragmento de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, que tiene una longitud de al menos diez aminoácidos y tiene al menos 70% de homología sobre la longitud del fragmento.
\vskip1.000000\baselineskip
En un aspecto, la expresión se compara con un
intervalo de referencia previamente determinado. Preferiblemente,
la etapa de detectar comprende:
- (a)
- poner en contacto la muestra con un reactivo de captura que es específico para un polipéptido como se define en (a) a (c), anteriormente; y
- (b)
- detectar si la unión ha ocurrido entre el reactivo de captura y dicho polipéptido en la muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto, el polipéptido capturado se
detecta usando un reactivo de detección marcado directamente o
indirectamente que puede inmovilizarse en una fase sólida.
Un medio conveniente para detectar/cuantificar
un polipéptido CDCP1 implica el uso de anticuerpos. Un polipéptido
CDCP1 puede usarse como un inmunógeno para incitar anticuerpos que
interaccionan con (se unen a o reconocen) dicho polipéptido usando
métodos conocidos en la técnica como se ha descrito anteriormente.
Así, en un aspecto adicional, la presente invención proporciona el
uso de un anticuerpo que se une específicamente al menos a un
polipéptido CDCP1 para el cribado de y/o diagnóstico del cáncer de
ovario en un sujeto o para monitorizar la eficacia de una terapia
anti-cáncer de ovario. En una realización
particular, los métodos de diagnóstico usando un anticuerpo
anti-polipéptido CDCP1 pueden usarse para
identificar una población de pacientes apropiada para tratamiento
según los métodos de la invención.
También pueden usarse anticuerpos frente a
CDCP1, inter alia, para el diagnóstico del cáncer de ovario
detectando la expresión de CDCP1 en una muestra biológica de tejido
humano y/o en subfracciones de éste, por ejemplo pero sin
limitación, subfracciones de membrana, citosólicas o nucleares.
En un aspecto adicional, el método para detectar
un polipéptido CDCP1 en una muestra biológica comprende detectar
y/o cuantificar la cantidad del polipéptido CDCP1 en dicha muestra
usando un reactivo de detección marcado directamente o
indirectamente. Un polipéptido CDCP1 puede detectarse mediante
cualquier inmunoensayo conocido en la técnica, incluyendo, sin
limitación, inmunoprecipitación seguida de electroforesis en gel de
poliacrilamida con dodecil sulfato sódico, electroforesis en gel
bidimensional, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos
usando técnicas tales como transferencias Western,
radioinmunoensayos, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a
enzima), inmunoensayos en "sandwich", ensayos de
inmunoprecipitación, reacciones de precipitina, reacciones de
difusión en gel con precipitina, ensayos de inmunodifusión, ensayos
de aglutinación, ensayos de fijación del complemento, ensayos
inmunoradiométricos, inmunoensayos fluorescentes e inmunoensayos con
proteína A.
La detección de la interacción de un anticuerpo
con un antígeno puede facilitarse acoplando el anticuerpo con una
sustancia detectable por ejemplo, pero sin limitación, una enzima
(tal como peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina,
beta-galactosidasa, acetilcolinesterasa), un grupo
prostético (tal como estreptavidina, avidina, biotina), un material
fluorescente (tal como umbelliferona, fluoresceína, isotiocianato de
fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro
de dansilo, ficoeritirina), un material luminiscente (tal como
luminol), un material bioluminiscente (tal como luciferasa,
luciferina, aequorina), un radionúclido (tal como ^{125}I,
^{131}I, ^{111}In, ^{99}Tc) un metal emisor de positrones o un
ion metálico paramagnético no radiactivo (véase US 4.741.900).
\global\parskip0.900000\baselineskip
La invención también proporciona kits de
diagnóstico, que comprenden un reactivo de captura (p. ej. un
anticuerpo) frente a un polipéptido CDCP1 como se ha definido
anteriormente. Además, dicho kit puede comprender opcionalmente uno
o más de los siguientes:
- (1)
- instrucciones para usar el reactivo de captura para cribado, diagnóstico, pronóstico, monitorización terapéutica o cualquier combinación de estas aplicaciones;
- (2)
- un compañero de unión marcado del reactivo de captura;
- (3)
- una fase sólida (tal como una tira reactiva) en la que se inmoviliza el reactivo de captura; y
- (4)
- una etiqueta o inserto que indica la aprobación reglamentaria para uso en cribado, diagnóstico, pronóstico o terapéutico o cualquier combinación de estos.
\vskip1.000000\baselineskip
Si no se proporciona ningún compañero de unión
marcado del reactivo de captura, el reactivo de captura
anti-polipéptido CDCP1 puede marcarse él mismo con
un marcador detectable, p. ej. un resto quimioluminiscente,
enzimático, fluorescente o radiactivo (véase anteriormente).
También será evidente para el experto en la
técnica que puede usarse la detección y/o cuantificación de un
ácido nucleico CDCP1 en un método de cribado y/o diagnóstico o
pronóstico del cáncer de ovario en un sujeto, y/o monitorización de
la eficacia de la terapia del cáncer de ovario.
A no ser que el contexto indique otra cosa, los
ácidos nucleicos CDCP1 incluyen aquellas moléculas de ácido
nucleico que pueden tener una o más de las características
siguientes y así pueden:
- d)
- comprender o consistir en la secuencia de ADN de SEQ ID NO:2 o su ARN equivalente;
- e)
- tener una secuencia que es complementaria a las secuencias de d);
- f)
- tener una secuencia que codifica un polipéptido CDCP1;
- g)
- tener una secuencia que muestra una identidad sustancial con cualquiera de las de d), e) y f); o
- h)
- es un fragmento de d), e), f) o g), que tiene una longitud de al menos 10 nucleótidos;
\vskip1.000000\baselineskip
y puede tener una o más de las características
siguientes:
- 1)
- pueden ser ADN o ARN;
- 2)
- pueden ser monocatenarios o bicatenarios;
- 3)
- pueden estar en forma sustancialmente pura. Así, pueden proporcionarse en una forma que sustancialmente no contenga proteínas contaminantes y/o otros ácidos nucleicos; y
- 4)
- pueden tener intrones o no tener intrones (p. ej. como ADNc).
\vskip1.000000\baselineskip
Los fragmentos de ácidos nucleicos CDCP1 tienen
una longitud preferiblemente de al menos 20, al menos 30, al menos
50, al menos 100 o al menos 250 nucleótidos.
La invención también proporciona el uso de
ácidos nucleicos que son complementarios a los ácidos nucleicos
CDCP1 descritos en (d)-(h) anteriormente, y pueden hibridar con
dichos ácidos nucleicos CDCP1. Dichas moléculas de ácido nucleico
se refieren como moléculas de ácido nucleico "que hibridan".
Por ejemplo, pero sin limitación, las moléculas de ácido nucleico
que hibridan pueden ser útiles como sondas o cebadores. Las
moléculas de ácido nucleico que hibridan pueden tener un grado de
identidad de secuencia a lo largo de su longitud con una molécula
de ácido nucleico en el alcance de (d)-(h) anterior (p. ej. al menos
50%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al
menos 95%, o al menos 98% de identidad de secuencia). El uso de
moléculas de ácido nucleico que hibridan que pueden hibridar con
cualquiera de las moléculas de ácido nucleico discutidas
anteriormente, p. ej. en ensayos de hibridación, también está
englobado en la presente invención.
Los ensayos de hibridación pueden usarse para
cribado, pronóstico, diagnóstico o monitorización de la terapia del
cáncer de ovario en un sujeto. De acuerdo con esto, dicho ensayo de
hibridación comprende:
- i)
- poner en contacto una muestra biológica, obtenida de un sujeto, que contiene ácido nucleico con una sonda de ácido nucleico capaz de hibridar con una molécula de ácido nucleico CDCP1, bajo condiciones tales que la hibridación pueda ocurrir; y
- ii)
- detectar o medir cualquier hibridación resultante.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Preferiblemente, dichas moléculas que hibridan
tienen una longitud de al menos 10 nucleótidos y tienen
preferiblemente una longitud de al menos 25 o al menos 50
nucleótidos. Más preferiblemente, las moléculas de ácido nucleico
que hibridan, hibridan específicamente con ácidos nucleicos en el
alcance de uno cualquiera de (d) a (h), anterior. Lo más
preferiblemente, la hibridación ocurre bajo condiciones de
hibridación astringentes. Un ejemplo de condiciones de hibridación
astringentes es cuando la hibridación pretendida se realiza a una
temperatura de aproximadamente 35ºC a aproximadamente 65ºC usando
una disolución de sal que es aproximadamente 0,9M. Sin embargo, el
experto en la técnica será capaz de variar dichas condiciones según
sea apropiado con el fin de tener en cuenta variables tales como
longitud de la sonda, composición de bases, tipo de iones presente,
etc.
La invención también proporciona un kit de
diagnóstico que comprende una sonda de ácido nucleico capaz de
hibridar con ARN que codifica un polipéptido CDCP1, reactivos
adecuados e instrucciones de uso.
En una realización adicional, se proporciona un
kit de diagnóstico que comprende en uno más contenedores un par de
cebadores que bajo condiciones de reacción apropiadas puede cebar la
amplificación de al menos una parte de una molécula de ácido
nucleico CDCP1, tal como por reacción en cadena de la polimerasa
(véase p. ej. Innis et al., 1990, PCR Protocols, Academic
Press, Inc., San Diego, CA), reacción en cadena de la ligasa (véase
EP 320.308) uso de replicasa Q\beta, reacción de sonda cíclica, u
otros métodos conocidos en la técnica. Típicamente, los cebadores
tienen una longitud de al menos ocho nucleótidos y tendrán
preferiblemente una longitud de al menos diez a veinticinco
nucleótidos y más preferiblemente una longitud de quince a
veinticinco nucleótidos. En algunos casos, pueden usarse cebadores
con una longitud de al menos treinta o al menos treinta y cinco
nucleótidos.
Los ácidos nucleicos CDCP1 pueden obtenerse
usando técnicas de clonación y cribado estándar, a partir de una
biblioteca de ADNc derivada de ARNm en células humanas, usando
análisis de etiqueta de secuencia expresada (EST) (Adams, M. et
al., 1991, Science, 252:1651-1656; Adams, M.
et al., 1992, Nature 355:632-634; Adams, M.
et al., 1995, Nature, 377:Supl: 3-174). Los
ácidos nucleicos CDCP1 también pueden obtenerse a partir de fuentes
naturales tales como bibliotecas de ADN genómico o pueden
sintetizarse usando técnicas muy conocidas y disponibles
comercialmente. Los ácidos nucleicos CDCP1 que comprenden secuencias
codificadoras de los polipéptidos CDCP1 descritos anteriormente
pueden usarse para la producción recombinante de dichos
polipéptidos. Los ácidos nucleicos CDCP1 pueden incluir la
secuencia codificadora del polipéptido maduro, por sí mismos; o la
secuencia codificadora del polipéptido maduro en marco de lectura
con otras secuencias codificadoras, tales como las que codifican
una secuencia líder o secretora, una secuencia de pre-, pro- o
prepro-proteína, una secuencia escindible u otras
partes de péptido de fusión, tales como una etiqueta de afinidad o
una secuencia adicional que confiere estabilidad durante la
producción del polipéptido. Las etiquetas de afinidad preferidas
incluyen múltiples restos de histidina (por ejemplo véase Gentz
et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci USA
86:821-824), una etiqueta FLAG, etiqueta HA o
etiqueta myc. Los ácidos nucleicos CDCP1 también pueden contener
secuencias no codificadoras en 5' y 3', tales como secuencias
transcritas no traducidas, señales de corte y empalme y de
poliadenilación, sitios de unión a ribosomas y secuencias que
estabilizan el ARNm.
Los derivados del polipéptido CDCP1 anteriores
pueden crearse introduciendo una o más sustituciones, adiciones o
deleciones de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos de un ácido
nucleico CDCP1 de manera que se introducen una o más sustituciones,
adiciones o deleciones de aminoácidos en la proteína codificada.
Pueden emplearse técnicas convencionales, conocidas por los
expertos en la técnica, para introducir mutaciones, incluyendo, por
ejemplo, mutagénesis dirigida específica de sitio y mutagénesis
mediada por PCR. Preferiblemente, se hacen sustituciones
conservativas de aminoácidos en uno o más restos predichos de
aminoácidos no esenciales.
Un ácido nucleico CDCP1 que codifica un
polipéptido CDCP1, incluyendo homólogos y ortólogos de especies
distintas de la humana, pueden obtenerse por un proceso que
comprende las etapas de cribado de una biblioteca apropiada bajo
condiciones de hibridación astringentes con una sonda marcada que
tiene la secuencia de un ácido nucleico CDCP1 como se ha descrito
en (d)-(h) anteriormente, y aislamiento de clones de ADNc de
longitud completa y genómico, que contienen dicha secuencia de
ácido nucleico. Dichas técnicas de hibridación son muy conocidas en
la técnica. Un ejemplo de condiciones de hibridación astringentes es
cuando la hibridación pretendida se realiza a una temperatura de
aproximadamente 35ºC a aproximadamente 65ºC usando una disolución de
sal de aproximadamente 0,9M. Sin embargo, el experto en la técnica
será capaz de variar dichas condiciones según sea apropiado con el
fin de tener en cuenta variables tales como longitud de la sonda,
composición de bases, tipo de iones presente, etc. Para un alto
grado de selectividad, se usan condiciones relativamente
astringentes tales como condiciones de baja sal o alta temperatura,
para formar los dúplex. Las condiciones altamente astringentes
incluyen hibridación a ADN unido a filtro en 0,5M NaHPO_{4}, 7%
dodecil sulfato de sodio (SDS), 1 mM EDTA a 65ºC, y lavado en
0,1xSSC/0,1% SDS a 68ºC (Ausubel F.M. et al., eds., 1989,
Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing
Associates, Inc., y John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, en p.
2.10.3). Para algunas aplicaciones, se requieren condiciones menos
astringentes para la formación de dúplex. Las condiciones
moderadamente astringentes incluyen lavado en 0,2xSSC/0,1% SDS a
42ºC (Ausubel et al., 1989, supra). Las condiciones de
hibridación también pueden hacerse más astringentes por la adición
de cantidades crecientes de formamida, para desestabilizar el
dúplex híbrido. Así, las condiciones de hibridación particulares
pueden manipularse fácilmente y se elegirán generalmente según sea
apropiado. En general, las temperaturas de hibridación convenientes
en presencia de 50% formamida son: 42ºC para una sonda que es
95-100% idéntica al fragmento de un gen que codifica
un polipéptido según se define en la presente memoria, 37ºC para
90-95% de identidad y 32ºC para
70-90% de
identidad.
identidad.
Un experto en la técnica entenderá que, en
muchos casos, una secuencia de ADNc aislada estará incompleta, ya
que la región que codifica el polipéptido es más corta en el extremo
5' del ADNc. Esto es consecuencia de la transcriptasa inversa, una
enzima con una capacidad de procesamiento baja inherente (una medida
de la capacidad de la enzima para permanecer unida al molde durante
la reacción de polimerización), incapaz de completar una copia del
ADN del molde de ARNm durante la síntesis de la 1^{a} cadena del
ADNc.
Los métodos para obtener ADNc de longitud
completa o para extender ADNc cortos son muy conocidos en la
técnica, por ejemplo RACE (Amplificación rápida de extremos de
ADNc; p. ej. Frohman et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci USA
85:8998-9002). Las modificaciones recientes de la
técnica, ejemplificadas por la tecnología Marathon^{TM} (Clontech
Laboratories Inc.) han simplificado significativamente la búsqueda
de ADNc mayores. Esta tecnología usa ADNc preparados a partir de
ARNm extraído de un tejido elegido seguido de la ligación de una
secuencia adaptadora en cada extremo. Se realiza PCR para
amplificar el extremo 5' ausente del ADNc usando una combinación de
cebadores oligonucleotídicos específicos de genes y específicos de
adaptador. La reacción de PCR se repite usando cebadores anidados
que se han diseñado para hibridar con el producto amplificado,
típicamente un cebador específico de adaptador que hibrida además
3' en la secuencia adaptadora y un cebador específico de gen que
hibrida además 5' en la secuencia génica conocida. Los productos de
esta reacción pueden analizarse por secuenciación de ADN y
construirse un ADNc de longitud completa uniendo el producto
directamente al ADNc existente para proporcionar una secuencia
completa o realizando una PCR separada de longitud completa usando
la información de la secuencia nueva para el diseño del cebador
5'.
Un aspecto adicional de la invención se refiere
a una composición de vacuna para usarse en el tratamiento y/o
profilaxis del cáncer de ovario. Un polipéptido o ácido nucleico
CDCP1 como se ha descrito anteriormente puede usarse en la
producción de vacunas para el tratamiento y/o profilaxis del cáncer
de ovario. Dicho material puede ser antigénico y/o inmunogénico.
Antigénico incluye una proteína o ácido nucleico que puede usarse
para incitar anticuerpos o que además puede inducir una respuesta
de anticuerpos en un sujeto. El material inmunogénico incluye una
proteína o ácido nucleico que puede incitar una respuesta inmune en
un sujeto. Así, en el último caso, la proteína o ácido nucleico
puede ser capaz no sólo de generar una respuesta de anticuerpo sino
además respuestas inmunes no basadas en anticuerpos, es decir, una
respuesta celular o humoral. Es muy conocido en la técnica que es
posible identificar aquellas regiones de un polipéptido antigénico o
inmunogénico que son responsables de la antigenicidad o
inmunogenicidad de dicho polipéptido, es decir, un epítopo o
epítopos. Las características de aminoácidos y péptidos muy
conocidas para el experto en la técnica pueden usarse para predecir
el índice antigénico (una medida de la probabilidad de que una
región sea antigénica) de un polipéptido CDCP1. Por ejemplo, pero
sin limitación, pueden usarse el programa "Peptidestructure"
(Jameson y Wolf, 1988, CABIOS, 4(1):181) y una técnica
referida como "Threading" (Altuvia Y. et al., 1995, J.
Mol. Biol. 249:244). Así, los polipéptidos CDCP1 pueden incluir uno
o más de dichos epítopos o ser suficientemente similares a dichas
regiones de manera que retienen sus propiedades
antigénicas/inmunogénicas.
Como un polipéptido o un ácido nucleico puede
degradarse en el estómago, la composición de vacuna se administra
preferiblemente por vía parenteral (p. ej. inyección subcutánea,
intramuscular, intravenosa o intradérmica).
De acuerdo con esto, en realizaciones
adicionales, la presente invención proporciona:
- a)
- el uso de dicha vacuna para inducir una respuesta inmune en un sujeto; y
- b)
- un método para el tratamiento y/o profilaxis del cáncer de ovario en un sujeto, o para vacunar a un sujeto frente al cáncer de ovario que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de un polipéptido o ácido nucleico CDCP1, preferiblemente como una vacuna.
\vskip1.000000\baselineskip
Las características preferidas de cada
realización de la invención son como para cada una de las demás
realizaciones mutatis mutandis. Todas las publicaciones,
incluyendo, pero sin estar limitadas a, las patentes y solicitudes
de patente citadas en esta especificación se incorporan en la
presente memoria por referencia como si cada publicación individual
estuviera específica e individualmente indicada para ser incorporada
por referencia en la presente memoria como si estuviera expuesta en
su totalidad.
La invención se describirá a continuación
haciendo referencia a los siguientes ejemplos, que son meramente
ilustrativos y no deberían considerarse de ninguna manera que
limitan el alcance de la presente invención.
Figura 1: muestra la secuencia de aminoácidos
(SEQ ID NO:1) de un polipéptido CDCP1. Los espectros de masa en
tándem están en negrita, las equivalencias de masa en negrita y
subrayadas.
Figura 2: muestra una secuencia de ácido
nucleico (SEQ ID NO:2) que codifica un polipéptido CDCP1.
Figura 3: muestra la distribución tisular del
ARNm CDCP1. Los niveles de ARNm en tejidos normales y líneas
celulares y tejidos de carcinoma de ovario se cuantificaron por
RT-PCR en tiempo real. Los niveles de ARNm se
expresan como el número de copias ng^{-1} de ADNc. Las muestras
CI06829T, CI06326T, CU01081T, CU06481T, CI00069T y CI05532T son
muestras de adenocarcinoma de ovario. Las muestras CI214T, CU9398T y
CI6902T se obtienen de osteosarcoma. OV 90, SK OV3 y TOV 112D son
líneas celulares de adenocarcinoma de ovario humano.
\vskip1.000000\baselineskip
Las proteínas en las membranas de las líneas
celulares derivadas de tumor se separaron por
SDS-PAGE y se analizaron.
Células de próstata humana, de adenocarcinoma
colorectal (células HCT-15, HT-29,
LoVo, LS 174T, SW620 y SW948), de mama, de hígado, pancreáticas y
de riñón (células 293, una línea celular de riñón embrionaria
transformada con ADN de adenovirus; células 786-O
& ACHN, adenocarcinomas renales; células A-498
& A-704, carcinomas renales; células
Caki-2, un carcinoma renal de células claras, y
células SW839, un adenocarcinoma renal de células claras) se
crecieron a 37ºC en una atmósfera humidificada de 95% aire y 5%
dióxido de carbono.
Las preparaciones de membrana purificadas se
aislaron a partir de líneas celulares. Las células adherentes (2 x
10^{8}) se lavaron tres veces con PBS y se despegaron usando un
raspador celular de plástico. Las células se centrifugaron a 1.000
x g durante 5 min a 4ºC y el sedimento celular se resuspendió en
tampón de homogeneización (250 mM Sacarosa, 10 mM HEPES, 1 mM EDTA,
1 mM Vanadato y 0,02% azida, inhibidores de proteasas). Las células
se fraccionaron usando un homogeneizador de bolas (bola de 8,002 mm,
equipo HGM Lab) hasta que se rompió aproximadamente el 95% de las
células. Las membranas se fraccionaron usando el método descrito por
Pasquali et al (Pasquali C. et al., 1999 J.
Chromatography 722: p 89-102). Las células
fraccionadas se centrifugaron a 3.000 x g durante 10 min a 4ºC y el
sobrenadante postnuclear se puso en una capa en un cojín de 60%
sacarosa y se centrifugó a 100.000 x g durante 45 min. Las
membranas se recogieron usando una pipeta pasteur y se pusieron en
capa en un gradiente preformado de 15 a 60% sacarosa y se
centrifugaron a 100.000 x g durante 17 hrs. Las proteínas del
gradiente de sacarosa fraccionado se corrieron en un gel
4-20% 1D (Novex) y se sometieron a transferencia
western; aquellas fracciones que contienen inmunoreactividad de
fosfatasa alcalina y transferrina pero no inmunoreactividad de
oxidoreductasa II o calnexina se juntaron y representaron la
fracción de membrana plasmática.
Las fracciones de membrana plasmática que tenían
inmunoreactividad de transferrina pero no inmunoreactividad de
oxidoreductasa II o calnexina se identificaron y se juntaron. Este
conjunto que representaba la fracción de membrana plasmática se
diluyó al menos cuatro veces con 10 mM HEPES, 1 mM EDTA 1 mM
Vanadato, 0,02% Azida y se añadió a un tubo SW40 o SW60 y se
centrifugó a 100.000 x g durante 45min con una aceleración y
desaceleración lentas. El sobrenadante se eliminó del sedimento de
membrana resultante y el sedimento se lavó tres veces con
PBS-CM. El sedimento de membrana se solubilizó en 2%
SDS en 63 mM TrisHCl, pH 7,4. Se realizó un ensayo de proteínas
seguido de la adición de mercaptoetanol (2% final), glicerol (10%) y
se añadió azul de bromofenol (0,0025% final). Se usó una
concentración final de proteínas de 1 microgramo/microlitro para la
carga del gel 1D.
Los sedimentos de proteína o membrana se
solubilizaron en tampón de muestra 1D (aproximadamente 1mg/ml) y la
mezcla se calentó a 95ºC durante 5 min.
Las muestras se separaron usando electroforesis
en gel 1D en geles precargados con un gradiente
8-16% adquiridos en Bio-Rad
(Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, UK). Se
aplicó una muestra que contiene 30-50 microgramos
de las mezclas de proteínas obtenidas de un extracto de detergente a
los pocillos del gel de carga usando una
micro-pipeta. Se incluyó un pocillo que contiene
marcadores de peso molecular (10, 15, 25, 37, 50, 75, 100, 150 y
250 kDa) para la calibración por interpolación del gel de separación
después de visualización. La separación de las proteínas se realizó
aplicando una corriente de 30mA al gel durante aproximadamente 5 hrs
o hasta que el marcador de tinción azul de bromofenol alcanzó la
parte inferior del gel.
Después de la electroforesis, las placas del gel
se abrieron haciendo palanca, el gel se puso en una bandeja de
fijador (10% ácido acético, 40% etanol, 50% agua) y se agitaron toda
la noche. El gel se cebó durante 30 minutos por agitación en una
disolución de cebador (7,5% ácido acético, 0,05% SDS en agua
Milli-Q) seguido de incubación con un marcador
fluorescente (0,06% marcador OGS en 7,5% ácido acético) con
agitación durante 3 hrs. Un marcador fluorescente preferido se
describe en la Patente US No. 6.335.446. Sypro Red (Molecular
Probes, Inc., Eugene, Oregon) es un marcador alternativo adecuado
para este propósito.
Se obtiene una imagen digital del gel teñido por
escaneo en un Escáner Storm (Molecular Dynamics Inc, EEUU) en modo
fluorescencia azul. La imagen capturada se usó para determinar el
área del gel que se iba a escindir para proteolisis en gel.
Cada carril vertical del gel se escindió usando
una hoja de escalpelo de acero inoxidable. Las proteínas se
procesaron usando digestión en gel con tripsina (Tripsina
modificada, Promega, Wisconsin, EEUU) para generar péptidos
trípticos digeridos. Las muestras recuperadas se dividieron en dos.
Antes del análisis MALDI las muestras se desalaron y se
concentraron usando C18 Zip Tips^{TM} (Millipore, Bedford, MA).
Las muestras para espectrometría de masas en tándem se purificaron
usando un sistema nano LC (LC Packings, Amsterdam, Holanda) que
incorpora material C18 SPE. Los conjuntos de péptidos recuperados se
analizaron por espectrometría de masas MALDI-TOF
(Voyager STR, Applied Biosystems, Framingham, MA) usando un láser de
longitud de onda 337 nm para desorción y el modo reflectrón de
análisis. Los conjuntos también se analizaron por espectrometría de
masas en tándem nano-LC (LC/MS/MS) usando un
espectrómetro de masas Micromass Cuadrupolar de Tiempo de Vuelo
(Q-TOF) (Micromass, Altrincham, UK). Para la
secuenciación parcial de aminoácidos e identificación de proteínas
de la membrana de las células de cáncer, se buscaron los espectros
de masas en tándem no interpretados de péptidos trípticos frente a
una base de datos de proteínas del dominio público construida a
partir de entradas de proteínas en bases de datos no redundantes
del National Centre for Biotechnology Information (NCBI) que es
accesible en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ usando el programa de
búsqueda SEQUEST (Eng et al., 1994, J. Am. Soc. Mass
Spectrom. 5:976-989), versión v.C.1. Los criterios
para la identificación en la base de datos incluyeron: la
especificidad de escisión de la tripsina; la detección de un
conjunto de iones a, b e y en péptidos obtenidos en la base de
datos y un incremento en masa para todos los restos de Cys para
justificar la carbamidometilación. Después de la identificación de
las proteínas mediante correlación
espectral-espectral usando el programa SEQUEST, las
masas detectadas en los espectros de masas MALDI-TOF
se asignaron a los péptidos trípticos digeridos en las proteínas
identificadas. En los casos en los que no se pudieron identificar
secuencias de aminoácidos mediante la búsqueda con espectros MS/MS
no interpretados de péptidos trípticos digeridos usando el programa
SEQUEST, se interpretaron los espectros de masa en tándem de los
péptidos manualmente, usando métodos conocidos en la técnica. (En
el caso de interpretación de espectros de masa de fragmentación de
baja energía de los iones de los péptidos véase Gaskell et
al., 1992, Rapid Commun. Mass Spectrom.
6:658-662). El método descrito en WO 02/21139
también se usó para interpretar los espectros de masas.
Se encontró que siete espectros en tándem
(mostrados en negrita) y tres equivalencias de masa (negrita y
subrayado) eran equivalentes al registro de GenBank NM_022842 que
representa CDCP1 en las líneas celulares de cáncer (SEQ ID NO:1;
Figura 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras de tejido fueron de Ardais Corp.
(Lexington, MA). La RT-PCR en tiempo real se usó
para medir cuantitativamente la expresión de CDCP1 en tejidos de
tumor de ovario y tejidos normales. Los cebadores usados para PCR
fueron los siguientes:
Sentido,
5'-tcacagaaaggtatccacgctg-3', (SEQ
ID NO: 3)
Antisentido,
5'-catcctctgcatcattgtactg-3' (SEQ ID
NO: 4)
\vskip1.000000\baselineskip
Se ensayaron reacciones que contienen 5 ng ADNc,
reactivos de detección de secuencia verde SYBR (PE Biosystems) y
cebadores sentido y antisentido en un sistema de detección de
secuencia ABI7700 (PE Biosystems). Las condiciones de PCR fueron 1
ciclo a 50ºC durante 2 min, 1 ciclo a 95ºC durante 10 min, y 40
ciclos a 95ºC durante 15s, 65ºC durante 1min. La acumulación del
producto de PCR se midió en tiempo real como el incremento en
fluorescencia verde SYBR, y los datos se analizaron usando el
programa Detector de Secuencia v1.6.3 (PE Biosystems). Se generaron
curvas estándar relacionando el número de copias inicial del molde
con la fluorescencia y el ciclo de amplificación usando el producto
amplificado por PCR como molde, y se usaron para calcular el número
de copias de CDCP1 en cada muestra.
Se observaron niveles de expresión de CDCP1
relativamente bajos en tejido de ovario normal (Figura 3). Por el
contrario, los niveles de expresión de CDCP1 estaban muy
incrementados en 4/6 muestras de tumor de ovario y en las líneas
celulares de adenocarcinoma de ovario respecto al ovario normal
(Figura 3). Estos datos indican que CDCP1 es una diana para la
intervención terapéutica en el cáncer de ovario.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inmunizaron ratas con una o unas secuencias
recombinantes que codifican el dominio extracelular predicho de
(CDCP1) que comprende los restos 30-667 de SEQ ID
NO: 1. Tres inmunizaciones resultaron en una respuesta
anti-CDCP1 significativa. Se recogió sangre en este
momento y se preparó anticuerpo policlonal
anti-CDCP1 por purificación de afinidad frente a
proteína CDCP1 recombinante usando metodología estándar.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó inmunohistoquímica en varios tejidos
normales y múltiples tejidos de donantes con cáncer de ovario
usando el anticuerpo policlonal del Ejemplo 3. Los tejidos normales
fueron de Medical Solutions Plc, Nottingham, UK e incluyeron mama,
hígado, próstata, tiroides, bazo, duodeno, pulmón, ovario, corazón,
íleo, colon y páncreas. Los tejidos de tumor de ovario fueron de
Ardais Corp., MD.
Se descongelaron secciones de tejido normal y
tumoral congeladas durante 15 minutos a temperatura ambiente y se
fijaron en acetona fría durante 5 minutos. La actividad peroxidasa
endógena se eliminó por una incubación de 5 minutos a temperatura
ambiente en reactivo bloqueante de peroxidasa (DakoCytomation), se
lavó mediante inmersión en disolución salina tamponada con tris
(TBS) y se bloqueó durante 30 minutos a temperatura ambiente en
bloque de proteína sin suero (DakoCytomation). El anticuerpo
policlonal anti-CDCP1 (1 \mug/ml en diluyente de
anticuerpo DakoCytomation) se incubó en los tejidos a temperatura
ambiente durante 1 hora seguido de dos lavados en TBS durante 5
minutos cada uno. Las secciones de tejido se incubaron con un
anticuerpo secundario conjugado con biotina (de burro
anti-rata conjugado biotina-SP
AffiniPure, Jackson ImmunoResearch) diluido a 1:200 (2,5 \mug/ml
en diluyente de anticuerpo) durante 1 hora. Los portaobjetos se
lavaron 3 veces en TBS y el tejido se incubó con
Estreptavidina-HRP (Jackson ImmunoResearch) diluida
1:500 (1 \mug/ml en diluyente de anticuerpo) durante 30 minutos a
temperatura ambiente, seguido de tres lavados en TBS de 5 minutos.
La señal de anticuerpo se logró por una incubación de 5 minutos en
presencia de sustrato cromogénico
3,3'-diaminobenzidina (DAB+, DakoCytomation) que
resulta en un precipitado de color marrón en el sitio del antígeno.
Las secciones se contratiñeron en hematoxilina (DalcoCytomation) y
se montaron bajo cubreobjetos de vidrio usando medio de montaje
acuoso (Faramount, DakoCytomation).
Sólo se observó una débil expresión de CDCP1 en
colon, íleo y páncreas; todos los demás tejidos normales fueron
negativos. También se investigó la expresión de CDCP1 en 14 tejidos
congelados de donantes con cáncer de ovario (Ardais Corp, MD). El
65% de los donantes mostró una buena tinción del tejido tumoral
mostrando los subtipos de célula clara (2/2) y endometrioide (2/3)
la tinción más intensa (Tabla 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Las células OvCar3 derivadas de cáncer de ovario
se sembraron a una densidad de 5 x 10^{4} células por cámara de
un portaobjetos con cámara de 8 pocillos y se incubaron según lo
normal (37ºC, 5% CO_{2}) durante 24 horas. El medio se eliminó y
las células se lavaron cuidadosamente en Dulbecco PBS frío (DPBS).
Se preparó 1 \mug/ml de anticuerpos policlonales
anti-CDCP1 (véase Ejemplo 3) y el anticuerpo de
isotipo control en 200 \mul de medio DMEM/F12 sin suero frío, se
añadieron a sus cámaras respectivas y se incubaron a 4ºC durante 20
mins. Las células se lavaron dos veces con DPBS y las muestras de 0
hr se fijaron en 4% paraformaldehído (PFA) durante 10 mins. Se
añadió medio templado a las cámaras restantes y las células se
incubaron durante 30 mins, 1 y 2 hrs antes de la fijación. Después
de la fijación, las células se lavan dos veces en DPBS y se
bloquearon/permeabilizaron durante 20 mins a temperatura ambiente
(RT) en 0,1% saponina/5% suero de burro en DPBS. Se añadió IgG de
cabra anti-rata biotinilada diluida 1:200 (10
\mug/ml) en 5% suero de burro/PBS durante 1 hr a temperatura
ambiente seguido de tres lavados en DPBS. Se añadió
extravidina-Cy3 (Sigma-Aldrich)
diluida 1:500 en 0,1% saponina/5% suero de burro/PBS durante 30 mins
seguido de tres lavados en PBS. Las células se montaron en medio de
montaje que incrementa la fluorescencia (DakoCytomation, Ely, UK) y
se examinaron usando un microscopio de fluorescencia Leica
Microsystems con objetivo x 63 de inmersión en aceite.
Los resultados de estos estudios mostraron que
en la primera hora después de la adición del medio templado el
complejo CDCP1-anticuerpo estaba localizado
predominantemente en la membrana plasmática. Sin embargo, después
de 2 horas había una evidencia clara de internalización del complejo
CDCP1-anticuerpo con una débil tinción de la
membrana y una intensa tinción intracelular (endosomal). Estos
resultados indican que CDCP1 es una diana adecuada para la terapia
del cáncer de ovario usando un anticuerpo, lo más preferiblemente
usando una técnica citotóxica dependiente de anticuerpo.
Claims (26)
1. Un anticuerpo anti-CDCP1 o
fragmento de éste de unión a epítopo, para usarse en el tratamiento
y/o profilaxis del cáncer de ovario o el cribado de y/o diagnóstico
o pronóstico del cáncer de ovario.
2. Un anticuerpo según la reivindicación 1 ó 2
en el que CDCP1:
- (a)
- comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1; o
- (b)
- es un fragmento de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1, que tiene una longitud de al menos 100 aminoácidos y tiene al menos 70% de identidad con el polipéptido de SEQ ID NO:1.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Un anticuerpo según la reivindicación 1 ó 2
para el cribado de y/o diagnóstico o pronóstico del cáncer de
ovario.
4. Un anticuerpo según la reivindicación 3, en
el que el anticuerpo es monoclonal.
5. Un anticuerpo según la reivindicación 3 ó 4,
acoplado a un marcador detectable o a un segundo anticuerpo.
6. Un anticuerpo según la reivindicación 1 ó 2,
en el que el anticuerpo es monoclonal, policlonal, quimérico,
humanizado o biespecífico.
7. Un anticuerpo según una cualquiera de las
reivindicaciones 1, 2, ó 6, en el que el anticuerpo está conjugado
con un resto terapéutico, marcador detectable, segundo anticuerpo o
un fragmento de éste, una molécula efectora o informadora, un
agente citotóxico o citoquina, o está fusionado a través de un
enlace covalente a una proteína.
8. Un anticuerpo según una cualquiera de las
reivindicaciones 1, 2, 6 ó 7, en el que dicho anticuerpo es un
inhibidor de la actividad del polipéptido CDCP1.
9. Un anticuerpo según una cualquiera de las
reivindicaciones 1, 2, 6, 7 u 8, en el que el fragmento del
anticuerpo se modifica uniendo una molécula de polímero
seleccionada de poli(etilenglicol) o
metoxipoli(etilenglicol).
10. Una composición farmacéutica adecuada para
administración parenteral que comprende un anticuerpo como se ha
definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 6 a 9, para
usarse en el tratamiento y/o profilaxis del cáncer de ovario.
11. Polipéptido CDCP1 para usarse en el
tratamiento y/o profilaxis del cáncer de ovario.
12. El uso según la reivindicación 11, en el que
el polipéptido CDCP1:
- (a)
- comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1; o
- (b)
- fragmento de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1, que tiene una longitud de al menos 100 aminoácidos y tiene al menos 70% de identidad con el polipéptido de SEQ ID NO:1.
\vskip1.000000\baselineskip
13. Una composición farmacéutica que comprende
un polipéptido como se ha definido en la reivindicación 11 ó 12
para usarse en el tratamiento y/o profilaxis del cáncer de
ovario.
14. Una composición farmacéutica para usarse
según la reivindicación 13, en la que la composición es una
composición de vacuna.
15. Un método de cribado para un agente
anti-cáncer de ovario, en el que dicho agente es un
anticuerpo o un fragmento de éste de unión a epítopo comprendiendo
dicho método:
- (a)
- poner en contacto un polipéptido CDCP1 con dicho anticuerpo; y
- (b)
- detectar si el anticuerpo se une específicamente a dicho polipéptido.
\vskip1.000000\baselineskip
16. El método según la reivindicación 15, en el
que la etapa b) comprende la detección cuantitativa de la
unión.
17. Un método de cribado para un agente
anti-cáncer de ovario, en el que dicho agente
comprende un anticuerpo o un fragmento de éste de unión a epítopo,
comprendiendo dicho método:
- (i)
- comparar la expresión o actividad de un polipéptido CDCP1 en presencia de dicho agente con la expresión o actividad de dicho polipéptido en ausencia del agente candidato o en presencia de un agente control; y
- (ii)
- determinar si el agente candidato causa que cambie la expresión o actividad de dicho polipéptido.
\vskip1.000000\baselineskip
18. El método según la reivindicación 17, en el
que la expresión o actividad de dicho polipéptido se compara con un
intervalo de referencia predeterminado.
19. Un método de cribado y/o diagnóstico o
pronóstico del cáncer de ovario en un sujeto, y/o monitorización de
la eficacia de la terapia del cáncer de ovario, que comprende la
etapa de detectar y/o cuantificar en una muestra biológica obtenida
de dicho sujeto, la expresión de un polipéptido CDCP1.
20. El método según la reivindicación 19, en el
que la expresión de dicho polipéptido se compara con un intervalo
de referencia determinado previamente o control.
21. El método según la reivindicación 19 ó 20,
en el que la etapa de detectar comprende:
- (a)
- poner en contacto la muestra con un anticuerpo que es específico para un polipéptido CDCP11; y
- (b)
- detectar si ha ocurrido la unión entre el anticuerpo y dicho polipéptido en la muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
22. El método según la reivindicación 21, en el
que la etapa (b) comprende detectar el polipéptido capturado usando
un reactivo de detección marcado directamente o indirectamente.
23. El método según la reivindicación 21 ó 22,
en el que el anticuerpo se inmoviliza en una fase sólida.
24. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 23, en el que el polipéptido se detecta y/o
cuantifica usando un anticuerpo que se une específicamente a un
polipéptido CDCP1.
25. El método según la reivindicación 24, en el
que el anticuerpo se conjuga con un marcador detectable, o un
segundo anticuerpo o un fragmento de éste.
26. Un kit de diagnóstico adecuado para el
cribado, diagnóstico, pronóstico y/o monitorización terapéutica del
cáncer de ovario, comprendiendo dicho kit un anticuerpo específico
para un polipéptido CDCP1, reactivos e instrucciones de uso.
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