PT1597367E - Antigénio glicoproteína sima 135 expresso em células tumorais humanas metastáticas - Google Patents

Description

ΡΕ1597367 1 DESCRIÇÃO "ANTIGÉNIO GLICOPROTEÍNA SIMA 135 EXPRESSO EM CÉLULAS TUMORAIS HUMANAS METASTÁTICAS"

Campo do invento 0 invento está relacionado, de um modo geral, com métodos para diagnosticar cancro e para diminuir as metástases de células de cancro num mamífero, como seja um ser humano. Mais especificamente, o invento está relacionado com a utilização de uma proteína marcadora de tumores para criar anticorpos que podem ser usados para detectar o aumento da produção da proteína numa célula e utilização dos anticorpos para diminuir as metástases de células de cancro que produzem a proteína marcadora de tumores.

Fundamento do invento

Um tumor maligno dissemina células que migram para novos tecidos e criam tumores secundários enquanto um tumor benigno não gera tumores secundários. 0 processo de geração de tumores secundários é designado metastização e é um processo complexo em que as células tumorais colonizam locais distantes do tumor primário. As metástases tumorais continuam a ser a principal causa de morte em doentes com 2 ΡΕ1597367 cancro, no entanto os mecanismos moleculares subjacentes à disseminação das células tumorais não estão claramente compreendidos. A metastização é um processo de múltiplos passos em que as células tumorais se devem destacar do tumor primário, invadir a matriz celular, penetrar nos vasos sanguíneos, entrar então no sistema circulatório (intravasado), parar num local distante, sair da corrente sanguínea (extravasado) e crescer. Ver, e.g., G.L. Nicolson (1982) Biochim. Biophis. Acta. 695:113-176; G.L. Nicolson e G. Poste (1983) In. Ver. Exp. Pathol. 25:77-181; G. Poste e I.J. Fidler (1980) Nature 283:139-145; e R. Roos (1984) Biochim. Biophis. Acta. 738:263-284. Dada a complexidade do processo, pensa-se que numerosos genes medeiem a formação de metástases de células tumorais. De facto, o fenótipo metastático tem sido correlacionado com a expressão de uma variedade de proteínas, incluindo proteases, moléculas de adesão e similares. No entanto, a evidência de que uma determinada proteína está directamente envolvida na disseminação muitas vezes não existe ou é difícil de provar. L.A. Liotta e W. Stetler-Stevenson (1989) J. Natl. Câncer Inst. 81:556-557. O carcinoma epidermóide humano, HEp-3, proporciona um sistema único que pode ser usado para detectar e caracterizar genes responsáveis pela disseminação de metástases. As células HEp-3, propagadas através de uma passagem seriada em membrana corioalantóica de galinha 3 ΡΕ1597367 (CAM), são tumorigénicas e formam metástases espontaneamente (T+M+). L. Ossowski e E. Reich (1980a) Câncer Res. 40:2300-2309. No entanto, quando tais células são crescidas continuamente in vitro formam facilmente tumores mas, progressivamente, tornam-se não metastáticas (T+M-) com o tempo. L. Ossowski e E. Reich (1980b) Câncer Res. 40:2310-2315. Com a cultura prolongada in vitro, elas eventualmente tornam-se também não tumorigénicas (T-M-). A perda da capacidade de formar metástases é reversível. As células T+M- na membrana corioalantóica durante duas a três passagens adquirem novamente a capacidade de formar metástases espontâneas. Assim, através da alteração das condições de crescimento, o potencial metastático destas células pode ser manipulado pelo investigador. O activador do plasminogénio humano tipo urocinase (uPA) foi demonstrado como estando directamente envolvido na disseminação de HEp-3, uma vez que as metástases espontâneas das células HEp-3 em embrião de galinha foram inibidas pelos anticorpos que eram específicos de UPA humano. L. Ossowski e E. Reich (1983b) Cell 35:611-619. Subsequentemente, foi observado que a inibição da actividade UPA bloqueava a infiltração do mesênquima CAM pelas células HEp-3 individuais. L. Ossowski (1988a) Cell 52:321-328. No entanto, UPA activo parece ser necessário para a intravasamento de células tumorais nas não para a extravasamento. L. Ossowski (1988a). Assim, outros factores devem também estar envolvidos na disseminação de HEp-3 e na disseminação de células cancerosas em 4 ΡΕ1597367 geral. J.P. Quigley et al. (1988) Ciba Foundation Symposium 141:22-47, Brooks et al., (1993) J. Cell Biol. 122 (6):1351-1359 e Testa et al., na Patente U.S. Nos 6245898 e 6498014 descrevem a geração de anticorpos monoclonais (mAbs), usando "imunização subtractiva", os quais reconhecem os antigénios da superfície celular expressos nas células HEp-3 e inibem as metástases tumorais no modelo de membrana corioalantóica. No entanto, estes antigénios não foram correlacionados com a formação de metástases in vivo nem se demonstrou que estejam directamente envolvidos no processo de formação de metástases in vivo.

Consequentemente, existe a necessidade de identificar moléculas biológicas que estejam funcionalmente envolvidas na disseminação de células de cancro, de forma a desenvolver terapias que possam ser usadas para inibir a migração de células tumorais para novos tecidos. Igualmente, métodos para inibir a formação de metástases de células tumorais e para diagnosticar cancro são necessários para ajudar na batalha do controlo do cancro através da redução ou da eliminação da disseminação de células de cancro ao longo do corpo de um mamífero atingido com cancro.

Sumário do invento O presente invento diz respeito à identificação e caracterização de uma proteína (SIMA 135) (SEQ ID NO:l) que foi produzida em células metastáticas. SEQ ID NO:l foi descrita como "NCSG135" na base de dados EBI com o n° de 5 ΡΕ1597367 acesso AF468010. Difere em duas posições (resíduos 525 e 827) de "B345" descrito em WO 02/04508. O invento está definido nas reivindicações.

Breve descrição dos desenhos

Figura 1 ilustra a sequência de aminoácidos de SIMA 135. A sequência sinal está em letras minúsculas e o domínio transmembranar putativo está delimitado. Estão indicados doze motivos de consenso para N-glicosilação com triângulos a cheio. Os resíduos de tirosina citoplasmática estão delimitados por um círculo. Os domínios CUB, que se pensa abrangerem os resíduos 221 a 348 e 417 a 544, estão sublinhados. Os três péptidos identificados a partir da digestão com tripsina e sequenciação estão sublinhados. O resíduo Arg que precede o péptido 2 e o Lis que precede o péptido 3 estão delimitados para evidenciar a consistência com a especificidade da tripsina para os substratos possuidores de Arg/Lis. As sequências PXXP do domínio citoplasmático estão sublinhadas. Um motivo de consenso para palmitoilação, após o domínio transmembranar putativo, está indicado por círculos a cheio. Um motivo de consenso para palmitoilação, após o domínio transmembranar putativo, está indicado por círculos a cheio.

Descrição detalhada do invento O invento está relacionado com a descoberta de 6 ΡΕ1597367 uma proteína glicosilada que foi purificada a partir de células HEp3 metastáticas através de imunização subtractiva com um anticorpo monoclonal designado 41-2. A proteína foi designada SIMA 135 (proteína de 135 kDa associada a imunização subtractiva de HEp3 M+). SIMA 135 refere-se a uma proteína que pode ser fisicamente isolada a partir das células, em oposição a ser uma proteína putativa prevista a partir da tradução da sequência de ácido nucleico. 0 isolamento físico da proteína SIMA 135 é significativo por uma série de razões. Uma delas é que o isolamento da proteína indica que o mRNA é de facto traduzido num polipéptido. Em segundo lugar, o isolamento e caracterização da proteína como aqui descritos indicam que a proteína é glicosilada. 0 isolamento físico da proteína glicosilada confirma que os locais de glicosilação dentro dos polipéptidos estão disponíveis para glicosilação e não estão submersos dentro da proteína enrolada de forma inacessível às glicosiltransferases. Tal conformação é importante devido ao papel conhecido que a glicosilação desempenha no enrolamento e imunogenicidade das proteínas. Assim, o isolamento da proteína SIMA 135 é um avanço significativo quando comparado com uma sequência polipeptídica teórica prevista a partir de uma sequência de ácido nucleico. É aqui demonstrado que o cDNA de SIMA 135 codifica uma proteína transmembranar da superfície celular tipo I, de 135 kDa, que imuno-reage especificamente com o mAb 7 ΡΕ1597367 41-2. A imunopurificação e a sequenciação de aminoácidos confirmam que a proteína madura começa em Phe30 após remoção de um péptido sinal de 29 aminoácidos. A análise imunocitoquímica confirma a localização da proteína na superfície da célula e a orientação tipo I da mesma. Ainda, consistente com a presença de 12 potenciais locais de qlicosilação, a análise de transferências Western dos lisados de células desglicosilados indica que até 40 kDa de diferença entre o peso molecular aparente (-135 kDa) e teórico (-90 kDa) de SIMA 135 madura é devido a glicanos ligados em N. A análise de transferência Western demonstra que SIMA 135 é uma proteína fosfotirosina, consistente com a presença de 5 resíduos tirosina intracelulares. Ainda, o inibidor PP2 foi usado para demonstrar que um membro da família de cinases Src actua de forma a fosforilar tirosinas de SIMA 135 em células HEp3. O domínio estrutural de SIMA 135 indica que pode interagir com proteínas extracelulares tais como ligandos solúveis, outras proteínas da superfície celular e/ou componentes da matriz, potencialmente via domínios CUB putativos presentes na região terminal amina. Pensa-se que estas estruturas medeiem a ligação a uma variedade de ligandos proteicos. Por exemplo, a homodimerização das proteases serínicas MASP, actuando dentro do ramo das lectinas da cascata de complemento, é estabilizada através de interacções que envolvem os domínios CUB (Chen e Wallis, 2001) . Igualmente uma série de proteases serínicas transmembranares do tipo II possui domínios CUB que se 8 ΡΕ1597367 pensa mediarem interacções enzima-substrato (Hooper et al., 2001). Por outro lado, os domínios CUB de cubilina medeiam a ligação ao factor intrínseco cabalamina assim como à albumina (Yammani et al., 2001). Como SIMA 135 é altamente glicosilada dentro do seu domínio extracelular, pensa-se que a ligação do ligando será, pelo menos parcialmente, dependente de grupos açúcar tal como foi demonstrado para várias isoformas da glicoproteína CD44 da superfície celular (Bajorath, 2000) . Pensa-se que a glicosilação contribua para o enrolamento da proteína SIMA 135 e para o transporte e manutenção na superfície celular (Gorelik et al., 2001; Grogan et al., 2002). SIMA 135 apresenta diferenças na sequência de aminoácidos relativamente a outras proteínas associadas ao carcinoma das células em anel de sinete (entrada no GenBank AK026622) e à linha celular de carcinoma das células não pequenas do pulmão Caiu 6 (entrada no GenBank AY026461) (Scherl-Mostageer et al., 2001). Pensa-se que estas diferenças afectem a capacidade de SIMA 135 para interagir com outras moléculas, comparativamente com outras proteínas conhecidas. A primeira alteração de aminoácidos, 525Arg—»Gln, ocorre dentro de um domínio extracelular de potencial ligação a ligandos; o segundo dos potenciais domínios CUB de SIMA 135. A segunda alteração de aminoácidos, 709G1Í—»Asp, está situada 2 resíduos após um resíduo de tirosina. Esta alteração de um aminoácido não polar para um resíduo carregado pode-se esperar que tenha um impacto significativo na capacidade da tirosina proximal ser fosforilada e, 9 ΡΕ1597367 assim, pensa-se que tenha impacto na capacidade de SIMA 135 para se ligar, por exemplo, a dominios SH2. A última alteração, 827Ser—»Asn, está situada a 4 residuos do motivo PXXP. Assim, esta alteração pode também ter impacto na capacidade de SIMA 135 para interagir com outras proteínas, neste caso as proteínas possuidoras de domínios SH3.

No tecido de cólon normal, a proteína SIMA 135 é observada nas superfícies basais e apicais das células epiteliais que delimitam o lúmen do cólon e na superfície apical das células epiteliais crípticas. Ao contrário da sua localização distinta no cólon normal, a distribuição de SIMA 135 no tecido de tumores do cólon é desorganizada e heterogénea, surgindo desregulada com coloração na membrana celular e no citoplasma. Parece que a expressão de SIMA 135 é mais intensa nas glândulas invasoras mais profundas da serosa do cólon e nos vasos sanguíneos de drenagem. Estes resultados indicam que o aumento da expressão da proteína SIMA 135 está mais associado às fases tardias da carci-nogénese, como seja a invasão local e metástases. Esta hipótese é parcialmente suportada por análise de transferências Western de pares de linhas celulares tumorais humanas provenientes do mesmo tecido. Por exemplo, os níveis de SIMA 135 foram muito mais elevados em células HEp3 M+ altamente metastáticas comparativamente com a variante congénica e pouco metastática, HEp3 M-. Por outro lado, as linhas celulares de cancro da próstata não congénicas PC-3 e LNCaP mostraram uma tendência semelhante; a primeira, uma celular metastática, mostrando níveis muito 10 ΡΕ1597367 mais elevados de SIMA 135 comparativamente com a última, um tipo celular pouco metastático (Soos et al., 1997). A observação de SIMA 135 aparentemente livre no muco glandular de glândulas normais e malignas é consistente com a observação de que uma forma solúvel de 110 kDa desta proteína é libertada in vitro pelas células HEp3. A perda distinta da ultra-estrutura do tecido glandular, que é aparente durante a tumorigénese, pode permitir a libertação da forma solúvel de SIMA 135/CDCP1 para o fluido e sistema vascular do doente com cancro do cólon. Assim, pensa-se que SIMA 135 possua utilidade como marcador do soro ou fluido de tecidos conforme foi proposto para as proteínas transmembranares MUC1 (Rye e McGuckin, 2001), CD44 (Adham et al., 1990) e ICAM-1 (Maruo et al., 2002). I. SIMA 135 que é glicosilada ou não glicosilada O invento proporciona a proteína fosfotirosina SIMA 135 (SEQ ID NO: 1) que pode ser glicosilada ou não glicosilada. Estas proteínas podem ser usadas como antigénios para induzir a produção de anticorpos que se ligam a SIMA 135, e.g. anticorpos que se ligam especifi-camente e/ou selectivamente a SIMA 135. Tais anticorpos que se ligam selectivamente incluem os que se ligam a SIMA 135 ou uma porção de SIMA 135, mas que não se ligam a proteínas e fragmentos de proteínas que não sejam SIMA 135 ou um fragmento de SIMA 135. Estas proteínas podem também ser usadas para seleccionar anticorpos que se ligam especifica- 11 ΡΕ1597367 mente e selectivamente a SIMA 135. Tais anticorpos que se ligam especificamente e selectivamente incluem os que se ligam a SIMA 135 ou a uma porção de SIMA 135, mas que não se ligam a proteínas e fragmentos de proteínas que não sejam SIMA 135 ou um fragmento de SIMA 135. Em particular, a selectividade de tais anticorpos significa que eles se ligam a SIMA 135 ou a uma porção de SIMA 135 mas que não se ligam à proteína de 180 kDa produzida pelo lisado de células HEp-3 metastáticas como descrito na Pat US N° 6498014 com uma constante de dissociação da mesma ordem de grandeza da resultante da ligação a SIMA 135 ou a um seu fragmento, ainda que a ligação de tais anticorpos à proteína 180 kDa possa ocorrer numa constante de dissociação de pelo menos duas ordens de grandeza superiores relativamente à ligação a SIMA 135 ou a um seu fragmento. A especificidade de tais anticorpos significa que a ligação imunogé-nica é o resultado da interacção entre epitopo e região hipervariável e não resulta da interacção não específica proteína-proteína. A interacção proteína-proteína não específica tipicamente terá uma constante de dissociação de pelo menos 3 ordens de grandeza superior à constante de dissociação para a ligação específica de uma interacção entre epitopo e região hipervariável. A constante de dissociação para o par de imunoligação anticorpo-antigénio pode ser medida de acordo com as técnicas descritas em Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Pub. 1988)).

Um fragmento de uma proteína SIMA 135 como aqui 12 ΡΕ1597367 usado, refere-se a um fragmento peptídico de um tamanho suficiente para ser antigénico. Falando de um modo geral, o fragmento inclui pelo menos 5 aminoácidos.

As proteínas do invento podem ser glicosiladas ou não glicosiladas. As proteínas podem ser glicosiladas in vivo quando as proteínas são expressas numa célula que é capaz de glicosilar a proteína recombinante. Como alternativa, as proteínas do invento podem ser glicosiladas in vitro através de transferases de açúcares. As proteínas podem ser tratadas para clivarem quaisquer glicanos através da utilização de enzimas comerciais, por exemplo PNGase F (New England Biolabs, Beverly, MA). Assim, as proteínas do invento podem ser usadas para produzir anticorpos que se ligam a SIMA 135 nativa, SIMA 135 desnaturada, porções específicas de SIMA 135, SIMA 135 glicosilada e SIMA 135 não glicosilada. 11. Um anticorpo que se liga selectivamente a SIMA 125 ou ao fragmento da reivindicação 2

Os anticorpos preferidos para serem usados em composições farmacêuticas incluem os anticorpos que inibem a formação de metástases de tumores. A inibição da formação de metástases tumorais pode ser determinada por uma série de ensaios, tais como o ensaio de migração, o ensaio de invasão ou o ensaio da membrana corioalantóica de galinha.

Podem ser preparados anticorpos que reconhecem 13 ΡΕ1597367 SIMA 135 com conformação nativa ou SIMA 135 desnaturada através da imunização de um animal com SIMA 135 nativa ou SIMA 135 desnaturada, respectivamente. Ainda, podem ser preparados anticorpos que reconhecem SIMA 135 glicosilada ou SIMA 135 não glicosilada através da imunização de um animal com SIMA 135 glicosilada ou não glicosilada. Os anticorpos que reconhecem várias formas de SIMA 135 (por exemplo, nativa vs desnaturada e glicosilada vs não glicosilada) são úteis para determinar se uma célula é capaz de enrolar adequadamente e glicosilar SIMA 135. Tais anticorpos são úteis para determinar se um agente candidato é capaz de interferir com acções celulares de processamento de SIMA 135 durante a formação de metástases. Assim, tais anticorpos podem ser usados para identificar a acção de agentes que podem ser usados para inibir a formação de metástases pelas células de cancro. 0 anticorpo monoclonal 41-2 é um anticorpo que foi inicialmente empregue para isolar SIMA 135. Reconhece SIMA 135 e ainda várias outras proteínas de metástases, incluindo a proteína de 180 kDa descrito nas Patentes US Nos 6245898 e 6498014. Por este motivo, um anticorpo preferido de acordo com o invento é um anticorpo monoclonal que se liga, e.g. selectivamente e/ou especificamente, a SIMA 135, e.g. o referido anticorpo não se liga a outras proteínas associadas a metástases, e.g. o referido anticorpo reconhece um epitopo de SIMA 135.

Caso se pretenda, os anticorpos monoclonais podem 14 ΡΕ1597367 ser purificados, por exemplo, através da ligação e eluição de uma matriz à qual se liga um polipéptido ou um péptido contra o qual foram induzidos os anticorpos. Os familiarizados com a matéria conhecerão as várias técnicas usadas na área da imunologia para a purificação e/ou concentração de anticorpos monoclonais (Coligan, et al., Unidade 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991). 0 presente invento diz respeito a um anticorpo para usar como tratamento terapêutico de um ser humano ou animal como definido na reivindicação 5. A preparação de anticorpos monoclonais é igualmente convencional (Kohler & Milstein, Nature, 256:495 (1975); Coligan et al., secções 2.5.1-2.6.7; e Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, página 726 (Cold Spring Harbor Pub. 1988)). Resumidamente, os anticorpos monoclonais podem ser obtidos através da injecção de ratinhos com uma composição compreendendo um antigénio, verificação da presença da produção de anticorpos através da remoção de uma amostra de soro, remoção do baço para obter linfócitos B, fusão dos linfócitos B com células de mieloma para produzir hibridomas, clonagem dos hibridomas, selecção dos clones positivos que produzem anticorpos contra o antigénio e isolamento dos anticorpos a partir das culturas de hibridomas. Os anticorpos monoclonais que podem ser isolados e purificados a partir de culturas de hibridomas por uma variedade de técnicas bem conhecidas. Tais técnicas de isolamento incluem cromatografia de 15 ΡΕ1597367 afinidade com Proteína-A Sepharose, cromatografia por exclusão de tamanho e cromatografia de permuta iónica (Coligan et al., secções 2.7.1-2.7.12 e secções 2.9.1-2.9.3; Barnes et al., Purification of Immunoglobulin G (IgG), em Methods in Molecular Biology, Vol. 10, páginas 79-104 (Humana Press 1992)). Métodos de multiplicação in vitro e in vivo de anticorpos monoclonais são conhecidos dos familiarizados com a matéria. A multiplicação in vitro pode ser realizada em meios de cultura adequados tais como Meio de Eagle Modificação de Dulbecco ou RPMI 1640, facultativamente complementado com um soro de mamífero, como seja soro fetal de vitela ou micronutrientes e suplementos que suportam o crescimento, tais como células de exudato peritoneal de ratinho normal, células do baço, macrófagos de medula óssea. A produção in vitro proporciona preparações de anticorpos relativamente puras e permite o aumento da escala para dar grandes quantidades dos anticorpos pretendidos. A cultura de hibridomas em larga escala pode ser realizada por cultura em suspensão homogénea num reactor com arejamento, num reactor com agitação contínua ou por cultura de células imobilizadas ou encarceradas. A multiplicação in vivo pode ser realizada através da injecção de clones celulares em mamíferos histocompatíveis relativamente às células parentais, e.g., ratinhos sin-geneicos, para induzir o crescimento de tumores produtores de anticorpos. Facultativamente, os animais são estimulados com um hidrocarboneto, especialmente óleos, como seja tetrametilpentadecano de pristina antes da injecção. Após uma a três semanas, o anticorpo monoclonal pretendido é recuperado do fluido corporal do animal. 16 ΡΕ1597367

Um anticorpo do invento pode derivar de um anticorpo monoclonal "humanizado". Os anticorpos monoclonais humanizados são produzidos transferindo regiões determinantes de complementaridade de ratinho, das cadeias variáveis pesada e leve da imunoglobulina de ratinho, para um domínio variável humano e depois substituindo com os resíduos humanos as regiões estruturais das contrapartes de ratinho. A utilização de componentes de anticorpos derivados de anticorpos monoclonais humanizados obvia problemas associados a imunogenicidade das regiões constantes murinas. Estão descritas técnicas gerais para a clonagem de domínios variáveis das imunoglobulinas murinas (Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:3833 (1989)). Estão descritas técnicas para a produção de anticorpos monoclonais humanizados (Jones et al., Nature, 321:522 (1986); Riechmann et ai., Nature, 332:323 (1988); Verhoeyen et ai., Science, 239:1534 (1988); Cárter et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:4285 (1992); Sandhu, Crit. Rev. Biotech., 12:437 (1992); e Singer et ai., J. Immunol., 150:2844 (1993) ) .

Ainda, os anticorpos do presente invento podem ser derivados de um anticorpo monoclonal humano. Tais anticorpos são obtidos a partir de ratinhos transgénicos que foram "manipulados" para produzirem anticorpos humanos específicos como resposta à estimulação antigénica. Nesta técnica, os elementos dos ioci das cadeias pesada e leve humanas são introduzidos em estirpes de ratinhos derivados 17 ΡΕ1597367 de linhas celulares estaminais embrionárias que possuem destruições dirigidas dos loci das cadeias endógenas pesada e leve. Os ratinhos transgénicos podem sintetizar anticorpos humanos específicos de antigénios humanos e os ratinhos podem ser usados para produzir hibridomas secretores de anticorpos humanos. Estão descritos métodos de obtenção de anticorpos humanos a partir de ratinhos transgénicos (Green et al., Nature Genet., 7:13(1994); Lonberg et al., Nature, 368:856 (1994); e Taylor et al., Int. Immunol., 6:579 (1994)).

Os fragmentos de anticorpos do invento podem ser preparados por hidrólise proteolítica do anticorpo ou através da expressão em E. coli do DNA codificador do fragmento. Os fragmentos de anticorpos podem ser obtidos por digestão com pepsina ou papaína de anticorpos completos por métodos convencionais. Por exemplo, os fragmentos de anticorpos podem ser produzidos por clivagem enzimática de anticorpos com pepsina para proporcionar um fragmento 5S designado F(ab')2. Este fragmento pode ser ainda clivado usando um agente redutor tiol e facultativamente um grupo bloqueador dos grupos sulfidrilo resultantes da clivagem de ligações dissulfito, para produzir fragmentos monovalentes Fab' 3,5S. Como alternativa, uma clivagem enzimática que usa pepsina produz directamente dois fragmentos monovalentes Fab' e um fragmento Fc. Estes métodos estão descritos (Goldenberg, Patentes U.S. N° 4036945 e 4331647; e referências incluídas ali incluídas; Porter, Biochem. J., 73:119 (1959); Edelmean et al., Methods in Enzymology, Vol. 18 ΡΕ1597367 1, página 422 (Academic Press 1967); e Coligan et al., nas secções 2.8.1-2.8.10 e 2.10.1-2.10.4).

Outros métodos de clivagem de anticorpos, tais como separação das cadeias pesadas para formarem fragmentos monovalentes das cadeias pesada e leve, clivagem dos fragmentos ou outras técnicas enzimáticas, químicas ou genéticas podem também ser usados, desde que os fragmentos se liguem ao antigénio que é reconhecido pelo anticorpo intacto.

Por exemplo, os fragmentos Fv incluem, uma associação de cadeias VH e VL. Esta associação pode ser não covalente (Inbar et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 69:2659 (1972)). Como alternativa, as cadeias variáveis podem ser ligadas por uma ligação dissulfito intermolecular ou ligadas de forma cruzada por compostos químicos tais como glutaraldeído (Sandhu, supra). De preferência, os fragmentos Fv compreendem cadeias VH e VL ligadas por um péptido. Estas proteínas de cadeia simples de ligação ao antigénio (sFv) são preparadas através da construção de um gene estrutural compreendendo sequências de DNA codificadoras dos domínios VH e VL ligados por um oligonucleó-tido. O gene estrutural é inserido num vector de expressão, o qual é subsequentemente introduzido numa célula hospedeira como seja E. coli. As células hospedeiras recombinantes sintetizam uma única cadeia polipeptídica com um péptido de ligação a unir os dois domínios V. Estão descritos métodos para a produção de sFvs (Whitlow et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology, Vol. 2, página 97 19 ΡΕ1597367 (1991); Bird et al., Science, 242:423 (1988), Ladner et al., patente US N° 4946778; Pack et al., Bio/Technology, 11:1271 (1993); e Sandhu, supra).

Uma outra forma de um fragmento de anticorpo é um péptido codificador de uma única região determinante de complementaridade (CDR). Os péptidos CDR ("unidades mínimas de reconhecimento") podem ser obtidos através da construção de genes que codificam a CDR de um anticorpo com interesse. Tais genes são preparados, por exemplo, usando a reacção em cadeia da polimerase para sintetizar a região variável de RN A de células produtoras de anticorpos (Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology, Vol. 2, página 106 (1991)) . III. Um método para tratar um tumor metastático e para inibir a formação de metástases por uma célula tumo-ral. O invento pode ser usado para o tratamento de tumores metastáticos. "Tratar um tumor metastático" significa que se previne, retarda ou inibe a formação de metástases do tumor. Os tumores metastáticos incluem tumores no local primário capazes de formar metástases e tumores metastizados num local secundário. Tais tumores metastáticos podem ter origem em tecido pulmonar, hepático, renal, da glândula mamária, epitelial, da tiróide, leucé-mico, pancreático, do endométrio, do ovário, cervical, da pele, do cólon e linfóide. Um indivíduo que possa ser 20 ΡΕ1597367 tratado pode ser qualquer mamífero, incluindo o Homem, cães, símios, vacas e similares, com excepção de ratinhos.

Uma realização consiste em métodos de tratamento de um tumor metastático num indivíduo através da administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo que inibe a formação de metástases tumorais do presente invento. Os anticorpos do presente invento que inibem as metástases tumorais foram descritos atrás.

Um anticorpo que inibe a formação de metástases tumorais pode ser administrado sozinho ou juntamente com um veiculo farmaceuticamente aceitável. Um veiculo farmaceuti-camente aceitável inclui todos os solventes, tais como gorduras sólidas, óleos, água, soluções salinas, lípidos, lipossomas, resinas, elementos de ligação, elementos de enchimento, meios de dispersão, meios de cultura celular e similar, ou combinações dos mesmos, que não sejam tóxicos para o indivíduo que os recebe.

De acordo com o presente invento, os ingredientes activos podem ser combinados com o veículo de qualquer forma conveniente e prática, e.g., através de solução, suspensão, emulsionação, mistura, encapsulação, absorção e similares e, se necessário, através da formulação das composições combinadas em pastilhas ou comprimidos. Tais procedimentos são de rotina para os familiarizados com a área. 21 ΡΕ1597367

As dosagens de um anticorpo para serem terapeu-ticamente eficazes dependem do estado da doença e de outros factores clínicos, tais como peso e condição do indivíduo, da resposta do indivíduo à terapia, do tipo de formulações e da via de administração. A dosagem precisa de um composto para ser terapeuticamente eficaz pode ser determinada pelos familiarizados com a matéria. Como regra geral, a dosagem terapeuticamente eficaz de um anticorpo pode ser na gama entre cerca de 0,5 μg e cerca de 2 gramas por forma unitária de dosagem. Uma forma de dosagem unitária refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas às dosagens unitárias para o tratamento de mamíferos: cada unidade contém uma quantidade pré-determinada do material activo, calculada para produzir o efeito terapêutico pretendido em associação com qualquer veículo farmacêutico necessário. Os métodos do presente invento contemplam uma ou múltiplas administrações, dadas simultaneamente ou ao longo de uma período de tempo prolongado. A administração de um anticorpo inibidor da formação de metástases tumorais pode ser realizada de qualquer forma conveniente, incluindo por inalação de aerossóis, injecção, ingestão, transfusão, implantação ou transplantação. De preferência, os anticorpos do presente invento são administrados a um doente por injecção subcutânea (s.c.), intraperitoneal (i.p.), intra-arterial (i.a.) ou intavenosa (i.v.). 22 ΡΕ1597367 IV. Um método para diagnosticar cancro num mamífero. 0 invento também inclui métodos de diagnóstico de tumores metastáticos através da detecção da expressão de SIMA 135, conforme definido na reivindicação 8.

Os tumores metastáticos incluem tumores no local primário capazes de formarem metástases e tumores metas-tizados num local secundário. Tais tumores metastáticos podem ter origem em tecido pulmonar, hepático, renal, da glândula mamária, epitelial, da tiróide, leucémico, pan-creático, do endométrio, do ovário, cervical, da pele, do cólon e linfóide. A expressão de SIMA 135 pode ser detectada usando um anticorpo que se liga a SIMA 135 ou a um fragmento de SIMA 135. Podem ser empregues tanto os anticorpos poli-clonais como monoclonais.

Numa realização, é retirada uma amostra de um indivíduo, e.g., uma amostra de biopsia retirada de tecido suspeito de ter um tumor metastático. De um modo geral, a amostra é tratada antes de ser realizado o ensaio. Os ensaios que podem ser empregues incluem ELISA, RIA, EIA, análise de transferência Western, coloração imuno-histoquímica e similares. Dependendo do ensaio usado, os antigénios ou os anticorpos podem ser marcados com uma enzima, um fluoróforo ou um isótopo radioactivo. Ver e.g., 23 ΡΕ1597367

Coligan et al., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons Inc., New York, N.Y. (1994); e Frye et al., Oncogen 4:1153-1157, 1987. 0 tratamento da amostra pode variar, dependendo do ensaio que é usado para detectar SIMA 135. Por exemplo, células de biopsia de tecido podem ser lisadas e os lisados celulares serem usados em, e.g., análise de transferências Western. Para os ensaios tais como o ensaio de ELISA com células totais, as células podem ser lavadas, e.g., com PBS, e depois fixadas com 0,25% de glutaraldeido em PBS antes do ensaio. A imuno-histoquímica pode ser usada para diagnosticar um tumor metastático num organismo. Nesta realização, uma amostra é retirada de um organismo, e.g., uma amostra de biopsia é retirada de tecido suspeito de ter um tumor metastático. A amostra pode ser fixada numa lâmina e colocada em contacto com anticorpos, como aqui descritos, que se ligam a SIMA 135. Os anticorpos podem ser marcados com um enzima, um fluoróforo ou um isótopo radioactivo. Ver e.g., Coligan et al., Current Protocols in Immunology, John

Wiley & Sons Inc., New York, N.Y. Após ligaçao dos anticorpos a SIMA 135, a posição dos anticorpos é determinada através da utilização de técnicas conhecidas. A expressão extensa com coloração heteróloga de SIMA 135 por toda a amostra de tecido e a coloração dentro de glândulas malignas na serosa do cólon indicam cancro metastizado. 24 ΡΕ1597367 V. Um estojo ("kit") contendo um anticorpo que se liga selectivamente ao fragmento da reivindicação 2 e material para embalagem. 0 invento proporciona um estojo ("kit") contendo um anticorpo que se liga ao fragmento de SIMA 135 da reivindicação 2 e material para embalagem. Tais estojos ("kits") são úteis para embalar e guardar anticorpos que podem ser usados no tratamento e detecção de cancro. Especificamente, tais estojos ("kits") podem ser usados por pessoal médico, num laboratório, para detecção de cancro metastático numa amostra de tecido obtida a partir de um organismo. Ainda, tais estojos ("kits") podem ser úteis para o pessoal médico para a formulação de composições farmacêuticas que contêm um anticorpo do invento. 0 material de embalagem proporcionará um ambiente protegido ao anticorpo. Por exemplo, o material de embalagem pode manter o anticorpo sem que este esteja contaminado. Ainda, o material de acondicionamento pode manter um anticorpo em solução sem ficar seco.

Exemplos de materiais adequados que podem ser usados no acondicionamento de materiais incluem vidro, plástico, metal e similares. Tais materiais podem ser silanizados para evitar a adesão do anticorpo ao material de embalagem. 25 ΡΕ1597367 VI · Uma composição farmacêutica contendo um anticorpo que se liga selectivamente ao fragmento de SIMA 135 da reivindicação 2 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Uma composição do invento inclui um anticorpo que é formulado como uma composição farmacêutica e administrado a um hospedeiro animal, como seja um doente humano numa variedade de formas adaptadas à via de administração escolhida, i.e., oralmente ou parentericamente, pelas vias intravenosa, intramuscular, tópica ou subcutânea.

Assim, um anticorpo pode ser sistematicamente administrado, e.g., oralmente, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável, como seja um diluente inerte ou um veículo comestível assimilável. Podem estar inclusos em cápsulas de gelatina dura ou mole, podem ser compactados em comprimidos ou podem ser incorporados directamente com os alimentos na dieta alimentar do doente. Para administração oral terapêutica, o anticorpo pode ser combinado com um ou mais excipientes e usado na forma de comprimidos ingeríveis, comprimidos para dissolução na boca, pastilhas, cápsulas, elixires, suspensões. Xaropes, bolachas e similares. Tais composições e preparações deverão conter pelo menos 0,1% do anticorpo. A percentagem das composições e preparações pode, certamente, variar e pode, convenientemente, ser entre cerca de 2 e cerca de 60% do peso de uma determinada forma de dosagem unitária. A quantidade de um ou mais anticorpos em tais composições terapeuticamente 26 ΡΕ1597367 úteis é tal que será obtido um nivel de dosagem eficaz. Quando administradas oralmente, as composições do invento podem ser preferencialmente administradas numa cápsula de gelatina.

Os comprimidos, pastilhas, pílulas, cápsulas e similares podem também conter o seguinte: elementos de ligação tais como goma tragacanta, acácia, amido de milho ou gelatina; excipientes tais como fosfato dicálcico; um agente de desintegração como seja amido de milho, amido de batata, ácido algínico e similares; um lubrificante como o estearato de magnésio; e pode ser adicionado um agente edulcorante como seja a sucrose, frutose, lactose ou aspartamo ou um agente aromatizante como seja hortelã pimenta, óleo de Gaultheria, ou aroma de cereja.

Quando a forma de dosagem unitária é uma cápsula, ela pode conter, para além de materiais do tipo atrás descrito, um veículo líquido, como seja um óleo vegetal ou um polietilenoglicol. Vários outros materiais podem estar presentes como revestimento ou para de outra forma modificarem a forma física da forma de dosagem unitária sólida. Por exemplo, os comprimidos, pílulas ou cápsulas podem ser revestidos com gelatina, cera, laca ou açúcar e similares. Um xarope ou elixir pode conter o anticorpo ou anticorpos, sucrose ou frutose como agente edulcorante, metilparabeno ou propilparabenos como preservativos, um corante e aromatizante como seja o aroma de cereja ou de laranja. Certamente, qualquer material usado na preparação 27 ΡΕ1597367 de qualquer forma de dosagem unitária deverá ser farmaceu-ticamente aceitável e substancialmente não tóxico nas quantidades empregues. Ainda, o anticorpo ou anticorpos podem ser incorporados em preparações e sistemas de libertação controlada. 0 anticorpo ou anticorpos podem também ser administrados intravenosamente ou intraperitonealmente através de infusão ou injecção. Soluções do anticorpo ou anticorpos podem ser preparadas em água, facultativamente misturadas com um tensioactivo não tóxico. As dispersões podem também ser preparadas em glicerol, polietilenoglicóis líquidos, triacetina, e misturas dos mesmos e em óleos. Nas condições gerais de armazenagem e utilização, estas preparações possuem um preservativo para prevenir o crescimento de microrganismos.

As formas de dosagem farmacêuticas adequadas para injecção ou infusão podem incluir soluções aquosas ou dispersões estéreis ou pós estéreis compreendendo o anticorpo ou anticorpos que são adaptados para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões estéreis, injectáveis ou para infusão, facultativamente encapsuladas em lipossomas. Em todos os casos, a forma de dosagem final deverá ser estéril, fluida e estável nas condições de produção e armazenamento. 0 veículo líquido pode ser um solvente ou meio de dispersão líquido compreendendo, por exemplo, água, etanol, um poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicóis líquidos e similares), 28 ΡΕ1597367 óleos vegetais, ésteres de glicerilo não tóxicos e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pela formação de lipossomas, através da manutenção do tamanho de partículas necessário no caso de dispersões ou através da utilização de tensioactivos. A prevenção da actuação de microrganismos pode ser efectuada através de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e similares. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, tampões ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injectáveis pode ser efectuada pela utilização nas composições de agentes que retardem a absorção, por exemplo monostearato de alumínio e gelatina.

Soluções injectáveis estéreis são preparadas através da incorporação de um anticorpo ou anticorpos na quantidade necessária, no solvente adequado, com vários outros ingredientes enumerados atrás, conforme necessário, seguido de esterilização por filtração.

Exemplo I

Linhas celulares e hibridomas

As células HeLa de adenocarcinoma cervical humano, fibrossarcona HT 1080, adenocarcinoma do cólon DLD-1 e SW480, adenocarcinoma da mama MCF7, adenocarcinoma da próstata PC-3, metástases nos nódulos linfáticos de carcinoma 29 ΡΕ1597367 da próstata LNCaP, carcinoma do pulmão A549 e tumor rabdói-de do rim G401 foram adquiridas à American Type Culture Collection (Rockville, MD) . As células de cancro hepático humano HuH7 e HLE e de cancro gástrico MKN45 e STKM-1 foram fornecidas pelo Dr. Peter Vogt (The Scripps Research Institute, La Jolla, CA) e as de adenocarcinoma da mama MDA-MB-231 pelo Dr. Lilina Ossowski (Mount Sinai School of Medicine, NY) . As células de carcinoma epidermóide humano HEp3 foram obtidas a partir de tumores sólidos, passadas seriadamente na membrana corioalantóica (CAM) de embriões de galinha (Testa, 1992; Brooks et al., 1993). A variante metastática de células HEp3, HEp3 M+, foi cultivada durante menos de 20 dias antes de ser usada. A variante pouco metastática, HEp3 M-, foi mantida em cultura durante pelo menos 80 dias antes de ser usada. As células endoteliais microvasculares humanas (HEC) e os fibroblastos da derme (HDF) foram adquiridos à Clonetics (San Diego, CA) e mantidas em meio EGM-2 MV e FGM-2 (Clonetics) respectiva-mente. As linhas de células de cancro foram mantidas como culturas em monocamada em DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado com 10% FBS (HyClone, Logan, UT), piruvato de sódio, penicilina/estreptomicina e aminoácidos não essenciais (Invitrogen) e crescidas numa atmosfera húmida de 5% de CO2 a 37°C. Os hibridomas produtores de MoAb 41-2 foram gerados por uma abordagem de imunização subtractiva ante-riormente descrita (Brooks et al., 1993). A cultura de hibridomas e a purificação dos mAbs foram efectuadas pelo Protein and Nucleic Acids Core Facility do The Scripps Research Institute usando procedimentos convencionais. ΡΕ1597367 30

Exemplo II

Reagentes

Os inibidores de proteases, IgG de ratinhos normais, mAb anti-FLAG M2, reagente DAB e hematoxilina de Gill foram adquiridos à Sigma (St. Louis, MO). Os reagentes da transcrição reversa e de PCR e o vector pCR-II Topo foram da Invitrogen. PP2 foi adquirido à Calbiochem (La Jolla, CA).

Exemplo III

Purificação das proteínas, sequenciaçao de péptidos e análise proteica.

As imunoprecipitações foram realizadas em lisados de células HEp3 (5 x 107) não marcadas ou marcadas com 35S. A marcação metabólica foi realizada durante a noite em meio DMEM sem metionina/cisteína contendo a marca Tran 35S (100 μΟί/ιηΙ; ICN, Costa Mesa, CA). As células foram extensivamente lavadas com PBS, depois lisadas num tampão contendo Tris 0,1M (pH 8,0), 0,1% Triton X-100, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, trans-epoxi-succinil-L-leucilamido (4-guanidino)butano 10 μΜ, 20 μρ/ιηΐ de inibidor da tripsina de soja e 25 μρ/ιηΐ de aprotinina. Os lisados foram pré-clarifiçados contra proteína G-Sepharose (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) a 31 ΡΕ1597367 4°C durante 30 minutos, depois incubados durante a noite a 4°C com 20 μρ do mAb 41-2 ou, como controlo, com nmlgG. Os imunocomplexos foram precipitados usando proteína G-Sepharose e os complexos foram desnaturados através da fervura em tampão de aplicação redutor com SDS antes da análise por electroforese em gel de poliacrilamida. Para as proteínas marcadas com 35S, o gel foi seco e exposto a um filme a -80°C. Como alternativa as proteínas foram transferidas para membranas de fluoreto de polivinilidina (PVDF) (Millipore, Bedford, MA). A banda predominante corada com azul Coomassie, como 135 kDa, foi excisada, depois digerida com tripsina. Os péptidos foram separados por cromatografia líquida de alta pressão e sequenciados num sequenciador de proteínas Procise 494 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). A digestão com tripsina e a sequenciação de péptidos foram realizadas pelo Protein and Nucleic Acids Core Facility do The Scripps Research Institute. As sequências foram usadas para pesquisar a base de dados GenBank usando algoritmos disponíveis no sítio da rede do National Center for Biotechnology Information (NCBI). A sequência completa da proteína SIMA 135 foi analisada relativamente a domínios estruturais, sinais de processamento celular e motivos de consenso de modificação pós-tradução usando a base de dados Prosite (Falquet et al., 2002), o algoritmo SMART (Schultz et al., 1998), o algoritmo PSORT (Nakai e Kanehisa, 1992) e o algoritmo NetPhos 2.0 (Blom et al., 1999). ΡΕ1597367 32

Exemplo IV

Construções de expressão e transfecções tran- sitórias 0 cDNA de SIMA 135 no vector de expressão eucariótico pME18S-FL3 (GenBank número de acesso AK026622) foi gerado como parte do projecto de sequenciação de cDNA humano Japanese NEDO e gentilmente cedido pelo Dr. Hiroko Hata (Dept. of Virology, Institute of Medicai Science, University of Tokyo). A construção SIMA135FLAGin foi gerada por PCR colocando as sequências codificadoras do epitopo FLAG (DYKDDDDK) imediatamente antes do codão de paragem da construção parental. Ambas as construções foram sequen-ciadas. As células HeLa (4xl05) foram transfectadas transitoriamente com as construções de expressão de SIMA 135 ou com SIMA135FLAGin usando o reagente Superfect (Qiagen, Valência, CA) como descrito pelo fabricante. As células foram lisadas em tampão arrefecido em gelo contendo Tris 10 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM, 1% Triton X-100, EDTA 5 mM e uma mini-mistura completa de inibidores de proteases sem EDTA IX (Roche, Indianapolis, IN) . O material insolúvel foi removido por centrifugação a 14000 rpm durante 10 min.

Exemplo V

Clonagem do cDNA SIMA135 a partir de células HEp3

Isolou-se RNA total usando um estojo ("kit") 33 ΡΕ1597367 RNeasy (Qiagen) e 2 μq serviram como matriz numa reacção de transcrição reversa usando a transcriptase reversa Superscript II. Realizou-se PCR com 1 μΐ do cDNA resultante usando as sequências iniciadoras TCCCCACCGTCGTTTTCC (SEQ ID NO:2) e GGTTAGGAACACGGACGGGTG (SEQ ID NO:3) (projectados com base na sequência GenBank n° de acesso AK026622) e a enzima DNA-polimerase com correcção de provas Platinum Pfx. As condições de amplificação por PCR foram 94°C durante 3 min, 30 ciclos de 94°C durante 30 seg, 55°C durante 30 seg e 72°C durante 150 seg, seguido de uma extensão final de 10 min. a 72°C. Os produtos de PCR foram purificados em gel (Qiagen), dotados de caudas de adenosina com DNA-polimerase Taq Platinum, depois clonados no vector pCR-II Topo e sequenciados.

Exemplo VI

Imunofluorescência Células HeLa transfectadas transitoriamente com a construção de expressão SIMA135FLAG e células HEp3 foram semeadas em lamelas. Após incubação durante 48 hrs a 37°C, as células foram lavadas com PBS, depois fixadas em 2% de formaldeido. As células HeLa a serem incubadas com o mAb anti-FLAG foram ou não permeabilizadas através da incubação em 0,5% de Triton X-100 em PBS, durante 5 min à temperatura ambiente. Ambos os tipos celulares foram bloqueados em 5% de BSA em PBS. Após incubação durante a noite a 4°C com o mAb 41-2 (5 μg/ml) ou com o mAb anti-FLAG M2 (4 μρ/ιηΐ) em 34 ΡΕ1597367 tampão de bloqueio, as células foram lavadas com PBS, depois incubadas com anticorpos de cabra anti-IgG conjugados com Alexa Flúor 546 (2 μρ/ιηΐ) (Molecular Probes) . As células marcadas foram visualizadas e fotografadas usando um sistema de imagiologia de varrimento confocal BioRad 1024 MRC2.

Exemplo VII

Análise de transferência Northern

Uma transferência Northern de 12 pistas com múltiplos tecidos humanos (Clontech) foi hibridada com fragmentos do inserto de DNA EcoRI/HincII, derivados de cDNA SIMA 135 e marcados com [a-32P]dCTP (Ambion) , durante a noite em solução UltraHyb (Ambion) a 68°C. A transferência foi lavada para uma restringência final de SSC 0,1X, 0,1% SDS, a 68°C, depois exposta a filme a -80°C. As transferências foram testadas novamente com cDNA de β-actina para determinar a consistência do RNA aplicado em cada uma das pistas.

Exemplo VIII

Análise de transferência Western

Lisados celulares, meio condicionado sem soro e proteínas imunoprecipitadas foram separados por electro-forese através de géis de 8% SDS-poliacrilamida, depois 35 ΡΕ1597367 transferidos para membranas de nitrocelulose (Millipore). As membranas foram bloqueadas em 5% de leite em pó desnatado em PBS, depois incubadas durante a noite a 4°C, com mAb 41-2 (2 μg/ml), mAb anti-FLAG M2 (0,8 μg/ml) ou mAb anti-fosfotirosina (1 μg/ml; Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) . Após lavagem extensiva, as membranas foram incubadas durante 2 hr à temperatura ambiente com anticorpos de cabra anti-IgG de ratinho (0,16 μg/ml, Pierce, Rockford, II) e as bandas imuno-reactivas detectadas por quimioluminescência estimulada (Pierce).

Exemplo IX

Procedimentos de caracterização bioquímica

Para a remoção dos glicanos ligado em N, os lisados (50 μΐ) de células HEp3 M+ e de células HeLa transitoriamente transfectadas com a construção de expressão SIMA135FLAGin foram desnaturadas e reduzidas em 0,5% SDS, 1% β-mercaptoetanol durante 10 minutos a 100°C, depois incubados com PNGase (New England Biolabs, Beverly, MA) a 37°C durante 45 minutos. Para análise do nível basal de fosforilação de tirosina de SIMA135, culturas subconfluen-tes de células HEp3 e HeLa (como controlo negativo) foram incubadas a 3 7°C durante 30 minutos com DMEM sem soro contendo NaF 50 mM e Na3VC>4 1 mM, depois lavados com PBS arrefecido em gelo. Para a inibição da fosforilação da família de cinases Src, células HEp3 foram cultivadas em DMEM sem soro sem NaF e Na3V04, durante 30 minutos, a 37°C 36 ΡΕ1597367 com PP2 (50 μΜ). As células foram então Usadas em tampão arrefecido em gelo contendo Tris 50 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, 1% Triton X-100, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM, benzamidina 1 mM, 25 μg/ml de aprotinina, 25 μg/ml de leupeptina, NaF 50 mM e Na3V04 1 mM. O material insolúvel foi removido por centrifugação a 14000 rpm durante 10 min. A imunoprecipitação foi realizada como descrito atrás em 300 μρ de lisados celulares usando 1 μρ do mAb 41-2 ou nmlgG (como controlo negativo). Para os ensaios da presença de SIMA 135 solúvel, células HEp3 quase confluentes foram lavadas três vezes com PBS, depois incubadas em meio condicionado sem soro durante 24 hr. O meio foi colhido e centrifugado a 4°C e 10000 g, depois concentrado 10 vezes usando filtros de centrifugação com um peso molecular de exclusão de 30000 kDa (Millipore). Os lisados celulares foram colhidos como descrito atrás.

Exemplo X

Imuno-histoquímica

Secções de crióstato (6 μιη) derivadas de amostras de tecido de adenocarcinoma do cólon humano de três doentes foram fixadas em zinco-formalina, durante 15 min, lavadas rapidamente com PBS, depois os locais de ligação não especifica foram bloqueados através da incubação em PBS contendo 3% de BSA. O mAb 41-2 (5 μρ/ml) foi aplicado a 4°C durante a noite. A ligação de anticorpos específicos foi detectada pela adição de anticorpos anti-ratinho conjugados 37 ΡΕ1597367 com biotina (Pierce) seguido de neutravidina conjugada com peroxidase (Pierce) e visualização com reagente DAB. As secções foram contrastadas usando hematoxilina de Gill.

Exemplo XI 0 mAb 41-2 reconhece um antigénio de 135 kDa expresso em níveis elevados em células HEp3 de tumor humano altamente metastático 0 antigénio reconhecido pelo anticorpo mAb 41-2 foi identificado e caracterizado. Como passo inicial na determinação da significância do antigénio reconhecido pelo mAb 41-2, procedeu-se à análise de transferências Western com o mAb 41-2 em lisados (20 μg) , preparados a partir de células HEp3 altamente metastáticas (M+) e pouco metastá- ticas (M—) , sujeitos a electroforese em condições não redutoras. 0 anticorpo monoclonal (mAb) 41-2, gerado por imunização subtractiva, detectou uma única banda de aproximadamente 135 kDa em ambos os tipos celulares. Consistente com a abordagem de imunização subtractiva usada na geração do mAb 41-2, a proteína imuno-reactiva foi expressa em níveis mais elevados nas células HEp3 M+ do que em células M-. A coloração paralela com azul Coomassie de géis dos lisados preparados a partir de células HEp3 altamente metastáticas (M+) e pouco metastáticas (M-) demonstrou que o padrão e teor global de proteínas eram indistintos para os extractos de células HEp3 M+ e M-. A diferença na imuno-reactividade do mAb 41-2 mostra uma 38 ΡΕ1597367 diferença significativa no nível de expressão do antigénio cognato entre as duas linhas celulares.

Exemplo XII

Identificação do antigénio reconhecido pelo mAb 41-2 derivado de células HEp3 metastáticas 0 mAb 41-2 purificado foi usado para imunopre-cipitar o antigénio do Exemplo XI de células HEp3 M+. As proteínas marcadas com 35S imunoprecipitadas a partir das células HEp3 M+ com o mAb 41-2 ou com IgG de ratinho normal foram analisadas em SDS-PAGE em condições não redutoras. 0 gel foi seco e exposto a filme a -80°C durante a noite. A principal proteína imunoprecipitada a partir de células HEp3 marcadas radioactivamente tinha um peso molecular de aproximadamente 135 kDa. Isto foi consistente com o peso molecular do antigénio detectado no Exemplo XI. Numa experiência paralela usando células HEp3 não marcadas, em que as proteínas imunoprecipitadas foram transferidas para uma membrana PVDF, a banda proteica de 135 kDa foi removida, sujeita a digestão com tripsina e os fragmentos separados sequenciados a partir do extremo N. Foram obtidas três sequências peptídicas principais. A pesquisa das bases de dados não redundantes de proteínas do GenBank indicou que cada uma das sequências proteicas condiz exactamente, ou quase exactamente, com a sequência teórica de uma entrada não publicada com o número de acesso BAB15511, traduzida a partir da entrada de cDNA não publicada AK026622. 39 ΡΕ1597367 Péptido 1 FEIALPRESQITVLG(I)KXGT SEQ ID NO: 4 BAB15511 FEIALPRESNITVLIKXGT SEQ ID NO: 5 Péptido 2 XXXXIPGSTTNPE SEQ ID NO: 6 BAB15511 VEYYIPGSTTNPE SEQ ID NO: 7 Péptido 3 XYXLQVPSDILH SEQ ID NO: 8 BAB15511 SYSLQVPSDILH SEQ ID NO: 9 A sequência completa da proteína identificada, a qual foi desiqnada proteína de 135 kDa associada à imunização subtractiva de HEp3M+ (SIMA135), está apresentada na Figura 1. Para confirmar que SIMA 135 era a mesma proteína especificamente reconhecida pelo mAb 41-2, realizaram-se hibridações Western em lisados de células HEp3, células HeLa não transfectadas e células HeLa transitoriamente transf ectadas com cDNA SIMA 135. Quando da análise por transferências Western (25 μρ) com o mAb 41-2 dos lisados celulares totais sujeitos a electroforese em condições não redutoras, derivados de células HEp3, células HeLa com transfecção simulada e células HeLa transitoriamente trans-fectadas com o cDNA SIMA 135, o mAb 41-2 reagiu com a mesma banda proteica de 135 kDa que está presente em células HEp3 e em células HeLa transitoriamente transfectadas com o cDNA SIMA 135, mas ausente nas células HeLa não transf ectadas. Para proporcionar confirmação adicional, a região codificadora da proteína do mRNA de SIMA 135 foi clonada a 40 ΡΕ1597367 partir de células HEp3 por transcrição reversa-PCR. A análise da sequência de DNA de dois clones gerados por esta abordagem confirmou que o mRNA de SIMA 135 é expresso por estas células. Foram identificadas quatro diferenças nos nucleótidos entre a sequência do GenBank entrada AK026622 e SIMA 135 obtida a partir de células HEp3: nucleótidos 1684G_>A, 1847T_K;, 2236g->a e 2590g_>a. A segunda transição é silenciosa e as outras resultam em alterações de amino-ácidos 52 5Arg_>Gln, 7o9Gli->Asp e 827Ser^Asn, respectivamente .

Exemplo XIII

Características estruturais de SIMA135 A sequência da proteína SIMA 135 inclui 836 aminoácidos (SEQ ID NO:l-Figura 1) e tem um peso molecular deduzido de 92,9 kDa. A análise da sequência identificou as características estruturais que se seguem. Após Ala29, ocorre um péptido sinal putativo no extremo amina. Esta característica é consistente com a sequência do péptido 1 indicando que SIMA135 madura, com um peso molecular previsto de 90,1 kDa, começa em Fen30. Um potencial domínio transmembranar, abrangendo os resíduos 666 a 686 (delimitado na Figura 1), foi previsto (Hartman et al., 1989) para orientar SIMA 135 com o seu extremo carboxilo situado intracelularmente. Doze motivos de consenso para N- glicosilação estão indicados na Figura 1. Um motivo de consenso de palmitoilação do tipo 1 (IICCV) (Hansen et al., 41 ΡΕ1597367 1999) está situado nos resíduos 687 a 691. Estão presentes cinco motivos PXXP (Figura 1) que noutras proteínas se mostrou mediarem a ligação a domínios de homologia com Src (SH) 3 (Pawson 1995; Mayer, 2001) . Os cinco resíduos de tirosina (delimitados por um círculo na Figura 1) podem ser locais fosforilados. Dois resíduos de tirosina estreitamente espaçados (Tir734 e Tir743) estão presentes nos motivos de consenso (YXXL/I) para ligação ao domínio SH2 (Songyan et al., 1993) . SIMA 135 não possui homologia com outras proteínas confirmadas na base de dados não redundante GenBank. No entanto, SIMA 135 possui elevada homologia com a proteína teórica CDCP1 conforme determinado por tradução da sequência de ácidos nucleicos descrita (Scherl-Mostageer et al., 2001) . Ainda, foram identificadas duas regiões da proteína SIMA 135, abrangendo os resíduos 221 a 348 e 417 a 544, os quais possuem baixa homologia com os domínios CUB (subcomponentes proteicos do complemento Clr/Cls, factor de crescimento embrionárinário do ouriço do mar e proteína morfogénica do osso 1) (Bork e Beckmann, 1993) . Estes domínios foram descritos como actuando na mediação das interacções proteína-proteína (Chen e Wallis, 2001; Sieron et al., 2000) . Um terceiro domínio CUB putativo descrito por Scherl-Mostageer e colaboradores, abrangendo os resíduos 545 a 660 (Scherl-Mostageer et al., 2001), está abaixo do patamar de detecção de homologia dos algoritmos de pesquisa usados no varrimento da sequência de aminoácidos SIMA 135 e da sequência de aminoácidos teórica de CDCP1. ΡΕ1597367 42

Exemplo XIV

Padrão de expressão de SIMA 135 em células e tecidos normais e malignos

Realizou-se análise de transferências Northern com RN A poli A+ (1 μρ por pista) derivado de 12 tecidos humanos normais usando como sonda cDNA de SIMA 135 marcado com 32P. Os niveis de mRNA de β-actina estão apresentados como medida da quantidade de material aplicado. 0 padrão de expressão do mRNA SIMA 135 em 12 tecidos humanos normais foi avaliado por análise de transferência Northern através da hibridação com uma sonda de cDNA SIMA 135 de 2,8 kb marcado com 32P. Uma banda de aproximadamente 6,0 kb foi detectada em níveis mais elevados no músculo esquelético e cólon, com níveis de expressão mais baixos no rim, intestino delgado, placenta e pulmão. Um sinal fracamente detectável em ~6,0 kb estava também presente nos leucócitos de sangue periférico. Ainda, um sinal muito mais fraco em aproximadamente 3,3 kb estava presente no músculo esquelético, cólon, placenta e pulmão. O mRNA de SIMA 135 não foi detectado no cérebro, coração, timo, baço ou fígado. Com base no alinhamento de SIMA 135 com cDNA7 de CDCPl e sequências genómicas (dados não apresentados), parece provável que os dois transcritos de SIMA 135 detectados por análise de transferências Northern resultam do uso alternado de sinais de poliadenilação dentro da 3'UTR de SIMA 135. O transcrito mais longo e mais expresso pensa-se que tenha resultado da utilização de um sinal de 43 ΡΕ1597367 consenso de poliadenilação mais 3' (no nucleótido 5850), enquanto o transcrito mais curto, expresso em níveis mais baixos resulta provavelmente da utilização de um sinal de poliadenilação variante, menos eficiente, situado no nucleótido 3186. É igualmente possível que estes transcritos variantes resultam de "splicing" alternativo do pré-mRNA de SIMA 135. A expressão da proteína SIMA 135 em 16 linhas celulares humanas, 14 linhas celulares de tumores humanos e duas linhas celulares humanas normais que reagem com o mAb 41-2, foi analisada com transferências Western em condições não redutoras nas quais quantidades iguais de proteína de lisado celular (20 μρ) foram sujeitas a electroforese para cada linha celular. SIMA 135 foi mais expressa em células HEp3 metastáticas, com a linha celular de cancro da próstats PC3 e a linha celular de cancro do cólon DLD-1 também manifestando níveis elevados de expressão. Níveis moderados do antigénio foram detectados na linha celular de fibrossarcoma HT1080, as linhas celulares de cancro gástrico MKN45 e STKM-1, a linha celular de cancro do cólon SW480 e a linha celular de cancro da próstata não metastá-tico LNCaP. Níveis baixos de SIMA 135 foram detectados em 2 linhas celulares de cancro do fígado, 2 linhas celulares de cancro da mama, na linha celular de cancro do pulmão A549 e na linha celular de tumor rabdóide do rim G401. SIMA 135 não foi detectável em células endoteliais da microvascu-latura normal humana e células de fibroblastos dérmicos. Níveis variáveis da proteína SIMA 135 foram expressos numa 44 ΡΕ1597367 série de linhas de células tumorais humanas, enquanto dois tipos de células humanas normais não expressaram a proteína .

Exemplo XV SIMA 135 é uma glicoproteína fosforilada da superfície celular

Usou-se imunocitoquímica para determinar a localização de SIMA 135 em células HEp3 e também em células HeLa que foram transitoriamente transfectadas com uma construção de expressão de SIMA 135. A construção de expressão continha um epitopo FLAG fundido com o extremo carboxilo da proteína SIMA 135. As células HEp3 incubadas com o mAb 41-2 mostraram forte coloração na membrana plasmática. As células HeLa transitoriamente transfectadas com SIMA 135 marcada com FLAG também mostraram semelhante forte coloração da membrana quando incubadas com o mAb41-2. Ainda, o extremo carboxilo SIMA 135 foi determinado como intracelular uma vez que células HeLa transfectadas transitoriamente, permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100 para permitir o acesso do anticorpo à marca FLAG intracelular e incubadas com mAb anti-FLAG, mostraram forte coloração da membrana quando incubadas com o mAb anti-epitopo FLAG, enquanto as células não permeabilizadas apresentaram pouca ou nenhuma coloração de fundo com o mAb anti-FLAG. As células HeLa não transfectadas surgiram essencialmente sem coloração quando incubadas com o mAb 41-2 ou com um mAb anti-epitopo FLAG. Estes dados confirmaram a superfície da 45 ΡΕ1597367 célula como sendo a localização de SIMA 135 assim como a orientação tipo I de SIMA135. Igualmente, a coincidência de coloração observada com o mAb 41-2 e o mAb anti-FLAG em células HeLa transitoriamente transfectadas com a construção de expressão SIMA135-FLAG, confirmou ainda que SIMA 135 é o antigénio alvo para o mAb 41-2. 0 peso molecular teórico de SIMA 135 madura é 90.1 kDa. No entanto, o peso molecular aparente da proteína detectada pelo mAb 41-2 foi de 135 kDa. Os lisados celulares das células HeLa transitoriamente transfectadas com uma construção de expressão SIMA135-FLAG foram tratados com N-glicosidade F em condições óptimas para a actividade enzimática para determinar se a diferença no peso molecular era devida à N-glicosilação. As proteínas foram avaliadas por análise de transferência Western em condições redutoras, com o mAb anti-epitopo FLAG, para lisados não tratados (-) e tratados com N-glicosidase F (PNGase F) (+) derivados de células HeLa transitoriamente transfectadas com a construção de expressão SIMA135FLAGin. As bandas devidas a SIMA 135 estão indicadas. Uma banda com reacti-vidade cruzada não específica é aparente em 80 kDa. O tratamento com N-glicosidase F resultou no desaparecimento da banda de proteína SIMA 135 em 135 kDa e sua substituição por uma banda de peso molecular mais baixo de aproxi-madamente 95 a 105 kDa (dados não apresentados). Os lisados de células HEp3 M+ também forma imunoprecipitados com o mAb 41-2 e tratados com N-glicosidase F. As proteínas detecta-das de acordo com este método também manifestaram uma diminuição semelhante do peso molecular. Assim, até 30-40 46 ΡΕ1597367 kDa do peso molecular aparente de SIMA 135 é devido a N-glicosilação, consistente com o grande número de locais de consenso para glicosilação na região extracelular desta proteína (Figura 1, SEQ ID N°l). A região intracelular de SIMA 135 continha 5 resíduos tirosina (Figura 1). A análise de transferências Western em condições redutoras com um anticorpo anti-fosfotirosina foi realizada nas proteínas imunoprecipitadas de lisados de células HEp3 com o mAb 41-2 para determinar se algum destes resíduos é fosforilado. Foram realizadas imunoprecipitações com IgG de ratinho normal (nmlgG) ou com o mAb 41-2 a partir de células HEp3 e HeLa (controlo negativo). AS proteínas imunoprecipitadas foram testadas com um anticorpo anti-fosfotirosina (Anti-P-Tir) e com o mAb 41-2 para avaliar a presença de SIMA 135 fosforilada e total, respectivamente. As proteínas dos lisados celulares foram imunoprecipitadas com o mAb 41-2. Os lisados foram preparados a partir de células HEp3 não tratadas (-) ou incubadas (+) durante 30 minutos a 37°C com PP2 (50 μΜ). O anticorpo anti-fosfotirosina detectou uma proteína de 135 kDa que imunoprecipitou a partir das células HEp3 com o mAb 41-2. A mesma banda proteica foi detectada quando as proteínas imunoprecipitadas foram testadas com o mAb 41-2. A análise de transferências Western foi também realizada com proteínas imunoprecipitadas a partir de lisados de células HeLa com o mAb 41-2 e as proteínas imunoprecipitadas a partir de lisados de células HEp3 com IgG de ratinho normal como controlos. Ambas as imunoprecipitações não possuíam imuno-reactividade quando testadas com o - 47 - ΡΕ1597367 anticorpo anti-fosfotirosina ou com o mAb 41-2, demonstrando a especificidade das imuno-reacções observadas com as células HEp3. 0 envolvimento de um membro da família das cinases Src na fosforilação das tirosinas de SIMA 135 foi avaliado usando PP2, um inibidor das cinases de tirosina selectivo para a família Src (Hanke et al., 1996). A análise de transferências Western com um anticorpo anti-fosfotirosina das proteínas imunoprecipitadas a partir de lisados de células HEp3 com o mAb 41-2, mostrou que as células HEp3 tratadas com PP2 durante 30 minutos possuíam uma redução significativa (-75%) no nível de fosforilação de tirosinas de SIMA 135 comparativamente com a proteína de células HEp3 não tratadas. A análise de transferência Western, usando o mAb 41-2, das mesmas proteínas imunoprecipitadas, indicou que quantidades aproximadamente iguais da proteína SIMA135 estavam presentes em ambas as pistas na membrana. Estes dados sugerem que um membro da família de cinases Src actue durante a fosforilação de tirosinas de SIMA 135 em células HEp3.

Uma série de proteínas integrais da superfície celular, tais como c-met (Wajih et al., 2002) e CD44 (Goebeler et al., 1996) são também produzidas como moléculas solúveis. A análise de transferências Western, com o mAb 41-2 como sonda, foi empregue para avaliar se as células HEp3 produziam uma forma solúvel de SIMA 135. As culturas de células HEp3 foram lavadas extensivamente com PBS, depois incubadas durante 20 hr com meio sem soro (SF). O meio condicionado (CM) foi colhido, o material celular foi removido por centrifugação e o meio depois concentrado 48 ΡΕ1597367 10 vezes. O anticorpo mAb 41-2 detectou uma banda imuno-reactiva de aproximadamente 110 kDa em HEp3 SFMC. SIMA 135 celular derivada dos lisados de HEp3 foi detectada a 135 kDa. Pelo contrário, células HeLa não transfectadas, as quais não produzem SIMA 135, não deram bandas imuno-reactivas no lisado ou em SFCM concentrado. Estes dados indicam que as células HEp3 libertam uma forma solúvel de SIMA 135 e a forma solúvel apresenta-se como uma proteína imuno-reactiva de peso molecular mais baixo.

Exemplo XVI

Expressão de SIMA 135 em cólon normal e canceroso A análise imuno-histoquímica foi realizada para determinar a localização in vivo de SIMA 135 em cólon normal e canceroso. Secções (6 jim) foram coradas com o mAb 41-2 como anticorpo primário. Mucosa colónica normal representativa mostra a expressão epitelial de SIMA 135 (castanho avermelhado na fotografia a cores, não apresentado) . Os carcinomas do cólon apresentam expressão heterogénea e extensa de SIMA 135. SIMA 135 é expressa pelas células dentro de glândulas malignas invasoras na serosa do cólon. SIMA 135 é expressa pelas células epiteliais malignas dentro do lúmen de um vaso sanguíneo de drenagem na serosa do cólon. Na mucosa do cólon normal, SIMA 135 foi expresso exclusivamente pelas células epiteliais onde estava presente uniformemente nas superfícies luminal e basal das células que delimitam o lúmen do cólon e nas superfícies apicais das células que delimitam as criptas 49 ΡΕ1597367 glandulares (dados não apresentados). A presença de uma coloração intensa no conteúdo das células de Goblet das criptas e no muco no lúmen das glândulas suporta a hipótese de SIMA 135 ser produzida na forma solúvel pelas células epiteliais do cólon. Nas amostras de carcinoma do cólon SIMA 135 foi extensivamente e heterogeneamente expressa com alguma acentuação focal no muco dentro das glândulas malignas. Alguns grupos de células cancerosas invasoras coraram fortemente, mostrando a presença de SIMA 135 nas membranas basal, apical e lateral, assim como dentro do muco glandular. Houve uma tendência definitiva no sentido da associação de uma coloração intensa com glândulas invasoras malignas uma vez que as células de carcinoma mais profundas na serosa do cólon e dentro dos vasos sanguíneos de drenagem frequentemente foram fortemente positivas para o antigénio SIMA 135. As secções de controlo que foram incubadas com o anticorpo secundário mas não com o anticorpo primário não tinham qualquer coloração.

Exemplo XVII

Seguindo os procedimentos de transfecção atrás descritos para células HeLa, foram usadas 7 linhas celulares diferentes para estudar e monitorizar a expressão do mRNA de SIMA 135. Destas linhas celulares, o clone n° 3 produziu um sinal de par de bases significativo adequado. A capacidade destas linhas celulares para se movimentarem num estudo in vitro, para metastizarem e para formarem tumores em ratinhos SCID e para colonizarem órgãos 50 ΡΕ1597367 secundários em ratinhos SCID foi igualmente estudada. Determinou-se que o clone 3 era capaz de se destacar e migrar através de membranas porosas e in vivo e de colonizar órgãos secundários. Estes resultados demonstram que SIM 135 é um factor central chave no controlo das metástases. As células transformadas do clone n° 3 são também úteis como sistema celular para identificação de agentes que promovem ou inibem/minimizam as metástases de células malignas.

Seguindo os procedimentos de transfecção atrás descritos, 7 linhas celulares diferentes foram empregues para estudar os efeitos da expressão de SIMA 135. Estas linhas celulares estão ilustradas na Figura 8. Seguindo os processos analíticos para a detecção do RNA de SIMA 135 apresentados atrás, foram analisadas estas 7 linhas celulares. A Figura 7 mostra os resultados da análise por RT-PCR destas 7 linhas celulares diferentes monitorizando o mRNA de SIMA 135. Os controlos e os dados de RT-PCR irrelevantes estão na parte esquerda da Figura 1. A parte direita da figura mostra um sinal amplificado de 600 pb gerado a partir de sequências iniciadoras específicas de SIMA 135. Células HeLa não transfectadas não dão qualquer sinal, HeLa n° 4 também não dá qualquer sinal e Eff(2)n°3, agora designada clone n°3, gera um sinal substancial de 600 pb. Estes dados indicam que as células do clone n°3 possuem níveis elevados do mRNA de SIMA 135.

Amostras destas 7 linhas celulares foram lisadas e os conteúdos celulares analisados de acordo com um 51 ΡΕ1597367 procedimento Western convencional para determinar a presença de SIMA 135 através da ligação ao mAb 41-2. As transferências Western nos lisados preparados a partir de 7 linhas celulares diferentes foram testadas com o mAb 41-2. Os resultados demonstram que o clone n°3 (Eff(2)n°3) produz níveis substanciais de proteína imuno-reactiva SIMA 135. Esta linha celular clonada produz mais proteína SIMA 135 do que a nossa linha celular HEp-3 altamente metastática, M+. 0 clone #4 e as células parentais HeLa não produzem proteína SIMA 135 detectável.

Uma vez confirmado que tinham sido obtidas células negativas para SIMA 135 e células que expressam abundantemente SIMA 135, estas células foram testadas relativamente ao seu potencial maligno, i.e. relativamente à sua capacidade para crescer e formar tumores em ratinhos SCID e relativamente à sua capacidade para colonizar órgãos secundários em ratinhos SCID. A Tabela I é um resumo de dois tipos de ensaios separados: o painel A mostra os resultados de ensaio experimental de metástases em que as células com interesse são inoculadas (i.v.) directamente na veia da cauda do ratinho. Algumas semanas mais tarde, órgãos seleccionados dos ratinhos inoculados foram analisados relativamente à presença de células humanas (DNA humano) no fundo de DNA total dos órgãos de ratinho. A análise foi realizada por PCR em tempo real usando sequências iniciadoras específicas baseadas nas sequências repetidas alu como descrito na referência que se segue (A. Zijlstra et al., Câncer Research, 2002). Os resultados apresentados no painel A indicam que as células do clone 52 ΡΕ1597367 n°3 colonizam e/ou crescem em pulmão e medula óssea de ratinho em níveis substancialmente acima das células do clone n°4 inoculadas de forma semelhante. É igualmente aparente que o clone n°3 não se dissemina por todo o ratinho inoculado, uma vez que um outro órgão aqui apresentado, o pâncreas, apenas possui níveis de fundo das células do clone n°3 e do clone n°4. 0 painel B da Tabela 1 mostra os resultados de um ensaio convencional de metástases espontâneas em que as células são inoculadas subcutaneamente nas coxas de ratinhos SCID, os tumores desenvolvem-se até cerca de 100 mg e depois órgãos seleccionados, geralmente os pulmões, são analisados relativamente a depósitos metastáticos. As metástases secundárias foram medidas pelos mesmos procedimentos de PCR em tempo real para alu que são específicos de DNA humano. Os resultados indicam que o clone n° 3 e o clone n°4 formam tumores primários de tamanho aproxima-damente igual (peso em miligramas-mg). No entanto, o clone n°3 parece ter metastizado para os pulmões num nível pelo menos 10 vezes superior ao do clone n°4. Pode ser mais de 10 vezes superior uma vez que o nível de células no pulmão do clone n°4 está perto do nível de fundo (50-100 células) em níveis dificilmente detectáveis.

Os resultados demonstram que a introdução ou a expressão da proteína SIMA 135 nas células que normalmente não a produzem confere propriedades malignas a essas células. De forma a caracterizar estes dois clones 53 ΡΕ1597367 relativamente a propriedades que possam indicar porque é que adquiriram potencial maliqno realizámos alguns ensaios biológicos celulares com os clones.

Um ensaio de crescimento ou proliferação celular foi realizado em cultura celular de acordo com os procedimentos descritos atrás. 0 crescimento in vitro destes dois clones é semelhante e também semelhante ao das células HeLa parentais. Assim, a simples velocidade de proliferação não é motivo para o seu potencial maligno diferencial.

Um ensaio de migração trans-alveolar, pelo qual as células com interesse são forçadas a migrarem através de um filtro poroso inserido entre duas câmaras, foi igualmente realizado. 0 ensaio foi conduzido com meio de cultura. Os resultados estão apresentados na Figura 10. A câmara superior possui as células em meio, enquanto a câmara inferior possui meio enriquecido com soro fetal de vitela (FCS) para atrair as células que migram da câmara superior. Os resultados mostram que as células do clone n°3 são muito mais migradoras que as células do clone #4. Esta poderá ser uma das propriedades adquiridas pelas células que expressam SIMA 135 em excesso e que contribui para o seu potencial maligno. Dados preliminares também indicam que as células do clone n°3 parecem ser mais resistentes que as células do clone n°4 à apoptose induzida quimicamente pelo composto ara C. 54 ΡΕ1597367

Tabela I

Malignidade in vivo de dois clones de HeLa; Clone #4 (negativo para SIMA 135) e clone #3 (expressa abundantemente SIMA 135) inoculados em ratinhos SCID. A. Metástases experimentais (inoculação i.v. na veia da cauda) Número calculado de células humanas/órgão* #4 #3 Pulmão 150 2300 Medula óssea <100 9500 Pâncreas 150 200 B. Metástases espontâneas (inoculação subcut< anea) ratinhos inoculados com #4 ratinhos inoculado com #3 Peso do tumor primário (mg) 227,5+68 (n=8) 184,1+26 (n=7) Células humanas no pulmão (# células)* 250* 2800* * baseado em PCR em tempo real para alu realizado em DNA total extraído do órgão removido 2 semanas após inoculação i.v. e 4 semanas após inoculação s.c.

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Songymg Z, Shoebon SE, Ottudhuri M, CHsh G} Pawson T, Baser WG, Kmg F, Roberts T, Ratnoísky S, Lechldder RI, N*çj BG. Bíigô RB, Fajardo XE, Orou MM, Hanafusa H, Schaííhâuseit B tod Caniley LC (1993), Cati, 72,767-778,

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Ainda que as especificações anteriores deste invento tenham sido descritas relativamente a determinadas realizações preferidas do mesmo, e muitos detalhes tenham sido descritos com fins ilustrativos, será aparente para os familiarizados com a matéria que o invento é susceptivel de outras realizações e que determinados detalhes aqui descritos podem variar consideravelmente sem se afastarem dos princípios básicos do invento.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> NOVARTIS AG <120> Métodos para o diagnóstico de cancro e decréscimo de metástases por células cancerosas. <130> 4-33290 <160> 9 <170> Patentln versão 3.2 57 ΡΕ1597367 <210> 1 <211> 836 <212> PRT <213> Humano <40 0> 1

Met Ala Gly Leu ASO cys Gly val Ser il e Ala Leu Leu Gly val Leu I 5 10 15 Leu LêU Gly Ala Ala Arg Leu Pro Arg Gly Ala Glu Ala Phe GlU He 20 25 30 Ala Leu Pro Arg Glu Ser Asn Ile Thr val Leu ile Lys Leu Gly Thr 35 40 45 Pro Thr Leu Leu Ala Lys pro cys Tyr He val He ser Lys Arg His 50 55 60 He Thr Met Leu Ser He Lys ser Gly Glu Arg Ile val Phe Thr Phe 65 70 75 80 ser Cys Gin ser Pro 61 u Asn His Phe val He Glu He Gin Lys ASO S5 90 95 He Asp Cys Met Ser Gly Pro cys Pro Phe Gly Glu val Gin teu Gin 100 105 110 Pro ser Thr Ser Leu Leu Pro Thr Leu Asn Arg Thr Phe He Trp Asp 115 120 125 vai LVS 13Ô Alã HÍS Lys ser He 335 Gly Leu 61 u Leu Gin 140 Phe ser He Pro Aro Leu Arg Gin Ile Gly Pro Gly Glu ser Çys Pro Asp Gly Val Thr 145 150 155 160 Hl S Ser He ser Gly Arg Ile Asp Ala Thr Val Val Arg Ile Gly Thr 165 170 175 Phe Cys Ser Asa Gly Thr Vai Ser Arg ile Lys Met Gin Glu Gly val ISO 185 190 58 ΡΕ1597367

Lys Met Ai a Leu His Leu pro Trp Phe His Pro Arg Asn val Ser Gly 195 200 205 Phe Ser Xl e Ala Asn Arg Ser Ser ile Lys Arg Leu cys lie xle Glu 210 215 220 Ser* vai Phe Glu Gly Glu Gly ser Ala Thr Leu Met Ser Ala Asn Tyr 225 230 235 240 Pro Glu Gly phe Pro Glu Asp Glu ueu Met Thr Trp Gin phe Val val 245 250 255 Pro Ala His Leu Arg Ala Ser vai ser Phe Leu Asn phe Asn Leu Ser 260 265 270 Asn cys Glu Arg Lys Glu Glu Arg vai Glu Tyr Tyr He Pro Gly ser 275 280 285 Thr Thr Asn Pro Glu vai Phe Lys Leu Glu Asp Lys Gin Pro Gly Asn 290 295 300 Met Ala Gly Asn Phe Asn Leu Ser Leu Gin Gly cys Asp Gin ASp Ala SOS 310 315 320 61 nf Ser pro Gly lie Leu Arg Leu Gin Phe Gin vai Leu val Gin His 32S 330 335 pro Gin Asn Glu Ser Asn Lys lie Tyr Vai vai Asp Leu ser Asn Glu 340 345 350 Arg Ala Met ser Leu Thr lie Gl u Pro Arg Pro Val Lys Gin ser Arg 355 360 365 lys Phe Vai Pro Gly Cys Phe vai cys Leu Glu ser Arg Thr cys ser 370 375 380 Ser Asn Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Lys His Lys lie ser Phe Leu 385 390 395 400 Cys ASp ASp L€U Thr Arg Leu Trp Met Asn val Glu tys Thr ile ser 405 420 415 Cys Thr ASp His Arg Tyr Cys Gin Arg Lys Ser Tyr SêF LéU Gin val 420 425 430 Pro ser A*P lie Leu Leu Pro vai Glu Leu His Asp Phe ser Trp 435 440 445

Lys teu Leu vai Pro Lys Asp Arg Leu Ser Leu vai Leu vai Pro Ala 450 455 460 59 ΡΕ1597367

Gin Lys Leu Gin Gin His Thr HIS Glu Lys Pro cys Asn Thr Ser Phe 465 470 475 480 ser Tyr Leu Val Ala Ser Ala rle Pro Ser Gin Asp Leu Tyr Phe Gly 48$ 490 495 Ser phe cys Prg Gly Gly Ser xle Lys Gin Ile Gin val tys Gin Asn SOO 505 510 lie ser Val Thr Leu Arg Thr Phe Ala Pro Ser Phe Arg Gin Glu Ala 515 520 525 Ser Ara Gin Gly Leu Thr val ser Phe lie Pro Tyr Phe Lys Glu Glu 530 535 540 Gly val Phe Thr val Thr pro ASp Thr tys Ser Lys val Tyr Leu Arg 545 550 SS5 560 Th r pro Asn Trp ASp Arg Gly Leu Pro ser Leu Thr Ser val Ser Trp 565 570 575 A£0 lie ser val ΡΓΟ Arg Asp Gin val Ala Cys Leu Thr Phe Phe Lys 5S0 585 590 Gly Arg Ser Gly val Val Cys Gin Thr Gly Arg Ala Phe «et ile xl e 595 600 605 Gin Glu Gin Arg Thr Arg Ala Gl« Glu Ile Phe Ser Leu Asp GlU ASp 610 615 620 val teu ΡΓ0 iys Pro ser Phe HÍS H1S His Ser Phe Trp Val Asn Xle 62 S 630 635 640 Ser Asn cys ser Pro Thr Ser Gly Lys Gin Leu Asp Leu Leu Phe ser 645 650 655 vai Thr ueu Thr pro Arg Thr val Asp Leu Thr val Ile Leu Ile Ala 660 665 670 Ala val Gly Gly Gly Val Leu Leu Leu Ser Ala Leu Gly Leu Ile xle 675 660 685 cys cys 690 Val Lys tys Lys Lys 695 Lys Lys Thr Asn Lvs 7Õ0 Gly pro Ala Val Gly Ile Tyr Asn Gly Asn Ile Asn Thr Glu Het pro Arg Gin pro Lys 705 710 715 720 Lys Phe Gin tys Gly Arg Lys Asp Asn ASp Ser HÍS val Tyr Ala Val 725 730 735 60 ΡΕ1597367

He Glu Asp Thr Met vai Tvr Gly His teu Leu Gin Asp ser ser Gly 740 745 750

Ser phe Leu Gin Pro Glu vai Asp Thr Tyr Arg pro phe Gin Gly Thr 755 760 765

Met Gly vai cys Pro Pro ser Pro pro Thr He tys ser Arg Ala pro 770 775 7B0

Thr Ala Lys Leu Ala Thr Glu Glu Pré Pro Pro Arg ser Pro Pro Glu 785 7S0 795 800

Ser Glu Ser Glu pro ryr Thr Phe ser His Pro Asn Asn Gly Aso vai 805 S1G 815

Ser ser Lys Asp Thr Asp lie Pro teu teu Ser Thr Gin Glu pro Ptet 820 825 830

Glu pro Ala Glu 835 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sequência iniciadora <400> 2 tccccaccgt cgttttcc <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sequência iniciadora <400> 3 ggttaggaac acggacgggt g <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> humana <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido natural 61 ΡΕ1597367 <400> 4

Fhe Glu He Ala leu Pra Ar§ £lu Ser <s*ín He Thr vai Leu Glv xle 15 10 15

Lys Xaa Gly Tfir 20 <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> humano <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido natural <400> 5

Phe Olu lie Ala Leu Pro Arg Glu ser Asrt ile Thr vai Leu ile tys 15 10 15

Xaa Gly Thr <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> humano <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido natural <400> 6

Xaa Xaa xaa xaa lie Pro Gly ser Thr Thr Asn Pro Glu 1 5 10 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> humano <400> 7 62 ΡΕ1597367 vai Glu Tyr Tyr lie Pro Gly ser Thr Thr Aso pro Glu 1 5 10 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> humano <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido natural <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido natural <400> 8

Xaa Tyr xaa Leu Gin Vai Pro ser Asp lie Leu His 1 5 10 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> humano <400> 9

Ser Tyr ser Leu Gin Vai Pro Ser Asp Ile teu His 1 S 10

Lisboa, 26 de Agosto de 2010

Claims (8)

1. ΡΕ1597367 1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:l, em que a proteína é uma proteína fosfotirosina.
2. 2. Um fragmento imuno-reactivo solúvel de SEQ ID N0:1 com um peso molecular de aproximadamente 110 kDa em SDS-PAGE redutora e obtido a partir de meio condicionado de uma cultura de células HEp3.
3. 3. Um anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao fragmento da reivindicação 2, em que o referido anticorpo não é o anticorpo monoclonal 41-2.
4. 4. 0 anticorpo monoclonal da reivindicação 3, em que o anticorpo reconhece uma proteína glicosilada que consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO:l, mas que não reconhece uma proteína não glicosilada que consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO:l.
5. 5. Um anticorpo monoclonal que se liga especificamente a uma proteína consistindo na sequência de aminoácidos SEQ ID NO:l, para usar no tratamento de carcinoma epidermóide ou de cancro da próstata, em que o referido anticorpo não é o anticorpo monoclonal 41-2. 2 ΡΕ1597367
6. 6. Uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo de acordo com a reivindicação 3 ou 4 e um veiculo farmaceuticamente aceitável.
7. 7. Um estojo ("kit") compreendendo o anticorpo de acordo com a reivindicação 3 ou 4 e material de embalagem.
8. 8. 0 anticorpo de acordo com a reivindicação 3 ou 4 para usar num método de diagnóstico de cancro que compreende (a) visualização da ligação de um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações a uma secção de tecido e (b) determinação se o anticorpo causa coloração heteróloga da amostra de tecido, o que indica expressão extensa de SIMA 135 da SEQ ID N0:1 ao longo da amostra de tecido, ou se cora as glândulas malignas na serosa do cólon. Lisboa, 26 de Agosto de 2010