ES2274220T3 - Diagnostico de carcinoma usando polipeptidos raig1. - Google Patents
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Abstract
Un método para escrutar el cáncer de mama, el cáncer de colon y/o el osteosarcoma en un individuo, y/o para monitorizar la eficacia de una terapia anti-cáncer de mama, anti-cáncer de colon y/o anti-osteosarcoma, el cual comprende la etapa de detectar y/o cuantificar, en una muestra biológica obtenida de dicho individuo, un polipéptido RAIG1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID nº 1, en el que dicho polipéptido RAIG1 se detecta y/o se cuantifica empleando un anticuerpo que se une específicamente a dicho polipéptido RAIG1.
Description
Diagnóstico de carcinoma usando polipéptidos
RAIG1.
El presente invento se refiere al escrutinio
para el cáncer de mama, cáncer de colon y/u osteosarcoma en un
individuo, y/o a la monitorización de la eficacia de una terapia
anti-cáncer de mama, anti-cáncer de
colon y/o anti-osteosarcoma empleando el
polipéptido RAIG1 (gen 1 inducible por el ácido retinoico, del
inglés retinoic acid-inducible gene 1;
también conocido como hipotética proteína FLJ10899 o inducida por el
ácido retinoico 3) o un ácido nucleico correspondiente. También se
proporciona el empleo de un anticuerpo que se une específicamente a
un polipéptido RAIG1 en la fabricación de un medicamento para el
tratamiento del cáncer de mama, cáncer de colon y/u osteosarcoma,
en el que el anticuerpo está conjugado con un resto terapéutico o
medicamentoso.
Se han identificado proteínas específicas del
tumor para muchos tipos de cánceres empleando técnicas como el
escrutinio diferencial de ADNc (Hubert, R.S., et al., 1999,
Proc Natl Acad Sci, USA 96:14523-14528) y la
purificación de proteínas de la superficie celular que son
reconocidas por anticuerpos específicos de tumor (Catimel, B.,
et al., 1996, J Biol Chem 271:25664-25670).
Más recientemente, los "chips" de ADN que contienen hasta
10.000 elementos de secuencia expresados se han empleado para
caracterizar la expresión génica de células tumorales
(Dhanasekaran, S.M., et al., 2001, Nature
412:822-826). Sin embargo, hay varias razones por
las que los numerosos y extensos análisis transcriptómicos previos
de cánceres pueden no haber revelado todas, o incluso la mayoría,
de las proteínas asociadas a tumores. Éstas incluyen: (i) ausencia
de correlación entre los niveles de transcrito y de proteína
asociada a la enfermedad, particularmente frecuente para proteínas
de membrana que a menudo tienen una vida media larga y, como tales,
no tienen un elevado recambio de ARNm. Por tanto, mientras la
diferencia en niveles de proteína entre las células normales y
cancerosas sea consistente es difícil, a menudo, asociar cambios en
el ARNm para una proteína de membrana dada con el estado canceroso;
(ii) la translocación de una proteína en el estado enfermo, más bien
que simplemente niveles diferenciales del transcrito; por ejemplo,
erbB2/HER2-neu muestra mucha mayor localización en
la membrana plasmática de las células cancerosas que en las células
normales de mama, y los factores de transcripción del receptor de
estrógenos y STAT3 se translocan al núcleo para ejercer sus efectos
tumorigénicos; y (iii) los genes nuevos, sin caracterizar, no están
muy bien representados dentro del "sistema cerrado" de un array
de ADNc donde hay restricciones en el número de elementos de
secuencia expresados por chip y en el conocimiento y disponibilidad
de los clones de ADN.
Por tanto, existe una necesidad de identificar
más marcadores para diagnosticar el cáncer y más dianas que puedan
emplearse en una aproximación terapéutica al cáncer. El presente
invento está basado en la nueva asociación de RAIG1 con el
carcinoma, en particular con el cáncer de mama, cáncer de páncreas,
cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de ovario, cáncer de
colon y/u osteosarcoma. El análisis de la expresión del ARNm de
RAIG1 reveló que está elevada en el cáncer de colon, cáncer de
mama, cáncer de pulmón, cáncer de páncreas, cáncer de ovario y
osteosarcoma cuando se comparó con tejido normal o tejido control
correspondiente.
El documento EP 1074617 se refiere a sets de
cebadores para sintetizar ADNc de extensión completa, útiles para
estudiar la función de la proteína, y describe una secuencia
nucleotídica de RAIG1 como una de las 16.000 secuencias útiles para
fabricar tales sets de cebadores. Sin embargo, no se advirtió
asociación con enfermedades.
RAIG1 es un receptor acoplado a proteína G
huérfana (GPCR, del inglés G-protein coupled
receptor) localizado en el cromosoma 12 (Cheng y Lotan, arriba;
Brauner-Osbourne, H., 2001, Biochim Biophys Acta
1518:237-248). A diferencia de un receptor
relacionado (GPCR5B), que se expresa ampliamente en los tejidos
periférico y central, se ha publicado que RAIG1 muestra un patrón
de expresión más restringido (Brauner-Osbourne, H. y
Krogsgaard-Larsen, P., 2000, Genomics,
65:121-128).
En consecuencia, el presente invento proporciona
un método para escrutar el cáncer de mama, cáncer de colon y/u
osteosarcoma en un individuo, y/o para monitorizar la eficacia de la
terapia anti-cáncer de mama,
anti-cáncer de colon y/o
anti-osteosarcoma, el cual comprende la etapa de
detectar y/o cuantificar en una muestra biológica obtenida de dicho
individuo un polipéptido RAIG1 que comprende o consiste en la
secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID nº 1); en
el que dicho polipéptido RAIG1 se detecta y/o se cuantifica
empleando un anticuerpo que se une de forma específica a dicho
polipéptido RAIG1.
En el contexto del presente invento, los
polipéptidos RAIG1 pueden obtenerse a partir de una muestra
biológica de cualquier fuente, tal como, y sin limitación, una
muestra de tejido de mama, páncreas, pulmón, hígado, ovario, colon
y/o médula ósea. En una realización, el nivel del polipéptido RAIG1
se compara con un intervalo de referencia o control.
El término "carcinoma" incluye un
crecimiento maligno nuevo que surge del epitelio, encontrado en la
piel, o más frecuentemente, en el endotelio de los órganos del
cuerpo, por ejemplo: mama, próstata, pulmón, riñón, páncreas,
estómago o intestino. Los carcinomas tienden a infiltrarse en el
tejido adyacente y a extenderse (metastatizar) a órganos distantes,
por ejemplo: a hueso, hígado, pulmón o al cerebro.
Los polipéptidos descritos con anterioridad se
denominan posteriormente "polipéptidos RAIG1". El término
"polipéptidos" incluye péptidos, polipéptidos y proteínas.
Éstos se emplean indistintamente a menos que se especifique de otra
manera. Los polipéptidos RAIG1 pueden estar en forma de una proteína
"madura" o pueden ser parte de una proteína más grande tal
como una proteína de fusión. A menudo es ventajoso incluir una
secuencia de aminoácidos adicional que contiene secuencias
secretoras o líder, una secuencia de pre, pro o preproproteína o una
secuencia que ayuda en la purificación tal como una etiqueta de
afinidad, por ejemplo, pero sin limitación, residuos múltiples de
histidina, una etiqueta FLAG, etiqueta HA o etiqueta myc. Una
secuencia adicional que pueda proporcionar estabilidad durante la
producción del recombinante también puede emplearse. Tales
secuencias pueden eliminarse opcionalmente, según se precise,
incorporando una secuencia escindible como secuencia adicional o
parte de la misma. De este modo, un polipéptido RAIG1 puede
fusionarse a otros restos, incluidos otros polipéptidos. Tales
secuencias y etiquetas de afinidad adicionales se conocen bien en la
técnica.
El invento también proporciona un método para
escrutar el cáncer de mama, el cáncer de colon y/o el osteosarcoma
en un individuo, y/o para monitorizar la eficacia de la terapia
anti-cáncer de mama, anti-cáncer de
colon y/o anti-osteosarcoma, el cual comprende la
etapa de detectar en una muestra biológica obtenida de dicho
individuo un ácido nucleico que:
- a)
- comprende o consiste en la secuencia de ADN mostrada en la Figura 2 (SEQ ID nº 2) o en su ARN equivalente;
- b)
- tiene una secuencia que es complementaria a una secuencia de a); o
- c)
- tiene una secuencia que codifica para un polipéptido según se define anteriormente.
A menos de que el contexto indique lo contrario,
los ácidos nucleicos de RAIG1 incluyen aquellas moléculas de ácido
nucleico definidas en a) a c) anteriormente y pueden tener una o más
de las siguientes características:
- 1)
- pueden ser ADN o ARN;
- 2)
- pueden ser de cadena sencilla o doble;
- 3)
- pueden estar en forma substancialmente pura. De este modo, pueden proporcionarse en una forma que está substancialmente libre de proteínas contaminantes y/o de otros ácidos nucleicos; y
- 4)
- pueden estar con intrones o sin intrones (p. ej., como ADNc).
El uso de ácidos nucleicos que son
complementarios a los ácidos nucleicos de RAIG1 descritos
anteriormente en a)-c) y que pueden hibridar a
dichos ácidos nucleicos de RAIG1 es posible. Tales moléculas de
ácido nucleico se denominan moléculas de ácido nucleico
"hibridadoras". Por ejemplo, pero sin limitación, moléculas de
ácido nucleico hibridadoras pueden ser útiles como sondas o
cebadores. Las moléculas de ácido nucleico hibridadoras pueden
tener un elevado grado de identidad de secuencia a lo largo de su
longitud con una molécula de ácido nucleico dentro del alcance de
a) - c) anterior (p. ej., al menos 50%, al menos 75%, al menos 80%,
al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 98% de
identidad de secuencia).
Los ensayos de hibridación pueden emplearse para
detectar, pronosticar, diagnosticar o monitorizar el tratamiento
del carcinoma, p. ej., cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de
pulmón, cáncer de hígado, cáncer de ovario, cáncer de colon y/u
osteosarcoma, en un individuo. En consecuencia, tal ensayo de
hibridación comprende:
- i)
- hacer contacto con una muestra biológica, obtenida de un individuo, que contiene ácido nucleico con una sonda de ácido nucleico capaz de hibridar una molécula de ácido nucleico de RAIG1, bajo condiciones en las que pueda ocurrir la hibridación; y
- ii)
- detectar o medir cualquier hibridación resultante.
Preferiblemente, tales moléculas hibridadoras
tienen al menos 10 nucleótidos de longitud y tienen preferiblemente
al menos 25 o al menos 50 nucleótidos de longitud. Más
preferiblemente, las moléculas de ácido nucleico hibridadoras
hibridan específicamente ácidos nucleicos dentro del alcance de a) -
c) anterior. Más preferiblemente, la hibridación ocurre bajo
condiciones de hibridación astringentes. Un ejemplo de condiciones
de hibridación astringentes es cuando la hibridación que se intenta
se lleva a cabo a una temperatura desde aproximadamente 35ºC hasta
aproximadamente 65ºC, empleando una solución salina que es de
aproximadamente 0,9 M. Sin embargo, la persona experta será capaz
de variar tales condiciones según sea apropiado para tener en cuenta
variables tales como la longitud de la sonda, la composición de las
bases, el tipo de iones presentes, etc.
Puede proporcionarse un kit diagnóstico que
comprende una sonda de ácido nucleico capaz de hibridar con el ARN
que codifica un polipéptido RAIG1, reactivos adecuados e
instrucciones de uso.
Puede proporcionarse un kit diagnóstico que
comprende en uno o más recipientes un par de cebadores que bajo
condiciones de reacción apropiadas puede amplificar con cebador al
menos una parte de una molécula de ácido nucleico de RAIG1, tal
como por reacción en cadena de la polimerasa (véase, p. ej.,
Innis et al., 1990, PCR Protocols, Academic Press, Inc., San
Diego, CA), reacción en cadena de la ligasa (véase el
documento EP 320.308), empleo de la replicasa Q\beta, reacción de
la sonda cíclica u otros métodos conocidos en la técnica.
Típicamente, los cebadores son al menos de ocho nucleótidos de
largo y serán preferiblemente de al menos diez a veinticinco
nucleótidos de largo y más preferiblemente de quince a veinticinco
nucleótidos de largo. En algunos casos, pueden emplearse cebadores
de al menos treinta o de al menos treinta y cinco nucleótidos de
longitud.
En un aspecto adicional, el método para detectar
la presencia de un polipéptido RAIG1 comprende detectar el
polipéptido capturado empleando un reactivo de detección marcado
directa o indirectamente.
Un polipéptido RAIG1 puede detectarse por medio
de cualquier inmunoensayo conocido en la técnica, incluyendo, sin
limitación, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos que
emplean técnicas como transferencias Western, radioinmunoensayos,
ELISA (siglas en inglés de ensayo inmunoabsorbente enlazado a
enzima), inmunoensayos "sándwich", ensayos de
inmunoprecipitación, reacciones de precipitina, reacciones de
precipitina por difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos
de aglutinación, ensayos de fijación del complemento, ensayos
inmunorradiométricos, inmunoensayos fluorescentes e inmunoensayos
de proteína A.
Kits diagnósticos, que comprenden un reactivo de
captura (p. ej., un anticuerpo) frente al polipéptido RAIG1 como se
define anteriormente, pueden proporcionarse. Además, tal kit puede
comprender opcionalmente uno o más de los siguientes:
- 1)
- instrucciones para el uso del reactivo de captura para diagnosticar, pronosticar, monitorizar terapéuticamente o cualquier combinación de estas aplicaciones;
- 2)
- una pareja de unión marcada al reactivo de captura;
- 3)
- una fase sólida (tal como una tira de reactivo) sobre la que se inmoviliza el reactivo de captura; y
- 4)
- un marcaje o inserto que indica aprobación reguladora para diagnosticar, pronosticar, emplear terapéuticamente o cualquier combinación de las mismas.
Si no se proporciona pareja de unión marcada al
reactivo de captura, el reactivo de captura
anti-polipéptido en sí mismo puede marcarse con un
marcador detectable, p. ej., un resto quimioluminiscente,
enzimático, fluorescente o radiactivo (véase arriba).
Pueden realizarse métodos de diagnóstico
empleando muchos métodos conocidos para aquellos expertos en la
técnica, incluidos, sin limitación, inmunoprecipitación seguidoa de
electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil sulfato sódico,
electroforesis en gel de 2 dimensiones, sistemas de ensayo
competitivo y no competitivo empleando técnicas como transferencias
en Western, inmunocitoquímica, inmunohistoquímica, inmunoensayos, p.
ej., radioinmunoensayos, ELISA (ensayo inmunoabsorbente enlazado a
enzima), inmunoensayos "sándwich", ensayos de
inmunoprecipitación, reacciones de precipitina, reacciones de
precipitina por difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos
de aglutinación, ensayos de fijación del complemento, ensayos
inmunorradiométricos, inmunoensayos fluorescentes e inmunoensayos
de proteína A.
Los polipéptidos RAIG1 representan una diana
adecuada para el tratamiento del carcinoma, p. ej., cáncer de mama,
cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de
ovario, cáncer de colon y/u osteosarcoma. De este modo, son
posibles métodos para identificar agentes capaces de interaccionar
con, o modular, la expresión o actividad de un polipéptido RAIG1 o
la expresión de una molécula de ácido nucleico de RAIG1. Los agentes
identificados a través de estos métodos de escrutinio son
potencialmente terapéuticos para el uso en el tratamiento del
carcinoma, p. ej., cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de
pulmón, cáncer de hígado, cáncer de ovario, cáncer de colon y/u
osteosarcoma.
Los agentes pueden seleccionarse a partir de una
amplia variedad de agentes candidatos. Ejemplos de agentes
candidatos incluyen, pero no están limitados a, ácidos nucleicos (p.
ej., ADN y ARN), anticuerpos, carbohidratos, lípidos, proteínas,
polipéptidos, péptidos, peptidomiméticos, moléculas pequeñas y otros
fármacos. Los agentes pueden obtenerse empleando cualquiera de los
numerosos planteamientos en métodos de bibliotecas combinatorias
conocidos en la técnica, incluidas: bibliotecas biológicas;
bibliotecas con diversidad espacial dirigida realizadas en fase
sólida o solución de manera paralelizada; el método de la biblioteca
"una bola un compuesto"; y los métodos de bibliotecas
sintéticas que emplean selección por cromatografía de afinidad. El
planteamiento de la biblioteca biológica se adapta a las
bibliotecas de péptidos, mientras que los otros cuatro
planteamientos son aplicables a péptidos, oligomeros no peptídicos
o bibliotecas de moléculas pequeñas de compuestos (Lam, 1997,
Anticancer Drug Des. 12:145; patente de EE.UU. 5.738.996 y patente
de EE.UU. 5.807.683).
Ejemplos de métodos adecuados basados en la
presente descripción para la síntesis de bibliotecas moleculares
pueden encontrarse en la técnica, por ejemplo en: DeWitt et
al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909; Erb et
al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et
al., 1994, J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al., 1993,
Science 261:1303; Carrell et al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed.
Engl. 33:2059; Carell et al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed.
Engl. 33:2061; y Gallop et al., 1994, J. Med. Chem.
37:1233.
\newpage
Pueden presentarse bibliotecas de compuestos,
por ejemplo, en solución (p. ej., Houghten, 1992, Bio/Techniques
13:412-421), o en bolas (Lam, 1991, Nature
354:82-84), chips (Fodor, 1993, Nature
364:555-556), bacterias (patente de EE.UU.
5.223.409), esporas (patentes de EE.UU 5.571.698; 5.403.484; y
5.223.409), plásmidos (Cull et al., 1992, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 89:1865-1869) o fagos (Scott y Smith, 1990,
Science 249:386-390; Devlin, 1990, Science
249:404-406; Cwirla et al., 1990, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 87: 6378-6382; y Felici, 1991, J.
Mol. Biol. 222:301-310).
Agentes que interaccionan con (p. ej., se unen
a) un polipéptido RAIG1 pueden identificarse en un ensayo basado en
células donde una población de células que expresan un polipéptido
RAIG1 pueden ponerse en contacto con un agente candidato y se
determina la capacidad del agente candidato para interaccionar con
el polipéptido. Preferiblemente, la capacidad de un agente
candidato para interaccionar con un polipéptido RAIG1 puede
compararse con un intervalo de referencia o control.
Alternativamente, una primera y segunda población de células que
expresa un polipéptido RAIG1 puede ponerse en contacto con un agente
candidato o un agente control y puede determinarse la capacidad del
agente candidato para interaccionar con el polipéptido comparando la
diferencia de interacción entre el agente candidato y el agente
control. Si se desea, este tipo de ensayo puede emplearse para
escrutar una pluralidad (p. ej., una biblioteca) de agentes
candidatos empleando una pluralidad de poblaciones celulares que
expresan un polipéptido RAIG1. Si se desea, este ensayo puede usarse
para escrutar una pluralidad (p. ej., una biblioteca) de agentes
candidatos. La célula, por ejemplo, puede ser de origen procariota
(p. ej., E. coli) o de origen eucariota (p. ej., levadura o
mamífero). Además, las células pueden expresar el polipéptido RAIG1
endógenamente o pueden fabricarse por ingeniería genética para
expresar el polipéptido. En algunas realizaciones, un polipéptido
RAIG1 o el agente candidato se marcan, por ejemplo, con un marcaje
radiactivo (tal como ^{32}P, ^{35}S o ^{125}I) o con un
marcaje fluorescente (tal como isotiocianato de fluoresceína,
rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina,
o-ftaldehído o fluorescamina) para permitir la
detección de una interacción entre un polipéptido y un agente
candidato.
Agentes que interaccionan con (p. ej., se unen
a) un polipéptido RAIG1 pueden identificarse en un sistema de
ensayo libre de células donde una muestra que expresa un polipéptido
RAIG1 se pone en contacto con un agente candidato y se determina la
capacidad del agente candidato para interaccionar con el
polipéptido. Preferiblemente, la capacidad de un agente candidato a
interaccionar con un polipéptido RAIG1 puede compararse con un
intervalo de referencia o control. Preferiblemente, una primera y
segunda muestra que comprende polipéptido RAIG1 nativo o
recombinante puede ponerse en contacto con un agente candidato o con
un agente control y la capacidad del agente candidato para
interaccionar con el polipéptido puede determinarse por comparación
de la diferencia de interacción entre el agente candidato y el
agente control. Si se desea, este ensayo puede emplearse para
escrutar una pluralidad (p. ej., una biblioteca) de agentes
candidatos empleando una pluralidad de muestras de polipéptidos
RAIG1. Preferiblemente, el polipéptido se inmoviliza primero
mediante, por ejemplo, contacto del polipéptido con un anticuerpo
inmovilizado que lo reconoce específicamente y se une a él, o
mediante contacto de una preparación purificada de polipéptido con
una superficie designada para unir proteínas. El polipéptido puede
purificarse parcial o completamente (p. ej., parcial o completamente
libre de otros polipéptidos) o ser parte de un lisado celular.
Además, el polipéptido puede ser una proteína de fusión que
comprende el polipéptido RAIG1 o una parte biológicamente activa
del mismo y un dominio tal como
glutatión-S-transferasa.
Alternativamente, el polipéptido puede biotinilarse empleando
técnicas bien conocidas por aquellos expertos en el campo (p. ej.,
kit de biotinilación, Pierce Chemicals; Rockford, IL). La capacidad
del agente candidato para interaccionar con el polipéptido puede
duplicarse mediante métodos conocidos por los expertos en la
técnica.
Un polipéptido RAIG1 puede emplearse como una
"proteína cebo" en un ensayo de 2-híbridos o en
un ensayo de tres híbridos para identificar otras proteínas que se
unen o interaccionan con el polipéptido RAIG1 (véase, p.
ej., la patente de EE.UU. 5.283.317; Zervos et al., 1993,
Cell 72:223-232; Madura et al., 1993, J.
Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel et al.,
1993, Bio/Techniques 14:920-924; Iwabuchi et
al., 1993, Oncogene 8:1693-1696; y el documento
WO 94/10300). Como los expertos en la técnica apreciarán, tales
proteínas de unión están también probablemente implicadas en la
propagación de señales por un polipéptido RAIG1. Por ejemplo,
pueden ser elementos anteriores o posteriores de una vía de
señalización que implica a un polipéptido RAIG1. Alternativamente,
los polipéptidos que interaccionan con un polipéptido RAIG1 pueden
identificarse aislando un complejo proteico que comprende un
polipéptido RAIG1 (es decir, un polipéptido RAIG1 que interacciona
directa o indirectamente con otro o más polipéptidos) e
identificando las proteínas asociadas empleando métodos conocidos
en la técnica tales como espectrometría de masas o transferencia
Western (véanse, por ejemplo, Blackstock, W. y Weir, M.
1999, Trends in Biotechnology, 17: 121-127; Rigaut,
G. 1999, Nature Biotechnology, 17:1030-1032; Husi,
H. 2000, Nature Neurosci. 3:661-669; Ho, Y. et
al., 2002, Nature, 415:180-183; Gavin, A. et
al., 2002, Nature, 415:141-147).
En todos los casos, la capacidad del agente
candidato para interaccionar directa o indirectamente con el
polipéptido RAIG1 puede determinarse mediante métodos conocidos
para aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, pero sin
limitación, la interacción entre un agente candidato y un
polipéptido RAIG1 puede determinarse mediante citometría de flujo,
un ensayo de centelleo, un ensayo de actividad, espectrometría de
masas, microscopía, inmunoprecipitación o análisis de transferencia
Western.
Pueden identificarse agentes que interaccionan
competitivamente con (es decir, se unen competitivamente) un
polipéptido RAIG1 en un ensayo de unión competitiva y puede
determinarse la capacidad del agente candidato para interaccionar
con el polipéptido RAIG1. Preferiblemente, la capacidad de un agente
candidato para interaccionar con un polipéptido RAIG1 puede
compararse con un intervalo de referencia o control.
Preferiblemente, una primera y segunda población de células que
expresan ambas un polipéptido RAIG1 y una proteína que se sabe
interacciona con el polipéptido RAIG1 pueden ponerse en contacto
con un agente candidato o con un agente control. La capacidad del
agente candidato para interaccionar competitivamente con el
polipéptido RAIG1 puede determinarse entonces comparando la
interacción en la primera y segunda población de células.
Alternativamente, una segunda población alternativa o una población
adicional de células puede ponerse en contacto con un agente que se
sabe que interacciona competitivamente con un polipéptido RAIG1.
Alternativamente, agentes que competitivamente interaccionan con un
polipéptido RAIG1 se identifican en un sistema de ensayo libre de
células al contactar una primera y segunda muestra que comprende un
polipéptido RAIG1 y una proteína que se sabe interacciona con el
polipéptido RAIG1 con un agente candidato o con un agente control.
La capacidad del agente candidato para interaccionar
competitivamente con el polipéptido RAIG1 se determina entonces
comparando la interacción en la primera y segunda muestra.
Alternativamente, una segunda muestra alternativa o una muestra
adicional que comprende un polipéptido RAIG1 puede ponerse en
contacto con un agente que se sabe interacciona competitivamente con
un polipéptido RAIG1. En cualquier caso, el polipéptido RAIG1 y la
proteína interactiva conocida pueden expresarse de forma natural o
pueden expresarse recombinantemente; el agente candidato puede
añadirse exógenamente o expresarse de forma natural o
recombinante.
Pueden identificarse agentes que modulan una
interacción entre un polipéptido RAIG1 y otro agente, por ejemplo,
aunque sin limitación, una proteína, en un ensayo basado en células
poniendo en contacto células que expresan un polipéptido RAIG1 en
presencia de un agente interactivo conocido y de un agente modulador
candidato, y seleccionando el agente candidato que modula la
interacción. Alternativamente, los agentes que modulan una
interacción entre un polipéptido RAIG1 y otro agente, por ejemplo,
aunque sin limitación, una proteína, pueden identificarse en un
sistema de ensayo libre de células poniendo en contacto el
polipéptido con un agente que se sabe interactúa con el polipéptido
en presencia de un agente candidato. Un agente modulador puede
actuar como un anticuerpo, un cofactor, un inhibidor, un activador
o tener un efecto antagonista o agonista sobre la interacción entre
un polipéptido RAIG1 y un agente conocido. Según se establece
anteriormente, la capacidad del agente que se sabe interacciona con
un polipéptido RAIG1 puede determinarse por métodos conocidos en la
técnica. Estos ensayos, basados en células o libres de células,
pueden emplearse para escrutar una pluralidad (p. ej., una
biblioteca) de agentes candidatos.
Un sistema de ensayo basado en células puede
emplearse para identificar agentes capaces de modular (es decir,
estimular o inhibir) la actividad de un polipéptido RAIG1. En
consecuencia, la actividad de un polipéptido RAIG1 se mide en una
población de células que expresan de forma natural o recombinante un
polipéptido RAIG1, en presencia de un agente candidato.
Preferiblemente, la actividad de un polipéptido RAIG1 se compara con
un intervalo de referencia o control. Preferiblemente, la actividad
de un polipéptido RAIG1 se mide en una primera y segunda población
de células que expresa de forma natural o recombinante un
polipéptido RAIG1 en presencia de agente o en ausencia de un agente
candidato (p. ej., en presencia de un agente control) y se compara
la actividad del polipéptido RAIG1. El agente candidato puede
entonces identificarse como un modulador de la actividad de un
polipéptido RAIG1 de acuerdo con esta comparación. Alternativamente,
la actividad de un polipéptido RAIG1 puede medirse en un sistema de
ensayo libre de células donde el polipéptido RAIG1 es bien natural
o recombinante. Preferiblemente, la actividad de un polipéptido
RAIG1 se mide en una primera y segunda muestra en presencia o
ausencia de un agente candidato y se compara la actividad del
polipéptido RAIG1. El agente candidato puede entonces identificarse
como un modulador de la actividad de un polipéptido RAIG1 de
acuerdo con esta comparación.
La actividad de un polipéptido RAIG1 puede
evaluarse detectando su efecto sobre un efector posterior, por
ejemplo, aunque sin limitación, el nivel o actividad de un segundo
mensajero (p. ej., cAMP, Ca^{2+} intracelular, diacilglicerol,
IP_{3}, etc.), detectando la actividad catalítica o enzimática,
detectando la inducción de un gen indicador (p. ej., luciferasa) o
detectando una respuesta celular, por ejemplo, proliferación,
diferenciación o transformación donde apropiado, como saben los
expertos en la técnica (para técnicas de medida de actividad,
véase, p. ej., la patente de EE.UU. 5.401.639). El agente
candidato puede entonces identificarse como un modulador de la
actividad de un polipéptido RAIG1 al comparar los efectos del agente
candidato con el agente control. Agentes control adecuados incluyen
PBS o salino normal.
Pueden identificarse agentes tales como una
enzima, o una parte biológicamente activa de la misma, la cual es
responsable de la producción o degradación de un polipéptido o ácido
nucleico RAIG1 o es responsable de la modificación postraduccional
de un polipéptido RAIG1. En una criba primaria, polipéptidos RAIG1
substancialmente puros, expresados de forma nativa o recombinante,
ácidos nucleicos o extractos celulares, u otra muestra que
comprende polipéptidos o ácidos nucleicos RAIG1 expresados de forma
nativa o recombinante, se ponen en contacto con una pluralidad de
agentes candidatos (por ejemplo, pero sin limitación, con una
pluralidad de agentes presentados como una biblioteca) que pueden
ser responsables del procesamiento de un polipéptido o ácido
nucleico RAIG1, para identificar tales agentes. La capacidad del
agente candidato para modular la producción, degradación o
modificación postraduccional de un polipéptido o ácido nucleico
RAIG1 puede determinarse mediante métodos conocidos para los
expertos en la técnica, incluyendo, sin limitación, citometría de
flujo, marcaje radiactivo, un ensayo de kinasa, un ensayo de
fosfatasa, inmunoprecipitación y análisis de transferencia Western o
análisis de transferencia Northern.
Las células que expresan un polipéptido RAIG1
pueden ponerse en contacto con una pluralidad de agentes candidatos.
La capacidad de tal agente para modular la producción, degradación
o modificación postraduccional de un polipéptido RAIG1 puede
determinarse mediante métodos conocidos para los expertos en la
técnica, según se describe anteriormente.
Pueden identificarse agentes que modulan la
expresión de un polipéptido RAIG1 (es decir, estimulan o inhiben)
en un sistema de ensayo basado en células. En consecuencia, una
población de células que expresa un polipéptido o ácido nucleico
RAIG1 se pone en contacto con un agente candidato y se determina la
capacidad del agente candidato para alterar la expresión del
polipéptido o ácido nucleico RAIG1 por comparación con un intervalo
de referencia o control. Alternativamente, una primera y segunda
población de células que expresa un polipéptido RAIG1 se pone en
contacto con un agente candidato o con un agente control y se
determina la capacidad del agente candidato para alterar la
expresión del polipéptido o ácido nucleico RAIG1 entre la primera y
segunda poblaciones de células. Alternativamente, la expresión del
polipéptido o ácido nucleico RAIG1 en la primera población puede
compararse adicionalmente con un intervalo de referencia o control.
Si se desea, este ensayo puede emplearse para escrutar una
pluralidad de agentes candidatos (p. ej., una biblioteca). La
célula, por ejemplo, puede ser de origen procariota (p. ej., E.
coli) o de origen eucariota (p. ej., levadura o mamífero).
Además, las células pueden expresar un polipéptido o ácido nucleico
RAIG1 endógenamente o fabricarse por ingeniería genética para
expresar un polipéptido o ácido nucleico RAIG1. La capacidad de los
agentes candidatos para alterar la expresión de un polipéptido o
ácido nucleico RAIG1 puede determinarse por métodos conocidos para
aquellos expertos en la técnica, por ejemplo, y sin limitación,
mediante citometría de flujo, marcaje radiactivo, un ensayo de
centelleo, inmunoprecipitación, análisis de transferencia Western o
análisis de transferencia Northern.
Pueden identificarse agentes que modulan la
expresión de un polipéptido o ácido nucleico RAIG1 en un modelo
animal. Ejemplos de animales adecuados incluyen, pero no están
limitados a, ratones, ratas, conejos, monos, cobayas, perros y
gatos. Preferiblemente, el animal empleado representa un modelo de
carcinoma, p. ej., cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de
pulmón, cáncer de hígado, cáncer de ovario, cáncer de colon y/u
osteosarcoma. En consecuencia, se administra un agente candidato o
un agente control a un primer y segundo grupo de mamíferos y se
determina la capacidad del agente candidato para modular la
expresión del polipéptido o ácido nucleico RAIG1 comparando la
diferencia en el nivel de expresión entre el primer y el segundo
grupo de mamíferos. Si se desea, los niveles de expresión de los
polipéptidos o ácidos nucleicos RAIG1 en el primer y segundo grupos
de mamíferos pueden compararse con el nivel de un polipéptido o
ácido nucleico RAIG1 en un grupo control de mamíferos. El agente
candidato o un agente control puede administrarse por medios
conocidos en la técnica (p. ej., oral, rectal o parenteralmente,
tal como intraperitoneal o intravenosamente). Cambios en la
expresión de un polipéptido o ácido nucleico pueden evaluarse por
los métodos esbozados anteriormente. Particularmente, un agente
terapéuticamente eficaz puede identificarse monitorizando un alivo o
mejoría en los síntomas de la enfermedad, para retrasar el inicio o
disminuir la progresión de la enfermedad, por ejemplo, pero sin
limitación, una reducción en el tamaño del tumor. Las técnicas
conocidas para los médicos familiarizados con el carcinoma pueden
emplearse para determinar si un agente candidato ha alterado uno o
más síntomas asociados con la enfermedad.
Un experto en la técnica también apreciará que
un polipéptido RAIG1 puede usarse también en un método para el
diseño basado en la estructura de un agente, en particular, una
molécula pequeña que actúa para modular (p. ej., estimular o
inhibir) la actividad de dicho polipéptido, dicho método
comprende:
1) determinar la estructura tridimensional de
dicho polipéptido;
2) deducir la estructura tridimensional dentro
del polipéptido del sitio(s) probablemente reactivo(s)
o de unión;
3) sintetizar agentes candidatos que se predice
reaccionan o se unen al sitio deducido de reacción o de unión;
y
4) someter a ensayo si el agente candidato es
capaz de modular la actividad de dicho polipéptido.
Se apreciará que el método descrito
anteriormente es probable que sea un procedimiento iterativo.
Pueden proporcionarse agentes que interaccionan
o modulan la expresión o actividad de un polipéptido o ácido
nucleico RAIG1, polipéptidos RAIG1, anticuerpos y ácidos nucleicos
RAIG1 y los usos de los mismos para tratamientos, según se describe
en esta memoria. Posteriormente, los agentes, polipéptidos RAIG1 y
ácidos nucleicos RAIG1 de uso en el tratamiento se denominan
"agentes activos". El término "tratamiento" incluye bien
terapia terapéutica o profiláctica. Cuando se hace una referencia
en la presente memoria a un método para tratar o prevenir una
enfermedad o afección empleando un agente activo particular o
combinación de agentes, debe entenderse que tal referencia pretende
incluir el uso de ese agente activo o combinación de agentes en la
preparación de un medicamento para tratar o prevenir la enfermedad
o afección.
En consecuencia, puede proporcionarse un método
para la profilaxis y/o el tratamiento del carcinoma, p. ej., cáncer
de mama, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de hígado,
cáncer de ovario, cáncer de colon y/u osteosarcoma, el cual
comprende administrar a dicho individuo una cantidad
terapéuticamente eficaz de al menos un agente activo.
A fin de emplear agentes activos en la terapia
(humana o veterinaria), éstos se formularán normalmente en una
composición farmacéutica de acuerdo con la práctica farmacéutica
estándar, p. ej., agregando el agente activo y un vehículo
farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas son
particularmente útiles en la prevención o tratamiento del
carcinoma. En un aspecto, la composición farmacéutica es para uso
como una vacuna y, de este modo, cualquier componente adicional
será aceptable para uso como vacuna. Además, la persona experta
apreciará que puede añadirse uno o más adyuvantes adecuados a tales
preparaciones de vacuna.
Los agentes activos pueden administrarse a un
individuo por cualquiera de las vías empleadas convencionalmente
para la administración de fármacos, por ejemplo, pueden
administrarse parenteral, oral, tópicamente (incluyendo bucal,
sublingual o transdérmicamente) o por inhalación. Las vías de
administración más adecuadas en cualquier caso dependerán del
agente activo particular, del carcinoma implicado, del individuo y
de la naturaleza y gravedad de la enfermedad y de la condición
física del individuo.
Los agentes activos pueden administrarse en
combinación, p. ej., simultánea, secuencial o separadamente con
otro o más agentes terapéuticamente activos, p. ej.,
anti-carcinoma.
La dosis de administración de un agente activo
variará de acuerdo con el agente activo particular, el carcinoma
implicado, el individuo y la naturaleza y gravedad de la enfermedad
y la condición física del individuo y la vía de administración
seleccionada; la dosis apropiada puede determinarse fácilmente por
una persona experta en la técnica. Para el tratamiento del
carcinoma en humanos y animales, la dosis puede variar desde 0,01
mg/kg hasta 750 mg/kg. Para uso profiláctico en humanos y animales,
la dosis puede variar desde 0,01 mg/kg hasta 100 mg/kg.
Las composiciones pueden contener desde 0,1% en
peso, preferiblemente desde 10-60% en peso, del
agente activo del invento, dependiendo del método de
administración.
Las composiciones farmacéuticas pueden
presentarse convenientemente en formas de dosis unitarias que
contienen una cantidad predeterminada de un agente activo del
invento por dosis. Tal unidad puede contener, por ejemplo, aunque
sin limitación, de 750 mg/kg a 0,1 mg/kg dependiendo de la afección
a tratar, la vía de administración y la edad, peso y condición del
individuo. Las composiciones de dosis unitarias preferidas son
aquellas que contienen una dosis o subdosis diaria del agente
activo, según se relata anteriormente, o una fracción apropiada de
la misma.
Se reconocerá por un experto en la técnica que
la cantidad y el espaciado óptimos de las dosis individuales de un
agente activo se determinarán por la naturaleza y alcance de la
afección a tratar, la forma, vía y lugar de administración y el
individuo a tratar en particular, y que estos óptimos pueden
determinarse mediante técnicas convencionales. Un experto en la
técnica apreciará también que el curso óptimo de tratamiento, es
decir, el número de dosis de un agente activo dado al día durante un
número definido de días puede averiguarse por aquellos expertos en
la técnica que emplean tests de determinación del curso del
tratamiento convencionales.
Los regímenes de dosis se ajustan para
proporcionar la respuesta óptima deseada. Por ejemplo, puede
administrarse un único bolo, pueden administrarse varias dosis
divididas a lo largo del tiempo o la dosis puede reducirse o
aumentarse proporcionalmente, según indiquen las exigencias de la
situación terapéutica.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables para
su uso pueden tomar una amplia variedad de formas dependiendo, p.
ej., de la vía de administración.
Las composiciones para administración oral
pueden ser líquidas o sólidas. Las preparaciones orales líquidas
pueden estar en la forma de, por ejemplo, suspensiones acuosas o
aceitosas, soluciones, emulsiones, siropes o elíxires, o pueden
presentarse como un producto seco para reconstituir con agua o con
otro vehículo adecuado antes de usar. Las preparaciones orales
líquidas pueden contener agentes suspendidos, por ejemplo, sorbitol,
metilcelulosa, sirope de glucosa, gelatina, hidroxietilcelulosa,
carboximetilcelulosa, gel estearato de aluminio o grasas
hidrogenadas comestibles, agentes emulsionantes, por ejemplo,
lecitina, monooleato de sorbitán o acacia; agua; vehículos no
acuosos (que pueden incluir aceites comestibles), por ejemplo,
aceite de almendras, ésteres aceitosos tales como glicerina,
propilenglicol o alcohol etílico; conservantes, por ejemplo,
p-hidroxibenzoato de metilo o propilo o ácido
sórbico; pueden usarse agentes aromatizantes, conservantes, agentes
colorantes y similares.
En el caso de preparaciones orales sólidas tales
como polvos, cápsulas y comprimidos, pueden incluirse vehículos
como almidones, azúcares, celulosa microcristalina, diluyentes,
agentes granulantes, lubricantes, aglutinantes, agentes
desintegrantes y similares. Debido a su fácil administración, los
comprimidos y las cápsulas representan la forma de dosis unitaria
oral más ventajosa en la que se emplean generalmente vehículos
farmacéuticos de envoltura sólida. Además de las formas frecuentes
de dosificación expuestas anteriormente, los agentes activos
también pueden administrarse mediante medios de liberación y/o
aparatos de administración controlada. Los comprimidos y las
cápsulas pueden comprender vehículos o excipientes convencionales
tales como agentes de unión, por ejemplo, sirope, acacia, gelatina,
sorbitol, tragacanto o polivinilpirrolidona; rellenos, por ejemplo,
lactosa, azúcar, almidón de maíz, fosfato cálcico, sorbitol o
glicina; lubricantes de comprimidos, por ejemplo, estearato de
magnesio, talco, polietilenglicol o sílice; desintegrantes, por
ejemplo, almidón de patata; o agentes humidificantes aceptables
tales como laurilsulfato sódico. Los comprimidos pueden estar
recubiertos mediante técnicas estándares acuosas o no acuosas, de
acuerdo con métodos bien conocidos en la práctica farmacéutica
normal.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para
la administración oral pueden presentarse como unidades discretas
tales como cápsulas, sellos o comprimidos, cada una conteniendo una
cantidad predeterminada del agente activo, como polvo o granulos, o
como una solución o una suspensión en un líquido acuoso, un líquido
no acuoso, una emulsión de aceite en agua o una emulsión líquida de
agua en aceite. Tales composiciones pueden prepararse por
cualquiera de los métodos de farmacia, pero todos los métodos
incluyen la etapa de asociar el agente activo con el vehículo, lo
que constituye uno o más ingredientes necesarios. En general, las
composiciones se preparan mezclando uniforme e íntimamente el
agente activo con los vehículos líquidos o con los vehículos sólidos
finamente divididos o con ambos y, entonces, si es necesario, dando
forma al producto en la presentación deseada. Por ejemplo, un
comprimido puede prepararse mediante compresión o moldeado,
opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios.
Las tabletas comprimidas pueden prepararse por
compresión, en una máquina adecuada, del agente activo en forma de
una fluencia suave tal como un polvo o granulos, mezclados
opcionalmente con un aglutinante, lubricante, diluyente inerte,
agente tensioactivo o dispersante. Los comprimidos moldeados pueden
fabricarse moldeando, en una máquina adecuada, una mezcla del
agente en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte. De forma
deseable, cada comprimido contiene desde aproximadamente 1 mg hasta
aproximadamente 500 mg del agente activo y cada sello o cápsula
contiene desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 500 mg del
agente activo.
También pueden prepararse composiciones que
comprenden un agente activo en polvo o en forma de concentrado
líquido. Los excipientes solubles en agua convencionales, tales como
lactosa o sacarosa, pueden incorporarse en los polvos para mejorar
sus propiedades físicas. De este modo, polvos particularmente
adecuados de este invento comprenden 50 a 100% p/p, y
preferiblemente 60 a 80% p/p de la combinación, y 0 a 50% p/p y
preferiblemente 20 a 40% p/p de los excipientes convencionales.
Cuando se emplean en un contexto veterinario tales polvos pueden
añadirse a los piensos de los animales, por ejemplo, por medio de un
intermediario premezclado, o diluido en el agua de bebida del
animal.
Los concentrados líquidos para la administración
oral contienen adecuadamente una combinación de agentes solubles en
agua y pueden incluir opcionalmente un solvente miscible en agua
aceptable en veterinaria, por ejemplo, polietilenglicol,
propilenglicol, glicerol, glicerol formal o tales solventes
mezclados con hasta un 30% v/v de
etanol.
etanol.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para
la administración parenteral pueden prepararse como soluciones o
suspensiones de agentes activos del invento en agua mezclados de
forma adecuada con un tensioactivo tal como hidroxipropilcelulosa.
Las dispersiones también pueden prepararse en glicerol, glicoles de
polietileno líquido y mezclas de los mismos en aceites. Bajo
condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones
contienen un conservante para impedir el crecimiento de
microorganismos.
Las formas farmacéuticas adecuadas para uso
inyectable incluyen soluciones de inyección estériles acuosas y no
acuosas, las cuales pueden contener antioxidantes, tampones,
bacteriostáticos y solutos que hacen la composición isotónica con
la sangre del futuro receptor y suspensiones estériles acuosas o no
acuosas que pueden incluir agentes de suspensión o agentes
espesantes. Las soluciones de inyección, dispersiones y suspensiones
extemporáneas pueden prepararse a partir de polvos, granulos y
comprimidos estériles.
Las composiciones pueden presentarse en dosis
única o en envases de múltiples dosis, por ejemplo, en ampollas y
viales sellados, y para aumentar la estabilidad pueden almacenarse
en un estado de secado por congelación (liofilizado) que sólo
requiere la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo, agua
para las inyecciones, inmediatamente antes del uso. El vehículo
líquido estéril puede suministrarse en un vial o ampolla separado y
puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contiene, por
ejemplo, agua, etanol, poliol (p. ej., glicerol, propilenglicol y
polietilenglicol líquido), mezclas adecuadas de éstos y aceites
vegetales. De forma ventajosa, agentes tales como un anestésico
local, agentes conservantes y tamponadores pueden incluirse en el
vehículo líquido estéril.
Los agentes activos pueden formularse para
asegurar la distribución adecuada in vivo, por ejemplo, en
liposomas. Para métodos de fabricación de liposomas véanse,
p. ej., las patentes de EE.UU. 4.522.811; 5.374.548; y 5.399.331.
Los liposomas pueden comprender uno o más restos que se transportan
de forma selectiva dentro de células u órganos específicos,
aumentan de este modo la administración dirigida del fármaco
(véase, p. ej., Ranade, V. 1989, J Clin Pharmacol.
29:685).
Restos ejemplares dirigidos incluyen folato o
biotina (véase, p. ej., la patente de EE.UU. 5.416.016);
manósidos (Umezawa, et al., 1988, Biochem Biophys Res Comm.
153:1038); anticuerpos (Bloeman, P. et al., 1995, FEBS Lett.
357:140; Owais, M., et al., 1995, Antimicrob Agents
Chemother. 39:180); receptor de proteína A tensioactiva (Briscoe,
et al., 1995, Am J Physiol. 1233:134), diferentes especies de
las cuales comprenden las composiciones, así como componentes, de
los agentes activos; psi 20 (Schreier, et al., 1994, J Biol
Chem. 269:9090); véanse también Keinanen, K. y Laukkanen,
M., 1994, FEBS Lett. 346:123; Killion, J. y Fidler, I., 1994,
Immunomethods 4:273. Los agentes activos pueden formularse en
liposomas; más preferiblemente los liposomas incluyen un resto
dirigido. Lo más preferible, los agentes terapéuticos activos en los
liposomas se administran por inyección de bolo hasta un lugar
próximo al tumor.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para
administración tópica pueden formularse como pomadas, cremas,
suspensiones, lociones, polvos, soluciones, pastas, geles, apósitos
impregnados, nebulizadores, aerosoles o aceites, aparatos
transdérmicos, polvos de uso externo y similares. Estas
composiciones pueden prepararse vía los métodos convencionales que
contienen el agente activo. De este modo, éstos también pueden
comprender vehículos y aditivos convencionales tales como
conservantes, solventes para ayudar en la penetración del fármaco,
emolientes en cremas o pomadas y etanol o alcohol oleico para
lociones. Tales vehículos pueden estar presentes como desde
aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 98% de la
composición. Más habitualmente formarán hasta aproximadamente un
80% de la composición. Como ilustración solamente, una crema o
pomada se prepara mezclando cantidades suficientes de material
hidrofílico y agua, conteniendo entre aproximadamente
5-10% en peso del agente activo, en cantidades
suficientes para producir una crema o pomada que tiene la
consistencia deseada.
\newpage
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para
administración transdérmica pueden presentarse como parches
discretos que tienen el propósito de permanecer en contacto íntimo
con la epidermis del receptor durante un periodo de tiempo
prolongado. Por ejemplo, el agente activo puede distribuirse a
partir del parche mediante ionoforesis.
Para aplicaciones en tejidos externos, por
ejemplo la boca y piel, las composiciones se aplican preferentemente
como una pomada o crema tópica. Cuando se formula en una pomada, el
agente activo puede emplearse bien con una base de pomada
parafínica o miscible en agua. Alternativamente, el agente activo
puede formularse como una crema con una base de crema de aceite en
agua o una base de agua en aceite.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para
administración tópica en la boca incluyen grageas, comprimidos y
lavados bucales.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para
administración tópica en el ojo incluyen gotas de ojos en las que
el agente activo se disuelve o suspende en un vehículo adecuado,
especialmente un disolvente acuoso. Éstas también incluyen pomadas
o cremas tópicas como anteriormente.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para
administración rectal en las que el vehículo es un sólido se
presentan más preferiblemente como supositorios de dosis unitaria.
Vehículos adecuados incluyen mantequilla de cacao u otro glicérido
o materiales empleados frecuentemente en la técnica, y los
supositorios pueden estar convenientemente formados por mezcla de
la combinación con el(los) vehículo(s)
ablandador(es) o fundidor(es) seguido(s) por
moldes de refrigeración y moldeo. Éstas también pueden administrarse
como enemas.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para
administración vaginal pueden presentarse como pesarios, tampones,
cremas, geles, pastas, espumas o composiciones pulverizadas. Éstas
pueden comprender emolientes o bases según se emplean comúnmente en
la técnica.
El empleo de al menos un polipéptido RAIG1 en la
preparación de una composición farmacéutica para uso en el
tratamiento del carcinoma, p. ej., cáncer de mama, cáncer de
páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de ovario,
cáncer de colon y/u osteosarcoma puede proporcionarse.
Preferiblemente, polipéptidos RAIG1 recombinantes pueden emplearse
en la fabricación de una composición farmacéutica para el
tratamiento del carcinoma, p. ej., cáncer de mama, cáncer de
páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de ovario,
cáncer de colon y/u osteosarcoma. Particularmente, se proporciona
un polipéptido RAIG1 fusionado a otro polipéptido, tal como el
dominio de transducción de la proteína HIV/Tat, la cual facilita la
entrada de la proteína de fusión dentro de una célula (Asoh, S.,
et al., 2002, Proc Natl Acad Sci USA,
99:17107-17112) para usar en la fabricación de una
composición farmacéutica para el tratamiento del carcinoma, p. ej.,
cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de
hígado, cáncer de ovario, cáncer de colon y/u osteosarcoma.
Los polipéptidos RAIG1 recombinantes pueden
prepararse mediante procedimientos bien conocidos en la técnica a
partir de células hospedantes fabricadas por ingeniería genética que
comprenden sistemas de expresión. En consecuencia, el presente
invento también se refiere a sistemas de expresión que comprenden un
polipéptido RAIG1 o ácido nucleico RAIG1, a células hospedantes que
están fabricadas por ingeniería genética con tales sistemas de
expresión y a la producción de polipéptidos RAIG1 mediante técnicas
recombinantes. Los sistemas de traducción libres de células también
pueden emplearse para producir polipéptidos recombinantes (p. ej.,
lisado de reticulocitos de conejo, lisado de gérmen de trigo y los
kits de transcripción y traducción SP6/T7 in vitro T&T y
RTS 100 E. coli HY de Roche Diagnostics Ltd., Lewes, RU y el
sistema TNT Quick de transcripción/traducción acopladas de Promega
RU, Southampton, RU.
Para producir el polipéptido recombinante RAIG1,
las células hospedantes pueden fabricarse por ingeniería genética
para incorporar sistemas de expresión o partes de los mismos para
ácidos nucleicos RAIG1. Tal incorporación puede llevarse a cabo
empleando métodos bien conocidos en la técnica, tales como
transfección por fosfato cálcico, transfección mediada por
DEAD-dextrano, transvección, microinyección,
transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación,
transducción, carga de raspado, introducción balística o infección
(véase, p. ej., Davis et al., Basic Methods in
Molecular Biology, 1986 y Sambrook et al., Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory
Press, Cold Spring Harbour, NY, 1989).
Ejemplos representativos de células hospedantes
incluyen células bacterianas, p. ej., células de E. coli,
Streptococci, Staphylococci, Streptomyces y Bacillus
subtilis; células de hongos tales como céulas de levadura y
células de Aspergillus; células de insecto tales como células
de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células de
animales tales como CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, HEK 293, BHK y
células de melanoma de Bowes; y células de plantas.
Puede usarse una amplia variedad de sistemas de
expresión tales como, y sin limitación, sistemas derivados de
cromosomas, episomas y virus, p. ej., vectores derivados de
plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de transposones, de
episomas de levadura, de elementos de inserción, de elementos
cromosómicos de levaduras, de virus tal como baculovirus, papova
virus como SV40, virus vaccinia, adenovirus, virus de la viruela
aviar, virus de la pseudorrabia y retrovirus, y vectores derivados
de combinaciones de éstos, tal como los derivados de plásmidos y
elementos genéticos de bacteriófagos, como cósmidos y fagémidos. Los
sistemas de expresión pueden contener regiones control que regulan,
así como engendran expresión. Generalmente, puede emplearse
cualquier sistema o vector que es capaz de mantener, propagar o
expresar un ácido nucleico para producir un polipéptido en un
hospedante. La secuencia de ácido nucleico apropiada puede
insertarse dentro de un sistema de expresión por cualquier variedad
de las técnicas rutinarias y bien conocidas, tales como las
divulgadas en Sambrook et al., supra. Pueden
incorporarse en el polipéptido RAIG1 señales de secreción apropiadas
para permitir la secreción de la proteína traducida dentro del
lumen del retículo endoplásmico, del espacio periplásmico o del
medio extracelular. Estas señales pueden ser endógenas al
polipéptido RAIG1 o pueden ser señales heterólogas.
Los polipéptidos RAIG1 pueden proporcionarse de
forma aislada e incluir polipéptidos RAIG1 que se han purificado al
menos parcialmente. Los polipéptidos RAIG1 pueden producirse
empleando métodos recombinantes, producirse sintéticamente o
producirse por una combinación de estos métodos. Los polipéptidos
RAIG1 pueden proporcionarse en forma substancialmente pura, es
decir, libres, substancialmente, de otras proteínas. De este modo,
un polipéptido RAIG1 puede proporcionarse en una composición en la
que es el componente presente predominante (es decir, está presente
en un nivel de al menos el 50%; preferiblemente al menos el 75%, al
menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90% o al menos el 95%;
cuando se determina en base a peso/peso, excluyendo los disolventes
o excipientes).
Si se va a expresar un polipéptido RAIG1 para
usarse en ensayos de escrutinio basados en células, es preferible
que el polipéptido se produzca en la superficie celular. En este
evento, las células pueden recogerse antes de emplearse en el
ensayo de escrutinio. Si el polipéptido RAIG1 se segrega en el
medio, el medio puede recuperarse para aislar dicho polipéptido. Si
se produce intracelularmente, las células deben lisarse primero
antes de que el polipéptido RAIG1 se recupere.
Los polipéptidos RAIG1 pueden recuperarse y
purificarse a partir de cultivos de células recombinantes por
métodos bien conocidos, incluida precipitación por sulfato de amonio
o etanol, extracción en ácido, cromatografía de intercambio
aniónico o catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía
de afinidad, cromatografía de interacción hidrofóbica,
cromatografía de hidroxilapatita, cromatografía de tamizado
molecular, métodos de centrifugación, métodos de electroforesis y
cromatografía de lectina. Se emplea una combinación de estos
métodos. Alternativamente, se emplea cromatografía líquida de alta
resolución. Alternativamente, puede emplearse un anticuerpo que se
une específicamente a un polipéptido RAIG1 para vaciar una muestra
que contiene un polipéptido RAIG1 de dicho polipéptido o para
purificar dicho polipéptido. Pueden emplearse técnicas bien
conocidas en el campo del replegado hasta regenerar las
conformaciones nativa o activa de los polipéptidos RAIG1 cuando los
polipéptidos se han desnaturalizado durante el aislamiento y/o la
purificación.
El empleo de al menos un ácido nucleico de RAIG1
en la preparación de una composición farmacéutica para uso en el
tratamiento del carcinoma, p. ej., cáncer de mama, cáncer de
páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de ovario,
cáncer de colon y/u osteosarcoma puede proporcionarse.
Las moléculas de ácido nucleico que hibridan
RAIG1 pueden emplearse como moléculas antisentido, para alterar la
expresión de los polipéptidos RAIG1 al unirse a los ácidos nucleicos
complementarios de RAIG1 y pueden emplearse en el tratamiento o
prevención del carcinoma, p. ej., cáncer de mama, cáncer de
páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de ovario,
cáncer de colon y/u osteosarcoma. Un ácido nucleico antisentido
incluye un ácido nucleico de RAIG1 capaz de hibridar en virtud de
alguna complementariedad de secuencia a una parte de un ARN
(preferiblemente ARNm) que codifica un polipéptido RAIG1. El ácido
nucleico antisentido puede ser complementario a una región
codificante y/o no codificante de un ARNm que codifica dicho
polipéptido. Más preferiblemente, la expresión de un polipéptido
RAIG1 se inhibe mediante el empleo de ácidos nucleicos antisentido.
De este modo, puede proporcionarse el uso terapéutico o profiláctico
de ácidos nucleicos que comprenden al menos ocho nucleótidos que
son antisentido a un gen o ADNc que codifica un polipéptido
RAIG1.
Los síntomas del carcinoma pueden mejorarse por
disminución del nivel o actividad de un polipéptido RAIG1 empleando
secuencias génicas que codifican un polipéptido, según se define en
la presente memoria en conjunción con métodos bien conocidos de
"knock-out" génico, ribozimas o triple hélice
para disminuir la expresión génica del polipéptido. En esta
aproximación, las moléculas de ribozima o triple hélice se emplean
para modular la actividad, expresión o síntesis del gen y, por
tanto, para mejorar los síntomas del carcinoma. Tales moléculas
pueden diseñarse para reducir o inhibir la expresión de un gen
diana, mutante o no mutante. Las técnicas de producción y uso de
tales moléculas son bien conocidas para los expertos en el
campo.
La expresión endógena de polipéptido RAIG1 puede
reducirse también por inactivación o "knocking out" del gen
que codifica el polipéptido, o el promotor de tal gen, empleando
recombinación homóloga dirigida (p. ej., véase Smithies,
et al., 1985, Nature 317:230-234; Thomas y
Capecchi, 1987, Cell 51:503-512; Thompson et
al., 1989, Cell 5:313-321; y Zijlstra et
al., 1989, Nature 342:435-438). Por ejemplo, un
gen mutante que codifica un polipéptido no funcional (o una
secuencia de ADN completamente independiente) flanqueado por ADN
homólogo al gen endógeno (bien las regiones codificantes o regiones
reguladoras del gen que codifica el polipéptido) puede emplearse,
con o sin un marcador seleccionable y/o un marcador seleccionable
negativo, para transfectar células que expresan el gen diana in
vivo. La inserción del constructo de ADN, vía recombinación
homóloga dirigida, da como resultado la inactivación del gen
diana.
El ácido nucleico puede administrarse vía
terapia génica (véase, por ejemplo, Hoshida, T. et
al., 2002, Pancreas, 25:111-121; Ikuno, Y.
2002, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2002,
43:2406-2411; Bollard, C, 2002, Blood
99:3179-3187; Lee E., 2001, Mol. Med.
7:773-782). La terapia génica se refiere a la
administración a un individuo de un ácido nucleico expresado o
expresable. Cualquiera de los métodos de terapia génica disponibles
en la técnica puede emplearse de acuerdo con el presente invento. En
un aspecto, la composición farmacéutica comprende un ácido nucleico
de RAIG1, dicho ácido nucleico es parte de un vector de expresión
que expresa un polipéptido RAIG1 o proteína quimera del mismo en un
hospedante adecuado. En particular, tal ácido nucleico tiene un
promotor ligado operativamente a la región codificante del
polipéptido, siendo dicho promotor inducible o constitutivo (y,
opcionalmente, específico de tejido). Alternativamente, se emplea
una molécula de ácido nucleico en la que las secuencias
codificantes y cualesquiera otras secuencias deseables están
flanqueadas por regiones que promueven la recombinación homóloga en
un lugar deseado del genoma, proporcionando de este modo expresión
intracromosómica del ácido nucleico (Koller y Smithies, 1989, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA86:8932-8935; Zijlstra et
al., 1989, Nature 342:435-438).
La administración del ácido nucleico RAIG1 en un
paciente puede ser directa, en cuyo caso el paciente se expone
directamente al ácido nucleico o al vector que porta el ácido
nucleico; esta aproximación se conoce como terapia génica in
vivo. Alternativamente, la administración del ácido nucleico en
el paciente puede ser indirecta, en cuyo caso las células se
transforman primero con el ácido nucleico in vitro y entonces
se trasplantan en el paciente; esta aproximación se conoce como
terapia génica ex vivo.
Los ácidos nucleicos de RAIG1 pueden obtenerse
empleando técnicas de clonaje y escrutinio convencionales a partir
de una biblioteca de ADNc derivada de ARNm de células humanas,
empleando análisis de secuencias etiqueta expresadas (EST, del
inglés expressed sequence tag) (Adams, M. et al.,
1991, Science, 252:1651-1656; Adams, M. et
al., 1992, Nature 355:632-634; Adams, M. et
al., 1995, Nature, 377:supl:3-174). Los ácidos
nucleicos de RAIG1 pueden obtenerse también a partir de fuentes
naturales tales como bibliotecas de ADN genómicas o pueden
sintetizarse empleando técnicas bien conocidas y disponibles
comercialmente. Los ácidos nucleicos de RAIG1 que comprenden la
secuencia codificante para los polipéptidos RAIG1 descritos
anteriormente pueden emplearse para la producción recombinante de
dichos polipéptidos. Los ácidos nucleicos de RAIG1 pueden incluir la
secuencia codificante para el polipéptido maduro, por sí mismo; o
la secuencia codificante para el polipéptido maduro en fase de
lectura con otras secuencias codificantes, tales como las que
codifican una secuencia líder o secretora, una secuencia pre, pro o
prepro-proteína, una secuencia escindible u otras
partes de un péptido de fusión, tales como una etiqueta de afinidad
o una secuencia adicional que confiere estabilidad durante la
producción del polipéptido. Las etiquetas de afinidad preferidas
incluyen residuos múltiples de histidina (por ejemplo, véase
Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci USA
86:821-824), una etiqueta FLAG, etiqueta HA o
etiqueta myc. Los ácidos nucleicos de RAIG1 también pueden contener
secuencias no codificantes 5' y 3', tales como secuencias
transcritas no traducidas, señales de empalme y poliadenilación,
lugares de unión a ribosomas y secuencias que estabilizan el
ARNm.
Los derivados polipeptídicos de RAIG1, según se
refiere en la parte b) anterior, pueden crearse por introducción de
una o más sustituciones, adiciones o deleciones nucleotídicas dentro
de la secuencia nucleótida de un ácido nucleico de RAIG1, de modo
que una o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos
se introducen en la proteína codificada. Las técnicas estándares
conocidas por aquellos expertos en la técnica pueden emplearse para
introducir mutaciones, incluyendo, por ejemplo, mutagénesis dirigida
al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Preferiblemente, se
realizan sustituciones conservadoras de aminoácidos en uno o más
aminoácidos predichos como no esenciales.
Un ácido nucleico de RAIG1 que codifica un
polipéptido RAIG1, incluyendo homólogos y ortólogos de especies
distintas de la humana, puede obtenerse mediante un procedimiento
que comprende las etapas de escrutar una biblioteca apropiada bajo
condiciones de hibridación astringentes con una sonda marcada que
tiene la secuencia de un ácido nucleico de RAIG1 según se describe
en a)-c) anterior, y se aisla el ADNc de cadena
completa y los clones genómicos que contienen dicha secuencia de
ácido nucleico. Tales técnicas de hibridación se conocen bien en el
campo. Un ejemplo de condiciones de hibridación astringentes es
donde la hibridación intentada se lleva a cabo a una temperatura
desde aproximadamente 35ºC hasta aproximadamente 65ºC, empleando una
solución salina de aproximadamente 0,9 M. Sin embargo, la persona
experta será capaz de variar tales condiciones según sea apropiado
para tener en cuenta variables como la longitud de la sonda, la
composición de las bases, el tipo de iones presentes, etc. Para un
grado alto de selectividad se emplean condiciones relativamente
astringentes, como condiciones de baja sal o de temperatura
elevada, para formar los dúplex. Condiciones altamente astringentes
incluyen hibridación a ADN unido a filtro en 0,5 M de NaHPO_{4},
7% de sodio dodecil sulfato (SDS), 1 mM de EDTA a 65ºC y lavado en
0,1 x SSC/0,1% de SDS a 68ºC (Ausubel F.M. et al., eds.,
1989, Current Protocols in Molecular Biology, vol. I, Green
Publishing Associates, Inc., y John Wiley y Sons, Inc., Nueva York,
en el apartado 2.10.3). Para algunas aplicaciones, se requieren
condiciones menos astringentes para la formación del dúplex.
Condiciones moderadamente astringentes incluyen lavado en 0,2 x
SSC/0,1% de SDS a 42ºC (Ausubel et al., 1989, supra).
Las condiciones de hibridación pueden hacerse más astringentes
mediante la adición de cantidades crecientes de formamida para
desestabilizar el dúplex híbrido. De este modo, las condiciones de
hibridación particulares pueden ser fácilmente manipuladas y se
eligirán generalmente según convenga. En general, las temperaturas
convenientes de hibridación en presencia de 50% de formamida son:
42ºC para una sonda que es 95-100% idéntica al
fragmento de un gen que codifica un polipéptido según se define en
la presente memoria, 37ºC para una identidad del
90-95% y 32ºC para un 70-90% de
identidad.
Uno experto en la técnica entenderá que, en
muchos casos, una secuencia de ADNc aislada estará incompleta, en
tanto que la región codificante para el polipéptido está
interrumpida en el extremo 5' del ADNc. Esto es una consecuencia de
la transcriptasa reversa, una enzima que tiene inherentemente baja
procesividad (una medida de la capacidad de la enzima de permanecer
unida al molde durante la reacción de polimerización), y no logra
completar una copia de ADN del molde de ARNm durante la síntesis de
la 1ª cadena de ADNc.
Los métodos para obtener ADNc de cadenas
completas o para extender ADNc cortos se conocen bien en la técnica,
por ejemplo, RACE (siglas en inglés de rápida amplificación de los
extremos de ADNc; p. ej., Frohman et al., 1988, Proc. Natl.
Acad. Sci USA 85:8998-9002). Modificaciones
recientes de la técnica, ejemplificadas por la tecnología Marathon™
(Clonetech Laboratorios, Inc.) han simplificado significativamente
la búsqueda de ADNc más largos. Esta tecnología emplea ADNc
preparados a partir de ARNm extraído de un tejido elegido seguido
por la ligación de una secuencia adaptadora sobre cada extremo.
Entonces se lleva a cabo la PCR para amplificar el extremo 5' que
falta del ADNc empleando una combinación de cebadores
oligonucleótidos específicos de gen y específicos de adaptador. La
reacción de PCR se repite entonces empleando cebadores anidados que
se han diseñado para aparearse con el producto amplificado,
típicamente un cebador específico del adaptador que se aparea en 3'
más allá de la secuencia adaptadora y un cebador específico de gen
que se aparea en 5' más allá de la secuencia conocida del gen. Los
productos de esta reacción pueden analizarse entonces mediante
secuenciación de ADN y un ADNc de extensión completa se construye
bien por unión del producto directamente al ADNc existente para dar
una secuencia completa o llevando a cabo una PCR de extensión
completa separada empleando la nueva información de la secuencia
para el diseño del cebador en 5'.
Puede proporcionarse la composición de una
vacuna de uso en el tratamiento del carcinoma, p. ej., cáncer de
mama, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer
de ovario, cáncer de colon y/u osteosarcoma. Un polipéptido o ácido
nucleico RAIG1, según se describe con anterioridad, puede usarse en
la producción de vacunas para el tratamiento del carcinoma, p. ej.,
cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de
hígado, cáncer de ovario, cáncer de colon y/u osteosarcoma. Tal
material puede ser antigénico y/o inmunogénico. El antigénico
incluye una proteína o ácido nucleico que es capaz de usarse para
generar anticuerpos o en realidad es capaz de inducir una respuesta
humoral en un individuo. El material inmunogénico incluye una
proteína o ácido nucleico que es capaz de producir una respuesta
inmune en un individuo. De este modo, en el último caso, la
proteína o ácido nucleico puede ser capaz de generar no sólo una
respuesta humoral, sino, además, una respuesta inmune no basada en
anticuerpos, es decir, una respuesta celular o humoral. Se conoce
bien en la técnica que es posible identificar las regiones de un
polipéptido antigénico o inmunogénico que son responsables de la
antigenicidad o inmunogenicidad de dicho polipéptido, es decir, un
epítopo o epítopos. Las características de los aminoácidos y los
péptidos, bien conocidas para los expertos, pueden emplearse para
predecir el índice antigénico (una medida de la probabilidad de que
una región sea antigénica) de un polipéptido RAIG1. Por ejemplo,
aunque sin limitación, puede emplearse el programa
"Peptidestructure" (Jameson y Wolf, 1988, CABIOS,
4(1):181) y una técnica denominada "Threading" (Altuvia
Y. et al., 1995, J. Mol. Biol. 249:244). De este modo, los
polipéptidos RAIG1 pueden incluir uno o más de tales epítopos o ser
suficientemente similares a tales regiones como para retener sus
propiedades antigénicas/inmunogénicas.
Dado que un polipéptido o un ácido nucleico
puede descomponerse en el estómago, la composición de la vacuna
puede administrarse preferiblemente de forma parenteral (p. ej.,
inyección subcutánea, intramuscular, intravenosa o
intradérmica).
En consecuencia, puede proporcionarse:
- a)
- el uso de tal vacuna para inducir una respuesta inmune en un individuo; y
- b)
- un método para tratar el carcinoma, p. ej., cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de ovario, cáncer de colon y/u osteosarcoma, en un individuo, o para vacunar a un individuo frente al carcinoma, p. ej., cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de ovario, cáncer de colon y/u osteosarcoma, lo que comprende la etapa de administrar al individuo una cantidad eficaz de un polipéptido o ácido nucleico RAIG1, preferiblemente como una vacuna.
Puede proporcionarse un método para el
tratamiento del cáncer de mama, cáncer de colon y/u osteosarcoma en
un individuo, lo que comprende administrar a dicho individuo una
cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un anticuerpo que se
une específicamente a un polipéptido RAIG1, en el que el anticuerpo
está conjugado con un resto terapéutico o medicamentoso. Pueden
usarse anticuerpos que se unen específicamente a polipéptidos RAIG1
para inhibir la actividad de dichos polipéptidos.
En consecuencia, se proporciona el uso de un
anticuerpo que reconoce de forma específica un polipéptido RAIG1
para su uso en la preparación de una composición farmacéutica para
uso en el tratamiento del cáncer de mama, cáncer de colon y/u
osteosarcoma, en el que el anticuerpo se conjuga con un resto
terapéutico o medicamentoso.
Un anticuerpo conjugado con un resto terapéutico
puede emplearse como composición terapéutica que se administra sola
o en combinación con un(os) factor(es)
citotóxico(s) y/o citoquina(s). En particular, los
anticuerpos del invento se conjugan con un agente terapéutico o
resto medicamentoso para modificar una respuesta biológica dada. El
agente terapéutico o resto medicamentoso no debe interpretarse como
limitado a agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el
resto medicamentoso puede ser una proteína o polipéptido que posee
una actividad biológica deseada. Tales restos pueden incluir, por
ejemplo y sin limitación, una toxina como abrina, ricina A,
exotoxina de Pseudomonas o la toxina de la difteria; una
proteína tal como factor de necrosis tumoral, interferón \alpha,
interferón \beta, factor de crecimiento nervioso, factor de
crecimiento derivado de plaquetas, activador plasminógeno de
tejidos, un agente trombótico o un agente antiangiogénico, p. ej.,
angiostatina o endostatina; o un modificador de la respuesta
biológica tal como una linfoquina, interleuquina-1
(IL-1), interleuquina-2
(IL-2), interleuquina-6
(IL-6), factor estimulante de colonias de macrófagos
granulocitos (GM-CSF, del inglés granulocyte
macrophage colony stimulating factor), factor estimulante de
colonias de granulocitos (G-CSF, del inglés
granulocyte colony stimulating factor), factor de crecimiento
nervioso (NGF, del inglés nerve growth factor) u otros
factores de crecimiento. Otros restos terapéuticos pueden incluir
radionucleidos tales como ^{111}In e ^{90}Y; antibióticos, p.
ej., caliqueamicina; o fármacos tales como, aunque no limitados a,
alquilfosfocolinas, inhibidores de la topoisomerasa I, taxoides y
suramina.
Las técnicas para conjugar tales restos
terapéuticos con los anticuerpos se conocen bien en la técnica
(véase, p. ej., Arnon et al., "Monoclonal
Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en
Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al.
eds., 1985 pág. 243-56, ed. Alan R. Liss, Inc;
Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en
Controlled Drug Delivery, 2ª ed. Robinson et al. eds., 1987,
pág. 623-53, Marcel Dekker, Inc.; Thorpe,
"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A
Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical
Applications; Pinchera et al., 1985, eds., pág.
475-506; "Analysis, Results, And Future
Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabelled Antibody In
Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection
And Therapy, Baldwin et al. (eds.), 1985, pág.
303-16, Academic Press; Thorpe et al., 1982
"The Preparation And Cytotoxic Properties Of
Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev.,
62:119-58 y Dubowchik et al., 1999,
Pharmacology and Therapeutics, 83:67-123).
Un anticuerpo puede conjugarse con un segundo
anticuerpo para formar un anticuerpo heteroconjugado (véase
la patente de EE. UU. 4.676.980).
Pueden proporcionarse las proteínas de fusión de
los anticuerpos (o fragmentos funcionalmente activos del mismo),
por ejemplo, pero sin limitación, donde el anticuerpo o fragmento de
éste se fusiona vía un enlace covalente (p. ej., un enlace
peptídico) en el N-terminal o
C-terminal opcionalmente, a una secuencia de
aminoácidos de otra proteína (o parte de la misma; preferiblemente
al menos una parte de 10, 20 o 50 aminoácidos de la proteína).
Preferiblemente, el anticuerpo o su fragmento está ligado a la otra
proteína en el N-terminal del dominio constante
del anticuerpo. Según se establece anteriormente, tales proteínas de
fusión pueden facilitar la depleción o purificación de un
polipéptido según se describe en la presente memoria, aumentar la
vida media in vivo e intensificar la administración de un
antígeno a través de una barrera epitelial hasta el sistema
inmune.
Los polipéptidos RAIG1 o las células que los
expresan pueden emplearse entonces para producir anticuerpos, p.
ej., los que reconocen específicamente dichos polipéptidos RAIG1.
Reconocer específicamente o unirse específicamente significa que
los anticuerpos tienen mayor afinidad por los polipéptidos RAIG1 que
por otros polipéptidos. Los anticuerpos generados contra un
polipéptido RAIG1 pueden obtenerse administrando los polipéptidos a
un animal, preferiblemente a un animal no humano, empleando
protocolos rutinarios y bien conocidos.
En una realización adicional, el presente
invento proporciona el empleo de un anticuerpo que se une
específicamente al menos a un polipéptido RAIG1 para escrutar el
cáncer de mama, cáncer de colon y/u osteosarcoma en un individuo o
para monitorizar la eficacia de una terapia
anti-cáncer de mama, anti-cáncer de
colon y/o anti-osteosarcoma.
Los anticuerpos de RAIG1 pueden emplearse, entre
otras cosas, para el diagnóstico del carcinoma, p. ej., cáncer de
mama, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer
de ovario, cáncer de colon y/u osteosarcoma, mediante la detección
de la expresión de RAIG1 en tejido humano y/o en subfracciones del
mismo, por ejemplo, aunque sin limitación, subfracciones de
membrana, citosólicas o nucleares.
Los anticuerpos de RAIG1 incluyen fragmentos,
derivados o análogos funcionalmente activos y pueden ser, aunque no
están limitados a, anticuerpos policlonales, monoclonales,
biespecíficos, humanizados o quimeras, anticuerpos de cadena
sencilla, fragmentos Fab y fragmentos F(ab'), fragmentos
producidos por una biblioteca de expresión de Fab, anticuerpos
antiidiotipos (anti-Id) y fragmentos de unión al
epítopo de cualquiera de los anteriores. Los anticuerpos
humanizados son moléculas de anticuerpo de especies no humanas que
tienen una o más regiones determinantes de la complementariedad
(CDR, del inglés complementarity determining regions) de las
especies no humanas y una región entramado de una molécula de
inmunoglobulina humana (véase, p. ej., la patente de EE. UU.
5.585.089). Los anticuerpos incluyen moléculas de inmunoglobulina y
partes activas inmunológicamente de moléculas de inmunoglobulinas,
es decir, moléculas que contienen un lugar de unión a antígeno que
une específicamente un antígeno. Las moléculas de inmunoglobulinas
del invento pueden ser de cualquier clase (p. ej., IgG, IgE, IgM,
IgD e IgA) o subclase de molécula de inmunoglobulina.
Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse
por cualquier método conocido en la técnica, tal como la técnica
del hibridoma (Kohler y Milstein, 1975, Nature,
256:495-497), la técnica del trioma, la técnica del
hibridoma de célula B humana (Kozbor et al., 1983,
Immunology Today, 4:72) y la técnica del
EBV-hibridoma (Cole et al., Monoclonal
Antibodies and Cancer Therapy, pág. 77-96, Alan R
Liss, Inc., 1985).
Los anticuerpos quimeras son aquellos
anticuerpos codificados por genes de inmunoglobulinas que se han
fabricado por ingeniería genética, de modo que los genes de la
cadena ligera y pesada se componen de segmentos de genes de
inmunoglobulinas que pertenecen a diferentes especies. Estos
anticuerpos quimera son probablemente menos antigénicos. Los
anticuerpos biespecíficos pueden construirse mediante métodos
conocidos en la técnica (Milstein et al., 1983, Nature
305:537-539; documento WO 93/08829, Traunecker et
al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659).
\newpage
Los anticuerpos para uso en el presente invento
pueden generarse también empleando varios métodos de exposición en
fago conocidos en la técnica e incluyen los descritos por Brinkman
et al. (en J. Immunol. Methods, 1995,
182:41-50), Ames et al. (en J. Immunol.
Methods, 1995, 184:177-186), Kettleborough et
al. (en Eur. J. Immunol. 1994, 24:952-958),
Persic et al. (Gene. 1997, 187:9-18), Burton
et al., (en Advances in Immunology, 1994,
57:191-280) y en los documentos WO 90/02809; WO
91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO
95/20401; y en las patentes de EE.UU. 5.698.426; 5.223.409;
5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698;
5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 y 5.969.108.
Las técnicas para producir anticuerpos de cadena sencilla, tales
como las descritas en la patente de EE.UU. 4.946.778 también pueden
adaptarse para producir anticuerpos de cadena sencilla a
polipéptidos NKCC1. También, ratones transgénicos u otros
organismos, incluyendo otros mamíferos, pueden usarse para expresar
anticuerpos humanizados.
La detección de la interacción de un anticuerpo
con un antígeno puede facilitarse por acoplamiento del anticuerpo a
una sustancia detectable, por ejemplo, aunque sin limitación, una
enzima (como peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina,
beta-galactosidasa, acetilcolinesterasa), un grupo
prostético (como estreptavidina, avidina, biotina), un material
fluorescente (como umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de
fluoresceína, rodamina, fluoresceína de amina de diclorotriazinilo,
cloruro de dansilo, ficoeritrina), un material luminiscente (como
luminol), un material bioluminiscente (como luciferasa, luciferina,
aecuorina), un nucleido radiactivo (como ^{125}I, ^{131}I,
^{111}In, ^{99}Tc), un metal que emite positrones o un ión
metálico paramagnético no radiactivo (véase la patente de
EE.UU. 4.741.900).
Los anticuerpos del invento incluyen análogos y
derivados que están modificados, por ejemplo, aunque sin limitación,
por la adhesión covalente de cualquier tipo de molécula.
Preferiblemente, dicha adhesión no impide la unión
inmunoespecífica.
En compendio, el invento además proporciona el
uso de un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido
RAIG1 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del
cáncer de mama, cáncer de colon y/u osteosarcoma, en el que el
anticuerpo está conjugado con un resto terapéutico o
medicamentoso.
El invento se describirá ahora con referencia a
los ejemplos siguientes, los cuales son meramente ilustrativos y no
deberían de ningún modo interpretarse como limitantes del alcance
del presente invento. Los ejemplos se refieren a las figuras en las
que:
La Figura 1 muestra la secuencia de la proteína
RAIG1 (RAIG1; AAC98506/O95357), SEQ ID nº 1. Los péptidos del
espectro de masas en tándem están en fuente negrita, subrayada; los
péptidos del espectro de masa MALDI están en fuente negrita).
La Figura 2 muestra la secuencia del ácido
nucleico de RAIG1 (RAIG1; AF095448), SEQ ID nº 2.
La Figura 3 muestra la distribución del ARNm de
RAIG1 en tejidos emparejados adyacentes normales (un número seguido
por la letra N) y tumorales de mama (un número seguido por la letra
T) de pacientes; los niveles de ARNm se cuantificaron por
RT-PCR en tiempo real y se expresaron como el número
de copias ng^{-1} de ADNc.
La Figura 4 muestra la distribución del ARNm de
RAIG1 en tejidos emparejados normales (un número seguido por la
letra N) y tumorales de colon (un número seguido por la letra T);
los niveles de ARNm se cuantificaron por RT-PCR en
tiempo real y se expresaron como el número de copias ng^{-1} de
ADNc.
La Figura 5 muestra la distribución del ARNm de
RAIG1 en 3 muestras de tejido emparejado normal (norm) y en 8 de
tumores pancreáticos; los niveles de ARNm se cuantificaron por
RT-PCR en tiempo real y se expresaron como el
número de copias ng^{-1} de ADNc.
La Figura 6 muestra la distribución del ARNm de
RAIG1 en tejidos tumorales de mama. Se obtuvieron 40 muestras
tumorales de pacientes con (barras negras) o sin (barras blancas)
metástasis de los ganglios linfáticos; también se muestran 2
muestras de tejido de mama normal (barras grises). Los niveles de
ARNm se cuantificaron por RT-PCR en tiempo real y
se expresaron como el número de copias ng^{-1} de ADNc.
La Figura 7 muestra la distribución del ARNm de
RAIG1 en tejido normal de pulmón y en 6 muestras de cáncer de
pulmón; los niveles de ARNm se cuantificaron por
RT-PCR en tiempo real y se expresaron como el número
de copias ng^{-1} de ADNc.
La Figura 8 muestra la distribución del ARNm de
RAIG1 en tejido normal de ovario y médula ósea, en líneas celulares
de ovario y osteosarcoma, en 5 muestras de cistadenocarcinoma seroso
de ovario, en 6 muestras de adenocarcinoma de ovario y en 3
muestras de osteosarcoma; los niveles de ARNm se cuantificaron por
RT-PCR en tiempo real y se expresaron como el
número de copias ng^{-1} de ADNc.
\newpage
Ejemplo
1
Las proteínas de las membranas de las líneas
celulares de mama, riñón, páncreas e hígado se separaron mediante
SDS-PAGE y se analizaron.
La línea celular de tumor pancreático HPAFII se
cultivó en EMEM + 2 mM de glutamina + 1 mM de NaPyr + 1% de NEAA +
10% de FBS + 1,5 g/l de bicarbonato sódico. La línea celular de
tumor pancreático Capan2 se cultivó en medio McCoy + 2 mM de
glutamina + 10% de FBS + 1,5 g/l de bicarbonato sódico (Capan2).
Las líneas celulares de cáncer de mama T47D y
MCF7pool se cultivaron en medio DMF12 que contenía 10% de suero
bovino fetal, 2 mM de glutamina y 1% de
penicilina/estreptomicina.
La líneas celulares de cáncer hepático SK
3B2.1-7 y SKHep1pool se cultivaron en EMEM + 2 mM de
glutamina + 1 mM de NaPyr + 1% de NEAA + 10% de FBS.
Las líneas celulares de cáncer renal empleadas
fueron CAK12 + A498 + SW839 + CAK12pool. CAK12 se cultivó en medio
McCoy + 2 mM de glutamina + 10% de FBS, las células A498 y SW839 se
cultivaron en DMEM + 2 mM de glutamina + 10% de FBS. Todas las
células se cultivaron a 37ºC en una atmósfera humidificada del 95%
de aire y el 5% de dióxido de carbono.
Las preparaciones de membranas purificadas se
aislaron a partir de las líneas celulares. Las células adherentes
(2 x 10^{8}) se lavaron tres veces con PBS y se rasparon empleando
un recolector celular de plástico. Las células se centrifugaron a
1.000 x g durante 5 min a 4ºC y el sedimento de células se
resuspendió en tampón de homogeneización (250 mM de sacarosa, 10 mM
de HEPES, 1 mM de EDTA, 1 mM de vanadato y 0,02% de azida,
inhibidores de proteasas). Las células se fraccionaron empleando un
homogenizador de soporte de bolas (bola de 8,002 mm, del equipo HGM
Lab) hasta que aproximadamente el 95% de las células se rompió. Las
membranas se fraccionaron empleando el método descrito por
Pasquali, C. et al., (1999, J. Chromatography
722:89-102). Las células fraccionadas se
centrifugaron a 3.000 x g durante 10 min a 4ºC y el sobrenadante
postnuclear se estratificó sobre un colchón de 60% de sacarosa y se
centrifugó a 100.000 x g durante 45 min. Las membranas se recogieron
empleando una pipeta pasteur y se estratificaron sobre un gradiente
previamente formado del 15% al 60% de sacarosa y se centrifugaron a
100.000 x g durante 17 horas. Las proteínas del gradiente de
sacarosa fraccionado se migraron en un gel 1D del
4-20% (Novex) y se sometieron a transferencia
Western; las fracciones que contenían fostatasa alcalina y
transferrina inmunorreactivas, pero no oxidorreductasa II o
calnexina inmunorreactiva, se agruparon y representaron la fracción
de membranas plasmáticas.
Se identificaron las fracciones de membrana
plasmática que presentaban inmunorreactividad a transferrina, pero
sin inmunorreactividad a oxidorreductasa II ni calnexina. Estas
fracciones de sacarosa se agruparon y se diluyeron al menos cuatro
veces con 10 mM de HEPES, 1 mM de EDTA, 1 mM de vanadato, 0,02% de
azida. La fracción diluida de sacarosa se añadió a un tubo SW40 o
SW60 y se centrifugó a 100.000 x g durante 45 min con aceleración y
desaceleración bajas. El sobrenadante se eliminó del sedimento de
membranas y el sedimento se lavó tres veces con
PBS-CM. El sedimento de membranas se solubilizó en
2% de SDS en 63 mM de TrisHCl a pH 7,4. Se realizó un ensayo de
proteína seguido de la adición de mercaptoetanol (2% final),
glicerol (10%) y se añadió azul de bromofenol (0,0025% final). Se
empleó una concentración final de proteína de 1 \mug/\mul para
la carga del gel 1D.
La proteína o sedimentos de membranas se
solubilizaron en tampón de muestra 1D (aproximadamente 1 mg/ml) y
la mezcla se calentó a 95ºC durante 5 min.
Las muestras se separaron empleando
electroforesis en gel 1D sobre geles en gradiente
8-16% previamente montados adquiridos de
Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hemel
Hempstead, RU). Una muestra que contenía 30-50
microgramos de las mezclas de proteínas obtenidas a partir de un
extracto de detergente se aplicaron a los pocillos del gel de
empaquetamiento empleando una micropipeta. Un pocillo que contenía
marcadores de peso molecular (10, 15, 25, 37, 50, 75, 100, 150 y
250 kDa) se incluyó para calibrar por interpolación del gel
separador tras formación de la imagen. La separación de las
proteínas se llevó a cabo aplicando una corriente de 30 mA al gel
durante aproximadamente 5 horas o hasta que el colorante del
marcador azul de bromofenol hubiese alcanzado el final del gel.
\newpage
Después de la electroforesis las placas del gel
se abrieron a palanca, el gel se colocó en un recipiente de fijador
(10% de ácido acético, 40% de etanol, 50% de agua) y se agitó
durante toda la noche. El gel entonces se imprimó durante 30
minutos por agitación en una solución de imprimación (7,5% de ácido
acético, 0,05% de SDS en agua Milli-Q) seguido por
incubación con un colorante fluorescente (0,06% de colorante OGS en
7,5% de ácido acético) con agitación durante 3 h. Se describe un
colorante fluorescente preferido en la patente de EE.UU. 6.335.446.
El rojo de Sypro (Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregón) es un
colorante alternativo adecuado para este propósito.
Una imagen digital del gel teñido se obtuvo
mediante escaneo en un escáner Storm (Molecular Dynamics Inc.,
EE.UU.) en el modo de fluorescencia azul. La imagen capturada se
empleó para determinar el área del gel a cortar para la proteólisis
en gel.
Una calle vertical del gel correspondiente a 77
kDa se cortó empleando una cuchilla de escalpelo de acero
inoxidable o un cortador de geles PEEK (OGS) que reduce
secuencialmente la longitud de la calle del gel sin intentar
recoger bandas de proteínas específicas.
Las proteínas se procesaron empleando digestión
del gel con tripsina (tripsina modificada, Promega, Winsconsin,
EE.UU.) para generar péptidos por digestión tríptica. Las muestras
recuperadas se dividieron en dos. Antes del análisis MALDI las
muestras se desalaron y se concentraron empleando C18 Zip Tips™
(Millipore, Bedford, MA). Las muestras para la espectrometría de
masa en tándem se purificaron empleando un sistema nano LC (LC
Packings, Ámsterdam, Holanda) que incorpora material C18 SPE. Las
agrupaciones de los péptidos recuperados se analizaron por
espectrometría de masas MALDI-TOF (Voyager STR,
Applied Biosystems, Framingham, MA) empleando un láser de 337 mm de
longitud de onda para la deserción y el modo de análisis reflectron.
Las agrupaciones se analizaron también por espectrometría de masas
en tándem nano-LC (LC/MS/MS) empleando un
espectrómetro de masas Micromass Quadrupole
Time-of-Flight
(Q-TOF, Micromass, Altrincham, RU). Para la
secuenciación parcial de los aminoácidos y la identificación de
proteínas de la membrana de células de cáncer de hígado y pulmón se
buscaron espectros de masa en tándem no interpretados de péptidos
trípticos frente a una base de datos de proteínas de dominio
público construida de entradas de proteínas en la base de datos no
redundante mantenida por el Centro Nacional de Información
Biotecnológica (NCBI, del inglés Nacional Centre for
Biotechnology Information) que está accesible en
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, empleando el programa de
búsqueda SEQUEST (Eng et al., 1994, J. Am. Soc. Mass
Spectrom. 5:976-989), versión v.C.1. Los criterios
para la identificación de la base de datos incluyeron: la escisión
específica de la tripsina y la detección de una serie de iones a, b
e y en los péptidos devueltos de la base de datos. Tras la
identificación de las proteínas a través de la correlación
espectral-espectral empleando el programa SEQUEST,
las masas detectadas en los espectros de masas
MALDI-TOF se asignaron a los péptidos obtenidos por
digestión tríptica dentro de las proteínas identificadas. En los
casos en los que no se pudieron identificar las secuencias de
aminoácidos a través de la búsqueda de los péptidos obtenidos por
digestión tríptica con espectros MS/MS no interpretados empleando el
programa SEQUEST, se interpretaron manualmente los espectos de
masas en tándem de los péptidos empleando métodos conocidos en la
técnica. (En el caso de interpretación de espectros de masas por
fragmentación de baja energía de iones peptídicos véase
Gaskell et al., 1992, Rapid Commun. Mass Spectrom.
6:658-662). El método descrito en el documento WO
02/21139 se empleó también para interpretar los espectros de
masas.
Se encontró que dos espectros en tándem
(mostrados en negrita y subrayados en la Figura 1) y 1
correspondencia de masa (mostrada en negrita en la Figura 1) se
emparejaban con los números de acceso al GenBank AF095448 y
AAC98506, y al SwissProt O95357.
Ejemplo
2
Se empleó RT-PCR en tiempo real
para medir cuantitativamente la expresión de RAIG1 en una gama de
tejidos tumorales y sus correspondientes controles. Se obtuvo la
aprobación ética de las muestras de tejido normal y tumoral de mama
en la cirugía (Universidad de Oxford, RU). Se obtuvieron muestras de
colon, pulmón, cistadenocarcinoma seroso de ovario, adenocarcinoma
de ovario, muestras de osteosarcoma metastásico y de tumor
pancreático de Ardais Corp., Banco de Tejidos de Peterborough,
Banco de Tejido de Investigación Humana, Hospital del Distrito de
Peterborough, RU y Clinomics Biosciences Inc., MD. Los cebadores
empleados para PCR fueron como sigue:
| Sentido, | 5' - ctcgtgaagaagagctatggtc - 3', | (SEQ ID nº 3) |
| Antisentido, | 5' - cactcttcaggacagagttagc - 3' | (SEQ ID nº 4) |
Reacciones con 5 ng de ADNc, reactivos de
detección de la secuencia verde SYBR (PE Biosystems) y cebadores
sentido y antisentido se sometieron a ensayo en un sistema de
detección de secuencias ABI7700 (PE Biosystems). Las condiciones de
PCR fueron 1 ciclo a 50ºC durante 2 min, 1 ciclo a 95ºC durante 10
min y 40 ciclos a 95ºC durante 15 s, 65ºC durante 1 min. La
acumulación del producto de PCR se midió en tiempo real como el
incremento de la fluorescencia verde SYBR y los datos se analizaron
empleando un programa Detector de Secuencia v1.6.3 (PE Biosystems).
Las curvas estándar relacionando el número de copias del molde
inicial con la fluorescencia y el ciclo de amplificación se
generaron empleando el producto amplificado de PCR como molde y se
emplearon para calcular el número de copias de RAIG1 en cada
muestra.
Se observaron niveles de expresión de RAIG1
relativamente bajos en los tejidos normales (Figuras
3-8; obsérvese que las escalas entre las Figuras
son diferentes).
En contraste, los niveles de expresión de RAIG1
estaban aumentados en las muestras de tumor de mama relativo a sus
controles correspondientes, con 5/7 muestras de tumor mostrando
niveles de expresión enormemente elevados por ng de ADNc (Figura
3).
La expresión de RAIG1 se examinó en trece
muestras de tumores de colon y se observó un aumento de la expresión
en diez muestras relativas a una muestra control de colon normal,
con dos muestras mostrando poco cambio y una muestra de tumor
mostrando una pequeña reducción (Figura 4). En las muestras de
tumores pancreáticos, se observó un aumento de la expresión del
ARNm de RAIG1 en seis de las ocho muestras tumorales relativas al
tejido pancreático control (Figura 5). En las muestras de tumores de
pulmón, 4/6 muestras mostraron un aumento de la expresión de RAIG1
relativo a una muestra control de tejido de pulmón (Figura 7).
Además, se investigó la expresión de RAIG1 en
muestras de tejido de mama de 20 pacientes con metástasis en los
nódulos linfáticos y de 20 pacientes sin metástasis en los nódulos
linfáticos. No se observaron diferencias significativas entre los
dos grupos, aunque una comparación con las muestras de tejido normal
indica que RAIG1 está elevada en gran proporción de los pacientes
con y sin metástasis en los nódulos linfáticos cuando se comparaban
a los controles (Figura 6).
La expresión del ARNm de RAIG1 se examinó en 5
muestras de cistadenocarcinoma seroso de ovario, 6 muestras de
adenocarcinoma de ovario, 3 muestras de osteosarcoma metastásico y
en tejido y líneas celulares control. Se observó un aumento en los
niveles de expresión del ARNm de RAIG1 en 2/6 de las muestras de
adenocarcinoma de ovario y en 2/3 de las muestras de osteosarcoma
metastásico, pero no se observó aumento en las muestras de
cistadenocarcinoma seroso de ovario (Figura 8).
Estos datos demuestran que RAIG1 se expresa en
muchas de las líneas celulares tumorigénicas, incluidas líneas
celulares de mama, hígado y páncreas y que está aumentado en una
selección de carcinomas, incluido cáncer de mama, cáncer de colon,
adenocarcinoma de ovario, osteosarcoma, cáncer de pulmón y cáncer de
páncreas, lo que indica que RAIG1 es probablemente de utilidad como
una diana del carcinoma. Este hallazgo no podía haberse predicho a
partir de hallazgos previamente descritos sobre los niveles de
expresión de ARNm de RAIG1; RAIG1 fue inicialmente identificado
empleando expresión diferencial como el ADNc de un nuevo gen con
niveles elevados de expresión del ARNm en tejidos de pulmón fetales
y adultos (Cheng, Y. y Lotan, R., 1998, J. Biol. Chem.
273:35008-35015). Se ha publicado que su expresión
se induce por el ácido transretinoico (ATRA). Tres de cinco líneas
celulares de cáncer de cabeza y cuello y cuatro de pulmón que tenían
bajos niveles de ARNm de RAIG1 exhibieron aumento del ARNm tras
tratamiento con ATRA (Cheng y Lotan, anteriormente), sin embargo,
los niveles de expresión de RAIG1 demostrados por estos autores
fueron extremadamente variables (desde niveles de expresión
indetectables hasta elevados). Otro grupo ha descrito que RAIG1
muestra un patrón de expresión restringido con la máxima abundancia
en el tejido pulmonar (Brauner-Osbourne, H. y
Krogsgaard-Larsen, P. 2000, Genomics,
65:121-128); en contraste, aunque los autores de la
presente memoria encontraron niveles bajos de expresión en las
muestras de tejido control no encontraron una expresión más elevada
de ARNm de RAIG1 en tejido de pulmón normal, particularmente cuando
los compararon con los niveles exhibidos por las muestras tumorales.
Por tanto, estos resultados demuestran claramente un aumento de la
expresión del ARNm de RAIG1 en una variedad de tipos de carcinoma,
lo que indica su utilidad en el diagnóstico, tratamiento y/o
profilaxis del carcinoma, p. ej., cáncer de mama, cáncer de
páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de ovario,
cáncer de colon y/u osteosarcoma, lo que no hubiera sido obvio a
partir de la bibliografía.
<110> Oxford GlycoSciences (UK) Ltd
\hskip1cmTerrett, Jonathan A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Una proteína implicada en el
carcinoma
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P0180-WO01
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> GB0208331.9
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-04-11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> GB0221538.2
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-09-17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 357
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Proteína
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2.302
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcgtgaaga agagctatgg tc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador
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<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcactcttcag gacagagtta gc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (8)
1. Un método para escrutar el cáncer de mama, el
cáncer de colon y/o el osteosarcoma en un individuo, y/o para
monitorizar la eficacia de una terapia anti-cáncer
de mama, anti-cáncer de colon y/o
anti-osteosarcoma, el cual comprende la etapa de
detectar y/o cuantificar, en una muestra biológica obtenida de dicho
individuo, un polipéptido RAIG1 que comprende o consiste en la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID nº 1, en el que dicho
polipéptido RAIG1 se detecta y/o se cuantifica empleando un
anticuerpo que se une específicamente a dicho polipéptido
RAIG1.
2. El método de la reivindicación 1, en el que
el nivel de dicho polipéptido se compara con un intervalo de
referencia determinado previamente o control.
3. El método, de acuerdo con la reivindicación 1
o 2, en el que el anticuerpo se inmoviliza sobre una fase
sólida.
4. El empleo de un anticuerpo que se une
específicamente a un polipéptido RAIG1, según se define en la
reivindicación 1, en la fabricación de un medicamento para tratar el
cáncer de mama, el cáncer de colon y/o el osteosarcoma, en el que
el anticuerpo se conjuga con un resto terapéutico o
medicamentoso.
5. El empleo, de acuerdo con la reivindicación
4, en el que el anticuerpo es policlonal, monoclonal, quimérico,
humanizado o biespecífico, o un fragmento de unión al epítopo de uno
cualquiera de ellos.
6. El empleo, de acuerdo con la reivindicación 4
o 5, en el que el resto terapéutico o medicamentoso es un
radionucleido o una toxina.
7. Un método para escrutar el cáncer de mama, el
cáncer de colon y/o el osteosarcoma en un individuo y/o para
monitorizar la eficacia de una terapia anti-cáncer
de mama, anti-cáncer de colon y/o
anti-osteosarcoma, el cual comprende la etapa de
detectar en una muestra biológica obtenida de dicho individuo un
ácido nucleico que:
- a)
- comprende o consiste en la secuencia de ADN de SEQ ID nº 2, o en su ARN equivalente;
- b)
- tiene una secuencia que es complementaria a una secuencia de a); o
- c)
- tiene una secuencia que codifica para un polipéptido, según se define en la reivindicación 1.
8. El método de la reivindicación 7, en el que
el nivel de dicho ácido nucleico se compara con un intervalo de
referencia determinado previamente o control.
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| GB0208331 | 2002-04-11 | ||
| GB0208331A GB0208331D0 (en) | 2002-04-11 | 2002-04-11 | Proteins |
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