JP2007523836A - 転移ヒト腫瘍細胞で発現される糖タンパク質抗原sima135 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、概括的には哺乳類、例えばヒトにおける癌の診断および癌細胞による転移を減少させる方法に関するものである。さらに具体的には、本発明は、腫瘍マーカータンパク質の使用による、細胞におけるタンパク質生成増加の検出に使用され得る抗体の生成、および抗体の使用による、腫瘍マーカータンパク質を生産する癌細胞による転移の低減化に関するものである。
悪性腫瘍は、新しい組織へ移動し、二次腫瘍を生じさせる細胞を散らすが、良性腫瘍が二次腫瘍を生じさせることは無い。二次腫瘍を発生させる過程は転移と呼ばれ、腫瘍細胞が一次腫瘍からは遠い部位でコロニーを形成する複雑な過程である。腫瘍転移は、依然として癌患者における主たる死亡原因であるが、腫瘍細胞播種の根底にある分子機構についてまだはっきりとは理解されていない。
本発明は、転移細胞で生産されるタンパク質(SIMA135)(配列番号1)の同定および特性確認に関するものである。従って、本発明は、SIMA135のグリコシル化および非グリコシル化形態を提供する。本発明はまた、SIMA135およびSIMA135のフラグメントに特異的かつ選択的に結合する抗体を提供する。これらの抗体は、グリコシル化または非グリコシル化形態であるSIMA135またはSIMA135のフラグメントに結合し得る。従って、本発明は、SIMA135に特異的に結合する抗体の使用を通じて癌細胞の転移を阻止、低減化または排除する方法を提供する。本発明はまた、癌の診断方法および試験試料中における癌細胞の存在の測定方法を提供する。これらの方法は、哺乳類、例えばヒトに関して使用され得る。本発明はまた、SIMA135およびSIMA135のフラグメントに特異的かつ選択的に結合する抗体を含む医薬組成物およびキットを提供する。本発明はまた、細胞によるSIMA135の生産を調節する薬剤についてのスクリーニング方法を提供する。
図1はSIMA135のアミノ酸配列を示す。シグナル配列は小文字で書かれており、推定される貫膜ドメインは四角に囲まれている。12の共通N−グリコシル化モチーフは、黒三角で示されている。細胞質チロシン残基は円で囲まれている。残基221〜348および417〜544に及ぶと考えられるCUBドメインには下線が付されている。トリプシン消化および配列決定から同定される3ペプチドには、上に線が引かれている。ペプチド2に先行するArg残基およびペプチド3に先行するLysについては、四角で囲むことにより、Arg/Lys含有基質についてのトリプシン特異性との一致を強調している。細胞質ドメインPXXP配列には下線が付されている。推定される貫膜ドメインの後の共通パルミチル化モチーフは、黒丸により示されている。推定される貫膜ドメインの後の共通パルミチル化モチーフは、黒丸により示されている。
本発明は、41−2と称されるモノクローナル抗体を用いたサブトラクティブ免疫を通じて転移性HEp3細胞から精製されたグリコシル化タンパク質の発見に関するものである。このタンパク質は、SIMA135と称される(サブトラクティブ免疫M+HEp3結合135kDaタンパク質)。
本発明は、グリコシル化されているかまたは非グリコシル化形態であり得るSIMA135タンパク質(配列番号1)、SIMA135のフラグメント、およびSIMA135の変異型を提供する。SIMA135のこれらのタンパク質、フラグメントおよび変異型は、SIMA135に結合する抗体、例えばSIMA135に特異的および/または選択的に結合する抗体の産生を誘導する抗原として使用され得る。上記選択的結合抗体には、SIMA135またはSIMA135の一部分に結合するが、SIMA135またはSIMA135のフラグメントではないタンパク質およびタンパク質のフラグメントには結合しないものが含まれる。またこれらのタンパク質、フラグメントおよび変異型は、SIMA135に特異的および選択的に結合する抗体を選択するのに使用され得る。上記の特異的および選択的結合抗体には、SIMA135またはSIMA135の一部分には結合するが、SIMA135またはSIMA135のフラグメントではないタンパク質およびタンパク質のフラグメントには結合しないものが含まれる。特に、上記抗体の選択性は、米国特許第6498014号に記載されているところによると、それらがSIMA135またはSIMA135の一部分には結合するが、転移性Hep−3細胞ライゼートから生産される180kDaのタンパク質には結合しないことを意味し、その場合の解離定数はSIMA135またはそのフラグメントへの結合によるものと同じ桁数であるが、180kDaタンパク質との上記抗体の結合は、SIMA135またはそのフラグメントとの結合についての上記定数より少なくとも2桁大きい解離定数で行われ得る。上記抗体の特異性は、免疫原性結合が、エピトープ−超可変領域相互作用の結果であって、非特異的タンパク質−タンパク質相互作用の結果ではないことを意味する。非特異的タンパク質−タンパク質相互作用は、典型的にはエピトープ−超可変領域相互作用の特異的結合についての解離定数よりも少なくとも3桁大きい解離定数を有する。抗体−抗原免疫結合対についての解離定数は、Harlow et al.、Antibodies: A Laboratory Manual(コールドスプリングハーバー・パブリッシング、1988)に記載された技術に従って決定され得、これについては出典明示により援用する。
本発明は、SIMA135に結合する抗体を提供する。医薬組成物で使用されるのに好ましい抗体には、腫瘍転移を阻害する抗体がある。腫瘍転移の阻害は、多くの検定法、例えば移動検定法、侵入検定法またはニワトリ漿尿膜検定法により測定され得る。
本発明はまた、転移性腫瘍の処置方法を含む。「転移性腫瘍を処置する」とは、腫瘍の転移を予防、遅延または阻止することを意味する。転移性腫瘍は、転移可能である原発部位での腫瘍および二次部位での転移腫瘍の両方を包含する。上記転移性腫瘍は、肺、肝臓、腎臓、乳腺、上皮、甲状腺、白血病、膵臓、子宮内膜、卵巣、子宮頚部、皮膚、結腸およびリンパ系組織などの組織に由来するものであり得る。処置され得る対象は、マウス以外のヒト、イヌ、サル、ウシ等を含む哺乳類対象であり得る。
本発明はまた、SIMA135の発現を検出することによる、対象における転移性腫瘍の診断方法を含む。
本発明は、SIMA135に結合する抗体およびパッケージング材料を含むキットを提供する。上記キットは、癌の処置および検出に使用され得る抗体の輸送および貯蔵に有用である。具体的には、上記キットは、生物体から得られた組織試料における転移性癌を検出するために研究室における医療関係者により使用され得る。さらに、上記キットは、本発明抗体を含む医薬組成物を処方する場合に医療関係者にとって有用であり得る。
本発明の医薬組成物は、医薬組成物として処方され、選択された投与経路、すなわち経口または非経口、静脈内、筋肉内、局所または皮下経路に適合化された様々な形態で動物宿主、例えばヒト患者に投与されるSIMA135に結合する抗体を含むものである。
本発明は、細胞によるSIMA135の生産を増加または減少させる薬剤の同定方法を提供する。一般的に、本方法では、試験細胞を候補薬剤と接触させ、試験細胞によるSIMA135の生産が、候補薬剤と接触させなかった対照細胞に対して増加しているか減少しているかを測定する。
細胞系およびハイブリドーマ
ヒト子宮頚腺癌ヒーラ、線維肉腫HT1080、結腸腺癌DLD−1およびSW480、乳腺癌MCF7、前立腺癌PC−3、前立腺癌リンパ節転移LNCaP、肺癌A549および腎横紋筋肉腫様腫瘍G401細胞を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ロックビル、メリーランド)から入手した。ヒト肝癌HuH7およびHLE、および胃癌MKN45およびSTKM−1細胞は、ドクターPeter Vogt(ザ・スクリップス・リサーチ・インスティテュート、ラホーヤ、カリフォルニア)により提供され、乳腺癌MDA−MB−231細胞は、ドクターLiliana Ossowski(マウント・サイナイ・スクール・オブ・メディシン、ニューヨーク)により提供された。ヒト類表皮癌HEp3細胞を、ニワトリ胚の漿尿膜(CAM)で連続継代された固体腫瘍から入手した(Testa、1992;Brooks et al.、1993)。HEp3細胞の転移性変異型、M+HEp3を使用前に20日未満の期間培養した。低転移性変異型、M−HEp3を、使用前に少なくとも80日間培養状態で維持した。ヒト微小血管内皮細胞(HEC)および皮膚線維芽細胞(HDF)を、クローンティクス(サンディエゴ、カリフォルニア)から入手し、それぞれEGM−2 MVおよびFGM−2培地(クローンティクス)で維持した。癌細胞系を、10%FBS(ハイクローン、ローガン、ユタ)、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン/ストレプトマイシンおよび非必須アミノ酸(インビトロゲン)を補ったDMEM(インビトロゲン、カールスバッド、カリフォルニア)中で単層培養物として維持し、37℃で加湿5%CO2雰囲気中において成長させた。MoAb41−2を生産するハイブリドーマを、以前に報告されたサブトラクティブ免疫方法(Brooks et al.、1993)により作製した。mAbのハイブリドーマ培養および精製を、標準手順を用いてザ・スクリップス・リサーチ・インスティテュートのザ・プロテイン・アンド・ヌクレイック・アシッズ・コア・ファシリティーにより実施した。
試薬
プロテアーゼ阻害剤、正常マウスIgG、抗FLAG M2 mAb、DAB試薬およびギルヘマトキシリンを、シグマ(セントルイス、ミズーリ)から購入した。逆転写およびPCR試薬およびpCR−II Topoベクターをインビトロゲンから購入した。PP2をカルビオケム(ラホーヤ、カリフォルニア)から入手した。
タンパク質精製、ペプチド配列決定およびタンパク質分析
非標識または35S−標識HEp3細胞(5×107)からのライゼートにおいて免疫沈降を実施した。トラン35S−標識(100μCi/ml;ICN、コスタメサ、カリフォルニア)を含むメチオニン/システイン不含有DMEM中で代謝性標識を一晩実施した。細胞を、PBSで充分に洗浄し、次いで0.1Mのトリス(pH8.0)、0.1%トリトンX−100、150mMのNaCl、5mMのEDTA、10μMのトランス−エポキシスクシニル−L−ロイシルアミド(4−グアニジノ)ブタン、20μg/mlの大豆トリプシン阻害剤および25μg/mlのアプロチニンを含む緩衝液中で溶解した。ライゼートを、4℃で30分間、プロテインG−セファロース(ファルマシア・バイオテック、ピスキャタウェイ、ニュージャージー)に対して澄明化し、次いで、20μgのmAb 41−2または対照としてnmIgGと4℃で一晩インキュベーションした。プロテインG−セファロースを用いて、免疫複合体を沈澱させ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析前に還元性SDSローディング緩衝液中で沸騰させることにより複合体を変性させた。35S−標識タンパク質については、ゲルを乾燥し、−80℃でフィルムに露出した。他方タンパク質をポリビニリジンジフルオリド(PVDF)膜(ミリポア、ベッドフォード、マサチューセッツ)へ移した。135kDaでの優勢なクーマシー染色バンドを切除し、次いでトリプシンで消化した。生成したペプチドを高圧液体クロマトグラフィーにより分離し、プロサイス494タンパク質シーケンサー(アプライド・バイオシステムズ、インコーポレイテッド、フォスターシティー、カリフォルニア)で配列決定した。トリプシン消化およびペプチド配列決定を、ザ・スクリップス・リサーチ・インスティテュートのザ・プロテイン・アンド・ヌクレイック・アシッズ・コア・ファシリティーにより実施した。ペプチド配列を用いることにより、米国立生物工学情報センター(NCBI)ウェブサイトで利用可能なアルゴリズムを用いてGenBankデータベースを検索した。Prositeデータベース(Falquet et al.、2002)、SMARTアルゴリズム(Schultz et al.、1998)、PSORTアルゴリズム(NakaiおよびKanehisa、1992)およびNetPhos2.0アルゴリズム(Blom et al.、1999)を用いて、完全SIMA135タンパク質配列を、構造ドメイン、細胞プロセッシングシグナルおよび共通翻訳後修飾モチーフについて解析した。
発現構築物および一時的トランスフェクション
真核生物発現ベクターpME18S−FL3(GenBank受入番号AK026622)におけるSIMA135 cDNAは、日本国NEDOヒトcDNA配列決定プロジェクトの一環として作製され、ドクターHiroko Hata(東京大学、医科学研究所、ウイルス学部門)のご好意で提供された。親構築物の停止コドンの直前にFLAGエピトープをコード化する配列(DYKDDDDK)を配置するPCRによりSIMA135FLA Gin構築物を作製した。両構築物を配列決定した。製造業者により記載された要領で、スーパーフェクト試薬(キアゲン、バレンシア、カリフォルニア)を用いて、ヒーラ細胞(4×105)を、SIMA135またはSIMA135FLAGin発現構築物により一時的にトランスフェクションした。10mMのトリス(pH8.0)、150mMのNaCl、1%のトリトンX−100、5mMのEDTAおよび1×完全ミニEDTA不含有プロテアーゼ阻害剤カクテル(ロシュ、インディアナポリス、インディアナ)を含む氷冷緩衝液中で細胞を溶解した。10分間14000rpmでの遠心分離により不溶性材料を除去した。
HEp3細胞からのSIMA135 cDNAのクローニング
RNeasyキット(キアゲン)を用いて全RNAを単離し、その2μgを、スーパースクリプトII逆転写酵素を用いる逆転写反応における鋳型として用いた。生成したcDNA1μgにおいて、プライマーTCCCCACCGTCGTTTTCC(配列番号2)およびGGTTAGGAACACGGACGGGTG(配列番号3)(GenBank受入番号AK026622に基いて設計)およびプルーフリーディング酵素プラチナPfx DNAポリメラーゼを用いることによりPCRを実施した。PCRサイクリング条件は、94℃で3分間の後、94℃を30秒間、55℃を30秒間および72℃を150秒間を1サイクルとして30サイクル、次いで最後の72℃伸長は10分間であった。PCR産物を、ゲル精製(キアゲン)し、プラチナTaq DNAポリメラーゼを用いてアデノシンを付加し、次いでpCR−II Topoベクターでクローン化し、配列決定した。
免疫蛍光
SIMA135FLAGin発現構築物により一時的にトランスフェクションしたヒーラ細胞、およびHEp3細胞を、カバーガラス上に置いた。37℃で48時間インキュベーション後、細胞をPBSで洗浄し、次いで2%ホルムアルデヒドに固定した。抗FLAG mAbとインキュベーションされるヒーラ細胞は、透過性化されていないかまたは室温で5分間PBS中0.5%のトリトンX−100中でインキュベーションすることにより透過性にされていた。両細胞型ともPBS中5%のBSAで遮断した。ブロッキングバファー中でmAb 41−2(5μg/ml)または抗FLAG M2 mAb(4μg/ml)と4℃で一晩インキュベーションした後、細胞をPBSで洗浄し、次いでAlexa Fluor546コンジュゲートヤギ抗マウスIgG(2μg/ml)(モレキュラー・プローブズ)とインキュベーションした。バイオラッド1024MRC2走査型共焦イメージングシステムを用いて、標識細胞を視覚化および撮影した。
ノーザン・ブロット分析
ヒト12レーン多組織ノーザン・ブロット(クロンテック)を、68℃のUltraHyb溶液(アンビオン)中で一晩SIMA135 cDNAの[α−32P]dCTP標識(アンビオン)EcoRI/HincII DNA挿入フラグメントとハイブリダイゼーションした。ブロットを、68℃で0.1×SSC、0.1%SDSの最終ストリンジェンシーとなるまで洗浄し、次いで−80℃でフィルムに露出した。ブロットをβ−アクチンcDNAで再プロービングすることにより、各レーンにおけるRNAローディングのコンシステンシーを測定した。
ウエスタン・ブロット分析
細胞ライゼート、血清不含有条件培地および免疫沈降タンパク質を、8%SDS−ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動により分離し、次いでニトロセルロース膜(ミリポア)に移した。膜をPBS中5%の脱脂粉乳で遮断し、次いで4℃で一晩、mAb 41−2(2μ/ml)、抗FLAG M2 mAb(0.8μg/ml)または抗ホスホチロシンmAb(1μg/ml;アップステート・バイオテクノロジー、レークプラシッド、ニューヨーク)とインキュベーションした。充分な洗浄後、膜を室温で2時間ヤギ抗マウスIgG(0.16μg/ml、ピアス、ロックフォード、イリノイ)とインキュベーションし、免疫反応性バンドを強化化学発光(ピアス)により検出した。
生化学的特性確認手順
N−結合グリカンの除去については、M+HEp3細胞およびSIMA135FLAGin発現構築物により一時的にトランスフェクションしたヒーラ細胞からのライゼート(50μl)を、100℃で10分間、0.5%SDS、1%β−メルカプトエタノール中で変性させて還元し、次いで37℃で45分間、PNGアーゼF(ニューイングランド・バイオラブズ、ベヴァリー、マサチューセッツ)とインキュベーションした。SIMA135のチロシンリン酸化の基礎レベルの分析については、HEp3およびヒーラ(陰性対照として)細胞の準飽和レベルの培養物を、37℃で30分間、50mMのNaFおよび1mMのNa3VO4を含む血清不含有DMEMとインキュベーションし、次いで氷冷PBSで洗浄した。Srcキナーゼファミリーリン酸化の阻害については、HEp3細胞を、NaFおよびNa3VO4を含まない血清不含有DMEM中でPP2(50μM)と共に37℃で30分間培養した。次いで、細胞を、50mMのトリス(pH7.4)、150mMのNaCl、1%トリトンX−100、1mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド、1mMのベンズアミジン、25μl/mlのアプロチニン、25μg/mlのロイペプチン、50mMのNaFおよび1mMのNa3VO4を含む氷冷緩衝液に溶解した。不溶性材料を10分間14000rpmでの遠心分離により除去した。1μgのmAb 41−2またはnmIgG(陰性対照として)を用いて、300μgの細胞ライゼートについて上記要領により免疫沈降を実施した。可溶性SIMA135の存在について検定するため、飽和密度に近づいたHEp3細胞を、PBSで3回洗浄し、次いで血清不含有条件培地中で24時間インキュベーションした。培地を集め、4℃および10000gでの遠心分離にかけ、次いで分子重量カットオフが30000kDaであるミクロン遠心分離フィルター(ミリポア)を用いて10倍濃縮した。細胞ライゼートを上記要領で集めた。
免疫組織化学
3患者からの既採取ヒト腺癌結腸組織試料からのクリオスタット薄片(6μm)を、15分間亜鉛−ホルマリンに固定し、簡単にPBSですすぎ、次いで、3%BSAを含むPBS中でインキュベーションすることにより非特異的結合部位を遮断した。mAb41−2(5μg/ml)を4℃で一晩適用した。特異的抗体結合は、ビオチンコンジュゲート抗マウス抗体(ピアス)、次いでDAB試薬を用いて可視化されたペルオキシダーゼコンジュゲートニュートラアビジン(ピアス)の添加により検出された。ギルヘマトキシリンを用いて薄片を対比染色した。
mAb41−2は、高転移性ヒト腫瘍HEp3細胞において高レベルで発現された135kDa抗原を認識する
抗体mAb41−2により認識される抗原を同定および特性確認した。mAb 41−2により認識される抗原の意義の決定における最初の段階として、非還元的条件下で電気泳動させた高転移性(M+)および低転移性(M−)HEp3細胞から調製したライゼート(20μg)でmAb41−2を用いてウエスタン・ブロット分析を実施した。サブトラクティブ免疫により生成された、モノクローナル抗体41−2(mAb)により両細胞型において約135kDaの単一バンドが検出された。mAb41−2の生成で採られたサブトラクティブ免疫方法と合致することに、免疫反応性タンパク質はM−HEp3細胞よりもM+HEp3細胞における方が高レベルで発現された。高転移性(M+)および低転移性(M−)HEp3細胞から調製したライゼートの平行クーマシー染色ゲルは、全体的タンパク質パターンおよび内容物がM+およびM−HEp3細胞抽出物間で区別できなかったことを立証している。mAb41−2免疫反応性の差異は、2種の細胞系間における同族抗原の発現レベルにおける著しい差異を示す。
転移性HEp3細胞からのmAb41−2により認識される抗原の同定
精製mAb41−2を用いて、M+HEp3細胞から実施例11の抗原を免疫沈降させた。mAb41−2または正常マウスIgGによりM+HEp3細胞から免疫沈降した35S標識タンパク質を、還元的条件下においてSDS−PAGEで分析した。ゲルを乾燥し、一晩−80℃でフィルムに露出した。放射性標識HEp3細胞から免疫沈降した主要タンパク質は、約135kDaの分子量を有していた。これは、実施例11で検出された抗原の分子量と一致していた。免疫沈降したタンパク質をPVDF膜に移した、非標識HEp3細胞を用いた平行実験では、135kDaタンパク質バンドを切除し、トリプシン消化にかけ、分離したフラグメントをN−末端から配列決定した。3つの主要ペプチド配列が得られた。GenBank非重複タンパク質データベースの検索結果は、ペプチド配列の各々が、未公開cDNA登録AK026622から翻訳された、受入番号BAB15511の未公開登録の理論的配列と正確またはほぼ正確なマッチ(対合)を有することを示していた。
BAB15511 FEIALPRESNITVLIKXGT 配列番号5
ペプチド2 XXXXIPGSTTNPE 配列番号6
BAB15511 VEYYIPGSTTNPE 配列番号7
ペプチド3 XYXLQVPSDILH 配列番号8
BAB15511 SYSLQVPSDILH 配列番号9
SIMA135構造的特徴
SIMA135タンパク質配列は、836アミノ酸(配列番号1−図1)を含み、分子量が92.9kDaであると推定される。配列解析により以下の構造的特徴が確認された。推定アミノ末端シグナルペプチドについては、Ala29の後で開裂が行なわれると予測される。この特徴はペプチド1の配列と一致することから、成熟SIMA135が予測分子量90.1kDaであり、Phe30から始まることを示している。残基666〜686(図1で四角に囲まれている)に及ぶ潜在的貫膜ドメインは、そのカルボキシ末端が細胞内に位置すべくSIMA135を配向させると予測される(Hartmann et al.、1989)。N−グリコシル化についての12の共通モチーフは、図1に示されている(indicted)。共通1タイプパルミチル化モチーフ(IICCV)(Hansen et al.、1999)は、残基687〜691に位置する。他のタンパク質ではSrc相同性(SH)3ドメインへの結合を仲介することが示されていた(Pawson1995、Mayer、2001)5個のPXXPモチーフが存在する(図1)。5個のチロシン残基(図1では円で囲まれている)はリン酸化部位であり得る。2個の空間的に近いチロシン残基(Tyr734およびTyr743)は、SH2ドメイン結合についての共通モチーフ(YXXL/I)に存在する(Songyang et al.、1993)。SIMA135は、GenBank非重複データベースにおける他の確認されたタンパク質との相同性を欠いていた。しかしながら、SIMA135は、報告された核酸配列の翻訳により測定されたところによると(Scherl-Mostageer et al.、2001)、理論的タンパク質CDCP1と高い相同性を実際に有していた。さらに、残基221〜348および417〜544に及ぶ、SIMA135タンパク質の2領域は、CUB(補体タンパク質サブコンポーネントC1r/C1s、ウニ(urchin)胚成長因子および骨(bone)形態形成タンパク質1)ドメインとの相同性の低いことが確認された(BorkおよびBeckmann、1993)。これらのドメインは、タンパク質−タンパク質相互作用の仲介において作用すると報告されている(ChenおよびWallis、2001;Sieron et al.、2000)。残基545〜660に及ぶScherl-Mostageerおよび共同研究者により報告された第3の推定CUBドメイン(Scherl-Mostageer et al.、2001)は、SIMA135アミノ酸配列およびCDCP1についての理論的アミノ酸配列を走査するのに我々が使用した検索アルゴリズムの相同性検出閾値より下であった。
正常および悪性細胞および組織におけるSIMA135の発現パターン
32P標識SIMA135 cDNAプローブでプロービングした12の正常ヒト組織からのポリA+RNA(1レーンにつき1μg)のノーザン・ブロット分析を実施した。β−アクチン mRNAのレベルは、ローディングの尺度として示されている。12の正常ヒト組織におけるSIMA135 mRNAの発現パターンを、32P標識2.8kb SIMA135 cDNAプローブとのハイブリダイゼーションによるノーザン・ブロット分析により調べた。約6.0kbのバンドは、骨格筋および結腸において非常に高レベルで検出され、腎臓、小腸、胎盤および肺では低い発現レベルであった。〜6.0kbでのほとんど検出できないシグナルは、末梢血白血球に存在した。さらに、約3.3kbでのかなり弱いシグナルが、骨格筋、結腸、胎盤および肺に存在した。SIMA135 mRNAは、脳、心臓、胸腺、脾臓または肝臓からは検出されなかった。CDCP1 cDNA7およびゲノム配列とSIMA135のアラインメントに基くと(データは示さず)、ノーザン・ブロット分析により検出された2つのSIMA135転写物は、SIMA−135 3'UTR内の選択的ポリアデニル化シグナルの使用により生じる可能性が非常に高いと思われる。長い、発現レベルの高い転写物はさらなる3'共通ポリアデニル化シグナル(ヌクレオチド59507)の使用により生じたと考えられ、短い、発現レベルの低い転写物はヌクレオチド31867に位置する有効性が劣る変異型ポリアデニル化シグナルの使用により生じたと思われる。また、これらの変異型転写物がSIMA135プレ−mRNAの選択的スプライシングから生じる可能性もある。
SIMA135は、細胞表面、リン酸化糖タンパク質である。
免疫細胞化学を用いて、HEp3細胞、および同じくSIMA135発現構築物で一時的にトランスフェクションしたヒーラ細胞におけるSIMA135の細胞位置を測定した。発現構築物は、SIMA135タンパク質のカルボキシ末端後に融合したFLAGエピトープを含んでいた。mAb41−2とインキュベーションしたHEp3細胞は、原形質膜での強い染色を示した。FLAG標識SIMA135により一時的にトランスフェクションしたヒーラ細胞もまた、mAb41−2とインキュベーションしたとき類似した強い膜染色を示した。さらに、細胞内に位置するFLAG標識への抗体の接近を可能とするために、0.5%トリトンX−100を用いて透過性にされ、抗FLAGmAbとインキュベーションされた一時的トランスフェクションヒーラ細胞は、抗FLAGエピトープmAbとインキュベーションしたときに強度の膜染色を示したが、非透過性の細胞では、抗FLAGmAbによる染色が低度またはほぼバックグラウンドに近かったので、SIMA135カルボキシ末端は細胞内にあるものとして測定された。非トランスフェクションヒーラ細胞は、mAb41−2または抗FLAGエピトープmAbとインキュベーションしても本質的に染色されなかった。これらのデータにより、SIMA135の予測される細胞表面位置およびI型配向が確認された。また、SIMA135−FLAG標識発現構築物で一時的にトランスフェクションしたヒーラ細胞においてmAb41−2および抗FLAG mAbで観察された染色の一致により、SIMA135がmAb41−2についての標的抗原であることがさらに確認された。
正常および癌結腸におけるSIMA135の発現
免疫組織化学分析を実施することにより、正常および癌結腸におけるSIMA135のインビボ局在性を測定した。薄片(6μm)を、一次抗体としてmAb41−2で染色した。代表的正常結腸粘膜は、SIMA135の上皮発現を示す(カラー写真では赤−褐色、示さず)。結腸癌は、SIMA135の不均一で広範な発現を示す。SIMA135は、結腸漿膜における浸潤性悪性腺により発現される。SIMA135は、結腸漿膜における排出血管の管腔内における悪性上皮細胞により発現される。正常な結腸粘膜では、SIMA135は、それが結腸管腔の内側を覆う細胞の管腔および基底表面、および腺陰窩の内側を覆う細胞の先端表面に均一に存在する上皮細胞により独占的に発現された(データは示さず)。陰窩の杯細胞内容物および腺管腔の粘膜における強度染色の存在は、SIMA135が結腸上皮細胞により可溶性形態で生産されるという考えを裏付けている。結腸癌標本では、SIMA135は、悪性腺内の粘膜にある程度焦点強調部分を伴いながら広範で不均一に発現された。浸潤性癌細胞群の中には、基底、先端および外側膜上並びに腺粘膜内におけるSIMA135の存在を示す多量に染色されたものもあった。結腸漿膜深部および排出血管内の癌細胞はSIMA135抗原について強い陽性であることが多いことから、悪性の高い、浸潤性腺と強度染色を関連付ける明確な傾向があった。一次抗体ではなく二次抗体とインキュベーションした対照薄片は、染色されなかった。
ヒーラ細胞についての上記トランスフェクション手順に従って、7種の異なる細胞系を用いることにより、SIMA135mRNAの発現を試験およびモニターした。これらの細胞系のうち、クローン番号3は、適切な塩基対シグナルを生じた。
SCIDマウスに接種された2種のヒーラクローン;クローン4番(SIMA−135陰性)およびクローン3番(SIMA−135過剰発現体)のインビボ悪性
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Claims (18)
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- 配列番号1のグリコシル化または非グリコシル化フラグメントであって、アミノ酸525および/またはアミノ酸827を含むフラグメント。
- 請求項1記載の配列番号1のタンパク質の変異型であって、アミノ酸525がアルギニンであり、および/またはアミノ酸827がセリンである変異型。
- 請求項1記載のタンパク質に特異的に結合する抗体であって、mAb41−2ではない抗体。
- 請求項2記載のフラグメントに特異的に結合する抗体であって、mAb41−2ではない抗体。
- 請求項3記載の変異型に特異的に結合する抗体であって、mAb41−2ではない抗体。
- 抗体がモノクローナルまたはポリクローナル抗体である、請求項5〜6のいずれか1項記載の抗体。
- ヒトおよび動物体の治療的処置として使用される、請求項5〜6のいずれか1項記載の抗体。
- 哺乳類における癌細胞による転移の阻害に使用される医薬の製造を目的とする、請求項5〜6のいずれか1項記載の抗体。
- 癌細胞が、類表皮癌細胞、前立腺癌細胞、結腸癌細胞、線維肉腫、胃癌細胞、肝癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞および腎臓杆状癌細胞である、請求項9記載の抗体。
- 癌細胞がHep3細胞である、請求項10記載の抗体。
- 請求項5〜6のいずれか1項記載の抗体および医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
- 請求項5〜6のいずれか1項記載の抗体およびパッケージ材料を含むキット。
- (a)哺乳類から得られる試験試料と請求項5〜8のいずれか1項記載の抗体を接触させ、そして(b)抗体が非癌組織の対照試料に結合する場合よりも著しい程度で抗体が試験試料に結合するか否かを測定することを含む癌の診断方法で使用される、請求項5〜6記載の抗体。
- (a)問題の切片と請求項のいずれか1項記載の抗体の結合を視覚化し、そして(b)抗体が、組織試料の異種染色を誘発するか、組織試料の全体にわたってSIMA135の充分な発現を示すか、または結腸漿膜における悪性腺を染色するか否かを測定することを含む癌の診断方法で使用される、請求項5〜6記載の抗体。
- (a)請求項5〜8記載の抗体と試験試料を接触させ、そして(b)非転移Hep3細胞を含む対照試料への抗体の結合と試験試料への抗体の結合を比較することを含み、対照試料への抗体の結合と比べて試験試料への抗体の結合が増加しているときは、試験試料が転移HEp3細胞を含むことを示すものとする、試験試料が転移細胞を含むか否かを測定するのに使用される、請求項5〜6記載の抗体。
- SIMA−135を発現する細胞を薬剤と合わせることにより試験細胞を製造し、試験細胞からのSIMA−135の発現が、薬剤と合わせる前に細胞により発現される量より多いか少ないかを測定することを含む、薬剤の転移調節能力の測定に使用される、請求項5〜6記載の抗体。
- (a)候補薬剤と試験細胞を接触させ、そして(b)試験細胞によるSIMA135生産が、対照によるSIMA135生産に対して増加しているか減少しているかを測定することを含む、候補薬剤が細胞によるSIMA135生産を調節するか否かを測定するのに使用される、請求項5〜6記載の抗体。
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