JP2013502217A - ａｒＮＯＸタンパク質９回膜貫通型スーパーファミリー（ＴＭ９ＳＦ）のクローニング及び発現、方法並びに利用 - Google Patents

Abstract

加齢関連障害についての細胞表面及び循環マーカー（ＮＡＤＨ酸化酵素の特定のアイソフォーム（ａｒＮＯＸ））が記載される。組換え加齢関連ＮＡＤＨ酸化酵素アイソフォーム及びそれらのコード配列、並びに組織及び血液、血清、尿、唾液、汗及びその他の体液中のａｒＮＯＸアイソフォームの存在及び量を検出する方法が提供される。組換えａｒＮＯＸタンパク質は、モノクローナル及びポリクローナル抗体並びに加齢障害の診断及び治療用の免疫原性組成物の作製で使用するための抗原の調製において有用である。ＤＮＡ配列情報に基づくＤＮＡプローブは、加齢障害の危険性がある個体を同定するため、及び治療的介入又は老化防止化粧品若しくは哺乳動物における加齢プロセスを遅らせることに利益をもたらすその他の製剤を開発するために用いることができる。
【選択図】なし

Description

発明の詳細な説明

［関連出願の相互参照］
[0001]本出願は、本開示と矛盾しない範囲で本明細書に参照により組み込まれている、２００９年８月１７日にファイルされた米国特許仮出願第６１／２３４，３６８号の利益を主張する。

［背景］
[0002]本開示は、分子生物学及び生化学の分野に関し、特にＮＡＤＨ酸化酵素の加齢特異的アイソフォーム（ａｒＮＯＸ）による酸化ダメージを原因とする障害の予防又は治療に関し、加齢関連障害についての循環マーカー、その組み換え発現及び発現又は阻害剤についてのスクリーニングアッセイにも関する。

[0003]細胞膜電子伝達の末端酸化酵素として機能して、細胞質ヒドロキノン還元酵素、細胞膜局在キノン及びＮＯＸタンパク質を伴う電子伝達鎖を完了する、ヒドロキノン（ＮＡＤＨ）酸化酵素活性（ＮＯＸという）を有する細胞表面タンパク質が、本発明者らにより明らかにされた（Ｋｉｓｈｉら、１９９９、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １４１２：６６〜７７及びＭｏｒｒｅ、１９９８、Ｐｌａｓｍａ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｒｅｄｏｘ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｒｏｌｅ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｋｌｅｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、１２１〜１５６頁）。この系は、加齢のミトコンドリア理論の影響の合理的な基礎、並びに、加齢の過程におけるミトコンドリアのＡＴＰ合成能力及びその他のエネルギー依存性プロセスの減退を含む加齢に関連するミトコンドリア損傷の伝搬の合理的な基礎をもたらす（Ｂｏｆｆｏｌｉら、１９９６、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １２２６：７３〜８２；Ｌｅｎａｚら、１９９８、ＢｉｏＦａｃｔｏｒｓ ８：１９５〜２０４；ｄｅ Ｇｒｅｙ、１９９７、ＢｉｏＥｓｓａｙｓ １９：１６１〜１６６；及びｄｅ Ｇｒｅｙ、１９９８、Ｊ．Ａｎｔｉ−Ａｇｉｎｇ Ｍｅｄ．１：５３〜６６）。

[0004]細胞膜ＮＡＤＨ酸化酵素（ＮＯＸ又はＥＮＯＸ）は、ホルモン及び増殖因子に対して通常応答するヒドロキノン（ＮＡＤＨ）酸化酵素活性と、タンパク質ジスルフィド−チオール交換活性とを有するユニークな細胞表面タンパク質である。ａｒＮＯＸ（又はＥＮＯＸ３）は、加齢細胞と関連する成長関連タンパク質のファミリーである。

[0005]ＮＡＤＨ酸化酵素の加齢関連アイソフォーム（ａｒＮＯＸ）は、ＥＮＯＸタンパク質のこのファミリーのメンバーである。ａｒＮＯＸの循環型は、特に６５歳より後の個体のヒト血清及びリンパ球において著しく増加する。ａｒＮＯＸタンパク質は、アテローム発生及びその他の遠隔作用加齢現象を含む加齢に関連する変化に著しく寄与し得るスーパーオキシドラジカルを作製する能力を独特の特徴とする。加齢細胞及び血清におけるａｒＮＯＸの活性は、以前に記載されている（Ｍｏｒｒｅ及びＭｏｒｒｅ、２００６、Ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ Ｒｅｓ．９：２３１〜２３６）。

[0006]加齢は、フリーラジカルを伴う破壊的化学反応のレベルが増え続けることに起因し、該プロセスの主なメディエーターがミトコンドリアであることが提案されている（Ｈａｒｍａｎ、１９５６、Ｊ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．１１：２９８〜３００及びＨａｒｍａｎ、１９７２、Ｊ．Ａｍ．Ｇｅｒｉａｔｒ．Ｓｏｃ．２０：１４５〜１４７）。この考えを支持する推論の中心は、全ての細胞内成分のうち、ミトコンドリアが、フリーラジカルの主要な供給源と、フリーラジカルダメージの主要な直接的な犠牲者との両方であるということである。結果として、ミトコンドリア機能の喪失が、加齢の根底にある細胞内変化の駆動力であり、より緩慢なタンパク質代謝回転のようなその他の酸化促進変化の原因になることがある。この理論は、間接的及び直接的な実験により広く支持されている。例えば、加齢の過程におけるＡＴＰ合成能力の減退及びエネルギー依存性プロセスの減退が報告されている（Ｓｙｒｏｖｙ及びＧｕｔｍａｎｎ、１９９７、Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．１２：３１〜３５；Ｓｕｇｉｙａｍａら、１９９３、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｌ．３０：９３７〜９４４；Ｂｏｆｆｏｌｉら、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １２２６：７３〜８２；並びにＬｅｎａｚら、１９９８、ＢｉｏＦａｃｔｏｒｓ ８：１９５〜２０４）。

[0007]ａｒＮＯＸの効果についてのこのモデルは、加齢の過程において、ミトコンドリアにおける増加した活性酸素種がミトコンドリアＤＮＡに変異を引き起こし、ミトコンドリア成分にダメージを与えて、老齢化をもたらすという加齢のミトコンドリア理論と矛盾しない。加齢のミトコンドリア理論は、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の自発的体細胞変異の蓄積が、ｍｔＤＮＡによりコードされるポリペプチド鎖に誤りを導くと提案している（Ｍａｎｃｚａｋ Ｍら、２００５、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．９２（３）：４９４〜５０４）。ｍｔＤＮＡによりコードされるポリペプチド鎖で生じるこれらの誤りは、確率論的であり、ミトコンドリア及び細胞分裂中に、無作為に伝えられる。これらの変化の結果は、酸化的リン酸化に欠陥をもたらす。呼吸鎖での欠陥は、元のダメージを増幅する酸化ストレスの増加と関連するようになることがある（Ｏｚａｗａ、１９９５、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １２７１：１７７〜１８９；及びＬｅｎａｚ、１９９８、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３６６：５３〜６７）。この観点で、よって、変異ミトコンドリアＤＮＡは、体内に非常に少量でしか存在しなくても、酸化ストレスの主な発生原因になり得る。

[0008]ｍｔＤＮＡの体細胞変異の蓄積が酸化的リン酸化の欠陥を導く場合、細胞膜酸化還元酵素（ＰＭＯＲ）系が、酸化されたピリジンヌクレオチドの再生により、ミトコンドリアに欠陥がある細胞の生存を増すと示唆されている（ｄｅ Ｇｒｅｙ、１９９７、ＢｉｏＥｓｓａｙｓ １９：１６１〜１６６；ｄｅ Ｇｒｅｙ、１９９８、Ａｎｔｉ−Ａｇｉｎｇ Ｍｅｄ．１：５３〜６６；Ｙｏｎｅｄａら、１９９５、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２０９：７２３〜７２９；Ｓｃｈｏｎら、１９９６、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ、Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９〜３４頁；Ｏｚａｗａら、１９９７、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７７：４２５〜４６４；及びＬｅｎａｚ、１９９８、ＢｉｏＦａｃｔｏｒｓ８：１９５〜２０４頁）。しかし、それらのｍｔＤＮＡの変化は、加齢に関連する他の形態の細胞及び組織の変化と関連しにくい。これらのうちで主要なものは、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）酸化及びアテローム発生である（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ、１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２０９６３〜２０９６６）。

[0009]ｍｔＤＮＡにおける損傷の蓄積と、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）における脂質の酸化及び付随する動脈の変化とを関連づけるモデルが、ｒｈｏ^０細胞を用いて最初に提案された（Ｌａｒｍら、１９９４、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３００９７〜３０１００；Ｌａｗｅｎら、１９９４、Ｍｏｌ．Ａｓｐｅｃｔｓ．Ｍｅｄ．１５：ｓ１３〜ｓ２７；ｄｅ Ｇｒｅｙ、１９９７、ＢｉｏＥｓｓａｙｓ １９：１６１〜１６６；並びにｄｅ Ｇｒｅｙ、１９９８、Ａｎｔｉ−Ａｇｉｎｇ Ｍｅｄ．１：５３〜６６）。同様の研究が、形質転換された培養ヒト細胞を用いて行われた（Ｖａｉｌｌａｎｔら、１９９６、Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．Ｂｉｏｍｅｍｂ．２８：５３１〜５４０）。

[0010]細胞膜酸化還元酵素（ＰＭＯＲ）が過剰発現される状況の下で、電子は、ＮＡＤＨから外部アクセプターに、確定された電子伝達鎖により輸送され、細胞表面にて活性酸素種（ＲＯＳ）が作製される。このような細胞表面で作製されたＲＯＳは、次いで、ミトコンドリアを起源とする加齢カスケードを、隣接細胞と低密度リポタンパク質のような循環血液成分との両方に伝搬することがある（Ｍｏｒｒｅ及びＭｏｒｒｅ、２００６、Ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ Ｒｅｓ．９：２３１〜２３６）。

[0011]加齢は、ヒトの健康にとって著しい脅威となり、加齢に関連する障害は著しい経済的及び社会的経費をもたらすので、加齢に関連する疾患の状態をアッセイするか又は該状態のモデル阻害剤となる効果的で経済的で技術的に単純な系、加齢に関連する酵素特異的マーカー及び抗体、並びに試薬、阻害剤及び活性化剤スクリーニング方法及び発現系に対する必要性が長く存在している。

［概要］
[0012]組換え膜結合タンパク質又は可溶性タンパク質としての組換え加齢関連ＮＡＤＨ酸化酵素のアイソフォーム（本明細書においてａｒＮＯＸと称する）、それらのコード配列及びこれらの配列を含有してこれらのタンパク質を発現する単離宿主細胞を提供することが目的である。全長配列は、表１並びに配列番号１、３、５、７及び９に示す具体的な例示的ゲノムコード配列を有する。配列表は、対応するスプライシングされたコード配列についての情報を含む。全長タンパク質は、表２並びに配列番号２、４、６、８及び１０に示すアミノ酸配列を有する。これらの具体的に例示した配列と同義のコード配列も、この目的に包含される。組換えａｒＮＯＸタンパク質のさらなる態様は、表３並びに配列番号１３〜１７に示すような可溶性（切断型）ａｒＮＯＸについてのものである。これらの切断型タンパク質は、膜組み込み領域を規定するＣ末端部分を欠く。所望により、組換えａｒＮＯＸタンパク質は、「タグ」領域をさらに含んで、タグ配列の発現後の精製を促進でき、タグ配列は当該技術において公知であり、ヘキサヒスチジン、鞭毛抗原（Ｆｌａｇ）、グルタチオン合成酵素（ＧＳＴ）、ビオチン結合タンパク質（ＡｖｉＴａｇ）などを含む。

[0013]加齢細胞表面マーカーをコードし、該コード配列がストリンジェントな条件下で上記の具体的に例示した全長又は部分配列にハイブリダイズし、ａｒＮＯＸの酵素活性を有する配列も包含される。細胞表面ａｒＮＯＸは、年齢進行の特徴であり、細胞表面から切り落とされた場合、これは、加齢障害の非侵襲性マーカーとして体液中を循環する。組換えａｒＮＯＸタンパク質、特に全長タンパク質の酵素活性部分は、加齢障害の診断及び治療用のポリクローナル及びモノクローナルの両方の抗体の作製に用いるための抗原の調製において有用である。

[0014]哺乳動物において加齢関連ａｒＮＯＸを決定するための方法もさらに提供され、該方法は、生体試料中の１又は複数のａｒＮＯＸアイソフォームの存在及び量を、酵素活性の測定、免疫学的検出法による特定のタンパク質の測定、又は関連する遺伝子の転写発現の測定により検出するステップを含む。

[0015]本開示により、組換えａｒＮＯＸアイソフォーム若しくは切断型ａｒＮＯＸアイソフォームタンパク質、又はａｒＮＯＸアイソフォームアミノ酸配列に由来する配列の抗原性ペプチドを特に用いる抗体調製物の作製が可能になり、該抗体は、配列番号２、４、６、８、１０若しくは１３〜１７に示すアミノ酸配列を特徴とするタンパク質又は本明細書に示すペプチド配列からなる群より選択されるタンパク質と特異的に結合する。これらの抗体含有組成物は、患者からの血液、血清、唾液、汗又は組織（生体試料）中の１又は複数のａｒＮＯＸタンパク質を検出して、ａｒＮＯＸ状態及び／又は治療介入に対する応答を確認することにおいて有用である。

[0016]少なくとも１つの組換えａｒＮＯＸアイソフォーム若しくは切断型ａｒＮＯＸアイソフォームタンパク質、又は表２に示すアミノ酸配列を特徴とするタンパク質からなる群より選択される抗体と特異的に結合するａｒＮＯＸアイソフォームアミノ酸配列に由来する配列の抗原性ペプチドを含む免疫原性組成物。５つのａｒＮＯＸアイソフォームのそれぞれに特異的な抗体を作製するために有用なペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：ＴＭ９ＳＦ１ａ及び／又はＴＭ９ＳＦ１ｂ、ＱＥＴＹＨＹＹＱＬＰＶＣＣＰＥＫＩＲＨＫＳＬＳＬＧＥＶＬＤＧＤＲ、配列番号２のアミノ酸５６〜８７；ＴＭ９ＳＦ２、ＶＬＰＹＥＹＴＡＦＤＦＣＱＡＳＥＧＫＲＰＳＥＮＬＧＱＶＬＦＧＥＲ、配列番号６のアミノ酸７３〜１０４；ＴＭ９ＳＦ３、ＱＥＴＹＫＹＦＳＬＰＦＣＶＧＳＫＫＳＩＳＨＹＨＥＴＬＧＥＡＬＱＧＶＥ、配列番号８のアミノ酸５５〜８８；並びにＴＭ９ＳＦ４、ＱＬＰＹＥＹＹＳＬＰＦＣＱＰＳＫＩＴＹＫＡＥＮＬＧＥＶＬＲＧＤＲ、配列番号１０のアミノ酸５３〜８４は、上記のような抗体を調製するために有用である。ＴＭ９ＳＦ１ａ（しかしＴＭ９ＳＦ１ｂではない）の膜結合型に特異的な抗体は、配列番号２のアミノ酸５４８〜５６８（ＬＹＳＶＦＹＹＡＲＲＳＮＭＳＧＡＶＱＴＶＥ）に示す配列を有するペプチド抗原を用いて作製される。ペプチド抗体を有する免疫原性組成物は、典型的に、担体分子と結合したペプチドを含み、担体分子は、当該技術において公知の他のタンパク質のうちでキーホールリンペットヘモシアニンであってもよい。さらに、このような免疫原性組成物は、ヒト又は動物においてａｒＮＯＸ酵素により行われる酸化反応のあるいくつかの有害な態様の重篤度を低減し、そのことによりそのような免疫原性組成物が投与された個体の健康及び幸福を改善するために用いることができる。

[0017]組織並びに尿及び血清、汗、唾液又はその他の体液中のａｒＮＯＸ及び切り落とされた（可溶形）ａｒＮＯＸに特異的な抗体は、ＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングするため、又は加齢関連障害若しくはそのような障害についての傾向を、ヒト若しくは動物からの試料中で検出又は診断するためのプローブとして有用である。望ましくは、抗体（又はａｒＮＯＸを認識する抗体に特異的な二次抗体）は、共有結合又は非共有結合により、検出可能なシグナルを提供する物質をつなぐことにより標識される。適切な標識は、それらに限定されないが、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光物質、化学発光物質、磁性粒子などを含む。このような標識の使用について記載する米国特許は、それらに限定されないが、米国特許第３，８１７，８３７号、第３，５８０，７５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，４３７号、第４，２７５，１４９号及び第４，３６６，２４１号を含む。診断及びスクリーニングアッセイに有用な抗体は、上記の全長タンパク質又は表２若しくは３に示すもののうちのアミノ酸配列に相当するタンパク質の全部又は一部に由来する配列のペプチド抗原を用いて調製できる。

[0018]ａｒＮＯＸタンパク質若しくは本明細書で上記のペプチドのようなその抗原性部分を含む免疫原性組成物及び／又はワクチンは、当該技術において知られる任意の手段により処方して投与できる。これらは、典型的には、溶液又は懸濁液のいずれかとしての注射剤として調製される。注射前に液体中に溶解又は懸濁するために適切な固体形態も調製できる。調製物は、例えば乳化してもよいか、又はリポソームに被包されたタンパク質（複数可）／ペプチド（複数可）であってもよい。有利には、このような免疫原性組成物は、免疫応答を刺激する少なくとも１つの成分、例えばアジュバントを含む。免疫原性組成物の投与は、ヒト若しくは実験動物において皮下、皮内、腹腔内、静脈内、筋内経路、又は実験動物の肉趾内へ、又は当該技術において知られるその他の経路によることができる。

[0019]ノーザンブロット分析を用いて、ａｒＮＯＸのコード配列（複数可）が、加齢障害の危険性がある個体において発現されていることを示すことができる。配列（複数可）を用いることができるので、発現の特異性の迅速なさらなる試験及び治療介入又は加齢化粧品若しくはその他の製剤のさらなる開発が可能になる。

[0020]ヒトａｒＮＯＸ、組換えヒトａｒＮＯＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列、及び組換えヒトａｒＮＯＸを発現する組換え細胞は、加齢診断プロトコール、並びに新しい抗加齢薬物及び／又は栄養補助剤、薬用化粧品、薬用栄養素及び加齢防止又は遅延方策を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて用いるための、組換えａｒＮＯＸタンパク質（複数可）又はその一部分の生成において用いることができる。

[0021] ＴＭ−９タンパク質スーパーファミリーメンバーの膜結合の図である。Ｎ末端可溶性断片は、切断部位にてタンパク質切断され、細胞の外部環境又は細胞内小胞の内腔に放出される。 [0022] アイソフォームＳＦ２の機能的ａｒＮＯＸモチーフとその位置を示す。可溶性酵素のアミノ酸配列について、配列番号６を参照されたい。 [0023] フェリシトクロムｃの低減により測定されるスーパーオキシドの産生だけを示す組換え可溶性ａｒＮＯＸアイソフォームＳＦ−４のａｒＮＯＸ活性を示す。最大値は、２６分の間隔で離れている。 [0024] 一般的なＥＮＯＸタンパク質に特徴的な、典型的な５ピークパターンの活性を示す組換え可溶性ａｒＮＯＸアイソフォームＳＦ−４のａｒＮＯＸ活性を示す。比活性の単位は、μモル／分／ｍｇタンパク質であることに注意されたい。スーパーオキシド産生は、５最大値振動パターンのうちの最大値３で強くなる。 [0025] ２８歳の女性からのリンパ球における、８℃でのインキュベーションの第２日と第５及び６日でのａｒＮＯＸ活性の誘導を示す。この期間内の５つ全てのａｒＮＯＸアイソフォームの際立った誘導に注意されたい。 [0026] ａｒＮＯＸ活性（上のパネル）及びａｒＮＯＸメッセンジャーＲＮＡ（下のパネル）の誘導の時間経過を示す。後者は、２２歳及び７３歳の個体からのリンパ球を用いて得られた結果を比較する。 [0027] 血清へのペプチド抗体の逐次的添加により得られた結果を示し、これは、特異的アイソフォームＳＦ１〜ＳＦ４を用いて採血前に存在する特定の最大値の関連性の同定を示す。ＳＦ−４特異的抗体を加えた後に、ａｒＮＯＸ活性が残存する証拠は観察されなかった。ＴＭ９ＳＦ３に特異的な抗体を加えた後に、１つのアイソフォームだけが残った。ＴＭ９ＳＦ２特異的抗体を加えた後に、２つのアイソフォームが残った、などである。 [0028] ａｒＮＯＸ特異的ペプチドを抗原として用いて調製されたａｒＮＯＸ特異的抗体を用いる、皮膚、唾液及び血清中のＥＬＩＳＡによるａｒＮＯＸ検出及び相対的な量を示す。 [0029] ａｒＮＯＸ特異的抗体調製物を用いるＥＬＩＳＡを用いて評価された、老齢の人及び若い人からの材料におけるａｒＮＯＸの相対的な量を示す。図９Ａは、皮膚切屑物におけるａｒＮＯＸについての結果を示し、図９Ｂは、３の異なる年齢の４名の個体から採取した血清試料中の相対的な量を示し、図９Ｃは、老齢及び若い個体からの唾液試料における、全てのａｒＮＯＸアイソフォームに特異的な抗体の組み合わせを用いて行ったＥＬＩＳＡからの結果を示す。

［詳細な説明］
[0030]本明細書で用いる場合、「障害」との用語は、不具合、疾患、病気、臨床状態又は病的状態のことをいう。

[0031]本明細書で用いる場合、「活性酸素種」との用語は、フリーラジカル（例えばスーパーオキシド又はヒドロキシルラジカル）の形成をもたらす酸素の代謝又は自由電子の移動からの酸素誘導体のことをいう。

[0032]本明細書で用いる場合、「抗酸化剤」との用語は、活性酸素種の活性を中和するか又は該活性種により行われた細胞へのダメージを阻害する化合物のことをいう。

[0033]本明細書で用いる場合、「９回膜貫通型スーパーファミリー」との用語は、まとめてａｒＮＯＸ又はａｒＮＯＸタンパク質としても知られる、本明細書の表１及び２に示すメンバー１ａ、１ｂ、２、３及び４と配列類似性又は相同性を有する任意のそして全てのタンパク質のことをいう。

[0034]本明細書で用いる場合、「単離宿主細胞」との用語は、細胞が、インタクトな多細胞生物の一部分でないことを意味する。

[0035]９回膜貫通型（ＴＭ−９）スーパーファミリーのタンパク質と、ａｒＮＯＸ活性としてアッセイされたものとの関連は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の酵母欠失及び過剰発現株の分析を用いて始まった。ａｒＮＯＸ活性は、欠失ライブラリーにおいて同定され、それぞれの欠失を遺伝子ＹＥｒｌｌ３Ｃまで追跡し、次いで、対応するタンパク質を酵母過剰発現ライブラリーから特徴づけ、９回膜貫通型スーパーファミリーのメンバーであることが決定された。酵母データベースにおける発現配列タグ（ＥＳＴ）により、ヒトゲノムの相同性検索からヒトａｒＮＯＸが同定できた。ヒトａｒＮＯＸ ｃＤＮＡは、９つの膜貫通ドメインに組織化される高度に疎水性のＣ末端部分を有するポリペプチドをコードし、これは、ヒト遺伝子命名委員会により「ＴＭ９ＳＦ」（９回膜貫通型タンパク質スーパーファミリー）と呼ばれる複数で広がるドメインタンパク質の新規なファミリーのメンバーと構造及び配列が非常に類似する。ＴＭ９ＳＦファミリーの主要なメンバーは、エンドソームにある２４ｋＤａタンパク質（ｐ２４ａ）にプロセシングされる７０ｋＤａの前駆体である、サッカロミセス・セレビシエＥＭＰ７０遺伝子生成物である（Ｓｉｎｇｅｒ−Ｋｒｕｇｅｒら、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１４３７６〜１４３８６）。今日までに、ヒトＴＭ９ＳＦタンパク質の５つのサブタイプ（アイソフォーム）、すなわちＴＭ９ＳＦ−Ｉ（ｈＭＰ７０；Ｃｈｕｌｕｂａ ｄｅ Ｔａｐｉａら、１９９７、Ｇｅｎｅ １９７：１９５〜２０４）、ＴＭ９ＳＦ−Ｉｂ、ＴＭ９ＳＦ−２（ｐ７６；Ｓｃｈｉｍｍｏｌｌｅｒら、１９９８、Ｇｅｎｅ ２１６：３１１〜３１８）、ＴＭ９ＳＦ−３及びＤ８７４４４（これらは、互いに及び酵母ｐ２４ａ前駆体と３０〜４０％のアミノ酸配列同一性を示す）（Ｓｕｇａｓａｗａら、２０００、Ｇｅｎｅ ２７３：２２９〜２３７）が同定されている。全てのアイソフォームは、ａｒＮＯＸ活性を示す。ａｒＮＯＸ活性が、少なくとも５つの異なるタンパク質によりもたらされることは、驚くべき結果であった。

[0036]ｐ７６及びその近縁種の水治療分析（Ｋｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５〜１３２）により、これらのタンパク質が、固有の膜結合ドメインを共有することが明らかになった（Ｓｃｈｉｍｍｏｌｌｅｒら、１９９８、Ｇｅｎｅ ２１６：３１１〜３１８）。これらは、シグナル配列に特徴的な短いＮ末端疎水性伸長と、その後のほぼ親水性のアミノ末端部分も含有し、該アミノ末端部分は、あるファミリーメンバーにおいて、アミノ酸残基３００まで伸びる。これらのタンパク質の残りの部分は、非常に疎水性であり、９つの膜貫通ドメインを含有するので、１型トポロジーを採用する一体型膜タンパク質になる。ポリペプチド転位は、それらのＮ末端疎水性シグナル配列により開始し、これらは、最終的に、移行停止配列により膜に係留される。

[0037]ＥＭＰ７０遺伝子は、この２４ｋＤａのタンパク質をマイクロ配列決定により得られるＮ末端配列情報に基づいてクローニングされた（Ｓｉｎｇｅｒ−Ｋｒｕｇｅｒら、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１４３７６１４３８６；ＧｅｎｅｍｂｌデータベースエントリーＸ６７３１６）。サッカロミセス・セレビシエゲノムの配列決定により、ＥＭＰ７０遺伝子が第ＸＩＩ染色体上にあることが明らかになった（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ５３８８０）。ｐ７６のｃＤＮＡは、６６３アミノ酸のタンパク質をコードし、推定質量は７６ｋＤａである（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ受託番号Ｕ８１００６）。

[0038]タンパク質レベルにて、ｐ７６及びｐ２４ａタンパク質前駆体（Ｅｍｐ７０）は、３５％のアミノ酸配列同一性を有する。著しいことに、最も高いレベルの配列同一性は、これらのタンパク質のＣ末端の６０％に局在化している。これとは対照的に、Ｎ末端ドメインは、より大きいアミノ酸配列多様性を示す。別のヒトホモログ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｄ８７４４４）は、７２ｋＤａの推定質量を有し、ｐ７６と区別するためにヒトＥＭＰ７０ｐと呼ぶ。

[0039]ＴＭ−９タンパク質スーパーファミリーのメンバーの全ては、細胞膜を行ったり来たりする、特徴的な一連の９つの膜に広がる疎水性へリックスを有する細胞表面タンパク質（ａｒＮＯＸタンパク質と同様に）であることを特徴とする。膜貫通領域は、５つのアイソフォームのそれぞれにおいて高度に保存され、類似又は同一である。このようなアイソフォームが５つ知られている（１ａ、１ｂ、２、３及び４；アイソフォーム１ａ及び１ｂは非常に類似している）。これらは、異なる遺伝子にコードされていると考えられる。これらは、スプライシングバリアントではない。ＴＭ−９ファミリーメンバーは、エンドソームに存在することが知られている。

[0040]本発明者らは、細胞膜の外表面に露出されている顕著なＴＭ９ＳＦタンパク質のおよそ３０ｋＤａのＮ末端領域が、血液及びその他の体液（唾液、汗、尿）中に切り落とされることを発見した。これらは、血清及び血漿中に存在し、まとめてａｒＮＯＸとして測定される。５つのアイソフォームの全ては、異なる比率であるが老化した個体の試料中に存在する。図１の矢印にてセリンプロテアーゼ切断部位が存在する。切り落とされた形のそれぞれは、ＥＮＯＸタンパク質に必要とされる機能的モチーフを含有し、機能的モチーフは、ａｒＮＯＸファミリーに固有である。単離されたａｒＮＯＸタンパク質の可溶形の配列と同様に、機能的モチーフを図２及び３に示す。各アイソフォーム中に必要な機能的モチーフが存在するにもかかわらず、異なるアイソフォーム間の配列同一性は、最小限である。アミノ酸配列からのこれらの同定、又はａｒＮＯＸの可溶形の配列分析に対する同定は、当業者にとってさえ自明でなかった。

[0041]ｃＤＮＡがＳＦ４アイソフォームについて得られ、酵母での発現を試みた。全長タンパク質（配列番号９）の発現は、成功しなかった。しかし、ＴＭ９ＳＦ４の可溶性断片のクローニングは成功し、クローニングされたタンパク質は、ａｒＮＯＸタンパク質のものと同一の機能的特徴を有した（図４及び５）。アイソフォームの可溶形の可溶性アミノ酸及びＤＮＡ配列を次いで用いて、各アイソフォームに対するペプチド抗体と、各アイソフォームに対するＲＮＡプローブとをそれぞれ調製した。抗体は、５つのアイソフォームをヒト血清及び唾液において系統的に同定して、ＴＭ−９スーパーファミリーのタンパク質アイソフォームの既知の配列に対応させるために用い、ＤＮＡ配列情報は、各アイソフォームについてのＲＴ−ＰＣＲプローブを作製して、ヒトリンパ球及びヒト皮膚外植片の両方におけるそれらの発現を証明した。これらのデータにより、ＴＭ９スーパーファミリーのタンパク質が、ヒト血清、血漿及びその他の体液の５つの既知のａｒＮＯＸアイソフォームの遺伝子的起源であることが確認される。

[0042]ａｒＮＯＸについての現在のアッセイは、時間がかかり、不正確であり、２６分の間隔で離れた最大活性の５つの異なるアイソフォームが明らかになるが、各最大値を特定のアイソフォームと関連付けない。これら及びその他の困難を防ぐために、本明細書に開示される情報を用いて、アイソフォーム特異的なａｒＮＯＸについてのＥＬＩＳＡベースのアッセイを開発した。ペプチド抗体を、各アイソフォームの可溶性タンパク質配列に対して、ウサギにおいて作製した。ａｒＮＯＸ供給源で９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの５つの反復するウェルのそれぞれを被覆し、適当な洗浄及びブロッキングの後に、アイソフォーム特異的抗体を１つずつ、又は目的が全ａｒＮＯＸを単純に測定することであれば混合物として、５つの反復ウェルのそれぞれに加えた。ペルオキシダーゼ結合二次抗体を、比色基質とともに加え、発生した色を、自動化プレートリーダーで決定した。吸光度の読み取りは、ａｒＮＯＸの量に対して直線的であり、本明細書に記載するようにして作製した組換え可溶性ａｒＮＯＸタンパク質を用いた標準曲線により定量した。ＥＬＩＳＡプロトコールは標準的であり、独特ではない。しかし、ａｒＮＯＸアイソフォームに対する抗体を、ａｒＮＯＸ及びａｒＮＯＸアイソフォームの定量の方法として用いることが新しく、新規であり、本明細書に含めて、これらの発見の有用性が自明でないことをさらに証明する。

[0043]ＴＭ９ＳＦアイソフォームが、血清を含む体液中に均質に分布されていないことがさらに証明された。しかし、生体試料は、興味対象の対象哺乳動物、特にヒトからであり得、それらに限定されることなく、対象哺乳動物からの皮膚試料、唾液、血液、血清、尿、腹腔内液、組織試料又はその他の試料であり得る。

[0044]機能に著しく影響することなくａｒＮＯＸタンパク質中に限定された数のアミノ酸置換が存在でき、例示されていないａｒＮＯＸが、具体的に例示されたアミノ酸配列（複数可）からのある程度のアミノ酸配列相違を有し得ることを、当業者は認識している。このような天然に存在するバリアントは、例えば、例示されたコード配列（又はヒトａｒＮＯＸ配列と特異的にハイブリダイズできるその一部分）との、少なくとも約７０％のヌクレオチド配列相同性、好ましくは約８０％、より好ましくは約９０％若しくは９５〜１００％の配列相同性、又は上記の特定した範囲内の任意の整数を検出するために適当な条件下でのハイブリダイゼーションにより同定できる。好ましくは、コードされるａｒＮＯＸは、例示されたａｒＮＯＸアミノ酸配列（複数可）と少なくとも約９０％、又は９０と１００％の間の任意の整数のアミノ酸配列同一性を有する。例示されていない配列を調べる場合、特徴的なａｒＮＯＸ活性及びサリシンのようなａｒＮＯＸ特異的阻害剤に対するこれらの感受性を証明することにより、当業者は、機能的ａｒＮＯＸタンパク質が生成されていることを確認できる。

[0045]ａｒＮＯＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、表１に示す核酸配列内のコード配列を含む核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離核酸分子も、本開示の範囲内である。本発明の具体的に例示されたａｒＮＯＸコード配列と少なくとも８５％のヌクレオチド配列同一性を有するＤＮＡ分子は、本明細書に示すプローブを用いる、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションにより同定される。ストリンジェントな条件は、例えば、６５℃と６８℃との間の温度にて水溶液（５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、１％ドデシル硫酸ナトリウム）中、又は約４２℃にて５０％ホルムアミド溶液中でのハイブリダイゼーションと、０．２×ＳＳＣ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム中で室温での洗浄を含む。本発明の具体的に例示するａｒＮＯＸ配列は、当業者により容易に試験される。

実施例１．可溶性ａｒＮＯＸタンパク質９回膜貫通型スーパーファミリー（ＴＭ９ＳＦ）アイソフォーム４のクローニング及び発現
[0049]ｐＥＴ１１ｂベクター及びＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞を、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から購入した。ＴＭ９ＳＦ４配列を有するプラスミドを、可溶性ＴＭ９ＳＦ４コード配列をｐＥＴ１１ｂベクター（ＮｈｅＩ部位とＢａｍＨＩ部位の間）に挿入することにより調製した。ＴＭ９ＳＦ４配列を、全長ｃＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。用いたプライマーは、５’−ＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＣＴＡＧＣＡＴＧＧＣＧＡＣＧＧＣＧＡＴＧＧＡＴ−３’（フォワード）（配列番号１１）及び５’−ＴＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＴＣＴＡＴＣＴＴＣＡＣＡＧＣ−３’（リバース）（配列番号１２）であった。ＰＣＲ生成物を、次いで、ＮｈｅＩとＢａｍＨＩで二重に消化し、ｐＥＴ１１ｂベクターにライゲーションした。

[0050]ライゲーション生成物（ｐＥＴ１１ｂ−ＴＭ９ＳＦ４）のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定により確認した。次いで、ｐＥＴ１１ｂ−ＴＭ９ＳＦ４でＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞を形質転換した。単一コロニーを採取し、５ｍｌのＬＢ＋アンピシリン（ＬＢ／ＡＭＰ）培地に接種した。１晩培養物（１ｍｌ）を１００ｍｌのＬＢ／ＡＭＰ培地に希釈した（１：１００希釈）。細胞を、激しく振とうしながら（２５０ｒｐｍ）３７℃にて、０．４〜０．６のＯＤ_６００まで成長させ、ＩＰＴＧ（０．５ｍＭ）を誘導のために加えた。培養物を、振とうしながら（２５０ｒｐｍ）３７℃での５時間のインキュベーションの後に回収した。約３０ｋＤａの可溶性ＴＭ９ＳＦ４の発現が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色により確認された。形質転換細胞を、−８０℃にて標準的なグリセロール貯蔵溶液中で貯蔵した。

[0051]ＴＭ９ＳＦ４の発現について、ＬＢ＋Ａｍｐ寒天上で成長した単離コロニーからの少量の細胞をＬＢ＋Ａｍｐに接種し、８時間成長させ、４℃にて１晩貯蔵した。次いで、培養物を６，０００ｒｐｍにて６分間遠心分離した。上清を捨て、細胞ペレットを４ｍｌのＬＢ＋ａｍｐ培地に再懸濁し、１：１００でＬＢ／ａｍｐ培地に接種し、８時間成長させた。細胞培養培地には、ＩＰＴＧを加えなかった。

[0052]細胞を、培養物（４００ｍｌ）から、６，０００ｇにて２０分間の遠心分離により採集した。細胞ペレットを２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０（０．５ｍＭ ＰＭＳＦを加えた０．３ｍｌの５０ｍＭ ＰＭＳＦ、６０μｌの１Ｍ ６−アミノカプロン酸及び６０μｌの０．５ＭベンズアミジンＨＣｌ、Ｔｒｉｓ緩衝液を加えることにより３０ｍｌの最終容量に調整）に再懸濁した。

[0053]細胞を、２０，０００ｐｓｉのフレンチプレスに３回通すことにより破壊した。抽出物を１０，０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離した。上清を捨て、ペレット（封入体）を２０ｍｌのＴｒｉｓ緩衝液に再懸濁した。２ｍｌの２０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を各チューブに加え、試料の容量をＴｒｉｓ緩衝液で４０ｍｌに調整した。チューブを室温にて１時間より長く、振とうしながらインキュベートし、１０，０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットを、２５ｍｌのＴｒｉｓ緩衝液に再懸濁し、遠心分離することによりＴｒｉｓ緩衝液で２回、及び２５ｍｌの純水で１回洗浄した。

[0054]封入体の可溶化を、次のようにして行った。ペレットを２０ｍｌの水及び４ｍｌの０．５Ｍ ＣＡＰＳ緩衝液、ｐＨ１１（５０ｍＭ最終濃度）に再懸濁し、４０μｌの１Ｍ ＤＴＴ（１ｍＭ最終濃度）及び０．４ｍｌの３０％ラウロイルサルコシンナトリウム（０．３％最終濃度）を加えた。試料の容量を、水で４０ｍｌに調整した。試料を室温にて１７時間インキュベートした。

[0055]組換え切断型ａｒＮＯＸのリフォールディングを、次のようにして行った。可溶化の後に、試料を１０，０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、上清を回収した。上清を、０．４５μｍニトロセルロースフィルタを通して濾過した。濾液を２つの透析バッグ（３５００ＭＷＣＯ、平坦幅４５ｍｍ及び直径２９ｍｍ、ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ）に注ぎ、冷却透析緩衝液１（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、１ｍＭシステアミン、０．１ｍＭシスタミン、１ｍＭ ６−アミノカプロン酸及び０．５ｍＭベンズアミジンＨＣｌ）に対して３回交換して、冷却透析緩衝液２（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ６−アミノカプロン酸及び０．５ｍＭベンズアミジンＨＣｌ）に対して１回交換して、そして透析緩衝液３（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ６−アミノカプロン酸及び０．５ｍＭベンズアミジンＨＣｌ）に対して１回交換して透析した。透析は、各交換の後に少なくとも１７時間であった。

[0056]透析の後に、ＰＭＳＦを０．５ｍＭの最終濃度まで加え、試料を１０，０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離した。上清を回収し、約１６ｍｌに、セントリプラス（Ｃｅｎｔｒｉｐｌｕｓ）濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ、ＭＷＣＯ１０，０００；４７００ｒｐｍ、２８００×ｇ）を用いて濃縮した。リフォールディングされたａｒＮＯＸを、マイクロ遠心チューブに０．５ｍｌで分割し、−８０℃で貯蔵した。

実施例２．組換えａｒＮＯＸの特徴決定
[0057]スーパーオキシドによるフェリシトクロムｃの低減を、スーパーオキシド形成の標準的な指標として採用した（Ｍａｙｏ，Ｌ．Ａ．及びＣｕｒｎｕｔｔｅ，Ｊ．、１９９０、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８６：５６７〜５７５；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．ら、１９８２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１０７４７〜１０７５０）。この方法は、スーパーオキシドジスムターゼ阻害と組み合わせて、スーパーオキシド発生の測定として一般的に受け入れられている。アッセイは、ＰＢＳＧ緩衝液（８．０６ｇ ＮａＣｌ、０．２ｇ ＫＣｌ、０．１８ｇ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、０．１３ｇ ＣａＣｌ_２、０．１ｇ ＭｇＣｌ_２、１．３５ｇグルコースを１０００ｍｌ脱イオン水に溶解し、ｐＨ７．４に調整し、濾過し、４℃にて貯蔵）中の１５０μｌのバフィーコート材料からなる。スーパーオキシドによるフェリシトクロムｃの低減を、５４０ｎｍを参照とし、５５０ｎｍの吸光度の増加としてモニターした（Ｂｕｔｌｅｒら、１９８２）。ａｒＮＯＸ活性の特異性についてのさらなる対照として、６０単位のスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）をアッセイの終わり近くに加えて、速度をベースラインに確実に戻した。速度は、ＳＬＭアミンコ（Ａｍｉｎｃｏ）ＤＷ−２０００分光光度計を二重波長モードの操作で用いて決定した。

[0058]速度は、ＳＬＭアミンコＤＷ−２０００分光光度計（Ｍｉｌｔｏｎ Ｒｏｙ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を二重波長モードの操作で、１．５分ごとに１分間の連続測定で用いて決定した。４５分後に、試験化合物を加え、反応をさらに４５分間継続した。４５分後に、１９．１ｃｍ^−１のミリモル吸光係数を、低減されたフェリシトクロムｃについて用いた。試験化合物の結果を、ＴＭ９ＳＦ４を用いて行った実験について以下（表４）に示すが、図７の結果から、全てのａｒＮＯＸアイソフォームが、以下に示す種々の化合物に対して同様の応答を有すると結論付けられる。抽出物は、そうでないと記載しない限り、水中の化合物で構成された。

[0059]表４．組換えａｒＮＯＸ（ＴＭ９ＳＦ４）の特性
シミリカラクトンＤに対して２６分の期間耐性
スーパーオキシドジスムターゼにより７８％阻害
ａｒＮＯＸ阻害剤セイボリーにより７０％阻害
ａｒＮＯＸ阻害剤没食子酸により８０％阻害
３方阻害剤（ドルミン＋シザンドラ＋サリシン）により７０％阻害

[0060]本明細書で引用する参考文献は全て、それらが本開示と矛盾しない程度でその全体が参照により本明細書に組み込まれている。

[0061]本明細書で言及する全ての特許及び出版物は、本発明が関する当該技術における当業者のレベルを示す。本明細書で引用する参考文献は、いくつかの場合においてそれらの出願日における技術水準を示すために、その全体が本明細書に参照により組み込まれ、この情報は、本明細書において、必要であれば採用して、従来技術における特定の実施形態を除く（例えば放棄する）ことができる。例えば、ある化合物が請求される場合、本明細書に開示される参考文献（特に参照された特許文献）に開示されるある化合物を含む、従来技術において既知の化合物は、請求項に含まれないことが意図されると理解される。

[0062]マーカッシュグループ又はその他のグループ分けが本明細書で用いられる場合、群の全ての個別のメンバー、並びに群から可能な全ての組み合わせ及び副次的な組み合わせは、本開示に個別に含まれることが意図される。

[0063]記載されるか又は例示される製剤又は成分の組み合わせは全て、そうでないと記載しない限り、本発明を行うために用いることができる。タンパク質又はコード配列又は遺伝子の具体的な名称は、例示であることを意図する。なぜなら、当業者は、同じ遺伝子又はタンパク質に別の名称を付けることができるからである。例えば、化合物が、タンパク質の特定のアイソフォームが特定されないように記載されている場合、その記載は、個別又は任意の組み合わせで記載される各アイソフォームを含むことを意図する。

[0064]当業者は、具体的に例示されたもの以外のベクター、プロモーター、コード方法、出発材料、合成方法などを、過度の実験を行うことなく本発明を行うために採用できることを認識している。任意のこのような方法、ベクター、プロモーター、コード配列、合成方法などの当該分野において既知の機能的等価物は全て、本記載に含まれると意図される。

[0065]明細書中において範囲、例えば温度範囲、時間範囲、配列に関する範囲又は組成物の範囲が示される場合、全ての中間の範囲及び副次的な範囲並びに示されるこれらの範囲に含まれる全ての個別の値が、本明細書に含まれることが意図される。

[0066]本明細書で用いる場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する」又は「特徴とする」と同義であり、包括的又は制限がなく、追加の記載されていない要素又は方法ステップを排除しない。本明細書で用いる場合、「からなる」は、請求項の要素において明記されない任意の要素、ステップ又は成分を排除する。本明細書で用いる場合、「から本質的になる」は、請求項の基本的で新規な特徴に実質的に影響しない材料又はステップを排除しない。本明細書、特に組成物の成分の記載又はデバイスの要素の記載における「含む」との用語についてのいずれの記述も、記述された成分又は要素から本質的になり、そして該成分又は要素からなるこれらの組成物及び方法を包含すると理解される。本明細書に説明される本発明は、本明細書に具体的に開示されないいずれの１又は複数の要素、１又は複数の限定が存在せずに、適切に行うことができる。

[0067]採用された用語及び表現は、制限でなく記載の用語として用いられ、そのような用語及び表現の使用は、示され記載される特徴の任意の等価物又はその部分を除外することを意図しないが、請求される本発明の範囲内で種々の変形が可能であることが認識される。つまり、本発明は、好ましい実施形態により具体的に開示されているが、本明細書に開示される概念の任意選択の特徴、改変及び変動を、当業者が用いることができ、そのような改変及び変動は、添付の特許請求の範囲内であるとみなされると理解される。

[0068]本明細書で用いる場合、本開示のある態様は、単離核酸及び単離核酸の使用方法に関する。あるいくつかの実施形態において、本明細書で開示される核酸配列及びその選択された領域は、ハイブリダイゼーションプローブ又は増幅プライマーとして有用性を有する。これらの核酸は、例えば、組織試料の診断評価において用いることができる。あるいくつかの実施形態において、これらのプローブ及びプライマーは、オリゴヌクレオチド断片からなる。このような断片は、ＲＮＡ又はＤＮＡ組織試料との特異的ハイブリダイゼーションをもたらすために十分な長さのものである。配列は、典型的には１０〜２０ヌクレオチドであるが、より長くてもよい。より長い配列、例えば４０、５０、１００、５００及び全長までさえの配列は、あるいくつかの実施形態のために好ましい。

[0069]開示される核酸配列から選択される配列からの約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７５０、１０００、１５００、２０００、２５００又はそれより多いヌクレオチドの連続するストレッチを有する核酸分子が企図される。上記の配列に相補的な分子、及び高いストリンジェントの条件下でこれらの配列と結合する分子も企図される。これらのプローブは、サザン及びノーザンブロッティングのような種々のハイブリダイゼーションの実施形態において有用である。

[0070]１４と１００ヌクレオチドの間の長さのハイブリダイゼーションプローブの使用により、安定で選択的な二重分子の形成が可能になる。２０塩基の長さを超えるストレッチに対する相補配列を有する分子が、ハイブリッドの安定性及び選択性を増加させ、そのことにより、得られる特定のハイブリッド分子の質及び程度を改善するために、通常、好ましい。２０〜３０ヌクレオチド、又は所望によりさらにより長いストレッチを有する核酸分子を設計することが、通常、好まれる。このような断片は、例えば、化学的手段により又は選択された配列を組換え生成のための組換えベクターに導入することにより断片を直接合成することにより、容易に調製できる。

[0071]よって、本明細書におけるヌクレオチド配列は、遺伝子若しくはＲＮＡの相補的なストレッチと二重分子を選択的に形成するか、又は組織からのＤＮＡ若しくはＲＮＡの増幅のためのプライマーを提供するそれらの能力について用いることができる。構想される用途に応じて、標的配列に対する種々の程度のプローブの選択性を達成するために、種々のハイブリダイゼーション条件を採用することを所望することがある。

[0072]高い選択性が要求される用途について、ハイブリッドを形成するために比較的ストリンジェントな条件を典型的に採用し、例えば、約０．０２Ｍ〜約０．１０Ｍ ＮａＣｌで約５０℃〜約７０℃の温度によりもたらされるような、比較的低い塩及び／又は高い温度条件を選択する。このような高いストリンジェンシー条件は、プローブと鋳型又は標的鎖との間のミスマッチが存在するとすればそのミスマッチにほとんど耐えず、特異的遺伝子を単離するか、又は特異的ｍＲＮＡ転写産物を検出するために特に適切である。条件は、加えるホルムアミドの量を増加させることにより、よりストリンジェントにできることが一般的に認識されている。

[0073]あるいくつかの用途について、より低いストリンジェンシーの条件が必要である。これらの条件下では、ハイブリダイゼーションは、プローブ及び標的鎖の配列が完全に相補的でなく、１又は複数の位置でミスマッチがあっても生じる。塩濃度を増加し、温度を減少させることにより、条件をより低いストリンジェンシーにできる。例えば、中程度のストリンジェンシーの条件は、約０．１〜０．２５Ｍ ＮａＣｌで約３７〜約５５℃の温度によりもたらされるが、低いストリンジェンシーの条件は、約０．１５Ｍ〜約０．９Ｍの塩で、約２０〜約５５℃の範囲の温度によりもたらすことができる。よって、ハイブリダイゼーション条件は、容易に操作でき、よって、一般的に、所望の結果に応じて選択される方法である。

[0074]その他の実施形態において、ハイブリダイゼーションは、例えば、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭジチオトレイトールでおよそ２０℃の温度の条件下で達成できる。用いるその他のハイブリダイゼーション条件は、およそ１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５μＭ ＭｇＣ１_２でおよそ４０〜約７２℃の範囲の温度を含み得る。

[0075]あるいくつかの実施形態において、本明細書に記載される核酸配列を、ハイブリダイゼーションを決定するために、標識のような適切な手段と組み合わせて採用することが有利である。検出され得る蛍光、放射活性、酵素又はアビジン／ビオチンのようなその他のリガンドを含む広範囲の適当な指示物質が、当該技術において知られている。好ましい実施形態において、蛍光標識又はウレアーゼ、アルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼのような酵素タグを、放射活性又はその他の環境的に望ましくない試薬の代わりに採用することを所望することがある。酵素タグの場合、人の目又は分光光度測定的に可視の検出手段を提供して、相補核酸含有試料との特異的ハイブリダイゼーションを同定するために採用できる熱量的な指示基質が知られている。

[0076]一般的に、本明細書に記載されるハイブリダイゼーションプローブは、対応する遺伝子の発現を検出するための、ＰＣＲのような溶液ハイブリダイゼーション、及び固相を採用する実施形態における試薬の両方として有用である。固相を含む実施形態において、試験ＤＮＡ（又はＲＮＡ）は、選択されたマトリクス若しくは表面に吸着されるか又はそうでなければ付着される。このようにして固定された１本鎖核酸を、次いで、選択されたプローブとの所望の条件下でのハイブリダイゼーションに供する。選択された条件は、要求される特定の基準に基づく特定の状況に依存する（例えばＧ＋Ｃ含量、標的核酸のタイプ、核酸の供給源、ハイブリダイゼーションプローブのサイズなどに依存する）。非特異的に結合したプローブ分子を除去するためのハイブリダイズした表面の洗浄の後に、ハイブリダイゼーションを、標識により検出するか又は定量する。

[0077]本明細書に開示される方法は、開示される特定のプローブに限定されず、開示される配列にハイブリダイズ可能な核酸配列を少なくとも包含するか、又はこれらの配列の機能的配列類似体であることを特に意図する。例えば、部分配列を用いて、構造が関連する遺伝子又はそれが由来する全長ゲノム若しくはｃＤＮＡクローンを同定できる。当業者は、上記のプローブについての標的として用いることができるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーを作製する方法をよく知っている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）。

[0078]本発明の核酸セグメントを、本明細書に開示されるプラスミドのようなベクターに組み込む用途について、これらのセグメントは、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、制限酵素部位、マルチクローニングサイト、その他のコードセグメントなどのようなその他のＤＮＡ配列と組み合わせて、それらの全体の長さが著しく変動することがある。ほぼどんな長さの核酸断片も用いてよく、全長は、好ましくは、調製の容易さと意図する組換えＤＮＡプロトコールにおける使用とにより制限されることが企図される。

[0079]特定の遺伝子をコードするＤＮＡセグメントを、組換え宿主細胞に導入して、特定の構造又は調節タンパク質を発現するために採用することができる。代わりに、遺伝子工学の技術を用いることにより、選択された遺伝子の副次的な部分又は誘導体を採用できる。プロモーター領域のように調節領域を含有する上流の領域を単離して、その後、興味対象のコード配列に作動可能に連結した後に、選択された遺伝子の発現のために採用できる。

[0080]発現生成物を作製する場合、核酸配列を、同じ生成物をコードする能力を保持したまま変動させることが可能である。同義のコード配列を提供するコドンチャートを参照することにより、当業者は、既知のアミノ酸配列のポリペプチド生成物をコードする任意の核酸を設計できる。

[0081]プラスミド調製物及び複製手段は、当該技術において公知である。例えば米国特許第４，２７３，８７５号及び第４，５６７，１４６号を参照されたい。

[0082]本発明の実施形態は、当該技術において公知の条件及び試薬を用いる、標的遺伝物質の少なくとも一部分の増幅を含む。

[0083]本明細書におけるあるいくつかの実施形態は、微生物の遺伝物質の少なくとも一部分を増幅するための任意の方法を含む（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＮＡＳＢＡ（核酸配列ベースの増幅））。ある実施形態において、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を、対象の遺伝物質の少なくとも一部分を増幅し、対象の遺伝物質の増幅の結果を確認するために内部対照プラスミドを同時に増幅するために用いることができる。

[0084]本明細書における範囲は、微生物の遺伝物質の少なくとも一部分を増幅するための任意の方法（例えばポリメラーゼ連鎖反応、すなわちＰＣＲ、及び核酸配列ベースの増幅、すなわちＮＡＳＢＡ）を含むが、例えば、本開示は、ＲＴ−ＰＣＲ技術に関する実施形態に関する。

[0085]典型的に、ＰＣＲ技術の作業条件を確認するために、陽性及び陰性の外部対象を、例えば増幅のための対照核酸配列を用いて反応条件を試験するための試料チューブと並行する反応において行う。いくつかの実施形態において、内部対照を用いて、ＲＴ−ＰＣＲ反応の条件が特定の標的試料についての特定のチューブ内で働いているかを決定できる。代わりに、いくつかの実施形態において、内部対照を用いて、ＲＴ−ＰＣＲ反応の条件が特定の標的試料について特定の時間で特定のチューブ内で働いているかを決定できる。

[0086]対象哺乳動物及び内部対照における遺伝物質のヌクレオチド配列を知ることにより、特異的プライマー配列を設計できる。本発明の一実施形態において、標的哺乳動物のゲノム物質の一部分を増幅するために用いたプライマー対のうちの少なくとも一方のプライマーは、内部対照プラスミドのような内部対照又は興味対象のその他の配列の遺伝物質の一部分を増幅するために用いるプライマー対のうちのプライマーの一方と共通である。一実施形態において、プライマーは、限定されないか、１０〜５０オリゴヌクレオチド長又は約１５〜４０オリゴヌクレオチド長又は約２０〜３０オリゴヌクレオチド長である。適切なプライマー配列は、当業者が容易に合成できるか、又はＢＲＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）などの供給業者から容易に入手可能である。ＰＣＲのような核酸配列増幅に必要なＤＮＡポリメラーゼ及びヌクレオチドのようなその他の試薬も、商業的に入手可能である。

[0087]ＰＣＲ増幅生成物の存在又は非存在は、当業者に知られる技術のいずれを用いても検出できる。ある特定の実施形態において、本発明の方法は、ＰＣＲ増幅生成物の存在又は非存在を、微生物の特定の遺伝物質とハイブリダイズするプローブを用いて検出することを含む。微生物の遺伝物質の異なる部分とハイブリダイズするＰＣＲプライマー配列及びプローブヌクレオチド配列を設計することにより、本明細書に開示される方法の正確性及び／又は感度を増加できる。

[0088]放射活性及び蛍光標識プローブのような種々の標識プローブが利用可能であるが、ある特定の実施形態において、方法は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）標識プローブを、内部ハイブリダイゼーションプローブとして用いる。特定の実施形態において、内部ハイブリダイゼーションプローブは、ＰＣＲ増幅生成物が形成されるにつれて生成物が検出され、そのことによりＰＣＲ後の処理時間を短縮するように、ＰＣＲ反応混合物に含まれる。ＲｏｃｈｅライトサイクラーＰＣＲ装置（米国特許第６，１７４，６７０号）又はその他のリアルタイムＰＣＲ装置を、この実施形態において用いることができ、例えば米国特許第６，８１４，９３４号を参照されたい。いくつかの場合において、リアルタイムＰＣＲ増幅及び検出は、全アッセイ時間を著しく低減する。よって、本明細書の方法は、迅速及び／又は高度に正確な結果をもたらし、これらの結果は、内部対照により確認される。

[0089]あるいくつかの実施形態において、ＤＮＡ断片を、興味対象の細胞に、別のポリヌクレオチドセグメントを付着させ、そのことにより付着されたセグメントの複製及び／又は発現をもたらすレプリコンであるベクターを用いることにより導入できる。ベクターは、１又は複数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有することができ、該部位では、ベクターの本質的な生物学的機能を喪失することなく、決定できる様式でＤＮＡ配列を切断できる。ベクターは、プライマー部位（例えばＰＣＲのため）、転写及び／又は翻訳の開始及び／又は調節部位、組換えシグナル、レプリコン、選択マーカーなどをさらにもたらすことができる。ベクターの例は、プラスミド、ファージ、コスミド、ファージミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、ウイルス、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクターのようなウイルスベースのベクター、並びにｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくは宿主細胞において複製できるか又は複製されるか、或いは所望のＤＮＡセグメントを宿主細胞内の所望の位置に運ぶことができるその他のＤＮＡ配列を含む。ベクターは、例えば、ファージ、プラスミド、ウイルス又はレトロウイルスベクターであり得る。レトロウイルスベクターは、複製能力があるか又は複製能力がないことがある。後者の場合、ウイルス増殖は、通常、相補性宿主細胞でのみ生じる。

[0090]ポリヌクレオチドを、宿主での増殖のために、選択マーカーを含有するベクターにつないでよい。ベクターがウイルスである場合、ベクターを、適当なパッケージング株化細胞を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏでパッケージングして、次いで宿主細胞に形質導入することができる。

[0091]ポリヌクレオチド挿入断片は、いくつかを挙げるとファージラムダＰＬプロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ）ｌａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡ及びｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター並びにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターのような適当なプロモーターと作動可能に連結できる。その他の適切なプロモーターは、当業者に知られている。発現コンストラクトは、転写開始、終結についての部位、及び転写された領域において、翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含有する。コンストラクトにより発現される転写産物のコード部分は、好ましくは、始めに翻訳開始コドンと、翻訳されるポリペプチドの最後の適当な位置に終結コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ又はＵＡＧ）を含む。

[0092]記載するように、発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことができる。例示的なマーカーは、それらに限定されないが、真核細胞培養についてジヒドロ葉酸還元酵素、Ｇ４１８、グルタミン合成酵素又はネオマイシン耐性、並びに大腸菌及びその他の細菌における培養についてテトラサイクリン、カナマイシン又はアンピシリン耐性遺伝子を含み得る。適当な宿主の代表例は、それらに限定されないが、大腸菌、放線菌及びサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）細胞のような細菌細胞；酵母細胞（例えばサッカロミセス・セレビシエ又はピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＡＴＣＣ受託番号２０１１７８））のような真菌細胞；ショウジョウバエＳ２及びスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）Ｓｆ９細胞のような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３及びボーズメラノーマ細胞のような動物細胞；並びに植物細胞を含む。適当な培養培地、形質転換技術並びに上記の宿主細胞についての細胞成長及び遺伝子発現の条件は、当該技術において知られている。

[0093]あるいくつかの実施形態において、細菌について用いるベクターは、それらに限定されないが、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．から入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０及びｐＱＥ−９；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から入手可能なｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ファージスクリプトベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ；並びにＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．から入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５を含み得る。好ましい真核ベクターは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１及びｐＳＧ；並びにＰｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬである。酵母系での使用のための好ましい発現ベクターは、それらに限定されないが、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺａｌｐｈ、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ及びＰＡ０８１５（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．から入手可能）を含む。その他の適切なベクターは、当該技術において容易に入手可能である。

[0094]発現ベクターの構築のために用いられる組換えＤＮＡ技術は、既知で、当業者により通常用いられるものである。標準的な技術は、クローニング、ＤＮＡの単離、増幅及び精製のために用いられている。ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼを含む酵素反応は、製造者の推奨に従って行われる。これらの技術及びその他のものは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に従って通常行われる。

[0095]あるいくつかの実施形態において、単離宿主細胞は、本明細書に記載されるベクターコンストラクトを含有でき、及び／又は単離宿主細胞は、当該技術において既知の技術及び配列を用いて１又は複数の異種制御領域(例えばプロモーター及び/又はエンハンサー)と作動可能に連結された本明細書のヌクレオチド配列を含有できる。宿主細胞は、哺乳類細胞(例えばヒト由来細胞)のような高等真核細胞、又は酵母細胞のような下等真核細胞であり得るか、又は宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞であり得る。宿主株は、挿入された遺伝子配列の発現を調節するか、又は遺伝子生成物を所望の特定の様式で修飾してプロセシングするように選択できる。あるいくつかのプロモーターからの発現は、ある特定の誘導物質の存在下で上昇し得る。つまり、遺伝子工学的に操作されたポリペプチドの発現は、制御できる。さらに、異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳時及び翻訳後プロセシング及び修飾（例えばリン酸化、切断）について特徴及び特定の機構を有する。適当な株化細胞は、発現される外来タンパク質の所望の修飾及びプロセシングを確実にするように選択できる。

[0096]あるいくつかの実施形態は、内因性の遺伝物質（例えばコード配列）を欠失若しくは置き換えるか、及び／又は本明細書のポリヌクレオチドと作動可能に関連し、内因性ポリヌクレオチドを活性化、変更及び／又は増幅する遺伝物質（例えば異種ポリヌクレオチド配列）を含むように工学的に操作された、脊椎動物起源、特に哺乳類起源の初代、２次及び不死化宿主細胞も包含する。例えば、当該技術において既知の技術を用いて、異種制御領域（例えばプロモーター及び／又はエンハンサー）と内因性ポリヌクレオチド配列を、相同組換えにより作動可能に関連させることができる（例えば米国特許第５，６４１，６７０号；ＷＯ９６／２９４１１；ＷＯ９４／１２６５０；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２〜８９３５（１９８９）；及びＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５〜４３８（１９８９）を参照されたい）。

[0097]増幅のための鋳型として用いる核酸は、標準的な方法に従って、生体試料に含まれる細胞から単離できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）。核酸は、ゲノムＤＮＡ又は分画若しくは全細胞ＲＮＡであり得る。ＲＮＡを用いる場合、ＲＮＡを相補的ｃＤＮＡに変換することが望ましいことがある。ある実施形態において、ＲＮＡは全細胞ＲＮＡであり、増幅のための鋳型として直接用いられる。

[0098]特異的マーカーに相当する核酸と選択的にハイブリダイズするプライマーの対を、単離核酸と、選択的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触させる。一旦ハイブリダイズすると、核酸：プライマー複合体を、鋳型依存的核酸合成を容易にする１又は複数の酵素と接触させる。「サイクル」とも呼ばれる複数の回の増幅を、十分な量の増幅生成物が生成されるまで行う。

[0099]次に、増幅生成物を検出する。あるいくつかの用途において、検出は、視覚的手段により行うことができる。代わりに、検出は、化学発光、取り込まれた放射性標識若しくは蛍光標識の放射活性シンチレーション写真撮影法、又は電気的若しくは熱的衝撃シグナルを用いる系（中でもアフィマックス（Ａｆｆｙｍａｘ））さえによる生成物の間接的同定を含み得る。

[00100]本明細書で定義する場合、プライマーとの用語は、鋳型依存的プロセスで発生する核酸の合成を開始できる任意の核酸を包含することを意味する。典型的には、プライマーは、１０〜２０塩基対のオリゴヌクレオチド長であるが、より長い配列を採用できる。プライマーは、二本鎖又は一本鎖の形で供給できるが、一本鎖の形が好ましい。

[00101]いくつかの鋳型依存的プロセスが、所定の鋳型試料中に存在するマーカー配列を増幅するために利用可能である。最もよく知られた増幅法の１つは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲという）であり、これは、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号及び第４，８００，１５９号並びにＩｎｎｉｓら、１９９０に詳述されている。

[00102]逆転写酵素ＰＣＲ増幅手順を行って、増幅されるｍＲＮＡの量を定量できる。ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する方法は公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９に記載されている。逆転写の代替法は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを利用する。これらの方法は、ＷＯ９０／０７６４１に記載されている。ポリメラーゼ連鎖反応法は、当該技術において公知である。その他の増幅法は、欧州公開第３２０３０８号に開示されるＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）のようなＰＣＲとともに当該技術において既知である。

[00103]制限エンドヌクレアーゼとリガーゼとを用いて制限部位の一方の鎖にヌクレオチド５’−［アルファ−チオ］−三リン酸を含有する標的分子の増幅を達成する等温増幅法も、本明細書における核酸の増幅に有用なことがある。鎖置換増幅（ＳＤＡ）は、核酸の等温増幅を行う別の方法であり、これは、鎖置換及び合成、すなわちニックトランスレーションの複数のラウンドを含む。修復連鎖反応（ＲＣＲ）と呼ばれる同様の方法は、増幅の標的にする領域にわたっていくつかのプローブをアニーリングすることと、４つの塩基のうち２つだけが存在するその後の修復反応とを含む。その他の２つの塩基は、容易な検出のためのビオチン化誘導体として付加され得る。同様のアプローチが、ＳＤＡで用いられる。標的特異的配列は、環状プローブ反応（ＣＰＲ）でも検出できる。ＣＰＲでは、非特異的ＤＮＡの３’及び５’配列と特異的ＲＮＡの中間の配列とを有するプローブが、試料中に存在するＤＮＡとハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションの際に、反応をＲＮアーゼＨで処理し、プローブの生成物が、消化の後に放出される特異な生成物として同定される。元の鋳型は、別の環状プローブにアニーリングして、反応が繰り返される。当該技術において既知のさらにその他の増幅法を、本明細書に記載される方法とともに用いることができる。

[00104]増幅の後に、特異的増幅が生じたかどうかを決定する目的のために増幅生成物を、鋳型及び過剰のプライマーから分離することが望ましいことがある。増幅生成物は、標準的な方法を用いるアガロース、アガロース−アクリルアミド又はポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離できる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照されたい。

[00105]代わりに、クロマトグラフィーの技術を採用して、増幅生成物又はその他の分子を分離できる。用いることができる多くの種類のクロマトグラフィー：吸着、分配、イオン交換及び分子ふるい、並びにカラム、ペーパー、薄層及びガスクロマトグラフィーを含む、当該技術において既知の、それらを用いるための多くの特化された技術が存在する。

[00106]増幅生成物は、マーカー配列の増幅を確認するために可視化できる。ある典型的な可視化方法は、臭化エチジウムでのゲルの染色と、ＵＶ光の下での可視化とを含む。代わりに、増幅生成物に放射性標識又は蛍光標識ヌクレオチドが組み込まれて標識されているならば、増幅生成物をｘ線フィルムに露光できるか、又は分離の後に適当な刺激スペクトルの下で可視化できる。

[00107]可視化は、間接的に達成することができる。増幅生成物の分離の後に、標識された核酸プローブを、増幅マーカー配列と接触させる。プローブは、好ましくは、発色団とコンジュゲートされているが、放射性標識することができる。別の実施形態において、プローブは、抗体又はビオチンのような結合パートナーとコンジュゲートされ、結合対の他方のメンバーが検出可能な部分を有する。

[00108]一般的に、本明細書において有用なベクターの構築におけるＤＮＡ配列のクローニングのために用いられる原核生物は、それらに限定されないが、大腸菌Ｋ１２株又はＷ３１１０株のような任意のグラム陰性細菌を含み得る。用いることができるその他の微生物株は、シュードモナス・エルギノサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＯ１株及び大腸菌Ｂ株を含み得る。これらの例は、限定するよりもむしろ、説明のためである。ライブラリーを構築するための細菌宿主のその他の例は、それらに限定されないが、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｕｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）及びバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）を含む。

[00109]一般的に、宿主細胞と適合する種に由来するプロモーター及び制御配列を含有するプラスミドベクターを、これらの宿主とともに用いる。ベクターは、通常、複製部位と、形質転換細胞において表現型による選択を可能にする１又は複数のマーカー配列とを有する。例えば、多くのグラム陰性細菌株において有用なＰＢＢＲ１レプリコン領域又は広範囲のグラム陰性宿主細菌において有用な任意のその他のレプリコン領域を、本発明において用いることができる。

[00110]原核宿主とともに用いるために適切なプロモーターは、説明のために、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系を含む。その他の実施形態において、原核宿主細胞において用いられる発現ベクターは、任意の適切なプロモーターから発現できる特異的ｍＲＮＡ配列をコードする特異的遺伝子の効率的な翻訳のために必要な配列も含有できる。これは、プロモーターと、その後のリボソーム結合部位又はｍＲＮＡをコードするＤＮＡと作動可能に連結されたシャイン−ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列を組み込むことを必要とする。

[00111]所望のコード配列及び制御配列を含有する適切なベクターの構築は、標準的なライゲーション技術を採用する。単離プラスミド又はＤＮＡ断片を切断し、調整し、所望の形態に再びライゲーションして、要求されるプラスミドを形成する。

[00112]構築されたプラスミドにおける正しい配列を確認するための分析のために、ライゲーション混合物を用いて、大腸菌Ｋ１２のような細菌株を形質転換し、成功した形質転換体を、適切であればテトラサイクリンのような抗生物質耐性により選択する。形質転換体からのプラスミドを調製し、制限により分析し、及び／又は配列決定する。

[00113]単離宿主細胞を、発現ベクターで形質転換でき、プロモーターの誘導、形質転換体の選択又は遺伝子の増幅のために適当であるように改変された従来の栄養培地で培養できる。温度、ｐＨなどのような培養条件は、発現のために選択した宿主細胞とともに以前に用いたものであり、当業者に明らかである。

[00114]形質転換とは、任意のコード配列が実際に発現されるかされないかによらず、宿主細胞による発現ベクターの取り込みのことをいう。興味対象のＤＮＡ分子を単離宿主細胞に導入するための多くの方法、例えばＣａ塩及びエレクトロポレーションが当該技術において知られている。形質転換の成功は、ベクターの作動の任意の指標が宿主細胞内で生じる場合に、一般的に認識される。

[00115]ＤＮＡの消化とは、ＤＮＡ中のある配列でのみ作用する制限酵素でのＤＮＡの触媒による切断のことをいう。本明細書で用いる種々の制限酵素が商業的に利用可能であり、それらの反応条件、補因子及びその他の要件は、当該技術において知られるとおりに用いた。

[00116]制限消化からの所定のＤＮＡ断片の回収又は単離とは、消化物を電気泳動によりポリアクリルアミド又はアガロースゲル上で分離すること、興味対象の断片を、既知の分子量のマーカーＤＮＡ断片のものに対してその移動度を比較することにより同定すること、所望の断片を含有するゲル区画を取り出すこと及びＤＮＡをゲルから分離することを意味する。この手順は、一般的に知られている（Ｌａｗｎ，Ｒ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：６１０３ ６１１４［１９８１］及びＧｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４０５７［１９８０］）。

[00117]脱リン酸化とは、細菌アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）での処理による末端５’リン酸の除去のことをいう。この手順は、ＤＮＡ断片の２つの制限切断された末端が、「環化」又は閉鎖ループを形成して制限部位での別のＤＮＡ断片の挿入を妨げることを防ぐ。脱リン酸化のための手順及び試薬は、従来のものである（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、１３３〜１３４、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、［１９８２］）。ＢＡＰを用いる反応は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ中で６８℃にて行って、酵素調製物中に存在し得るいずれのエキソヌクレアーゼの活性も抑制する。反応は、１時間行う。反応の後に、ＤＮＡ断片をゲル精製する。

[00118]ライゲーションとは、２つの二本鎖核酸断片間のホスホジエステル結合の形成のプロセスのことをいう（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら、１９８２、１４６）。そうでないと示さない限り、ライゲーションは、既知の緩衝液及び条件を用いて、１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）をライゲーションするＤＮＡ断片のおよそ等モルの０．５．ｍｕ．ｇあたりに用いて達成できる。

[00119]充填又は平滑末端化とは、制限酵素で切断した核酸の付着末端における一本鎖の端を二本鎖に変換することをいう。このことにより、付着末端がなくなり、平滑末端が形成される。このプロセスは、１つだけ又はいくつかのその他の制限酵素により創出される端と付着性であり得る制限切断端を、任意の平滑切断制限エンドヌクレアーゼに適合する末端又はその他の充填された付着末端に変換するために用途が広いツールである。一実施形態において、平滑末端化は、２〜２０μｇ付近の標的ＤＮＡを、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭジチオトレイトール、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）緩衝液中で約３７℃にて８単位のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片と２５０μＭの４つの各デオキシヌクレオチド三リン酸との存在下でインキュベートすることにより達成される。インキュベーションは、通常、３０分後に、フェノール及びクロロホルム抽出とエタノール沈殿を用いて終結される。

[00120]本明細書において交換可能に用いられるように、「核酸分子（複数可）」、「オリゴヌクレオチド（複数可）」及び「ポリヌクレオチド（複数可）」との用語は、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ（一本鎖若しくは二本鎖、コード、相補又はアンチセンスのいずれも）、又は一本鎖若しくは二重鎖の形態のいずれかの１より多いヌクレオチドのＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列（上記の種のそれぞれが特に明記できるが）を含む。「ヌクレオチド」との用語は、本明細書において、一本鎖若しくは二重鎖の形態の任意の長さのＲＮＡ、ＤＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列を含む分子を記載するための形容詞として用いる。より正確には、「ヌクレオチド配列」との表現は、核酸物質自体を包含し、よって、特定のＤＮＡ又はＲＮＡ分子を生化学的に特徴づける配列情報（例えば４つの塩基の文字から選択される文字の羅列）に限定されない。「ヌクレオチド」との用語は、本明細書において、個別のヌクレオチド又はヌクレオチドの種類のことをいい、プリン若しくはピリミジン、リボース若しくはデオキシリボース糖部分及びリン酸基、又はオリゴヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド内のヌクレオチドの場合はホスホジエステル結合を含む、より大きい核酸分子中の分子又は個別の単位を意味する名詞としても用いられる。「ヌクレオチド」との用語は、本明細書において、（ａ）代替連結基、（ｂ）プリンの類似形態、（ｃ）ピリミジンの類似形態又は（ｄ）類似糖のような少なくとも１つの修飾を含む「修飾ヌクレオチド」を包含するためにも用いられる。類似連結基、プリン、ピリミジン及び糖の例については、例えばＷＯ９５／０４０６４（その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている）を参照されたい。本発明の好ましい修飾は、それらに限定されないが、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルグアノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルグアノシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）ワイブトキソシン、シュードウラシル、グアノシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、及び２，６−ジアミノプリンを含む。本明細書のポリヌクレオチド配列は、合成、組換え、ｅｘ ｖｉｖｏ作製又はそれらの組み合わせを含む任意の既知の方法により、及び当該技術において既知の任意の精製方法を利用することにより調製できる。メチレンメチルイミノ連結オリゴヌクレオチド及び混合主鎖化合物は、米国特許第５，３７８，８２５号；第５，３８６，０２３号；第５，４８９，６７７号；第５，６０２，２４０号；及び第５，６１０，２８９号に記載されるようにして調製できる。ホルムアセタール及びチオホルムアセタール連結オリゴヌクレオチドは、米国特許第５，２６４，５６２号及び第５，２６４，５６４号に記載されるようにして調製できる。エチレンオキシド連結オリゴヌクレオチドは、米国特許第５，２２３，６１８号に記載されるようにして調製できる。ホスフィネートオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，５０８，２７０号に記載されるようにして調製できる。アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドは、米国特許第４，４６９，８６３号に記載されるようにして調製できる。３’−デオキシ−３’−メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，６１０，２８９号又は第５，６２５，０５０号に記載されるようにして調製できる。ホスホラミダイトオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，２５６，７７５号又は第５，３６６，８７８号に記載されるようにして調製できる。アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドは、ＷＯ９４／１７０９３及びＷＯ９４／０２４９９に記載されるようにして調製できる。３’−デオキシ−３’−アミノホスホラミデートオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，４７６，９２５号に記載されるようにして調製できる。ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，０２３，２４３号に記載されるようにして調製できる。ボラノホスフェートオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，１３０，３０２号及び第５，１７７，１９８号に記載されるようにして調製できる。

[00121]「上流」との用語は、本明細書において、特定の参照点からポリヌクレオチドの５’端に向かう位置のことをいう。

[00122]「塩基対形成した」及び「ワトソンクリック塩基対形成した」との用語は、本明細書において交換可能に、チミン又はウラシル残基がアデニン残基と２つの水素結合により連結し、シトシンとグアニン残基が３つの水素結合により連結される、二重らせんＤＮＡで見出されるような様式で、それらの配列が何であるかにより互いに水素結合できるヌクレオチドのことをいう。

[00123]「相補的な」又は「その相補鎖」との用語は、本明細書において、相補性領域の全体にわたって別の特定されたポリヌクレオチドとワトソンクリック塩基対を形成できるポリヌクレオチドの配列のことをいう。本発明の目的のために、第１ポリヌクレオチドは、第１ポリヌクレオチドにおける各塩基がその相補的塩基と対形成するならば、第２ポリヌクレオチドと相補的であるとみなされる。相補的塩基は、通常、ＡとＴ（又はＡとＵ）又はＣとＧである。「相補鎖」とは、本明細書において、「相補的ポリヌクレオチド」、「相補的核酸」及び「相補的ヌクレオチド配列」と同義として用いられる。これらの用語は、それらの配列のみに基づくポリヌクレオチドの対について用いられ、２つのポリヌクレオチドが実際に結合する条件のいずれの特定の組についても用いない。そうでないと述べない限り、全ての相補的ポリヌクレオチドは、考慮するポリヌクレオチドの全長で完全に相補的である。

[00124]本明細書において交換可能に用いられる「ポリペプチド」及び「タンパク質」との用語は、ポリマーの長さに関係なく、アミノ酸のポリマーのことをいう。よって、ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質は、ポリペプチドの定義の中に含まれる。本明細書のポリペプチドの化学的及び発現後修飾は、具体的な実施形態に含まれ排除され得るが、この用語は、本明細書のポリペプチドの化学的若しくは発現後修飾を特定又は排除しない。よって、例えば、グリコシル基、アセチル基、リン酸基、脂質基などの共有結合による付着を含むポリペプチドの修飾は、ポリペプチドとの用語に明白に包含される。さらに、これらの修飾を有するポリペプチドは、本発明に含まれるか又は本発明から排除されるように個別の種として特定できる。上記の例に列挙したもののような天然又はその他の化学的修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖及びアミノ末端又はカルボキシ末端を含むポリペプチドのどこでも生じることができる。所定のポリペプチド中のいくつかの位置にて、同じ又は異なる程度で同じタイプの修飾が存在できることが認識される。また、所定のポリペプチドは、多くのタイプの修飾を含有できる。ポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分岐してもよく、これらは、分岐を有するか又は有さない環状であってもよい。修飾は、当該技術において知られるように、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合による付着、ヘム部分の共有結合による付着、ヌクレオチド若しくはヌクレオチド誘導体の共有結合による付着、脂質若しくは脂質誘導体の共有結合による付着、ホスファチジルイノシトールの共有結合による付着、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合的架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ｐｅｇ化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなトランスファーＲＮＡ媒介によるタンパク質へのアミノ酸の付加、及びユビキチン化を含む。アミノ酸の１又は複数の類似体を含有するポリペプチド（例えば非天然アミノ酸、関係しない生物系においてのみ天然に存在するアミノ酸、哺乳類の系からの改変アミノ酸など）、置換された結合を有するポリペプチド、並びに天然に存在するものと天然に存在しないものの両方の、当該技術において既知のその他の修飾も、定義に含まれる。
本明細書で用いる場合、「組換えポリヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド構築物」との用語は、交換可能に、人工的に設計され、それらの最初の天然環境において連続ヌクレオチド配列として見出されない少なくとも２ヌクレオチド配列を含む、線状又は環状の、精製又は単離されたポリヌクレオチドのことをいうために用いられる。特に、これらの用語は、ポリヌクレオチド又はｃＤＮＡが、それが天然の環境では隣接していない「主鎖」核酸に隣接することを意味する。本発明による主鎖分子は、発現ベクターのような核酸、自己複製核酸、ウイルス、組み込み核酸及び興味対象の核酸挿入物を維持若しくは操作するために用いられるその他のベクター又は核酸を含む。

[00125]本明細書で用いる場合、「作動可能に連結された」との用語は、機能的関係でのポリヌクレオチドエレメントの連結のことをいう。プロモーターのような調節配列と「作動可能に連結した」配列とは、該調節エレメントが、ＲＮＡポリメラーゼ開始及び興味対象の核酸の発現を制御するための核酸の関係において正しい位置及び方向にあることを意味する。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響する場合は、コード配列と作動可能に連結されている。

[00126]ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも１５、３０、５０、１００、１２５、５００又は１０００の連続ヌクレオチドである。別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、３００ｋｂ、２００ｋｂ、１００ｋｂ、５０ｋｂ、１０ｋｂ、７．５ｋｂ、５ｋｂ、２．５ｋｂ、２ｋｂ、１．５ｋｂ又は１ｋｂと等しいか又はそれ未満の長さである。さらなる実施形態において、本明細書のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるコード配列の一部を含むが、任意のイントロンの全て又は一部分は含まない。別の実施形態において、コード配列を含むポリヌクレオチドは、ゲノムフランキング遺伝子のコード配列を含有しない（すなわち、ゲノム中の興味対象の遺伝子の５’又は３’）。別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、１０００、５００、２５０、１００、７５、５０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２又は１より多い天然に存在するゲノムフランキング遺伝子（複数可）を含有しない。

[00127]検出可能なプローブとハイブリダイズできる核酸の存在を検出するために用いる手順は、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、ドットブロッティング、コロニーハイブリダイゼーション、及びプラークハイブリダイゼーションのように公知の技術を含む。いくつかの用途において、標識されたプローブとハイブリダイズできる核酸は、発現ベクター、配列決定ベクター又はｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ベクターのようなベクターにクローニングして、試料中のハイブリダイズする核酸の特徴決定及び発現を容易にすることができる。例えば、このような技術を用いて、本明細書に記載されるような検出可能なプローブとハイブリダイズできるゲノムライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーにおける配列を単離してクローニングできる。

[00128]あるいくつかの実施形態は、標識をプローブ、プライマー及び／又は標的核酸に組み込んで、検出ユニットによるその検出を容易にすることを含み得る。ラマンタグ、蛍光体、発色団、放射性同位体、酵素タグ、抗体、化学発光体、電気発光体、親和性標識などのようないくつかの異なる標識を用いることができる。当業者は、これら及び本明細書で言及しないその他の標識部分を、開示される発明において用いることができることを認識している。

[00129]用いる蛍光標識は、それらに限定されないが、Ａｌｅｘａ３５０、Ａｌｅｘａ４３０、ＡＭＣＡ（７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸）、ＢＯＤＩＰＹ（５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸）６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ（フルオレセイン）、ＢＯＤＩＰＹ−Ｒ６Ｇ（６−カルボキシローダミン）、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ（テトラメチルローダミン）、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲＸ（テキサスレッド−Ｘ）、カスケードブルー、Ｃｙ２（シアニン）、Ｃｙ３、Ｃｙ５，６−ＦＡＭ（５−カルボキシフルオレセイン）、フルオレセイン、６−ＪＯＥ（２’７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン）、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、パシフィックブルー、ローダミングリーン、ローダミンレッド、ＲＯＸ（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、ＴＡＭＲＡ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン）、テトラメチルローダミン及びテキサスレッドを含み得る。蛍光及び発光標識は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）のような標準的な商業的供給源から得ることができる。

[00130]酵素標識の例は、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼを含む。比色指示基質をこのような酵素とともに用いて、人の目又は分光光学的に可視の検出手段を得ることができる。用いる可能性がある放射性同位体は、^１４Ｃ、^３Ｈ、^１２５Ｉ、^３２Ｐ及び^３５Ｓを含む。

[00131]あるいくつかの実施形態において、発現ベクターを用いて、ＴＭ９ＳＦ ａｒＮＯＸアイソフォームの１又は複数の阻害剤をスクリーニングするための材料を調製する。発現は、適切なシグナルがベクター内に設けられていることを必要とでき、該ベクターは、宿主細胞での興味対象の遺伝子の発現を駆動するウイルス又は哺乳類供給源からのエンハンサー／プロモーターのような種々の調節エレメントを含む。二方向性宿主因子非依存性転写終結エレメントを、発現ベクターに組み込むことができ、転写、翻訳、ＲＮＡ安定性又はタンパク質安定性のレベルを、当該技術において知られる標準的な技術を用いて決定できる。二方向性宿主因子非依存性転写終結配列の効果は、二方向性宿主因子非依存性転写終結配列を欠く対照発現ベクター、又は既知の効果の二方向性宿主因子非依存性転写終結配列を含有する発現ベクターとの比較により決定できる。

[00132]あるいくつかの実施形態において、核酸コード配列の一部又は全体が転写され得る遺伝子生成物をコードする核酸を含有する発現コンストラクト又は発現ベクター、任意のタイプの遺伝子コンストラクトは、興味対象のコード配列が、プロモーターの転写制御と作動可能に連結され、該制御の下で発現されるように構築される。「プロモーター」とは、遺伝子の特異的転写を開始するために必要な細胞の合成装置又は導入された合成装置により認識されるＤＮＡ配列のことをいう。「転写制御の下で」との句は、プロモーターが、核酸との関係において正しい位置及び方向にあって、ＲＮＡポリメラーゼ開始及び興味対象の単離宿主細胞における遺伝子の発現を制御することを意味し得る。

[00133]ｃＤＮＡ挿入物を採用する場合、典型的には、ポリアデニル化シグナルを含んで、遺伝子転写産物の正しいポリアデニル化を行うことができる。ターミネーターも、発現コンストラクトのエレメントとして構想される。これらのエレメントは、メッセージレベルを増進し、コンストラクトから他の配列に読み過ごされることを最小限にし得る。

[00134]あるいくつかの実施形態において、発現構築物又はベクターは、レポーター遺伝子を含有し、その活性を検出又は測定して、二方向性宿主因子非依存性転写終結エレメント又はその他のエレメントの効果を決定できる。簡便には、レポーター遺伝子は、着色生成物、蛍光生成物又は発光生成物のような容易にアッセイされる生成物を生成する。ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）、ルシフェラーゼ、ＧＡＬ（β−ガラクトシダーゼ）、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）をコードする遺伝子などのようなレポーター遺伝子の多くの例が利用可能である。採用される具体的なレポーター遺伝子は、それが発現でき、発現が検出できることを条件として、重要でない。レポーター遺伝子のさらなる例は、当該技術において公知であり、既知のもののいずれも、請求項に記載の方法の実施において用いることができる。

[00135]クローニングについての一般的な参考文献は、当業者に容易に利用可能な他のものの中でも、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８２）、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ １９９３、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、ＮＹを含む。

[00136]興味対象のａｒＮＯＸタンパク質と特異的に反応するモノクローナル又はポリクローナル抗体は、当該技術において公知の方法により作製できる。当業者が容易に利用できる他のものの中でも、例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；及びＡｕｓｕｂｅｌら（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ／Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹを参照されたい。

[00137]全般的に、本明細書で用いる用語及び句は、それらの当該技術において認識される意味を有し、これは、そうでないと定義しない限り、標準的な参考書、雑誌参考文献及び当業者に知られる状況で見出すことができる。

Claims (13)

1. 可溶性加齢関連ＮＡＤＨ酸化酵素（ａｒＮＯＸ）ポリペプチド又はその酵素活性断片をコードする部分を含む非天然組換えＤＮＡ分子であって、前記部分が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列、又は前記配列の１つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、ハイブリダイズする前記配列が、ａｒＮＯＸファミリーのアイソフォームの加齢関連マーカータンパク質をコードする非天然組換えＤＮＡ分子。
2. 請求項１の組換えＤＮＡ分子を含有するように形質転換又はトランスフェクションされた単離宿主細胞。
3. 細菌細胞である、請求項２に記載の単離宿主細胞。
4. 前記細菌細胞が、エシェリキア・コリ細胞である、請求項３に記載の単離宿主細胞。
5. 真核細胞である、請求項２に記載の単離宿主細胞。
6. 哺乳類細胞である、請求項２に記載の単離宿主細胞。
7. ＣＯＳ細胞である、請求項６に記載の単離宿主細胞。
8. 酵母細胞である、請求項５に記載の単離宿主細胞。
9. 宿主細胞でａｒＮＯＸ活性タンパク質又はポリペプチドを組換え生成する方法であって、
   ａ．前記宿主細胞において活性なプロモーターと、前記ａｒＮＯＸポリペプチドのコード領域とを含むベクターに単離宿主細胞を感染させるか又は該ベクターで該宿主細胞を形質転換して、組換え宿主細胞を生成するステップであって、前記ａｒＮＯＸタンパク質又はポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６又は配列番号１７のアミノ酸配列により同定される９回膜貫通型スーパーファミリーメンバー１ａ、１ｂ、２、３及び４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、前記プロモーターが、前記コード領域と作動可能に連結されているステップと、
   ｂ．組換え宿主細胞を、前記ａｒＮＯＸタンパク質又はポリペプチドが発現される条件下で培養するステップと
   を含む方法。
10. 哺乳動物における加齢の状態及びａｒＮＯＸアイソフォーム組成を決定する方法であって、
    ａ．生体試料を準備するステップと、
    ｂ．ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション又はプライマーと鋳型との完全な一致が必要とされるポリメラーゼ連鎖反応を用いて行われる、加齢と関連する１又は複数のａｒＮＯＸタンパク質をコードするリボ核酸分子の生体試料中での存在を検出するステップであって、ハイブリダイゼーションプローブ又はプライマーが、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７及び配列番号９に示すヌクレオチド配列の少なくとも１５連続ヌクレオチドから本質的になるステップと
    を含み、
    生体試料中のリボ核酸分子の存在が、ａｒＮＯＸ発現を示す方法。
11. 配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６若しくは配列番号１７、又は配列番号２のアミノ酸５６〜８７、配列番号２のアミノ酸５４８〜５６８、配列番号６のアミノ酸７３〜１０４、配列番号８のアミノ酸５５〜８８、配列番号１０のアミノ酸５３〜８４に示すアミノ酸配列を特徴とするタンパク質からなる群より選択される抗原と特異的に結合する抗体調製物。
12. 哺乳動物におけるａｒＮＯＸアイソフォーム組成を決定する方法であって、
    ａ．哺乳動物からの生体試料を準備するステップと、
    ｂ．ステップａ）の生体試料を、少なくとも１つのａｒＮＯＸタンパク質に特異的な検出可能な抗体と、抗体とａｒＮＯＸタンパク質との結合を可能にする条件下で接触させるステップと、
    ｃ．加齢関連障害と関連する少なくとも１つのａｒＮＯＸアイソフォームの生体試料中の存在を、ａｒＮＯＸタンパク質に特異的な検出可能な抗体が結合した場合に検出するステップと
    を含む方法。
13. 哺乳動物における加齢関連障害の改善に効果的な免疫原性組成物であって、
    配列番号２、４、６、８、１０、１３、１４、１５、１６若しくは１７に示す少なくとも１つのａｒＮＯＸタンパク質又はポリペプチド、或いは
    配列番号２のアミノ酸５４８〜５６８、配列番号２のアミノ酸５６〜８７、配列番号６のアミノ酸７３〜１０４、配列番号８のアミノ酸５５〜８８若しくは配列番号１０のアミノ酸５３〜８４に示すアミノ酸配列を有するペプチド
    を含む組成物。

Images