KR20040032927A - 신규 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 핵산 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규 폴리펩티드 및 이들 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본원에서는 상기 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 본 발명의 폴리펩티드를 이종 폴리펩티드 서열에 융합시킨 키메라 폴리펩티드 분자, 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 항체, 및 본 발명의 폴리펩티드를 제조하는 방법도 제공된다.

Description

신규 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 핵산 {Novel Polypeptides and Nucleic Acids Encoding the Same}

본 발명은 신규 DNA의 확인 (identification) 및 분리와 이 DNA에 의해 코딩되는 신규 폴리펩티드의 재조합적 제조 방법에 관한 것이다.

세포외 단백질은 다세포 생물의 형성, 분화 및 유지에 중요한 역할을 담당한다. 많은 개별 세포의 운명, 예를 들어 증식, 이동, 분화 또는 다른 세포와의 상호작용은 다른 세포로부터 받은 정보 및(또는) 인접 환경에 의해 지배당하는 것이 일반적이다. 이런 정보는 종종 분비된 폴리펩티드 (예를 들면 유사분열 촉진인자, 생존 인자, 세포독성 인자, 분화 인자, 신경 펩티드 및 호르몬)에 의해 전달되어,결국엔 다양한 세포 수용체들이나 막결합 단백질들에 의해 수용되고 해독된다. 이들 분비 폴리펩티드 또는 신호전달 분자는 대개 세포 분비 경로를 통해 세포외 환경의 자신의 작용 장소, 보통은 막결합 수용체 단백질에 도달하게 된다.

분비 단백질은 제약, 진단, 바이오센서, 생물반응기 등과 같은 다양한 산업적 용도를 갖고 있다. 사실상 현재 이용되는 대부분의 단백질 의약, 예컨데 혈전융해제, 인터페론, 인터루킨, 에리트로포이에틴, 콜로니 자극 인자 및 다양한 다른 사이토킨은 분비 단백질이다. 이들의 수용체인 막결합 단백질도 치료제나 진단제로서 가능성이 있다. 새로운 천연 분비 단백질 및 막결합 수용체 단백질을 찾아내려는 노력이 산업계와 학계에서 이루어지고 있다. 이런 노력 가운데 상당수는 포유동물 재조합 DNA 라이브러리를 스크리닝해서 신규한 분비 단백질 및 막결합 수용체 단백질의 코딩 서열을 찾아내는 데 집중되어 있다. 스크리닝 방법 및 기술의 예는 문헌 (Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93:7108-7113 (1996); 미국특허 제5,536,637호)에 기재되어 있다.

막결합 단백질 및 수용체는 다세포 생물의 형성, 분화 및 유지에 중요한 역할을 담당할 수 있다. 많은 개별 세포의 운명, 예를 들어 증식, 이동, 분화 또는 다른 세포와의 상호작용은 다른 세포로부터 받은 정보 및(또는) 인접 환경에 의해 지배당하는 것이 일반적이다. 이런 정보는 종종 분비된 폴리펩티드 (예를 들면 유사분열 촉진인자, 생존 인자, 세포독성 인자, 분화 인자, 신경 펩티드 및 호르몬)에 의해 전달되어, 결국엔 다양한 세포 수용체들이나 막결합 단백질들에 의해 수용되고 해독된다. 이러한 막결합 단백질과 세포 수용체로는 사이토킨 수용체, 수용체 키나제, 수용체 포스파타제, 세포-세포 상호작용에 관여하는 수용체, 셀렉틴 및 인테그린과 같은 세포 어드헤신 (adhesin) 분자 등을 들 수 있으나 이것으로 국한되는 것은 아니다. 세포 성장 및 분화를 조절하는 신호 도입 (transduction)은 부분적으로 여러 세포 단백질의 인산화를 통해 조절된다. 이 과정을 촉매하는 효소인 단백질 티로신 키나제는 성장인자 수용체로도 작용할 수 있다. 그 예로는 섬유아세포 성장인자 수용체 및 신경 성장인자 수용체 등을 들 수 있다.

막결합 단백질 및 수용체 분자는 제약 및 진단제를 비롯한 다양한 산업적 용도를 갖는다. 예를 들면 수용체 면역어드헤신 (immunoadhesin)는 수용체-리간드 상호작용을 차단하는 치료제로 사용될 수 있다. 막결합 단백질은 또한 관련 수용체/리간드 상호작용의 억제할 수 있는 펩티드 또는 소분자 억제제를 스크리닝하는 데도 사용될 수 있다. 신규한 천연 수용체 단백질을 찾아내려는 학계 및 산업계의 노력이 진행되고 있다. 이런 노력 가운데 상당수는 포유동물 재조합 DNA 라이브러리를 스크리닝해서 신규한 수용체 단백질의 코딩 서열을 찾아내는 데 집중되어 있다.

본 발명자들은 이 명세서에서 신규한 분비 폴리펩티드와 막횡단 (transmembrane) 폴리펩티드 및 이 폴리펩티드를 코딩하는 신규 핵산의 확인 및 특징 분석을 기재했다.

도 1은 천연 서열 PRO351 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 131)이며, 서열 131은 이 명세서에서 "UNQ308" 및(또는) "DNA40571-1315"로 명명되는 클론이다.

도 2는 도 1에 나타낸 서열 131의 코딩 서열에서 유도된 아미노산 서열 (서열 132)이다.

PRO351

프로스타신은 인간 정액으로부터 정제된 신규 인간 세린 프로테이나제이다. 면역조직학적 편재는 프로스타신이 전립선의 관 및 상피 세포에 존재함을 드러낸다. 프로스타신의 cDNA가 클로닝되어 특징분석이 이루어졌다. 역전사 중합효소 연쇄 반응 후에 이루어진 서던 블롯 분석 결과, 프로스타신 mRNA는 전립선, 간, 침샘, 신장, 폐, 이자, 결장, 기관지, 신장 근위 세뇨관 세포 및 전립선 암종 LNCaP 세포에서 발현되는 것으로 나타났다. 프로스타신 mRNA의 세포 편재는 계내 (in situ) 혼성화 조직화학에 의해 인간 전립선의 상피세포 내에서 확인되었다 (Yu et al., J. Biol. Chem. (1994) 269 (29): 18843-18848, Yu et al, J. Biol. Chem. (1994) 270 (22): 13483-13489).

따라서 프로스타신 및 이의 친족 분자는 특히 전립선 관련 의학적 상태의 연구, 진단 및 치료에 있어서 관심의 대상이다. 프로스타신 및 이의 친족 분자는 문헌 (Yu et al., Genomics (1996) 32(3):334-340)에 더 설명되어 있다. 본 발명자들은 이 명세서에서 프로스타신에 대해 상동성이 있는 신규 폴리펩티드 (본원에서는 PRO351 폴리펩티드로 명명함)의 확인 및 특징 분석에 관해 설명한다.

<발명의 요약>

1. PRO351

본 발명자들은 본원에서 "PRO351" 폴리펩티드로 명명된, 프로스타틴과 서열 유사성이 있는 신규 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA 클론을 찾아냈다.

한 실시양태에서 본 발명은 "PRO351" 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 한 측면에서, 이 단리된 핵산 분자는 도 2 (서열132)의 아미노산 잔기 1 내지 571을 갖는 PRO351 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 것이거나, 또는 이 코딩 핵산 서열에 상보적이어서 적어도 중간정도의 엄격 조건 및 경우에 따라 고염격 조건에서 상기 코딩 핵산 서열에 안정하게 결합된 채로 남아있는 것이다. 다른 측면에서, 이 단리된 핵산 분자는 도 2 (서열 132)의 아미노산 잔기 약 16 내지 571을 갖는 PRO351 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 것이거나, 또는 이 코딩 핵산 서열에 상보적이어서 적어도 중간정도의 엄격 조건 및 경우에 따라 고염격 조건에서 상기 코딩 핵산 서열에 안정하게 결합된 채로 남아있는 것이다. 이 단리된 핵산 서열은 PRO351를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 1998년 4월 21일 ATCC 209784로 기탁된 DNA40571-1315 벡터의 cDNA 삽입체를 포함할 수 있다.

다른 실시양태에서 본 발명은 단리된 PRO351 폴리펩티드를 제공한다. 특히 본 발명은 단리된 천연 서열 PRO351 폴리펩티드를 제공하며, 이 경우의 한 실시양태에서 이 폴리펩티드는 도 2 (서열 132)의 잔기 약 16 내지 571을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 실시양태에서 본 발명은 도 2 (서열 132)의 잔기 약 16 내지 571을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 신호 서열이 없는 단리된 PRO351 폴리펩티드를 제공한다. 경우에 따라 PRO351 폴리펩티드는 1998년 4월 21일 ATCC 209784로 기탁된 DNA40571-1315 벡터의 cDNA 삽입체에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 발현시킴으로써 얻어지거나 얻어질 수 있다.

2. 추가의 실시양태

본 발명의 한 실시양태에서는 상기 또는 하기한 폴리펩티드 중 어느 하나를코딩하는 DNA를 포함하는 벡터를 제공한다. 또한 이런 벡터를 포함하는 숙주 세포도 제공된다. 예를 들면 이 숙주 세포는 CHO 세포, 대장균(E. coli), 또는 효모이다. 또한 숙주 세포를 원하는 폴리펩티드의 발현에 적절한 조건에서 배양하여 이 세포 배양물로부터 원하는 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는 원하는 폴리펩티드의 제조 방법도 제공한다.

다른 실시양태에서는 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 상기 또는 하기 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자를 제공한다. 이런 키메라 분자의 예로는 에피토프 태그 서열 또는 면역글로불린의 Fc 영역에 융합된 상기 또는 하기 폴리펩티드 중 어느 하나를 포함한다.

또다른 실시양태에서는 상기 또는 하기 폴리펩티드 중 어느 하나에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 경우에 따라 이 항체는 모노클로날 항체이다.

또다른 실시양태에서는 게놈 및 cDNA 뉴클레오티드 서열을 단리하는 데 사용하기 위한, 상기 또는 하기 뉴클레오티드 서열로부터 유래된 것일 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 제공한다.

Ⅰ.정의

"PRO 폴리펩티드" 및 "PRO"란 본 명세서에 사용된 바와 같이 바로 뒤에 숫자가 붙어서 다양한 폴리펩티드를 의미하는데, 완전한 명칭(즉, PRO/숫자)은 본 명세서에 기재된 특정 폴리펩티드를 의미하는 용어이다. 본 명세서에 사용된 "PRO/숫자 폴리펩티드"는 천연 서열 폴리펩티드 및 폴리펩티드 변이체 (본 명세서에 추가로 정의됨)를 포함하는 용어이다. 본 명세서에 기재된 PRO 폴리펩티드는 인간 조직 또는 다른 출처와 같은 다양한 출처에서 단리되거나 재조합 또는 합성에 의해 제조될 수 있다.

"천연 서열 PRO 폴리펩티드"는 자연으로부터 유도된 대응하는 PRO 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 천연 서열 PRO 폴리펩티드는 자연으로부터 단리할 수 있거나 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조할 수 있다. 용어 "천연 서열 PRO 폴리펩티드"는 구체적으로는 특정 PRO 폴리펩티드 (예를 들어 세포외 도메인 서열), 이러한 폴리펩티드의 천연 변이체 (달리 스프라이싱된 형태) 및 천연 대립 변이체의 천연 말단 절단 (truncated) 또는 분비된 형태를 포함한다. 본 발명의 다양한 실시양태에서, 천연 서열 PRO351 폴리펩티드는 도 2 (서열 132)의 아미노산 1 내지 571을 포함하는 성숙 또는 전장 천연 서열 PRO351 폴리펩티드이다.

PRO 폴리펩티드 "세포외 도메인" 또는 "ECD"란 본질적으로 막횡단 또는 세포질 도메인이 없는 PRO 폴리펩티드의 형태를 의미한다. PRO 폴리펩티드 ECD는 통상 막횡단 및(또는) 세포질 도메인을 1％ 미만으로 포함하며, 바람직하게는 그러한 도메인들을 0.5％ 미만으로 포함한다. 본 발명의 PRO 폴리펩티드에 나타나는 모든 막횡단 도메인은 당업계에서 소수성 도메인 유형을 밝히는 데 통상적으로 사용되는 기준에 준거하여 확인된 것임이 이해될 것이다. 막횡단 도메인의 정확한 경계선은 다를 수 있지만, 대부분은 최초 확인된 도메인의 말단에서 5개 아미노산 범위 내에 존재한다. 따라서, PRO 폴리펩티드의 세포외 도메인은 통상, 최초 확인된 막횡단 도메인 또는 이것에서 아미노산을 5개까지 더 적게 포함한다.

"PRO 폴리펩티드 변이체"는 본원에 개시된 전장 천연 서열 PRO 폴리펩티드 서열과 약 80％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 활성 PRO 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 PRO 폴리펩티드 변이체로는 예를 들어 전장 천연 아미노산 서열의 N 말단 또는 C 말단에 하나 이상의 아미노산 잔기가 부가되거나 결실된 PRO 폴리펩티드 등이 있다. 통상, PRO 폴리펩티드 변이체는 본원에서 개시된 전장 천연 아미노산 서열의 아미노산 서열과 약 80％ 이상, 더 바람직하게는 약 85％ 이상, 더욱더 바람직하게는 약 90％ 이상, 보다 더 바람직하게는 약 91％ 이상, 더욱더 바람직하게는 92％ 이상, 더욱더 바람직하게는 약 93％ 이상, 더욱더 바람직하게는 약 94％ 이상, 더욱더 바람직하게는 약 96％ 이상, 더욱더 바람직하게는 약 97％ 이상, 더욱더 바람직하게는 약 98％ 이상, 가장 바람직하게는 약 99％의 아미노산 서열 동일성을 갖는다.

본원에서 밝혀진 PRO 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 (％)"는 특정 PRO 폴리펩티드 서열와 후보 서열을 정렬하고, 필요한 경우 서열 동일성 퍼센트의 최대치를 얻기 위해 갭을 도입한 후 어떠한 보존적 치환도 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않은 상태에서 특정 PRO 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열의 아미노산 잔기의 비율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 (％)을 측정하기 위한 정렬은 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어 BLAST, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 쉽게 구할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 바람직한 정렬 소프트웨어 프로그램은 BLAST이다. 당업계의 숙련가는 비교되는 서열의 전체 길이에 대해 최대로 정렬시키기위해 필요한 알고리즘을 포함하여 정렬을 측정하기에 적합한 파라미터를 정할 수 있다. 본원에 사용된 동일성 값(％)는 WU-BLAST-2 컴퓨터 프로그램 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-80 (1996); http://blast.wustl/ edu/blast/README.html)를 이용하여 얻었다. WU-BLAST-2 연구 파라미터 대부분은 디폴트값으로 설정했다. 조정가능한 파라미터는 다음 값으로 설정되었다. 오버랩 스팬 = 1, 오버랩 분획 = 0.125, 워드 한계 (T) = 11, 점수 매트릭스 = BLOSUM62. BLAST-2에 의해 사용되는 동력학적 값인 HSP S 및 HSP S2 파라미터는 해당 서열의 조성 및 서열의 연구에 사용되는 데이타베이스의 조성에 따라서 프로그램 자체에 의해 설정된다. 그러나 이 값들을 조정하여 감도를 증가시킬 수 있다. 서열 동일성 (％)는 정렬된 영역의 전체 잔기 수로 매치되는 동일한 잔기를 나눈 값으로 결정된다.

본원에서 확인된 PRO 코딩 핵산과 관련하여 "핵산 서열 동일성 (％)"은 특정 PRO 핵산 서열과 후보 서열을 정렬시키고, 필요한 경우 서열 동일성의 최대치를 얻기 위해 갭을 도입한 후 특정 PRO 핵산 서열의 뉴클레오티드와 동일한, 후보 서열의 뉴클레오티드의 비율로서 정의된다. 핵산 서열 동일성 (％)을 측정하기 위한 정렬은 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어 BLAST, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 쉽게 구할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업계의 숙련가는 비교되는 서열의 전체 길이에 대해 최대로 정렬시키기 위해 필요한 알고리즘을 포함하여 정렬을 측정하기에 적합한 파라미터를 정할 수 있다. 본원에서 사용된 동일성 값은 디폴트값으로 설정된 WU-BLAST-2의BLASTN 모듈에 의해 얻어진다 (이때 오버랩 스팬 및 오버랩 분획은 각기 1 및 0.125로 설정됨).

상기한 바와 같이 수행되는 서열 비교와 관련하여 "양성"이란 용어는 동일하지는 않으나 (예를 들면 보존적 치환의 결과로) 유사한 성질을 갖는, 비교 서열 중의 잔기를 의미한다. 양성 값(％)는 BLOSUM 62 매트릭스에서 양성 값을 기록한 잔기를 상기한 바와 같이 정렬된 영역의 전체 잔기 수로 나눈 값으로 결정된다.

본원에 사용된 "에피토프 태그를 붙인"란 용어는 PRO 폴리펩티드 또는 이의 도메인 서열이 "태그 폴리펩티드"에 융합된 키메라 폴리펩티드를 지칭한다. "태그 폴리펩티드"는 대항하는 항체를 제조할 수 있거나 다른 어떤 작용제에 의해 확인될 수 있는 에피토프를 제공하기에 충분한 잔기를 갖지만, 해당 PRO 폴리펩티드의 활성을 방해하지 않을 정도로는 충분히 짧다. 태그 폴리펩티드는 아주 독특해서 그 항체가 다른 에피토프와는 실질적으로 가교반응하지 않는 것이 바람직하다. 적절한 태그 폴리펩티드는 일반적으로 6개 이상의 아미노산을 가지며, 통상 약 8 내지 약 50개의 아미노산 잔기를 갖는다 (바람직하게는 약 10 내지 약 20개의 잔기).

본원에 개시된 다양한 폴리펩티드를 기술하기 위해 사용된 "단리된"은 폴리펩티드가 확인되고, 그 자연 환경 요소로부터 분리 및(또는) 회수되었음을 의미한다. 폴리펩티드의 자연 환경의 오염 요소는 이 폴리펩티드의 진단 또는 치료적 사용을 일반적으로 방해하는 물질로서, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질 등이 있을 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 (1) 스피닝컵 서열결정기를 사용하여 N 말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를얻기에 충분한 정도로 정제하거나, 또는 (2) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 비환원 또는 환원 조건 하에 SDS-PAGE에서 하나의 밴드만 나타날 정도로 정제될 수 있다. 단리된 폴리펩티드는 PRO 폴리펩티드 자연 환경의 하나 이상의 요소가 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내에 존재하는 폴리펩티드를 포함한다. 그러나, 통상 단리된 폴리펩티드는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

"단리된" PRO 폴리펩티드 핵산은 이 핵산 분자가 PRO 폴리펩티드 핵산의 천연 출처에서 통상 결합되는 하나 이상의 오염 핵산 분자로부터 확인 및 분리된 핵산 분자이다. 단리된 PRO 폴리펩티드 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 상태와 다르게 존재한다. 따라서, 단리된 PRO 폴리펩티드 핵산 분자는 천연 세포에 존재하는 특정 PRO 폴리펩티드 핵산 분자와 구별된다. 그러나, 단리된 PRO 폴리펩티드 핵산 분자는 예를 들어 핵산 분자가 천연 세포와 상이한 염색체 위치에 존재하는, PRO 폴리펩티드를 통상 발현하는 세포에 포함된 PRO 폴리펩티드 핵산 분자를 포함한다.

용어 "조절 서열"이란 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열이다. 원핵생물에 적절한 조절 서열은 예컨데 프로모터, 경우에 따라 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결함 위치를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 사용하는 것으로 알려져 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들면, 전서열 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩티드가 분비에 관여하는 전단백질로서 발현되는 경우 그 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 그것이 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며, 리보좀 결합 부위는 그것이 번역을 촉진하는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 인접하여 위치하고, 분비 리더의 경우 인접하여 위치할 뿐만 아니라 동일한 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접하여 위치할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 사용한다.

용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로는 하나의 항-PRO 폴리펩티드 모노클로날 항체 (아고니스트, 길항제 및 중화 항체 포함) 및 폴리에피토프 특이성을 갖는 항-PRO 폴리펩티드 항체 조성물을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종 항체들의 집단으로부터 얻은 항체를 의미하며, 즉, 집단을 이루는 개별적인 항체들은 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생적 돌연변이를 제외하고는 동일하다.

본원에서 사용된 "활성을 갖는" 또는 "활성"은 특정 천연 또는 PRO 폴리펩티드의 생물학적 및(또는) 면역학적 활성을 보유하는 PRO 폴리펩티드의 형태(들)을 의미한다.

"처치"는 치료 처치와 예방 또는 방지 조치를 모두 나타낸다. 처치를 요하는 대상은 이미 질환을 갖고 있는 대상 뿐만 아니라 질환을 방지하고자 하는 대상을 포함한다.

처치를 위한 "포유동물"은 인간, 가축과 사육 동물, 비인간 영장동물, 및 동물원용, 경기용 또는 애완용 동물, 예를 들면, 개, 말, 고양이, 소 등을 포함하는 포유동물로서 분류되는 모든 동물을 의미한다.

본원에서 사용되는 "담체"는 사용되는 투여량 및 농도에 노출되는 세포 또는 포유동물에 비독성인 제약상 허용되는 담체, 부형제, 안정화제를 포함한다. 생리학상 허용되는 담체는 pH 완충 수용액이다. 생리학상 허용되는 담체의 예는 포스페이트, 시트레이트, 다른 유기산과 같은 완충액, 아스코르브산을 포함하여 항산화제, 저분자량 (약 10 잔기 미만) 폴리펩티드, 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린, 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈, 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신, 단당류, 이당류 및 기타 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 탄수화물, 킬레이팅제, 예를 들어 EDTA, 당 알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨, 염 형성 카운터 이온, 예를 들어 나트륨, 및(또는) 비이온계 계면활성제, 예를 들어 TWEEN^TM, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 PLURONICS^TM를 포함한다.

용어 "아고니스트"는 본 발명의 천연 PRO 폴리펩티드 (여기서 천연 PRO 폴리펩티드는 프로-PRO 폴리펩티드, 프리-PRO 폴리펩티드, 프리프로-PRO 폴리펩티드 또는 성숙 PRO 폴리펩티드를 의미함)의 펩티드 및 비펩티드 유사체, 및 천연 PRO 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체로서 천연 PRO 폴리펩티드의 하나 이상의 생물학적 활성을 보유하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명의 아고니스트는 천연 PRO 폴리펩티드의 질적 결합 인식 특성 및 수용체 활성화 특성을 보유한다.

용어 "길항제"는 본 발명의 천연 PRO 폴리펩티드 (여기서 천연 PRO 폴리펩티드는 프로-PRO 폴리펩티드, 프리-PRO 폴리펩티드, 프리프로-PRO 폴리펩티드 또는 성숙 PRO 폴리펩티드를 의미함)의 생물학적 활성을 억제하는 분자를 의미한다. 바람직하게는, 본원에서 사용되는 길항제는 본 발명의 천연 PRO 폴리펩티드의 결합하을 억제한다. 바람직한 길항제는 자신이 결합하는 PRO 폴리펩티드에 대한 천연 PRO 폴리펩티드의 결합을 본질적으로 완전히 차단한다. 상기 수용체는 TGF 거대족에 대해 확인된 타입 I 및 타입 II, 및 가능하게는 타입 III 수용체를 포함할 수 있다 (Kolodziejczyk and Hall, 상기 문헌). PRO 폴리펩티드 "길항제"는 PRO 길항제 효과 기능을 억제하거나 방해하는 분자 (예를 들어 PRO 폴리펩티드에 의한 PRO 폴리펩티드 수용체의 결합 및(또는) 활성화를 억제 또는 방해하는 분자)이다. 상기 분자는 예를 들어 시험 길항제 분자의 존재 및 부재시에 천연 PRO 폴리펩티드의 결합을 모니터링함으로써 PRO 폴리펩티드 수용체 활성화를 경쟁적으로 억제하는 능력에 대해 스크리닝할 수 있다. PRO 폴리펩티드의 예는 F-2에 대한 중화 항체를 포함한다. 본 발명의 길항제는 또한 PRO 폴리펩티드 유전자으의 전사 또는 번역을 차단하여 그의 발현 및 생물학적 활성을 억제하는, PRO 폴리펩티드 유전자에 대한 안티센스 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

혼성화 반응의 "엄격도"는 당업자가 용이하게 결정할 수 있으며, 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도, 염 농도에 따라 달라지는 실험적 계산값이다. 일반적으로 긴 프로브일수록 적절한 어닐링에 높은 온도를 필요로하며, 짧은 프로브일수록 낮은 온도를 필요로 한다. 혼성화는 일반적으로 변성된 DNA가 상보적 가닥이 존재할 때 그들의 용융 온도 보다 낮은 환경에서 재어닐링되는 능력에 따라 달라진다. 프로브와 혼성화가능한 서열 사이의 원하는 상동성의 정도가 높다면, 사용할 수 있는 상대적인 온도도 높다. 따라서, 높은 상대적 온도일수록 반응 조건을 더 엄격하게 만들며, 낮은 온도일수록 덜 엄격한 조건을 만든다. 혼성화 반응의 엄격도와 관련한 더 자세한 사항 및 설명은 문헌 (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995))을 참조한다.

"엄격 조건"이란 (1) 세척시 이온 세기가 낮고 온도가 높은 조건, 예를 들면 0.015 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1％ 나트륨 도데실 술페이트를 50 ℃에서 사용하는 조건, 또는 (2) 혼성화시에 42 ℃에서 0.1％ 소혈청 알부민/0.1％ 피콜/0.1％ 폴리비닐피롤리돈/750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨이 함유된 50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.5)이 함유된 50％ (vol/vol) 포름아미드 등의 포름아미드와 같은 변성제를 사용하는 조건을 의미한다. 또다른 예는 50％ 포름아미드, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1％ 피로인산 나트륨, 5 x Denhardt's 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA (50 ㎍/ml), 0.1％ SDS, 및 10％ 덱스트란 술페이트를 42 ℃에서 사용하고, 0.2 x SSC 및 0.1％ SDS로 42 ℃에서 세척하는 것이다. 또다른 예는 10％ 덱스트란 술페이트, 2 x SSC (염화나트륨/시트르산 나트륨) 및 50％ 포름아미드의 완충액을 사용하여 55 ℃에서 혼성화한 후, 55 ℃에서 EDTA가 함유된 0.1 x SSC로 이루어진 고엄격세척을 수행하는 것이다.

"중간정도의 엄격 조건"이란 Sambrook 등의 상기 문헌에 기재된 바와 같고, 예컨대 상기한 것보다 엄격성이 낮은 혼성화 조건 (예를 들어 온도, 이온 세기 및 SDS 비율) 및 세척액의 사용을 들 수 있다. 중간정도의 엄격 조건의 예는 20％ 포름아미드, 5 x SSC (150 mM 염화나트륨, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5 x Denhardt 용액, 10％ 덱스트란 술페이트 및 20 mg/ml의 전단변형시킨 변성 연어 정액 DNA를 포함하는 용액 중에서 37℃에서 철야 인큐베이션한 후 필터를 약 37 내지 50℃에서 1 x SSC로 세척하는 조건이다. 당업계의 숙련가는 프로브 길이 등과 같은 인자를 조정하기 위해 필요한 온도, 이온 세기 등을 조절하는 방법을 잘 알 것이다.

"서던 분석" 또는 "서던 블롯팅"은 DNA 또는 DNA 함유 조성물의 제한 엔도뉴클레아제 분해물 중에 DNA 서열의 존재 여부를 공지의 표지된 올리고뉴클레오티드 또는 DNA 단편에 대한 혼성화에 의해 확인하는 방법이다. 서던 분석은 일반적으로 아가로오스 겔 상에서 DNA 분해물을 전기영동에 의해 분리하고 전기영동에 의한 분리 후에 DNA의 변성시키고, 니트로셀룰로스, 나일론 또는 분석에 적합한 다른 막 지지체로의 DNA의 이송하여, 방사성 표지되거나 바이오티닐화되거나 효소 표지된 프로브로 분석하는 과정을 수반한다 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, section 9.37-9.52, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

"노던 분석" 또는 "노던 블롯팅"은 올리고뉴클레오티드, DNA 단편, cDNA 또는 그의 단편 또는 RNA 단편과 같은 공지 프로브에 혼성화하는 RNA 서열을 확인하는 데 사용되는 방법이다. 프로브는³²P와 같은 방사성 동위원소 또는 바이오티닐화 또는 효소로 표지된다. 분석되는 RNA는 일반적으로 아가로오스 또는 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동에 의해 분리되고, 니트로셀룰로스, 나일론 또는 다른 적합한 막에 이송된 후, Sambrook 등의 상기 문헌 중 7.39-7.52 부분에 기재된 것과 같은 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 프로브에 혼성화된다.

본원에 사용된 용어 "면역어드헤신"은 면역글로불린 불변 도메인의 이펙터 기능과 이종 단백질 (어드헤신)의 결합 특이성을 겸비한 항체 유사 분자를 지칭한다. 구조적으로 보면 면역어드헤신은 항체의 항원 인식 및 결합 부위 이외의 원하는 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열과 면역글로불린 불변 도메인 서열과의 융합체를 포함한다. 면역어드헤신 분자의 어드헤신 부분은 전형적으로 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 최소한 포함하는 인접 아미노산 서열이다. 면역어드헤신 중 면역글로불린 불변 도메인 서열은 IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-4 서브타입, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD 또는 IgM 등의 임의의 면역글로불린으로부터 얻을 수 있다.

"만성" 투여란 급성 방식과 반대로 연속 방식으로 작용제(들)를 투여하여, 초기 치료 효과 (활성)를 장기간 동안 유지하는 것을 말한다. "간헐적" 투여는 중단없이 계속해서 행하는 것이 아니라 성질상 주기적으로 이루어지는 처치를 의미한다.

하나 이상의 다른 치료제와 "병행하여" 투여된다는 것은 동시에 투여하거나 어떤 순서로든 연속하여 투여하는 것을 포괄한다.

"발현 벡터"란 본원의 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 이의 발현에 영향을 줄 수 있는, 숙주 세포에 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 벡터를 정의하는 것으로 사용된다. 벡터는 통상적으로 복제 개시점 (이것은 염색체 통합이 일어나는 경우에는 필요하지 않음)을 보유한다. 발현 벡터는 또한 형질전환된 세포에서 표현형 선별을 가능하게 하는 마커 서열을 포함한다. 예를 들어 대장균은 통상 대장균 종으로부터 유래된 플라스미드인 pBR322로 형질전환된다 (Bolivar et al., Gene 2: 95 (1997)). pBR322는 암피실린 및 테트라사이클린 내성 유전자를 포함하기 때문에 클로닝 또는 발현의 목적이든 형질전환된 세포를 확인하는 용이한 수단을 제공한다. 또한 발현 벡터는 최적으로는, 전사 및 번역을 조절하는 데 유용한 서열, 예를 들면, 프로모터 및 샤인-달가르노 서열 (원핵세포의 경우) 또는 프로모터와 인핸서 (포유동물 세포의 경우)를 포함한다. 프로모터는 유도성 프로모터로 제한되는 것은 아니지만 유도성일 수 있으며, 포유동물 숙주를 위해서는 CMV 프로모터와 같은 훨씬 강력한 구성적 프로모터가 숙주 세포 독성 없이 LHR을 생성할 수 있는 것으로 발견되었다. 발현 벡터가 어떠한 발현 조절, 복제 서열 또는 선별 유전자를 포함하지 않는 것도 생각할 수 있으나, 이들이 없다면 하이브리드 형질전환체의 확인 및 고수준 하이브리드 면역글로불린 발현의 달성이 어려울 것이다.

"리포폴리사카라이드" 또는 "LPS"란 용어는 "엔도톡신"과 동의어로 이 명세서에 사용된다. 리포폴리사카라이드 (LPS)는 대장균 (E. coli)과 같은 그램 음성 세균의 외막의 특징적 성분이다. 이들은 다당류 부분과 리피드 A라 불리는 지방 부분으로 구성된다. 다당류는 세균 종마다 달라지며, O-특이적 쇄 (3 내지 8개의 당의 반복 유닛으로 구성됨) 및 2부 코어로 이루어진다. 리피드 A는 실제로 항상 인산기 및 다양한 수의 지방산에 의해 변형된 두 개의 글루코사민 당을 포함한다. 추가의 정보는 예를 들면 문헌 (Rietschel and Brade, Scientific American August 1992, 54-61)을 참조한다.

"폐혈증성 쇼크"란 용어는 최광의 의미로 이 명세서에 사용하며, 문헌 (Bone, Ann. Intern Med. 114, 332-333 (1991))에 개시된 모든 정의를 포함한다. 구체적으로는 폐혈증성 쇼크는 감염에 대한 전신 반응인 폐혈증이란 증후군과 함께 시작된다. 이 증후군은 저혈압 및 기관 부전을 초래하며, 이를 폐혈증성 쇼크라 한다. 폐혈증성 쇼크는 그램 양성 유기체 및 진균에 의해서 뿐만 아니라, 엔도톡신을 갖는 그램 음성 유기체에 의해서도 개시될 수 있다. 따라서, 이 정의는 "엔도톡신 쇼크"로 한정되지 않는다.

"유전자 증폭" 및 "유전자 복제 (duplication)"는 서로 바꿔 사용할 수 있고, 특정 세포 또는 세포주에서 유전자 또는 유전자 단편의 복제본이 여러 개 형성되는 과정을 말한다. 복제된 영역 (증폭된 DNA 스트레치)는 종종 "암플리콘 (amplicon)"으로 불린다. 통상적으로 생성되는 mRNA의 양, 즉 유전자 발현량은 발현되는 특정 유전자의 복제본의 개수에 비례한다.

본원에 사용된 "종양"은 악성이든 양성이든 모든 신생물 세포 성장 및 증식,및 모든 예비암성 및 암성 세포 및 조직을 일컫는다. 용어 "암" 및 "암성"은 미조절된 세포 증식이라는 전형적 특징을 갖는 포유동물의 생리 상태를 의미하거나 규정한다. 암의 예로는 암종, 임파종, 아세포종, 육종 및 백혈병을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 암의 보다 구체적인 예는 유방암, 전립선암, 결장암, 판상 세포암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 위장암, 췌장암, 신경교아종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 결장직장암, 자궁내막암, 타액선암종, 신장암, 외음부암, 갑상선암, 간암종 및 여러 종류의 두부 및 경부 암을 포함한다.

용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 저해하거나 억제하고(하거나) 세포를 파괴시키는 물질을 의미한다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어 I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰및 Re¹⁸⁶), 화학요법제 및 독소, 예를 들면 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성을 갖는 독소 또는 그의 단편을 포함하는 것을 의미한다.

"화학요법제"는 암 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 이의 예는 아드리아마신, 독소루비신, 에피루비신, 5-플루오로우라실, 시토신 아라비노시드 ("Ara-C"), 시클로포스파미드, 티오테파, 부술판, 시톡신, 탁소이드, 예를 들면 파클리탁셀 (등록상표명 탁솔, 미국 뉴저지주 프린스톤에 위치한 브리스톨마이어스스큅 온콜로지사 제품) 및 독세탁셀 (탁소테레 Taxotere, 프랑스 안토니에 위치한 롱플랑 로레아사 제품), 톡소테레, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 멜팔란, 빈블라스틴, 블레오마이신, 에토포시드, 이포스파미드, 미토마이신 C, 미톡산트론, 빈크리스틴, 비노렐빈, 카르보플라틴, 테니포시드, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신, 에스페라미신 (미국 특허 제4,675,187호 참조), 멜팔란 및 다른 관련 질소 머스타드를 포함한다. 또한, 타목시펜 및 오나프리스톤과 같은 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 호르몬 제제도 상기 화학요법제의 정의에 포함된다.

"증식 억제제"는 세포, 특히 ErbB2 과다발현 암세포의 시험관 내 또는 체내 증식을 억제하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 따라서, 성장 억제제는 ErbB2 과다발현 세포의 S기 비율을 크게 감소시키는 물질이다. 성장 억제제의 예는 세포 주기 진행을 (S기 이외의 시기에서)차단하는 물질, 예를 들어 G1 정지 및 M기 정지를 유도하는 물질을 포함한다. 전통적인 M기 차단제로는 빈카스 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁솔, 및 토포 II 억제제, 예를 들어 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신 등이 있다. 또한, G1을 정지시키는 물질, 예를 들어 DNA 알킬화제, 예를 들어 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메톡트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 아라-C는 S기 정지에도 작용한다. 추가 정보는 문헌 [Murakami et al., The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., "Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs" (WB Saunders: Philadelphia, 1995), Chapter 1, 특히 13면]에 기재되어 있다.

"독소루비신"은 안트라사이클린 항생제이다.

"사이토킨"은 하나의 세포 군집에 의해 방출되는, 세포간 매개제로서 다른 세포에 대해 작용하는 단백질의 일반 명칭이다. 이러한 사이토킨의 예는 임포킨,모노킨 및 전통적인 폴리펩티드 호르몬이다. 사이토킨에는 성장 호르몬, 예를 들어 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 렐락신; 프로렐락신 등이 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 사이토킨은 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질 및 천연 서열 사이토킨의 생물학적 활성 등가물을 포함한다.

"천연 항체" 및 "천연 면역글로불린"은 일반적으로 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성되는 약 150,000 달톤의 헤테로테트라머의 당단백질이다. 각각의 경쇄는 하나의 디술피드 공유결합에 의해 중쇄에 연결되고, 디술피드 결합의 개수는 상이한 면역글로불린 이소형의 중쇄 사이에서 변한다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄는 규칙적 간격으로 사슬 내부의 디술피드 결합을 갖는다. 각각의 중쇄는 한 말단에 가변 도메인(V_H) 및 이 도메인에 후속하는 많은 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 한 말단에 가변 도메인(V_L) 및 다른 말단에 불변 도메인을 갖고, 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 한줄로 위치하고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 한줄로 위치한다. 특정 아미노산 잔기들이 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 생각된다.

용어 "가변"은 항체들 간에 가변 도메인의 특정 부분의 서열이 크게 상이하고 그 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다는 사실을 의미한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 걸쳐 균일하게 분포되지 않는다. 가변성은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두의 상보성 결정 영역 (CDR) 또는초가변 영역으로 불리는 3개의 세그먼트에 집중된다. 가변 도메인에서 보존도가 보다 높은 부분은 프레임워크 영역(FR)이라 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은, 루프 연결을 형성하며 어떤 경우에는 β-시트 구조의 일부를 이루는 3개의 CDR에 의해, 주로 β-시트의 입체형태인 프레임워크 영역 4개가 연결되어 이루어진다. 각 사슬 내의 CDR은 FR 영역에 의해 서로 매우 근접하게 유지되고, 다른 사슬의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다 (Kabat et al., NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, pages 647-669 (1991) 참조). 불변 도메인은 항체의 항원 결합시에 직접 관여하지 않지만, 항체 의존적 세포의 세포독성에서 항체의 참가와 같은 상이한 이펙터 기능을 보인다.

"항체 단편"은 온전한 항체의 일부로 이루어지며, 바람직하게는 온전한 항체의 항원 결합 영역 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 디아바디, 선형 항체 (Zapata et al., Protein Eng. 8 (10):1057-1062 (1995), 단쇄 항체 분자, 항체 단편으로부터 형성된 다특이성 항체 등이 있다.

항체를 파파인 분해하면 2개의 동일한 항원 결합 단편, 즉 항원 결합 부위를 하나씩 갖는 "Fab" 단편, 및 쉽게 결정화되는 능력을 반영하여 이름 붙여진 나머지 "Fc" 단편이 생성된다. 펩신을 처리하면, 2개의 항원 결합 부위를 가지며 여전히 항원에 교차결합할 수 있는 F(ab')₂단편이 생성된다.

"Fv"는 완전한 항원 인식 및 항원 결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 단단하게 비공유결합된 하나의 중쇄 가변 도메인과 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. 이것은 각 가변 도메인의 CDR 3개가 상호작용하여 V_H-V_L이량체의 표면 상의 항원 결합 부위를 한정하는 배열로 존재한다. 결론적으로 보면, 6개의 CDR이 항체에 대한 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 하나의 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 단지 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)의 경우에도 전체 결합 부위보다 친화성은 낮지만 항원을 인식하여 항원에 결합하는 능력을 갖는다.

또한, Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역에서 유래한 하나 이상의 시스테인을 포함하여 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇개의 잔기가 첨가되었다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 보유하는 Fab'를 의미한다. F(ab')₂항체 단편은 본래 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 몇쌍의 Fab' 단편으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 공지되었다.

임의의 척추동물종으로부터 유래한 항체(면역글로불린)의 "경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 2개의 명백하게 상이한 종류 중의 하나로 분류될 수 있다.

중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 클래스로 분류될 수 있다. 면역글로불린에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5개의 주요클래스가 존재하고, 이들 중 몇 개는 서브클래스(이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 추가 분류될 수 있다.

"단일쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 사슬 중에 존재하는 항체의 V_H및 V_L도메인을 포함한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합에 필요한 구조를 형성하도록 하는 V_H및 V_L도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 포함한다(sFv에 관해서는 문헌 (Plueckthan in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg 및 Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)) 참조).

용어 "디아바디 (diabody)"는 동일한 폴리펩티드 사슬 (V_H-V_L) 내의 경쇄 가변 도메인(V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (V_H)을 포함하는, 2개의 항원 결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 의미한다. 동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이의 페어링을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용하여, 도메인을 다른 사슬의 상보성 도메인과 강제로 페어링시켜 2개의 항원 결합 부위를 생성시킨다. 디아바디는 예를 들어 EP 404,097, WO93/11611 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)에 보다 상세하게 기재되어 있다.

"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 요소로부터 확인 및 분리 및(또는) 회수된 항체이다. 그의 천연 환경의 오염 요소는 항체의 진단 또는 치료적 사용을 방해하는 물질로서, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법에 의해 측정시95 중량％ 초과, 가장 바람직하게는 99 중량％ 초과의 항체로, 또는 (2) 스피닝 컵(spinning cup) 서열분석기를 사용하여 N 말단 또는 내부 아미노산의 잔기 15개 이상을 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루, 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 하나의 밴드로 정제될 것이다. 단리된 항체는 그 항체의 천연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에, 재조합 세포 내의 원위치에서의 항체이다. 그러나, 단리된 항체는 일반적으로 하나 이상의 정제 단계에 의해 정제될 것이다.

"표지 (label)"은 이 명세서에 사용될 때, 항체에 직간접적으로 접합되어 "표지된" 항체를 생성시키는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지는 그 자체로 (방사성동위원소 또는 형광 표지) 검출될 수 있거나, 효소 표지인 경우에는 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매할 수 있다.

"고상 (solid phase)"은 본 발명의 항체가 부착될 수 있는 비수성 매트릭스를 의미한다. 고상의 예는 부분적으로 또는 완전하게 유리 (예를 들어 세공 조절된 유리), 폴리사카리이드 (예를 들어 아가로스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알콜 및 실리콘을 포함한다. 특정 실시양태에서, 내용에 따라 고상은 분석 플레이트의 웰을 포함할 수 있다. 즉, 고상은 정제 컬럼 (예를 들어 친화도 크로마토그래피 컬럼)이다. 이 용어는 또한 미국 특허 제4,275,149호에 기재된 것과 같은 별개 입자의 비연속적 고상을 포함한다.

"리포솜"은 지질, 인지질 및(또는) 계면활성제로 이루어진 소낭이며, 약물을 포유동물에게 전달하는 데 유용한다. 리포솜의 성분은 통상적으로 생체막의 지질정렬과 유사하게 정렬되어 이중층을 형성할 수 있다.

II. 본 발명의 조성물 및 방법

1. 전장 PRO351 폴리펩티드

본 발명은 본원에서 PRO351로 언급되는 폴리펩티드를 코딩하는 새로이 확인되고 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히 본 발명자들은 아래의 실시예에서 보다 상세하게 설명된 바와 같이, PRO351 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 확인하고 단리했다. BLAST 및 FastA 서열 정렬 컴퓨터 프로그램을 사용하여 전장 PRO351 폴리펩티드의 아미노산 서열을 분석한 결과는 PRO351 폴리펩티드의 여러 부분이 프로스타틴 단백질에 상당한 서열 상동성을 가짐을 암시한다. 이는 PRO351이 신규 프로스타틴 단백질일 수 있음을 의미한다. 더 구체적으로는, 데이호프 (Dayhoff) 데이타베이스 (버전 35.45 SwissProt 35)의 분석은 PRO351 아미노산 서열과 다음의 데이호프 서열 사이에 상당한 서열 유사성을 입증했다: "AC003965_1", "CELC07G1_7", "GEN12917", "HEPS_HUMAN", "GEN14584", "MCT6_MOUSE", "HSU75329_1", "PLMN_ERIEU", "TRYB_HUMAN", 및 "PW22987". 따라서, 본원에 개시된 PRO351 폴리펩티드는 프로스타틴족의 새로 밝혀진 구성원이며, 프로스타틴족의 전형적인 생체 활성을 갖는 것으로 현재 생각된다.

2. PRO 폴리펩티드 변이체

본원에서 설명되는 전장 천연 서열 PRO 폴리펩티드 외에, PRO 폴리펩티드 변이체를 제조할 수 있다. PRO 폴리펩티드 변이체는 적합한 뉴클레오티드 변화를 PRO 폴리펩티드 DNA에 도입하거나 또는 목적 PRO 폴리펩티드의 합성에 의해 제조할수 있다. 당업계의 숙련가는 글리코실화 부위의 수 또는 위치의 변경 또는 막 앵커링 특성의 변화와 같은 아미노산 변화가 RPO 폴리펩티드의 번역후 프로세싱을 변경시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다.

본원에서 설명되는 전장 천연 서열 PRO 폴리펩티드 또는 PRO 폴리펩티드의 상이한 도메인에서의 변이는 예를 들어 미국 특허 제5,364,934호에 개시된 보존적 및 비보존적 돌연변이 기술 및 지침을 사용하여 제조할 수 있다. 변이는 천연 서열 PRO 폴리펩티드와 비교시에 PRO 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키는, PRO 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 임의로, 변이는 PRO 폴리펩티드의 하나 이상의 도메인 내의 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환함으로써 생성된다. 목적 활성에 유해한 효과를 주지 않으면서 삽입, 치환 또는 결실될 수 있는 아미노산은 PRO 폴리펩티드의 서열을 공지의 상동성 단백질 분자의 서열과 비교하고 상동성이 높은 영역에서 생성된 아미노산 서열 변화의 수를 최소화함으로써 결정할 수 있다. 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 유사한 구조 및(또는) 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환, 예를 들어 루이신의 세린으로의 치환, 즉 아미노산의 보존적 치환의 결과일 수 있다. 삽입 또는 결실은 1 내지 5개의 아미노산에서 발생할 수 있다. 허용되는 변이는 서열 내에 아미노산을 삽입, 결실 또는 치환시키고 하기 실시예에서 설명되는 시험관내 분석법으로 생성 변이체의 활성을 시험함으로써 정할 수 있다.

보존적 치환은 바람직한 치환의 표제 하에 표 1에 나타내었다. 이러한 치환에 의해 생물학적 활성의 변화가 이루어지면, 하기 표 1에서 치환예로서 나타내거나 아미노산 종류에 대해서 추후 상세하게 설명하는 보다 실질적인 치환을 도입하고 생성물을 스크리닝했다.

PRO 폴리펩티드의 기능 또는 면역학적 특성의 실질적인 변형은 (a) 치환 영역에서의 폴리펩티드 백본의 구조를, 예를 들어 시트 또는 나선 형태로서 유지하거나, (b) 표적 부위에서의 분자의 하전 또는 소수성을 유지하거나, 또는 (c) 대부분의 측쇄를 유지하는 그의 효과를 상당히 변경시키는 치환을 선택함으로써 수행된다. 천연 잔기는 일반적인 측쇄 특성에 따라 다음과 같은 군으로 구분된다:

(1) 소수성: norleucine, met, ala, val, leu, ile;

(2) 중성 친수성: cys, ser, thr, asn, gln;

(3) 산성: asp, glu;

(4) 염기성: his, lys, arg;

(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및

(6) 방향족; trp, tyr, phe.

비보존적 치환은 상기 한 종류의 구성 성분을 다른 종류의 것으로 교환시킬 것이다. 이렇게 치환되는 잔기는 보존적 치환 부위에 도입될 수 있거나 또는 보다 바람직하게는 나머지 (비보존) 부위에 도입될 수 있다.

변이는 올리고뉴클레오티드 매개 (위치 지정) 돌연변이 유발법, 알라닌 스캐닝 및 PCR 돌연변이 유발법과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수있다. 위치 지정 돌연변이 유발법 [Carter et al., PNAS USA 89, 4285 (1992); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)], 카세트 돌연변이 유발법 [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)], 제한 선택 돌연변이 유발법 [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] 또는 다른 공지의 기술을 클로닝된 DNA에 실시하여 목적하는 PRO 폴리펩티드 변이체 DNA를 제조할 수 있다.

또한, 스캐닝 아미노산 분석을 사용하여 인접 서열을 따라 하나 이상의 아미노산을 확인할 수 있다. 바람직한 스캐닝 아미노산은 비교적 작은 중성 아미노산이다. 이러한 아미노산은 알라닌, 글리신, 세린 및 시스테인을 포함한다. 알라닌은 베타-탄소 밖의 측쇄를 제거하고 변이체의 주쇄 배열을 변경시킬 가능성이 작기 때문에 바람직한 스캐닝 아미노산이다. 또한, 알라닌은 가장 흔한 아미노산이기 때문에 바람직하다. 또한, 알라닌은 파묻힌 위치 및 노출된 위치 모두에서 빈번하게 발견된다 [Creghton, The Proteins, (W.H. Freeman ＆ Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. 알라닌 치환이 적당한 양의 변이체를 생성시키지 않으면, 동배체(isoteric) 아미노산을 사용할 수 있다.

3. PRO 폴리펩티드의 변형

PRO 폴리펩티드의 공유결합 변형은 본 발명의 범위에 포함된다. 공유결합 변형의 한 형태는 PRO 폴리펩티드의 선택된 측쇄 또는 N 말단 또는 C 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 PRO 폴리펩티드의 표적 아미노산 잔기를 반응시키는 것을 포함한다. 이관능성 작용제를 사용한 유도체화는 예를 들어 항-PRO 폴리펩티드 항체 정제 방법에 사용하기 위한 수불용성 지지체 매트릭스 또는 표면에 PRO 폴리펩티드를 가교결합시키거나 그 반대로 가교결합시키는데 유용하다. 통상 사용되는 가교결합제는 예를 들어 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어 4-아지도살리시클릭산과의 에스테르, 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)와 같은 디숙신이미딜 에스테르를 포함하는 동종이관능성 이미도에스테르, 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄과 같은 이관능성 말레이미드 및 메틸-3[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 물질을 포함한다.

다른 변형은 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의 각각 대응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로의 탈아미드화, 프롤린 및 리신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 알파-아미노기의 메틸화[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties,W.H. Freeman ＆ Co., San Francisco, pp. 79-86(1983)], N-말단 아민의 아세틸화 및 C-말단 카르복실기의 아미드화를 포함한다.

본 발명의 범위 내에 포함되는 PRO 폴리펩티드의 공유결합 변형의 다른 종류는 폴리펩티드의 천연 글리코실화 패턴의 변화를 포함한다. "천연 글리코실화 패턴의 변화"은 천연 서열 PRO 폴리펩티드에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실 및(또는) 천연 서열 PRO 폴리펩티드에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가를 의미한다.

PRO 폴리펩티드에 대한 글리코실화 부위의 부가는 아미노산 서열의 변화에 의해 달성될 수 있다. 변화는 예를 들어 천연 서열 PRO 폴리펩티드에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 치환에 의해 이루어질 수 있다 (O-연결 글리코실화 부위의 경우). PRO 폴리펩티드 아미노산 서열은 특히 목적 아미노산으로 번역되는 코돈을 생성시키도록 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 미리 선택된 염기에서 돌연변이시킴으로써 DNA 수준에서의 변화를 변화를 통하여 임의로 변화시킬 수 있다.

PRO 폴리펩티드 상의 탄수화물 잔기의 수를 증가시키는 다른 수단은 글리코시드를 폴리펩티드에 화학적으로 또는 효소에 의해 커플링시키는 것이다. 이러한 방법은 예를 들어 1987년 9월 11일 공개된 WO 87/05330 및 문헌 [Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)]에 기재되어 있다.

PRO 폴리펩티드에 존재하는 탄수화물 잔기의 제거는 화학적으로 또는 효소에 의해 또는 글리코실화 표적으로 기능하는 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈의 돌연변이에 의한 치환에 의해 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52(1987) 및 Edge et al., Anal. Biochem., 118:131(1981)]에 기재되어 있다. 폴리펩티드 상의 탄수화물 잔기의 효소에 의한 절단은 다양한 엔도글리코시다제 및 엑소글리코시다제를 사용하여 달성할 수 있다 [Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350(1987)].

본 발명의 PRO 폴리펩티드의 공유결합 변형의 다른 종류는 미국 특허 제4,640,835호, 동 제4,496,689호, 동 제4,301,144호, 동 제4,670,417호, 동 제4,791,192호 및 동 제4,179,337호에 기재된 방식으로 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌 중의 하나에 PRO 폴리펩티드를 연결시키는 것을 포함한다.

또한, 본 발명의 PRO 폴리펩티드는 다른 이종성 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 PRO 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방식으로 변성될 수 있다. 다른 실시양태에서, 이러한 키메라 분자는 항-태그 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와 PRO 폴리펩티드의 융합체를 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 PRO 폴리펩티드의 아미노 또는 카르복실 말단에 위치한다. 상기 에피토프 태그를 갖는 형태의 PRO 폴리펩티드의 존재는 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 또한, 에피토프 태그를 도입하면 항-태그 항체 또는 에피토프 태그에 결합하는 다른 종류의 친화도 매트릭스를 사용한 친화도 정제에 의해 PRO 폴리펩티드를 용이하게 정제할 수 있다. 다른 실시양태에서, 키메라 분자는 PRO 폴리펩티드와 면역글로불린 또는 면역글로불린의 특정 영역의 융합체를 포함한다. 키메라 분자의 2가 형태의 경우, 융합체는 IgG 분자의 Fc 영역을 포함할 수 있다.

다양한 태그 폴리펩티드 및 이들의 각각의 항체는 당업계에 공지되어 있다. 그 예로는 폴리히스티딘(poly-his) 또는 폴리-히스티딘-글리신 (poly-his-gly) 태그, flu HA 태그 폴리펩티드 및 그의 항체 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)], c-myc 태그 및 이에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3636 (1985)], 및 단순포진 바이러스 당단백질 D (gD) 태그 및 그의 항체 [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]을 들 수 있다. 다른 태그 폴리펩티드는 Flag-펩티드 [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)], KT3 에피토프 펩티드 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)], 알파-튜불린 에피토프 펩티드 [Skinner et al., J. Biol. Chem. 266:15163-15166 (1991)] 및 T7 유전자 10 단백질 태그 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)]을 포함한다.

4. PRO 폴리펩티드의 제조

이하에 설명되는 내용은 1차적으로 목적 PRO 폴리펩티드 핵산을 함유하는 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 세포를 배양함으로써 PRO 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 물론, 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 PRO 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 예를 들어, PRO 폴리펩티드 서열 또는 그의 단편은 고상 가술을 사용하는 직접 펩티드 합성법에 의해 제조할 수 있다 [Stewart etl., Solid -Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1996); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963) 참조]. 시험관 내 단백질 합성은 수동 방법 또는 자동 방법에 의해 수행될 수 있다. 자동 합성법은 예를 들어 Applied Biosystems Peptide Synthesizer (미국 캘리포니아주 포스터시티 소재)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 수행할 수 있다. 목적 PRO 폴리펩티드의 상이한 단편은별개로 화학적으로 합성되어 화학적 또는 효소적 방법을 사용하여 조합함으로써 전장 PRO 폴리펩티드를 제조할 수 있다.

A. PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 단리

PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 목적하는 PRO 폴리펩티드 mRNA를 보유하여 검출가능한 수준으로 PRO 폴리펩티드를 발현할 것으로 생각되는 조직으로부터 제조한 cDNA 라이브러리를 수득할 수 있다. 따라서, 인간 PRO 폴리펩티드 DNA는 실시예에서 설명되는 바와 같이 인체 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 편리하게 수득할 수 있다. PRO 폴리펩티드 코딩 유전자는 또한 게놈 라이브러리로부터 수득하거나 또는 올리고뉴클레오티드 합성법에 의해 제조할 수 있다.

라이브러리는 목적 유전자 또는 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 확인하기 위해 고안된 프로브 (예를 들어 목적하는 PRO 폴리펩티드 또는 약 20 내지 80개의 염기로 구성된 올리고뉴클레오티드에 대한 항체)를 사용하여 스크리닝할 수 있다. 선택된 프로브를 사용한 cDNA 또는 게놈 라이브러리의 스크리닝은 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: ColdSpring Haror Laboratory Press, 1989)]에 기재된 바와 같은 표준 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 목적하는 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 단리하는 다른 수단은 PCR 방법을 사용하는 것이다 [Sambrook et al., 상기 문헌; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Haror Laboratory Press, 1995)].

하기 실시예는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 기술을 설명한다. 프로브로서 선택된 올리고뉴클레오티드 서열은 가양성 결과를 최소화하기 위해서 충분한 길이를 갖고 충분히 분명한 서열이어야 한다. 올리고뉴클레오티드는 스크리닝되는 라이브러리에서 DNA에 혼성화시에 검출될 수 있도록 표지되는 것이 바람직하다. 표지 방법은 당업계에 공지되어 있고,³²P 표지된 ATP와 같은 방사성 표지, 비오티닐화 또는 효소 표지를 포함한다. 중간정도 엄격성 및 높은 엄격성을 포함하여 혼성화 조건은 Sambrook 등의 상기 문헌에 제공된다.

상기 라이브러리 스크리닝 방법에서 확인된 서열은 GenBank와 같은 공개 데이타 베이스 또는 다른 비공개 데이타 베이스에 기탁되고 입수할 수 있는 다른 동지의 서열과 비교 및 정렬시킬 수 있다. 분자의 한정된 영역 내 또는 전장 서열에 걸친 서열 동일성 (아미노산 또는 뉴클레오티드 수준에서)은 상동성을 측정하기 위해 상이한 알고리즘을 사용하는 BLAST, ALIGH, DNAstar 및 INHERIT와 같은 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 사용한 서열 정렬을 통하여 정할 수 있다.

단백질 코딩 서열을 갖는 핵산은 먼저 본원에 개시된 추정 아미노산 서열 및필요한 경우 전구체를 검출하기 위한 Sambrook 등의 상기 문헌에 기재된 통상의 프라이머 신장 방법을 사용하여 선택된 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝하고, cDNA로 역전사되지 않은 mRNA의 중간체를 프로세싱함으로써 수득할 수 있다.

B. 숙주 세포의 선택 및 형질전환

숙주 세포는 PRO 폴리펩티드 생산에 대해 설명한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질감염 또는 형질전환되고 프로모터 유도, 형질전환체 선택 또는 목적 서열을 코딩하는 유전자 증폭에 적합한 개질된 통상의 영양 배지 중에서 배양된다. 배지, 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 과도한 실험을 수행하지 않고도 당업자가 선택할 수 있다. 일반적으로, 세포 배양물의 생산성을 최대화하기 위한 원칙, 프로토콜 및 실시되는 기술은 문헌 [Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) 및 Sambrook et al., 상기 문헌]에 기재되어 있다.

형질감염 방법, 예를 들어 CaPO₄및 일렉트로포레이션은 당업게의 숙련가에게 공지되어 있다. 사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 상기 세포에 적합한 표준 기술을 사용하여 수행된다. Sambrook 등의 상기 문헌에 기재된 염화칼슘을 이용하는 칼슘 처리 또는 일렉트로포레이션은 일반적으로 원핵세포 또는 실질적인 세포벽 장벽을 포함하는 다른 세포에 대해 사용된다. 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)을 사용함 감염은 문헌 [Shaw et al., Gene, 23:315(1983) 및 1989년 6월 29일 공개된 WO 89/05859]에 기재된 특정 식물 세포의형질전환에 사용된다. 세포벽이 없는 포유동물 세포의 경우, 문헌 [Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)]의 인산칼슘 침전법을 사용할 수 있다. 포유동물 세포 숙주 시스템 형질전환의 일반적인 특징은 미국 특허 제4,399,216호에 기재되어 있다. 효모 내로의 형질전환은 일반적으로 문헌 [Van Solingen et al., J. Bact., 130:949(1977) 및 Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(USA), 76:3829(1979)]의 방법에 따라 수행된다. 그러나, 세포 내로 DNA를 도입하는 다른 방법, 예를 들어 핵내 미세주입, 일렉트로포레이션, 완전 세포와 세균 원형질체 융합 또는 다원양이온(polycation), 예를 들어 폴리브렌, 폴리오르니틴도 사용할 수 있다. 포유동물 세포의 형질전환을 위한 상이한 기술에 대해서는 문헌 [Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) 및 Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988)] 참조.

본원에서 벡터 내의 DNA를 클로닝 또는 발현하기에 적합한 숙주 세포는 원핵세포, 효모 또는 고등 진핵세포이다. 적합한 원핵세포는 진정세균, 예를 들어 그람 음성 또는 그람 양성 생물, 예를 들어 엔테로박테리아세애, 예를 들어 대장균을 포함하고, 이에 제한되지 않는다. 다양한 대장균 균주, 예를 들어 대장균 K12 균주 MM294 (ATCC 31,446), 대장균 X1776 (ATCC 31,537), 대장균 균주 W3110 (ATCC 27,325) 및 K5 772 (ATCC 53,635)는 용이하게 입수할 수 있다. 다른 적합한 원핵생물 숙주 세포는 에셔리키아, 예를 들어 대장균, 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피무리움 (typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스 (marcescans) 및 시겔라 (Shigella), 및 바실러스 (Bacillus), 예를 들어 비. 서브틸리스 (subtilis) 및 비. 리체니포르미스 (licheniformis) (예를 들어 1989년 4월 12일자로 공고된 DD 266,710호에 기재된 비. 리체니포르미스 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예를 들어 피. 아에루기노사 (aeruginosa) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)를 포함한다. 다양한 대장균 균주, 예를 들어 대장균 K12 균주 MM294 (ATCC 31,446), 대장균 X1776 (ATCC 31,537), 대장균 균주 W3110 (ATCC 27,325) 및 K5 772 (ATCC 53,635)는 용이하게 입수할 수 있다. 이러한 예는 단지 예시적인 것으로서 이에 제한되는 것은 아니다. 균주 W3110은 재조합 DNA 산물 발효에 공통적인 숙주 균주이기 때문에 특히 바람직한 숙주 도는 모 숙주이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 최소량의 단백질 분해 효소를 분비한다. 예를 들어, 균주 W3110은 숙주의 내생 단백질을 코딩하는 유전자의 돌연변이를 초래하도록 변형될 수 있고, 이러한 숙주의 예는 완전한 유전자형 tonA를 갖는 대장균 W3110 균주 1A2, 완전한 유전자형 tonA ptr3을 갖는 대장균 W3110 균주 9E4, 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kan^r를 갖는 대장균 W3110 균주 27C7 (ATCC 55,244), 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan^r를 갖는 대장균 W3110 균주 37D6, 비카나마이신 내성 degP 결실 돌연변이를 갖는 균주 37D6인 대장균 W3110 균주 40B4 및 1990년 8월 7일 부여된 미국 특허 제4,946,783호에 개시된 페리플라즘 프로테아제 변이체를 갖는 대장균 균주를 포함한다. 별법으로, 시험관내 클로닝 방법, 예를 들어 PCR 또는 다른 핵산 폴리머라제 반응이 적합하다.

원핵세포 외에, 섬유상 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물이 PRO 폴리펩티드 코딩 벡터의 클로닝 또는 발현 숙주로서 적합하다. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)가 하등 진핵 숙주 미생물 중에서 가장 일반적으로 사용된다. 다른 미생물에는 시조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 [1989]; 1985년 5월 2일 공고된 EP 139,383); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주 (미국 특허 제4,943,529호; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)), 예를 들어 케이. 락티스 (lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Baceriol., 737 [1983]), 케이. 프라길리스 (fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스 (ATCC 16,045), 케이. 위케라미 (wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티이 (waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (drosophilarum) (ATCC 36,906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135(1990)), 케이. 테르모톨레란스 (thermotolerans) 및 케이. 막시아누스 (marxianus); 야로위아 (yarrowia) (EP 402,226); 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1988]); 칸디다 (Candida); 트리코데르마 레에시아 (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa; Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]); 시와니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어 시와니오마이세스 옥시덴탈리스 (occidentalis) (1990년 10월 31일 공고된 EP 394,538); 및 섬유상 진균, 예를 들어 뉴로스포라, 페니실리움 (Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) (1991년 1월 10일 공공된 WO 91/00357) 및 아스퍼길러스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스 (Nidulans) (Ballance et al,, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) 및 에이. 니게르 (niger) (Kelly and Hynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985])가 본원에서 통상 유용하게 사용된다. 메틸 영양 요구성 효모가 적합하고, 한세눌란 (Hansenula), 칸디다 (Candida), 클로엑케라 (Kloeckera), 피치아, 카라로마이세스, 토룰롭시스 및 로도토룰라로 이루어지는 속으로부터 선택되는 메탄올 상에서 성장할 수 있는 효모를 포함하고 이에 제한되지 않는다. 이들 종류의 효모의 예인 구체적인 종의 목록은 문헌 [C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)]에 기재되어 있다.

글리코실화 PRO 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 생물로부터 유래한다. 무척추동물 세포의 예는 드로소필라 S2 및 스포돕테라 Sf9와 같은 곤충 세포 및 식물 세포이다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 및 COS 세포를 포함한다. 보다 구체적인 예는 SV40로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인 (COS-7, ATCC CRL 1651), 인간 배 신장 라인 (293 세포 또는 현탁 배양액 중의 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59(1997)), 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)), 생쥐 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)), 인간 폐세포 (W138, ATCC CCL 75), 인간 간세포(Hep G2, HB 8065) 및 생쥐 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51)을 포함한다. 적합한 숙주 세포는 당업계의 숙련가가 용이하게 선택할 수 있다.

C. 복제가능 벡터의 선택 및 사용

목적하는 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 (예를 들어 cDNA 또는 게놈 DNA)은 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위한 복제가능 벡터에 삽입된다. 다양한 벡터를 용이하게 구할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자 또는 파지의 형태로 존재할 수 있다. 적합한 핵산 서열은 다양한 방법에 의해 벡터 내에 삽입될 수 있다. 일반적으로, DNA는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 적합한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들) 내에 삽입된다. 벡터 성분은 일반적으로시그날 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 성분, 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함하되, 이에 제한되지 않는다. 하나 이상의 상기 성분을 포함하는 적합한 벡터의 제조는 당업계의 숙련가에게 공지된 표준 라이게이션 기수을 사용한다.

목적하는 PRO 폴리펩티드는 직접 재조합 방법에 의해 생산될 수 있을 뿐만 아니라 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N 말단에서 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드 또는 시그날 서열일 수 있는 이종성 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 생산될 수 있다. 일반적으로, 시그날 서열은 벡터의 성분일 수 있거나 벡터 내로 삽입된 PRO 폴리펩티드 DNA의 일부일 수 있다. 시그날 서열은 예를 들어 알칼린 포스파타제, 페니실리나제, lpp 또는 열안정성 엔테로톡신 II 리더의 군으로부터 선택되는 원핵생물 시그날 서열일 수 있다. 효모 분비를 위해, 시그날 서열은예를 들어 효모 인버타제 리더, α 인자 리더 (사카로마이세스 (Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) α-인자 리더 (미국 특허 제5,010,182호)) 또는 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스 (C. albicans) 글루코아밀라제 리더 (1990년 4월 4일 공고된 EP 362,179) 또는 1990년 11월 15일 공개된 WO 90/13646에 기재된 시그날일 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 시그날 서열, 예를 들어 동일하거나 관련된 종의 분비되는 폴리펩티드로부터의 시그날 서열 및 바이러스 분비 리더는 단백질의 분비를 지시하기 위해 사용될 수 있다.

발현 및 클로닝 벡터 모두는 벡터가 1종 이상의 선택된 숙주 세포에서 복제할 수 있도록 만드는 핵산 서열을 함유한다. 이러한 서열은 다양한 세균, 효모 및 바이러스에 대해 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람 음성 세균에 적합하고, 2μ 플라스미드 기점은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 기원 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)는 포유동물 세포의 클로닝 벡터에 유용하다.

발현 및 클로닝 벡터는 선택가능한 마커로도 불리우는 선택 유전자를 함유할 수 있다. 대표적인 선택 유전자, 예를 들어 바실러스 (Bacillus)의 경우 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라싸이클린에 내성을 부여하는 단백질, (b) 영양요구성 결함을 보완하는 단백질 또는 (c) 복합 배지로부터 이용할 수 없는 중요한 영양물질을 공급하는 단백질을 코딩한다.

포유동물 세포에 적합한 선택가능한 마커의 예는 PRO 폴리펩티드 핵산을 수용할 수 있는 세포의 동정을 가능하게 하는 것, 예를 들어 DHFR 또는 티미딘 키나제이다. 야생형 DHFR이 이용될 경우, 적합한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결여된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주이고, 문헌 [Urlaub et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)]에 기재된 바와 같이 제조 및 증식된다. 효모에 사용하기 위한 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. trp1 유전자는 트립토판 중에서의 성장능이 결여된 효모의 변이주 (예를 들어 ATCC 44076 또는 PEP4-1)에 대한 선택 마커를 제공한다 [Jones, Genetics, 85: 12 (1977)].

발현 및 클로닝 벡터는 mRNA 합성을 지시하는, PRO 폴리펩티드 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 다양한 숙주 세포에 의해 인식되는 프로모터는 공지되어 있다. 원핵생물 숙주에 사용하기에 적합한 프로모터는 β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템 [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], 알칼리 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 [Goeddel, Nucleic acid Res., 8:4057 (1980); EP 36,776], 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 프로모터 [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)]를 포함한다. 또한, 세균계에 사용하기 위한 프로모터는 목적 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노 (S.D.) 서열을 함유할 것이다.

효모 숙주에 사용하기 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트키나제 [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] 또는 다른 당분해 효소 [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], 예를 들어 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이성질화효소, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이성질화효소, 포스포글루코스 이성질화효소 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 포함한다.

성장 조건에 의해 조절되는 추가의 전사 잇점을 갖는 유도가능한 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알코올 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사에 관련된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 및 말토스 및 갈락토스 이용에 작용하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 추가로 EP 73,657호에 기재되어 있다.

포유동물 숙주 세포에서의 벡터로부터의 PRO 폴리펩티드 전사는 바이러스, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스 (1989년 7월 5일 공고된 UK 2,211,504호), 아데노바이러스 (예를 들어 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 가장 바람직하게는 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터, 이종성 포유동물 프로모터, 예를 들어 악틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 열 충격 프로모터로부터 얻어진, 숙주 세포계에 적합성인 프로모터에 의해 조절된다.

고등 진핵세포에 의한 목적하는 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사는 인핸서 서열을 벡터에 삽입함으로써 종종 증가된다. 인핸서는 전사를 증가시키기 위해 프로모터에 대해 작용하는, 약 10 내지 300 bp의 DNA의 시스-액팅 성분이다. 현재, 많은 인핸서 서열이 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린)로부터 알려져 있다. 그러나, 일반적으로 진핵세포 바이러스로부터 유래한 인핸서를 사용할 것이다. 그 예는 복제 기점의 뒷부분 상의 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 뒷부분 상의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 인핸서는 항체 코딩 서열에 5' 또는 3' 위치에서 벡터에 스플라이싱될 수 있지만, 프로모터로부터 5' 부위에 위치하는 것이 바람직하다.

진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 생물로부터 유래한 응집 세포)에 사용되는 발현 벡터는 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 포함할 수도 있다. 그러한 서열은 통상적으로 진핵세포 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때로는 3' 비번역 영역으로부터 확보된다. 이들 영역은 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 세그먼트를 함유한다.

재조합 척추동물 세포 배양에서 PRO 폴리펩티드의 합성에 적용하기 위한 다른 방법, 벡터 및 숙주 세포는 문헌 [Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060 및 EP 117,058]에 기재되어 있다.

D. 유전자 증폭/발현 검출

유전자 증폭 및(또는) 발현은 예를 들어 통상의 서던 블롯팅, mRNA의 전사를 정량하기 위한 노던 블롯팅 [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], 도트 블롯팅 (DNA 분석) 또는 본원에서 제고오딘 서열을 기초로 하여 적절하게 표지된 프로브를 사용한 반응계내 혼성화에 의해 시료에서 직접 측정할 수 있다. 별법으로, DNA 이중체, RNA 이중체 및 DNA-RNA 혼성 이중체 또는 DNA-단백질 이중체를 포함하여 특정 이중체를 인식하는 항체를 사용할 수 있다. 항체는 표지될 수 있고, 이중체가 표면에 결합되고, 표면 상에 이중체 형성시에 이중체에 결합한 항체의 존재를 검출할 수 있는 분석을 수행할 수 있다.

별법으로, 유전자 발현은 세포 또는 조직 절편의 면역조직화학적 염색과 같은 면역학적 방법 및 유전자 산물의 발현을 직접 정량하기 위한 세포 배양액 또는 체액의 분석에 의해 측정할 수 있다. 면역조직화학적 염색 및(또는) 시료 유체의 분석에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있고, 포유동물에서 제조할 수 있다. 편리하게는, 천연 PRO 폴리펩티드 또는 본원에서 제공되는 DNA 서열을 기초로 한 합성 펩티드 또는 PRO 폴리펩티드 DNA에 융합되고 특정 항체 에피토프를 코딩하는 외인성 서열에 대한 항체를 제조할 수 있다.

E. 폴리펩티드의 정제

PRO 폴리펩티드의 형태는 배양 배지 또는 숙주 세포 용균액으로부터 회수될 수 있다. 막에 결합하는 경우, 적합한 세제 용액 (예를 들어 Triton-X 100)을 사용하여 효소에 의한 절단에 의해 막으로부터 방출될 수 있다. PRO 폴의 발현에 사용된 세포는 동결-해동 싸이클, 초음파 처리, 기계적 붕괴 또는 세포 용균제와 같은 다양한 물리적 또는 화학적 수단에 의해 붕괴시킬 수 있다.

재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 PRO 폴리펩티드를 정제하는 것이 바람직하다. 적합한 정제 공정의 예는 이온 교환 컬럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 또는 양이온 교환 수지, 예를 들어 DEAE 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, 예를 들어 Sephadex G-75를 사용한 겔 여과, IgG와 같은 오염물질을 제거하기 위한 단백질 A 세파로스 컬럼 및 PRO 폴리펩티드의 에피토프 부착 형태를 결합시키기 위한 금속 킬레이팅 컬럼이다. 다양한 단백질 정제 방법을 사용할 수 있으며, 이러한 방법은 문헌 [예를 들어 Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)]에 기재되어 있다. 선택되는 정제 단계(들)은 예를 들어 사용되는 생산 방법 및 생산되는 특정 PRO 폴리펩티드의 특성에 따라 결정될 것이다.

5. PRO 폴리펩티드의 용도

본 발명의 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (또는 그의 상보체)는 혼성화 프로브로서의 용도를 포함하여 분자생물학 분야, 염색체 및 유전자 맵핑 및 안티센스 RNA 및 DNA의 제조에서 다양한 용도를 갖는다. PRO 폴리펩티드 코딩 핵산은 또한 본원에서 설명되는 재조합 기술에 의한 PRO 폴리펩티드의 제조에도 유용할 것이다.

전장 천연 서열 PRO 폴리펩티드 코딩 핵산 또는 그의 단편은 PRO 폴리펩티드핵산 서열과 목적하는 서열 동일성을 갖는 전장 PRO 폴리펩티드 유전자 또는 다른 유전자 (예를 들어 PRO 폴리펩티드의 천연 변이체 또는 다른 종으로부터의 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 유전자)를 단리하기 위한 cDNA 라이브러리에 대한 혼성화 프로브로서 사용될 수 있다. 프로브의 길이는 약 20 내지 약 50개의 염기일 것이다. 혼성화 프로브는 본원에서 개시된 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열로부터 또는 프로모터, 인핸서 성분 및 천연 서열 PRO 폴리펩티드 코딩 DNA의 인트론으로부터 유도될 수 있다. 예를 들면, 스크리닝 방법은 약 40 염기의 선택된 프로브를 합성하기 위해서 공지의 DNA 서열을 사용하여 PRO 폴리펩티드 유전자의 코딩 영역을 단리하는 것을 포함할 것이다. 혼성화 프로브는³²P 또는³⁵S와 같은 방사성 뉴클레오티드를 포함한 다양한 표지 또는 아비딘/바이오틴 커플링 시스템을 통하여 프로브에 커플링된 알칼린 포스파타제와 같은 효소 표지에 의해 표지화될 수 있다. 본 발명의 특정 PRO 폴리펩티드 유전자와 상보성인 서열을 갖는 표지된 프로브를 사용하여 프로브가 라이브러리의 어떤 구성원에 혼성화하는지를 조사하기 위해 인간 cDNA, 게놈 DNA 또는 mRNA의 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 혼성화 기술은 하기 실시예에서 보다 상세하게 설명된다.

본원에 개시된 EST는 본원에서 설명된 방법을 사용하여 프로브로서 유사하게 사용될 수 있다.

또한, 프로브는 밀접하게 관련된 PRO 폴리펩티드 서열의 확인을 위한 일군의 서열을 생성시키기 위해 PCR 기술에 사용될 수 있다.

또한, PRO 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 맵핑 및 유전 질환이 있는 개체의 유전자 분석을 위한 혼성화 프로브의 제조에 사용될 수 있다. 본원에서 제공되는 뉴클레오티드 서열은 계내 혼성화, 공지의 염색체 마커에 대한 연결 분석 및 라이브러리를 사용한 혼성화 스크리닝과 같은 공지의 기술을 사용하여 염색체 및 염색체의 특정 영역에 맵핑시킬 수 있다.

PRO 폴리펩티드는 그의 리간드를 확인하기 위한 분석에 사용될 수 있다. 유사하게, 수용체/리간드 결합 상호작용의 억제제도 확인할 수 있다. 상기 결합 상호작용에 관여하는 단백질은 또한 펩티드 또는 결합 상호작용의 소분자 억제제 또는 작용제 스크리닝에 사용될 수 있다. 스크리닝 분석은 천연 PRO 폴리펩티드 또는 PRO 폴리펩티드에 대한 리간드의 생물학적 활성을 모방하는 화합물을 발견하도록 고안될 수 있다. 이러한 스크리닝 분석은 화합물 라이브러리에 대한 다량의 스크리닝을 가능하게 하고, 특히 소분자의 약물 후보물질 확인에 적합한 분석을 포함할 것이다. 소분자는 합성 유기 또는 무기 화합물을 포함한다. 분석은 당업계에 잘 특성화된 단백질-단백질 결합 분석, 생화학적 스크리닝 분석, 면역분석 및 세포 기재 분석을 포함하여 다양한 포맷으로 수행될 수 있다.

또한, PRO 폴리펩티드 또는 그의 변형체를 코딩하는 핵산은 유용한 치료제의 개발 및 스크리닝에 유용한 트랜스제닉(transgenic) 동물 또는 "녹 아웃(knock out)" 동물의 제조에 사용할 수 있다. 트랜스제닉 동물 (예를 들어 생쥐 또는 쥐)은 태아기 예를 들어 배 단계에서 동물 또는 그 동물의 조상에 도입된 형질도입유전자(transgene)를 함유하는 세포를 갖는 동물이다. 한 실시양태에서, 목적하는 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA는 확립된 기술에 따라 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA를 코딩하기 위해 사용할 수 있고, 게놈 서열은 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 발현하는 세포를 함유하는 트랜스제닉 동물을 생성시키는데 사용할 수 있다. 특히 생쥐 또는 쥐와 같은 트랜스제닉 동물을 생성시키는 방법은 당업계에 통상적인 방법으로 사용되고, 예를 들어 미국 특허 제4,736,866호 및 제4,870,009호에 기재되어 있다. 일반적으로, 특정 세포가 조직 특이적 인핸서를 도입한 PRO 폴리펩티드 형질도입유전자의 표적이 될 것이다. 배 단계에서 동물의 점 라인에 도입된 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 한 카피의 형질도입유전자를 포함하는 트랜스제닉 동물은 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 발현 증가 효과를 조사하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 동물은 예를 들어 PRO 폴리펩티드의 과다발현과 관련된 병리학적 상태로부터 보호할 것으로 생각되는 시약에 대한 시험 동물로서 사용할 수 있다. 본 발명의 이러한 특징에 따라, 동물은 시약으로 처리되고, 형질도입유전자를 보유하는 미처리 동물에 비해 저하된 병리학적 상태의 발생율은 병리학적 상태에 대한 효능있는 치료적 개입을 나타낼 것이다.

별법으로, PRO 폴리펩티드의 비인간 상동체는 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 내인성 유전자와 동물의 배세포에 도입된 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 변형된 게놈 DNA 사이의 상동성 재조합의 결과로서 목적하는 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 결함 또는 변형 유전자를 갖는 PRO 폴리펩티드 "녹 아웃" 동물을 제조하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, PRO 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA는 확립된 기술에 따라 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝하는데 사용할 수 있다. PRO 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA의 일부는 결실되거나 통합을 모니터하기 위해 사용될 수 있는 선택가능 마커를 코딩하는 유전자와 같은 다른 유전자로 치환될 수 있다. 일반적으로, 수천개의 염기의 비변형된 플랭킹 DNA (5' 및 3' 말단 모두에서)가 벡터에 포함된다 (예를 들어 상동성 재조합 벡터에 대해서는 Thomas and Capecchi, Cell, 51:503 (1987) 참조). 벡터는 배 간세포주 (예를 들어 일렉트로포레이션에 의해)에 도입되고, 도입된 DNA가 내인성 DNA와 상동 재조합된 세포가 선택된다 (예를 들어 Li et al., Cell, 69:915 (1992) 참조). 선택된 세포는 이어서 동물 (예를 들어 생쥐 또는 쥐)의 배반포에 주입되어 응집 키메라를 형성한다 (예를 들어 Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152). 이어서, 키메라 배를 적합한 가임신 대리모 동물에 이식하여 "녹 아웃" 동물을 생성시켰다. 배세포 내에 상동 재조합 DNA를 보유하는 자손체를 표준 기술로 확인하여 동물의 모든 세포가 상동성 재조합 DNA를 함유하는 동물의 번식에 사용할 수 있다. 녹 아웃 동물은 예를 들어 특정 병리학적 상태에 대한 방어 능력 및 PRO 폴리펩티드의 부재에 의한 병리학적 상태의 발생에 대해 특성화할 수 있다.

PRO 폴리펩티드의 생체내 투여를 실시할 때, 일반적인 투여량은 투여 경로에 따라 포유동물의 체중 1 kg당 약 10 ng 내지 100 mg, 바람직하게는 약 1 ㎍/kg/일 내지 10 mg/kg/일일 수 있다. 특정 투여량 및 전달 방법에 대한 지침은 문헌, 예를 들어 미국 특허 제4,657,760호, 제5,206,344호 또는 제5,225,212호에 제시되어있다. 다른 치료 화합물 및 다른 질환에 대해서는 다른 제제가 효과적일 수 있고, 예를 들어 자궁을 표적으로 하는 투여시에는 다른 기관 또는 조직, 예를 들어 심장 조직에 대한 것과는 상이한 방식으로 투여할 것이 필요할 수 있다.

PRO 폴리펩티드의 서방성 투여가 PRO 폴리펩티드의 투여를 필요로 하는 질병 또는 질환의 치료에 적합한 방출 특성을 갖는 제제에 요구되는 경우, PRO 폴리펩티드의 마이크로캡슐화가 고려된다. 지연 방출을 위한 재조합 단백질의 마이크로캡슐화는 인간 성장 호르몬 (rhGH), 인터페론 (rhIFN), 인터페론-2 및 MN rgp120을 사용하여 성공적으로 수행되었다 (Johnson et al., Nat. Med., 2:795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27:1221-1223(1993); Hora et al., Bio/Technology, 8:755-758(1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polyactide Polyglycolide Microsphere Systems," in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds, (Plenum Press: New York, 1995), pp. 439-462: WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399 및 미국 특허 제5,654,010호).

상기 단백질의 서방성 제제는 생체적합성 및 광범위한 생분해성을 갖는 폴리-락트산-co-글리콜산 (PLGA) 중합체를 사용하여 개발되었다. PLGA의 분해 산물인 락트산 및 글리콜산은 인간 체내에서 신속하게 소실될 수 있다. 또한, 상기 중합체의 분해가능성은 그의 분자량 및 조성에 따라 수개월 내지 몇년으로 조정될 수 있다 (Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer," in: M. Chasin and R. Langer (Eds.), BiodegradablePolymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1-41).

예를 들어, 최대 체중이 85 kg인 포유동물에 약 80 g/kg/일의 투여량을 제공할 수 있는 제제의 경우, 최대 투여량은 약 6.8 mg PRO 폴리펩티드/일일 것이다. 상기 투여 수준을 달성하기 위해서, 가능한 최저 초기 버스트 (<20％)와 함께 가능한 최대 단백질 함량 (15 내지 20% w/w PRO 폴리펩티드)을 포함하는 서방성 제제가 필요하다. 1 내지 2주 동안 미립자로부터 PRO 폴리펩티드의 연속(0차순) 방출도 바람직하다. 또한, 방출되는 캡슐화된 단백질은 그 통합성 및 안정성을 그 방출 기간 내에 유지하여야 한다.

프로스타신 단백질의 활성과 관련있는 생물학적 활성을 갖는 본 발명의 PRO351 폴리펩티드는 생체 내에서 치료 목적으로 및 시험관 내에서 모두 사용할 수 있다. 당업계의 통상의 기술자는 그러한 목적으로 본 발명의 PRO351 폴리펩티드를 사용하는 방법을 잘 알 것이다.

프로스타신에 상동성이 있는 PRO351 폴리펩티드 및 그 부분은 또한 생체내 치료 목적 뿐만 아니라 다른 다양한 용도에서 유용할 수 있다. 신규한 프로스타신 단백질 및 관련 분자의 동정은 많은 인간의 질병과 관련이 있을 수 있다. 따라서, 신규한 프로스타신 단백질 및 프로스타신형 분자의 동정은 이러한 단백질이 각종 상이한 인간의 질병에 대한 잠재적인 치료제로서 작용할 수 있는 점에서 매우 중요하다. 그러한 폴리펩티드는 또한 생물공학 및 의학 연구에서 뿐만 아니라 다양한 산업 용도에서 중요한 역할을 할 수 있다. 그 결과로서, PRO351과 같은 신규한 분자에 특별한 과학적 및 의학적 관심이 있다.

본 발명의 화합물은 제약상 유용한 조성물을 제조하는 공지된 방법에 따라 제제화될 수 있는데, 이 때 PRO 폴리펩티드는 제약항 허용가능한 비히클과 함께 조합될 수 있다. 적절한 담체 비히클 및 다른 인간 단백질, 예컨데 인간 혈청 알부민 등을 포함하는 이들의 제제는 예들 들면 문헌 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed. 1980, Mack Publishing Co., edited by Oslo et al.)에 기재되어 있으며, 이 문헌의 공개 내용은 이런 언급에 의해 본원에 도입된다.

본 발명의 제약 조성물의 투여량 및 원하는 약물 농도는 의도한 특정한 용도에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면 심한 정맥 혈전증 또는 말초 혈관 질병의 처치에서는 "농축괴 (bolus)" 투여가 통상 바람직하며, 이 때 후속 투여를 통해 대략 일정한 혈액내 농도, 바람직하게는 약 3 ㎍/ml대로 유지한다.

그러나, 일반적으로 주입이 불가능한 응급한 의료 보호 시설과 관련해서 사용될 경우는 근원적인 질병 (예를 들면, 색전증, 경색)의 일반적으로 중요한 성질 때문에, 어느 정도 큰 초기 투여량 (예를 들면 정맥내 농축괴)을 제공하는 것이 바람직하다.

6. 항-PRO 폴리펩티드 항체

본 발명은 추가로 항-PRO 폴리펩티드 항체를 제공한다. 항체의 예는 폴리클로날, 모노클로날, 인간화, 이중특이적 및 이종접합(heteroconjugate) 항체를 포함한다.

A. 폴리클로날 항체

항-PRO 폴리펩티드 항체는 폴리클로날 항체를 포함할 수 있다. 폴리클로날항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 폴리클로날 항체는 예를 들어 면역화제 및 필요한 경우 보조제를 1회 이상 주사함으로써 포유동물에서 생성시킬 수 있다. 일반적으로, 면역화제 및(또는) 보조제는 피하 또는 복강내 주사에 의해 포유동물에 주사될 것이다. 면역화제는 PRO 폴리펩티드 또는 그의 융합 단편을 포함할 수 있다. 면역처리되는 포유동물에서 면역원성인 것을 공지된 단백질에 면역화제를 접합시키는 것이 유용할 수 있다. 상기 면역원성 단백질의 예로는 키홀 삿갓조개 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 및 대두 트립신 억제제를 들 수 있다. 사용될 수 있는 보조제의 예는 프로인드 완전 보조제 및 MPL-TDM 보조제 (모노포스포릴 지질 A, 합성 트레할로스 디코리노미콜레이트)를 포함한다. 면역처리 방법은 당업계의 숙련가에 의해 선택될 수 있다.

B. 모노클로날 항체

항-PRO 폴리펩티드 항체는 별법으로 모노클로날 항체일 수 있다. 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)]에 기재되 바와 같은 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 생쥐, 햄스터 또는 다른 적절한 숙주 동물을 면역화제로 면역처리되어 면역화제에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 임파구를 생성시킨다. 별법으로, 임파구는 시험관 내에서 면역처리될 수 있다.

면역화제는 일반적으로 목적하는 PRO 폴리펩티드 또는 그의 융합 단백질을 포함한다. 일반적으로, 말초 혈액 임파구 ("PBL")는 인체 기원의 세포가 바람직한 경우 사용되거나, 비인간 포유동물 세포가 요구되는 경우에는 비장 세포 또는 임프절 세포가 사용된다. 이어서, 임파구는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합제를 사용하여 골수종 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다 [고딩 (Goding), Monoclonal Antibodies: Principle and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]. 골수종 세포주는 대체로 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 인체 기원의 골수종 세포이다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 비융합된 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제시키는 1종 이상의 물질을 함유하는 적합한 배지 중에 접종하고 배양시킨다. 예를 들면, 모세포가 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 결핍된 경우, 하이브리도마용 배지는 전형적으로 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것이며, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제시킨다.

바람직한 불멸화 세포주는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 높은 수준의 안정한 생산을 지지하며, HAT 배지와 같은 배지에 감수성이 있는 것이다. 더욱 바람직한 불멸화 세포주는 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center, 미국 캘리포니아주 샌디에고) 및 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, 미국 매릴랜드주 록빌)으로부터 입수가능한 쥐 골수종 세포주이다. 인간 골수종 세포주 및 생쥐-인간 헤테로골수종 세포주가 또한 인간 모노클로날 항체의 생산에 대해 기술되었다 [코즈보르 (Kozbor), J. Immunol., 133: 3001 (1984); 및 브로듀어 (Brodeur) 등, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)].

하이브리도마 세포가 성장하는 배지를 항원에 대해 유도된 모노클로날 항체의 생산에 대해 분석하였다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성을 면역침강법에 의해, 또는 방사성면역분석법 (RIA) 또는 효소 결합 면역 흡수 분석법 (ELISA)과 같은 시험관내 결합 분석에 의해 측정하였다. 이러한 기술 및 분석은 당업계에 공지되어 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어 Scatchard 분석 (Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980))에 의해 결정할 수 있다.

원하는 특이성, 친화도 및(또는) 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 제한 희석 절차에 의해 클론을 서브클로닝시키고 표준 방법 [고딩, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]으로 배양시켰다. 이러한 목적에 적합한 배지는 예를 들면, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수종양으로서 생체내 배양시킬 수 있다.

서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 예를 들면, 단백질 A-세파로스 (Sepharose), 히드록시아파티트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피와 같은 통상의 면역글로불린 정제 절차에 의해 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리시킨다.

또한, 모노클로날 항체는 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 것과 같은 재조합 DNA 방법에 의해 제조할 수도 있다. 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 절차 (예를 들면, 쥐 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써)를 이용하여 쉽게 분리되고 서열결정된다. 하이브리도마 세포는 그러한 DNA의 바람직한 기원으로서 작용한다. 일단 분리되면, DNA는 발현 백터 내로 넣을 수 있고, 이어서, 그렇지 않으면 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 대장균 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 형질감염시켜 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체를 합성시킨다. DNA는 또한 예를 들어 상동성 쥐 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환함으로써 (미국 특허 제4,816,567호; 모리슨 (Morrison) 등의 상기 문헌), 또는 비면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전체 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유 결합시킴으로써 변형시킬 수 있다. 전형적으로 그러한 비면역글로불린 폴리펩티드는 항체의 불변 도메인에 대해 치환되거나, 항체의 한 항체-결합 부위의 가변 도메인에 대해 치환되어 항원에 특이성을 갖는 하나의 항체-결합 부위 및 상이한 항원에 특이성을 갖는 다른 항원-결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 생성시킨다.

항체는 1가 항체일 수 있다. 1가 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 한 방법은 면역글로불린 경쇄 및 변성 중쇄의 재조합 발현을 포함한다. 중쇄는 중쇄 가교결합을 방지하기 위해서 Fc 영역의 임의의 지점에서 일반적으로 말단이 절단된다. 별법으로, 관련 시스테인 잔기는 가교결합을 방지하기 위해서 다른 아미노산 잔기로 치환되거나 결실된다.

또한, 시험관내 방법도 1가 항체의 제조에 적합하다. 항체의 단편, 특히 Fab 단편을 제조하기 위한 항체의 분해는 당업계에 통상적인 방법으로 수행될 수있다.

C. 인간화 항체

본 발명의 항-PRO 폴리펩티드 항체는 추가로 인간화 항체 또는 인간 항체를 포함할 수 있다. 비인간(예를 들어 쥐) 항체의 인간화 형태는 키메라 면역글로불린, 비인간 면역글로불린으로부터 유래한 최소 서열을 포함하는 면역글로불린 사슬 또는 그의 단편 (예를 들어 Fv, Fab, Fab', F(ab')₂또는 항체의 다른 항원 결합 서열)이다. 인간화 항체는 수용체의 상보성 결정 영역 (CDR)의 잔기를 목적 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 생쥐, 쥐 또는 토끼와 같은 비인간종 (공여 항체)의 CDR의 잔기로 치환시킨 인간 면역글로불린 (수용 항체)를 포함한다. 몇몇 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 대응하는 비인간 잔기로 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수용 항체 또는 도입되는 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 인간화 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역이 비인간 면역글로불린에 대응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역이 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 영역인 하나 이상, 일반적으로 둘 이상의 가변 도메인을 실질적으로 포함할 것이다. 또한, 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 일반적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다 [존스 (Jones) 등, Nature, 321: 522-525 (1986); 리치만 (Riechmann) 등, Nature, 332: 323-327 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)].

비인간 항체의 인간화 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 바람직하게는, 인간화 항체는 비인체 기원으로부터의 그에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 종종 "임포트(import)" 잔기로 부르며, 전형적으로 "임포트" 가변 도메인으로부터 취한다. 인간화는 인간 항체의 상응하는 서열 대신 설치류 CDRs 또는 CDR 서열로 치환함으로써 본질적으로 윈터 (Winter) 등의 방법 [존스 (Jones) 등, Nature, 321: 522-525 (1986); 리치만 (Riechmann) 등, Nature, 332: 323-327 (1988); 베르호옌 (Verhoeyen) 등, Science, 239: 1534-1536 (1988)]에 따라 수행할 수 있다. 따라서, 그러한 "인간화" 항체는 실질적으로 보다 적은 무손상 인간 가변 도메인이 비인간 종으로부터 상응하는 서열에 의해 치환된 키메라 항체 (미국 특허 제4,816,567호)이다. 실제, 인간화 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기를 설치류 항체에서 유사한 부위로부터의 잔기로 치환시킨 인간 항체이다.

인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리를 포함하여 당업계에 공지된 방법으로 제조할 수도 있다 [후겐붐 (Hoogenboom) 등, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); 막스 등, J. Mol. Bio., 222: 581-597 (1991)]. 코울 등 및 보에르너 등의 기술도 인간 모노클로날 항체의 제조에 사용할 수 있다 (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) and Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)].

D. 이중특이적 항체

이중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날, 바람직하게는 인간 또는 인간화 항체이다. 이 경우에, 결합 특이성 중의하나는 PRO 폴리펩티드에 대한 것이고, 다른 하나는 다른 항원, 바람직하게는 세포 표면 단백질 또는 수용체 또는 수용체 서브유닛에 대한 것이다.

이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 이중 특이적 항체의 재조합 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄/경쇄-중쇄 쌍의 동시발현에 기초하며, 여기에서, 2개의 사슬은 상이한 특이성을 갖는다 [밀스타인 (Millstein) 등, Nature, 305: 537-539 (1983)]. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분배로 인해, 이들 하이브리도마 (쿠아드로마)는 10개의 상이한 항체 분자의 가능한 혼합물을 생산하며, 이중 하나만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 정확한 분자의 정제는 친화도 크로마토그래피 단계로 수행된다. 유사한 절차가 국제 특허 공개 제WO 93/08829호 및 문헌[트라우네커(Traunecker) 등, EMBO J., 10: 3655-3659 (1991)]에 기재되어 있다.

원하는 결합 특이성(항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체의 가변 도메인을 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 융합은 바람직하게는 힌지, CH2의 적어도 일부 및 CH3 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 사용한다. 경쇄 결합을 위해 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 융합물의 적어도 하나에 존재하는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합물, 및 원하는 경우 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터에 삽입하고, 적당한 숙주 유기체로 동시형질감염시킨다. 이중특이적 항체를 생산하기 위한 보다 상세한 내용은 예를 들면, 문헌[수레쉬(Suresh) 등, Methods in Enzymmology, 121: 210(1986)] 참조.

E. 이종접합 항체

이종접합 항체도 본 발명의 범위에 포함된다. 이종접합 항체는 2개의 공유결합된 항체로 구성된다. 이러한 항체는 예를 들어 면역계 세포를 원하지 않는 세포에 표적화시키기 위해 (미국 특허 제4,676,980호), 및 HIV 감염의 치료를 위해 (국제 특허 공개 제WO 91/00360호, 동 제WO 92/200373호, 및 유럽특허 제EP03089호) 제안되었다. 이종접합 항체는 가교결합제를 사용하는 방법을 포함하여 합성 단백질 화학에 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 면역독소는 디술피드 교환 반응 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 제조할 수 있다. 상기 목적에 적합한 시약은 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트 및 미국 특허 제4,676,980호에 개시된 것을 포함한다.

7. 항-PRO 폴리펩티드 항체의 용도

본 발명의 항-PRO 폴리펩티드 항체는 다양한 유용성을 갖는다. 예를 들어, 항-PRO 폴리펩티드 항체는 PRO 폴리펩티드에 대한 진단 분석, 예를 들어 특정 세포, 조직 또는 혈청에서의 그의 발현의 검출에 사용될 수 있다. 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어 이종상 또는 동종상에서 수행되는 경쟁 결합 분석, 직접 또는 간접 샌드위치 분석 및 면역침전 분석[Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158]을 사용할 수 있다. 진단 분석에 사용되는 항체는 검출가능한 잔기로 표지될 수 있다. 검출가능한 잔기는 직간접적으로 검출가능한 시그날을 생성시킬 수 있어야 한다. 예를 들어, 검출가능한 잔기는 방사성 동위 원소, 예를 들어³H,¹⁴C,³²P,³⁵S 또는¹²⁵I, 형광 또는 화학발광 화합물, 예를 들어 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민 또는 루시페린, 또는 효소, 예를 들어 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 양고추냉이 퍼옥시다제일 수 있다. 문헌 [Hunter et al, Nature, 144:945(1962); David et al., Biochemistry, 13:1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth., 40:219 (1981); 및 Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982)]에 기재된 방법을 포함하여 항체를 검출가능한 잔기에 결합시키기 위한 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다.

또한, 항-PRO 폴리펩티드 항체는 재조합 세포 배양액 또는 천연 공급원으로부터 PRO 폴리펩티드의 친화도 정제에 유용하다. 이 과정에서, PRO 폴리펩티드에 대한 항체는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 세파덱스 수지 또는 여과지에 적합한 지지체에 고정된다. 고정된 항체는 정제될 PRO 폴리펩티드를 함유하는 시료와 접촉된 후, 고정된 항체에 결합한 PRO 폴리펩티드를 제외하고 시료 내의 모든 물질을 실질적으로 제거하기 위해 적합한 용매로 세척한다. 최종적으로, 지지체는 다른 적합한 용매로 세척하여 PRO 폴리펩티드를 항체로부터 방출시킨다.

다음의 실시예는 단지 예시를 목적으로 제공될 뿐이며, 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다.

이 명세서에 인용된 모든 특허와 문헌은 그를 언급함으로써 그 전체가 본원에 도입된다.

실시예

실시예에서 언급한 시판 시약들은 달리 지시하지 않는 한 제조업자의 지시에 따라 사용하였다. 하기 실시예와 명세서 전반에서 ATCC 기탁 번호로 확인되는 세포들의 입수원은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection, 메릴랜드주 록빌)이다.

실시예 1: 신규 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 cDNA를 확인하기 위한 세포외 도메인 상동성 스크리닝

스위스-프롯(Swiss-Prot) 공용 데이타베이스로부터 약 950개의 공지된 분비형 단백질로부터의 세포외 도메인 (ECD) 서열 (존재하는 경우 분비 신호 서열 포함)을 사용하여 EST 데이타베이스를 조사하였다. EST 데이타베이스는 공용 데이타베이스 (예를 들면, 데이호프(Dayhoff), 젠뱅크(GenBank))와 독점 데이타베이스 (예를 들면, LIFESEQ™ (인사이트 파마슈티칼스(Incyte Pharmaceuticals, 캘리포니아주 팔로 알토))를 포함한다. 조사는 EST 서열의 6개 프레임 번역에 대한 ECD 단백질 서열의 비교로서 컴퓨터 프로그램 BLAST 또는 BLAST2 [앨츠슐(Altschul) 및 기쉬(Gish), Methods in Enzymology 266: 460-80 (1996); http://blast.wustl/ edu/blast/README.html]를 이용하여 수행하였다. 공지된 단백질을 코딩하지 않는 70 (또는 몇몇 경우 90) 이상의 블라스트(Blast) 스코어를 갖는 비교물을 클러스터시키고, 프로그램 "phrap" (필 그린(Phil Green), University of Washington (워싱턴주 시애틀); http://bozeman.mbt.washington.edu/phrap.docs/phrap.html)를 사용하여 컨센서스 DNA 서열로 조립하였다.

본 세포외 도메인 상동성 스크린을 이용하여, 컨센서스 DNA 서열을 다른 확인된 EST 서열에 대해 조립하였다. 또한, 수득한 컨센서스 DNA 서열을 종종 (항상은 아니지만) 가능한 한 상기 논의한 EST 서열원을 사용하여 컨센서스 서열을 신장시키기 위해 BLAST와 phrap의 반복 사이클을 이용하여 신장시켰다.

이어서, 상기한 바와 같이 수득한 컨센서스 서열에 기준하여 올리고뉴클레오티드를 합성하여, PCR에 의해 관심있는 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 확인하기 위해 사용하고 PRO 폴리펩티드에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리시키기 위한 프로브로서 사용하였다. 전방향(.f) 및 역방향(.r) PCR 프라이머는 일반적으로 20 내지 30개 뉴클레오티드 범위이고, 종종 약 100 내지 1000 bp 길이의 PCR 산물을 제공하기 위해 고안된다. 프로브(.p) 서열은 대개 40 내지 55 bp 길이이다. 몇몇 경우, 컨센서스 서열이 약 1 내지 1.5 kbp보다 큰 경우 추가의 올리고뉴클레오티드가 합성된다. 전장 클론을 위한 몇몇 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 이들 라이브러리로부터의 DNA를 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 아우수벨 (Ausubel) 등[Current Protocols in Molecular Biology]에 따라 PCR 증폭에 의해 스크리닝하였다. 이어서, 양성 라이브러리를 사용하여 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍들 중 하나를 이용하는 관심있는 유전자를 코딩하는 클론을 단리시켰다.

cDNA 클론을 단리시키기 위한 cDNA 라이브러리는 인비트로겐(Invitrogen, 캘리포니아주 샌디에고)으로부터의 시약들과 같은 시판 시약을 사용하여 표준 방법으로 제작하였다. cDNA를 NotI 부위를 갖는 올리고 dT로 프라이밍시키고, SalI 헤미키나징된(hemikinased) 어댑터(adaptor)에 블런트 말단으로 연결시키고, NotI로절단하고, 겔 전기영동에 의해 적절하게 크기 분류하고, 적당한 클로닝 벡터 (예를 들면, pRKB 또는 pRKD; pRK5B는 SfiI 부위를 포함하지 않는 pRK5D의 전구체임; 문헌[홀름스(Holmes) 등, Science, 253: 1278-1280 (1991)] 참조) 내로 특이 XhoI 및 NotI 부위에서 규정 방향으로 클로닝시켰다.

실시예 2: 아밀라제 스크리닝에 의한 cDNA 클론의 단리

1. 올리고 dT 프라이밍된 cDNA 라이브러리의 제조

인비트로겐사의 시약 및 프로토콜을 사용하여 인간 조직으로부터 mRNA를 단리하였다. 미국 메릴랜드주 게터스버그 소재의 Life Technologies사의 시약 및 프로토콜 (Super Script Plasmid System)을 이용하여, 상기 RNA를 사용하여 벡터 pRK5D에 올리고 dT 프라이밍된 cDNA 라이브러리를 생성시켰다. 이 과정에서, 이중 가닥 cDNA의 크기를 1000 bp보다 크도록 선택하고, SalI/NotI 링커 부착 cDNA를 XhoI/NotI 절단 벡터에 클로닝하였다. pRK5D는 sp6 전사 개시 부위, SfiI 제한 효소 부위, XhoI/NotI cDNA 클로닝 부위를 순서대로 포함하는 클로닝 벡터이다.

2. 랜덤 프라이밍된 cDNA 라이브러리의 제조

1차 cDNA 클론의 5' 말단을 우선적으로 제공하기 위해 2차 cDNA 라이브러리를 생성시켰다. sp6 RNA를 1차 라이브러리 (상기한 바와 같음)로부터 생성시키고, Life Technologies사의 시약 및 프로토콜 (Super Script Plasmid System, 상기한 바와 같음)을 이용하여 상기 RNA를 사용하여 랜덤 프라이밍된 cDNA 라이브러리를 생성시켰다. 이 과정에서, 이중가닥 cDNA를 500 내지 1000 bp의 크기로 만들고, NotI 어댑터에 블런트 상태로 연결시키고, SfiI로 절단하여 SfiI/NotI 절단 벡터에클로닝하였다. pSST-AMY.0은 cDNA 클로닝 부위 및 마우스 아밀라제 서열 (성숙 서열, 분비 시그날 없음) 앞에 효모 알콜 탈수소효소 프로모터를 갖고 클로닝 부위 뒤에 효모 알콜 탈수소효소 터미네이터를 갖는 클로닝 벡터이다. 따라서, 아밀라제 서열에 인 프레임(in frame)으로 융합된 상기 벡터 내에 클로닝된 cDNA는 적절하게 형질감염된 효모 콜로니로부터 아밀라제를 분비시킬 수 있다.

3. 형질전환 및 검출

상기 패러그래프 2에 기재된 라이브러리로부터 단리한 DNA를 빙상에서 냉각시켜 전기수용성(electorcompetent) DH10B 세균 (Life Technologies) 20 ml을 첨가하였다. 세균 및 벡터 혼합물을 이어서 제조자의 권고대로 일렉트로포레이션시켰다. 이어서, SOC 배지 (Life Technologies) 1 ml을 첨가하고 혼합물을 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 형질전환체를 암피실린 함유 표준 150 mm LB 플레이트 20개에 플레이팅하고 16시간 동안 (37℃)에서 인큐베이션하였다. 양성 콜로니를 플레이트로부터 분리하여 표준 프로토콜, 예를 들어 CsCL-구배법을 사용하여 DNA를 세균 펠렛으로부터 단리하였다. 정제된 DNA를 사용하여 다음과 같은 효모 프로토콜을 수행하였다.

효모 방법은 다음 세개의 카테고리로 분류된다: 1) 플라스미드/cDNA 조합 벡터를 사용한 효모의 형질전환, 2) 아밀라제를 분비하는 효모 클론의 검출 및 단리 및 3) 효모 콜로니로부터 삽입체의 직접 PCR 증폭 및 서열분석 및 추가의 분석을 위한 DNA의 정제.

사용된 효모는 HD56-5A (ATCC-90785)이었다. 이 균주는 MAT 알파, ura3-52,leu2-3, leu2-112, his3-11, his3-15, MAL⁺, SUC⁺, GAL⁺의 표현형을 갖는다. 바람직하게는, 후번역 경로가 결여된 효모 변이체를 사용할 수 있다. 이러한 변이체는 sec71, sec72, sec62, 바람직하게는 말단 절단된 sec71에 트랜스로케이션 결핍 대립유전자를 가질 수 있다. 별법으로, 상기 유전자의 정상적인 작동을 방해하는 길항질 (안티센스 뉴클레오티드 및(또는) 리간드 포함), 상기 후번역 경로에 관련된 다른 단백질 (예를 들어 SEC61p, SEC72p, SEC62p, SEC63p, TDJ1p 또는 SSA1p-4p) 또는 이들 단백질의 복합체를 아밀라제 발현 효모와 함께 사용할 수 있다.

형질전환은 문헌 [Gietz et al., Nucl. Acid. Res., 20:1425 (1992)]에 개관된 프로토콜에 기초하여 수행하였다. 이어서, 형질전환된 세포를 아가로부터 YEPD 복합 배지 브로쓰 100 ml에 접종하고 30℃에서 철야 성장시켰다. YEPD 브로쓰를 문헌 [Kaiser et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 207 (1994)]에 기재된 바와 같이 제조하였다. 철야 배양액을 신선 YEPD 브로쓰 500 ml로 약 2 x 10⁶세포/ml (약 OD₆₀₀= 0.1)로 희석하여 약 1 x 10⁷세포/ml (약 OD₆₀₀= 0.4 - 0.5)로 재성장시켰다.

이어서, 세포를 회수하여 형질전환을 위해 준비하고, Sorval GS3 로터의 GS3 로터 바틀로 이송하여 5,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 상등액을 버리고, 멸균수로 재현탁시켜 Beckman GS-6KR 원심분리기에서 3,500 rpm으로 50 ml 팔콘 튜브에서 다시 원심분리하였다. 상등액을 버리고, 세포를 LiAc/TE (10 ml, 10 mMTris-HCl, 1 mM EDTA pH7.5, 100 mM Li₂OOCCH₃)로 세척하여 LiAc/TE (2.5 ml)에 재현탁시켰다.

마이크로 원심분리 튜브에서 준비한 세포 100 ㎕를 신선한 변성 단일 가닥 연어 DNA (미국 메릴랜드주 게이터스버그 소재 Lofstrand Labs)와 형질전환 DNA 1 ㎍ (부피 < 10 ㎕)와 혼합하여 형질전환을 수행하였다. 혼합물을 볼텍싱에 의해 간단히 혼합한 후, 40％ PEG/TE 600 ㎕ (40％ 폴리에틸렌 글리콜-4000, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM Li₂OOCCH₃, pH 7.5)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 부드럽게 혼합하고 30분 동안 교반하면서 30℃에서 인큐베이션하였다. 세포를 이어서 42℃에서 15분 동안 열 쇼크를 가하고, 반응 용기를 마이크로원심분리기에서 12,000 rpm에서 5 내지 10초 동안 원심분리하여 상등액을 버리고 TE 500 ㎕ (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH7.5)에 재현탁시킨 후 재원심분리하였다. 세포를 TE 1 ml로 희석하고 분취액 200 ㎕를 1500 mm 성장 플레이트 (VWR)에서 미리 제조한 선택 배지 상에 도말하였다.

별법으로, 작은 다수회의 반응 대신에, 시약의 양을 증가시킬 수 있는 1회의 대규모의 반응을 사용하여 형질전환을 수행하였다.

사용된 선택 배지는 문헌 [Kaiser et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 208-210 (1994)]에 기재된 바와 같이 우라실 결여된 합성 완전 덱스트로스 아가 (SCD-Ura)이었다. 형질전환체를 30℃에서 2 내지 3일 동안 성장시켰다.

아밀라제를 분비하는 콜로니의 검출은 선택 성장 배지 중에 적색 전분을 포함시켜 수행하였다. 전분을 문헌 [Biely et al., Anal. Biochem., 172:176-179]에 기재된 바와 같은 방법에 따라 적색 염료 (반응성 Red-120, Sigma)에 결합시켰다. 결합된 전분을 최종 농도 0.15％ (w/v)로 SCD-Ura 아가 플레이트에 첨가하고, 인산칼륨을 사용하여 pH 7.0으로 완충시켰다 (최종 농도 50 내지 100 mM).

양성 콜로니를 새로운 선택 배지 (150 mm 플레이트 상의)에 스트리킹하여 동정가능한 단일 콜로리를 단리하였다. 적색 전분을 완충된 SCD-Ura 아가에 직접 첨가하여 아밀라제 분비 양성의 잘 단리된 단일 콜로니를 검출하였다. 직접 시각으로 확인할 수 있는 양성 콜로니 주위에 투명 원광(halo)을 생성시키는 양성 콜로니의 전분 분해능을 측정하였다.

4. PCR 증폭에 의한 DNA의 단리

양성 콜로니를 단리할 때, 그 일부를 이쑤시개로 떠내어 96웰 플레이트 내의 멸균수 30 ㎕ 중에 희석하였다. 이때, 양성 콜로니를 동결시켜 후속 분석을 위해 보관하거나 즉시 증폭하였다. 0.5 ㎕ Klentaq (미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 Clontech), 10 mM dNTP 4.0 ㎕ (Perkin Elmer-Cetus), Kentaq 완충액 (Clontech) 2.5 ㎕, 전방향 올리고뉴클레오티드 1 0.25 ㎕, 역방향 올리고뉴클레오티드 2 0.25 ㎕, 증류수 12.5 ㎕를 포함하는 25 ㎕ 부피의 PCR 반응의 주형으로서 세포의 분취액 5 ㎕를 사용하였다. 전방향 올리고뉴클레오티드 1의 서열은 다음과 같다:

5'-tgtaaaacgacggccagttaaatagacctgcaattattaatct-3' (서열 324)

역방향 올리고뉴클레오티드 2의 서열은 다음과 같다:

5'-caggaaacagctatgaccacctgcacacctgcaaatccatt-3' (서열 325)

이어서, PCR을 다음과 같이 수행하였다.

a. 92℃에서 5분 동안 변성시킴,

b. 92℃에서 30초 동안 변성, 59℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 60초간 신장시키는 과정을 3회 실시,

c. 92℃에서 30초 동안 변성, 57℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 60초간 신장시키는 과정을 3회 실시,

d. 92℃에서 30초 동안 변성, 55℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 60초간 신장시키는 과정을 3회 실시,

e. 4℃에서 유지시킴.

올리고뉴클레오티드의 밑줄친 영역은 ADH 프로모터 영역 및 아밀라제 영역에 각각 어닐링되고, 삽입체가 존재하지 않을 경우 벡터 pSST-AMY.O으로부터 307 bp 영역을 증폭하였다. 일반적으로, 상기 올리고뉴클레오티드의 5' 말단의 처음 18개의 뉴클레오티드는 서열분석 프라이머의 어닐링 부위를 포함하였다. 따라서, 삽입체가 없는 벡터로부터 PCR 반응의 총 생성물은 343 bp이었다. 그러나, 신호 서열 융합된 cDNA는 상당히 긴 뉴클레오티드 서열을 생성시켰다.

PCR 후에, 반응액의 분취액 5 ㎕를 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌]에 기재된 Tris-Borate-EDTA (TBE) 완충 시스템을 사용하여 1％ 아가로스 겔에서의 아가로스 겔 전기영동에 의해 조사하였다. 400 bp보다 큰 강력한 하나의 PCR 생성물을생성시키는 클론을 96 Qiaquick PCR clean-up 컬럼 (미국 캘리포니아주 채스워쓰 소재의 Qiagen Inc.)로 정제한 후 DNA 서열을 결정하여 분석하였다.

실시예 3: 인간 PRO351를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 다양한 EST 서열에 대해, DNA35950로 명명된 컨센서스 서열을 수득하였다. DNA35950 컨센서스 서열을 기초로 하여, 1) 목적 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고 2) PRO351의 전장 코딩 서열의 클론을 단리하기 위한 프로브로서 사용하기 위해 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.

PCR 프라이머쌍 (전방향 및 역방향)를 합성하였다.

전방향 PCR 프라이머: 5'-cctgtgctgt gcctcgagcc tgac-3' (서열 133)

역방향 PCR 프라이머: 5'-gtgggcagca gttagcaccg cctc-3' (서열 134)

추가로, 다음 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 컨센서스 DNA35950 서열로부터 제조하였다.

혼성화 프로브

5'-ggctggcatc atcagctttg catcaagctg tgcccaggag gacgc-3' (서열 135)

전장 클론의 공급원에 대해 몇개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍을 사용한 PCR 증폭에 의해 라이브러리의 DNA를 스크리닝하였다. 프로브 올리고뉴클레오티드 및 PCR 프라이머 중의 하나를 사용하여 양성 라이브러리를 이용하여 PRO351 유전자를 코딩하는 클론을 단리하였다. cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 태아 간 조직(LIB230)으로부터 단리하였다.

상기한 바와 같이 단리한 클론의 DNA 서열 분석을 통하여 PRO351 [UNQ308 (DNA40571-1315)로 명명]의 전장 DNA 서열 (서열 131) 및 이로부터 유도된 PRO351의 단백질 서열을 수득하였다.

UNQ308 (DNA40571-1315)의 전체 뉴클레오티드 서열은 도 1에 도시하였다 (서열 131). 클론 UNQ308 (DNA40571-1315)은 2개의 오픈 리딩 프레임, 즉 뉴클레오티드 위치 189 내지 191의 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 363 내지 365의 정지 코돈과 함께 단일 오픈 리딩 프레임 및 뉴클레오티드 470에서 시작하여 뉴클레오티드 위치 2009 내지 2011의 정지 코돈과 함께 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 1). 예상된 폴리펩티드 전구체는 571개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖는다 (도 2). PRO351의 아미노산 서열의 중요 영역은 신호 펩티드, 트립신 패밀리의 세린 프로테아제와 서열 유사성을 보이는 영역, 2개의 N-글리코실화 부위 및 3개의 Kringle 도메인을 포함한다. 클론 UNQ308 (DNA40571-1315)은 ATCC 기탁번호 209784로서 ATCC에 기탁되었다.

실시예 4: 혼성화 프로브로서 PRO 폴리펩티드-코딩 핵산의 용도

다음 방법은 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 혼성화 프로브로서의 용도를 기술한다.

본원에 기술한 바와 같이 관심있는 PRO 폴리펩티드의 코딩 서열을 포함하는 DNA를 프로브로서 이용할 수 있거나, 또는 인간 조직 cDNA 라이브러리 또는 인간 조직 게놈 라이브러리에서 상동성 DNA (예를 들면, PRO 폴리펩티드의 천연 변종을 코딩하는 것)를 스크리닝하기 위해 프로브를 제조하기 위한 기초로서 사용할 수 있다.

이들 라이브러리 DNA를 포함하는 필터의 혼성화 및 세척을 다음 고엄격 조건 하에 수행하였다. 방사선 표지된 PRO 폴리펩티드-코딩 핵산-유도 프로브를 필터에 혼성화시키는 것은 50％ 포름아미드, 5×SSC, 0.1％ SDS, 0.1％ 피로인산나트륨, 50 mM 인산나트륨, pH 6.8, 2×덴하르트(Denhardt's) 용액 및 10％ 덱스트란 황산염의 용액 중에서 42℃에서 20시간 동안 수행하였다. 필터의 세척은 0.1×SSC 및 0.1％ SDS의 수용액 중에서 42℃에서 수행하였다.

이어서, 전장 천연 서열 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA와 원하는 서열 동일성을 갖는 DNA를 당업계에 공지된 표준 방법으로 확인하였다.

실시예 5 : 대장균에서 PRO 폴리펩티드 코딩 핵산의 발현

본 실시예는 대장균 내의 재조합 발현으로 원하는 PRO 폴리펩티드의 비글리코실화된 형태를 제조하는 방법을 나타낸다.

처음에 원하는 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA서열을 선택된 PCR 프라이머를 이용하여 증폭하였다. 프라이머는 선택된 발현 벡터 상의 제한 효소 부위에 해당하는 제한 효소 부위를 포함해야만 한다. 여러 발현 벡터가 사용될 수 있다. 적합한 벡터의 예는 앰피실린 및 테트라사이클린 내성 유전자를 포함하는 pBR322[대장균에서 유래; Bolivar et al., Gene 2:95(1977)]이다. 벡터를 제한 효소로 절단하고 탈인산화시켰다. 이어서, PCR 증폭된 서열을 벡터에 라이게이션하였다. 벡터는 바람직하게는 항생제 내성 유전자, trp 프로모터, 폴리-his 리더(처음 6개의 STII 코돈, 폴리-his 서열 및 엔테로키나제 절단 부위를 포함), 특이적인 PRO 폴리펩티드 코딩 부위, 람다 전사 터미네이터 및 argU 유전자를 코딩하는 서열을 포함할 것이다.

이어서, Sambrook 등(상기 문헌)이 기재한 방법을 이용하여 라이게이션 혼합물을 선택된 대장균 균주를 형질전환시키는데 사용하였다. LB 배지에서 성장할 수 있는 형질전환체를 확인하고 항생제 내성을 갖는 콜로니를 선택하였다. 플라스미드 DNA를 제한 분석법 및 DNA 서열 분석을 이용하여 단리, 확인하였다.

선택된 클론을 항생제가 보충된 LB 브로스와 같은 액체 배양 배지에서 밤새 배양하였다. 이 배양액을 다음 단계의 배양 접종에 사용하였다. 이어서, 세포를 발현 프로모터가 작동되는 동안 원하는 광학 밀도까지 배양시켰다.

수시간 동안 세포를 배양한 후에 원심분리로 세포를 회수할 수 있다. 원심분리로 얻어진 세포 펠렛을 당업계에 공지된 여러가지 시약을 이용하여 용해시키고, 단백질이 강하게 결합하는 조건 하에서 금속 킬레이팅 컬럼을 이용하여 용해된 단백질을 정제하였다.

유럽 출원 제99912321.9호에서, 폴리펩티드들은 다음 과정을 이용하여 대장균에서 폴리-His 태그가 부가된 형태로 발현되었다. 처음에, 선택된 PCR 프라이머를 이용하여 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 증폭하였다. 프라이머는 선택된 발현 벡터 상의 제한효소 부위에 해당하는 제한 효소 부위 및 효율적이고 신뢰할 만한 번역 개시, 금속 킬레이트 컬럼에서 빠른 정제, 엔테로키나아제를 사용한 단백질 분해 제거를 제공하는 다른 유용한 서열을 포함하였다. 이어서 PCR 증폭된, 폴리-His 태그가 부가된 서열을 발현 벡터에 라이게이션시켜 대장균 숙주[균주52(W3110fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) clpP (lacIq)]를 형질전환 시켰다. 우선 형질전환체를 50 ㎎/㎖의 카르베니실린 (carbenicillin)을 포함하는 LB 배지에서 O.D.600이 3 내지 5에 도달할 때까지 30℃에서 진탕 배양하였다. 배양액을 CRAP 배지(물 500 ㎖ 내의 3.57 g (NH₄)₂SO₄, 0.71 g 시트르산나트륨·2H₂O, 1.07 g KCl, 5.36 g Difco 효모 추출물, 5.36 g Sheffield hycase SF, 또한 110 mM MPOS, pH 7.3, 0.55％ (w/v) 글루코스 및 7 mM MgSO₄를 혼합하여 준비)로 50 내지 100배로 희석하고 약 20 내지 30시간 동안 30℃에서 진탕 배양시켰다. SDS-PAGE 분석법으로 발현을 확인하기 위해 시료들을 취하고 대량 배양액을 원심분리하여 세포를 펠렛으로 만들었다. 세포 펠렛을 정제와 리폴딩시킬 때까지 냉동시켰다.

0.5 내지 1L 발효액으로부터 얻은 대장균 페이스트(6 내지 10 g 펠렛)를 10배 부피(w/v)의 7 M 구아니딘, 20 mM Tris, pH 8 완충액에 재현탁시켰다. 고체 아황산나트륨 및 사티온산나트륨을 각각 최종 농도 0.1 M과 0.02 M이 되도록 첨가하고 용액을 4℃에서 밤새 교반하였다. 이 단계에서 아황산염화에 의해 모든 시스테인 잔기가 차단된 변성 단백질이 생성되었다. 이 용액을 Beckman 초원심 분리기에서 40,000 rpm에서 30분간 원심분리하였다. 상등액을 3 내지 5 배 부피의 금속 킬레이트 컬럼 완충액(6 M 구아니딘, 20 mM Tris, pH 7.4)으로 희석하고 0.22 마이크론 필터로 여과시켜 정화하였다. 정화된 추출물을 금속 킬레이트 컬럼 완충액으로 평형화된 5 ㎖ Qiagen Ni-NTA 금속 킬레이트 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 50 mM 이미다졸(Calbiochem, Utrol grade)을 포함하는 추가의 완충액(pH 7.4)으로 컬럼을세척하였다. 단백질을 250 mM 이미다졸을 포함하는 완충액으로 용출시키고, 목적하는 단백질을 포함하는 분획을 모아 4℃에 보관하였다. 아미노산 서열에 따라 계산된 흡광 계수를 이용하여 280 nm 흡광도로 단백질 농도를 측정하였다.

시료를 20 mM Tris, pH 8.6, 0.3 M NaCl, 2.5 M 우레아, 5 mM 시스테인, 20 mM 글리신 및 1 mM EDTA로 구성된 새롭게 준비한 리폴딩 완충액으로 천천히 희석하여 단백질을 리폴딩시켰다. 리폴딩 부피는 최종 단백질 농도가 50 내지 100 ㎍/㎖가 되도록 정하였다. 리폴딩 용액을 4℃에서 12 내지 36시간 가량 서서히 교반하였다. 최종농도가 0.4％(약 pH 3)가 되도록 TFA를 첨가하여 리폴딩 반응을 정지시켰다. 추가로 단백질을 정제하기 전에, 용액을 0.22 마이크론 필터로 여과시키고 아세토니트릴을 최종 농도 2 내지 10％가 되도록 첨가하였다. 리폴딩된 단백질을 10 내지 80％의 아세토니트릴 농도 구배로 용출시키면서 0.1％ TFA의 이동 완충액을 이용하는 Poros R1/H 역상 컬럼 크로마토그래피시켰다. A280 흡광도를 보이는 분획의 분액을 SDS 폴리아크릴아미드 겔에서 분석하여 균질하게 리폴딩된 단백질을 포함하는 분획을 회수하였다. 일반적으로, 리폴딩된 단백질은 역상 수지와의 상호작용으로부터 보호되는 소수성의 내부 부분과 가장 밀착되기 때문에, 대부분의 단백질에서 적절하게 리폴딩된 단백질 형태는 아세토니트릴의 가장 낮은 농도에서 용출된다. 응집된 단백질은 대개 높은 아세토니트릴 농도에서 용출된다. 역상 단계는 바람직한 형태의 단백질로부터 잘못 폴딩된 형태의 단백질을 분리할 뿐 아니라, 시료로부터 내독소를 제거한다.

목적하는 폴딩된 PRO 단백질을 포함하는 분획을 회수하여 용액에 대해 질소기류를 부드럽게 적용하여 아세토니트릴을 제거하였다. 투석법 또는 제제화 완충액으로 평형화되고 멸균 여과된 G25 Superfine(Pharmacia) 수지를 이용한 겔 여과법으로 0.14 M 염화나트륨 및 4％ 만니톨을 포함하는 20 mM Hepes, pH 6.8으로 단백질을 제제화하였다.

실시예 6 : 포유동물 세포에서 PRO 폴리펩티드의 발현

본 실시예는 포유동물 세포내의 재조합 발현으로 PRO 폴리펩티드의 글리코실화된 형태를 제조하는 방법을 예시한다.

벡터 pRK5(1989. 3.15 공개된 EP 307,247 참조)를 발현 벡터로 사용한다. 임의로, Sambrook 등(상기 문헌)이 기재한 라이게이션 방법을 이용하여 PRO 폴리펩티드-코딩 DNA를 선택된 제한 효소를 사용하여 pRK5에 라이게이션시켜, PRO 폴리펩티드 DNA를 삽입하였다. 생성 벡터를 각각 pRK5-PRO 폴리펩티드로 명명하였다.

한 실시양태에서, 숙주 세포로서 293 세포를 선택할 수 있다. 인간 293 세포(ATCC CCL 1573)를 태아 송아지 혈청 및 임의로 영양소 및(또는) 항생제가 보충된 DMEM와 같은 배지에서 조직 배양 플레이트에 융합(confluent)되도록 배양하였다. 약 10 ㎍ pRK5-PRO 폴리펩티드 DNA를 VA RNA 유전자를 코딩하는 DNA[Thimmappaya et al., Cell, 31: 543(1982)] 약 1 ㎍과 혼합하여, 500 ㎕의 1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA 및 0.227 M CaCl₂에 용해시켰다. 이 혼합물에 500 ㎕의 50 mM HEPES(pH 7.35), 280 mM NaCl, 1.5 mM NaPO₄를 적가하여 25℃에서 10분간 침전물을 형성시켰다. 침전물을 현탁시키고 293 세포에 첨가하여 37℃에서 4시간 가량을 정치시켰다. 배지를 흡인 제거하고 PBS 내의 20％ 글리세롤 2 ㎖를 30초 동안 첨가하였다. 이어서, 293세포를 혈청 무첨가 배지로 세척하고 새로운 배지를 첨가하고 5일간 세포를 배양하였다.

형질감염 약 24시간 후에 배지를 제거하고 배지(만으로) 또는 200 μCi/㎖³⁵S-시스테인 및 200 μCi/㎖³⁵S-메티오닌을 포함하는 배지로 대체하였다. 12시간 배양 후, 조건화된 배지를 회수하고 회전 필터에서 농축시켜 15％ SDS 겔에 로딩하였다. 처리된 겔을 건조시키고 PRO 폴리펩티드의 존재를 확인하기 위해 일정 기간동안 필름에 노출시켰다. 형질감염된 세포를 포함하는 배양액을 추가로 배양시키고(혈청 무첨가 배지), 배지를 선택된 생물분석법으로 시험하였다.

별법으로, Soparyac 등[Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575(1981)]이 기재한 덱스트란 술페이트 방법을 이용하여 PRO 폴리펩티드를 293 세포에 일시적으로 도입시킬 수 있었다. 293 세포는 회전 플라스크에서 최고 밀도가 되도록 배양하고 700 ㎍ pRK5-PRO 폴리펩티드 DNA를 첨가하였다. 세포를 우선 원심분리하여 회전 플라스크로부터 농축하고 PBS로 세척하였다. DNA-덱스트란 침전물을 4시간 동안 세포 펠렛 상에서 인큐베이션하였다. 세포를 20％ 글리세롤로 90초간 처리하고 조직 배양 배지로 세척한 후 다시 조직 배양 배지, 5 ㎍/㎖ 소의 인슐린 및 0.1 ㎍/㎖ 소의 트랜스페린을 포함하는 회전 플라스크에 넣었다. 약 4일 후에 조건화된 배지를 원심분리하고 여과시켜 세포와 파쇄물을 제거하였다. 발현된 PRO 폴리펩티드를 포함하는 시료를 농축시키고 선택된 방법, 예를 들어 투석 및(또는) 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다.

다른 실시양태로, PRO 폴리펩티드를 CHO 세포에 발현시킬 수 있다. pRK5-PRO 폴리펩티드를 공지된 시약, 예를 들어 CaPO₄또는 DEAE 덱스트란을 이용하여 CHO 세포에 형질감염시킬 수 있다. 상기에서 언급한 것과 같이, 세포를 배양하고, 배지만으로 또는³⁵S-메티오닌과 같은 방사선 표지를 포함하는 배지로 배양액을 대체한다. 발현된 폴리펩티드의 존재를 확인하고 나서, 배양 배지를 혈청 무첨가 배지로 대체한다. 바람직하게는, 6일 가량 배양물을 인큐베이션 하고 조건화된 배지를 회수한다. 발현된 PRO 폴리펩티드를 포함하는 배지를 농축하여 선택된 방법으로 정제한다.

또한, 에피토프 태그가 부가된 PRO 폴리펩티드는 CHO 숙주세포에서 발현될 수 있다. PRO 폴리펩티드는 pRK5로부터 서브클로닝될 수 있다. 서브클론의 삽입은 PCR을 통해 폴리-his 태그와 같은 선택된 에피토프 태그를 갖는 형태로 바큘로바이러스 발현 벡터에 융합될 수 있다. 폴리-his 태그가 부가된 PRO 폴리펩티드 삽입체는 안정한 클론을 선택하기 위해 DHFR과 같은 선택 마커를 포함하는 SV40 유도 벡터로 서브클로닝될 수 있다. 최종적으로, CHO 세포는 (상기에서와 같이) SV40 유도 벡터로 형질감염될 수 있다. 발현을 확인하기 위해서 상기와 같은 방법으로 표지될 수 있다. 이어서, 발현된 폴리-His 태그된 PRO 폴리펩티드를 포함하는 배양 배지는 농축하여 Ni²⁺-킬레이트 친화도 크로마토그래피와 같이 선택된 방법으로 정제할 수 있다.

다음 실험 방법을 이용하여 CHO 세포 내에서 안정하게 발현되었다. 단백질은 각 단백질의 가용성 형태의 코딩 서열이 힌지, CH2 및 CH2 도메인을 포함하는 IgG1 불변 영역 서열에 융합된 IgG 구조체(면역어드헤신)로서 발현 및(또는) 폴리-His 태그가 부가된 형태로 발현되었다.

PCR 증폭에 이어 Ausubel 등[Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, Johnn Wiley and Sons(1997)]에 의해 기재된 표준 방법을 이용하여 각 DNA를 CHO 발현 벡터에 서브클로닝 하였다. CHO 발현 벡터는 목적하는 DNA의 5' 및 3'에 적합한 제한 부위를 갖도록 제조되어 cDNA의 제한 위치가 편리하게 셔틀링될 수 있게 된다. CHO 세포에서 발현에 사용되는 벡터는 Lucas 등[Nucl. Acids Res. 24:9(1774-1779(1996)]에 의해 기재된 바와 같으며, 목적하는 cDNA와 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR)를 발현시키기 위해 SV40 초기 프로모터/인핸서를 사용하였다. DHFR 발현으로 형질감염된 플라스미드의 안정적 유지를 선별할 수 있다.

원하는 플라스미드 DNA 12 ㎍을 시판되는 형질감염 시약 Superfect(Qiagen), Dosper또는 Fugene(Boehringer Mannheim)을 이용하여 약 1000만개의 CHO 세포에 도입하였다. 상기의 Lucas 등의 기재 방법에 따라 세포를 배양하였다. 추후에 세포를 배양 및 생산하기 위해 약 3 x 10^-7세포를 하기에 기재된 방법에 따라 앰플에 동결시켰다.

플라스미드 DNA를 포함하는 앰플을 수조에 넣어 녹인 후 볼텍싱하여 혼합하였다. 내용물을 배지 10 ㎖를 포함하는 원심분리 튜브에 피펫으로 넣고 1000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상등액을 흡입해 내고 세포를 10 ㎖ 선택 배지(0.2 ㎛ 투석 여과된 5％ 소 태아 혈장을 포함하는 0.2 ㎛ 여과된 PS20)에 재현탁시켰다. 세포를 90 ㎖ 선택 배지를 포함하는 100 ㎖ 스피너에 분주하였다. 1 내지 2일 후 세포를 150 ㎖ 선택 배지로 채워진 250 ㎖ 스피너로 옮겨 37℃에서 배양하였다. 2 내지 3일 후에 250 ㎖, 500 ㎖ 및 2000 ㎖ 스피너에 3 x 10⁵세포/㎖를 접종하였다. 세포 배양액을 원심 분리하여 신선한 배지로 교환하고 생산 배지에 재현탁하였다. 임의의 적합한 CHO 배지를 이용할 수 있으나, 공개 미국 특허 제 5,122,469호(1992. 6. 16)에 기재된 생산 배지를 실제로 이용하였다. 3 ℓ 생산 스피너에 1.2 x 10⁶세포/㎖가 되도록 접종하였다. 제0일에 세포 수와 pH를 측정하였다. 제1일에 스피너에서 시료를 취해 여과된 공기의 살포를 개시하였다. 제2일에 스피너에서 시료를 취해 온도를 33℃로 바꾸고 500 g/L-글루코스 30 ㎖ 및 10％ 소포제 0.6 ㎖의(예, 35％ 폴리디메틸 실록산 유액, Dow Corning 365 의약 등급 유액)을 첨가하였다. 전체 생산기 동안, pH를 약 7.2에서 유지시켜야만 한다. 10일 후 또는 생존률이 70％ 미만으로 떨어질 즈음 세포 배양액을 원심분리로 회수하고 0.22 ㎛ 필터에 여과시켰다. 여과액을 정제 컬럼에 로딩하기 전까지 4℃에 보관하였다.

폴리-his 태그된 구조물의 경우, Ni-NTA 컬럼(Qiagen)을 이용하여 단백질을 정제하였다. 정제하기 전에 이미다졸을 5 mM 농도로 조건화된 배지에 첨가하였다. 조건화된 배지를 0.3 M NaCl 및 5 mM 이미다졸을 포함하는 20 mM Hepes, pH 7.4 완충액으로 평형화된 6 ㎖ Ni-NTA 컬럼에 4℃에서 4 내지 5 ㎖/분의 유속으로 주입하였다. 로딩 후에 컬럼을 추가의 평형 완충액으로 세척하고 단잭질을 0.25 M 이미다졸을 포함하는 평형 완충액으로 용출하였다. 이어서 정제된 단백질을 25 ㎖의 G25 수퍼파인 (Pharmacia) 컬럼으로 10 mM Hepes, 0.14 M NaCl 및 4％ 만니톨을 함유하는 저장 완충액(pH6.8)에서 염을 제거하고 -80℃에서 보관하였다.

면역어드헤신(Fc 포함) 구조물은 조건화된 배지로부터 다음과 같이 정제되었다. 조건화된 배지를 20 mM 인산 나트륨 완충액(pH 6.8)로 평형화된 5 ㎖ 단백질 A 컬럼(Pharmacia)에 주입하였다. 로딩후, 평형화 완충용액으로 세척하고 100 mM 시트르산(pH 3.5)으로 용출하였다. 용출된 단백질을 275 ㎕의 1 M Tris 완충액(pH 9)을 포함하는 튜브에 1 ㎖ 분획으로 회수하여 즉시 중화시켰다. 이어서 고도로 정제된 단백질을 폴리-His 태그된 단백질의 경우에 상기에 기재된 방법으로 저장 완충액(pH6.8)으로 염을 제거하였다. 상동성을 SDS-PAGE 및 에드만 분해법으로 수행되는 N-말단 아미노산 서열 분석으로 확인하였다.

실시예 7: PRO 폴리펩티드의 효모에서의 발현

다음 방법은 효모에서 원하는 PRO 폴리펩티드의 재조합 발현을 기재하고 있다.

우선, ADH2/GAPDH 프로모터로부터 PRO 폴리펩티드의 세포내 생산 또는 분비를 위한 효모 발현 벡터를 제조하였다. 원하는 PRO 폴리펩티드, 선택된 시그날 펩티드 및 프로모터를 코딩하는 DNA를 PRO 폴리펩티드의 세포내 발현을 위해 선택된 플라스미드의 적합한 제한 효소 부위에 삽입하였다. 분비의 경우, PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 ADH2/GAPDH 프로모터, 효모 알파-인자 분비 시그날/리더 서열 및 링커 서열(필요한 경우)를 코딩하는 DNA와 함께 선택된 플라스미드에 클로닝할 수 있다.

이어서, 효모 세포, 예를 들어 효모 균주 AB110을 상기에서 기재된 발현 플라스미드로 형질전환 시키고 선택된 발효 배지에서 배양할 수 있다. 형질 전환된 효모 상등액을 10％ 트리클로로아세트산으로 침전시키고 SDS-PAGE로 분리한 후 겔을 쿠마시 블루로 염색하여 분석할 수 있다.

계속해서, 원심분리하여 발효 배지로부터 효모 세포를 회수하고 선택된 카트리지 필터를 이용하여 배지를 농축시켜 재조합 PRO 폴리펩티드를 단리하고 정제할 수 있다. PRO 폴리펩티드를 포함하는 농축액을 선택된 컬럼 크로마토그래피 수지를 이용하여 추가로 정제할 수 있다.

실시예 8 : 바큘로바이러스 감염 곤충 세포 내에서 PRO 폴리펩티드의 발현

다음 방법은 바큘로바이러스 감염 곤충 세포 내에서 PRO 폴리펩티드의 재조합 발현에 대하여 기재하고 있다.

PRO 폴리펩티드를 바큘로바이러스 발현 벡터에 포함된 에피토프 태그의 상류에 융합시켰다. 상기의 에피토프 태그는 폴리-his 태그 및 면역글로블린 태그(IgG의 Fc 영역과 같이)를 포함하고 있다. 시판되는 플라스미드, 예를 들어 pVL1393(Novagen)에서 유도된 플라스미드를 포함하여 여러 플라스미드를 사용할 수 있다. 간략하게, PRO 폴리펩티드 또는 PRO 폴리펩티드의 원하는 부분(예, 막횡단 단백질의 세포외 도메인을 코딩하는 서열)은 5' 및 3' 영역에 상보적인 프라이머를이용하여 PCR로 증폭하였다. 5' 프라이머는 인접한 (선택된) 제한 효소 분위를 포함할 수 있다. 이어서 생산물을 선택된 제한 효소로 절단하여 발현 벡터에 서브클로닝하였다.

재조합 바큘로바이러스는 리포펙틴(GIBCO-BRL로부터 구입)을 이용하여 상기의 플라스미드 및 BaculoGold™ 바이러스 DNA(Phamingen)를 스포돕테라 프루기페르다(Sf9) 세포(ATCC CRL 1711)에 동시에 형질감염시켜 생성되었다. 28℃에서 4 내지 5일 배양 후에, 방출된 바이러스를 회수하여 이후의 증폭에 사용한다. 바이러스 감염 및 단백질 발현은 문헌[O'Reilley et al., Baculovirus Expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)]에 따라 수행하였다.

이어서, 발현된 폴리-his 태그된 PRO 폴리펩티드는 예를 들어 Ni²⁺-킬레이트 친화도 크로마토그래피로 다음과 같이 정제될 수 있다. 추출액을 문헌[Rupert et al., Nature, 362: 175-179(1993)]에 따라 재조합 바이러스-감염된 Sf9 세포로부터 제조한다. 간략하게, Sf9 세포를 세척하여 초음파 처리 완충액 (25 ㎖ Hepes, pH 7.9; 12.5 mM MgCl₂; 0.1 mM EDTA; 10％ 글리세롤; 0.1％ NP-40; 0.4 M KCl)에 재현탁시키고 빙상에서 20초간 두차례 초음파 처리하였다. 초음파 처리물을 원심분리로 제거하고 상등액을 로딩 완충액(50 mM 인산, 300 mM NaCl, 10％ 글리세롤, pH 7.8)에 50배 희석하여 0.45 ㎛ 필터로 여과시켰다. Ni²⁺-NTA 아가로즈 컬럼(Quiagen으로부터 구입)을 5 ㎖ 충진 부피로 준비하여 물 25 ㎖로 세척하고 로딩 완충액 25 ㎖로 평형화시켰다. 여과시킨 세포 추출물을 분당 0.5 ㎖로 컬럼에 로딩하였다. 점 분획 회수를 개시할 때 컬럼을 로딩 완충액으로 A₂₈₀기준선까지 세척하였. 다음으로, 2차 세척 완충액(50 mM 인산; 300 mM NaCl, 10％ 글리세롤, pH 6.0)으로 컬럼을 세척하여 비특이적으로 결합된 단백질을 용출시켰다. A₂₈₀이 기준선에 다시 도달하면, 컬럼을 2차 세척 완충액에 0 내지 500 mM 이미다졸로 구배로 전개시켰다. 1 ㎖ 분획을 회수하여 SDS-PAGE 및 은 염색 또는 알카리 포스파타제에 결합된 Ni²⁺-NTA(Qiagen)로 웨스턴 블롯팅하여 분석하였다. 용출된 His₁₀태그된 PRO 폴리펩티드를 포함하는 분획을 모아 로딩 완충액에 대해 투석하였다.

별법으로, IgG 태그된 (또는 Fc 태그된) PRO 폴리펩티드의 정제는 공지된 크로마토그래피 기술, 예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 수행하였다.

유럽 출원 제99912321.9호에서, 폴리펩티드들은 바큘로바이러스 감염된 Sf9 곤충 세포에서 성공적으로 발현되었다. 발현은 실제 0.5 내지 2ℓ 규모로 실시되었지만 더 큰 규모(8ℓ)로 생산하기 위해 대규모화할 수 있다. 단백질은 단백질 세포외 영역이 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 IgG1 불변 영역 서열에 융합된 IgG 구조체(NL1-IgG 면역어드헤신) 및(또는) 폴리-His 태그가 부가된 형태로 발현되었다.

바큘로바이러스 감염된 Sf9 세포에서 발현시키기 위해, PCR 증폭 후 각각의 코딩 서열을 바큘로바이러스 발현 벡터(IgG 융합체의 경우 pb.PH.IgG 및 폴리-His태그된 단백질의 경우 pb.PH.His.c)에 서브클로닝하였으며, 리포펙틴(GIBCO-BRL)을 이용하여 벡터 및 BaculoGold™ 바이러스 DNA(Phamingen)를 105 스포돕테라 프르기페르다(Sf9) 세포(ATCC CRL 1711)에 동시에 형질감염시켰다. pb.PH.IgG 및 pb.PH.His는 His 서열 또는 Fc 태그 서열을 포함시키기 위해 변형된 폴리링커 부위를 포함시킨, 시판되는 바큘로바이러스 발현 벡터 pVL1393(Pharmingen)의 변형물이다. 세포를 10％ FBS(Hyclone)가 보충된 Hink's TNM-FH 배지에서 세포를 배양하였다. 세포를 28℃에서 5일간 배양하였다. 상등액을 회수하고 계속해서 10％ FBS로 보충된 Hink's TNM-FH 배지에서 약 10의 감염 배수(MOI)로 Sf9 세포를 감염시켜 1 바이러스 증폭에 사용하였다. 세포를 28℃에서 3일간 배양하였다. 상등액을 회수하여, 히스티딘 태그된 단백질의 경우 25 ㎖ Ni-NTA 비드(QIAGEN)에 또는 IgG 부가된 단백질의 경우 단백질 A 세파로스 CL-4B 비드(Pharmacia)에 상등액 1 ㎖를 배치 결합시켜 SDS-PAGE 분석을 실시하여 쿠마시 블루 염색으로 이미 공지된 농도의 단백질과 비교하여 바큘로바이러스 발현 벡터 내의 구조물의 발현을 측정하였다.

제1 바이러스 증폭 상등액을 ESF-921 배지(Expression Systems LLC)에서 MOI가 약 0.1이 되도록 배양된 Sf9 세포의 스피너 배양액(500 ㎖)을 감염시키는데 사용하였다. 세포를 28℃에서 3일간 배양하였다. 상등액을 회수하여 여과하였다. 스피너 배양액의 발현이 확인될 때까지 필요한 만큼 배치 결합 및 SDS-PAGE 분석을 반복하였다.

형질감염된 세포(0.5 내지 3 ℓ)의 조건화된 배지를 원심분리하여 세포를 제거하고 0.22 ㎛ 필터로 여과하였다. 폴리-His 태그된 구조물은 Ni-NTA컬럼(Qiagen)을 이용하여 정제하였다. 정제하기 전에 이미다졸을 5 mM 농도로 조건화된 배지에 첨가하였다. 조건화된 배지를 0.3 M NaCl 및 5 mM 이미다졸을 포함하는 20 mM Hepes 완충액(pH 7.4)으로 평형화된 6 ㎖ Ni-NTA 컬럼에 4℃에서 4 내지 5 ㎖/분의 유속으로 주입하였다. 로딩 후에 컬럼을 추가의 평형 완충액으로 세척하고 단백질을 0.25 M 이미다졸을 포함하는 평형 완충액으로 용출하였다. 이어서 고도로 정제된 단백질을 25 ㎖ G25 수퍼파인(Pharmacia) 컬럼으로 10 mM Hepes, 0.14 M NaCl 및 4％ 만니톨을 포함하는 저장 완충액(pH6.8)에서 염을 제거하고 -80℃에서 보관하였다.

단백질의 면역어드헤신(Fc 포함) 구조체는 다음과 같이 조건화된 배지로부터 정제되었다. 조건화된 배지를 20 mM 인산나트륨 완충액(pH 6.8)으로 평형화된 5 ㎖ 단백질 A 컬럼(Pharmacia)에 주입하였다. 로딩후, 평형화 완충용액으로 세척하고 100 mM 시트르산(pH 3.5)으로 용출하였다. 용출된 단백질을 275 ㎖의 1 M Tris 완충액(pH 9)을 포함하는 튜브에 1 ㎖ 분획으로 회수하여 즉시 중화시켰다. 이어서 고도로 정제된 단백질을 상기에 기재된 폴리-His 태그가 부가된 단백질의 경우와 같이 저장 완충액(pH6.8)에서 염을 제거하였다. 단백질의 상동성을 SDS-PAGE로 확인하고 에드만 분해법으로 수행되는 N-말단 아미노산 서열 분석으로 확인하였다.

유럽 출원 제99912321.9호에서, 폴리펩티드들은 바큘로바이러스 감염된 Hi5 곤충 세포에서 성공적으로 발현되었다. 발현은 실제 0.5 내지 2ℓ 규모로 실시되었지만 더 큰 규모(8ℓ)로 생산하기 위해 대규모화할 수 있다.

PRO 폴리펩티드를 바큘로바이러스 감염 Hi5 세포에서 발현시키기 위해, PRO폴리펩티드을 코딩하는 DNA가 적합한 시스템, 예를 들어 Pfu(Stratagene) 또는 바큘로바이러스 발현 벡터에 포함된 에피토프 태그의 상류에 융합시켰다. 상기의 에피토프 태그는 폴리-his 태그 및 면역글로블린 태그(IgG의 Fc 영역과 같이)를 포함하고 있다. 시판되는 플라스미드, 예를 들어 pVL1393(Novagen)에서 유도된 플라스미드를 포함하여 여러 플라스미드를 사용할 수 있다. 간략하게, PRO 폴리펩티드 또는 PRO 폴리펩티드의 원하는 부분(예, 막횡단 단백질의 세포외 도메인을 코딩하는 서열)을 코딩하는 DNA를 5' 및 3' 영역에 상보적인 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 5' 프라이머는 (선택된) 제한 효소 인접 부위에 결합할 수 있다. 이어서 생산물을 선택된 제한 효소로 절단하여 발현 벡터에 서브클로닝하였다. 예를 들어, pVL1393의 유도체는 인간 IgG(pb.PH.IgG)의 Fc 부위 또는 NAME 서열의 하류에 8개의 히스티딘(pb.PH.His) 태그를 포함할 수 있다. 바람직하게, 벡터 구조물을 서열분석하여 확인한다.

Hi5 세포를 27℃, CO₂없는 NO pen/strep의 조건 하에서 융합성(confluency)이 50％가 되도록 배양하였다. 각 150 mm 플레이트에 PRO 폴리펩티드를 포함하는 pIE 유도 벡터 30 ㎍을 1 ㎖ Ex-Cell 배지(배지: Ex-Cell 401 + 1/100 L/Glu JRH Biosciences #14401-78P(빛에 민감))와 혼합하고 다른 시험관에 CellFectin (CellFECTIN(GibcoBRL #10362-010)(볼텍스하여 섞어줌)) 100 ㎕를 1 ㎖의 Ex-Cell 배지와 혼합하였다. 두 용액을 혼합하여 상온에서 15분간 인큐베이션하였다. Ex-Cell 배지 8 ㎖를 DNA/CellFECTIN 혼합물에 첨가하고 이것을 Ex-Cell 배지로 한차례 세척된 Hi5 세포 위를 덮었다. 이어서 플레이트를 실온의 암실에서 1시간동안 인큐베이션하였다. 이어서, DNA/CellFECTIN 혼합물을 흡인 제거하고 과잉의 CellFECTIN이 제거되도록 세포를 Ex-Cell로 한차례 세척하였다. 혼합물을 새로운 Ex-Cell 배지 30 ㎖를 첨가하고 세포를 28℃에서 3일간 배양하였다. 상등액을 회수하여, 히스티딘 태그가 부가된 단백질의 경우 25 ㎖의 Ni-NTA 비드(QIAGEN)에 또는 IgG 부가된 단백질의 경우 단백질 A 세파로스 CL-4B 비드(Pharmacia)에 상등액 1 ㎖를 배치 결합시켜 SDS-PAGE 분석을 실시하여 쿠마시 블루 염색으로 이미 공지된 농도의 단백질과 비교하여 바큘로바이러스 발현 벡터 내의 구조물의 발현을 측정하였다.

형질감염된 세포(0.5 내지 3 ℓ)의 조건화된 배지를 원심분리하여 세포를 제거하고 0.22 ㎛ 필터로 여과하였다. 폴리-His 태그된 구조물은 Ni-NTA 컬럼(Qiagen)을 이용하여 정제하였다. 정제하기 전에 이미다졸을 5 mM 농도로 조건화된 배지에 첨가하였다. 조건화된 배지를 0.3 M NaCl 및 5 mM 이미다졸을 포함하는 20 mM Hepes 완충액(pH 7.4)으로 평형화된 6 ㎖ Ni-NTA 컬럼에 4℃에서 4 내지 5 ㎖/분의 유속으로 주입하였다. 로딩 후에 컬럼을 추가의 평형 완충액으로 세척하고 단백질을 0.25 M 이미다졸을 포함하는 평형 완충액으로 용출하였다. 이어서 고도로 정제된 단백질을 25 ㎖ G25 수퍼파인(Pharmacia) 컬럼으로 10 mM Hepes, 0.14 M NaCl 및 4％ 만니톨을 포함하는 저장 완충액(pH6.8)에서 염을 제거하고 -80℃에서 보관하였다.

단백질의 면역어드헤신(Fc 포함) 구조체는 다음과 같이 조건화된 배지로부터정제되었다. 조건화된 배지를 20 mM 인산 나트륨 완충액(pH 6.8)로 평형화된 5 ㎖ 단백질 A 컬럼(Pharmacia)에 주입하였다. 로딩후, 컬럼 평형화 완충용액으로 세척하고 100 mM 시트르산(pH 3.5)으로 용출하였다. 용출된 단백질을 275 ㎖의 1 M Tris 완충액(pH 9)을 포함하는 튜브에 1 ㎖ 분획으로 회수하여 즉시 중화시켰다. 이어서 고도로 정제된 단백질을 상기에 기재된 폴리-His 태그가 부가된 단백질의 경우와 같이 저장 완충액(pH6.8)에서 염을 제거하였다. 단백질의 상동성을 SDS-PAGE로 확인하고 에드만 분해법으로 수행되는 N-말단 아미노산 서열 분석으로 확인하였다.

실시예 9 : PRO 폴리펩티드에 결합하는 항체의 제조

본 실시예는 PRO 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 단클론 항체를 제조하는 방법이다.

단클론 항체를 생산하는 기술은 당업계에 공지되어 있으며 예를 들어 상기의 문헌(Goding)에 기재되어 있다. 이용될 수 있는 면역원은 본 발명의 정제된 PRO 폴리펩티드, PRO 폴리펩티드를 포함하는 PRO 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질 및 세포 표면에 재조합 리간드 상동체를 발현하는 세포를 포함한다. 숙련자는 부적당한 실험을 실시하지 않고도 면역원을 선택할 수 있다.

마우스, 예를 들어 Balb/c를 프로인드 완전 보조액에 유화된 PRO 폴리펩티드 면역원 1 내지 100 ㎍을 피하 또는 복강내 주사하여 면역화시켰다. 별법으로, 면역원을 MPL-TDM 보조액(Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT)에 유화시켜 동물의 뒷발바닥에 주사하여 면역화하였다. 이어서 면역화된 마우스를 10 내지 12일 후에 선택된 보조제 내에 유화된 추가의 면역원으로 부스팅하였다. 그 이후, 수주 동안 마우스를 추가 면역 주사로 부스팅할 수 있다. 항-PRO 폴리펩티드 항체를 검출하기 위한 ELISA 분석법을 시험하기 위해 역회전 출혈법으로 마우스로부터 혈청 시료를 주기적으로 채취하였다.

적합한 항체 역가가 검출되면, 항체에 대해 "양성"인 동물에 대해 주어진 리간드를 최종 정맥주사하였다. 3 내지 4일 후에 마우스를 희생시켜 비장 세포를 회수한다. 이어서, 비장 세포를 선택된 쥐의 골수종 세포주, 예를 들어 ATCC No. CRL 1597로부터 이용 가능한 P3X63AgU.1와 융합시켰다(35％ 폴리에틸렌 글리콜 이용). 융합체는 비 융합 세포, 골수종 하이브리드 및 비장세포 하이브리드의 증식을 억제하는 HAT(하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘) 배지를 포함하는 96 웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅될 수 있는 하이브리도마 세포를 생성하였다.

하이브리도마 세포는 PRO 폴리펩티드에 대한 반응성을 ELISA로 스크리닝될 수 있다. PRO 폴리펩티드에 대한 목적하는 단클론 항체를 분비하는 "양성" 하이브리도마 세포를 결정하는 방법은 당업계의 숙련자에게 잘 알려져 있다.

양성 하이브리도마 세포는 동계의 Balb/c 마우스가 항-PRO 폴리펩티드 단클론 항체를 포함하는 복수를 생산하도록 복강 내에 주사될 수 있다. 별법으로, 하이브리도마 세포는 조직 배양 플라스크 또는 롤러병에서 배양될 수 있다. 복수 내에서 생성된 단클론 항체는 황산암모늄 침전, 이어서 겔 배제 크로마토그래피를 이용하여 정제될 수 있다. 별법으로, 항체의 단백질 A 또는 단백질 G 결합을 기초로 하는 친화도 크로마토그래피를 이용할 수도 있다.

실시예 10: 키메라 PRO 폴리펩티드

PRO 폴리펩티드를 단백질 정제를 촉진하기 위해 첨가된 1종 이상의 추가의 폴리펩티드 도메인을 갖는 키메라 단백질로서 발현시킬 수 있다. 이러한 정제 촉진 도메인은 고정된 금속 상에서 정제를 허용하는 히스티딘-트립토판 모듈과 같은 금속 킬레이팅 펩티드, 고정된 면역글로불린 상에서 정제를 허용하는 Protein A 도메인 및 FLAGS™ 신장/친화성 정제 시스템 (임뮤넥스 코오퍼레이션(Immunex Corp., 워싱턴주 시애틀))에서 이용되는 도메인을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 정제 도메인과 PRO 폴리펩티드 서열 사이에 인자 XA 또는 엔테로키나제 (인비트로겐 (캘리포니아주 샌디에고))와 같은 절단가능한 링커 서열을 포함시키는 것이 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 발현을 촉진시키기 위해 유용할 수 있다.

실시예 11: 특이적 항체를 사용한 PRO 폴리펩티드의 정제

천연 또는 재조합 PRO 폴리펩티드를 단백질 정제 분야의 다양한 표준 기법으로 정제할 수 있다. 예를 들면, 프로(pro)-PRO 폴리펩티드, 성숙 PRO 폴리펩티드 또는 프리(pre)-PRO 폴리펩티드를 관심있는 PRO 폴리펩티드에 특이적인 항체를 사용하는 면역친화성 크로마토그래피로 정제한다. 일반적으로, 면역친화성 컬럼은 항-PRO 폴리펩티드 항체를 활성화된 크로마토그래피 수지에 공유 결합적으로 커플링시킴으로써 제작된다.

폴리클론 면역글로불린은 면역 혈청으로부터 황산암모늄으로 침전시키거나, 고정화 Protein A (Pharmacia LKB Biotechnology (뉴저지주 피츠카타웨이)) 상에서 정제하여 제조하였다. 유사하게, 모노클로날 항체는 생쥐 복수액으로부터 황산암모늄 침전법 또는 고정화 Protein A 상의 크로마토그래피에 의해 제조하였다. 부분적으로 정제된 면역글로불린을 CnBr-활성화 SEPHAROSE™ (Pharmacia LKB Biotechnology)와 같은 크로마토그래피 수지에 공유적으로 부착시켰다. 항체를 수지에 커플링시키고, 수지를 블록킹시키고, 유도된 수지를 제조업자의 지시에 따라 세척하였다.

이러한 면역친화성 컬럼은 PRO 폴리펩티드를 가용성 형태로 포함하는 세포로부터 분획을 제조함으로써 PRO 폴리펩티드의 정제에 이용된다. 이 제제는 세제 첨가에 의해 또는 당업계에 잘 알려져 있는 다른 방법에 의한 전세포의 가용화 또는 차등 원심분리를 통해 수득한 세포하 분획의 가용화에 의해 유도된다. 별법으로, 시그날 서열을 포함하는 가용성 PRO 폴리펩티드가 유용한 양으로 세포가 성장하는 배지 내로 분비될 수 있다.

가용성 PRO 폴리펩티드 함유 제제를 면역친화성 컬럼 상으로 통과시키고, 컬럼을 PRO 폴리펩티드의 차별적인 흡수를 허용하는 조건 (예를 들면, 세제의 존재 하에 고이온 농도 완충액) 하에 세척하였다. 이어서, 컬럼을 항체/PRO 폴리펩티드 결합을 파괴시키는 조건 (예를 들면, 약 pH 2-3과 같은 저 pH 완충액 또는 고농도의, 요소 또는 티오시아네이트 이온과 같은 카오트로프(chaotrope)) 하에 용출시키고, PRO 폴리펩티드를 회수하였다.

실시예 12 : 약물 스크리닝

본 발명은 PRO 폴리펩티드 또는 그의 결합 단편을 사용하여 임의의 다양한 약물 스크리닝 기법으로 화합물을 스크리닝하기 위해 특히 유용하다. 이러한 시험에 사용된 PRO 폴리펩티드 또는 단편은 용액 중에 유리되어 있거나, 고상 지지체에 고착되거나, 세포 표면에서 유지되거나, 세포내에 위치할 수 있다. 약물 스크리닝의 한 방법에서는 PRO 폴리펩티드 또는 단편을 발현하는 재조합 핵산을 사용하여 안정하게 형질전환된 진핵 또는 원핵 숙주 세포를 이용한다. 약물을 경쟁적 결합 분석으로 그러한 형질전환된 세포에 대해 스크리닝하였다. 생존형 또는 고정형의 그러한 세포는 표준 결합 분석을 위해 사용할 수 있다. 예를 들면, PRO 폴리펩티드 또는 단편과 시험되는 활성제 사이의 복합체 형성을 측정할 수 있다. 별법으로, 시험되는 활성제의 의해 유발된 PRO 폴리펩티드와 그의 표적 세포 또는 표적 수용체 사이의 복합체 형성의 감소를 검사할 수 있다.

따라서, 본 발명은 PRO 폴리펩티드-관련 질환 또는 장애에 영향을 끼칠 수 있는 약물 또는 임의의 다른 활성제를 스크리닝하기 위한 방법을 제공한다. 이들 방법은 그러한 활성제를 PRO 폴리펩티드 또는 그의 단편과 접촉시키고, 당업계에 잘 알려진 방법으로 (i) 활성제와 PRO 폴리펩티드 또는 단편 사이의 복합체의 존재 또는 (ii) PRO 폴리펩티드 또는 단편과 세포 사이의 복합체의 존재에 대해 분석하는 것을 포함한다. 이러한 경쟁적 결합 분석에서, PRO 폴리펩티드 또는 단편은 대개 표지화시킨다. 적합한 인큐베이션 후, 유리 PRO 폴리펩티드 또는 단편을 결합형으로 존재하는 것으로부터 분리시키며, 유리 또는 비복합된 표지의 양은 특정 활성제의 PRO 폴리펩티드에 결합하는 능력 또는 PRO 폴리펩티드/세포 복합체를 저해하는 능력의 척도이다.

또다른 약물 스크리닝 기법은 폴리펩티드에 적합한 결합 친화도를 갖는 화합물에 대한 고처리량 스크리닝을 제공하고, WO84/03564 (1984. 9. 13일자 공개)에 상세히 기재되어 있다. 간단히 서술하면, 다수의 상이한 작은 펩티드 시험 화합물을 플라스틱 핀 또는 몇몇 다른 표면과 같은 고상 기질 상에 합성한다. PRO 폴리펩티드에 적용시켜, 펩티드 시험 화합물을 PRO 폴리펩티드와 반응시키고 세척한다. 결합된 PRO 폴리펩티드는 당업계에 잘 공지된 방법으로 검출한다. 정제된 PRO 폴리펩티드는 또한 상기 언급한 약물 스크리닝 기법에 사용하기 위해 평판 상에 직접 코팅될 수 있다. 또한, 비중화 항체를 사용하여 펩티드를 포획하여 이를 고상 지지체 상에 고정시킬 수 있다.

본 발명은 또한 PRO 폴리펩티드에 결합할 수 있는 중화 항체가 PRO 폴리펩티드 또는 그의 단편에 결합하는데 있어서 시험 화합물과 특이적으로 경쟁하는 경쟁적 약물 스크리닝 분석의 이용을 고려한다. 이러한 방식으로, 항체를 PRO 폴리펩티드와 하나 이상의 항원 결정자를 공유하는 임의의 펩티드의 존재를 검출하기 위해 사용할 수 있다.

실시예 13: 합리적인(rational) 약물 디자인

합리적 약물 디자인의 목표는 관심있는 생물 활성 폴리펩티드 (즉, PRO 폴리펩티드) 또는 이들이 상호작용하는 작은 분자, 예를 들면, 아고니스트, 길항제 또는 억제제의 구조적 동족체를 생산하는 것이다. 이들 예 중 임의의 것들을 PRO 폴리펩티드의 보다 활성적이거나 보다 안정한 형태인 약물, 또는 생체내 PRO 폴리펩티드의 기능을 강화하거나 저해하는 약물을 형성하기 위해 이용할 수 있다 (문헌[호드슨 (Hodgson),Bio/Technology,9: 1921 (1991)] 참조).

한 연구에서, PRO 폴리펩티드 또는 PRO 폴리펩티드-억제제 복합체의 3차원 구조를 x-선 결정법, 컴퓨터 모델링 또는 가장 전형적으로 상기 두 방법의 조합에 의해 결정한다. 분자의 구조를 밝히고 활성 부위(들)을 결정하기 위해 PRO 폴리펩티드의 형태와 전하 모두를 확인해야 한다. 덜 빈번하지만, PRO 폴리펩티드의 구조에 관한 유용한 정보는 상동성 단백질의 구조를 기준으로 모델링함으로써 얻을 수 있다. 두 경우 모두, 관련 구조 정보를 동족 PRO 폴리펩티드 유사 분자를 디자인하거나 유효한 억제제를 확인하기 위해 사용한다. 합리적 약물 디자인의 유용한 예는 문헌[블락스톤(Braxton) 및 웰스(Wells),Biochemistry, 31:7796-7801 (1992)]에 나타낸 바와 같이 활성 또는 안정성을 증진시킨 분자, 또는 문헌[아타우다(Athauda) 등,J. Biochem.,113:742-746 (1993)]에 나타낸 바와 같이 천연 펩티드의 억제제, 아고니스트 또는 길항제로서 작용하는 분자를 포함할 수 있다.

표적-특이적 항체를 단리하고, 상기한 바와 같이 기능 분석에 의해 선택한 다음, 그의 결정 구조를 해석하는 것도 가능하다. 이 방법으로 원칙적으로 후속적인 약물 디자인이 기준이 될 수 있는 파마코어(pharmacore)를 얻는다. 단백질 결정법 기능성 약리 활성 항체에 대한 항-유전형 항체 (항-id)를 생산함으로써 단백질 결정법을 모두 회피하는 것도 가능하다. 거울상의 거울상으로서, 항-id의 결합 부위는 원래 수용체의 동족체일 것으로 기대될 것이다. 이어서, 항-id를 사용하여 화학적 또는 생물학적으로 생산된 펩티드 뱅크로부터 펩티드를 확인하고 단리시킬 수 있을 것이다. 이어서, 단리된 펩티드는 파마코어로서 작용할 것이다.

본 발명에 의해, x-선 결정법과 같은 분석적 연구를 수행하기 위해 충분한양의 PRO 폴리펩티드를 이용가능하게 할 수 있다. 또한, 본원에 제공된 PRO 폴리펩티드 아미노산 서열 지식은 x-선 결정법 대신 또는 그에 덧붙여 컴퓨터 모델링 기법을 이용하는데 지침을 제공할 것이다.

실시예 14 : 유전자 증폭

본 실시예는 여러 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 특정 인간 암의 게놈에서 증폭된다는 것을 보여준다. 증폭은 유전자 산물의 과다 발현과 관련되며, 이는 PRO 폴리펩티드가 특정 암, 예를 들어 결장암, 폐암 및 기타 암에서 치료의 유용한 표적이라는 것을 나타낸다. 치료제는 PRO 폴리펩티드-코딩 유전자의 길항제 형태, 예를 들어 PRO 폴리펩티드에 대한 쥐-인간 키메라, 인간화 항체 또는 인간 항체의 길항제가 될 수 있다.

스크리닝을 위한 출발 물질은 여러 암으로부터 단리된 게놈 DNA이다. DNA는 정확하게, 예를 들어 형광측정으로 정량되었다. 음성 대조군으로, DNA는 정상의 10명의 건강한 인간의 세포로부터 단리되어 건강한 인간(NorHu)에서의 유전자 카피의 분석 대조군으로 사용되었다.

5' 뉴클레아제 분석법(예, TaqMan™) 및 실시간 정량 PCR(예, ABIPrism7700 Sequence Detection System™(Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA))이 특정 암에서 증폭될 가능성 있는 유전자를 발견하는 데 이용되었다. 결과는 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA가 스크리닝되는 임의의 폐암 및 결장암에서 과잉발현되었는가를 결정하는 데 이용되었다. 결과는 델타 CT 단위로 나타낸다. 1 단위는 PCR 1 싸이클 또는 정상에 비해 약 2 배 증폭에 해당하며, 2 단위는 4배, 3 단위는 8 배 증폭에 해당한다. 정량에는 PRO 폴리펩티드로-코딩 유전자로부터 유도된 프라이머 및 TaqMan™ 형광을 이용하였다. 고유의 핵산 서열을 포함 가능성이 가장 크고 인트론을 스플라이싱할 가능성이 가장 작은 PRO 폴리펩티드 유전자 영역, 예를 들어 3' 비번역 부위가 프라이머 유도에 바람직하다.

5' 뉴클레아제 분석 반응은 실시간 동안 증폭을 모니터하기 위해 Taq DNA 폴리머라제의 5' 엑소뉴클레아제 활성을 이용하는 형광 PCR계 기술이다. 두 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 PCR 반응에 전형적인 앰플리콘을 생산하는데 이용된다. 제3 올리고뉴클레오티드 또는 프로브는 두개의 PCR 프라이머 사이에 위치한 뉴클레오티드 서열을 검출하도록 디자인된다. 프로브는 Taq DNA 폴리머라제 효소에 의해 신장되지 않으며 리포터 형광 염료 및 억제제 형광 염료로 표지된다. 리포터 염료로부터 레이저 유도된 방출은 두개의 염료가 프로브 상에 함께 가까이 위치할 때 억제 염료에 의해 억제된다. 증폭 반응 동안, TAQ DNA 폴리머라제 효소는 주형 의존적 방법으로 프로브를 절단한다. 생성되는 프로브 단편은 용액에서 분리되고, 방출된 염료의 시그날은 2차 형광단의 억제 효과를 받지 않는다. 리포터 염료의 한 분자는 각각의 합성된 신규 분자에 대해 방출되고 억제되지 않은 리포터 염료의 검출은 데이타의 정량적 해석의 기초를 제공한다.

5' 뉴클레아제 실험은 실시간 정량 PCR 장비, 예를 들어 ABI Prism 7700TM Sequence Detection에서 실시된다. 본 시스템은 열 순환기, 레이저, 하전-커플 장비(CCD) 카메라 및 컴퓨터로 구성된다. 본 시스템은 열 순환기에서 96 웰 형식으로 시료를 증폭시킨다. 증폭하는 동안, 레이저 유발된 형광 시그날을 96웰에 광섬유를 통해 실시간으로 모아져 CCD에서 검출된다. 본 시스템은 장치를 작동하고 분석을 위한 소프트웨어를 포함하고 있다.

5' 뉴클레아제 분석 자료는 초기에는 Ct 또는 스레스홀드 사이클로 표현된다. 이것은 리포터 시그날이 형광의 기본 수준 이상으로 축적될 때의 사이클로서 정의된다. Ct 측정값은 핵산 시료 내의 특정 표적 서열의 출발 카피에 대한 상대적 수치의 양적인 측정치로서 이용된다.

PRO351 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 상기 분석법에서 증폭되었다.

실시예 15 : 계내 혼성화

계내 혼성화는 세포 또는 조직 내에 핵산 서열의 발견 및 위치 결정을 위한 강력하고 다양한 기술이다. 예를 들어, 유전자 발현 부위의 확인, 전사의 조직 분포의 분석, 바이러스 감염의 확인 및 위치 결정, 특정 mRNA 합성의 변화의 확인 및 염색체 맵핑에 유용하다.

PCR-합성된³³P 표지된 리보프로브를 이용한 최적화된 실험방법[Lu and Gillett, Cell Vision 1: 169-176(1994)]을 이용하여 계내 혼성화를 실시하였다. 포르말린 고정된 파라핀에 삽입된 인간의 조직을 절편화하고, 파라핀을 제거하고, 프로테이나제 K(20 g/㎖)로 37℃에서 15분간 단백질을 제거한 후 Lu 와 Gillett(1994)가 기재한 방법으로 계내 혼성화를 진행하였다. [³³P] UTP-표지 안티센스 리보프로브를 PCR 산물로부터 얻어 55℃에서 밤새 혼성화하였다. 슬라이드를 KODAK NTB2 뉴클리어 트랙 에멀전에 침지시키고 4주 동안 노출시켰다.

³³ P-리보프로브 합성

6.0 ㎕ (125 mCi)의³³P-UTP(Amersham BF 1002, SA < 2000 Ci/mmole)를 스피드 백에서 건조시켰다. 건조된³³P-UTP를 포함하는 각 튜브에 다음 성분들을 첨가하였다.

2.0 ㎕ 5 x 전사 완충액

1.0 ㎕ DTT (100 mM)

2.0 ㎕ NTP 혼합물 (2.5 mM:10μ;각각의 10 mM GTP, CTP ＆ ATP + 10 ㎕ H₂O)

1.0 ㎕ UTP (50 μM)

1.0 ㎕ Rnasin

1.0 ㎕ DNA 주형 (1 ㎍)

1.0 ㎕ H₂O

1.0 ㎕ RNA 폴리머라제 (일반적으로, PCR 산물용 T3=AS, T7=S)

튜브를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1.0 ㎕ RQ1 DNase를 첨가하고 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 90 ㎕ TE(10 mM Tris pH 7.6/1 mM EDTA pH 8.0)를 첨가하고 혼합물을 DE81 종이 위에 피펫으로 옮겼다. 남은 용액은 Microcon-50 한외여과 장치(ultrafiltration unit)에 넣고 프로그램 10(6분)을 이용하여 회전시켰다. 여과 장치를 뒤집어 두 번째 튜브 상에 놓고 프로그램 2(3분)을 이용하여 회전시켰다. 최종적으로 회수하기 위해 회전시킨 후, 100 ㎕ TE를 첨가하였다. 최종 산물 1 ㎕를 DE81 종이 위에 피펫으로 옮기고 6 ㎖ 바이오플루오르 II(Biofluor II)내에서 계수하였다.

프로브를 TBE/우레아 겔에서 전기영동시켰다. 프로브 1 내지 3 ㎕ 또는 RNA MrkIII 5 ㎕를 로딩 완충액 3 ㎕에 첨가하였다. 95℃ 가열 블록에서 3분간 가열한 후에 즉시 얼음에 넣었다. 겔의 웰을 세척하고 시료를 넣고 180 내지 250 V에서 45분간 전기영동하였다. 겔을 사란랩으로 싸고 -70℃ 냉동실에서 1시간 내지 밤새도록 강화 스크린이 있는 XAR 필름에 노출시켰다.

³³ P-혼성화

A. 냉동절편의 전처리

슬라이드를 냉동실에서 꺼내어 알루미늄 접시에 놓고 상온에서 5분간 녹였다. 응축을 감소시키기 위해 접시를 55℃ 배양기에서 5분간 두었다. 연기 배출기에서 빙상의 4％ 파라포름알데하이드 내에 슬라이드를 10분간 고정시키고 나서 상온에서 5분간 0.5 x SSC(25 ㎖ 20 x SSC + 975 ㎖ SQ H₂O)로 세척하였다. 37℃에서 10분간 0.5 ㎍/㎖ 프로테이나제 K(250 ㎖의 미리 가온시킨 RNase 부재 RNAse 완충액 내의 10 ㎎/㎖ 원액 12.5 ㎕)로 단백질을 제거한 후 절편들을 상온에서 10분간 0.5 x SSC로 세척하였다. 절편은 70％, 95％, 100％ 에탄올로 각각 2분간 탈수시켰다.

B. 파라핀에 삽입된 절편의 전처리

슬라이드에서 파라핀을 제거하고 SQ H₂O에 넣고, 상온에서 각각 2분간 2 x SSC로 두차례 세척하였다. 인간의 배의 경우 절편을 20 ㎍/㎖ 프로테아제 K(250 ㎖의 RNase 부재 RNAse 완충액 내의 10 ㎎/㎖ 용액 500 ㎕, 37℃, 15분) 또는 포르말린 조직의 경우 8 x 프로테아제 K(250 ㎖ RNAse 완충액 내의 100 ㎕, 37℃, 30분)로 단백질을 제거하였다. 이어서 절편들을 상기한 바와 같이 0.5 x SSC로 세척하고 탈수하였다.

C. 전혼성화

슬라이드를 박스 완충액(4 x SSC, 50％ 포름아마이드)-포화된 여과지로 충전된 플라스틱 박스에 놓았다. 조직을 혼성화 완충액 50 ㎕(3.75 g 덱스트란 술페이트 + 6 ㎖ SQ H₂O)로 덮고, 섞어준 후 마개를 느슨하게 하여 마이크로파로 2분간 가열하였다. 빙상에 냉각시킨 후, 18.75 ㎖ 포름아미드, 3.75 ㎖ 20 x SSC 및 9 ㎖ SQ H₂0 를 첨가하고 조직을 볼텍싱한 후 42℃에서 1 내지 4시간 동안 인큐베이션하였다.

D. 혼성화

슬라이드 당 1.0 x 10⁶cpm 프로브 및 1.0 ㎕ tRNA(50 ㎎/㎖ 원액)를 95℃에서 3분간 가열하였다. 슬라이드를 빙상에서 식히고 48 ㎕ 혼성화 완충액을 각 슬라이드에 첨가하였다. 잘 섞어준 후 50 ㎕³³P 혼합물을 슬라이드 상의 전혼성화물에 첨가하였다. 슬라이드를 55℃에서 밤새 인큐베이션하였다.

E. 세척

2 x SSC, EDTA(400 ㎖ 20 x SSC +16 ㎖ 0.25 M EDTA, V_f=4L)로 상온에서 10분 동안 2회 세척하고, 37℃에서 30분간 RNase A(250 ㎖ Rnase 완충액 내의 10 ㎎/㎖ 용액 500 ㎕ = 20 ㎍/㎖)를 처리하였다. 슬라이드를 2 x SSC, EDTA로 상온에서 10분간 2회 세척하였다. 엄격 세척 조건은 55℃에서 2시간, 0.1 x SSC, EDTA(20 ㎖ 20 x SSC + 16 ㎖ EDTA, V_f=4L)이었다.

F. 올리고 뉴클레오티드

본원에 개시된 여러 DNA 서열에 대해 계내 혼성화 분석을 실시하였다. 이 분석에 이용된 올리고뉴클레오티드는 본원에 개시된 뉴클레오티드 서열에서 유래되었으며 일반적으로 40 내지 55개 길이의 뉴클레오티드이다.

재료의 기탁

다음 재료들을 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (미국 메릴랜드주 록빌 파크론 드라이브 12301) (ATCC)에 기탁하였다:

재료 ATCC 기탁번호 기탁일

DNA40571-1315ATCC2097841998년 4월 21일

이들 기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 및 그의 규칙 (부다페스트 조약 (Budapest Treaty))의 규정 하에 이루어졌다. 이는 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 생존 배양물의 유지를 보장한다. 기탁물은부다페스트 조약의 협약 하에 ATCC로부터 제넨테크 인크와 ATCC 사이 협정에 따라 분양될 것이며, 이는 관련 미국 특허의 허여시 또는 미국 또는 외국 특허 출원의 공개시 (이 중 먼저인 때) 공공에 대한 기탁물의 배양 프로제니의 영구적이고 비제한적인 분양을 보장하고, 미국 특허 및 상표청장에 의해 35 USC §122 및 그에 따른 미국 특허 및 상표청장의 규칙 (37 CFR §1.14 포함, 특히 886 OG 638 참조)에 따라 권리가 있는 것으로 결정한 이에게 프로제니의 분양을 보장한다.

본 출원의 양수인은 적합한 조건 하에 배양할 때 기탁 물질의 배양물이 사멸하거나 손실되거나 파손된 경우, 그 통지시 물질을 다른 동일한 물질로 즉시 교체할 것임을 동의하였다. 기탁 물질의 분양은 각국 정부의 권한으로 그 특허법에 따라 승인된 권리에 위배하여 본 발명을 실시하도록 허가하는 것으로서 해석되어서는 안된다.

앞서 기술한 명세서는 당업계의 숙련인이 본 발명을 실시할 수 있도록 하기에 충분한 것으로 생각된다. 본 발명은 기탁된 실시양태는 본 발명의 특정 측면의 한 예시로서 의도되는 것이므로 기탁된 구조물의 범위에 제한되지 않고, 기능적으로 동등한 임의의 구조물은 본 발명의 범위 내에 있다. 본원에서 물질의 기탁은 본원에 포함된 기재 내용이 본 발명의 최선의 양식을 포함한 임의의 측면을 실시하기에 부적절하다는 것을 의미하지는 않으며, 특허 청구 범위의 범위를 명세서에서 나타내는 구체적인 설명에 제한하려는 것으로 해석되어서는 안된다. 실제로, 앞서의 상세한 설명으로부터 본원에 나타내고 기술된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형이 당업계의 숙련인에게는 명백하고, 이는 첨부된 특허 청구의 범위 내에 있을 것이다.

본 발명자들은 이 명세서에서 신규한 PRO351 폴리펩티드 및 이 폴리펩티드를 코딩하는 신규 핵산의 확인 및 특징 분석을 기재했다.

Claims (24)

1. 도 2 (서열 132)에 나타낸 아미노산 서열과의 서열 동일성이 80％ 이상인 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드.
2. 제1항에 있어서, 도 2 (서열 132)에 나타낸 아미노산 서열과의 서열 동일성이 85％ 이상인 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드.
3. 제2항에 있어서, 도 2 (서열 132)에 나타낸 아미노산 서열과의 서열 동일성이 90％ 이상인 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드.
4. 제1항에 있어서, 도 2 (서열 132)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드.
5. 제1항에 있어서, 기탁 번호 ATCC 209784로 기탁된 DNA에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드.
6. 이종(heterologous) 아미노산 서열에 융합된 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자.
7. 제6항에 있어서, 상기 이종 아미노산 서열이 에피토프 서열인 키메라 분자.
8. 제6항에 있어서, 상기 이종 아미노산 서열이 면역글로불린의 Fc 영역인 키메라 분자.
9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체.
10. 제9항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
11. 제10항에 있어서, 인간화 항체인 항체.
12. 제10항에 있어서, 키메라 항체인 항체.
13. 제10항에 있어서, 인간 항체인 항체.
14. 도 2 (서열 132)에 나타낸 아미노산 서열과의 서열 동일성이 80％ 이상인 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
15. 제14항에 있어서, 도 2 (서열 132)에 나타낸 아미노산 서열과의 서열 동일성이 85％ 이상인 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
16. 제15항에 있어서, 도 2 (서열 132)에 나타낸 아미노산 서열과의 서열 동일성이 90％ 이상인 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
17. 제16항에 있어서, 도 2 (서열 132)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
18. 제14항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 도 1 (서열 131)에 나타낸 뉴클레오티드 서열의 전장 코딩 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
19. 제14항에 있어서, 기탁 번호 ATCC 209784로 기탁된 DNA의 전장 코딩 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
20. 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 벡터.
21. 제20항에 있어서, 상기 핵산이 형질전환될 숙주 세포에 의해 인식되는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 것인 벡터.
22. 제20항 또는 제21항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
23. 제22항에 있어서, CHO 세포, 대장균(E. coli.) 세포 또는 효모 세포인 숙주 세포.
24. 제22항 또는 제23항의 숙주 세포를 상기 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에서 배양하는 단계 및 이 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드의 생산 방법.