CN102016587B

CN102016587B - 新的转移性人类肿瘤相关分子、检测激活的基因和蛋白的方法以及干扰基因表达的方法

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Publication number: CN102016587B
Application number: CN200980111385.6A
Authority: CN
Inventors: F·洛祖波内; S·法伊斯
Original assignee: Hansabiomed OU
Current assignee: Waisomix Co., Ltd
Priority date: 2008-01-25
Filing date: 2009-01-26
Publication date: 2015-05-13
Anticipated expiration: 2029-01-26
Also published as: ES2587055T3; JP2011511625A; RU2010135525A; PL2245465T3; WO2009092385A1; US8097407B2; AU2009207926A1; EP2245465A1; EP2245465B1; CA2713193A1; CN102016587A; JP5752419B2; RU2546000C2; AU2009207926B2; US20090191222A1; BRPI0906681A2; MX2010008163A; CA2713193C

Abstract

本公开描述了tm9sf4编码的人类蛋白的功能和表达。该蛋白在恶性肿瘤细胞中高度表达，因此是恶性的新型标志物。此外，该蛋白参与肿瘤细胞的吞噬特性。本公开了提供了诊断和跟进肿瘤的恶性的方法和工具。此外，提供了抑制肿瘤细胞的吞噬特性的方法以及治疗癌症的方法。

Description

新的转移性人类肿瘤相关分子、检测激活的基因和蛋白的方法以及干扰基因表达的方法

技术领域

本发明大体上涉及癌症研究领域，更具体地，涉及鉴定新的与肿瘤发生和转移相关的蛋白和基因。本发明涉及恶性的新型标志物。本发明还涉及基因治疗领域。

背景技术

在2005年，全世界58,000,000死亡人数中有7,600,000人死于癌症。据预测，癌症死亡将持续增加，估计在2015年会有9,000,000人死于癌症，2030年会有11,400,000人死于癌症(WHO数据)。癌症治疗可能包括手术、放疗、化疗、激素治疗或这些治疗的一些组合，但是目前对于多数癌症患者而言，生存率是极低的。根据世界卫生组织，如果发现得早且治疗充分的话，三分之一的癌症负担是可以治愈的。病理学研究提供了建立多数实体瘤诊断的方法。虽然根据目前的病理学标准可以可靠地将很多病例进行分类，但是存在重要的病例亚型，其中即使在病理学专家中也未能达到一致意见。诊断上的含糊对于患者具有严重的有害结果。将肿瘤错误地分类为良性可能是致命的，将良性病变诊断为恶性则可能引起高发病率。目前没有方法可以确切地解决这些含糊。因此，显然需要一种能够降低这些不确定性的治疗性检测。

吞噬是细胞将大颗粒(通常直径为0.1mm)例如细菌或细胞碎片内化的过程。可以尝试性地将吞噬的早期阶段分成不同的步骤：细胞膜结合颗粒、吞噬体形成和吞噬体内化。已经有人提出在吞噬体形成和内化的过程中，肌动蛋白细胞骨架驱动这些步骤以允许吞噬。

早在一个世纪之前即已在恶性肿瘤中鉴定了吞噬细胞，更近一些时候，在不同组织学的肿瘤中检测到了具有吞噬行为(也定义为同类相食行为(cannibalistic behavior)的细胞，所述肿瘤为例如肺的燕麦细胞瘤、乳腺癌、膀胱癌、成神经管细胞瘤、胃腺癌、皮肤的黑素瘤和鳞片细胞癌。

我们最近观察到吞噬是转移性的黑素瘤细胞的特征，这些细胞能够吞噬凋亡细胞、塑料珠染色的酵母以及显示出负责巨噬细胞样活性的有效吞噬机制的活的淋巴细胞，而源自初级病变的黑素瘤细胞不显示任何同类相食或吞噬活性。此外，在100％的转移性黑素瘤病变中均可检测到同类相食细胞(cannibal cell)(Lugini等人，2004；Lugini等人，2006)。

同类相食细胞的主要特征之一是溶酶体样小泡的酸性增加和组织蛋白酶B的过表达，组织蛋白酶B是被报道参与肿瘤侵袭和转移的蛋白水解酶(Sloane等人，1981)。与专职的吞噬细胞样巨噬细胞不同，同类相食肿瘤细胞不利用皱状结构或任何伪足运动。相反，触碰肿瘤细胞的外膜的活的或死的材料立即被内吞并通过一种流沙机制被消化，该机制似乎不涉及任何特异性受体。

这些发明指引我们推测：同类相食细胞以其它细胞进行饲养，其中可能不存在源自血液的营养物供给的特定需要，还推测肿瘤细胞对淋巴细胞的同类相食可能代表了肿瘤免疫逃逸的根本机理。此外，这些发现指引我们获得了新型的、革命性的解释：癌细胞在其使用其它细胞进行饲养的行为中可能表现为单细胞真核细胞的行为，其唯一目的是在与其它细胞和不利环境持续抗争的过程中存活下来。该理论进一步指引我们推测：变形虫和转移性的细胞可能具有含有相同调控元件的相同框架，所述调控元件允许它们在不利的微环境条件下存活下来。但是，目前为止，尚未发现与癌细胞的同类相食行为特异相关的基因。

细胞粘霉菌盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)以前曾被用作研究吞噬的模式生物。盘基网柄菌细胞的吞噬中涉及的机制与哺乳动物的吞噬细胞使用的机制非常相似，包括肌动蛋白细胞骨架和RacF1，RacF1是GTP结合蛋白的Rho家族的成员。但是，在哺乳动物中尚未鉴定出与吞噬相关的特异性蛋白。

最近发现：在变形虫盘基网柄菌中，在细胞粘附和吞噬中牵涉到PHG1A基因编码的蛋白。该蛋白属于TM9超家族，可以在真核细胞基因组中明确地鉴定出编码TM9蛋白的基因。该家族在生物(从酵母到植物和人类)中包括很多成员。仅举一些例子：在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、变形虫盘基网柄菌和果蝇中有该家族的3个成员，在人类和小鼠中有4个。它们全都显示出相似的总体结构，具有高度可变的潜在的腔结构域，后跟更保守的膜结构域和9个或10个推定的跨膜结构域。

发明概述

基于我们的理论：癌细胞使用其它细胞进行饲养，其行为表现为单细胞真核细胞，并且可能与变形虫具有含有相同调控元件的相同框架，我们比较了PHG1A基因和人类基因组。在人类中phg1的三个同源物已经被完全测序(TM9SF4、U81006和U94831)，我们发现人类中与盘基网柄菌的phg1最近的同源物是tm9sf4(其它别名：KIAA0255、dJ836N17.2)，其位于染色体20q11.21上。虽然该基因已经被完全测序，但是其功能或表达产物从未被描述过。

因此，我们更详细地研究了tm9sf4编码的蛋白的功能和表达。在本公开中，我们显示了该蛋白的功能并提供了很多应用。

本公开显示：该蛋白在恶性细胞中是高度表达的。在源自患者的几种黑素瘤细胞系中的观察显示：TM9SF4是恶性的标志物，因为该蛋白在源自初级病变的细胞系中是检测不到的。此外，在转移性的黑素瘤细胞的吞噬行为中也涉及该蛋白，因为使编码该蛋白的基因发生沉默会强烈抑制转移性细胞的吞噬行为。基于这些发现，我们将此蛋白命名为TUCAP-1(肿瘤相关的同类相食蛋白1，Tumor associated cannibal protein 1)。相应地，编码该蛋白的基因在本文中被称为tucap-1基因。

本发明满足了用于检测恶性细胞和诊断黑素瘤及其它肿瘤的快速测试的要求。因此，本公开提供了可用于进行TUCAP-1检测、分析和潜在的治疗效应的抗体、引物、寡核苷酸和多肽。

本发明提供了对应于或互补于tucap-1基因的全部或一部分的多核苷酸，以及与tucap-1基因、mRNA或编码TUCAP-1的多核苷酸杂交的多核苷酸或寡核苷酸。提供了含有TUCAP-1多核苷酸的重组DNA分子、经这样的分子转化或转导的细胞，以及用于表达tucap-1基因产物的宿主-载体系统。本公开还提供了TUCAP-1蛋白及其多肽片段。

本发明还提供了与TUCAP-1蛋白及其多肽片段结合的抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体、鼠和其它哺乳动物抗体、嵌合抗体、人源化和完全的人类抗体，以及经可检测标记物标记的抗体，和与放射性核苷酸、毒素或其它治疗性组合物偶联的抗体。本发明还提供了用于检测在各种生物样品中是否存在TUCAP-1多核苷酸和蛋白的方法，以及用于鉴定表达TUCAP-1的细胞的方法。

附图说明

图1.TM9SF4/TUCAP-1蛋白的分子结构

(A)TUCAP-1蛋白序列的水性分布图。疏水性区域在横线以上以正数表示。在横坐标中标明了氨基酸编号。N末端区域中的亲水性区段之后是9个疏水性区域。使用TopPred预测程序根据Claros和von Heijneb进行分析。

(B)根据TopPred预测服务器的TUCAP-1二级结构的图像代表。

图2.TM9SF4/TUCAP-1转录本的检测和TUCAP-1抗体的表征

(A)在最近在体外从转移性病变建立的5种转移性(MM1-5)和5种初级黑素瘤(PM1-5)细胞系以及来自2个不同供体的外周血细胞(PBL1-2)中进行的TUCAP-1(上面的图板)和GAPDH(下面的图板)的RT-PCR分析；M：大小标志物。

(B)用于免疫小鼠的6-组氨酸标记的TUCAP-1肽和未经诱导的细菌裂解物中的6-组氨酸或TUCAP-1的Western印迹。将等量的纯化的蛋白和细菌裂解液装入还原性凝胶中并以6-His-抗体或TUCAP-1小鼠抗血清进行印迹。使用HPR偶联的二抗显示蛋白并以ECL系统(Pierce)显示。

(C)在GFP-TUCAP-1(GFP-Tuc)转染的MM1细胞的Triton可溶性(泳道1)和Triton不可溶性(泳道2)组分，以及未经转染的MM1细胞的Triton可溶性和不可溶性组分(泳道3-4)中进行的GFP-TUCAP-1和GAPDH的Western印迹。M：大小标志物。使用HPR偶联的二抗显示蛋白并以ECL(Pierce)显示。作为分子量标志物，使用了RainbowTM(Amersham UK)预染的标准物。

图3.TUCAP-1的Western印迹分析

为了检测TUCAP-1，在GFP-Tuc转染的MM2细胞、4种转移性的黑素瘤细胞系(MM2-5)和CCD-1064SK人类皮肤成纤维细胞(HSC)中进行的Western印迹。通过肌动蛋白的免疫检测控制上样量。使用HPR偶联的二抗和DAB系统(DAKO，Denmark)作为色原体(cromogen)来显示蛋白。使用RainbowTM(Amersham UK)预染的标准物作为分子量标志物。

图4.TUCAP-1的免疫细胞化学和免疫组织化学分析。图4A与图4相同，不过图4A是黑白图。

(A)MM2细胞；(B)外周血淋巴细胞；(C)体外分化的巨噬细胞的小鼠免疫前血清免疫细胞化学分析。

(D)M2细胞；(E)外周血细胞；(F)巨噬细胞的TUCAP-1免疫细胞化学分析。

以(G)免疫前小鼠血清；(H)TUCAP-1免疫血清和(I)抗-GP100染色的恶性黑素瘤组织的免疫组织化学分析。

以(J)免疫前小鼠血清；(K)TUCAP-1免疫血清和(L)抗-ezrin抗体染色的健康皮肤的免疫组织化学分析。放大倍数为10倍。

图5.TUCAP-1/-I的亚细胞定位。图5A与图5相同，不过图5A是黑白图。

(A)来自MM2总裂解物的TUCAP-1免疫沉淀物的亚细胞组分的Western印迹分析。M：大小标志物，TE：总提取物。

(B)TUCAP-1(绿色)和Rab5(红色)的免疫荧光(IF)双染色分析。

(C)TUCAP-1(绿色)和Lamp-1(红色)的IF双染色分析。

(D)TUCAP-1(绿色)和Mitotracker染色的线粒体(红色)的IF双染色分析。黄色/橙色区域表示共定位。细胞核以Hoechst 33258染色。放大倍数为100倍。

图6.TUCAP-1/-II的亚细胞定位。图6A与图6相同，不过图6A是黑白图

在MM2细胞中TUCAP-1(绿色)和EEA1(红色)的免疫荧光(IF)双染色分析。黄色/橙色区域表示共定位。细胞核以Hoechst 33258染色。放大倍数为100倍。

图7.同类相食细胞中的TUCAP-1检测。图7A与图7相同，不过图7A是黑白图

(A)与活的淋巴细胞共培养的转移性的黑素瘤MM1细胞中TUCAP-1的检测和定位。TUCAP-1(绿色)的IVM分析。图像着重显示仅在黑素瘤细胞中可以检测到TUCAP-1。

(B)与活的淋巴细胞共培养的转移性的黑素瘤MM1细胞中TUCAP-1(绿色)和EEA1(红色)的双荧光分析。黄色/橙色区域表示共定位。细胞核以Hoechst 33258染色。

图8.TUCAP-1表达的FACS分析

在未经转染的MM2细胞、打乱的(Scrambled)siRNA和TUCAP-1siRNA(TM9SF4siRNA)转染的MM2细胞中在转染之后48小时进行TUCAP-1表达的Facs分析。

图9.TM9SF4/TUCAP-1的功能分析

(A)打乱的siRNA(SC-siRNA)或TUCAP-1siRNA(TM9SF4siRNA)转染的MM2细胞的吞噬活性的FACS分析。灰色：未染色的对照细胞；红色：阴性对照，打乱的siRNA转染的细胞；绿色：TM9SF4siRNA转染的细胞。

(B)SC-siRNA或TM9SF4siRNA转染的MM2细胞与DHR123染色的淋巴细胞孵育18小时后的同类相食活性的FACS分析。灰色：未染色的对照细胞；红色：SC-siRNA转染的细胞；绿色：TM9SF4siRNA转染的。为了排除未被黑素瘤细胞摄取的DHR123染色的淋巴细胞，评价了专有性的黑素瘤细胞荧光发射。

(C)LysoTracker DND-26染色的SC-siRNA或TM9SF4siRNA转染的MM2细胞的FACS分析。灰色：未染色的对照细胞；红色：SC-siRNA转染的；绿色：TM9SF4siRNA转染的。

图10.通过Matrigel证明TUCAP-1的过表达增强细胞侵袭。图10A与图10相同，不过图10A是黑白图

侵袭性WM743黑素瘤细胞相对于GFP-标记的全长TUCAP-1WM743黑素瘤细胞(TWM)的相显微镜图像。将侵袭性细胞固定于福尔马林中并以结晶紫染色。图像清晰地显示：TWM的侵袭性细胞的数目显著较高，对于未转染的TWM是平均25个细胞，对于TUCAP-1转染的TWM是平均132个细胞。

发明描述

TUCAP-1/TM9SF4(HUGO命名法官方委员会官方全名：跨膜9超家族蛋白成员4)属于跨膜9超家族(TM9SF)，其为高度保守的蛋白家族，其特征在于存在大的可变的细胞外N末端结构域和9至10个推定的跨膜结构域。但是，在人类细胞中从未描述过TM9SF4的功能和定位。在本公开中，我们对该蛋白的表达进行了定位并提供了该蛋白的有用的和新的应用。本公开鉴定出该蛋白为新的癌蛋白并且显示该蛋白在恶性肿瘤细胞中表达，而在众多健康细胞和组织中是检测不到的。本公开还显示了该蛋白的结构，并通过与其它蛋白类比显示了该蛋白可能参与细胞内小泡的pH调节。贯穿本公开，我们将该蛋白称为TUCAP-1，相应地将编码该蛋白的基因称为tucap-1。

下表1显示了TUCAP-1蛋白的理化参数

通过TopPred预测服务器对TUCAP-1进行的水性分析显示出多数为亲水性的、延伸至氨基酸262的氨基末端部分，而该蛋白的剩余部分是极度疏水性的并含有9个潜在的跨膜结构域(图1A)。基于这种预测的结构，可以非常合理的假设：TUCAP-1是整合的膜蛋白，如图1B所示。我们的发现“TUCAP-1和PHG1之间有相当高的同源性(45％，如果考虑到NCBI Blast蛋白程序阳性比对则上升到63％)”引领我们得到如下新的假设：TUCAP-1可能在人类转移性黑素瘤细胞的同类相食活性中发挥作用。

根据本发明的一个优选的实施方式是，对应于或互补于tucap-1基因的全部或一部分、mRNA和/或编码序列的多核苷酸，优选为分离的形式，包括编码TUCAP-1蛋白及其片段的多核苷酸、DNA、RNA、DNA/RNA杂合体，以及相关分子，互补于tucap-1基因或其mRNA序列或部分的寡核苷酸，以及与TUCAP-1基因、mRNA或编码TUCAP-1的多核苷酸杂交的多核苷酸或寡核苷酸。

根据本发明的另一个优选实施方式是“抗体”，其为识别(或可结合)TUCAP-1蛋白的“特定序列”(即其抗原)的完整抗体分子或其片段。抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。在这个实施方式中，TUCAP-1蛋白是具有如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽，特定序列是多肽或其片段，所述多肽具有的氨基酸序列与SEQ ID NO：1的氨基酸序列相比含有一个或多个氨基酸的删除、替代或添加。本发明的抗体包括抗体突变体。“抗体突变体”是这样的突变体：抗体中的一个或多个氨基酸残基经过了相对于原始状态的修饰。

根据另一个实施方式是TUCAP-1抑制剂。这样的抑制剂分子可以是与SEQ ID NO：2的序列基本上互补的多核苷酸序列或其部分，以及与SEQ IDNO：2的片段基本上互补的寡核苷酸序列。

根据本发明的另一个实施方式是治疗人类患者中的癌症的方法，包括以下步骤：给予所述患者治疗有效量的组合物，所述组合物包含与化疗药物偶联的TUCAP-1结合试剂。与TUCAP-1蛋白特异性结合的抗体和片段可用于治疗癌症。本发明包括使用与对于癌症可具有细胞毒性效应的其它部分融合的抗体和抗体片段。

本发明的另一个优选的实施方式是产生针对TUCAP-1蛋白或其片段的单克隆抗体的细胞系。

根据另一个优选的实施方式是含有全长野生型或突变的TUCAP-1序列或TUCAP-1的删除突变体的重组DNA或RNA分子，包括但不限于噬菌体、质粒、噬菌粒、粘粒、YAC、BAC以及各种本领域熟知的病毒和非病毒表达载体，和经过这样的重组DNA或RNA分子转化或转染的细胞。使用这些表达载体，TUCAP-1可以在几种恶性肿瘤细胞系中优选表达。优选的实施方式包括宿主-载体系统，其可用于产生TUCAP-1蛋白或其片段。这样的宿主-载体系统可用于：i)研究TUCAP-1和TUCAP-1突变的功能特性；ii)作为模型来开发基于使用TUCAP-1沉默载体和表达TUCAP-1突变体的载体的基因治疗方案。

因此，本发明提供了测定、研究和检测TUCAP-1(作为很多类型的癌症的恶性的标志物)的独特工具。此外，本发明介绍了用于临床肿瘤学家管理和跟进(follow up)癌症患者的新的工具。此外，作为抗肿瘤化合物，能够干扰TUCAP-1表达或作为TUCAP-1阻断试剂的其它分子的肽落在本发明的范围内。

本发明的另一个优选的实施方式是用于检测来自肿瘤患者的组织样品和体液的TUCAP-1的试剂盒，其作为诊断和或预后工具，例如作为检测试剂盒。这样的试剂盒包括：a)抗TUCAP-1抗体；b)由纯化的TUCAP-1蛋白组成的阳性对照，和必要的缓冲剂。

现在通过实施例的方式描述本发明，这些实施例不是为了限制本发明的范围。本发明的范围由随附的权利要求书确定。

实施例

实施例1

在人类恶性黑素瘤细胞中可以检测到Tucap-1转录本和TUCAP-1蛋白，但是在初级黑素瘤细胞、外周血单核细胞或健康皮肤细胞中检测不到

细胞培养.人类初级和转移性的黑素瘤细胞系分别源自在IstitutoNazionale dei Tumori，Milan，Italy进行手术切除的患者的初级或转移性的肿瘤损伤。本研究中使用的所有细胞被称为PM(初级黑素瘤)或MM(转移性的黑素瘤)，后跟累进数字。通过Ficoll-Hypaque(Pharmacia)密度梯度从健康供体的黄层纯化人类外周血单核细胞(PBMC)。根据生产商的指示，使用CD 14标记的Miltenyi微珠从PBMC分离单核细胞，并于37℃置于RPMI 1640+15％FCS中使其分化2周。在CD14珠子介导的单核细胞消除之后获取剩余的外周血淋巴细胞(PBL)。在37℃在5％CO₂环境中将所有的细胞培植于补充了100IU/mL青霉素、100Ag/mL链霉素、10％FCS的RPMI 1640中(所有的试剂购自Cambrex)。

PCR分析.通过rt-PCR分析在Instituto Nazionale Tumori，Milan通过手术切除的患者的黑素瘤获得的几种初级和转移性黑素瘤细胞系中Tucap-1转录本的表达，将其与外周血淋巴细胞(PBL)进行比较。通过RNAzol(Invitrogen)方法从细胞获取总RNA，RNA模板用于RT-PCR扩增。用于TUCAP-1检测的引物是：

tgtgtgaaacaagcgccttc(SEQ ID NO：3)和

atgaggtggacgtagtagt(SEQ ID NO：4)。

这些引物扩增349个碱基对的片段。

用于指导TUCAP-1His-标记的N末端结构域合成的引物是：

gaattcatgtgtgaaacaagcgcctt(SEQ ID NO：5)和

gtcgacagaaaaccagtggatctg(SEQ ID NO：6)。

用于检测GAPDH的引物是：

ccatggagaaggctgggg(SEQ ID NO：7)和

caaagttgtcatggatgacc(SEQ ID NO：8)。

人类黑素瘤细胞中TUCAP 1的克隆和TUCAP 1融合蛋白的表达：将PCR产物克隆进入pTopo载体(Invitrogen)，然后以合适的限制性酶对(EcoRI、SalI)切割以获得单一片段，然后将该单一片段连接进入pTrcHis2载体(Invitrogen)。按照生产商的指示，使用Ni NTA琼脂糖树脂(Qiagen)纯化表达的重组蛋白并用于免疫小鼠。

用于指导GFP-标记的全长TUCAP-1的引物是：

gaattcatgtgtgaaacaagcg(SEQ ID NO：9)，和

gtcgatgtctatcttcacagcata(SEQ ID NO：10)。

将PCR产物克隆进入pTopo载体(Invitrogen)，然后以合适的限制性酶对(EcoRI-SalI)切割并连接以获得单一片段，然后在EcoRI和SalI位点将该单一片段连接进入pEGFPN1载体(Clontech)以产生GFP-TUCAP-1融合蛋白。按照生产商的指示，使用Lipofectamine 2000转染试剂盒(Invitrogen)将编码GFP-TUCAP-1融合蛋白的质粒转染进入MM1和MM2细胞，从而获得GFP-TUCAP-1(GFP-Tuc)MM1或MM2细胞。通过荧光活化细胞分选分析来评价转染的细胞的百分率。

Western印迹和免疫沉淀

将细菌裂解物、黑素瘤细胞全裂解物和CCD-1064SK健康皮肤成纤维细胞(SantaCruz)重悬于SDS样品缓冲液，通过煮沸变性，通过SDS-PAGE分离，并通过Western印迹分析。分别以抗6His单抗(Sigma)、抗GFP(克隆1E4MBL)、抗TUCAP-1小鼠血清和抗GAPDH(SantaCruz)检测6xHis标记的蛋白、GFP、TUCAP-1和GAPDH。在4℃在存在蛋白A+G-Sepharose珠子(Pierce)的情况下，通过使用兔子抗TUCAP-1多克隆抗体从预清除的细胞裂解物中免疫沉淀TUCAP-1蛋白。兔子免疫前血清用作阴性对照。以抗肌动蛋白单抗(Sigma)检测肌动蛋白。

为了表征tucap-1的基因产物，将源自MM1细胞的cDNA克隆进入细菌表达载体以获得融合至6-组氨酸N末端标签的TUCAP-1的前265个氨基酸(6H-Nt-TUCAP 1)(SEQ ID NO：11)。纯化的重组蛋白的Western印迹分析得到大约30kDa的翻译产物，在对照的细菌全裂解物(阴性对照)中不存在此产物。因此，His-标记的TUCAP-1重组肽用作免疫原以在小鼠中产生抗TUCAP-1抗体。通过纯化的6H-Nt-TUCAP-1与抗6His和TUCAP-1小鼠抗血清的免疫印迹反应的Western印迹分析确定TUCAP-1抗血清的特异性(图2B)。通过Western印迹在经过GFP-标记的全长TUCAP-1(GFP-TUCAP-1)转染的或未经转染的MM1细胞的Triton可溶性和Triton不可溶性组分中进一步分析TUCAP-1小鼠抗血清。抗-GFP抗体显示出100kDa范围内的单一的特异性翻译产物，而抗-TUCAP-1抗体同时识别GFP标记的和内源性的TUCAP-1，其对应于在两种细胞系中均可检测到的70kDa的蛋白(图2C)。有趣的是，在Triton不可溶性组分(GAPDH阴性，富含细胞骨架蛋白的组分)中代表了更多的TUCAP-1，因此支持“提出TUCAP-1是跨膜蛋白”的临时模型。为了进一步支持PCR结果，在4种转移性黑素瘤细胞(MM2-MM5)的细胞提取物中进行抗-TUCAP-1抗体的印迹反应，以前分析过所述这些细胞与作为对照的健康皮肤成纤维细胞(HSC)和GFP-TUCAP-1转染的MM2细胞相比的同类相食行为。仅在黑素瘤细胞中检测到了TUCAP-1，而在皮肤细胞中检测不到(图3)。

实施例2

免疫化学显示TUCAP-1仅存在于黑素瘤细胞中

免疫细胞化学和免疫组织化学.为了进行免疫细胞化学，将培养于腔室玻璃片(Falcon)上的黑素瘤细胞和巨噬细胞和离心涂片于玻璃片上的PBL于4℃在80％的甲醇中固定10分钟，并以TUCAP-1、TUCAP-1小鼠血清或免疫前对照血清染色。以免疫前血清、抗TUCAP-1小鼠抗血清将来自Biomax阵列玻璃片(Biomax)的恶性黑素瘤和对应的正常皮肤组织进行免疫染色。另外以抗-gp100(Immunotech)将黑素瘤染色，以抗-ezrin(Sigma)将正常皮肤染色。使用过氧化物酶抗过氧化物酶方法通过单染(Dako)和Mayer苏木精复染来显示蛋白。

图4A-C显示：MM2细胞系(A)、外周血淋巴细胞(B)和体外分化的巨噬细胞(C)对于小鼠免疫前血清是阴性的。与PCR结果一致，恶性黑素瘤培养的细胞显示出对于TUCAP-1的清晰的阳性染色(图4D)而PBL(图4E)和巨噬细胞(图4F)对于TUCAP1染色是阴性的。恶性黑素瘤组织相对于健康皮肤的免疫组织化学分析表明：仅在黑素瘤组织中可以检测到TUCAP-1(图H)，在健康皮肤中检测不到(图4K)。作为黑素瘤和正常组织的阳性对照标志物，分别使用了GP100(图4I)和ezrin(图4L)。在两种组织中免疫前小鼠血清染色一直是阴性的(图4G、4J)。这些结果提供了清晰的证据证明了仅在黑素瘤细胞中可以检测到TUCAP-1，因此，其支持实施例1的结果。

实施例3

TUCAP-1的亚细胞定位

进行了进一步的实验以分析TUCAP 1的细胞内定位

细胞区室分离.按照Qproteome细胞膜试剂盒程序(Quiagen)收集并处理细胞以获得细胞区室的非变性组分，其对应于纯化的细胞膜和细胞质。然后以丙酮沉淀后一个组分并重悬于免疫沉淀缓冲液B中(0.1％SDS、1％NP40、0.5％胆酸钠)，以进行以兔子抗TUCAP-1的免疫沉淀。通过离心将来自细胞区室组分的残余沉淀(其含有完整细胞和细胞器)中的完整细胞除掉，并进行Triton X-100提取以获得可溶性和不可溶性组分，对这些组分以兔子抗TUCAP-1进行免疫沉淀。在进行样品的电泳之后，以小鼠抗-TUCAP-1在硝酸纤维素膜上进行印迹反应。

免疫荧光分析.将MM2细胞培植于置于60-mm皮氏培养皿中的盖玻片上。将细胞固定于2％的多聚甲醛并渗透(Triton X-100(0.1％))24个小时。为了进行TUCAP 1和Rab5双染色，分别以小鼠抗TUCAP-1血清和兔子抗-Rab5(SantaCruz)标记细胞，并以Alexa Fluor 488-偶联的抗小鼠IgG和Alexa Fluor 594-偶联的抗兔子IgG(Molecular Probes)显示。为了进行TUCAP-1和Lamp-1检测，分别以兔子抗TUCAP-1多抗和小鼠抗Lamp-1单抗(BD Pharmingen)标记细胞，以Alexa Fluor 594-偶联的抗兔子IgG和Alexa Fluor 488-偶联的抗小鼠IgG染色。TUCAP-1和线粒体的检测这样进行：以抗TUCAP-1小鼠多抗将TUCAP-1染色并以Alexa Fluor 488偶联的抗小鼠IgG进行标记；以Mithotracker Red(Invitrogen)标记线粒体。洗涤之后，以甘油∶PBS(2∶1)将所有的样品封片并以Leica DM 2500荧光显微镜观察。以配备有IAS 8.2图像分析系统的(Delta Sistemi)的Spot Insight数码相机(Delta Sistemi)记录图像。

以抗TUCAP-1抗体将MM2的全细胞裂解物进行免疫沉淀，分离各个亚细胞组分并通过Western印迹进行分析。结果显示：TUCAP-1的回收主要发生在富含细胞器的组分中，而在细胞质和细胞膜组分中检测不到(图5A)。为了鉴定TUCAP-1的亚细胞定位，将MM2细胞进行TUCAP-1和早期内涵体标志物Rab5的双染色，或者TUCAP-1和晚期内涵体和溶酶体成分Lamp-1的双染色，或者TUCAP-1和线粒体标志物Mitotracker^TM的双染色。荧光显微镜分析显示：TUCAP-1与Rab5(图5B)和EEA-1(图6和图7B)均发生共定位，而TUCAP-1不与Lamp-1(图5C)、Mitotracker^TM(图5D)或Hoechst染色的细胞核发生共定位。

此外，图7显示了与活的淋巴细胞共培养的相同细胞中进行的双染色荧光。仅在黑素瘤细胞的表面能够检测到TUCAP-1，而淋巴细胞完全是非染色状态(图7A)。同样，TUCAP-1与初级内涵体标志物EEA-1共定位(图7B)，这确认了该蛋白在早期内涵体中的表达。

实施例4

TUCAP-1的功能分析

Tucap-1沉默抑制吞噬行为

通过Tucap-1沉默来抑制TUCAP-1蛋白的表达，从而评价TUCAP-1蛋白在人类转移性黑素瘤细胞中的作用。

根据生产商的指示，使用下列StealthR RNAi双链(Invitrogen)进行tucap-1沉默并退火：

gagugacguccagauccacugguuu(SEQ ID NO：13)，和

aaaccaguggaucuggacgucacuc(SEQ ID NO：14)。作为阴性对照，使用Stealth RNAi Negative control medium GC duplexes(Invitrogen)。根据生产商的指示，使用Lipofectamine RNAiMAX试剂(Invitrogen转染黑素瘤细胞。简而言之，在转染的前一天，将黑素瘤细胞培植于6孔板(1X10⁵/孔)，24小时后，以30pmol siRNA/孔转染细胞。转染后48小时，通过FACS分析细胞中TUCAP-1的表达。

以针对Tucap-1的小干扰RNA(Tucap-1siRNA)或以不相关的siRNA寡聚体(SC-siRNA)转染3种不同的吞噬性的转移细胞系。图8显示了转染48小时后，在未经转染的MM2细胞和经过打乱的siRNA或TUCAP-1siRNA转染的MM2细胞中对于TUCAP-1表达的FACS分析。在打乱的和TUCAP-1沉默的MM3细胞中获得了相似的结果(未显示)。这确认了TUCAP-1的有效敲低。

为了评价这些细胞的吞噬活性，我们首先测定了未经转染的、经过SC-siRNA转染的或Tucap-1沉默的黑素瘤细胞系摄取染色的酵母细胞或活的淋巴细胞的能力。转染后48小时，在37℃将FITC染色的酿酒酵母FITC(1∶60)或10μMol二氢罗丹明123(DHR123)(Molecular Probes)染色的活的淋巴细胞(1∶10)与SC-siRNA或TUCAP-1siRNA转染的MM2和MM3黑素瘤细胞一起孵育。4小时后，以PBS洗掉多余的淋巴细胞或酵母细胞并加入含有胰蛋白酶(1.5g/L)、EDTA(0.44g/L)的PBS溶液，以此测定吞噬/同类相食。洗涤之后，收集黑素瘤细胞并通过配备了488-nm氩激光的细胞计数器进行分析。获取至少10,000个事件并使用CellQuest软件(Becton Dickinson)通过Macintosh计算机进行分析。显示绿色荧光的黑素瘤细胞被认为是吞噬/同类相食的。结果显示：TUCAP-1敲低显著抑制黑素瘤细胞的吞噬和同类相食活性(图9A、9B、表1)，这证明TUCAP-1在转移性的人类黑素瘤的同类相食行为中发挥重要作用，因此该蛋白可用作恶性的标志物。

表2.TUCAP-1在吞噬/同类相食中的作用

打乱的siRNA(SC-siRNA)转染的和Tucap-1沉默的(Tucap-1siRNA)MM2和MM3转移性的黑素瘤细胞对于FITC染色的酵母和DHR123染色的活的淋巴细胞的吞噬/同类相食活性。吞噬活性表达为吞噬细胞的百分数。数字为5次不同实验的平均值±s.d.。

实施例5

TUCAP-1在调节内涵体小泡的酸性中发挥作用

在37℃使用1μM LysoTracker探针(Molecular Probes)将打乱的siRNA转染的和TUCAP-1沉默的MM2和MM3细胞染色30分钟并立即通过细胞计数器分析。使用荧光强度柱状图的中位数通过CellQuest软件进行不同黑素瘤细胞系之间的比较。

基于“TUCAP-1定位于具有Rab5的内涵体”的结果(见实施例3)，我们测试了“TUCAP-1蛋白在调节恶性肿瘤细胞的吞噬/内涵体区室的pH中发挥作用”的假设。为了验证该假设，以向酸性探针LysoTracker绿将对照SC-RNAi和TUCAP-1-siRNA转染的细胞染色，并通过流式细胞术分析。相对于SC-RNA转染的对照细胞，Tucap-1基因的沉默诱导黑素瘤细胞中较少的酸性小泡的出现(图9C)。这些实验支持“TUCAP-1在调节内部小泡例如早期内涵体的酸性中发挥作用”的假设。

实施例6

TUCAP-1参与早期转移过程

基于使用TUCAP-1过表达细胞的正在进行的实验表明：该蛋白在转移过程的早期参与肿瘤细胞侵袭。通过使用Matrige侵袭室(Becton-Dickenson，Bedford，MA，USA)分析了这些细胞的细胞侵袭能力。简而言之，将未经转染的WM743或GFP标记的全长TUCAP-1WM743黑素瘤细胞(TWM)重悬于无血清培养基中并装入顶室，将底室置于培养基中，培养基中添加10％FCS作为化学吸引剂。在37℃在潮湿的空气中孵育细胞并允许其通过趋化室迁移48小时。孵育之后，使用棉花载体将保持在上部表面的细胞完全除掉。使用结晶紫将位于趋化室底部的迁移的细胞染色。通过显微镜(40x)在4个不同的视野/滤光器中对侵袭细胞进行计数。图10显示了跨孔膜的较低侧，其清晰地表明：对于TWM而言侵袭细胞的数目显著较高，对于未经转染的是平均为25个细胞；对于TUCAP 1转染的TWM细胞是平均为132个细胞。

实施例7

TUCAP-1参与黑素瘤细胞对顺铂的抗性

几篇发表的文章显示了蛋白在离子运送中的作用和内涵体区室在药物捕获、灭活和挤出(作为药物抗性)中的作用。早期内涵体中的TUCAP 1的表达及其参与内涵体小泡中的pH调节(如以上实施例所示)指引我们假设该蛋白在癌细胞对于药物的抗性中发挥作用。为了证明此假设，以打乱的(SC-siRNA)或Tucap-1si-RNA将高度表达TUCAP-1的MM2黑素瘤细胞预处理48小时(如以上实施例所示)，转染后，以2μM顺铂处理细胞。在顺铂诱导后48小时，通过FACS分析早期(annexin-V单一阳性)和晚期(PI/Annexin V双阳性)细胞凋亡来评价细胞毒性。相对于作为未经转染的对照细胞的打乱的siRNA处理的WM743细胞，Tucap-1沉默使顺铂的细胞毒性效应显著升高。在对照转染的细胞中平均有63％的活细胞；在TUCAP-1沉默的细胞中平均有37％的活细胞。

这套实验证明了TUCAP-1参与过表达TUCAP-1的细胞的药物抗性，tucap-1沉默是抑制肿瘤细胞吞噬特性的理想方法。

基于以上实施例中显示的结果，本公开还提供了高度敏感的和特异性的用于检测黑素瘤和几种其它的具有所描述的吞噬行为特征的肿瘤(即，乳腺癌、肺癌、膀胱癌、成神经管细胞瘤和胃腺癌)的方法。此外，通过显示TUCAP-1专有性地在恶性肿瘤中表达，本公开提供了区分恶性和良性癌症病灶的方法。检测癌症的方法包括评价来自推定癌症病灶的生物学样品，通常通过原位杂交、rt-PC或免疫酶学方法进行。

实施例8

TUCAP-1的多克隆和单克隆抗体

基于以上实施例，特异性针对TUCAP-1的多克隆(pAb)和单克隆抗体(mAb)对于各种目的将是有用的，包括例如用于确定肿瘤的恶性的诊断，和癌症的治疗。

为了产生多克隆抗体，将来自MM1细胞的cDNA克隆进入细菌表达载体以获得与6-组氨酸N末端标签融合的TUCAP-1氨基酸18-282(SEQ IDNO：11)。使用纯化的重组肽在小鼠中产生抗-TUCAP-1抗体。抗-TUCAP-1抗体识别免疫原、作为阳性对照的GFP-标记的全长蛋白，以及内源性TUCAP-1蛋白。

还通过使用具有根据SEQ ID NO：12的氨基酸序列的纯化的肽片段免疫兔子、山羊和驴产生了多克隆抗体。所产生的抗体能够通过结合至由SEQ IDNO：1的氨基酸221-235组成的肽片段而识别人类TUCAP-1蛋白。还通过免疫山羊和驴获得了多克隆抗体。

为了产生单克隆抗体，使用具有根据SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的氨基酸序列或其片段的肽片段免疫小鼠。或者，使用具有根据SEQ IDNO：15的氨基酸序列的肽片段免疫小鼠。通过使用选择的小鼠的脾细胞产生选择的杂交瘤克隆。简而言之，使来自免疫小鼠的脾脏的B细胞与专门选择用于产生杂交瘤的骨髓瘤肿瘤细胞系融合。所产生的融合(杂合)细胞能够在培养中无限生长并随之产生大量的需要的抗体。根据标准程序进行杂交瘤生产。筛选所选择的杂交瘤之后，将杂交瘤克隆并使其大规模生长以产生抗体。对于不同的用途选择不同的阳性杂交瘤，例如：a)实验室实验用途(Western印迹、免疫沉淀、FACS分析、免疫荧光和免疫组化和免疫细胞化学分析人类组织和培养的细胞)；b)临床前和临床研究；c)肿瘤诊断和预后工具，例如检测试剂盒。所产生的单克隆抗体与SEQ ID NO：1的TUCAP-1蛋白氨基酸18-282的构象型或线性表位结合，或者与由SEQ IDNO：1的氨基酸221-235组成或由SEQ ID NO：1的氨基酸303-352组成的肽片段结合。抗体还与小鼠、大鼠、猫、狗和绵羊来源的TUCAP-1蛋白结合。

以上实施例详细公开了本发明的特定实施方式。但是，这是通过举例的方式进行的并且仅仅是为了解释的目的。实施例不是为了限制随附的权利要求的范围，随附的权利要求确定本发明。

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Claims

1.SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列在制备转移性黑素瘤诊断试剂中的用途。

2.选自SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：15的氨基酸序列在制备转移性黑素瘤诊断试剂中的用途。

3.SEQ ID NO：1的表达抑制剂在制备用于抑制黑素瘤细胞的吞噬特性的药物中的用途。

4.权利要求3的用途，其中通过使SEQ ID NO：2基因的表达沉默来抑制所述表达。

5.权利要求3的用途，其中所述表达通过分离的核酸序列抑制，所述分离的核酸序列与SEQ ID NO：2或其部分互补，或与SEQ ID NO：2mRNA或SEQ ID NO：2特异性调控因子互补。