RS56985B1 - Antitela protiv alfa receptora folata i njihove upotrebe - Google Patents

Antitela protiv alfa receptora folata i njihove upotrebe

Info

Publication number
RS56985B1
RS56985B1 RS20180252A RSP20180252A RS56985B1 RS 56985 B1 RS56985 B1 RS 56985B1 RS 20180252 A RS20180252 A RS 20180252A RS P20180252 A RSP20180252 A RS P20180252A RS 56985 B1 RS56985 B1 RS 56985B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
frα
antibody
seq
amino acid
acid sequence
Prior art date
Application number
RS20180252A
Other languages
English (en)
Inventor
Daniel John O'shannessy
Original Assignee
Eisai R&D Man Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eisai R&D Man Co Ltd filed Critical Eisai R&D Man Co Ltd
Publication of RS56985B1 publication Critical patent/RS56985B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57515—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the breast
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5752—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the lungs
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57535—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the large intestine, e.g. colon, rectum or anus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57545—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the ovaries
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5755—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the uterine cervix, uterine corpus or endometrium
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57557—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of other specific parts of the body, e.g. brain
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • G01N33/5759—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites involving compounds localised on the membrane of tumour or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/82—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving vitamins or their receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
OBLAST TEHNIKE
[0001] Ovde obezbeđeni predmet odnosi se na (FRα)-specifična antitela protiv alfa receptora folata.
OSNOVA
[0002] Kod ljudi, receptor visokog afiniteta za folat nalazi se u četiri izoforme: alfa, beta, gama, i delta. Alfa, beta i delta oblici su tipično vezani za membrane ćelija sa glikozil fosfatidilinozitolnim (GPI) sidrom. Recikliraju se između ekstracelularnih i endocitoznih odeljaka i sposobni su da transportuju folat u ćeliju. Rastvorljivi oblici receptora folata mogu se dobiti dejstvom proteaza ili fosfolipaze na folatne receptore usidrene na membrani.
[0003] Alfa receptor folata (takođe označen kao FRα, FR-alfa, FOLR-1 ili FOLR1) eksprimiran je u različitim epitelnim tkivima, uključujući ona od horioidnog pleksusa, pluća, tiroidee, bubrega, uterusa, dojke, jajovoda, epididimisa, i pljuvačnih žlezda. Weitman, SD et al., Kancer Res 52: 3396-3401 (1992); Weitman SD et al., Kancer Res 52: 6708-6711 (1992). Prekomerna ekspresija FRα uočena je kod različitih kancera, uključujući kancer pluća (npr., karcinoidni tumori, nesitnoćelijski kanceri pluća, kao što su adenokarcinomi); mezoteliom; kancer jajnika; bubrežni kancer; kancer mozga (npr., anaplastični ependimom, cerebelarni juvenilni pilocitni astrocitom, i metastaze u mozgu); kancer grlića materice; nazofaringijalni kancer; mezodermalno izvedeni tumor; karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata; kancer endometrijuma; papilarni serozni i endometrijalni adenokarcinomi jajnika, serozni cistadenokarcinomi jajnika, kancer dojke; kancer bešike; kancer pankreasa; kancer kostiju (npr., osteosarkom visokog gradusa); kancer hipofize (npr., adenomi hipofize); kolorektalni kancer i medularni tiroidni kancer. Videti npr., U.S. Patent No. 7,754,698; U.S. Patent Publication No. 2005/0232919; Int1. Pub1. No. WO 2009/132081; Bueno R et al., J of Thoracic and Cardiovascular Surgery, 121(2): 225-233 (2001); Elkanat H & Ratnam M. Frontiers in Bioscience, 11, 506-519 (2006); Basal et al., PLoS ONE, 4(7):6292 (2009); Fisher RE J Nucl Med, 49: 899-906 (2008); Franklin, WA et al., Int J Kancer, Suppl 8: 89-95 (1994); Hartmann LC et al., Int J Kancer 121: 938-942 (2007); Iwakiri S et al., Annals of Surgical Oncology, 15(3): 889-899 (2008); European patent publication EP 2199796, Parker N. et al., Analytical Biochemistry, 338: 284-293 (2005); Weitman, SD et al., Kancer Res 52: 3396-3401 (1992); Saba NF et al., Head Neck, 31(4): 475-481 (2009); Yang R et al., Clin Kancer Res 13: 2557-2567 (2007). Kod nekih tipova kancera (npr., karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata), visok nivo FRα ekspresije je povezan sa lošom prognozom, dok je kod drugih tipova kancera (npr., nesitnoćelijskih kancera pluća), viši nivo FRα ekspresije povezan sa boljom prognozom. Videti, npr., Iwakiri S et al., Annals of Surgical Oncology, 15(3): 889-899; Saba NF et al., Head Neck, 31(4): 475-481 (2009). Smith et al, Hybridoma, vol 26, no.5, 2007-10 pg 281-288 opisuje monoklonsko antitelo koje se može koristiti za detekciju alfa receptora folata.
[0004] Ranije otkrivanje kancera poboljšava stope preživljavanja i kvalitet života. Da bi se poboljšala verovatnoća ranog otkrivanja i tretmana, mora postojati urgentnost za ne-invazivne postupke za dijagnozu FRα-eksprimirajućih kancera i za monitoring postojećih FRαeksprimirajućih kancera.
REZIME
[0005] Ovde su obezbeđena antitela koja se specifično vezuju za FRα. Takođe su opisani povezani polinukleotidi sposobni da kodiraju obezbeđena antitela, ćelije koje eksprimiraju obezbeđena antitela, kao i povezani vektori i detektabilni obeleživači antitela. Dodatno, opisani su postupci za upotrebu obezbeđenih antitela. Na primer, obezbeđena antitela se mogu koristiti za dijagnozu kancera; praćenje napredovanja kancera, regresiju, ili stabilnu bolest; razvijanje prognoze kancera kod subjekta; za određivanje da li kod pacijenta treba tretirati kancer, ili za određivanje da li je subjekat pogođen sa FRα-eksprimirajućim kancerom i stoga može biti pogodan za tretman sa FRα-specifičnim anti-kancer terapeuticima.
[0006] Prvi aspekt prema predmetnom pronalasku obezbeđuje izolovano antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, specifičan za alfa receptor folata (FRα) koje sadrži CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 26, CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 27, CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 28, CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 30, CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 31, i CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 32.
[0007] Drugi aspekt prema predmetnom pronalasku obezbeđuje izolovani polinukleotid koji kodira antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, specifičan za alfa receptor folata (FRα), naznačen time da CDR1 lakog lanca kodiranog antitela sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26, CDR2 lakog lanca kodiranog antitela sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 27, CDR3 lakog lanca kodiranog antitela sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28, CDR1 teškog lanca kodiranog antitela sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 30, CDR2 teškog lanca kodiranog antitela sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31, i CDR3 teškog lanca kodiranog antitela sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 32.
[0008] Treći aspekt prema predmetnom pronalasku obezbeđuje vektor koji sadrži izolovani polinukleotid prema bilo kom od patentnih zahteva 5 do 6.
[0009] Četvrti aspekt prema predmetnom pronalasku obezbeđuje rekombinantnu ćeliju koja sadrži vektor prema patentnom zahtevu 7.
[0010] Peti aspekt prema predmetnom pronalasku obezbeđuje izolovano antitelo specifično za alfa receptor folata (FRα) proizvedeno od ćelijske linije deponovane u ATCC sa pristupnim brojem PTA-11885.
[0011] Šesti aspekt prema predmetnom pronalasku obezbeđuje postupak za detekciju alfa receptora folata (FRα) ili FRα-eksprimirajući kancer u biološkom uzorku, koji sadrži izlaganje uzorka antitelu prema patentnom zahtevu 1 ili 10, ili njegovom antigen-vezujućem fragmentu, i detektovanje alfa receptora folata (FRα).
[0012] Sedmi aspekt prema predmetnom pronalasku obezbeđuje postupak za dijagnozu ekspresije kancera sa ekspresijom alfa receptora folata kod subjekta, koji sadrži:
a. izlaganje biološkog uzorka subjekta antitelu prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 10, ili njegovom antigen-vezujućem fragmentu;
b. kvantifikaciju količine alfa receptora folata (FRα) prisutnog u uzorku;
c. poređenje količine alfa receptora folata (FRα) prisutnog u uzorku sa poznatim standardom; i
d. određivanje da li nivoi alfa receptora folata (FRα) kod subjekta potpadaju pod nivoe alfa receptora folata (FRα) povezane sa kancerom.
[0013] Osmi aspekt prema predmetnom pronalasku obezbeđuje postupak za monitoring kancera koji eksprimira alfa receptor folata kod subjekta koji sadrži:
a. izlaganje biološkog uzorka subjekta antitelu prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 10, ili njegovom antigen-vezujućem fragmentu;
b. kvantifikaciju količine alfa receptora folata (FRα) prisutnog u uzorku koji je vezan sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom;
c. poređenje količine alfa receptora folata (FRα) prisutnog u uzorku ili sa
i. poznatim standardom, ili
ii. biološkim uzorkom dobijenim od subjekta ranije; i
d. određivanje da li su nivoi alfa receptora folata (FRα) kod subjekta indikativni za progresiju kancera, regresiju ili stabilnu bolest.
[0014] Deveti aspekt prema predmetnom pronalasku obezbeđuje komplet za detektovanje prisustva alfa receptora folata (FRα) u biološkom uzorku, koji sadrži najmanje jedno antitelo prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 10, ili njegov antigen-vezujući fragment.
[0015] Deseti aspekt prema predmetnom pronalasku obezbeđuje komplet za detektovanje prisustva alfa receptora folata (FRα) u biološkom uzorku, koji sadrži:
najmanje jedno antitelo prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 10, ili njegov antigen-vezujući fragment;
naznačeno time da je uključeno antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, pričvršćen za čvrstu podlogu.
[0016] Jedanaesti aspekt prema predmetnom pronalasku obezbeđuje komplet za detektovanje prisustva alfa receptora folata (FRα) u biološkom uzorku, koji sadrži:
najmanje jedno antitelo prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 10, ili njegov antigen-vezujući fragment;
naznačeno time da je uključeno antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, detektabilno obeleženo.
(FRα)-Antitela specifična za alfa receptor folata
[0017] Ovde su opisana izolovana anatiela i antigen-vezujući fragmenti koji se specifično vezuju za FRα. U nekim primerima izvođenja, antitela ili natigen-vezujući fragmenti je mišji IgG, ili njegovi derivati.
[0018] Ovde su opisana izolovana antitela i antigen-vezujući fragmenti koji se specifično vezuju za FRα ili u nativnom, neredukovanom, ili hemijski očuvanom obliku. U nekim primerima izvođenja, antitela ili antigen-vezujući fragmenti su mišji IgG, ili njegovi derivati. Dok antitela ili antigen-vezujući fragmenti mogu biti humani, humanizovani, ili himerni, antitela ili antigen-vezujući fragmenti ovde dati primerima su mišji.
[0019] Opisana antitela ili antigen-vezujući fragmenti mogu uključivati varijabilni domen lakog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu suštinski istu kao, ili identičnu, SEQ ID NO: 29. U nekim primerima izvođenja, izolovani polinukleotid koji uključuje sekvencu suštinski istu, ili identičnu, SEQ ID NO: 61 može kodirati ovu aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca. Opisana antitela ili antigen-vezujući fragmenti mogu uključivati varijabilni domen teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu suštinski istu kao, ili identičnu, SEQ ID NO: 33. U nekim primerima izvođenja, izolovani polinukleotid koji uključuje sekvencu suštinski istu, ili identičnu, SEQ ID NO: 65 može kodirati ovu aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca. Opisana antitela ili antigenvezujući fragmenti mogu uključivati varijabilne domene lakog i teškog lanca, naznačeno time da varijabilni domen lakog lanca uključuje aminokiselinsku sekvencu suštinski istu, ili identičnu, SEQ ID NO: 29, i varijabilni domen teškog lanca uključuje aminokiselinsku sekvencu suštinski istu, ili identičnu, SEQ ID NO: 33. U nekim primerima izvođenja obezbeđeni su 26B3.F2 (26B3) antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, koji je sposoban da se vezuje za nativne, neredukovane, ili hemijski očuvane oblike FRα.
[0020] U nekim primerima izvođenja, 26B3 antitelo je proizvedeno od strane ćelija koje proizvode antitelo deponovanih u American Type Culture Collection (10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209) 19 maja 2011. i dodeljen im je pristupni br. PTA-11885. U nekim primerima izvođenja, antitela, ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, imaju afinitet vezivanja za FRα antitela proizvedena od strane deponovanih ćelija koje proizvode antitelo. U nekim primerima izvođenja, opisana antitela, ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, sadrže CDRs lakog i teškog lanca antitela proizvedenog od strane deponovanih ćelija koje proizvode antitelo. U nekim primerima izvođenja, antitela, ili njihovi antigenvezujući fragmenti, sadrže varijabilne regione lakog i teškog lanca antitela proizvednog od strane deponovanih ćelija koje proizvode antitelo.
[0021] Takođe su opisani polinukleotidi koji kodiraju antitela ili antigen-vezujuće fragmente koji se specifično vezuju za nativne, neredukovane, ili hemijski očuvane oblike FRα. U nekim primerima izvođenja, izolovani polinukleotidi kodiraju antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji ima CDR1 sekvencu lakog lanca suštinski istu, ili identičnu, SEQ ID NO: 26, na primer SEQ ID NO: 58. U nekim primerima izvođenja, izolovani polinukleotid kodira antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji ima CDR2 lakog lanca suštinski isti, ili identični, SEQ ID NO: 27, na primer SEQ ID NO: 59. U nekim primerima izvođenja, izolovani polinukleotid kodira antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji ima CDR3 lakog lanca suštinski isti, ili identični, SEQ ID NO: 28, na primer SEQ ID NO: 60. U nekim primerima izvođenja, izolovani polinukleotid kodira antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji ima CDR1 teškog lanca suštinski isti, ili identični, SEQ ID NO: 30, na primer SEQ ID NO: 62. U nekim primerima izvođenja, izolovani polinukleotid kodira antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji ima CDR2 teškog lanca suštinski isti, ili identični, SEQ ID NO: 31, na primer SEQ ID NO: 63. U nekim primerima izvođenja, izolovani polinukleotid kodira antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji ima CDR3 teškog lanca suštinski isti, ili identični, SEQ ID NO: 32, na primer SEQ ID NO: 64. Polinukleotidi mogu kodirati antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji ima CDR1 lakog lanca suštinski isti, ili identičan, SEQ ID NO: 26, na primer SEQ ID NO: 58; CDR2 suštinski isti, ili identičan, SEQ ID NO: 27, na primer SEQ ID NO: 59; i CDR3 suštinski isti, ili identičan, SEQ ID NO: 28, na primer SEQ ID NO: 60. Polinukleotidi mogu kodirati antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji ima CDR1 teškog lanca suštinski isti, ili identičan, SEQ ID NO: 30, na primer SEQ ID NO: 62; CDR2 suštinski isti, ili identičan, SEQ ID NO: 31, na primer SEQ ID NO: 63; i CDR3 suštinski isti, ili identičan, SEQ ID NO: 32, na primer SEQ ID NO: 64. Polinukleotidi mogu kodirati antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji ima CDR1 lakog lanca suštinski isti, ili identičan, SEQ ID NO: 26, na primer SEQ ID NO: 58; CDR2 kodiran od strane nukleotidne sekvence suštinski iste, ili identične, SEQ ID NO: 27, na primer SEQ ID NO: 59; i CDR3 kodiran od strane nukleotidne sekvence suštinski iste, ili identične, SEQ ID NO: 28, na primer SEQ ID NO: 60; i CDR1 teškog lanca suštinski isti, ili identičan, SEQ ID NO: 30, na primer SEQ ID NO: 62; CDR2 suštinski isti, ili identičan, SEQ ID NO: 31, na primer SEQ ID NO: 63; i CDR3 suštinski isti, ili identičan, SEQ ID NO: 32, na primer SEQ ID NO: 64. Antigen-vezujući aranžmani CDRs mogu se takođe dobiti inženjeringom korišćenjem proteina sličnih antitelu kao CDR osnove. Takvi inženjeringom dobijeni antigenvezujući proteini su unutar obima opisa.
[0022] Ovde opisani polinukleotidi mogu kodirati antitela ili antigen-vezujuće fragmente koji imaju segment varijabilnog domena lakog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu suštinski istu, ili identičnu, SEQ ID NO: 29, na primer SEQ ID NO: 61. U nekim primerima izvođenja opisani polinukleotidi mogu kodirati antitela ili antigen-vezujuće fragmente koji imaju segment varijabilnog domena teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu suštinski istu, ili identičnu, SEQ ID NO: 33, na primer SEQ ID NO: 65. U nekim primerima izvođenja opisani polinukleotidi mogu kodirati antitela ili antigen-vezujuće fragmente koji imaju segment varijabilnog domena lakog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu suštinski istu, ili identičnu SEQ ID NO: 29, na primer SEQ ID NO: 61; i segment varijabilnog domena teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu suštinski istu, ili identičnu, SEQ ID NO: 33, na primer SEQ ID NO: 65. Polinukleotidi koji su sposobni da kodiraju ovde obezbeđene segmente varijabilnog domena mogu biti uključeni na istim, ili različitim, vektorima da bi proizveli antitela ili antigen-vezujuće fragmente. Polinukleotidi opisani ovde mogu kodirati 26B3 antitelo ili njegove antigen-vezujuće fragmente, sposobne za vezivanje za nativne, neredukovane, ili hemijski očuvane oblike FRα.
[0023] Vektori koji sadrže polinukleotide koji kodiraju antitelo- i antigen-vezujući fragment su obezbeđeni, kao što su i ćelije koje eksprimiraju antitela ili antigen-vezujuće fragmente koji se specifično vezuju za FRα. Takođe su obezbeđene ćelije sposobne za ekspresiju opisanih vektora. Ove ćelije mogu biti ćelije sisara (kao što su CHO-K1 ćelije), ćelije insekata (kao što su Sf7 ćelije), ćelije kvasca, biljne ćelije, ili ćelije bakterija (kao što je
e. coli). Opisana antitela mogu takođe biti proizvedena od strane ćelija hibridoma, kao što je ovde opisano.
Postupci za dijagnozu kancera
[0024] Ovde su obezbeđeni postupci za dijagnozu kancera dojke, tiroidee, kolorektalni, endometrijalni, kancera jajovoda, jajnika ili pluća epitelnog porekla kod subjekta. U nekim primerima izvođenja opisani postupci uključuju procenu da li je subjekat pogođen sa FRαeksprimirajućim kancerom određivanjem nivoa FRα koji je prisutan u uzorku koji je izveden iz subjekta; i upoređivanja uočenog nivoa FRα sa nivoom FRα u kontrolnom uzorku, naznačeno time da je razlika između nivoa FRα u uzorku izvedenom iz subjekta i nivoa FRα u kontrolnom uzorku indikacija da je subjekt pogođen ili nije pogođen sa FRα-eksprimirajućim kancerom.
[0025] U nekim primerima izvođenja kontrolni uzorak može se izvesti iz subjekta koji nije pogođen sa FRα-eksprimirajućim kancerom. U nekim primerima izvođenja kontrolni uzorak može se izvesti iz subjekta koji je pogođen sa FRα-eksprimirajućim kancerom. U nekim primerima izvođenja gde je kontrolni uzorak izveden iz subjekta koji nije pogođen sa FRαeksprimirajućim kancerom, uočeno povećanje u količini FRα prisutnoj u uzorku, u odnosu na ono uočeno u kontrolnom uzorku, indikacija je da je ispitivani subjekat pogođen sa FRαeksprimirajućim kancerom. U nekim primerima izvođenja gde je kontrolni uzorak izveden iz subjekta koji nije pogođen sa FRα-eksprimirajućim kancerom, uočeno povećanje ili sličnost u količini FRα prisutnoj u testiranom uzorku, u odnosu na onu u kontrolnom uzorku, indikacija je da ispitivani subjekat nije pogođen sa FRα-eksprimirajućim kancerom. U nekim primerima izvođenja gde je kontrolni uzorak izveden iz subjekta koji je pogođen sa FRα-eksprimirajućim kancerom, uočena sličnost u količini FRα prisutnoj u testiranom uzorku, u odnosu na onu uočenu u kontrolnom uzorku, indikacija je da je ispitivani subjekat pogođen sa FRαeksprimirajućim kancerom. U nekim primerima izvođenja gde je kontrolni uzorak izveden iz subjekta koji je pogođen sa FRα-eksprimirajućim kancerom, uočeno smanjenje količine FRα prisutno u testiranom uzorku, u odnosu na ono u kontrolnom uzorku, indikacija je da ispitivani subjekat nije pogođen sa FRα-eksprimirajućim kancerom.
[0026] U nekim primerima izvođenja nivo FRα u uzorku izvedenom iz subjekta je procenjen dovođenjem u kontakt uzorka sa antitelom koje se vezuje sa FRα, kao što su ovde opisana antitela. Slični postupci se mogu koristiti da se odredi da li je subjektat pogođen sa kancerom koji nije povezan sa povećanom proizvodnjom FRα. Uzorak procenjivan u odnosu na prisustvo FRα može se uzeti iz urina, krvi, seruma, plazme, pljuvačke, ascita, cirkulišućih ćelija, cirkulišućih ćelija tumora, ćelija koje nisu povezane sa tkivom (tj., slobodnih ćelija), tkiva (npr., hirurški odstranjenog tkiva tumora, biopsija, uključujući aspiraciju tankom iglom), histoloških preparata, i slično.
[0027] U nekim primerima izvođenja opisani postupci uključuju procenu da li je subjekat pogođen sa FRα-eksprimirajućim kancerom određivanjem nivoa FRα povezanog sa ćelijom ili tkivom koje je prisutno u uzorku izvedenom iz subjekta; i poređenjem uočenog nivoa FRα sa nivoom FRα u kontrolnom uzorku, gde je razlika između nivoa FRα u uzorku izvedenom iz subjekta i nivoa FRα u kontrolnom uzorku indikacija da je subjekat pogođen sa FRαeksprimirajućim kancerom. U nekim primerima izvođenja nivo FRα u uzorku izvedenom iz subjekta procenjen je dovođenjem u kontakt uzorka sa antitelom koje vezuje FRα, kao što su ovde opisana antitela. Uzorak procenjen u odnosu na prisustvo FRα može biti iz cirkulišućih ćelija, cirkulišućih ćelija tumora, ćelija koje nisu povezane sa tkivom (tj., slobodnih ćelija), tkiva (npr., hirurški odstranjenog tkiva tumora, biopsija, uključujući aspiraciju tankom iglom), histoloških preparata, i slično.
[0028] U nekim primerima izvođenja opisani postupci uključuju procenu da li je subjekat pogođen sa FRα-eksprimiranim kancerom određivanjem nivoa FRα koji nije povezan sa ćelijom ili tkivom koje je prisutno u uzorku izvedenom iz subjekta; i poređenjem uočenog nivoa FRα sa nivoom FRα u kontrolnom uzorku, gde je razlika između nivoa FRα u uzorku izvedenom iz subjekta i nivoa FRα u kontrolnom uzorku indikacija da je subjekat pogođen sa FRα-eksprimirajućim kancerom. U nekim primerima izvođenja nivo FRα u uzorku izvedenom iz subjekta je procenjen dovođenjem u kontakt uzorka sa antitelom koje se vezuje za FRα, kao što su ovde opisana antitela. Uzorak procenjivan u odnosu na prisustvo FRα može biti urin, krv, serum, plazma, pljuvačka, ascit, histološki preparati, i slično.
[0029] U različitim primerima izvođenja opisanih postupaka, kancer može biti FRαeksprimirajući kancer. U naročitom primeru izvođenja, FRα-eksprimirajući kancer je kancer jajnika. U nekim primerima izvođenja FRα-eksprimirajući kancer je endometrijalni kancer. U nekim primerima izvođenja FRα-eksprimirajući kancer je kolorektalni kancer. U nekim primerima izvođenja FRα-eksprimirajući kancer je kancer dojke. U nekim primerima izvođenja FRα-eksprimirajući kancer je tiroidni kancer. U nekim primerima izvođenja FRαeksprimirajući kancer je kancer jajovoda. U sledećem primeru izvođenja, FRα-eskprimirajući kancer je nesitnoćelijski kancer pluća, kao što je adenokarcinom. Alternativno, opisani postupci mogu se koristiti da se identifikuje kancer koji ne eksprimira FRα, kao što je karcinom skvamoznih ćelija. Na primer, opisani postupci se mogu koristiti za razlikovanje FRα-eksprimirajućeg kancera pluća, kao što je adenokarcinom, od kancera pluća koji ne eksprimira FRα, kao što je kancer skvamoznih ćelija. Opisani postupci se mogu korisiti za razlikovanje FRα-eksprimirajućeg kancera dojke, kao što je fibroadenom, od kancera koji ne eksprimira FRα, kao što je cistosarkom. Dodatno, opisani postupci se mogu korisiti za razlikovanje FRα-eksprimirajućeg tiroidnog kancera, kao što je papilarni karcinom, od tiroidnog kancera koji ne eksprimira FRα, kao što je medularni karcinom. U nekim primerima izvođenja opisanim ovde detekcija FRα-eksprimirajućih ćelija kancera kod subjekta može se koristiti za određivanje da se subjekt može tretirati sa terapeutskim agensom usmerenim protiv FRα. U nekim primerima izvođenja terapeutski agens usmeren protiv FRα može biti antitelo, kao što je Farletuzumab.
[0030] U različitim aspektima, nivo FRα je određen dovođenjem u kontakt uzorka sa antitelom, ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, koji se vezuje za FRα. U nekim primerima izvođenja, uzorak se može dovesti u kontakt sa više od jednog tipa antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, koji se vezuje za FRα. U nekim primerima izvođenja, uzorak se može dovesti u kontakt sa prvim antitelom, ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, koji se vezuje za FRα i zatim dovesti u kontakt sa drugim antitelom, ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, koji se vezuje za FRα. Kada se koriste dva antitela jedno od antitela je kao što je definisano prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3 i drugo antitelo je izabrano iz grupe koja se sastoji od:
(a) antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, koji se vezuju za isti epitop kao bilo koje od antitela 9F3, antitela 19D4, antitela 24F12, ili antitela 26B3;
(b) bilo kojeg od antitela 9F3, antitela 19D4, antitela 24F12, ili antitela 26B3, ili njihovog antigen-vezujućeg fragmenta;
(c) antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, koji sadrže CDRs teškog i lakog lanca bilo kog od antitela 9F3, antitela 19D4, antitela 24F12, ili antitela 26B3
(d) antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, koji sadrže segment varijabilnog domena teškog lanca i segment varijabilnog domena lakog lanca bilo kog od antitela 9F3, antitela 19D4, antitela 24F12, ili antitela 26B3, kao što je opisano u Tabeli 1; ili
(e) antitela koje ima aminokiselinsku sekvencu antitela proizvedenog od strane bilo koje od ćelijskih linija deponovanih u ATCC sa pristupnim brojem PTA-11887, PTA-11884, PTA-11886, ili PTA-11885, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta.
[0031] U određenim primerima izvođenja, nivo FRα je određen western blot analizom, radioimunoanalizom, imunofluorimetrijom, imunoprecipitacijom, ravnotežnom dijalizom, imunodifuzijom, elektrohemiluminescentnom (ECL) imunoanalizom, imunohistohemijom, fluorescencijom-aktiviranim sortiranjem ćelija (FACS) ili ELISA testom.
[0032] U različitim primerima izvođenja prethodnih aspekata pronalazaka, kontrolni uzorak je standardizovani kontrolni nivo FRα kod zdravog subjekta. U drugim primerima izvođenja kontrolni uzorak može biti FRα protein poznate koncentracije (npr., rekombinatni ili prečišćeni uzorak FRα proteina). U nekim primerima izvođenja, uočeni FRα-nivoi testiranog subjeka mogu se porediti sa FRα nivoom uočenim u uzorcima od subjekata za koje se zna da imaju FRα-eksprimirajući kancer ili poznate koncentracije FRα.
Postupci za monitoring kancera
[0033] Ovde su obezbeđeni postupci za monitoring FRα-eksprimirajućeg kancera kod subjekta. Opisani postupci se mogu koristiti pre tretmana za kancer, nakon tretmana za kancer, ili oba pre i posle tretmana za kancer. U nekim primerima izvođenja opisani postupci uključuju procenu da li FRα-eksprimirajući kancer napreduje, povlači se, ili ostaje stabilan određivanjem nivoa FRα koji je prisutan u test uzorku izvedenom iz subjekta; i poređenjem uočenog nivoa FRα sa nivoom FRα u uzorku dobijenom od subjekta ranije, gde razlika između nivoa FRα u test uzorku i ranijem uzorku obezbeđuje indikaciju da li kancer napreduje, povlači se, ili ostaje stabilan. U ovom pogledu, test uzorak sa povećanim nivoom FRα, u odnosu na nivoe uočene za raniji uzorak, može ukazivati na napredovanje FRαeksprimirajućeg kancera. Nasuprot tome, test uzorak sa smanjenim nivoom FRα, u odnosu na nivoe uočene za raniji uzorak, može ukazivati na povlačenje FRα-eksprimirajućeg kancera. Shodno tome, test uzorak sa razlikom u nivou FRα koja nije značajna, u odnosu na nivoe uočene za raniji uzorak, može ukazivati na stanje stabilne bolesti za FRα-eksprimirajući kancer. U nekim primerima izvođenja nivo FRα u uzorku izvedenom iz subjekta je procenjen dovođenjem u kontakt uzorka sa antitelom koje se vezuje za FRα, kao što su ovde opisana antitela. Uzorak procenjen u odnosu na prisusutvo FRα može se izvesti iz urina, krvi, seruma, plazme, pljuvačke, ascita, cirkulišućih ćelija, cirkulišućih ćelija tumora, ćelija koje nisu povezane sa tkivom (tj., slobodne ćelije), tkiva (npr., hirurški izvađeno tkivo tumora, biopsija, uključujući aspiraciju tankom iglom), histoloških preparata, i slično.
[0034] U nekim primerima izvođenja opisani postupci uključuju procenu da li FRαeksprimirajući kancer napreduje, povlači se, ili ostaje stabilan određivanjem nivoa FRα povezanog sa ćelijom ili tkivom koji su prisutni u test uzorku izvedenom iz subjekta; i poređenjem uočenog nivoa FRα sa nivoom FRα u uzorku dobijenom iz subjekta, na sličan način, ranije, gde razlika između nivoa FRα u test uzorku i ranijem uzorku obezbeđuje indikaciju da li kancer napreduje, povlači se, ili ostaje stabilan. U ovom pogledu, test uzorak sa povećanim nivoom FRα, u odnosu na nivoe uočenih za raniji uzorak, može ukazivati na napredovanje FRα-eksprimirajućeg kancera. Nasuprot tome, test uzorak sa smanjenim nivoom FRα, u odnosu na niove uočene za raniji uzorak, može ukazivati na povlačenje FRαeksprimirajućeg kancera. Shodno tome, test uzorak sa razlikom u nivou FRα koja nije značajna, u odnosu na nivoe uočene za raniji uzorak, može ukazivati na stanje stabilne bolesti za FRα-eksprimirajući kancer. U nekim primerima izvođenja nivo FRα u uzorku izvedenom iz subjekta je procenjen dovođenjem u kontakt uzorka sa antitelom koje se vezuje za FRα, kao što su ovde opisana antitela. Uzorak procenjen u odnosu na prisustvo FRα može biti iz cirkulišućih ćelija, cirkulišućih ćelija tumora, ćelija koje nisu povezane sa tkivom (tj., slobodne ćelije), tkiva (npr., hirurški izvađeno tkivo tumora, biopsija, uključujući aspiraciju tankom iglom), histoloških preparata, i slično.
[0035] U nekim primerima izvođenja opisani postupci uključuju procenu da li FRαeksprimirajući kancer napreduje, povlači se, ili ostaje stabilan određivanjem nivoa FRα koji nije povezan sa ćelijom ili tkivom koji su prisutni u test uzorku izvedenom iz subjekta; i poređenjem uočenog nivoa FRα sa nivoom FRα u uzorku dobijenom iz subjekta, na sličan način, ranije, gde razlika između nivoa FRα u test uzorku i ranijem uzorku obezbeđuje indikaciju da li kancer napreduje, povlači se, ili ostaje stabilan. U ovom pogledu, test uzorak sa povećanim nivoom FRα, u odnosu na nivoe uočenih za raniji uzorak, može ukazivati na napredovanje FRα-eksprimirajućeg kancera. Nasuprot tome, test uzorak sa smanjenim nivoom FRα, u odnosu na nivoe uočene za raniji uzorak, mogu ukazivati na povlačenje FRαeksprimirajućeg kancera. Shodno tome, test uzorak sa razlikom u nivou FRα koja nije značajna, u odnosu na nivoe uočene za raniji uzorak, mogu ukazivati na stanje stabilne bolesti za FRα-eksprimirajući kancer. U nekim primerima izvođenja nivo FRα u uzorku izvedenom iz subjekta je procenjen dovođenjem u kontakt uzorka sa antitelom koje se vezuje za FRα, kao što su ovde opisana antitela. Uzorak procenjen u odnosu na prisustvo FRα može biti iz urina, krvi, seruma, plazme, pljuvačke, ascita, histoloških preparata i slično.
[0036] U različitim primerima izvođenja opisanih postupaka, kancer može biti FRαeksprimirajući kancer. U naročitom primeru izvođenja, FRα-eksprimirajući kancer je kancer jajnika. U nekim primerima izvođenja FRα-eksprimirajući kancer je kancer endometrijuma. U nekim primerima izvođenja FRα-eksprimirajući kancer je kolorektalni kancer. U nekim primerima izvođenja FRα-eksprimirajući kancer je kancer dojke. U nekim primerima izvođenja FRα-eksprimirajući kancer je tiroidni kancer. U nekim primerima izvođenja FRαeksprimirajući kancer je kancer jajovoda. U sledećem primeru izvođenja, FRα-eksprimirajući kancer je nesitnoćelijski kancer pluća, kao što je adenokarcinom.
[0037] U različitim aspektima, nivo FRα je određen dovođenjem u kontakt uzorka sa antitelom, ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, koji se vezuje za FRα. U nekim primerima izvođenja, uzorak može biti doveden u kontakt sa više od jednog tipa antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, koji se vezuje za FRα. U nekim primerima izvođenja, uzorak može biti doveden u kontakt sa prvim antitelom, ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, koji se vezuje za FRα i zatim doveden u kontakt sa drugim antitelom, ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, koji se vezuje za FRα. Kada se koriste dva antitela jedno od antitela je kao što je definisano prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, i drugo antitelo je izabrano iz grupe koja se sastoji od:
(a) antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, koji se vezuje za isti epitop kao bilo koje antitelo od 9F3, antitelo 19D4, antitelo 24F12, ili antitelo 26B3;
(b) bilo koje antitelo od antitelo 9F3, antitelo 19D4, antitelo 24F12, ili antitelo 26B3, ili njegov antigen-vezujući fragment;
(c) antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji sadrži CDRs teškog i lakog lanca bilo kog od antitela 9F3, antitela 19D4, antitela 24F12, ili antitela 26B3.
[0038] U određenim primerima izvođenja, nivo FRα je određen western blot analizom, radioimunoanalizom, imunofluorimetrijom, imunoprecipitacijom, ravnotežnom dijalizom, imunodifuzijom, elektrohemiluminescentnom (ECL) imunoanalizom, imunohistohemijom, fluorescencijom-aktiviranim sortiranjem ćelija (FACS) ili ELISA testom.
[0039] Dodatni aspekti rezimiranog predmetnog pronalaska obezbeđeni su u detaljnijem opisu i obezbeđenim primerima i povezanim slikama.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0040] Predmetni pronalazak je definisan patentnim zahtevima. Bilo koje slike koje su izvan obima pronalaska obezbeđene su samo kao referenca i ne čine deo pronalaska.
Slika 1 prikazuje migratorne obrasce FRα sa SDS-PAGE pod neredukujućim uslovima. FRα je procenjen ili u nativnom (staza 2) ili redukovanom ili alkilovanom (staza 3) obliku.
Slika 2 ilustruje aminokiselinske ostatke FRα (SEQ ID NO: 1) koji sadrže epitope (osenčeni regioni) za monoklonska antitela 9F3, 24F12, i 26B3, kao što je predviđeno postupcima masene spektrometrije sa izmenom vodonik/deuterijum i dokinga.
Slika 3 prikazuje četiri western blota prečišćenih rekombinantnih (A) i lizata celih ćelija (B) iz CHO ćelija koje eksprimiraju FRα ili FR homologe FRβ, FRΓ ili FrΔ koji su pušteni na SDS-PAGE gelove. Proteini su pripremljeni u puferu za uzorke sa ili bez redukujućih sredstava. Panel A, staza 1, markeri molekulske težine, staze 2-5. 0.5μg redukovanog FRα, FRβ, FRΓ, i FRΔ, respektivno; staza 6, blank; staze 7-10, 0.5μg neredukovanog FRα, FRβ, FRΓ, i FRΔ, respektivno. Pozitivna traka predstavlja jedine reaktivne vrste u svakoj stazi i odgovara molekulskoj težini od ∼38kDa. Panel B, staza 1 markeri molekulske težine, staza 2 CHO-FRα, staza 3, CHO-FRβ, staza 4 CHO-FRΔ lizati celih ćelija pripremljeni u puferu za uzorke bez redukujućih sredstava i frakcionisani na SDS-PAGE gelu. Svaki panel je testiran sa označenim anti-FRα mAb markiranim na desnoj strani. Molekulske težine za FR su: FRα ∼38kDA; FRβ ∼30kDa; FRΓ ∼28kDa; FRΔ ∼26kDa. LK26 i BN3.2 antitela koja prepoznaju FRα pod denaturišućim i neredukujućim ili redukujućim uslovima, respektivno, korišćena su kao pozitivne kontrole.
Slika 4 prikazuje uzorak papilarnog seroznog kancera jajnika fiksiranog u formalinu, ukalupljenog u parafinu, testiranog na prisustvo FRα sa monoklonskim antitelom 26B3.
Slika 5 prikazuje FRα ekspresiju u normalnim tkivima. Uzorci normalnih pluća (A) i bubrega (B) obojeni sa antitelom 26B3 pokazuju da je ekspresija FRα veoma ograničena na epitelne ćelije i ima pretežno apikalnu distribuciju (slike su pod uveličanjem od 20x).
Slika 6 obezbeđuje grafički prikaz koji poredi M-skorove za adenokarcinom pluća generisane korišćenjem antitela 26B3 ili antitela BN3.2.
Slika 7 prikazuje FRα bojenje histoloških podtipova nesitnoćelijskog karcinoma pluća: (A) adenokarcinom pluća na 20x, (B) adenokarcinom pluća na 40x, (C) adenoskvamozni karcinom pluća na 20x, i (D) karcinom skvamoznih ćelija pluća na 40x.
Slika 8 obezbeđuje grafički prikaz koji poredi M-skorove za duplikate uzoraka (cores) adenokarcinoma pluća obojene sa antitelom 26B3.
Slika 9 ilustruje M-skor za FRα distribuciju adenokarcinoma pluća i karcinoma skvamoznih ćelija. Srednje vrednosti M-skorova bile su 19.84 (618.64) i 1.39 (65.54), respektivno (p<0.0001).
Slika 10 prikazuje FRα ekspresiju za tri uzorka adenokarcinoma pluća dobijena aspiracijom tankom iglom (FNA) (A), (B), i (C). Bojenje materijala ćelijskih blokova iz FNAs limfnog čvora sa antitelom 26B3 pokazalo je uspešno bojenje FRα, sa ekspresijom ograničenom na epitelne ćelije sa apikalnom distribucijom.
Slika 11 ilustruje funkcije preživljavanja (smrt ili supresija) za subjekte koji imaju adenokarcinom pluća koji se smatraju FRα pozitivnim i FRα negativnim sa imunohistohemijskom analizom uzoraka tkiva korišćenjem antitela 26B3.
Slika 12 prikazuje reprezentativne slike tkivnih matrica (TMA) obojenih sa antitelom 26B3 na uveličanju od 20x ili 40x za (A) karcinom duktusa in situ, (B)-(D) invazivni karcinom duktusa.
Slika 13 obezbeđuje grafički prikaz distribucije M-skora, kao što je određeno bojenjem sa 26B3, u odnosu na molekularni podtip (her-2 (+) i her-2 (-)) uzorka kancera dojke.
Slika 14 (A-D) prikazuje reprezentativne histološke uzorke stadijuma IV, her2 negativnog kancera dojke obojene sa antitelom 26B3 na uveličanju od 20x ili 40x.
Slika 15 prikazuje reprezentativne slike uzoraka meatstatskog kancera dojke dobijene aspiracijom tankom iglom obojene sa antitelom 26B3.
Slika 16 prikazuje FRα ekspresiju u seroznom karcinomu jajnika. (A) 3+ jako (desno polje) i 2+ umereno bojenje membrane (levo gornje polje) vidljivo je na uveličanju od 10x. (B) Prikazuje istu površinu kao (A) na uveličanju od 20x, potvrđujući 3+ jako, gusto periferno bojenje membrane (desno polje). 2+ umereno bojenje membrane (levo gornje polje) ima slabije, tanje bojenje od 3+, i periferno je ili lokalizovano na granicama lumena. (C) prikazuje da je 1+ slabo bojenje membrane ograničeno na granice lumena i zahteva uveličanje od 40x da bi se vizuelizovalo. (D) Epitelne ćelije na površini jajnika i kortikalne ćelije strome ispod njih su potpuno negativne (uveličanje 20x)).
Slika 17 pokazuje da je FRα ekspresija ograničena na granicama lumena normalnog endometrijuma sa slabim 1+ i umerenim 2+ intenzitetom na uveličanju od 40x (A). Snažno (+3) bojenje membrane može se uočiti na granicama lumena atipične kompleksne hiperplazije na uveličanju od 20x (B).
Slika 18 prikazuje jako (+3) FRα bojenje membrane na granicama lumena adenokarcinoma endometrijuma 1 gradusa (A). Dodatno, mnoge ćelije tumora imaju 2+ ili 3+ citoplazmatično bojenje (20x uveličanje). FRα bojenje membrane (2+ i 3+) prisutno je na granicama lumena adenokarcinoma endometrijuma 2 gradusa; citoplazmatično bojenje je slabo (20x uveličanje (B). Oko 50% ćelija tumora adenokarcinoma endometrijuma 3 gradusa pokazuje 3+ jako, periferno bojenje membrane uz slabo bojenje citoplazme na uveličanju od 40x (C).
Slika 19 prikazuje adenokarcinom sa skvamoznom metaplazijom sa oko 80% metaplastičnih skvamoznih ćelija sa 2+ i 3+ FRα bojenjem membrane i 1+ i 2+ FRα bojenje citoplazme na uveličanju od 20x (A). Svetloćelijski karcinom tumorskih ćelija endometrijuma ima velika nepravilna jedra, izražene nukleoluse i puno bistre citoplazme. Najveći broj ovakvih tumorskih ćelija ima 2+ ili 3+ FRα bojenje membrane na uveličanju od 40x (B).
Slika 20 prikazuje da cilijarne i ne-cilijarne ćelije normalnog jajovoda imaju 3+ FRα bojenje membrane na granicama lumena i lateralnih ćelija (A). Citoplazmatično bojenje je takođe očigledno (20x uveličanje). (B) Hronični salpingitis sa velikim brojem limfocita u plazmi i stromi. Mukozne ćelije zadržavaju 3+ FRα bojenje na granicama lumena (20x uveličanje). (C) tumorske ćelije seroznog adenokarcinoma jajovoda 2 gradusa formiraju kompleksne papilarne nastavke i prikazuju 3+ FRα bojenje membrane na granicama lumena i lateralnih ćelija, sa takođe očiglednim citoplazmatskim bojenjem (20x uveličanje).
Slika 21 prikazuje kortikalne serozne/tubalne ciste jajnika. Granične ćelije imaju 3+, jako bojenje membrane i citoplazme (20x uveličanje).
DETALJAN OPIS ILUSTRATIVNIH PRIMERA IZVOĐENJA
[0041] Sledeći opis karakterizuje antitela, i njihove antigen-vezujuće fragmente, koji se specifično vezuju za FRα. Takođe su opisani povezani polinukleotidi koji su sposobni da kodiraju ova antitela, i antigen-vezujuće fragmente, ćelije koje eksprimiraju antitela, i antigen-vezujuće fragmente, kao i povezane vektore i detektabilne markere antitela. Dodatno, opisani su postupci za upotrebu antitela, i antigen-vezujućih fragmenata. Na primer, obezbeđena antitela, i antigen-vezujući fragmenti, mogu se koristiti za dijagnozu progresije, povlačenja ili stabilnog kancera jajnika, dojke, tiroidee, kolorektalnog, endometrijalnog, jajovoda, ili kancera pluća; praćenje progresije, povlačenja ili stabilnog kancera jajnika, dojke, tiroidee, kolorektalnog, endometrijalnog, jajovoda, ili kancera pluća; da se odredi da li pacijenta treba tretirati za kancer, ili da se odredi da li je subjekt pogođen sa FRαeksprimirajućim kancerom i stoga može biti pogodan za tretman sa FRα-specifičnim antikancer terapeuticima.
Definicije
[0042] Različiti termini koji se odnose na aspekte opisa korišćeni su kroz specifikaciju i patentne zahteve. Takve termine treba shvatiti u njihovom uobičajenom značenju u tehnici ukoliko nije drugačije naznačeno. Druge specifično naznačene termine treba shvatiti na način konzistentan sa ovde obezbeđenim definicijama.
[0043] Kao što je korišćeno u ovoj specifikaciji i priključenim patentnim zahtevima, oblici jednine "a," "an," i "the" uključuju reference množine ukoliko sadržaj jasno ne diktira drugačije. Stoga, na primer, referenca na "ćelija" uključuje kombinaciju dve ili više ćelija, i slično.
[0044] Termin "oko" kao što je ovde korišćen kada se odnosi na merljivu vrednost kao što je količina, vremensko trajanje, i slično, obuhvata varijacije so ±10% od specifikovane vrednosti, jer su takve varijacije odgovarajuće da se izvedu opisani postupci. Ukoliko nije drugačije naznačeno, sve brojeve koji izražavaju količine sastojaka, osobine kao što su molekulska težina, reakcioni uslovi, i tako dalje koji su korišćeni u specifikaciji i patentnim zahtevima treba shvatiti kao modifikovane u svim slučajevima od strane termina "oko." Shodno tome, ukoliko nije drugačije naznačeno, numerički parameteri dati u sledećoj specifikaciji i priključenim patentnim zahtevima su aproksimacije koje mogu varirati u zavisnosti od željenih osobina koje se žele dobiti sa predmetnim pronalaskom. Najmanje, i ne kao pokušaj da se ograniči primena doktrine ekvivalenata u odnosu na obim patenih zahteva, svaki numerički parametar treba najmanje biti shvaćen u svetlu broja objavljenih značajnih cifara i primene uobičajenih tehnika zaokruživanja.
[0045] Iako su numerički opsezi i parametri koji pronalasku daju širi obim aproksimacije, numeričke vrednosti date u specifičnim primerima su objavljene precizno koliko god je to moguće. Bilo koja numerička vrednost, međutim, inherentno sadrži određene greške koje obavezno rezultuju iz standardne devijacije pronađene u njihovim rezultujućim merenjima pri testiranju.
[0046] "Izolovano" označava da je biološka komponenta (kao što je nukleinska kiselina, peptid ili protein) u značajnom stepenu izdvojena, odvojena od, ili prečišćena od drugih bioloških komponenti organizma u kojoj se komponenta prirodno javlja, tj., drugim hromozomskim i ekstrahromozomskim DNK i RNK, i proteinima. Nukleinske kiseline, peptidi i proteini koji su "izolovani" stoga uključuju nukleinske kiseline i proteine prečišćene standardnim postupcima prečišćavanja. "Izolovane" nukleinske kiseline, peptidi i proteini koji mogu biti deo kompozicije i još uvek mogu biti izolovani ukoliko takva kompozicija nije deo nativne sredine nukleinske kiseline, peptida, ili proteina. Termin takođe obuhvata nukleinske kiseline, peptide i proteine pripremljene rekombinatnom ekspresijom u ćeliji domaćinu kao i hemijski sintetisane nukleinske kiseline.
[0047] "Polinukleotid," označen kao sinonim za "molekul nukleinske kiseline" ili "nukleinskih kiselina," odnosi se na poliribonukleotid ili polidezoksiribonukleotid, koji može biti nemodifikovana RNK ili DNK ili modifikovana RNK ili DNK. "Polinukleotidi" uključuju, bez ograničenja jednolančane- i dvolančane DNK, DNK koja je smeša jedno- i dvolančanih regiona, jedno- i dvolančane RNK, i RNK koja je smeša jedno- i dvolančanih regiona, hibridne molekule koji sadrže DNK i RNK koji mogu biti jednolančani ili, tipičnije, dvolančani ili smeša jedno- i dvolančanih regiona. Dodatno, "polinukleotid" se odnosi na trolančane regione koji sadrže RNK ili DNK ili obe RNK i DNK. Termin polinukleotid takođe uključuje DNKs ili RNKs koje sadrže jednu ili više modifikovanih baza i DNKs ili RNKs sa osnovnim lancima modifikovanim u odnosu na stabilnost ili iz drugih razloga. "Modifikovane" baze uključuju, na primer, tritilovane baze i neuobičajene baze kao što je inozin. Različite modifikacije se mogu načiniti DNK i RNK; stoga, "polinukleotid" obuhvata hemijski, enzimatski ili metabolički modifikovane oblike polinukleotida kao što se tipično nalaze u prirodi, kao i hemijske oblike DNK i RNK karakteristične za viruse i ćelije. "Polinukleotid" takođe obuhvata relativno kratke lance nukleinske kiseline, koji se često označavaju kao oligonukleotidi.
[0048] Značenje "u značajnom stepenu isto" može se razlikovati u zavisnosti od konteksta u kome se termin koristi. Usled toga što je verovatno da postoji variranje prirodne sekvence između teških i lakih lanaca i gena koji ih kodiraju, očekivalo bi se da se pronađe neki nivo variranja unutar aminokiselinskih sekvenci ili gena koji kodiraju antitela ili antigen-vezujuće fragmente opisane ovde, sa malo ili nimalo uticaja na njihove jedinstvene osobine vezivanja (npr., specifičnost i afinitet). Takva očekivanja su delimično usled degenerisanosti genetičkog koda, kao i zbog evolucionog uspeha variranja konzervativne aminokiselinske sekvence, koje znatno ne menjaju prirodu kodiranog proteina. Shodno tome, u kontekstu sekvenci nukelinske kiseline, "u značajnom stepenu iste" označava najmanje 65% identičnosti između dve ili više sekvenci. Poželjno, termin se odnosi na najmanje 70% identičnosti između dve ili više sekvenci, poželjnije najmanje 75% identičnosti, još poželjnije najmanje 80% identičnosti, još poželjnije najmanje 85% identičnosti, još poželjnije najmanje 90% identičnosti, još poželjnije najmanje 91% identičnosti, još poželjnije najmanje 92% identičnosti, još poželjnije najmanje 93% identičnosti, još poželjnije najmanje 94% identičnosti, još poželjnije najmanje 95% identičnosti, još poželjnije najmanje 96% identičnosti, još poželjnije najmanje 97% identičnosti, još poželjnije najmanje 98% identičnosti, i još poželjnije najmanje 99% ili veće identičnosti. Takva identičnost može se odrediti korišćenjem nBLAST algoritma (Altschul et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-8; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-7).
[0049] Stepen variranja koji se može naći unutar aminokiselinske sekvence proteina bez značajnog efekta na funkciju proteina je mnogo niži nego onaj kod sekvence nukleinske kiseline, jer ne važi isti princip degenerisanosti za aminokiselinske sekvence. Shodno tome, u kontekstu antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta, "u značajnom stepenu isti" označava antitela ili antigen-vezujuće fragmente koji imaju 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sa opisanim antitelima ili antigen-vezujućim fragmentima. Drugi primeri izvođenja uključuju FRα specifična antitela, ili antigen-vezujuće fragmente, koji imaju okvirne, potporne, ili druge nevezujuće regione koji ne dele značajnu identičnost sa ovde opisanim antitelima i antigen-vezujućim fragmentima, ali uključuju jedan ili više CDRs ili drugih sekvenci neophodnih da daju vezivanje koji su 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identični sa takvim ovde opisanim sekvencama.
[0050] "Vektor" je replikon, kao što je plazmid, fag, kozmid, ili virus u kom može biti operativno ubačen drugi segment nukleinske kiseline tako da se postigne replikacija ili ekspresija segmenta.
[0051] Ćelija je " transformisana" kada su egzogene ili heterologne nukleinske kiseline kao što je DNK uvedene unutar ćelije. Transformišuća DNK može ili ne mora biti integrisana (kovalentno vezana) u genom ćelije. Kod prokariota, kvasca, i ćelija sisara na primer, transformišuća DNK se može održati na epizomalnom elementu kao što je plazmid. U odnosu na eukariotske ćelije, stabilno transformisana ćelija, ili "stabilna ćelija" demonstrirana je sposobnošću eukariotske ćelije da ustanovi ćelijske linije ili klonove koji se sastoje od populacije kćerki ćelija koje sadrže transformišuću DNK. "Klon" je populacija ćelija izvedenih iz pojedinačne ćelije ili zajedničkog pretka mitozom. "Ćelijska linija" je klon primarne ćelije koja je sposobna za stabilni rast in vitro u mnogo generacija. U nekim ovde obezbeđenim primerima, ćelije su transformisane transfektovanjem ćelija sa DNK.
[0052] Termini "eksprimira" i "proizvodi" su ovde korišćeni kao sinonimi, i odnose se na biosintezu proizvoda gena. Ovi termini obuhvataju transkripciju gena u RNK. Ovi termini takođe obuhvataju translaciju RNK u jedan ili više polipeptida, i dalje obuhvataju sve posttranskripcione i post-translacione modifikacije koje se javljaju u prirodi. Ekspresija ili proizvodnja antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta mogu biti unutar citoplazme ćelije, ili unutar ekstracelularnog miljea kao što je medijum za rast ćelijske kulture.
[0053] Termini "tretiranje" ili "tretman" odnose se na bilo kakav uspeh ili indikaciju uspeha u atenuaciji ili ublažavanju povrede, patologije ili stanja, uključujući bilo koji objektivni ili subjektivni parameter kao što je smanjenje, remisija, smanjivanje simptoma ili činjenja stanja tolerantnijim za pacijenta, usporavanjem stope degeneracije ili propadanja, činjenja krajnje tačke degeneracije manje onesposobljujućom, poboljšanje fizičkog ili mentalnog zdravlja subjekta, ili produžavanje dužine preživljavanja. Tretman se može proceniti objektivnim ili subjektivnim parameterima; uključujući rezultate fizičkog pregleda, neurološkog pregleda, ili psihijatrijskih procena.
[0054] "Antitelo" se odnosi na sve izotipove imunoglobulina (IgG, IgA, IgE, IgM, IgD, i IgY) uključujući različite monomerne i polimerne oblike svakog izoptipa, ukoliko niije drugačije naznačeno.
[0055] Antigen-vezujući fragmenti su bilo koja proteinska struktura koja može pokazivati afinitet vezivanja za određeni antigen. Neki antigen-vezujući fragmenti su sastavljeni od delova intaktnih antitela koja zadržavaju antigen-vezujuću specifičnost roditeljskog molekula antitela. Na primer, antigen-vezujući fragmenti mogu sadržati najmanje jedan varijabilni region (varijabilni region ili teškog ili lakog lanca) ili jedan ili više CDRs antitela za koje se zna da se vezuje za određeni antigen. Primeri antigen-vezujućih fragmenata uključuju, bez ograničenja dijatela i jednolančane molekule kao i Fab, F(ab’)2, Fc, Fabc, i Fv molekule, jednolančana (Sc) antitela, pojedinačne lake lance antitela, pojedinačne teške lance antitela, himerne fuzije između lanaca antitela ili CDRs i drugih proteina, proteinskih potpora, monomera ili dimera teškog lanca, monomera ili dimera lakog lanca, dimera koji se sastoje od jednog teškog i jednog lakog lanca, i slično. Svi izotipovi antitela mogu se koristiti da proizvedu antigen-vezujuće fragmente. Dodatno, antigen-vezujući fragmenti mogu uključivati ne-antitelo proteinske okvirne delove koji se mogu uspešno inkorporisati u polipeptidne segmente u orijentaciji koja daje afinitet za dati antigen od interesa, kao što su proteinske potpore. Antigen-vezujući fragmenti mogu se rekombinantno proizvesti ili proizvesti enzimatskim ili hemijskim cepanjem intaktnog antitela. Izraz "antitelo ili njegov antigenvezujući fragment" može se koristiti da označi da dati antigen-vezujući fragment uključuje jedan ili više aminokiselinskih segmenata koji se pominju u izrazu.
[0056] "Specifično vezivanje" kada je korišćeno u kontekstu antitela, ili fragmenata antitela, predstavlja vezivanje preko domena kodiranih imunoglobulinskim genima ili fragmentima imunoglobulinskih gena za jedan ili više epitopa proteina od interesa, ali koji suštinski ne prepoznaju i ne vezuju se za druge molekule u uzorku koji sadrži mešanu populaciju antigenih molekula. Tipično, antitelo se vezuje za srodni antigen sa Kdmanjom od oko 1x10<-8>M, kao što je mereno analizom površinske plazmon rezonance ili analizom ćelijskog vezivanja.
[0057] Termin "subjekt" se odnosi na humane i ne-humane životinje, uključujući sve kičmenjake, npr., sisare i ne-sisare, kao što su ne-humani primati, miševi, zečevi, ovce, psi, mačke, konji, krave, kokoške, vodozemci, i gmizavci. U mnogim primerima izvođenja opisanih postupaka, subjekt je čovek.
[0058] Kao što je ovde korišćeno, termin "alfa receptor folata" (takođe označen kao FRα, FR-alfa, FOLR-1 ili FOLR1) odnosi se na alfa izoformu receptora visokog afiniteta za folat. Membranski vezani FRα je vezan za površinu ćelije sa glikozil fosfatidilinozitolnim (GPI) sidrom. Rastvorljivi oblici FRα mogu se izvesti dejstvom proteaza ili fosfolipaze na membranski usidrene folatne receptore. Aminokiselinska sekvenca za humani FRα ovde je data kao SEQ ID NO: 1. Varijante, na primer, alelne varijante ili sekvence koje sadrže najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju koje se javljaju u prirodi, obuhvaćene su terminima kao što je ovde korišćeno. Kao što će ceniti stručnjaci, oblici humanog FRα vezani sa ćelijom ili nevezani sa ćelijom mogu obuhvatati oblike SEQ ID NO: 1.
[0059] Termin "uzorak" kao što je ovde korišćen odnosi se na kolekciju sličnih tečnosti, ćelija, ili tkiva (npr., hirurški odstranjeno tkivo tumora, biopsije, uključujući aspiraciju tankom iglom), izolovanih iz subjekta, kao i na tečnosti, ćelije, ili tkiva prisutna unutar subjekta. U nekim primerima izvođenja uzorak je biološka tečnost. Biološke tečnosti su tipično tečnosti na fiziološkim temperaturama i mogu uključiti tečnosti koje se prirodno javljaju u, izvađene su iz, eksprimirane ili na drugi način ekstrahovane iz subjekta ili biološkog izvora. Određene biološke tečnosti mogu se izvesti iz određenih tkiva, organa ili lokalizovanih regiona i određene druge biološke tečnosti mogu se nalaziti globalnije ili više sistemski u subjektu ili biološkom izvoru. Primeri bioloških tečnosti uključuju krv, serum serozne tečnosti, plazmu, limfu, urin, pljuvačku, tečnosti iz cista, suze, feces, ispljuvak, mukozne sekrecije sekretornih tkiva i organa, vaginalne sekrecije, tečnosti iz ascita kao što su one povezane sa ne-solidnim tumorima, tečnosti pleuralne, perikardijalne, peritonealne, abdominalne i drugih telesnih šupljina, tečnosti sakupljene bronhijalnom lavažom i slično.
[0060] Biološke tečnosti mogu takođe uključiti tečne rastvore dovedene u kontakt sa subjektom ili biološkim izvorom, na primer, medijum kulture ćelija i organa koji uključuje kondicionirani medijum za ćeliju ili organ, tečnosti iz lavaža i slično. Termin "uzorak," kao što je ovde korišćeno, obuhvata materijale uklonjene iz subjekta ili materijale prisutne u subjektu.
[0061] Termin "napredovanje," kao što je korišćeno u kontekstu napredovanja FRαeksprimirajućeg kancera, uključuje promenu kancera od blažeg ka težem stanju. Ovo može uključiti povećanje u broju ili težini tumora, gradusu metastaze, brzine kojom kancer raste ili se širi, i slično. Na primer, "napredovanje kancera jajnika" uključuje napredovanje takvog kancera od blažeg ka težem stanju, kao što je napredovanje od stadijuma I u stadijum II, od stadijuma II u stadijum III, itd.
[0062] Termin "povlačenje," kao što je korišćeno u kontekstu povlačenja FRαeksprimirajućeg kancera, uključuje promenu kancera od težeg ka blažem stanju. Ovo može da uključi smanjenje u broju ili težini tumora, gradusu metastaze, brzini kojom kancer raste ili se širi, i slično. Na primer, "povlačenje kancera jajnika" uključuje povlačenje takvog kancera od težeg ka blažem stanju, kao što je povlačenje od stadijuma III u stadijum II, od stadijuma II u stadijum I, itd.
[0063] Termin "stabilan" kao što je korišćeno u kontekstu stabilnog FRα-eksprimirajućeg kancera, opisuje stanje bolesti koje nije, ili koje se nije, dovoljno značajno promenilo tokom klinički relevantnog vremenskog perioda da bi se smatralo kancerom koji napreduje ili koji se povlači.
[0064] Ovde opisani primeri izvođenja nisu ograničeni na određene postupke, reagense, jedinjenja, kompozicije ili biološke sisteme, koji mogu, naravno, varirati.
FRoc-specifična antitela i antigen-vezujući fragmenti
[0065] Ovde su opisana izolovana monoklonska antitela ili antigen-vezujući fragmenti koji se specifično vezuju za FRα. Opšta struktura molekula sadrži antigen vezujući domen, koji uključuje teške i lake lance, i Fc domen, koji ima različite funkcije, uključujući fiksiranje komplementa i vezivanje receptora antitela.
[0066] Opisana antitela ili antigen-vezujući fragmenti uključuju sve izotipove, IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, i sintetičke multimere četvorolančane imunoglobulinske strukture. Opisana antitela ili antigen-vezujući fragmenti takođe uključuju IgY izotip koji se generalno nalazi u serumu kokoške ili ćurke i žumancetu jaja kokoške ili ćurke.
[0067] Antitela ili antigen-vezujući fragmenti opisani u delu sa primerima izvedeni su iz miševa. Slična antitela mogu se izvesti iz bilo koje vrste rekombinatnim sredstvima. Na primer, antitela ili antigen-vezujući fragmenti mogu biti himerni, pacova, koze, konja, svinje, goveda, kokoške, zeca, kamelida, magarca, čoveka, i slično. Za upotrebu za primenu na ljude, ne-humano izvedena antitela ili antigen-vezujući fragmenti mogu se genetički ili strukturno izmeniti da budu manje antigeni pri primeni na humanog pacijenta.
[0068] U nekim primerima izvođenja, antitela ili antigen-vezujući fragmenti su himerni. Kao što je ovde korišćeno, termin "himerni" odnosi se na antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, sa najmanje nekim delom najmanje jednog varijabilnog domena izvedenog iz aminokiselinske sekvence antitela ne-humanog sisara, glodara, ili gmizavca, dok su preostali delovi antitela, ili njegov antigen-vezujući fragment, izvedeni iz čoveka. Na primer, himerno antitelo može sadržati mišji antigen vezujući domen sa humanim Fc ili drugim takvim strukturnim domenom.
[0069] U nekim primerima izvođenja, antitela su humanizovana antitela. Humanizovana antitela mogu biti himerni imunoglobulini, imunoglobulinski lanci ili njihovi fragmenti (kao što su Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2 ili druge antigen-vezujuće sekvence antitela) koji sadrže minimalnu sekvencu izvedenu iz ne-humanog imunoglobulina. Najvećim delom, humanizovana antitela su humani imunoglobulini (antitelo recipijent) u kom su ostaci iz regiona koji određuje komplementarnost (CDR) recipijenta zamenjeni ostacima iz CDR nehumanih vrsta (antitelo donor) kao što su miš, pacov ili zec koji imaju željenu specifičnost, afinitet, i kapacitet. Generalno, humanizovano antitelo će sadržati suštinski sve od najmanje jednog, i tipično dva, varijabilna domena, u kojima svi ili suštinski svi CDR regioni odgovaraju onima od ne-humanog imunoglobulina i svi ili suštinski svi okvirni regioni su oni od humane imunoglobulinske sekvence. Humanizovano antitelo može uključivati najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično onog od humanog imunoglobulina.
[0070] Antitela ili antigen-vezujući fragmenti opisani ovde mogu se javiti u različitim oblicima, ali će uključivati jedan ili više segmenata ili CDRs varijabilnog domena antitela prikazane u Tabeli 1. Izotipovi antitela opisani u Tabeli 1 su prikazani u zagradama da bi se opisali konstantni regioni svakog antitela, za koje je poznato da imaju konzervativne sekvence.
Tabela 1. Segmenti antitela opisanog antitela i njihovih antigen-vezujućih fragmenata ("Lc" označava laki lanac i "Hc" označava teški lanac).
[0071] Ovde su opisana izolovana antitela i antigen-vezujući fragmenti koji se specifično vezuju za FRα. U nekim primerima izvođenja, antitela ili antigen-vezujući fragmenti su mišji IgG, ili njihovi derivati. Dok antitela ili antigen-vezujući fragmenti mogu biti humani, humanizovani, ili himerni, antitela ili antigen-vezujući fragmenti ovde dati primerima su mišji. U nekim primerima izvođenja, antitela ili antigen-vezujući fragmenti mogu uključiti aminokiselinsku sekvencu CDR1 lakog lanca suštinski istu kao, ili identičnu, SEQ ID NO: 26. U nekim primerima izvođenja, antitela ili antigen-vezujući fragmenti mogu uključiti aminokiselinsku sekvencu CDR2 lakog lanca suštinski istu kao, ili identičnu, SEQ ID NO: 27. U nekim primerima izvođenja, antitela ili antigen-vezujući fragmenti mogu uključiti aminokiselinsku sekvencu CDR3 lakog lanca suštinski istu kao, ili identičnu, SEQ ID NO: 28. U nekim primerima izvođenja, antitela ili antigen-vezujući fragmenti mogu uključiti aminokiselinsku sekvencu CDR1 teškog lanca suštinski istu kao, ili identičnu, SEQ ID NO: 30. U nekim primerima izvođenja, antitela ili ili antigen-vezujući fragmenti mogu uključiti aminokiselinsku sekvencu CDR2 teškog lanca suštinski istu kao, ili identičnu, SEQ ID NO: 31. U nekim primerima izvođenja, antitela ili ili antigen-vezujući fragmenti mogu uključiti aminokiselinsku sekvencu CDR3 teškog lanca suštinski istu kao, ili identičnu, SEQ ID NO: 32. Antitela ili antigen-vezujući fragmenti mogu uključiti laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu CDR1 suštinski istu, ili identičnu, SEQ ID NO: 26; aminokiselinsku sekvencu CDR2 suštinski istu, ili identičnu, SEQ ID NO: 27; i aminokiselinsku sekvencu CDR3 suštinski istu, ili identičnu, SEQ ID NO: 28. Antitela ili antigen-vezujući fragmenti mogu uključiti teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu CDR1 suštinski istu, ili identičnu, SEQ ID NO: 30; aminokiselinsku sekvencu CDR2 suštinski istu, ili identičnu, SEQ ID NO: 31; i aminokiselinsku sekvencu CDR3 suštinski istu, ili identičnu, SEQ ID NO: 32. Antitela ili antigen-vezujući fragmenti mogu uključiti laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu CDR1 suštinski istu kao, ili identičnu, SEQ ID NO: 26; aminokiselinsku sekvencu CDR2 suštinski istu, ili identičnu, SEQ ID NO: 27; i aminokiselinsku sekvencu CDR3 suštinski istu, ili identičnu, SEQ ID NO: 28, i takođe imati teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu CDR1 suštinski istu, ili identičnu, SEQ ID NO: 30; aminokiselinsku sekvencu CDR2 suštinski istu, ili identičnu, SEQ ID NO: 31; i aminokiselinsku sekvencu CDR3 suštinski istu, ili identičnu, SEQ ID NO: 32.
[0072] Opisana antitela ili antigen-vezujući fragmenti mogu uključiti varijabilni region lakog lanca koij uključuje aminokiselinsku sekvencu suštinski istu, ili identičnu, SEQ ID NO: 29. U nekim primerima izvođenja, izolovani polinukleotid koji uključuje sekvencu suštinski istu, ili identičnu, SEQ ID NO: 61 može kodirati ovu aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca. Opisana antitela ili antigen-vezujući fragmenti mogu uključiti varijabilni domen teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu suštinski istu, ili identičnu, SEQ ID NO: 33. U nekim primerima izvođenja, izolovani polinukleotid koji uključuje sekvencu suštinski istu, ili identičnu, SEQ ID NO: 65 može kodirati ovu aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca. Opisana antitela ili antigen-vezujući fragmenti mogu uključiti varijabilne domene lakog i teškog lanca, gde varijabilni region lakog lanca uključuje aminokiselinsku sekvencu suštinski istu, ili identičnu, SEQ ID NO: 29, i varijabilni domen teškog lanca uključuje aminokiselinsku sekvencu suštinski istu, ili identičnu, SEQ ID NO: 33.
[0073] U nekim primerima izvođenja, antitela su proizvedena od strane ćelija koje proizvode antitelo deponovanih u American Type Culture Collection (10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209) 19. maja 2011. i dodeljen im je pristupni br. PTA-11885. U nekim primerima izvođenja, antitela, ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, imaju afinitet vezivanja za FRα antitela proizvedenih od strane deponovanih ćelija koje prozvode antitelo. U nekim primerima izvođenja, opisana antitela, ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, sadrže CDRs lakog i teškog lanca antitela proizvedenih od strane deponovanih ćelija koje proizvode antitelo. U nekim primerima izvođenja, antitela, ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, sadrže varijabilne regione lakog i teškog lanca antitela proizvedenog od strane deponovanih ćelija koje proizvode antitelo.
[0074] Takođe su opisani polinukleotidi koji kodiraju antitela ili antigen-vezujuće fragmente koji se specifično vezuju za FRα. U nekim primerima izvođenja, izolovani polinukleotidi kodiraju antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sa sekvencom CDR1 lakog lanca suštinski istom kao, ili identičnom kao, SEQ ID NO: 26, na primer SEQ ID NO: 58. U nekim primerima izvođenja, izolovani polinukleotidi kodiraju antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sa CDR2 lakog lanca suštinski istom, ili identičnom, SEQ ID NO: 27, na primer SEQ ID NO: 59. U nekim primerima izvođenja, izolovani polinukleotidi kodiraju antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sa CDR3 lakog lanca suštinski istom, ili identičnom, SEQ ID NO: 28, na primer SEQ ID NO: 60. U nekim primerima izvođenja, izolovani polinukleotidi kodiraju antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sa CDR1 teškog lanca suštinski istom, ili identičnom, SEQ ID NO: 30, na primer SEQ ID NO: 62. U nekim primerima izvođenja, izolovani polinukleotidi kodiraju antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment CDR2 teškog lanca suštinski istom, ili identičnom, SEQ ID NO: 31, na primer SEQ ID NO: 63. U nekim primerima izvođenja, izolovani polinukleotidi kodiraju antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sa CDR3 teškog lanca suštinski istom, ili identičnom, SEQ ID NO: 32, na primer SEQ ID NO: 64. Polinukleotidi mogu kodirati antitelo ili njegov antigenvezujući fragment sa lakim lancem sa CDR1 suštinski istom, ili identičnom, SEQ ID NO: 26, na primer SEQ ID NO: 58; CDR2 suštinski istom, ili identičnom, SEQ ID NO: 27, na primer SEQ ID NO: 59; i CDR3 suštinski istom, ili identičnom, SEQ ID NO: 28, na primer SEQ ID NO: 60. Polinukleotidi mogu kodirati antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sa CDR1 teškog lanca suštinski istom, ili identičnom, SEQ ID NO: 30, na primer SEQ ID NO: 62; CDR2 suštinski istom, ili identičnom, SEQ ID NO: 31, na primer SEQ ID NO: 63; i CDR3 suštinski istom, ili identičnom, SEQ ID NO: 32, na primer SEQ ID NO: 64. Polinukleotidi mogu kodirati antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sa CDR1 lakog lanca istom, ili identičnom, SEQ ID NO: 26, na primer SEQ ID NO: 58; CDR2 kodiran sa nunukleotidnom sekvencom suštinski istom, ili identičnom, SEQ ID NO: 27, na primer SEQ ID NO: 59; i CDR3 kodiranim sa nukleotidnom sekvencom suštinski istom, ili identičnom, SEQ ID NO: 28, na primer SEQ ID NO: 60; CDR1 teškog lanca suštinski istom, ili identičnom, SEQ ID NO: 30, na primer SEQ ID NO: 62; CDR2 suštinski istom, ili identičnom, SEQ ID NO: 31, na primer SEQ ID NO: 63; i CDR3 suštinski istom, ili identičnom, SEQ ID NO: 32, na primer SEQ ID NO: 64. Antigen vezujući aranžmani CDRs mogu takođe biti konstruisani inženjeringom korišćenjem proteina sličnih antitelu kao CDR potpora. Takvi inženjeringom dobijeni antigen-vezujući proteini su unutar obima opisa.
[0075] Ovde opisani polinukleotidi mogu kodirati antitela ili antigen-vezujuće fragmente koji imaju segment varijabilnog domena lakog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu suštinski istu, ili identičnu, SEQ ID NO: 29, na primer SEQ ID NO: 61. U nekim primerima izvođenja opisani polinukleotidi mogu kodirati antitela ili antigen-vezujuće fragmente koji imaju segment varijabilnog domena teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu suštinski istu, ili identičnu, SEQ ID NO: 33, na primer SEQ ID NO: 65. U nekim primerima izvođenja opisani polinukleotidi mogu kodirati antitela ili antigen-vezujuće fragmente koji imaju segment varijabilnog domena lakog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu suštinski istu, ili identičnu, SEQ ID NO: 29, na primer SEQ ID NO: 61; i segment varijabilnog domena teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu suštinski istu, ili identičnu, SEQ ID NO: 33, na primer SEQ ID NO: 65. Polinukleotidi sposobni da kodiraju segmente varijabilnog domena obezbeđeni ovde mogu biti uključeni na istim, ili različitim, vektorima da proizvedu antitela ili antigen-vezujuće fragmente.
[0076] Polinukleotidi koji kodiraju inženjeringom dobijene antigen-vezujuće proteine takođe su unutar obima opisa. U nekim primerima izvođenja, opisani polinukleotidi (i peptidi koje kodiraju) uključuju lider sekvencu. Može se koristiti bilo koja lider sekvenca poznata u tehnici. Lider sekvenca može uključivati, ali nije ograničena na, restrikciono mesto ili mesto početka translacije.
[0077] Antitela ili antigen-vezujući fragmenti opisani ovde uključuju varijante koje imaju jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija, ili adicija koji zadržavaju biološke osobine (npr., afinitet vezivanja ili efektornu imunu aktivnost) opisanih antitela ili antigenvezujućih fragmenata. Stručnjak može proizvesti varijante koje imaju jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija, ili adicija. Ove varijante mogu uključivati: (a) varijante u kojima je jedan ili više aminokiselinskih ostataka supstituisano sa konzervativnim ili nekonzervativnim aminokiselinama, (b) varijante u kojima su jedna ili više aminoksielina dodate ili deletirane iz polipeptida, (c) varijante u kojima jedna ili više aminokiselina uključuje supstituentsku grupu, i (d) varijante u kojima je polipeptid fuzionisan sa drugim peptidom ili polipeptidom kao što je fuzioni partner, proteinski tag ili drugi hemijski deo, koji može imati korisne osobine za polipeptid, kao što je, na primer, epitop za antitelo, polihistidinska sekvenca, biotinski deo i slično. Antitela ili antigen-vezujući fragmenti opisani ovde mogu uključivati varijante u kojima su aminokiselinski ostaci iz jedne vrste zamenjeni sa odgovarajućim ostatkom u drugoj vrsti, bilo na konzervativnim ili nekonzervativnim pozicijama. U drugim primerima izvođenja, aminokiselinski ostaci na nekonzervativnim su supstituisani sa konzervativnim ili nekonzervativnim ostacima. Tehnike za dobijanje ovih varijanti, uključujući genetičke (supresije, delecije, mutacije, itd.), hemijske, i enzimske tehnike, poznate su stručnjaku.
[0078] Antitela ili antigen-vezujući fragmenti opisani ovde mogu uključivati nekoliko izotipova antitela, kao što su IgM, IgD, IgG, IgA i IgE. Specifičnost antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta je većinom definisana aminokiselinskom sekvencom, i aranžmanom, CDRs. Stoga, CDRs jednog izotipa mogu se preneti na drugi izotip bez izmene specifičnosti za antigen. Alternativno, ustanovljene su tehnike da izazovu hibridome da se promene u odnosu na proizvodnju jednog tipa antitela u drugo (promena izotipa) bez izmene specifičnosti za antigen. Shodno tome, takvi izotipovi antitela su unutar obima opisanog antitela ili antigen-vezujućih fragmenata.
[0079] Antitela ili antigen-vezujući fragmenti opisani ovde imaju afinitete vezivanja (u M) za FRα koji uključuju konstantu disocijacije (KD) manju od oko 1x10<-8>M. U jednom primeru izvođenja antitelo 9F3 ima afinitet za FRα od 7.15x10<-10>M. U jednom primeru izvođenja antitelo 19D4 ima afinitet za FRα od 5.67x10<-10>M. U jednom primeru izvođenja antitelo 24F12 ima afinitet za FRα od 1.02x10<-10>M. U jednom primeru izvođenja antitelo 26B3 ima afinitet za FRα od 2.73x10<-11>M. U jednom primeru izvođenja antitelo 9F3 ima afinitet za FRα od oko 6.5x10<-10>M do oko 8x10<-10>M. U jednom primeru izvođenja antitelo 19D4 ima afinitet za FRα od oko 5x10<-10>M do oko 6.5x10<-10>M. U jednom primeru izvođenja antitelo 24F12 ima afinitet za FRα od oko 0.5x10<-10>M do oko 2x10<-10>M. U jednom primeru izvođenja antitelo 26B3 ima afinitet za FRα od oko 1x10<-11>M do oko 3.5x10<-11>M.
[0080] Takođe su obezbeđeni vektori koji sadrže polinukleotide opisane ovde. Vektori mogu biti ekspresioni vektori. Rekombinantni vektori koji sadrže sekvencu koja kodira polipeptid od interesa su stoga predviđeni kao unutar obima opisa. Ekspresioni vektor može sadržati jednu ili više dodatnih sekvenci kao što su, ali ne ograničavajući se na, regulatorne sekvence (npr., promotor, enhanser), selekcioni marker, i poliadenilacioni signal. Vektori za transformisanje veoma raznovrsnih ćelija domaćina su dobro poznati i uključuju, ali nisu ograničeni na, plazmide, fagemide, kozmide, bakuloviruse, bakmide, bakterijske veštačke hromozome (BACs), veštačke hromozome kvasca (YACs), kao i druge vektore bakterija, kvasca i virusa.
[0081] Rekombinantni ekspresioni vektori unutar obima opisa uključuju sintetičke, genomske, ili cDNK-izvedene fragmente nukleinske kiseline koji kodiraju najmanje jedan rekombinantni protein koji može biti operativno vezan za pogodne regulatornne elemente. Takvi regulatorni elementi mogu uključiti transkripcioni promotor, sekvence koje kodiraju pogodna iRNK ribozomska vezujuća mesta, i sekvence koje kontrolišu završetak transkripcije i translacije. Ekspresioni vektori, naročito sisarski ekspresioni vektori, mogu takođe uključivati jedan ili više elemenata koji ne podležu transkripciji kao što je oridžin replikacije, pogodni promotor i enhanser povezan sa genom koji se eksprimira, druge 5’ ili 3’ okružujuće sekvence koje ne podležu transkripciji, 5’ ili 3’ sekvence koje ne podležu translaciji (kao što su neophodna mesta vezivanja na ribozomu), poliadenilaciono mesto, splajs donor i akceptor mesta, ili sekvence za završavanje transkripcije. Takođe se može inkorporisati oridžin replikacije koji daje sposobnost replikacije u domaćinu.
[0082] Transkripcione i translacione kontrolne sekvence u ekspresionim vektorima za korišćenje u transformaciji ćelija kičmenjaka mogu se obezbediti virusnim izvorima. Primeri vektora mogu se konstruisati kao što je opisano od strane Okayama and Berg, 3 Mol. Cell. Biol. 280 (1983).
[0083] U nekim primerima izvođenja, sekvenca koja kodira antitelo- ili antigen-vezujući fragment stavljena je pod kontrolu snažnog konstitutivnog promotora, kao što su promotori sledećih gena: hipoksantin fosforibozil transferaza (HPRT), adenozin deaminaza, piruvat kinaza, beta-aktin, humani miozin, humani hemoglobin, humani mišićni kreatin, i drugi. Dodatno, mnogi virusni promotori funkcionišu konstitutivno u eukariotskim ćelijama i pogodni su za upotrebu sa opisanim primerima izvođenja. Takvi virusni promotori uključuju, bez ograničenja, neposredni rani promotor citomegalovirusa (CMV), rane i kasne promotore SV40, promotor virusa tumora dojke miša (MMTV), duge terminalne ponovke (LTRs) virusa Maloney leukemije, virusa humane imunodeficijencije (HIV), Epstein Barr virusa (EBV), Rous Sarcoma virusa (RSV), i drugih retrovirusa, i timidin kinaza promotor Herpes Simplex virusa. U jednom primeru izvođenja, sekvenca koja kodira antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment je stavljena pod kontrolu inducibilnog promotera kao što je metalotionein promotor, tetraciklin-inducibilni promotor, doksiciklin-inducibilni promotor, promotori koji sadrže jedan ili više elemenata koji odgovaraju na stimulaciju interferonom (ISRE) kao što je protein kinaza R 2’, 5’-oligoadenilat sintetaze, Mx geni, ADAR1, i slično.
[0084] Ovde opisani vektori mogu sadržati jedan ili više internih ribozomalnih mesta ulaska (IRES). Uključivanje IRES sekvence u fuzione vektore može biti korisno za pojačanje ekspresije nekih proteina. U nekim primerima izvođenja vektorski sistem će uključivati jedan ili više poliadenilacionih mesta (npr., SV40), koje može biti ushodno ili nishodno od bilo kojih prethodno pomenutih sekvenci nukleinske kiseline. Komponente vektora mogu biti neprekidno vezane, ili aranžirane na način koji obezbeđuje optimalno rastojanje za ekspresiju genskih proizvoda (tj., introdukovanjem "spejser" nukleotida između ORFs), ili postavljenih na drugi način. Regulatorni elementi, kao što je IRES motiv, mogu takođe biti aranžirani tako da obezbede otimalno rastojanje za ekspresiju.
[0085] Vektori mogu sadržati selekcione markere, koji su dobro poznati u tehnici. Selekcioni markeri uključuju pozitivne i negativne selekcione markere, na primer, gene za rezistenciju na antibiotike (npr., gen za rezistenciju na neomicin, gen za rezistenciju na higromicin, gen za rezistenciju na kanamicin, gen za rezistenciju na tetraciklin, gen za rezistenciju na penicilin), gene za glutamat sintazu, HSV-TK, HSV-TK derivate za ganciklovir selekciju, ili bakterijsku fosforilazu purinskog nukleozida, gen za 6-metilpurin selekciju (Gadi et al., 7 Gene Ther.
1738-1743 (2000)). Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira selekcioni marker ili mesto za kloniranje može biti ushodno ili nishodno od sekvence nukleinske kiseline koja kodira polipeptid od interesa ili mesto za kloniranje.
[0086] Ovde opisani vektori mogu se koristiti za transformisanje različitih ćelija sa genima koji kodiraju opisana antitela ili antigen-vezujuće fragmente. Na primer, vektori se mogu koristiti za stvaranje ćelija koje proizvode antitela ili antigen-vezujuće fragmente. Stoga, sledeći aspekat se odnosi na ćelije domaćine transformisane sa vektorima koji sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja kodira antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje sa FRα, kao što su antitela ili antigen-vezujući fragmenti ovde opisani i dati primerima.
[0087] U tehnici su poznate brojne tehnike za uvođenje stranih gena u ćelije i mogu se koristiti za konstruisanje rekombinantnih ćelija za izvođenje opisanih postupaka, u skladu sa različitim primerima izvođenja ovde opisanim i datim primerima. Korišćena tehnika treba da obezbedi stabilni transfer sekvence heterolognog gena u ćeliju domaćina, tako da je sekvenca heterolognog gena nasledna i da se može eksprimirati od potomaka ćelije, i tako da neophodne razvojne i fiziološke funkcije ćelija recipijenata nisu poremećene. Tehnike koje se mogu koristiti uključuju, ali nisu ograničene na transfer hromozoma (npr., fuzija ćelija, tansfer gena posredovan hromozomom, genski transfer posredovan mikro ćelijom), fizički postupci (npr., transfektovanje, fuzija sferoplasta, mikroinjekcija, elektroporacija, lipozomalni nosač), transfer virusnim vektorom (npr., rekombinantni DNK virusi, rekombinantni RNK virusi) i slično (opisani u Cline, 29 Pharmac. Ther. 69-92 (1985)). Za transformaciju ćelija takođe se mogu koristiti precipitacija kalcijum fosfatom i polietilen glikolom (PEG)-indukovana fuzija bakterijskih protoplasta sa sisarskim ćelijama.
[0088] Ćelije pogodne za upotrebu u ekspresiji antitela ili antigen-vezujućih fragmenata opisanih ovde su poželjno eukariotske ćelije, poželjnije ćelije biljnog, glodarskog, ili humanog porekla, na primer, ali ne ograničavajući se, između ostalog, na NSO, CHO, CHOK1, perC.6, Tk-ts13, BHK, HEK293 ćelije, COS-7, T98G, CV-1/EBNA, L ćelije, C127, 3T3, HeLa, NS1, Sp2/0 ćelije mijeloma, i BHK ćelijske linije. Dodatno, ekspresija antitela može se postići korišćenjem ćelija hibridoma. Postupci za proizvodnju hibridoma su dobro ustanovljeni u tehnici.
[0089] Ćelije transformisane sa ekspresionim vektorima opisane ovde mogu se selektovati ili se može izvršiti njihov skrining u odnosu na rekombinantnu ekspresiju antitela ili antigenvezujućih fragmenata opisanih ovde. Izvrešena je ekspanzija rekombinantno-pozitivnih ćelija i skrining u odnosu na subklonove koji pokazuju željeni fenotip, kao što je visok nivo ekspresije, poboljšane osobine rasta, ili sposobnost da daju proteine sa željenim biohemijskim karakteristikama, na primer, usled modifikacije proteina ili izmenjenih post-translacionih modifikacija. Ovi fenotipovi mogu biti usled inherentnih osobina datog subklona ili usled mutacije. Mutacije se mogu izvesti korišćenjem hemikalija, svetlosti UV-talasne dužine, zračenja, virusa, insercionim mutagenima, inhibicijom popravke pogrešnog sparivanja DNK, ili kombinacijom takvih postupaka.
[0090] Ovde su obezbeđeni postupci za detektovanje FRα u uzorku putem dovođenja u kontakt uzorka sa antitelom, ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, opisanim ovde. Kao što je ovde opisano, uzorak se može uzeti iz urina, krvi, seruma, plazme, pljuvačke, ascita, cirkulišućih ćelija, cirkulišućih tumorskih ćelija, ćelija koje nisu povezane sa tkivom (tj., slobodnih ćelija), tkiva (npr., hirurški odstranjenog tkiva tumora, biopsija, uključujući aspiraciju tankom iglom), histoloških preparata, i slično. U nekim primerima izvođenja opisani postupci uključuju detektovanje FRα u uzorku putem dovođenja u kontakt uzorka sa antitelom, ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, specifičnim za alfa receptor folata, kao što je definisano u patentnim zahtevima. U primerima izvođenja gde su korišćena dva antitela, ili njihov antigen-vezujući fragment, jedno od antitela ili njihovih antigen vezujućih fragmenata su kao što je definisano u patentnim zahtevima i drugo antitelo je izabrano od
(a) antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, koji vezuje isti epitop kao bilo koje od antitela 9F3, antitela 19D4, antitela 24F12, ili antitela 26B3;
(b) bilo koje od antitela 9F3, antitela 19D4, antitela 24F12, ili antitela 26B3, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta;
(c) antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, koji sadrži aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 teškog lanca i aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 lakog lanca bilo kog od antitela 9F3, antitela 19D4, antitela 24F12, ili antitela 26B3, kao što je opisano u Tabeli 1;
(d) antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji sadrži segment varijabilnog domena teškog lanca i segment varijabilnog domena lakog lanca bilo kog od antitela 9F3, antitela 19D4, antitela 24F12, ili antitela 26B3, kao što je opisano u Tabeli 1; ili
(e) antitelo koje ima aminokiselinsku sekvencu antitela proizvedenog od strane bilo koje od ćelijskih linija deponovanih kod ATCC sa pristupnim brojem PTA-11887, PTA-11884, PTA-11886, ili PTA-11885, ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom.
[0091] U nekim primerima izvođenja uzorak se može dovesti u kontakt sa više od jednog antitela, ili antigen-vezujućeg fragmenta opisanih ovde. Na primer, uzorak može biti doveden u kontakt sa prvim antitelom, ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, i zatim doveden u kontakt sa drugim antitelom, ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, gde prvo antitelo ili antigen-vezujući fragment i drugo antitelo ili antigen-vezujući fragment nisu isto antitelo ili antigen-vezujući fragment. U nekim primerima izvođenja, prvo antitelo, ili njegov antigenvezujući fragment, mogu biti pričvršeni za površinu, kao što je višekomorna ploča, čip, ili sličan supstrat pre kontaktiranja uzorka. U drugim primerima izvođenja prvo antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, ne mora biti pričvršćeno, ili vezano, za bilo šta pre kontaktiranja uzorka.
[0092] Različite kombinacije antitela, ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata, mogu se koristiti za detekciju FRα u uzorku.
[0093] U jednom primeru izvođenja uzorak se može dovesti prvo u kontakt sa antitelom, ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, koji sadrži aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 teškog lanca i aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 lakog lanca antitela 26B3 (kao što je dato u Tabeli 1), i zatim posebno kontaktiran sa drugim antitelom, ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, koji sadrži aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 teškog lanca i aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 lakog lanca antitela 9F3 (kao što je dato u Tabeli 1). U jednom primeru izvođenja uzorak se može dovesti prvo u kontakt sa antitelom, ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, koji sadrži aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 teškog lanca i aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 lakog lanca antitela 26B3 (kao što je dato u Tabeli 1), i zatim posebno kontaktiran sa drugim antitelom, ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, koji sadrži aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 teškog lanca i aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 lakog lanca antitela 24F12 (kao što je dato u Tabeli 1). U jednom primeru izvođenja uzorak se može dovesti prvo u kontakt sa antitelom, ili njegovim antigenvezujućim fragmentom, koji sadrži aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 teškog lanca i aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 lakog lanca antitela 26B3 (kao što je dato u Tabeli 1), i zatim posebno kontaktiran sa drugim antitelom, ili njegovim antigenvezujućim fragmentom, koji sadrži aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 teškog lanca i aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 lakog lanca antitela 19D4 (kao što je dato u Tabeli 1).
[0094] U jednom primeru izvođenja uzorak se može dovesti prvo u kontakt sa antitelom, ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, koji sadrži aminokiselinske sekvence segmenta varijabilnog domena teškog lanca i aminokiselinske sekvence segmenta varijabilnog domena lakog lanca antitela 26B3 (kao što je dato u Tabeli 1), i zatim posebno kontaktiran sa drugim antitelom, ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, koji sadrži aminokiselinske sekvence segmenta varijabilnog domena teškog lanca i aminokiselinske sekvence segmenta varijabilnog domena lakog lanca antitela 9F3 (kao što je dato u Tabeli 1). U jednom primeru izvođenja uzorak se može dovesti prvo u kontakt sa antitelom, ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, koji sadrži aminokiselinske sekvence segmenta varijabilnog domena teškog lanca i aminokiselinske sekvence segmenta varijabilnog domena lakog lanca antitela 26B3 (kao što je dato u Tabeli 1), i zatim posebno kontaktiran sa drugim antitelom, ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, koji sadrži aminokiselinske sekvence segmenta varijabilnog domena teškog lanca i aminokiselinske sekvence segmenta varijabilnog domena lakog lanca antitela 24F12 (kao što je dato u Tabeli 1). U jednom primeru izvođenja uzorak se može dovesti prvo u kontakt sa antitelom, ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, koji sadrži aminokiselinske sekvence segmenta varijabilnog domena teškog lanca i aminokiselinske sekvence segmenta varijabilnog domena lakog lanca antitela 26B3 (kao što je dato u Tabeli 1), i zatim posebno kontaktiran sa drugim antitelom, ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, koji sadrži aminokiselinske sekvence segmenta varijabilnog domena teškog lanca i aminokiselinske sekvence segmenta varijabilnog domena lakog lanca antitela 19D4 (kao što je dato u Tabeli 1).
[0095] U jednom primeru izvođenja uzorak se može dovesti prvo u kontakt sa antitelom proizvedenim od strane ćelijske linije koja ima ATCC pristupni broj PTA-11885, ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, i zatim posebno kontaktiran sa drugim antitelom proizvedenim od strane ćelijske linije koja ima ATCC pristupni broj PTA-11884, ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom. U jednom primeru izvođenja uzorak se može dovesti prvo u kontakt sa antitelom proizvedenim od strane ćelijske linije koja ima ATCC pristupni broj PTA-11885, ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, i zatim posebno kontaktiran sa drugim antitelom proizvedenim od strane ćelijske linije koja ima ATCC pristupni broj PTA-11887, ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom. U jednom primeru izvođenja uzorak se može dovesti prvo u kontakt sa antitelom proizvedenim od strane ćelijske linije koja ima ATCC pristupni broj PTA-11885, ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, i zatim posebno kontaktiran sa drugim antitelom proizvedenim od strane ćelijske linije koja ima ATCC pristupni broj PTA-11886, ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom.
[0096] Opisana antitela i antigen-vezujući fragmenti mogu se detektabilno obeležiti. U nekim primerima izvođenja obeležena antitela i antigen-vezujući fragmenti mogu olakšati detekciju FRα preko ovde opisanih postupaka. Mnogi takvi obeleživači su dobro poznati stručnjaku. Na primer, pogodni obeleživači uključuju, ali ih ne treba smatrati ograničenim na, radioobeleživače, fluorescentne obeleživače (kao što je DyLight® 649), epitop tagove, biotin, hromofor obeleživače, ECL obeleživače, ili enzime. Specifičnije, opisani obeleživači uključuju rutenijum,<111>In-DOTA,<111>In-dietilentriaminpentasirćetnu kiselinu (DTPA), peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu i beta galaktozidazu, polihistidin (HIS tag), akridin boje, cijanin boje, fluoron boje, oksazin boje, fenantridin boje, rodamin boje, Alexafluor® boje, i slično.
[0097] Opisana antitela i antigen-vezujući fragmenti mogu se koristiti u različitim analizama za detekciju FRα u uzorku. Neke pogodne analize uključuju, ali ih ne treba smatrati ograničavajućim, western blot analizu, radioimuno analizu, imunofluorimetriju, imunoprecipitaciju, ravnotežnu dijalizu, imunodifuziju, elektrohemiluminescentnu (ECL) imunoanalizu, imunohistohemiju, fluorescencijom-aktivirano sortiranje ćelija (FACS) ili ELISA test.
[0098] U nekim primerima izvođenja opisanim ovde detekcija FRα-eksprimirajućih ćelija kancera kod subjekta može se koristiti da se odredi da li se subjekt može tretirati teraputskim sredstvom usmerenim protiv FRα. U nekim primerima izvođenja terapeutsko sredstvo usmereno protiv FRα može biti antitelo, kao što je Farletuzumab.
Postupci za dijagnozu kancera
[0099] Ovde su obezbeđeni postupci za dijagnozu kancera jajnika, dojke, tiroidee, kolorektalni, endometrijalni, jajovoda, ili kancera pluća epitelnog porekla kod subjekta. U nekim primerima izvođenja, kao što je prethodno opisano, detektovanje FRα u uzorku, kao što je histološki uzorak, uzorak iz aspirata tankom iglom, isečenog tkiva tumora, cirkulišućih ćelija, cirkulišućih ćelija tumora, i slično, obezbeđuje sposobnost dijagnoze kancera kod subjekta od koga je dobijen uzorak. U nekim primerima izvođenja, već može biti poznato da subjekt od koga je dobijen uzorak ima kancer, ali tip kancera koji je pogodio subjekta nije još dijagnostifikovan ili preliminarna dijagnoza može biti nejasna, pa stoga detekcija FRα u uzorku dobijenom od subjekta može omogućiti, ili razjasniti, dijagnozu kancera.
[0100] U nekim primerima izvođenja opisani postupci uključuju procenu da li je subjekt pogođen sa FRα-eksprimirajućim kancerom određivanjem količine FRα koja je prisutna u uzorku dobijenom od subjekta; i poređenjem uočene količine FRα sa količinom FRα u kontrolnom uzorku, pri čemu razlika između količine FRα u uzorku izvedenom iz subjekta i količine FRα u kontrolnom uzorku je indikacija da je subjekt pogođen sa FRαeksprimirajućim kancerom. U nekim primerima izvođenja količina FRα u uzorku izvedenom iz subjekta procenjena je dovođenjem u kontakt uzorka sa antitelom koje se vezuje za FRα, kao što su antitela opisana ovde. Slični postupci se mogu koristiti da se odredi da li je subjekt pogođen sa kancerom koji nije povezan sa povećanom proizvodnjom FRα. Uzorak procenjen u odnosu na prisustvo FRα može se dobiti iz urina, krvi, seruma, plazme, pljvačke, ascita, cirkulišućih ćelija, cirkulišućih ćelija tumora, ćelija koje nisu povezane sa tkivom (tj., slobodne ćelije), tkiva (npr., hirurški odstranjenog tkiva tumora, biopsija, uključujući aspiraciju tankom iglom), histoloških preparata, i slično. U nekim primerima izvođenja subjekt je čovek.
[0101] U nekim primerima izvođenja postupak dijagnoze FRα-eksprimirajućeg kancera uključivaće: dovođenje u kontakt biološkog uzorka subjekta sa FRα-specifičnim antitelom, ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom (kao što su oni koji se mogu izvesti iz antitela i fragmenata obezbeđenih u Tabeli 1), kvantifikovanja količine FRα prisutne u uzorku koji je vezan sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, poređenja količine FRα prisutnog u uzorku sa poznatim standardom; i određivanje da li su nivoi FRα subjekta u okviru nivoa FRα povezanim sa kancerom. U dodatnom primeru izvođenja, dijagnostički postupak može biti praćen sa dodatnim korakom primene ili propisivanjem kancerspecifičnog tretmana. U nekim primerima izvođenja kancer-specifični tretman može biti usmeren protiv FRα-eksprimirajućih kancera, kao što je Farletuzumab.
[0102] U nekim primerima izvođenja opisani postupci uključuju procenu da li je subjekt pogođen FRα-eksprimirajućim kancerom određivanjem količine FRα povezane sa ćelijom ili tkivom koje je prisutno u uzorku izvedenom iz subjekta; i poređenje uočene količine FRα sa količinom FRα u kontrolnom uzorku, gde je razlika između FRα u uzorku izvedenom iz subjekta i količine FRα u kontrolnom uzorku indikacija da je subjekt pogođen sa FRαeksprimirajućim kancerom.
[0103] U nekim primerima izvođenja kontrolni uzorak se može izvesti iz subjekta koji nije pogođen sa FRα-eksprimirajućim kancerom. U nekim primerima izvođenja kontrolni uzorak može biti izveden iz subjekta koji je pogođen sa FRα-eksprimirajućim kancerom. U nekim primerima izvođenja gde je kontrolni uzorak izveden iz subjekta koji nije pogođen sa FRαeksprimirajućim kancerom, uočeno povećanje u količini FRα prisutno u uzorku, u odnosu na ono uočeno kod kontrolnog uzorka, je indikacija da je subjekt koji se procenjuje pogođen sa FRα-eksprimirajućim kancerom. U nekim primerima izvođenja gde je kontrolni uzorak izveden iz subjekta koji nije pogođen FRα-eksprimirajućim kancerom, uočeno smanjenje ili sličnost u količini FRα prisutnom u test uzorku, u odnosu na onaj uočen za kontrolni uzorak, indikacija je da subjekat koji se procenjuje nije pogođen FRα-eksprimirajućim kancerom. U nekim primerima izvođenja gde je kontrolni uzorak izveden iz subjekta koji je pogođen FRαeksprimirajućim kancerom, uočena sličnost u količini FRα prisutnog u test uzorku, u odnosu na onu uočenu za kontrolni uzorak, indikacija je da je subjekt koji se procenjuje pogođen FRα-eksprimirajućim kancerom. U nekim primerima izvođenja gde je kontrolni uzorak izveden iz subjekta koji je pogođen FRα-eksprimirajućim kancerom, uočeno smanjenje u količini FRα prisutnoj u test uzorku, u odnosu na onu uočenu za kontrolni uzorak, indikacija je da subjekt koji se procenjuje nije pogođen FRα-eksprimirajućim kancerom.
[0104] U nekim primerima izvođenja količina FRα u uzorku dobijenom od subjekta je procenjena dovođenjem u kontakt uzorka sa antitelom koje se vezuje za FRα, kao što su antitela opisana ovde. Uzorak procenjen u odnosu na prisustvo FRα može biti iz cirkulišućih ćelija, cirkulišućih ćelija tumora, ćelija koje nisu povezane sa tkivom (tj., slobodnih ćelija), tkiva (npr., hirurški odstranjenog tkiva tumora, biopsija, uključujući aspiraciju tankom iglom), histoloških preparata, i slično.
[0105] U nekim primerima izvođenja opisani postupci uključuju procenu da li je subjekt pogođen sa FRα-eksprimirajućim kancerom određivanjem količine FRα koja nije povezana sa ćelijom ili tkivom koje je prisutno u uzorku izvedenom iz subjekta; i poređenjem uočene količine FRα sa količinom FRα u kontrolnom uzorku, pri čemu je razlika između količine FRα u uzorku dobijenom od subjekta i količine FRα u kontrolnom uzorku indikacija da je subjekt pogođen FRα-eksprimirajućim kancerom. U nekim primerima izvođenja količina FRα u uzorku dobijenom od subjekta procenjena je dovođenjem u kontakt uzorka sa antitelom koje se vezuje sa FRα, kao što su antitela opisana ovde. Uzorak procenjen u odnosu na prisustvo FRα može biti urin, krv, serum, plazma, pljuvačka, ascit, histološki preparati, i slično.
[0106] U različitim primerima izvođenja opisanih postupaka, kancer može biti FRαeksprimirajući kancer. U naročitom primeru izvođenja, FRα-eksprimirajući kancer je kancer jajnika. U nekim primerima izvođenja FRα-eksprimirajući kancer je endometrijalni kancer. U nekim primerima izvođenja FRα-eksprimirajući kancer je kolorektalni kancer. U nekim primerima izvođenja FRα-eksprimirajući kancer je kancer dojke. U nekim primerima izvođenja FRα-eksprimirajući kancer je tiroidni kancer. U nekim primerima izvođenja FRαeksprimirajući kancer je kancer jajovoda. U sledećem primeru izvođenja, FRα-eksprimirajući kancer je nesitnoćelijski kancer pluća, kao što je adenokarcinom. Alternativno, opisani postupci mogu se koristiti da se dijagnostikuje kancer koji ne eksprimira FRα, kao što je karcinom skvamoznih ćelija.
[0107] U različitim aspektima, količina FRα je određena dovođenjem u kontakt uzorka sa antitelom, ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, koji se vezuje za FRα. U nekim primerima izvođenja, uzorak može biti doveden u kontakt sa više od jednog tipa antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, koji se vezuje za FRα. U nekim primerima izvođenja, uzorak može biti doveden u kontakt sa prvim antitelom, ili njegovim antigen fragmentom, koji se vezuje za FRα kao što je definisano u patentnim zahtevima 1 do 3 i zatim dovedeno u kontakt sa drugim antitelom, ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, koji se vezuje za FRα. Drugo antitelo je izabrano iz grupe koja se sastoji od:
(a) antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, koji vezuje isti epitop kao bilo koje od antitela 9F3, antitela 19D4, antitela 24F12, ili antitela 26B3;
(b) bilo kojeg od antitela 9F3, antitela 19D4, antitela 24F12, ili antitela 26B3, ili njegov antigen-vezujući fragment;
(c) antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, koji sadrži aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 teškog lanca i aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 lakog lanca bilo kog od antitela 9F3, antitela 19D4, antitela 24F12, ili antitela 26B3, kao što je opisano u Tabeli 1;
(d) antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, koje sadrži segment varijabilnog domena teškog lanca i segment varijabilnog domena lakog lanca bilo kojeg od antitela 9F3, antitela 19D4, antitela 24F12, ili antitela 26B3, kao što jeopisano u Tabeli 1; ili
(e) antitela koje ima aminokiselinsku sekvencu antitela proizvedenog od strane bilo koje ćelijske linije deponovane kod ATCC sa pristupnim brojem PTA-11887, PTA-11884, PTA-11886, ili PTA-11885, ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta.
Različite kombinacije antitela i antigen-vezujućih fragmenata opisanih u (a)-(e), kao što je prethodno detaljno dato u opštem delu koji opisuje postupke detekcije, mogu se koristiti da bi se obezbedilo "prvo" i "drugo" antitelo ili antigen-vezujući fragment da bi se izveli opisani dijagnostički postupci.
[0108] U određenim primerima izvođenja, količina FRα je određena western blot analizom, radioimuno analizom, imunofluorimetrijom, imunoprecipitacijom, ravnotežnom dijalizom, imunodifuzijom, elektrohemiluminescentnom (ECL) imunoanalizom, imunohistohemijom, fluorescencijom-aktiviranim sortiranjem ćelija (FACS) ili ELISA testom.
[0109] U različitim primerima izvođenja opisanih dijagnostičkih postupaka korišćen je kontrolni uzorak. Kontrolni uzorak može biti kontrolni pozitivni ili negativni test koji osigurava da korišćena analiza ispravno radi; na primer, kontrolni test ovog tipa može se uobičajeno koristiti za imunohistohemijske analize. Alternativno, kontrolni uzorak može biti standardizovana kontrolna količina FRα kod zdravog subjekta. U nekim primerima izvođenja, uočeni FRα nivoi testiranog subjekta mogu se uporediti sa FRα nivoima uočenim kod uzoraka od kontrolnih subjekata za koje se zna da imaju FRα-eksprimirajući kancer. U nekim primerima izvođenja, the FRα-eksprimirajući kancer kontrolnog subjekta je kancer jajnika, endometrijalni kancer, kolorektalni kancer, kancer dojke, tiroidni kancer, kancer jajovoda, ili kancer pluća, kao što je adenokarcinom. U nekim primerima izvođenja, poznato je da kontrolni subjekt ima rani stadijum FRα-eksprimirajućeg kancera, kao što je I stadijum kancera jajnika, endometrijalnog kancera, kolorektalnog kancera, kancera dojke, tiroidnog kancera, kancera jajovoda, ili kancera pluća (npr., adenokarcinom). U nekim primerima izvođenja, poznato je da kontrolni subjekt ima srednji stadijum FRα-eksprimirajućeg kancera, kao što je II stadijum kancera jajnika, endometrijalnog kancera, kolorektalnog kancera, kancera dojke, tiroidnog kancera, kancera jajovoda, ili kancera pluća (npr., adenokarcinom). U nekim primerima izvođenja, poznato je da kontrolni subjekt ima kasni stadijum FRαeksprimirajućeg kancera, kao što je III ili IV stadijum kancera jajnika, endometrijalnog kancera, kolorektalnog kancera, kancera dojke, tiroidnog kancera, kancera jajovoda, ili kancera pluća (npr., adenokarcinom).
[0110] Dijagnostički postupci obezbeđeni ovde takođe obezbeđuju osnovu na kojoj može biti moguće predviđanje da li subjekt ima relativno veću ili manju verovatnoću preživljavanja od 5 godina nakon dijagnoze. U nekim primerima izvođenja, opisani postupak se može koristiti da predvidi poželjan ishod za subjekta koji ima adenokarcinom, pri čemu je poželjan ishod definisan tako da ima povećanu stopu 5-godišnjeg preživljavanja. Kao što ovde obezbeđeni podaci ukazuju, subjekti za koje je određeno da imaju adenokarcinom stadijuma I ili stadijuma II koji ne eksprimira FRα imaju 2 puta veću verovatnoću za umiranje u okviru pet godina od subjekata kod kojih je određeno da imaju adenokarcinom stadijuma I ili stadijuma II koji eksprimira FRα. Shodno tome, ovde opisani dijagnostički postupci mogu se kombinovati sa ovim saznanjima da bi se omogućio postupak za predviđanje verovatnoće 5-godišnjeg preživljavanja za subjekte za koje je određeno da imaju kancer. U nekim primerima izvođenja postupak je korišćen za predviđanje verovatnoće 5-godišnjeg preživljavanja subjekata za koje je određeno da imaju adenokarcinom.
[0111] U nekim primerima izvođenja opisani prognostički postupak će uključivati: dovođenje u kontakt biološkog uzorka subjekta sa FRα-specifičnim antitelom, ili njegovim antigenvezujućim fragmentom (kao što su oni koji se mogu izvesti iz antitela i fragmenata obezbeđenih u Tabeli 1), kvantifikaciju količine FRα prisutne u uzorku koja je vezana sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, poređenje količine FRα prisutnog u uzorku sa poznatim standardom; i određivanje da li nivoi FRα subjekta ukazuju na prisustvo FRα eksprimirajućeg kancera, čime se omogućava predviđanje da li će subjekt preživeti pet godina nakon što mu je uspostavljena dijagnoza kancera. U nekim primerima izvođenja poznato je da subjekt ima ili je određeno da ima adenokarcinom. U nekim primerima izvođenja subjekt je čovek.
Postupci za monitoring kancera
[0112] Ovde su obezbeđeni postupci za monitoring kancera epitelnog porekla kod subjekta. U nekim primerima izvođenja opisani postupci uključuju procenu da li FRα-eksprimirajući kancer napreduje, povlači se, ili ostaje stabilan određivanjem količine FRα koja je prisutna u test uzorku dobijenom od subjekta; i poređenjem uočene količine FRα sa količinom FRα u uzorku ranije dobijenom od subjekta, pri čemu razlika između količine FRα u test uzorku i ranijem uzorku obezbeđuje indikaciju da li kancer napreduje, povlači se, ili ostaje stabilan. U tom pogledu, test uzorak sa povećanom količinom FRα, u odnosu na količinu uočenu za raniji uzorak, može ukazivati na napredovanje FRα-eksprimirajućeg kancera. Nasuprot tome, test uzorak sa smanjenom količinom FRα, u odnosu na količinu uočenu za raniji uzorak, može ukazivati da se FRα-eksprimirajući kancer povlači. Shodno tome, test uzorak sa razlikom u količini FRα koja nije značajna, u odnosu na količinu uočenu za raniji uzorak, može ukazivati na stanje stabilne bolesti za FRα-eksprimirajući kancer. U nekim primerima izvođenja količina FRα u uzorku dobijenom od subjekta procenjena je dovođenjem u kontakt uzorka sa antitelom koje se vezuje za FRα, kao što su antitela opisana ovde. Uzorak procenjen u odnosu na prisustvo FRα može biti dobijen iz urina, krvi, seruma, plazme, pljuvačke, ascita, cirkulišućih ćelija, cirkulišućih ćelija tumora, ćelija koje nisu povezane sa tkivom (tj., slobodne ćelije), tkiva (npr., hirurškii isečenog tkiva tumora, biopsija, uključuje aspiraciju tankom iglom), histoloških preparata, i slično. U nekim primerima izvođenja subjekt je čovek.
[0113] U nekim primerima izvođenja postupak monitoringa FRα-eksprimirajućeg kancera će uključivati: dovođenje u kontakt uzorka od subjekta sa FRα-specifičnim antitelom, ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom (kao što su oni izvedeni iz antitela i fragmenata obezbeđenih u Tabeli 1), kvantifikaciju količine FRα prisutne u uzorku koji je vezan sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, poređenja količine FRα prisutne u uzorku sa količinom FRα određenom iz uzorka istog subjekta ranije; i određivanja da li su se nivoi FRα subjekta promenili tokom vremena. Test uzorak sa povećanom količinom FRα, u odnosu na kolilčinu uočenu za raniji uzorak, može ukazivati na napredovanje FRαeksprimirajućeg kancera. Suprotno tome, test uzorak sa smanjenom količinom FRα, u odnosu na količinu uočenu za raniji uzorak, može ukazivati na povlačenje FRα-eksprimirajućeg kancera. Shodno tome, test uzorak sa razlikom u količini FRα koja nije značajna, u odnosu na količinu uočenu za raniji uzorak, može ukazivati na stabilnu bolest za FRα-eksprimirajući kancer. U nekim primerima izvođenja, FRα nivoi uzorka mogu se uporediti sa poznatim standardom, zasebno ili dodatno FRα nivoima uočenim za ranije procenjen uzorak. U nekim primerima izvođenja poznati standard može biti FRα protein poznate koncentracije (npr., rekombinantni ili prečišćeni uzorak FRα proteina). U dodatnom primeru izvođenja, dijagnostički postupak se može pratiti sa dodatnim korakom primene kancer-specifičnog tretmana. U nekim primerima izvođenja kancer-specifični tretman može biti usmeren protiv FRα-eksprimirajućih kancera, kao što je Farletuzumab.
[0114] U nekim primerima izvođenja opisani postupci uključuju procenu da li FRαeksprimirajući kancer napreduje, povlači se, ili ostaje stabilan određivanjem količine FRα povezane sa ćelijom ili tkivom koja je prisutna u test uzorku izvedenom iz subjekta; i poređenjem uočene količine FRα sa količinom FRα u uzorku dobijenom od subjekta, na sličan način, ranije, pri čemu razlika između količine FRα u test uzorku i ranijem uzorku obezbeđuje indikaciju da li kancer napreduje, povlači se, ili ostaje stabilan. U tom pogledu, test uzorak sa povećanom količinom FRα, u odnosu na količinu uočenu za raniji uzorak, može ukazivati na napredovanje FRα-eksprimirajućeg kancera. Suprotno tome, test uzorak sa smanjenom količinom FRα, u odnosu na količinu uočenu za raniji uzorak, može ukazivati na povlačenje FRα-eksprimirajućeg kancera. Shodno tome, test uzorak sa razlikom u količini FRα koja nije značajna, u odnosu na količinu koja je uočena za raniji uzorak, može ukazivati na stabilnu bolest za FRα-eksprimirajući kancer. U nekim primerima izvođenja količina FRα u uzorku dobijenom od subjekta je procenjena dovođenjem u kontakt uzorka sa antitelom koje se vezuje za FRα, kao što su antitela opisana ovde. Uzorak procenjen u odnosu na prisustvo FRα može se dobiti iz cirkulišućih ćelija, cirkulišućih ćelija tumora, ćelija koje nisu povezane sa tkivom (tj., slobodnih ćelija), tkiva (npr., hirurški odstranjenog tkiva tumora, biopsija, uključujući aspiraciju tankom iglom), histoloških preparata, i slično.
[0115] U nekim primerima izvođenja opisani postupci uključuju procenu da li FRαeksprimirajući kancer napreduje, povlači se ili ostaje stabilan određivanjem količine FRα koja nije povezana sa ćelijom ili tkivom koja je prisutna u test uzorku dobijenom od subjekta; i poređenjem uočene količine FRα sa količinom FRα u uzorku dobijenom od subjekta, na sličan način, ranije, pri čemu razlika između količine FRα u test uzorku i ranijem uzorku obezbeđuje indikaciju da li kancer napreduje, povlači se, ili ostaje stabilan. U tom pogledu, test uzorak sa povećanom količinom FRα, u odnosu na količinu uočenu za raniji uzorak, može ukazivati na napredovanje FRα-eksprimirajućeg kancera. Suprotno tome, test uzorak sa smanjenom količinom FRα, u odnosu na količinu uočenu za raniji uzorak, može ukazivati na povlačenje FRα-eksprimirajućeg kancera. Shodo tome, test uzorak sa razlikom u količini FRα koja nije značajna u odnosu na količinu uočenu za raniji uzorak, može ukazivati na stanje stabilne bolesti za FRα-eksprimirajući kancer. U nekim primerima izvođenja količina FRα u uzorku dobijenom od subjekta je procenjena dovođenjem u kontakt uzorka sa antitelom koje se vezuje za FRα, kao što su antitela opisana ovde. Uzorak procenjen u odnosu na FRα može biti urin, krv, serum, plazma, pljuvačka, ascit, histološki preparati, i slično.
[0116] U različitim primerima izvođenja opisanih postupaka, kancer može biti FRαeksprimirajući kancer. U naročitom primeru izvođenja, FRα-eksprimirajući kancer ja kancer jajnika. U nekim primerima izvođenja FRα-eksprimirajući kancer je endometrijalni kancer. U nekim primerima izvođenja FRα-eksprimirajući kancer je kolorektalni kancer. U nekim primerima izvođenja FRα-eksprimirajući kancer je kancer dojke. U nekim primerima izvođenja FRα-eksprimirajući kancer je tiroidni kancer. U nekim primerima izvođenja FRαeksprimirajući kancer je kancer jajovoda. U sledećem primeru izvođenja, FRα-eksprimirajući kancer je nesitnoćelijski kancer pluća, kao što je adenokarcinom.
[0117] U različitim aspektima, količina FRα određuje se dovođenjem u kontakt uzorka sa antitelom, ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, koji se vezuje za FRα. U nekim primerima izvođenja, uzorak može biti kontaktiran sa više od jednog tipa antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, koji se vezuje za FRα. U nekim primerima izvođenja, uzorak se može dovesti u kontakt sa prvim antitelom, ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, koji se vezuje za FRα kao što je definisano u patentnim zahtevima 1 do 3 i zatim doveden u kontakt sa drugim antitelom, ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, koji se vezuje za FRα. Drugo antitelo može se izabrati između:
(a) antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, koji se vezuje za isti epitop kao bilo koje od antitela 9F3, antitela 19D4, antitela 24F12, ili antitela 26B3;
(b) bilo kog od antitela 9F3, antitela 19D4, antitela 24F12, ili antitela 26B3, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta;
(c) antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, koji sadrži aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 teškog lanca i aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 lakog lanca bilo kog od antitela 9F3, antitela 19D4, antitela 24F12, ili antitela 26B3, kao što je opisano u Tabeli 1;
(d) antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, koji sadrže segment varijabilnog domena teškog lanca i segment varijabilnog domena lakog lanca bilo kog od antitela 9F3, antitela 19D4, antitela 24F12, ili antitela 26B3, kao što je opisano u Tabeli 1; ili
(e) antitela koje ima aminokiselinsku sekvencu antitela proizvedenog od srane bilo koje od ćelijskih linija deponovanih kod ATCC sa pristupnim brojem PTA-11887, PTA-11884, PTA-11886, ili PTA-11885, ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta.
Različite kombinacije antitela i antigen-vezujućih fragmenata opisanih u (a)-(e), kao što je prethodno dato detaljno u opštem odeljku koji opisuje postupke detekcije, mogu se koristiti da bi se obezbedilo "prvo" i "drugo" antitelo ili antigen vezujući fragment da bi se izveli opisani postupci monitoringa.
[0118] U određenim primerima izvođenja, količina FRα je određena western blot analizom, radioimuno analizom, imunofluorimetrijom, imunoprecipitacijom, ravnotežnom dijalizom, imunodifuzijom, elektrohemiluminescentnom (ECL) imunoanalizom, imunohistohemijom, fluorescencijom-aktiviranim sortiranjem ćelija (FACS) ili ELISA testom.
[0119] Dodatni aspekti rezimiranog predmetnog pronalaska detaljnije su obezbeđeni u detaljnom opisu i obezbeđenim primerima i povezanim slikama.
Kompleti za detekciju FRα
[0120] Ovde su obezbeđeni kompleti za detekciju FRα u uzorku kao što je definisano u patentnom zahtevu 29.
[0121] Obezbeđeno antitelo, ili antigen-vezujući fragment, može biti u rastvoru; liofilizovano; pričvršćeno za susptrat, nosač, ili ploču; ili konjugovano sa detektabilnim obeleživačem.
[0122] Opisani kompleti mogu takođe uključivati dodatne komponente korisne za izvođenje postupaka opisanih ovde. Putem primera, kompleti mogu sadržati sredstva za dobijanje uzorka od subjekta, kontrolnog uzorka, npr., uzorka od subjekta koji ima sporo napredujući kancer i/ili subjekta koji nema kancer, jedan ili više odeljaka za uzorak, i/ili instrukcije koje opisuju izvođenje postupka prema pronalasku i tkivno specifične kontrole/standarde.
[0123] Sredstva za određivanje nivoa FRα mogu dodatno uključivati, na primer, pufere ili druge reagense za upotrebu u testu za određivanje nivoa FRα. Instrukcije mogu biti, na primer, štampane instrukcije za izvođenje testa i/ili instrukcije za procenjivanje nivoa ekspresije FRα.
[0124] Opisani kompleti mogu takođe uključivati sredstva za izolovanje uzorka iz subjekta. Ova sredstva mogu uključivati jedan ili više stavki opreme ili reagenasa koji se mogu koristiti da bi se dobila tečnost ili tkivo od subjekta. Sredstva za dobijanje uzorka od subjekta mogu takođe sadržati sredstva za izolovanje komponenti krvi, kao što je serum, iz uzorka krvi. Poželjno, komplet je dizajniran za upotrebu sa subjektom koji je čovek.
[0125] Opisani kompleti mogu takođe uključiti blokirajući reagens koji se može primeniti na uzorak da bi se smanjilo nespecifično vezivanje primarnog ili sekundarnog antitela. Primer blokirajućeg reagensa je goveđi serum albumin (BSA), koji se može razblažiti u puferu pre upotrebe. Drugi komercijalni reagensi za blokiranje, kao što je Block Ace i ELISA Synblock (AbD serotec), Background Punisher (BIOCARE MEDICAL), i StartingBlock (Thermo Fisher Scientific) poznati su u tehnici. Opisani kompleti mogu takođe uključivati negativnu kontrolu primarnog antitela koje se ne vezuje za FRα dovoljno da bi dalo pozitivni rezultat u antitelo-zasnovanom testu za detekciju. Dodatno, opisani kompleti mogu uključiti sekundarno antitelo sposobno da se vezuje za FRα primarno antitelo, kao što je antitelo 9F3, antitelo 19D4, antitelo 24F12, ili antitelo 26B3. U nekim primerima izvođenja sekundarno antitelo može biti konjugovano sa detektabilnim obeleživačem, kao što je peroksidaza rena (HRP) ili fluorofor, da bi se omogućila detekcija primarnog antitea vezanog za uzorak. Opisani kompleti mogu takođe uključiti kolorimetrijski ili hemiluminescentni supstrat koji omogućava da se detektuje prisustvo vezanog sekundarnog antitela u uzorku. U nekim primerima izvođenja kolorimetrijski ili hemiluminescentni supstrat može biti 2,2’-azinobis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kiselina) (ABTS); 3,3’,5,5’-Tetrametilbenzidin (TMB); 3,3’-Diaminobenzidin (DAB); SuperSignal (Thermo Fisher Scientific); ECL reagent (Thermo Fisher Scientific) ili drugi takvi reagensi poznati stručnjacima.
[0126] Sledeći primeri su obezbeđeni kao dodatak prethodnom opisu i da obezbede bolje razumevanje ovde opisanog. Ovi primere ne treba smatrati kao ograničavajuće za opisani predmetni pronalazak.
[0127] Predmetni pronalazak je definisan patentnim zahtevima. Bilo koji primeri koji spadaju izvan obima patentnih zahteva obezbeđeni su samo kao referenca i ne čine deo pronalaska.
PRIMER 1 – Ekspresija i prečišćavanje rekombinantnog, humanog FRα
[0128] Da bi se izveli eksperimenti povezani sa ovde opisanim studijama, nekoliko alfa receptor folata (FRα)-eskpresionih ćelijskih sistema ili linija stvoreno je da bi se generisali FRα-eksprimirajući ćelijski supstrati ili da bi se generisao prečišćeni rekombinantni humani FRα protein. Jedan ekspresioni sistem koji je korišćen bila je Sf9 linija ćelija insekta koja eksprimira rekombinantni humani FRα preko bakulovirusa. Ovaj sistem je pripremljen korišćenjem humane FRα sekvence, koja sadrži lider sekvencu optimizovanu za ekspresiju u ćeliji insekta, N-terminalni 6x histidin (6xhis) epitop tag, i intaktno mesto vezivanja nativnog GPI. Ćelije su zatim inkubirane u 1L boci za šejkiranje i kulture Sf9 insekatskih ćelija u logfazi su inficirane sa rekombinantnim bakulovirusom na multiplicitetu infekcije (MOI) od <1. Ćelije iz 30L kulture su sakupljene, lizirane i ekstrahovane 2x sa 1X fosfatno-puferovanim iziološkim rastvorom (PBS) koji sadrži 10 mM 3-[(3-holamidopropil)dimetilamonio]-1-propansulfonat (CHAPS). Koncentracija NaCl je podešena na 300 mM i filtrirana kroz 0.2 um membranu. Izbistreni supernatant je prečišćen hromatografijom prema afinitetu, korišćenjem 1X PBS sa 2M NaCl, 1 mM CHAPS, pH 7.4 kao pufera za ispiranje, nakon čega je eluirano sa 10 mM 3-(N-morfolino)propansulfonskom kiselinom (MOPS), 3M MgCl2, 1 mM CHAPS, pH 6.8. Vršne frakcije su ekstenzivno dijalizirane nasuprot 1X PBS, pH 7.4, analizirane u odnosu na čistoću sa SDS-PAGE, kvantifikovane analizom sa bicinhoninskom kiselinom (BCA), alikvotirane i uskladištene na -80 stepeni Celzijusa.
[0129] Ćelijska linija jajnika kineskog hrčka (CHO) koja stabilno eksprimira i izlučuje humani FRα proizvedena je korišćenjem sekvence humanog alfa receptora folata (FRα), koja sadrži humanu kapa lider sekvencu imunoglobulina i C-terminalni 6xhis epitop tag koji zamenjuje GPI mesto vezivanja. Po proizvodnji, FRα-eksprimirajuće CHO ćelije su uzgajane u 25L-razmeri u kesama za ćelijsku kulturu. Da bi se prečistio izlučeni FRα protein, ćelijski supernatant je očišćen od ćelijskog taloga dubokom filtracijom i zatim 10-puta koncentrovan tangencijalnom protočnom filtracijom i dijafiltriran u 50 mM natrijum fosfat, 300 mM NaCl, 1 mM imidazol, pH 8.0. Ovo je napunjeno u prethodno spakovanu Talon® IMAC kolonu korišćenjem FPLC. Nevezani materijal je ispran korišćenjem 50 mM natrijum fosfata, 300 mM NaCl, 5 mM imidazola, pH 8.0 i vezani protein je eluiran korišćenjem linearnog gradijenta od 5 mM -100 mM imidazola u 50 mM natrijum fosfata, 300 mM NaCl, pH 8.0. Vršne frakcije su ekstenzivno dijalizirane nasuprot 1X PBS, pH 7.4, analizirane za čistoću sa SDS-PAGE, kvantifikovane sa BCA testom, alikvotirane i uskladištene na -80 stepeni Celzijusa.
[0130] Sličan ćelijski sistem je takođe proizveden za humani beta receptor folata (FRβ), humani gama receptor folata (FRγ), i humani delta receptor folata (FRδ). Ukratko, konstrukti FRβ, FRγ, ili FRδ koji sadrže kapa lider sekvencu humanog imunoglobulina i C-terminalni 6xhis epitop tag koji zamenjuje GPI mesto vezivanja, korišćeni su da se prolazno transfektuje 1L kultura 293F ćelija. Rekombinantni FR proteini su prečišćeni kao što je prethodno opisano za humani FRα.
[0131] Ćelijska linija jajnika kineskog hrčka (CHO) koja stabilno eksprimira i izlučuje humanu sekvencu mezotelina, koja sadrži humanu kapa lider sekvencu imunoglobulina i C-terminalni 6xhis epitop tag koji zamenjuje GPI mesto vezivanja, takođe je pripremljena, jer je mezotelin služio kao negativna kontrola za mnoge studije. CHO ćelije koje eksprimiraju humani mezotelin uzgajane su u 25L-razmeri u kesama za ćelijsku kulturu. Da bi se prečistio izlučeni mezotelin protein, ćelijski supernatant je očišćen od ćelijskog taloga filtracijom kroz membranu tipa šupljeg vlakna i prečišćeni supernatant je 10-puta koncentrovan tangencijalnom protočnom filtracijom. NaCl koncentracija supernatanta je podešena do 300 mM NaCl i 0.5 mM imidazola. Ovo je napunjeno u prethodno spakovanu Talon® IMAC kolonu korišćenjem FPLC. Nevezani materijal je ispran korišćenjem 50 mM natrijum fosfata, 300 mM NaCl, 3 mM imidazola, pH 8.0 i vezani protein je eluiran sa 50 mM natrijum fosfata, 300 mM NaCl, 150 mM imidazola, pH 8.0. Vršne frakcije su ekstenzivno dijalizirane nasuprot 50 mM kalijum fosfata, pH 7.5. Dodat je amonijum sulfat do finalne koncentracije od 1M, i finalno prečišćavanje je zatim urađeno na prethodno spakovanoj fenil sefaroza koloni korišćenjem postepenog gradijenta od 1M - 0M amonijum sulfata u 50 mM kalijum fosfatu, pH 7.5. Vršne frakcije su ekstenzivno dijalizirane nasuprot 1X PBS, pH 7.4, analizirane u odnosu na čistoću sa SDS-PAGE, kvantifikovane sa BCA testom, alikvotirane i uskladištene na -80 stepeni Celzijusa.
PRIMER 2 – Proizvodnja prečišćenog redukovanog i alkilovanog FRα
[0132] Uložen je trud da se proizvede redukovani i alkilovani antigeni oblik FRα. Da bi se redukovao protein, prečišćeni FRα je koncentrovan do 2 mg/mL u fosfatno puferovanom fiziološkom rastvoru (pH 7.4) korišćenjem centrifugalnih filtera (Amicon Ultra, 3 kD MW limit). Koncentracija proteina je određena BCA testom (Thermo Scientific). Rezultujući FRα je razblažen 1:1 u 8M urea/ PBS da bi se stvorila finalna koncentracija od 1 mg/mL FRα u PBS koji sadrži 4M urea. Rastvor ditiotreitola (500 mM u PBS) dodat je do finalne koncentracije od 10 mM. Rastvor je inkubiran na 65 stepeni Celzijusa jedan čas, i ohlađen do sobne temperature.
[0133] Zatim je 1M rastvor jodoacetamida u fosfatno puferovanom fiziološkom rastvoru dodat u rastvor redukovanog receptora folata do finalne koncentracije od 10 mM, i reakcija je držana u mraku na sobnoj temperaturi 30 minuta. Protein je ostao rastvorljiv pod ovim uslovima. Finalni redukovani FRα za korišćenje u imunizaciji je uskladišten u fosfatno puferovanom fiziološkom rastvoru koji sadrži 4M uree, 10mM DTT, i 10 mM jodoacetamida.
[0134] Slika 1 prikazuje diferencijalnu migraciju nativnog FRα proteina i redukovanog i alkilovanog oblika proteina analiziranih sa SDS-PAGE pod neredukujućim uslovima.
PRIMER 3 – Proizvodnja hibridoma korišćenjem FRα
[0135] Osam nedelja stare ženke Balb/c miševa su imunizovane sa heksa-histidin tagovanim FRα proteinom (n=5) ili redukovanim i alkilovanim FRα proteinom (n=5). Inicijalne intraperitonealne imunizacije primenjene na dan 0 sadržale su 50 µg respektivnog imunogena pomešanog 1:1 (zapr.:zapr.) sa kompletnim Freund-ovim ađuvansom (Rockland, Cat# D614-0050). Miševi su zatim bustovani sa 50 µg imunogena pomešanog 1:1 (zapr.:zapr.) sa nekompletnim Freund-ovim ađuvansom (Rockland, Cat# D615-0050) primenjenim intraperitonealno 14 dana kasnije i svaki 21 dan nakon toga. Uzorci krvi su sakupljeni od imunizovanih miševa 24 dana nakon inicijalne imunizacije i svakih 21 dan nakon toga.
[0136] Sakupljeni uzorci krvi su analizirani direktnim enzimski-povezanim imunotestom (EIA) protiv FRα. Ploče su obložene sa FRα proteinom (100 ml 1mg/mL rastvora u PBS, 0.02 M kalijum fosfata, 0.15 M natrijum hlorid, pH 7.2) i inkubirane preko noći na 4°C, isprane sa PBS koji sadrži 0.2% Tween®-20 (PBST; Rockland, Cat# MB- 075-1000) i blokirane sa 3% ribljim gelom (Sigma) 1 čas na sobnoj temperaturi. Dozvoljeno je da se serijska trostruka razblaženja uzoraka seruma pojedinačnih miševa vezuju 1 čas na sobnoj temperaturi, ploče su zatim isprane 3 puta sa PBST i nakon toga testirane sa HRP-konjugovanim zečjim-antimišjim antitelom (Rockland, Cat#610-4320) na 1:2500 30 minuta na 37°C. Dodat je TMB supstrat (Rockland, Cat# TMBE-100) i rekacija je zaustavljena nakon 30 minuta dodavanjem 100 mL 1M HCl pre očitavanja apsorbance na 450 nm (Microplate Reader "Benchmark"; Biorad). Izvršen je kontra-skrininig svih uzoraka nasuprot heksa-histidin tagovanih rekombinantnog mezotelin (mezotelin-His6) proteina kao negativne kontrole.
[0137] Slezine miševa koji su pokazivali najviše antigen-specifičen titre su sakupljene i hibridomi su pripremljeni elektrofuzijom (Hybrimune™ Model CEEF-50B Waveform Generator; Cellectis, Romainville, France) splenocita sa Sp2/0 Ag14 mijeloma ćelijama (ATTC CRL1581). Nakon toga, izvršen je skrining supernatanata hibridoma sa ELISA nasuprot FRα i rekombinatnog mezotelin-His6 kao što je prethodno opisano da bi se selektovale pozitivne roditeljske fuzione ćelijske linije.
[0138] Izabrane roditeljske ćelijske linije za koje je određeno da proizvode antitela reaktivna na rekombinantni humani FRα (rhFRα) su zatim subklonirane sa ograničenim razblaženjem. Antitela proizvedena od strane ovih ćelija su zatim ponovo testirane u odnosu na FRα vezivanje i izotipizovane korišćenjem Clonetyping™ System (SouthernBiotech, Birmingham, AL). Izvršen je dalji skrining ovih klonova sa direktnim ELISA nasuprot tri dodatne izooblika humanog receptora folata (FRβ, FRγ i FRδ) da bi se opdredila specifičnost receptora. Ploče su obložene preko noći sa 100 µL 1 µg/mL rastvora respektivne FRα izoforme na 4°C, isprane sa PBS koji sadrži 0.2% Tween®-20 (Rockland, Cat# MB-075-1000) i blokirane sa 3% ribljeg gela (Sigma). Dozvoljeno je da se serije trostrukog razblaženja kulture supernatanata vezuju 1 čas na sobnoj temperaturi, pre nego što su isprane i testirane sa HRP-konjugovanom antimišjim antitelom kao što je prethodno opisano. Klonovi koji proizvode antitela reaktivna na FRβ, FRγ i FRδ nisu selektovani za dalju analizu.
[0139] Četiri selektovana klona hibridoma, 19D4.B7, 26B3.F2, 24F12.B1, i 9F3.H9.H3.H3.B5.G2, deponovani su kod American Type Culture Collection 19. maja 2011. i dodeljeni su im ATCC pristupni brojevi PTA-11884, PTA-11885, PTA-11886, i PTA-11887, respektivno.
PRIMER 4 – Proizvodnja prečišćenih monoklonskih antitela na FRα
[0140] Izabrane ćelijske linije su testirane na mikoplazmu korišćenjem test kompleta za mikoplazmu (Rockland, Cat# MAB-012) pre zasejavanja u 1L roler boce koje sadrže medijum bez seruma (Invitrogen, Cat#12045-076) i 5% niski IgG FBS (0.1µg/ml) (Gibco, Cat# 16250-078) na 0.5x10<5>ćelija/mL. Dozvoljeno je da kulture rastu na 37°C ili 14 ili 21 dan, nakon čega je sakupljen supernatant i koncentrovan oko 10-puta preko 50kDa filtracione membrane (Spectrum Labs, Rancho Dominguez CA) i zatim prečišćen korišćenjem protein A hromatografije (Rockland, Cat# PA50-00-0025). Vezano antitelo je eluirano sa 0.1M natrijum citratom, pH 3.5/4.5 u zavisnosti od izotipa antitela, i pufer je izmenjen nasuprot PBS dijalizom korišćenjem 12-14kDa membranoznog sistema cevi (Spectrum Labs, Rancho Dominguez CA). Prečišćeno antitelo bilo je sterilno filtrirano korišćenjem 0.22 µm Express™PLUS Stericups (Millipore, Billerica MA) i uskladišteno na 4°C za dalje testiranje.
[0141] Uložen je trud da se sekvencioniraju teški i laki lanci četiri izabrana klona hibridoma (9F3-H9, 19D4-B7, 24F12-B1, i 26B3-F2). Prvo, ukupna RNK je izolovana iz svake ćelijske linije hibridoma (ćelijski pelet od 1 x 10<3>do 1 x 10<5>ćelija svaki) korišćenjem RNKqueous® kompleta (Ambion) prema protokolu proizvođača. RNK je kvantifikovana korišćenjem NanoDrop™ 8000 spektrofotometra (Thermo Scientific).
[0142] Izolovana RNK je zatim amplifikovana preko multipleks RT-PCR, izvedenoj u triplikatu za svaki hibridom sa Mastercycler® EP Gradient Thermocycler (Eppendorf). Prvo, izvedene su dve zasebne gen-specifične cDNK amplifikacije za svaki hibridom (≤1ug RNK/reakciji) da bi se odredilo koji geni Ig teškog i lakog lanca su korišćeni tokom Ig rearanžmana. Svaki koktel se sastojao od jedinstvenih prajmera specifičnih za familiju dizajniranih za aniling sa bilo kojom od potencijalnih familija gena mišjih Ig V (IgHv, IgKv) i gena Ig konstantnog regiona (IgHcGamma, IgKc). cDNK stvaranje i amplifikacija je izvedena korišćenjem SuperScript® III One-Step RT-PCR System sa Platinum® Taq High Fidelity (Invitrogen) pod sledećim uslovima: 55°C 30 minuta i 95°C 2 minuta, nakon čega 40 ciklusa od 95°C 1 minut, 55°C 1 minut, 68°C 1 minut, i finalnih 68°C 10 minuta završnog koraka. DNK proizvodi su podvrgnuti elektroforezi na 2% agaroznom gelu. Odgovarajuće trake su isečene i gel je prečišćen korišćenjem QIAquick® Gel Extraction kompleta (Qiagen) praćenjem protokola proizvođača. Prečišćena DNK je predata na sekvenciranje (GENEWIZ, Inc., South Plainfield, NJ) da bi se odredili segmenti klicine linije eksprimirani od strane svakog hibridoma.
[0143] Dodatna RT-PCR analiza pogodna za naročite gene identifikovane za svaki hibridom je zatim izvedena korišćenjem istog RNK izvora kao prethodno i gen-specifičnim prajmerima (za razliku od prajmera specifičnih za familiju korišćenih u multipleks RT-PCR smeši). Da bi se olakšalo kloniranje, amplifikovane Ig cDNKs su stavljene u In-Fusion (IF) ekspresioni vektor, svaki gen-specifični prajmer takođe je sadržao vektor-kompatibilne linker sekvence koje će omogućiti homologi krosing over. Svi drugi reagensi i uslovi termociklusa su isti kao oni korišćeni za multipleks RT-PCR eksperimente, opisane prethodno.
PRIMER 5: Karakterizacija vezivanja antitela za FRα
[0144] Vezujuće karakteristike prečišćenih monoklonskih antitela za FRα su određene eksperimentima sa površinskom plazmon rezonancom (SPR). Svi SPR eksperimenti su izvedeni na 25°C korišćenjem BIAcore T100 sa CM5 čipovima istraživačkog gradusa (GE Healthcare), po specifikaciji proizvođača. Inicijalno, anti-mišje IgG obezbeđeno u kompletu za zarobljavanje mišjeg antitela (GE Healthcare) imobilisano je amidnim kulovanjem sa CM5 senzornim čipovima. Mišja anti-FRα monoklonska antitela (26B3, 24F12, 19D4, ili 9F3) su zarobljena na pojedinačnim protočnim ćelijama po ciklusu vezivanja, dok je četvrta protočna ćelija korišćena kao referentna. Eksperimenti sa vezivanjem su izvedeni sa HBS-P (GE Healthcare) kao tekućim puferom i na stopi protoka od 30µL/min. Svaki uzorak monoklonskog antitelo (0.5µg/mL) injektiran je 3 minuta da bi se zarobilo antitelo. Različite koncentracije prečišćenog rekombinantnog humanog FRα (rh-FRα) (1nM - 30nM) su zatim injektirane preko FRα-specifičnih i referentnih površina 3 minuta da bi se zabeležili senzogrami vezivanja korišćenjem postupka kinetike pojedinačnog ciklusa. Profil disocijacije je praćen 25 minutes. Između vezivanja, površina je regenerisana sa 30µl injekcijom 10mM glicina (pH 1.7). Sonzogrami su obrađeni i fitovani na 1:1 Langmuir model vezivanja korišćenjem BIAcore T100 softvera za procenu (verzija 2.0.1). Nake od karakteristika vezivanja antitela 26B3, 24F12, 19D4, i 9F3 su obezbeđene u Tabeli 2.
Tabela 2: Karakteristike vezivanja FRα-specifičnih antitela.
PRIMER 6: Mapiranje epitopa izabranih FRα-specifičnih antitela
[0145] FRα-specifična antitela 26B3, 24F12, i 9F3 su dodatno procenjena u studijama vezivanja epitopa korišćenjem Octet QK. Rezultati su pokazali da su 26B3 i 24F12, koji imaju visoke afinitete za prečišćeni humani FRα, u kompeticiji za vezivanje sa FRα. Stoga, ova antitela mogu deliti zajednički epitop, ili imati epitope koji su neposredno jedan pored drugog. Rezultati takođe ukazuju da 9F3 antitelo ima jedinstven epitop, jer nije bilo u kompeticiji sa drugim FRα-specifičnim antitelima za vezivanje sa FRα.
[0146] Dodatne studije mapiranja epitopa izvedene su sa ExSAR™ korišćenjem vodonik/deuterijum izmenjivačkom masenom spektrometrijom i postupcima dokinga. Rezultati ovih studija za antitela 9F3, 24F12, i 26B3 su ilustrovani na Slici 2. U odnosu na epitop za antitelo 26B3, ovi podaci sugerišu daje ono dostupno u nativnoj strukturi usidrenoj na membrani, uzimajući u obzir sposobnost 26B3 da prepozna nativni FRα preko protočne citometrije. Dodatno, ovi podaci dalje sugerišu da su konformaciona ograničenja epitopa prepoznatog od strane MAb 26B3, kao što je pokazano njegovom nemogućnošću da detektuje protein na redukovanim western blotovima, povezane sa cisteinom na položaju 185 u FRα proteinu koji formira disulfidni most sa cisteinom 111.
PRIMER 7: Prepoznavanje denaturisanih i hemijski očuvanih oblika FRα
[0147] Izvedeni su eksperimenti da bi se odredilo da li bilo koje od FRα-specifičnih antitela, prethodno opisanih, može prepoznati denaturisane oblike FRα. Za ove analize CHOK1 ćelije sa stabilnom ekspresijom GPI-povezanog humanog FRα, β, ili Δ, lizirane su u 1.1% OBG pufera (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.1% OBG) sa dodatkom Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) i PMSF (100 nM), i postavljene na led 15 minuta. Lizati su prethodno izbistreni centrfiugiranjem na 13,000 rpm 15 da bi se uklonio ćelijski talog. Za redukovane i denaturisane uzorke, jednake količine proteina (20 µg) ključale su 10 minuta u NuPAGE® LDS puferu za uzorke (Invitrogen) koji sadrži 5% β-merkaptoetanol 40 mM DTT. Proteini su razdvojeni korišćenjem elektroforezom na SDS-poliakrilamidnom gelu (SDS-PAGE) na 4-12% bis-tris gelu (Invitrogen) i preneti na PVDF membranu. Membrana je blokirana u PBST+ 5% obranom mleku 1 čas na sobnoj temperaturi nakon čega je membrana dva puta isprana sa PBST. Imunobloting je izveden korišćenjem mišjih monoklonskih antitela 9F3, 19D4, 24F12, ili 26B3 (1µg/mL) specifičnih za FRα, koja su detektovana sa kozjim-anti-mišjim HRP-konjugovanim antitelom i vizuelizovani korišćenjem SuperSignal West Pico hemiluminescentnog supstrata (Pierce, Rockford, IL). Liminescencija je vizuelizovana korišćenjem Omega 12iC molekularnog sistema za vizuelizaciju (Ultra-Lum, Claremont, CA) pri čemu je analiza slika izvedena korišćenjem UltraQuant™ 6.0 softvera (Ultra-Lum).
[0148] Western blot analize su takođe izvedene korišćenjem prečišćenih preparata receptora folata. Za ove eksperimente, 0.5µg prečišćenog humanog FRα, β, Γ ili Δ, proizvedenog kao što je opisano u Primeru 1, inkubirano je u 1X SDS-PAGE puferu za punjenje uzorka (Invitrogen) sa ili bez 20 mM DTT, ključalo 10min, i izvršena je elektroforeza sa 4-12% gradijentom SDSPAGE gelova. Protein je prenet na PVDF membranu i blotovi su testirani kao što je prethodno opisano. Gelovi su pušteni korišćenjem Benchmark™ prethodno obojenih proteinskih merdevina (Novex®). Gelovi koji su koristili prečišćene rekombinantne FR proteine su takođe vizuelizovani preko bojenja srebrom da bi se osiguralo du su jednake količine proteina napunjene.
[0149] Western blot analize ukazuju da antitela 19D4, 9F3, 24F12, i 26B3 prepoznaju neredukovani FRα, međutim, vezivanje za redukovane i denaturisane uzorke nije detektovano ni za jedno od ovih antitela (Slika 3(A) i (B)).
[0150] Imunohistohemijske (IHC) studije su takođe izvedene da bi se odredilo da li se bilo koja od ovih antitela mogu vezati za uzorke tkiva kancera jajnika fiksirana u formalinu i ukalupljena u parafinu. Indirektno IHC testiranje je izvedeno za FRα korišćenjem MACH4™ Universal HRP-Polymer Detection Kit (Biocare Medical). Primerci fiksirani u formalinu i ukalupljeni u parafinu isečeni su na 5 mikrona na pozitivno naelektrisanim staklenim pločicama i zagrevani oko 60 minuta na 60 °C. Pločice su deparafinizovane u 3 sekvencijalna kupatila ksilena 3 minuta u svakom, preneta u tri sekvencijalna kupatila 100% alkohola 3 minuta u svakom, i nakon toga u tri sekvencijalna kupatila od 95% alkohola 3 minuta u svakom i zatim isprana 5 minuta u dejonizovanoj (DI) vodi. Pripremljeni uzorci su zatim pretretirani sa Diva rastvorom za izdvajanje epitopa indukovano toplotom (Biocare Medical) razblaženi do 1:10 u DI vodi i stavljeni unutar Decloaking Chamber pod pritiskom koja je već bila napunjena sa 500 ml DI vode. Uzorci su inkubirani 15 minuta unutar „decloaking chamber“, pri čemu je inkubacija pod pritiskom dostigla maksimum od 125 °C na 16 PSI za 30 sekundi i zatim je ohlađena 15 minuta do 95 °C. Pločice su zatim ohlađene do sobne temperature 15 minuta. Nakon hlađenja, pločice su isprane u 3 sekvencijalna kupatila Tris puferovanog fiziološkog rastvora /0.1% Tween-20® pufer za ispiranje (TBST) 3 minuta u svakom. Sva sledeća ispiranja puferom su takođe izvedena na ovaj način. Pločice su zatim blokirane u Peroxidase-1 (Biocare Medical) blokirajućem rastvoru 5 minuta na sobnoj temperaturi, isprane sa TBST, i zatim je primenjen Background Sniper (Biocare Medical) univerzalni blokirajući reagens bez seruma 10 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon što su uzorci blokirani pločice su inkubirane sa 2.5 µg/ml 26B3 antitela razblaženog u Antibody Diluent (Dako) ili Universal Negative Control - Mouse ready-to-use negative control antibody (Dako, za tkivo sa negativnim izotipom) 60 minuta na sobnoj temperaturi. Pločice su zatim isprane sa TBST i inkubirane sa MACH4™ Mouse Probe Primary Antitelo Enhancer (obezbeđen iz Biocare Medical MACH4™ kompleta) 15 minuta na sobnoj temperaturi. Pločice su zatim ponovo isprane sa TBST i inkubirane sa Polymer-HRP reagensom (obezbeđen iz Biocare Medical MACH4 kompleta) 20 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon inkubacije, pločice su isprane sa TBST i inkubirane sa rastvorom 3,3’-diaminobenzidin tetrahidrohlorida (DAB) (Dako) 5 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim su pločice detaljno isprane sa DI vodom 3 puta po 30-60 sekundi svaka i kontrasno obojene sa hematoksilinom (Dako) 2 minutes, isprane sa TBST, dehidrirane u 3 sekvencijalna kupatila svako od 95% i 100% alkohola po 30 sekundi svaka, i očišćene u 3 sekvencijalna kupatila ksilena 30 sekundi svaka. Konačno, pre analize na pločice su stavljena pokrovna stakla.
[0151] Uobičajeno je mišljenje da antitelo mora biti sposobno da prepozna linearni epitop antigena od interesa da bi bilo efikasno za imunohistohemiju tkiva fiksiranih u formalinu i ukalupljenih u parafinu jer je antigen lišen tercijarne strukture usled destruktivne priode fiksacije tkiva. Stoga je bilo iznenađujuće da je antitelo 26B3 bilo sposobno da prepozna FRα u ovoj analizi (Sl. 4), jer ne prepoznaje redukovani i denaturisani FRα sa western blotom. Dodatno, obrazac FRα bojenja sa antitelom 26B3 uočen za normalna tkiva bio je konzistentan sa prethodno objavljenom literaturom korišćenjem različitih drugih antitela i tehnika, sa pankreasom, tiroideom, plućima, pljuvačnom žlezdom, bubregom, hipofizom, grlićem materice i dojkom koji su pokazivali ekspresiju do različitog stepena (Tabela 3). Kao što je prikazano na Slici 5, obrazac bojenja u normalnim tkivima, dato primerom kod preseka normalnih pluća (A) i normalnog bubrega (B), izrazito je ograničen na epitelne ćelije i tipično je po prirodi apikalan.
Tabela 3. Ekspresija FRα u normalnim humanim tkivima
PRIMER 8: Prepoznavanje nativnih oblika FRα
[0152] Izvedene su studije protočne citometrije da bi se procenila sposobnost izabranih FRαspecifičnih antitela da se vezuju za nativni protein. Za ove studije ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) koje eksprimiraju FRα, su sakupljene, isprane, i reuspendovane u ledeno hladnom medijumu za uzgajanje (RPMI sa dodatkom 10% FBS). Ćelije su inkubirane 1 čas na ledu sa 9F3, 19D4, 24F12, ili 26B3 (1mg/mL), isprane i zatim inkubirane sa FITC-konjugovanim sekundarnim antitelima [razblaženje 1:100] (Southern Biotech, Birmingham, AL). Pre analize, ćelije su obeležene sa 7-amino-aktinomicinom D (7-AAD) (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) za isključivanje nevijabilnih ćelija. CHO ćelije koje ne eksprimiraju FRα su takođe podrgnute istim eksperimentalnim procedurama, kao negativna kontrola. Ćelije su analizirane na EasyCyte™ Flow Cytometer (Guava® Technologies, Hayward, CA). Podaci obezbeđeni u Tabeli 4 ukazuju da su sva četiri antitela sposobna da vezuju nativni FRα.
Tabela 4: FRα-specifična antitela prepoznaju FRα eksprimiran na površini ćelije
PRIMER 9: Detekcija FRα u serumu subjekata za koje je poznato da imaju kancer jajnika
[0153] Izvedene su studije elektrohemiluminescencije da bi se odredilo da li FRα-specifična antitela opisana ovde mogu detektovati FRα u serumu pacijenata za koje je poznato da imaju kancer jajnika. Za ove eksperimente MAb 26B3 je korišćeno kao MAb za hvatanje i dodato je ECL pločama u koncentraciji od 75µg/mL. Ploče su isprane i dodato je 50 µL seruma uzorka svakom bunarčiću i inkubirano 2 časa. Uzorci seruma su dobijeni od normalnih zdravih ženskih osoba (negativna kontrola) i od pacijenata sa kancerom jajnika. Uzorci su razblaženi 1:4 u PBST (fosfatno puferovani fiziološki rastvor, pH7.4, koji sadrži 0.01% Tween®20). Nakon inkubacije, uzorci su isprani sa PBST i 25 µL/bunarčiću MAb 19D4 (1µg/mL), obeleženog sa Ru na stopi od otprilike 13 obeleživača/IgG molekulu, dodato je svakom bunarčiću da bi se detektovao vezani uzorak. Nakon perioda od 2-časa inkubacije, ploče su isprane sa PBST i očtane sa 2X MSD Buffer T. Rezultati u Tabeli 5 pokazuju da se FRα u serumu može zarobiti i detektovati korišćenjem monoklonskih antitela 26B3 i 19D4.
Tabela 5: Relativni nivoi FRα u serumu
PRIMER 10: Detekcija FRα u serumu i urinu subjekata za koje je poznato da imaju kancer jajnika
[0154] Izvedene su studije elektrohemiluminescencije da bi se odredilo da li FRα-specifična antitela opisana ovde mogu detektovati FRα u serumu i urinu pacijenata za koje je poznato da imaju kancer jajnika. Za ove eksperimente MAb 26B3 je korišćeno kao MAb za hvatanje i dodato je ECL pločama u koncentraciji od 75µg/mL. Ploče su isprane i dodato je 50 µL seruma uzorka svakom bunarčiću i inkubirano 2 časa. Upareni uzorci seruma i urina dobijeni su od normalnih zdravih ženskih osoba (negativna kontrola) i od pacijenata sa kancerom jajnika. Uzorci (serum ili urin) su razblaženi 1:4 u PBST (fosfatno puferovani fiziološki rastvor, pH7.4, koji sadrži 0.01% Tween®20). Nakon inkubacije, uzorci su isprani sa PBST i 25 µL/bunarčiću MAb 19D4 (1mg/mL), obeleženog sa Ru na stopi od otprilike 13 obeleživača/IgG molekulu, dodato je svakom bunarčiću da bi se detektovao vezani uzorak. Nakon perioda od 2-časa inkubacije, ploče su isprane sa PBST i očtane sa 2X MSD Buffer T.
Rezultati u Tabeli 6 pokazuju da se FRα u serumu i urinu može zarobiti i detektovati korišćenjem monoklonskih antitela 26B3 i 19D4.
Tabela 6: Relativni nivoi FRα u serumu i urinu
PRIMER 11: M-skor kao mera za rezutlate imunohistohemije
[0155] Razvijena je mera obojenosti (M-skor) za svaki uzorak i može se definisati kao što sledi:
U jednačini, xijje procenat tumora obojenog sa intenzitetom j za pacijenta i i wjje apsolutna vrednost intenziteta (u opsegu od 0 do 3+). Mera ima teorijski opseg od nula (bez pozitivne obojenosti) do pedeset (100% ćelija je obojeno sa 3+ intenzitetom). Kao takav, M-skor je ponderisani skor za IHC bojenje FRα na membrani ćelija tumora koji opisuje i proporciju FRα pozitivnih ćelija i intenzitet obojenosti. Izračunata je srednja vrednost M-skorova za svakog pacijenta u odnosu na višestruke uzorke tkiva u mikronizovima (TMA), gde je odgovarajuće. Ukoliko uzorak nema rezultata, tj. nije prisutan tumor ili nekrozno tkivo, M-skor je dodeljen ne-praznim određivanjima.
[0156] Praktična primena prethodne jednačine je prikazana ispod:
Ovde, x = % tumora obojenog sa intenzitetom 3+; y = % tumora obojenog sa intenzitetom 2+; z = % tumora obojenog sa intenzitetom 1+.
[0157] Stopa pozitivnosti za FRα ekspresiju unutar date histologije izračunata je kao proporcija uzoraka koji su obojeni pozitivno prema definiciji pozitivnog rezultata (≥ 5% ukupnih ćelija tumora obojeno). Tačni binomni intervali poverenja određeni su korišćenjem ustanovljenih postupaka (Clopper C.J. and Pearson R.C., Biometrika. 26:404-13 (1934)). Rezimirana statistika je ovde prikazana za sve demografske promenljive i za M-skor. Razlike srednjih vrednosti su određene korišćenjem jednofaktorske ANOVA sa post-hoc testovima uz kontrolisanje ukupne greške tipa I. Razlike u srednjim vrednostima bile su statistički različite ukoliko je p-vrednost povezana sa testom bila manja od Bonferroni podešene greške tipa I za taj test (maksimalna greška tipa I = 0.05).
PRIMER 12: Komparativno bojenje ćelija karcinoma pluća sa antitelom 26B3 i antitelom BN3.2
[0158] Postoje značajne razlike u literaturi u odnosu na procenat različitih karcinoma koji eksprimiraju FRα kao što je određeno sa IHC, delimično usled korišćenja različitih antitela, od kojih većina nije komercijalno dostupna. Jedno FRα specifično MAb koje je komercijalno dostupno i za koje je pokazano da detektuje FRα na FFPE presecima sa IHC je antitelo BN3.2 (Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL). Stoga su izvedene studije da se uporedi antitelo BN3.2 sa antitelom 26B3 i u odnosu na specifičnost i osetljivost za detekciju FRα korišćenjem komercijalnog TMA koji sadrži različite histološke tipove kancera pluća. Oba antitela bila su visoko specifična za adenokarcinom u poređenju sa drugim histološkim podtipovima, naročito karcinomom skvamoznih ćelija. Međutim, antitelo 26B3 je bilo značajno više osetljivo od BN3.2, identifikujući 26/36 (72%; M-skor srednja vrednost ± SD = 19.84 ± 18.64) i 22/36 (61%; M-skor srednja vrednost ± SD = 11.38 6 14.25) uzoraka adenokarcinoma, respektivno(p<0.0001). Ovi podaci pokazuju da je antitelo BN3.2 značajno manje osetljivo od antitela 26B3 za detekciju ekspresije FRα na FFPE uzorcima tkiva i, kao što je pokazano na Slici 6, međusobni odnos uočenih M-skorova na uzorcima adenokarcinoma pluća za ova dva antitela nije linearan.
PRIMER 13: Detekcija FRα kod subjekata za koje je poznato da imaju adenokarcinom pluća
[0159] Izvedeni su eksperimenti da bi se odredilo da li je prisustvo FRα pozitivne histologije, kao što je detektovano sa antitelom 26B3, povezano sa određenim oblicima kancera pluća. Tkivni mikroniz sa duplikatima normalnih i kancerskih uzoraka, stadijuma I, stadijuma II, stadijuma III, i stadijuma IV uzoraka tkiva pluća procenjeni su u odnosu na ekspresiju FRα preko IHC bojenja korišćenjem antitela 26B3, kao što je opisano u Primeru 7. Kao što se može videti iz podataka u Tabeli 6, FRα je povezan sa adenokarcinomima u odnosu na karcinome skvamoznih ćelija, koje su pokazivale ograničeno pozitivno bojenje.
Tabela 7: Histološka procena uzoraka tkiva kancera
[0160] Dodatne analize su izvedene na 89 histoloških uzoraka u tkivnim mikronizovima gde 36 (40%) su bili adenokarcinom, 32 (36%) su bili karcinom skvamoznih ćelija, 2 (2%) su bili adenoskvamozni karcinomi, i preostalih 19 (21%) predstavljalo je različite histologije (Tabela 8). Ukupne stope FRα pozitivnosti značajno su varirale za svaki od histoloških podtipova. Značajno viša proporcija adenokarcinom tumora bila je pozitivna za FRα u poređenju sa karcinomima skvamoznih ćelija (72% nasuprot 13%, p<0.0001). Od 4 pozitivna uzorka karcinoma skvamoznih ćelija, samo 1 je pokazivao 3+ bojenje na oba uzorka; 1 je imao (2+) bojenje na oba uzorka i druga 2 su bili veoma slabo pozitivni u pojedinačnom uzorku (5-10% od tumorskih ćelija na 1+). Dodatno, takođe je pokazano da su uzorci dva adenoskvamozna karcinoma bila pozitivna na FRα, sa bojenjem ograničenim na deo adenokarcinoma ovih uzoraka (Slika 7).
Tabela 8: Distribucija FRα ekspresije u NSCLC Tipa#
[0161] M-skor analize dupliciranih histoloških uzoraka adenokarcinoma pokazale su malo variranje u bojenju sa antitelom 26B3 (Slika 8), što odražava robusnost bojenja sa antitelom 26B3. Takođe, ispitivanje M-skorova po stadijumu i gradusu unutar histološkog podtipa adenokarcinoma ukazalo je da nijedan stadijum ili gradus bolesti nije bio povezan sa stepenom bojenja kao što je definisano sa M-skorovima (podaci nisu prikazani).
[0162] Distribucija M-skorova za FRα bojenje uzoraka adenokarcinoma pluća i karcinoma skvamoznih ćelija prikazana je na Slici 9. Srednja vrednost ( ± SD) M-skorova za uzorke adenokarcinoma i karcinoma skvamoznih ćelija obojenih sa antitelom 26B3 bili su 19.84 ( ± 18.64) i 1.39 ( ± 5.54), respektivno (p<0.0001). M-skor za adenokarcinom bio je takođe značajno veći u poređenju sa svim drugim histološkim tipovima kancera pluća. Dodatno, Tree Analysis je izvedena da bi se ustanovila verovatnoća da je histološki kancer adenokarcinom. M-skor >21.7 rezultovao je u odnosu verovatnoće (OR) od 16, što dodatno pokazuje da je FRα pretežno histološki eksprimiran kod adenokarcinoma (analiza nije prikazana).
[0163] Blokovi tkiva fiksirani u formalinu i ukalupljeni u parafinu (FFPE) su retko dostupni od pacijenata sa kasnim stadijumom kancera pluća, jer se u tipičnom slučaju ne vrši hirurško odstranjivanje. Stoga, izvedene su studije da bi se odredila pogodnost uzoraka aspirata sa tankom iglom (FNA) za FRα IHC korišćenjem MAb 26B3, jer je kancer pluća kasnog stadijuma nejčešće dijagnostifikovan preko male biopsije ili citološkog materijala. Za ove studije, uzorci su dobijeni od devet pacijenata sa kasnim stadijumom adenokarcinoma dijagnostifikovanih preko citološke procene aspirata torakalnog limfnog čvora (Slika 10) i pokazano je da se stopa FRα pozitivnosti (63%) mogla uporediti sa onom viđenom za histološke uzorke procenjene na TMA kancera pluća. Iako je uzorak male veličine, ovi podaci sugerišu da citološki uzorci mogu biti pogodan izvor tkiva za određivanje FRα ekspresije kod pacijenata sa kasnim stadijumom adenokarcinoma.
PRIMER 14 - FRα je eksprimiran od strane CK+/CD45- ćelija, ali ne od CK-/CD45+ ćelija, izolovanih iz krvi pacijenata za koje je poznato da imaju nesitnoćelijski karcinom pluća
[0164] Izvedene su studije da bi se odredio profil ekspresije FRα na cirkulišućim ćelijama tumora (CTCs) pacijenata za koje je poznato da imaju nesitnoćelijski karcinom pluća. Za ove studije, uzorci krvi su uzeti od 15 zdravih donora i 5 pacijenata sa kancerom pluća stadijuma IV i zatim su obogaćeni sa CTCs korišćenjem ApoSteam™ sistema od ApoCell. Nakon obogaćivanja, svaki uzorak je obojen u odnosu na citokeratin (CK), CD45 (receptor tipa C protein tirozin fosfataze), jedra, i FRα. FRα bojenje je izvedeno korišćenjem antitela 26B3 kao primarnog antitela, koje je zatim detektovano korišćenjem specifičnog za miša, sekundarnog antitela konjugovanog sa DyLight® 649. Kao što je prikazano na Tabeli 9, FRα ekspresija je uočena sa CK+/CD45- CTCs, ali ne sa CK-/CD45+ CTCs.
Tabela 9 – Ekspresija FRα od strane cirkulišućih ćelija tumora pacijenata za koje je poznato da imaju nesitnoćelijski karcinom pluća
PRIMER 15: 5-godišnje preživljavanje subjekata sa ili bez FRα-eksprimirajućeg adenokarcinoma pluća
[0165] Izvedeni su eksperimenti da bi se odredilo da li prisustvo histološki pozitivnog FRα, kao što je detektovano sa antitelom 26B3, može biti povezano sa ili poboljšanim ili smanjenim 5-godišnjim preživljavanjem. Uzorci tkiva pluća, normalni i kancerski, stadijum I ili stadijum II adenokarcinom, podvrgnuti su IHC bojenju, kao što je opisano u Primeru 7, i zatim očitani. Zabeležen je procenat 3+, 2+, 1+ i 0 intenziteta obojenosti na tumoru. Bilo je 177 pločica koje su se mogle interpretirati kao duplikati ili triplikati pacijenta. U kombinaciji sa kliničkim i histološkim podacima koji su se mogli proceniti identifikovano je 53 slučaja koja su se mogla proceniti. Analize su izvedene u pogledu podataka koji se odnose na demografski, klinički i status preživljavanja 5 godina nakon dijagnoze nesitnoćelijskog adenokarcinoma pluća.
[0166] Da bi se odredila optimalna granica za M-skor izvedena je Receiver Operating Characteristic (ROC) analiza. Dijagnostička tačnost nije bila od značaja u ovoj analizi; međutim, odnos proporcije dijagnostičke verovatnoće pozitivnog testa prema proporciji negativnog testa bio je važan. Ovi odnosi su definisani kao što je opisano u Pepe MS, The statistical evaluation of medical tests for classification and prediction, New York: Oxford University Press (2003). Na granici od 10 odnos verovatnoća postigao je maksimum 6.62. Ova vrednost M je izabrana da odredi pozitivnost obojene pločice.
[0167] Napravljene su Kaplan-Maier funkcije preživljavanja sa FRα asocijacijom kao prognostičkim faktorom. Test za log rangiranje ukazao je da je pozitivnost na FRα bila korisna za ne-fatalne događaje (Hi-kvadrat=7.34, df=1 p=0.007). Slika 11 ilustruje funkcije preživljavanja za grupe adenokarcinoma stadijuma I i stadijuma II za koje se smatra da su FRα pozitivne i FRα negativne sa 26B3 detekcijom. Na 5 godina odnos rizika je 2.42. Ovo ukazuje da subjekti koji imaju tumore koji su negativni (M<10) za FRα imaju 2.5 veću verovatnoću da umru unutar pet godina od dijagnoze od subjekata sa FRα-pozitivnim tumorima (M≥10).
PRIMER 16: Ekspresija alfa receptora folata je povezana sa trostruko-negativnim oblicima kancera dojke
[0168] Izvedene su studije za procenu ekspresije FRα preko uzoraka tkiva kancera dojke. Analize su izvedene korišćenjem uzoraka u tkivnim matricama (TMA) obojenim sa antitelom 26B3 kao što je opisano u Primeru 7 i FFPE histološki uzorci su pripremljeni i obojeni sa antitelom 26B3 kao što je opisano u Primeru 7.
[0169] Distribucija histologija prisutnih kod kancera dojke TMA (U.S. BioMAX catalog # BR1503a; 72 slučaja, duplicate cores) prikazane su u Tabeli 10, pri čemu je većina predstavljenih slučajeva identifikovana kao invazivni duktalni karcinom (IDC). TMA je uključivala uzorke 2 normalne dojke, koji su bili pozitivni u odnosu n a FRα ekspresiju kao što je odeđeno sa MAb 26B3. Bojenje normalne dojke ograničeno je na duktalne ćelije sa bojenjem lumena i membrane. Dva od tri slučaja fibroadenoma (67%), 0/2 slučajeva cistosarkoma (0%) i 1/6 in situ slučajeva duktalnog karcinoma (17%) bili su pozitivni na FRα. Pojedinačni invazivni lobularni karcinom (ILC) bio je negativan za FRα bojenje. Od 59 IDC uzoraka 18 (31%) su bili pozitivni za FRα (Slika 12). Uzimajući u obzir mali broj pozitivnih slučajeva na ovim TMA validna analiza FRα ekspresije u odnosu na stadijum ili gradus nije bila moguća; međutim, treba napomenuti da je većina uzoraka bila ili T1 ili T2. Pokazano je da je FRα ekspresija povezana sa ER/PR negativnim tumorima u odnosu na ER/PR pozitivne tumore (p=0.012) i sa trostruko negativnim kancrima dojki (TNBC) (ER/PR+ ili Her2+ nasuprot ER/PR/Her2-, p<0.0001).
[0170] Od 18 FRα pozitivnih IDC slučajeva, samo 2 (11 %) su bila Her2 pozitivna što znači da je velika većina (89%) bila Her2 negativna. Ovi podaci sugerišu da FRα pozitivnost bliže prati Her2 negativnost. Dodatno, od 18 FRα pozitivnih IDC slučajeva, 3 su bili pozitivni za estrogen receptor (ER) i 4 su bili pozitivni za progesteron receptor (PR), ali svi ER/PR pozitivni/FRα pozitivni slučajevi su bili Her2 negativni. Od FRα pozitivnih IDC slučajeva 12/18 (67%) su bili trostruko negativni kanceri dojki (TNBC), što sugeriše da FRα može biti marker i ciljna struktura za veoma lošu prognozu TNBC molekularnog podtipa. Gledajući TMA kao celinu, samo 2/13 (15%) od svih Her2 pozitivnih slučajeva bilo je takođe pozitivno za FRα dok 16/46 (35%) od Her2 negativnih slučajeva bilo je takođe FRα pozitivni, što podržava sugestiju da je FRα ekspresija u negativnoj korelaciji sa Her2 ekspresijom. Predstavljanje distribucije M-skorova za ove TMA u odnosu na molekularni podtip (her-2 (+) i her-2 (-)) prikazano je na Slici 13.
[0171] Prethodno opisane TMA sastavljene su primarno od kancera dojke ranog stadijuma: stadijum I, 6/60 (10%); stadijum II, 44/60 (73%); stadijum III, 10/60 (17%). Stoga, da bi se potvrdili i proširili rezutlati dobijeni na TMA, procenjeno je 61 FFPE blokova tkiva od stadijuma IV(T4) Her2 negativnih kancera dojki sa poznatom ER/PR ekspresijom u opsegu od 0-100% pozitivnih (FFPE blokovi tkiva su dobijeni od arhiva Genzyme Genetics). Svih 61 od ovih uzoraka bili su iz metastaza, ne iz primarnog tumora. Rezultati ove studije rezimirani su u Tabeli 11.
Tabela 10: Distribucija FRα pozitivnosti u histološkim tipovima – TMA podaci
[0172] FRα ekspresija (Slika 14) pronađena je u 22/61 (36%) od ovih pacijenata, što pokazuje da je procenat FRα pozitivnih uzoraka/tumora određenih u ranom stadijumu bolesti zadržan u kasnom stadijumu metastatske bolesti kod Her2 negativne populacije (TMA pozitivnost = 35%; stadijum IV metastatske bolesti = 36%). Od 22 FRα pozitivna pacijenta stadijuma IV sa metastazama, samo 3 (14%) pokazivalo je bilo kakvu pozitivnost za ER/PR sa trendom takve pozitivnosti u niskom opsegu (do 30%). Kao takvi, 19/22 (86%) FRα pozitivni pacijenti bili su trostruko negativnog molekularnog podtipa. Ponovo, ovi podaci se poželjno mogu uporediti sa podacima dobijenim u ranom stadijumu bolesti na TMA gde su 67% od svih FRα pozitivnih pacijenata bili trostruko negativnog podtipa.
Tabela 11: Distribucija FRα pozitivnosti u uzorcima molekularnih podtipova metastatskog kancera dojke
[0173] Dodatno, uzorci iz stadijuma IV metastatske bolesti dobijeni su od više metastatskih mesta uključujući uzorke iz limfnog čvora, kosti, kože i jetre kao i iz tečnog i aspirata dobijenog sa tankom iglom (FNA) dobijenog primarno iz pleure pacijenata i paracenteze. Nekoliko od ovih ’tečnih biopsija’ obojeno je pozitivno u odnosu na FRα (Slika 15) što sugeriše generalnu primenjivost opisane IHC metodologije na višestruke tipove uzoraka.
PRIMER 17: Procena histoloških ginekoloških uzoraka kancera za ekspresiju alfa receptora folata
[0174] Izvedene su imuniohistohemijske studije da se proceni FRα ekspresija kod ginekoloških maligniteta koji uključuju jajnik, endometrijum i jajovod. Izvedene su analize korišćenjem uzoraka tkivnih matrica (TMA) obojenih sa antitelom 26B3 kao što je opisano u Primeru 7 i FFPE histološkim uzorcima pripremljenim i obojenim sa antitelom 26B3 kao što je opisano u Primeru 7. Komercijalne tkivne matrice dobijene su od US Biomax, Inc. (Rockville, MD) za karcinome ovarijuma (catalog # OV1921; 96 slučajeva, duplicate cores); karcinome endometrijuma (catalog # EMC1021; 102 slučajeva, single cores); karcinome jajovoda (catalog # UTE601; 30 slučajeva, duplicate cores).
[0175] Uzorak je smatran pozitivnim u odnosu na FRα ekspresiju ukoliko je procenat ćelija tumora pozitivan na bojenje bio veći od ili jednak 5% na bilo kom intenzitetu. Uzorak je odbačen i stoga nije uključen u analize ukoliko je ginekološki patolog odredio da je ili potpuno nedostajao ili je sastavljen od nekroznog tkiva sa nedovoljnim brojem vijabilnih ćelija za procenu. Od uzoraka endometrijuma, šest je sadržalo samo atipične kompleksne hiperplazije bez adenokarcinoma. Histološka klasifikacija ćelijskog tipa i gradusa bila je zasnovana na WHO Classification of Breast and Female Genital Organs (Tavassoli and Devilee). Klinički stadijum zasnovan na FIGO i TNM sistemu obezbeđen je od strane proizvođača TMA (US Biomax).
[0176] Stopa pozitivnosti za FRα ekspresiju unutar datog tipa tumora izračunata je kao proporcija tumora koji su pozitivno obojeni prema definiciji pozitivnog rezutlata (6 5% obojenosti membrane tumorskih ćelija). Razlike u FRα pozitivnosti između grupa, npr. histološke, stadijum ili gradus, procenjeni su korišćenjem tabela kontingencije 2x2 i Fisherovim egzaktnim testom. Razlike u srednjim vrednostima su statistički značajne ukoliko je pvrednost povezana sa testom bila manja od Bonferroni podešene greške tipa I za taj test (maksimalna greška tipa I =0.05).
[0177] Intenzitet obojenosti membrane i citoplazme bodovan je kao 0, bez obojenosti; 1+, slabo; 2+, umereno i 3+, snažno. Određen je procenat ćelija za svaki intenzitet u uzorku. Tkivo je analizirano pod 4x, 10x, 20x i 40x objektivima. Snažna obojenost membrane (3+) je lako vizuelizovana pod 4x i potvrđena na 10x. Umerena obojenost membrane (2+) bila je vidljiva na 10x i potvrđena na 20x. Slaba obojenost (1+) zahtevala je 20x ili 40x (Slika 16). U prisustvu 3+ bojenja, membrana je bila debela i nalazila se na apikalnim i lateralnim granicama ćelije. Na tangencijalnim presecima, kompletni periferni obrazac bio je očigledan (Slika 16 (A) i (B)).2+ obojenost membrane je bila slabija po intenzitetu i tanja od 3+, obično lokalizovana na apikalnim luminalnim granicama i povremeno na lateralnim granicama ćelije.
1+ slaba membrana je generalno bila ograničena na granice lumena. Prateća obojenost citoplazme bila je varijabilna, u zavisnosti od tipa tumore.
[0178] Od 94 uzoraka koji su se mogli proceniti na tumoru jajnika TMA, 70 (74%) bili su seroznog tipa, 10 (11%) bili su mucinoznog, 4 (4%) endometrijalnog, 3 (3%) svetloćelijskog i preostalih 7 (8%) bili su ostali retki tumori. Od 87 uzoraka karcinoma jajnika, FRα pozitivna stopa za svaki tip ćelija bio je kao što sledi: 100% (70/70) seroznog tipa, 80% (8/10) mucinoznog tipa, 75% (3/4) endometrijalnog tipa, i 67% (2/3) svetloćelijskog tipa. Razlika između seroznog i mucinoznog tipa je značajna sa p vrednošću na 0.014 sa Fisher-ovim egzaktnim testom (Tabela 12). FRα status nije bio značajan za histološki gradus ili klinički stadijum. Ko-egzistirajuća citoplazmatska obojenost obično je bila 2+ ili 3+ kod seroznog tipa i slabija i manje učestala kod drugih tipova tumora.
Tabela 12: Distribucija FRα pozitivnosti u odnosu na histološki tip, klinički stadijum i histološki gradus u karcinomima jajnika
[0179] U uzorcima endometrijuma, FRα je eksprimiran u 80% (4/5) normalnih (Slika 17(A)), 100% (6/6) atipičnih kompleksnih hiperplazija (Slika 17(B)), i 89% (80/90) adenokarcinoma, uključujući 88 endometrijalnog tipa i 1 svetloćelijskog tipa (Slike 18 i 19). Osam adenokarcinoma endometrijuma sadržali su oblasti skvamozne metaplazije. U normalnom endometrijumu, bojenje membrane je bilo slabo i ograničeno na apikalne granice lumena (Slika 17(A)). Kod atipične kompleksne hiperplazije i karcinoma, bojenje je pretežno bilo luminalno sa dodatnom obojenošću na lateralnim granicama ćelije u nekim slučajevima (Slika 17(B)). U prisustvu 3+ obojenosti membrane, obojenost citoplazme je varirala u intenzitetu od snažnog (Slika 18(A)) do slabog (Slike 18(B) i (C)). Ćelije tumora sa 1+ ili 2+ obojenošću membrane retko su eksprimirale obojenost citoplazme. Većina metaplastičnih skvamoznih ćelija i svetlih ćelija pokazivala je umereno do snažno bojenje membrane. (Slike 19(A) i (B)).
[0180] FRα ekspresija je bila pozitivna u 100% tumora gradusa 1, 96% gradusa 2 i 74% gradusa 3 (gradus 1 vs. gradus 3, p vrednost = 0.0029; gradus 2 vs. gradus 3, p=0.034). FRα status nije bio značajan u odnosu na T1 vs. T2/3; N0 vs. N1, stadijum I vs. stadijum II/III.
[0181] Svi od sedamnaest jezgara normalnih jajovoda, 16 uzoraka hroničnog salpingitisa i 20 tubusnih seroznih karcinoma bili su snažno pozitivni u odnosu na bojenje membrane i citoplazme (Slike 20 (A) do (C)).
PRIMER 18: Procena histoloških kolorektalnih uzoraka u odnosu na ekspresiju alfa receptora folata
[0182] Imunohistohemijske studije su izvedene da bi se procenila FRα ekspresija u uzorcima kolorektalnog tkiva. Analize su izvedene korišćenjem uzoraka tkivnih matrica (TMA) dobijenih od US Biomax (catalog # BC051111). TMA je sadržao 90 uzorka tkiva u duplikatu dobijenih od subjekata za koje je poznato da imaju kolorektalni kancer i 10 normalnih kolorektalnih uzoraka. Uzorci su obojeni sa antitelom 26B3 kao što je opisano u Primeru 7. Od 90 uzoraka dobijenih od subjekata za koje je poznato da imaju kolorektalni kancer, 18 (20%) je bilo pozitivno u odnosu na FRα ekspresiju, dok nijedan od normalnih uzoraka nije bio pozitivan. Dodatno, pozitivno bojenje je generalno bilo umereno do slabo i nikakva uočljiva veza u odnosu na stadijum bolesti nije se mogla primetiti.
PRIMER 19: Procena histoloških uzoraka tiroidee u odnosu na ekspresiju alfa receptora folata
[0183] Imunohistohemijske studije su izvedene da bi se procenila FRα ekspresija u uzorcima tiroidnog tkiva. Analize su izvedene korišćenjem uzoraka tkivnih matrica (TMA) dobijenih od US Biomax (catalog # TH802a). Uzorci su obojeni sa antitelom 26B3 kao što je opisano u Primeru 7. Tiroidni papilarni karcinom bio je snažno pozitivan u odnosu na ekspresiju membranskog FRα (26/28, 93%) i mogao se razlikovati od medularnog karcinoma, gde je svih 5 uzoraka bilo negativno u odnosu na FRα bojenje, što je u skladu sa prethodnim objavama. Interesantno, folikularni adenomi mogli su se razdvojiti na makrofolikularni tip i mikrofolikularni tip sa 3/13 (23%) i 18/22 (82%) koji su pokazivali pozitivnost u odnosu na FRα ekspresiju, respektivno. Nešto pozitivnosti je takođe uočeno u malom broju uzoraka tumora Hurthle ćelija (2/3, 67%) i folikularnog karcinoma (3/7, 43%) na ovoj TMA. Ovi rezultati su rezimirani u Tabeli 13.
Tabela 13 – Ekspresija FRα u uzorcima tiroidnig tkiva
LISTING SEKVENCI

Claims (38)

Patentni zahtevi
1. Izolovano antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, specifičan za alfa receptor folata (FRα) koji sadrži CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 26, CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 27, CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 28, CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 30, CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 31, i CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 32.
2. Izolovano antitelo ili antigen-vezujući fragment prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time da antitelo je mišje antitelo, himerno antitelo, ili humanizovano antitelo.
3. Izolovano antitelo ili antigen-vezujući fragment prema patentnom zahtevu 1, sa varijabilnim regionom lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29 i/ili sa varijabilnim regionom teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 33.
4. Izolovani polinukleotid koji kodira antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, specifičan za alfa receptor folata (FRα), naznačen time da CDR1 lakog lanca kodiranog antitela sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26, CDR2 lakog lanca kodiranog antitela sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 27, CDR3 lakog lanca kodiranog antitela sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28, CDR1 teškog lanca kodiranog antitela sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 30, CDR2 teškog lanca kodiranog antitela sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31, i CDR3 teškog lanca kodiranog antitela sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 32.
5. Polinukleotid prema patentnom zahtevu 4, koji sadrži nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 61 i 65.
6. Izolovani polinukleotid prema patentnom zahtevu 4, koji sadrži sekvence nukleinske kiseline SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, i SEQ ID NO: 64.
7. Vektor koji sadrži izolovani polinukleotid prema bilo kom od patentnih zahteva 5 do 6.
8. Rekombinantna ćelija koja sadrži vektor prema patentnom zahtevu 7.
9. Rekombinantna ćelija prema patentnom zahtevu 8, naznačena time da ćelija je eukariotska ćelija, biljna ćelija, ili bakterija.
10. Izolovano antitelo specifično za alfa receptor folata (FRα) proizvedeno od strane ćelijske linije deponovane kod ATCC sa pristupnim brojem PTA-11885.
11. Postupak za detekciju alfa receptora folata (FRα) ili FRα-eksprimirajućeg kancera u biološkom uzorku, koji sadrži izlaganje uzorka antitelu prema patentnom zahtevu 1 ili 10, ili njegovom antigen-vezujućem fragmentu, i detekciju alfa receptor folata (FRα).
12. Postupak prema patentnom zahtevu 11, naznačen time da je biološki uzorak izveden iz čoveka, glodara, ne-humanog primata, zeca, ili psa.
13. Postupak za dijagnostifikovanje alfa receptor folata-eksprimirajući kancer kod subjekta, koi sadrži:
a. izlaganje biološkog uzorka subjekta antitelu prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 10, ili njegovom antigen-vezujućem fragmentu;
b. kvantifikaciju količine alfa receptora folata (FRα) prisutne u uzorku;
c. poređenje količine alfa receptora folata (FRα) prisutnog u uzorku sa poznatim standardom; i
d. određivanje da li nivoi alfa receptora folata (FRα) kod subjekta potpadaju pod nivoe alfa receptora folata (FRα) povezane sa kancerom.
14. Postupak prema patentnom zahtevu 13, naznačen time da nalaz da ćelije adenokarcinoma subjekta eksprimiraju alfa receptor folata ukazuje da će subjekt imati veću verovatnoću poboljšane stope 5-godišnjeg preživljavanja nego kod ćelija adenokarcinoma koje ne eksprimiraju alfa receptor folata.
15. Postupak praćenja alfa receptor folata-eksprimirajućeg kancera kod subjekta, koji sadrži: a. izlaganje biološkog uzorka subjekta antitelu prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 10, ili njegovom antigen-vezujućem fragmentu;
b. kvantifikaciju količine alfa receptora folata (FRα) prisutne u uzorku koja je vezana sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom;
c. poređenje količine alfa receptora folata (FRα) prisutnog u uzorku ili i. sa poznatim standardom ili ii. biološkim uzorkom dobijenim ranije od subjekta; i
d. određivanje da li nivoi alfa receptora folata (FRα) kod subjekta ukazuju na napredovanje, povlačenje ili stabilnu bolest.
16. Postupak prema bilo kom od patetntnih zahteva 11 do 15, gde je biološki uzorak izveden iz urina, krvi, seruma, plazme, pljuvačke, ascita, cirkulišućih ćelija, cirkulišućih ćelija tumora, ćelija koje nisu povezane sa tkivom, tkiva, hirurški odstranjenog tkiva tumora, biopsija, aspiracije tankom iglom, ili histoloških preparata.
17. Postupak prema patentnom zahtevu 13, naznačen time da kancer je kancer dojke, tiroidni kancer, kolorektalni kancer, endometrijalni kancer, kancer jajovoda, ili kancer jajnika.
18. Postupak prema patentnom zahtevu 17, naznačen time da kancer je kancer pluća.
19. Postupak prema patentnom zahtevu 18, naznačen time da kancer pluća je adenokarcinom.
20. Postupak prema patentnom zahtevu 13, naznačen time da poznati standard sadrži
a. nivoe alfa receptora folata (FRα) izvedene iz subjekata identifikovanih da nemaju kancer ili preparata proteina alfa receptora folata sa poznatom koncentracijom;
b. FRα nivoi izvedeni iz subjekata identifikovanih da imaju rani stadijum alfa receptor folataeksprimirajućeg kancera;
c. nivoi izvedeni iz subjekata identifikovanih da imaju srednji stadijum alfa receptor folataeksprimirajućeg kancera; ili
d. FRα nivoi izvedeni iz subjekata identifikovanih da imaju kasni stadijum alfa receptor folata-eksprimirajućeg kancera.
21. Postupak prema patentnom zahtevu 20, naznačen time da kancer je kancer dojke, tiroidni kancer, kolorektalni kancer, endometrijalni kancer, kancer jajovoda, kancer jajnika ili kancer pluća.
22. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 13 do 21, koji dalje sadrži, nakon pomenutog koraka izlaganja, izlaganje biološkog uzorka subjekta drugom antitelu, ili njegovom antigen-vezujućem fragmentu, izabranom od:
i. antitela prema patentnom zahtevu 1;
ii. antitela prema patentnom zahtevu 10;
iii. izolovanog antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, specifičnog za alfa receptor folata (FRα) koji sadrže CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 10, CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 11, CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 12, CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 14, CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 15, i CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 16;
iv. izolovanog antitela specifičnog za alfa receptor folata (FRα) proizvedenog od strane ćelijske linije deponovane kod ATCC sa pristupnim brojem PTA-11884;
v. izolovanog antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, specifičnog za alfa receptor folata (FRα) koji sadrže CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 18, CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 19, CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 20, CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 22, CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 23, i CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 24;
vi. izolovanog antitela specifičnog za alfa receptor folata (FRα) proizvedenog od strane ćelijske linije deponovane kod ATCC sa pristupnim brojem PTA-11886;
vii. izolovanog antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, specifičnog za alfa receptor folata (FRα) koji sadrže CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 2, CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 3, CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 4, CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 6, CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 7, CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 8; i
viii. izolovanog antitela specifičnog za alfa receptor folata (FRα) proizvedenog od strane ćelijske linije deponovane kod ATCC sa pristupnim brojem PTA-11887;
naznačeno time da je drugo antitelo različito od prvog antitela.
23. Postupak prema patentnom zahtevu 22, naznačen time da je biološki uzorak subjekta izložen antitelu prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 10, ili njegovom antigenvezujućem fragmentu, i zatim je izložen:
a. izolovanom antitelu, ili njegovom antigen-vezujućem fragmentu, specifičnom za alfa receptor folata (FRα) koji sadrže, CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 10, CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 11, CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 12, CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 14, CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 15, i CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 16;
b. izolovanom antitelu specifičnom za alfa receptor folata (FRα) proizvedenom od strane ćelijske linije deponovane kod ATCC sa pristupnim brojem PTA-11884;
c. izolovanom antitelu, ili njegovom antigen-vezujućem fragmentu, specifičnom za alfa receptor folata (FRα) koji sadrže, CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 18, CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 19, CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 20, CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 22, CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 23, i CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 24;
d. izolovanom antitelu specifičnom za alfa receptor folata (FRα) proizvedenom od strane ćelijske linije deponovane kod ATCC sa pristupnim brojem PTA-11886;
e. izolovanom antitelu, ili njegovom antigen-vezujućem fragmentu, specifičnom za alfa receptor folata (FRα) koji sadrže CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 2, CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 3, CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 4, CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 6, CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 7, i CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 8;
f. izolovanom antitelu specifičnom za alfa receptor folata (FRα) proizvedenom od strane ćelijske linije deponovane kod ATCC sa pristupnim brojem PTA-11887.
24. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 15 do 21, naznačen time da je postupak izveden nakon tretmana subjekta za kancer.
25. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 11 do 24, naznačen time da je antitelo, ili fragment antitela, obeležen.
26. Postupak prema patentnom zahtevu 25, naznačen time da obeleživač je radioobeleživač, fluorescentni obeleživač, epitop tag, biotin, hromofor obeleživač, ECL obeleživač, ili enzim.
27. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 11 do 24, naznačen time da je izloženi alfa receptor folata (FRα) vezan ili nije vezan za ćeliju.
28. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 11 do 24, naznačen time da je prisustvo alfa receptora folata (FRα) u uzorku detektovano korišćenjem western blota, imunohistohemije, protočne citometrije, radioimunoanalize, imunoprecipitacije, elektrohemiluminescentnom (ECL) imunoanalizom, ili ELISA.
29. Komplet za detekciju prisustva alfa receptora folata (FRα) u biološkom uzorku, koji sadrži najmanje jedano antitelo prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 10, ili njegov antigen-vezujući fragment.
30. Komplet za detekciju prisustva alfa receptora folata (FRα) u biološkom uzorku, koji sadrži:
najmanje jedano antitelo prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 10, ili njegov antigen-vezujući fragment;
naznačeno time da je uključeno antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, pričvršćeno za čvrstu podlogu.
31. Komplet za detekciju prisustva alfa receptora folata (FRα) u biološkom uzorku, koji sadrži:
najmanje jedano antitelo prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 10, ili njegov antigen-vezujući fragment;
naznačeno time da je uključeno antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, detektabilno obeleženo.
32. Postupak prema patentnom zahtevu 13 ili patentnom zahtevu 14, naznačen time da su nivoi alfa receptora folata (FRα) kod subjekta indikativni za tip kancera koji pogađa subjekta.
33. Postupak prema patentnom zahtevu 32, naznačen time da kancer je adenokarcinom pluća ili karcinom pluća skvamoznih ćelija.
34. Izolovano antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3 ili 10, naznačeno time da je antitelo detektabilno obeleženo.
35. Antitelo prema patentnom zahtevu 34, naznačeno time da detektabilni obeleživač je radioobeleživač, fluorescentni obeleživač, epitop tag, biotin, hromofor obeleživač, ECL obeleživač, ili enzim.
36. Antitelo prema patentnom zahtevu 35, naznačen time da obeleživač je rutenijum,<111>In-DOTA,<111>Indietilentriaminepentasirćetna kiselina (DTPA), peroksidaza rena, alkalna fosfataza i beta-galaktozidaza, ili poli-histidin.
37. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 11 do 21, naznačen time da je antitelo, ili antigen-vezujući fragment, pričvršćen za čvrstu podlogu.
38. Postupak prema patentnom zahtevu 13 ili 14, koji dodatno sadrži predviđanje povoljnog ishoda za subjekta koji ima adenokarcinom koji eksprimira alfa receptor folata (FRα), naznačen time da je poželjan ishod definisan da ima povećanu stopu 5-godišnjeg preživljavanja.
RS20180252A 2011-07-15 2012-07-13 Antitela protiv alfa receptora folata i njihove upotrebe RS56985B1 (sr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161508444P 2011-07-15 2011-07-15
US201261604412P 2012-02-28 2012-02-28
US201261604954P 2012-02-29 2012-02-29
EP12736054.3A EP2731972B1 (en) 2011-07-15 2012-07-13 Anti-folate receptor alpha antibodies and uses thereof
PCT/US2012/046672 WO2013012722A1 (en) 2011-07-15 2012-07-13 Anti-folate receptor alpha antibodies and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS56985B1 true RS56985B1 (sr) 2018-05-31

Family

ID=46516898

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20180252A RS56985B1 (sr) 2011-07-15 2012-07-13 Antitela protiv alfa receptora folata i njihove upotrebe

Country Status (21)

Country Link
US (4) US8475795B2 (sr)
EP (2) EP2731972B1 (sr)
JP (2) JP6220333B2 (sr)
CN (2) CN107011439B (sr)
AU (3) AU2012284321C1 (sr)
BR (1) BR112014001030A2 (sr)
CA (1) CA2841725C (sr)
CY (1) CY1120600T1 (sr)
DK (1) DK2731972T3 (sr)
ES (2) ES2824498T3 (sr)
HR (1) HRP20180353T1 (sr)
HU (1) HUE036929T2 (sr)
LT (1) LT2731972T (sr)
PL (1) PL2731972T3 (sr)
PT (1) PT2731972T (sr)
RS (1) RS56985B1 (sr)
SG (1) SG10201605278PA (sr)
SI (1) SI2731972T1 (sr)
SM (1) SMT201800150T1 (sr)
TR (1) TR201802838T4 (sr)
WO (1) WO2013012722A1 (sr)

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI672318B (zh) 2010-02-24 2019-09-21 美商免疫遺傳股份有限公司 葉酸受體１抗體類和免疫共軛物類及彼等之用途
CN114441757A (zh) 2011-04-01 2022-05-06 伊缪诺金公司 用于增加folr1癌症治疗的功效的方法
CN107011439B (zh) * 2011-07-15 2020-11-10 卫材R&D管理有限公司 抗叶酸受体α抗体及其应用
PL2890717T3 (pl) 2012-08-31 2020-08-10 Immunogen, Inc. Testy i zestawy diagnostyczne do wykrywania receptora folianu
US20160311921A1 (en) 2013-06-20 2016-10-27 Morphotek ,Inc. Methods for treatment of ovarian cancer
CN105814079B (zh) 2013-08-30 2021-02-09 伊缪诺金公司 用于检测叶酸受体1的抗体和测定
JP6875129B2 (ja) * 2014-05-08 2021-05-19 ノボダイアックス， インコーポレイテッド 直接的な免疫組織化学アッセイ
RS61010B1 (sr) 2014-11-20 2020-11-30 Hoffmann La Roche Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju t ćelije protiv folr1 i cd3
BR112017010513A2 (pt) 2014-11-20 2018-04-03 F. Hoffmann-La Roche Ag ?cadeias leves comuns e métodos de uso?
RU2753902C2 (ru) 2014-11-20 2021-08-24 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Комбинированная терапия на основе активирующих т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул против cd3 и фолатного рецептора 1 (folr1) и антагонистов, связывающихся с осью pd-1
RU2718780C9 (ru) * 2015-04-17 2020-07-08 Эйсай Инк. Способы лечения рака легкого
KR102700777B1 (ko) 2015-09-17 2024-08-29 이뮤노젠 아이엔씨 항-folr1 면역접합체를 포함하는 치료제 조합
US20180236098A1 (en) 2016-08-12 2018-08-23 L.E.A.F. Holdings Group Llc Alpha and gamma-d polyglutamated antifolates and uses thereof
AU2017308159B2 (en) 2016-08-12 2023-08-10 L.E.A.F. Holdings Group Llc Polyglutamated antifolates and uses thereof
US10822410B2 (en) 2016-11-23 2020-11-03 Eisai R&D Management Co., Ltd. Anti-folate receptor alpha antibodies and uses thereof
CN107353325B (zh) * 2017-07-26 2020-08-11 中国药科大学 叶酸受体α特异性结合肽1及其应用
CN107793471B (zh) * 2017-07-26 2020-08-11 中国药科大学 叶酸受体α特异性结合肽4及其应用
CN107446021B (zh) * 2017-07-26 2020-08-11 中国药科大学 叶酸受体α特异性结合肽5及其应用
CN107446020B (zh) * 2017-07-28 2019-10-01 中国药科大学 叶酸受体α特异性结合肽2及其应用
IL272840B2 (en) * 2017-09-05 2025-01-01 Immunogen Inc Methods for detecting folate receptor 1 in a patient sample
CN111954530A (zh) 2018-02-07 2020-11-17 L.E.A.F.控股集团公司 γ聚谷氨酸化培美曲塞及其用途
EP3749319A4 (en) 2018-02-07 2022-06-22 L.E.A.F Holdings Group LLC TETRAHYDROFOLATES ALPHA POLYGLUTAMATE AND THEIR USES
EP3749312A4 (en) 2018-02-07 2022-02-23 L.E.A.F Holdings Group LLC ALPHA-POLYGLUTAMATED LOMETREXOLE AND USES THEREOF
JP7487107B2 (ja) 2018-02-07 2024-05-20 エル．イー．エー．エフ． ホールディングス グループ エルエルシー アルファポリグルタミン酸化葉酸代謝拮抗薬およびその使用
CA3090384A1 (en) 2018-02-07 2019-08-15 L.E.A.F. Holdings Group Llc Alpha polyglutamated aminopterin and uses thereof
EP3749316A4 (en) 2018-02-07 2021-10-27 L.E.A.F Holdings Group LLC ALPHA-POLYGLUTAMATED PRALATREXATE AND USES THEREOF
US12220431B2 (en) 2018-02-07 2025-02-11 L.E.A.F. Holdings Group Llc Gamma polyglutamated antifolates and uses thereof
CA3090391A1 (en) 2018-02-07 2019-08-15 L.E.A.F. Holdings Group Llc Gamma polyglutamated raltitrexed and uses thereof
CN111954531A (zh) 2018-02-07 2020-11-17 L.E.A.F.控股集团公司 α聚谷氨酸化培美曲塞及其用途
WO2019157125A1 (en) 2018-02-07 2019-08-15 L.E.A.F. Holdings Group Llc Alpha polyglutamated methotrexate and uses thereof
CA3090389A1 (en) 2018-02-07 2019-08-15 L.E.A.F. Holdings Group Llc Alpha polyglutamated raltitrexed and uses thereof
CA3090875A1 (en) 2018-02-14 2019-08-22 L.E.A.F. Holdings Group Llc Gamma polyglutamated lometrexol and uses thereof
US12048766B2 (en) 2018-02-14 2024-07-30 L.E.A.F. Holdings Group Llc Gamma polyglutamated tetrahydrofolates and uses thereof
WO2019160733A1 (en) 2018-02-14 2019-08-22 L.E.A.F. Holdings Group Llc Gamma polyglutamated methotrexate and uses thereof
WO2019160736A1 (en) 2018-02-14 2019-08-22 L.E.A.F. Holdings Group Llc Gamma polyglutamated pralatrexate and uses thereof
CA3090943A1 (en) 2018-02-14 2019-08-22 L.E.A.F. Holdings Group Llc Gamma polyglutamated aminopterin and uses thereof
CN115925952A (zh) 2018-03-13 2023-04-07 东莞凡恩世生物医药有限公司 抗叶酸受体1抗体及其用途
KR102275930B1 (ko) * 2018-03-14 2021-07-12 (주)알테오젠 Folr1에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
JP7623939B2 (ja) * 2018-07-09 2025-01-29 マルチチュード インコーポレーテッド 葉酸受容体アルファに特異的な抗体
CN111393528B (zh) * 2020-01-19 2023-01-31 中国药科大学 一种靶向叶酸受体α的单链抗体及其应用
US20230210989A1 (en) * 2020-06-03 2023-07-06 Kar Muthumani Monoclonal Antibody Against Human Siglec-9 and Use For Immunotherapy
JP2024522544A (ja) * 2021-06-04 2024-06-21 イミュノジェン， インコーポレイテッド 可溶性ＦＲ－α患者におけるがんの治療
WO2023009529A2 (en) 2021-07-28 2023-02-02 Trustees Of Boston University Novel polypeptides and uses thereof
KR20240162569A (ko) * 2022-03-25 2024-11-15 자임워크스 비씨 인코포레이티드 항-엽산 수용체 알파 항체 및 사용 방법
WO2024104431A1 (zh) * 2022-11-16 2024-05-23 迈威(上海)生物科技股份有限公司 一种靶向FRα的抗体或其抗原结合片段及其应用
AU2024305352A1 (en) 2023-06-12 2025-12-04 Amgen Inc. Lymphotoxin beta receptor agonist binding proteins
CN117700557B (zh) * 2024-02-05 2024-04-30 卡秋(江苏)生物科技有限公司 一种特异性结合叶酸受体α的抗体或抗原结合片段
CN117700556B (zh) * 2024-02-05 2024-04-12 苏州百道医疗科技有限公司 一种抗FRα小鼠单克隆抗体及其应用
CN120554514B (zh) * 2025-07-29 2025-12-05 合肥综合性国家科学中心大健康研究院 一种靶向人的叶酸受体α的单克隆抗体
CN120842412B (zh) * 2025-09-23 2025-12-05 合肥综合性国家科学中心大健康研究院 一种靶向人的叶酸受体α的单克隆抗体及其应用

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5646253A (en) 1994-03-08 1997-07-08 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Recombinant human anti-LK26 antibodies
US5595756A (en) * 1993-12-22 1997-01-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents
US6770445B1 (en) 1999-02-26 2004-08-03 Pacific Northwest Research Institute Methods and compositions for diagnosing carcinomas
US7270960B2 (en) 2001-08-29 2007-09-18 Pacific Northwest Research Institute Diagnosis of ovarian carcinomas
WO2004082463A2 (en) 2003-03-17 2004-09-30 Medical College Of Ohio Folate receptor gene modulation for cancer diagnosis and therapy
US20040235108A1 (en) 2003-05-23 2004-11-25 Luigi Grasso Monoclonal antibodies that specifically bind a tumor antigen
AU2005214331B2 (en) 2004-02-12 2011-09-15 Eisai, Inc. Monoclonal antibodies that specifically bind to folate receptor alpha
AU2006230219A1 (en) 2005-03-30 2006-10-05 Endocyte, Inc. Method for cancer prognosis using cellular folate vitamin receptor quantification
AU2006241099B2 (en) * 2005-04-22 2012-04-19 Eisai, Inc. Antibodies with immune effector activity and that internalize in folate receptor alpha-positive cells
EP1900752A1 (en) * 2006-09-15 2008-03-19 DOMPE' pha.r.ma s.p.a. Human anti-folate receptor alpha antibodies and antibody fragments for the radioimmunotherapy of ovarian carcinoma
US7754698B2 (en) 2007-01-09 2010-07-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of FR-alpha expression
FR2918994B1 (fr) 2007-07-20 2012-10-19 Rhodia Operations Formulations de diesters d'acide carboxylique et leur utilisation pour le traitement de materiaux.
WO2009132081A2 (en) 2008-04-24 2009-10-29 The Research Foundation Of State University Of New York Monoclonal antibody-based targeting of folate receptors
US20110177525A1 (en) 2010-01-19 2011-07-21 Predictive Biosciences, Inc. Antibodies and methods of diagnosing diseases
WO2012061759A2 (en) 2010-11-05 2012-05-10 Morphotek Inc. Folate receptor alpha as a diagnostic and prognostic marker for folate receptor alpha-expressing cancers
EP2680839A1 (en) 2011-03-02 2014-01-08 Morphotek, Inc. Co -administration of eribulin and farletuzumab for the treatment of breast cancer
CN107011439B (zh) * 2011-07-15 2020-11-10 卫材R&D管理有限公司 抗叶酸受体α抗体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
US20130017195A1 (en) 2013-01-17
DK2731972T3 (en) 2018-03-12
AU2017202365B2 (en) 2018-06-28
EP2731972A1 (en) 2014-05-21
LT2731972T (lt) 2018-03-26
AU2012284321B2 (en) 2017-03-09
ES2824498T3 (es) 2021-05-12
US10101343B2 (en) 2018-10-16
JP6526143B2 (ja) 2019-06-05
AU2012284321C1 (en) 2017-07-13
CN107011439B (zh) 2020-11-10
ES2663556T3 (es) 2018-04-13
AU2018236755B2 (en) 2019-11-14
CA2841725C (en) 2021-03-09
JP6220333B2 (ja) 2017-10-25
SMT201800150T1 (it) 2018-05-02
WO2013012722A1 (en) 2013-01-24
AU2018236755A1 (en) 2018-10-18
EP3330291A1 (en) 2018-06-06
TR201802838T4 (tr) 2018-03-21
HUE036929T2 (hu) 2018-08-28
AU2012284321A1 (en) 2014-02-06
BR112014001030A2 (pt) 2017-07-04
EP3330291B1 (en) 2020-09-02
JP2018029605A (ja) 2018-03-01
CN107011439A (zh) 2017-08-04
CN103998467A (zh) 2014-08-20
CA2841725A1 (en) 2013-01-24
CN103998467B (zh) 2016-12-14
HRP20180353T1 (hr) 2018-04-06
PT2731972T (pt) 2018-03-09
PL2731972T3 (pl) 2018-06-29
US8834877B2 (en) 2014-09-16
US20130183299A1 (en) 2013-07-18
JP2014524744A (ja) 2014-09-25
SI2731972T1 (en) 2018-04-30
US20140341897A1 (en) 2014-11-20
US9599621B2 (en) 2017-03-21
EP2731972B1 (en) 2017-12-20
US8475795B2 (en) 2013-07-02
CY1120600T1 (el) 2019-12-11
US20170168078A1 (en) 2017-06-15
SG10201605278PA (en) 2016-08-30
AU2017202365A1 (en) 2017-04-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2018236755B2 (en) Anti-folate receptor alpha antibodies and uses thereof
US7521543B2 (en) A34 and A33-like 3 DNA, proteins, antibodies thereto and methods of treatment using same
US10822410B2 (en) Anti-folate receptor alpha antibodies and uses thereof
KR20230016212A (ko) 항-cldn18.2 항체 및 이의 진단 용도
KR102766022B1 (ko) Cd37 의 검출을 위한 항체 및 검정
TWI782000B (zh) 抗ｇｐｒ２０抗體、其製造方法及其應用