CN118091148A - 抗grid2抗体作为副肿瘤综合征的生物标志物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了抗GRID2抗体作为副肿瘤综合征的生物标志物的应用。本发明基于细胞的检测(Cell‑based assay，CBA)方法检出脑脊液抗GRID2抗体是伴神经母细胞瘤的副肿瘤性神经系统综合征的特异性生物标志物；可以使用GRID2蛋白检进行检测脑脊液抗GRID2抗体，具体为通过对蛋白与抗体的相互作用进行检测，从而诊断抗GIRD2抗体相关副肿瘤性神经系统综合征；以此生物标志物为依据进行检测，可以得到准确的临床检测结果；从而对患者进行准确的诊断和治疗；从而挽救患者的生命、改善患者的生存质量。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及抗GRID2抗体作为副肿瘤综合征的生物标志物的应用。
背景技术
副肿瘤性神经系统综合征并非恶性肿瘤直接侵犯神经系统所引起，而是恶性肿瘤产生远隔效应，通过免疫机制引起神经系统功能障碍的疾病。此类疾病的确诊依赖肿瘤的诊断与相关生物标志物，也就是肿瘤神经抗体的检测。
GRID2是一种细胞表面蛋白，具有一定的立体构象。在人体环境中，致病性抗体与具有立体构象的GRID2蛋白结合，从而致病。通过现有的酶联免疫吸附试验(ELISA)法和蛋白免疫印迹(WB)法检测抗GRID2抗体时，抗原底物为线性氨基酸序列，不具有立体构象。而CBA法能够检测出与存在立体构象的抗原结合的抗体，因此能够更加准确地检出人体环境中与真实蛋白结合的抗体。目前尚未评估通过CBA法检测脑脊液GRID2抗体，作为诊断副肿瘤性神经系统综合征的诊断性生物标志物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过CBA法检测的神经系统副肿瘤综合征的生物标志物抗GRID2抗体及其应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明第一方面，提供检测抗GRID2抗体的试剂在制备诊断副肿瘤性神经系统综合征的产品中的应用。
本发明可以通过检测抗GRID2抗体区分神经系统副肿瘤综合征相关的神经症状是否是神经系统副肿瘤性综合征产生的，还可以用来区分肿瘤患者是否伴有副肿瘤性神经系统综合征。
优选地，所述肿瘤为神经母细胞瘤。
优选地，所述检测抗GRID2抗体的试剂包括通过CBA、免疫印迹、膜条法、ELISA、化学发光、放射免疫法、液相芯片法、侧向层析、电化学、流式细胞中的至少一种方法检测抗GRID2抗体的试剂。
优选地，所述试剂包括GRID2蛋白，或能够表达所述GRID2蛋白的载体或细胞，或含所述GRID2蛋白的组织。
优选地，所述GRID2蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，或对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行修饰后的序列。
优选地，所述修饰包括磷酸化修饰、糖基化修饰、乙酰化修饰或泛素化修饰。
优选地，所述产品还包括洗涤液、封闭液、通透液、固定液、阳性对照、阴性对照、二抗中的至少一种。
优选地，所述阳性对照为抗GRID2蛋白抗体。
优选地，所述阴性对照为抗GRID2蛋白抗体阴性样本。
上述固定液、通透液、洗涤液、封闭液等可以替换为本领域常用的其他试剂，本发明并不对此进行特殊限定。
优选地，所述产品包括试剂、试剂盒、试纸、芯片中的至少一种。
优选地，所述检测的样本包括脑脊液、血液或血清。
本发明的第二方面，提供一种检测产品，所述产品包括检测抗GRID2抗体的试剂。
优选地，所述检测抗GRID2抗体的试剂包括通过CBA、免疫印迹、膜条法、ELISA、化学发光、放射免疫法、液相芯片法、侧向层析、电化学、流式细胞中的至少一种方法检测抗GRID2抗体的试剂。
优选地，所述试剂包括GRID2蛋白，或能够表达所述GRID2蛋白的载体或细胞。
优选地，所述细胞包括但不限于HEK293细胞、CHO、Cos7、Hela细胞、毕赤酵母、酿酒细胞、大肠杆菌。
优选地，所述GRID2蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，或对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行修饰后的序列。
优选地，所述修饰包括磷酸化修饰、糖基化修饰、乙酰化修饰或泛素化修饰。
优选地，所述产品还包括洗涤液、封闭液、通透液、固定液、阳性对照、阴性对照、二抗、封闭剂中的至少一种。
优选地，所述洗涤液包括PBS。
优选地，所述阳性对照为抗GRID2抗体。
优选地，所述固定液为多聚甲醛溶液。
优选地，所述通透液为0.1～2％triton x-100溶液。
优选地，所述封闭液包含0.01～0.5％叠氮钠、0.2～5％胎牛血清、0.1～2％triton x-100。
优选地，所述产品中还包含检测副肿瘤综合征临床症状的物质；可以通过临床症状结合抗GRID2抗体的表达情况判断副肿瘤综合征临床症状是否是由相关肿瘤引起的。
优选地，所述产品包括试剂、试剂盒、试纸、芯片中的至少一种。
本发明的第三方面，提供一种非诊断目的的检测抗GRID2抗体的方法，包括以下步骤：
S1：构建表达GRID2蛋白的细胞，固定、通透、封闭，得细胞爬片；
S2：将步骤S1的细胞爬片与样本混合孵育后加入二抗，荧光显微镜观察。
优选地，所述表达GRID2蛋白的细胞的构建方法为：将细胞接种至培养系统中，当细胞达到40％-70％的转染密度时，将表达GRID2的质粒转染细胞。
优选地，所述细胞包括但不限于HEK293细胞、CHO、Cos7、Hela细胞、毕赤酵母、酿酒细胞、大肠杆菌。
优选地，所述检测的样本包括脑脊液、血液或血清。
本发明的有益效果是：
本发明基于细胞的检测(Cell-based assay，CBA)方法检出脑脊液抗GRID2抗体是伴神经母细胞瘤的副肿瘤性神经系统综合征的特异性生物标志物；可以使用GRID2蛋白检进行检测，具体为通过对蛋白与抗体的相互作用进行检测，从而诊断抗GIRD2抗体相关副肿瘤性神经系统综合征；以此生物标志物为依据进行检测，可以得到准确的临床检测结果；从而对患者进行准确的诊断和治疗；从而挽救患者的生命、改善患者的生存质量。
附图说明
图1为患者1和患者2脑脊液的CBA检测结果。
图2为患者1脑脊液对小鼠小脑组织切片进行免疫荧光染色结果。
图3为患者1与没有产生副肿瘤神经系统综合征症状的神经母细胞瘤患者的组织切片进行免疫荧光染色的结果。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例使用了基于细胞的检测方法(Cell-based assay,CBA)，对需要的测试对象进行了测试，检测方法具体包括：
将HEK293T细胞系在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中分别培养；按每孔一片，将使用多聚赖氨酸处理的细胞爬片预先铺在标准24孔细胞培养板中；将293T细胞系使用胰酶消化并细胞计数；按每孔10万种入铺有细胞爬片的标准24孔细胞培养板的每孔之中；细胞系达到60％汇合度时，使用商业化的转染试剂LipofectamineTM3000将表达人源的GRID2蛋白转染入细胞。
使用Opti-MEMTM培养基稀释LipofectamineTM 3000:按24孔板每孔使用剂量，在2个EP管中分别加入0.75μl和1.75μl的LipofectamineTM 3000，使用25μl Opti-MEMTM培养基稀释，充分混匀。使用Opti-MEMTM培养基稀释DNA:按24孔板每孔使用剂量，在EP管中加入1μg表达GIRD2的质粒，加入50μl Opti-MEMTM培养基，2μl P3000TM，充分混匀。在已经稀释的两管LipofectamineTM 3000中加入稀释的DNA(1:1)，室温孵育10-15分钟。将DNA-脂质体复合物滴加到24孔板中并混匀。继续细胞培养1-2天，至汇合度增加至95％。
取出24孔板，吸去培养基，每孔使用PBS清洗3遍。在室温环境下，用固定液固定5分钟，吸去溶液并使用PBS清洗3遍。每孔使用通透液通透30分钟。吸去溶液并使用PBS清洗3遍。使用封闭液封闭30分钟，转入4℃储存。
固定液为多聚甲醛-PBS溶液；通透液为0.2％ Triton X-100溶液的PBS；洗涤液为PBS；封闭液为0.04％叠氮钠、2％胎牛血清、0.2％ Triton X-100的PBS溶液。
其中人源的GRID2蛋白序列为：
MEVFPFLLVLSVWWSRTWDSANADSIIHIGAIFDESAKKDDEVFRTAVGDLNQNEEILQTEKITFSVTFVDGNNPFQAVQEACELMNQGILALVSSIGCTSAGSLQSLADAMHIPHLFIQRSTAGTPRSGCGLTRSNRNDDYTLSVRPPVYLHDVILRVVTEYAWQKFIIFYDSEYDIRGIQEFLDKVSQQGMDVALQKVENNINKMITTLFDTMRIEELNRYRDTLRRAILVMNPATAKSFITEVVETNLVAFDCHWIIINEEINDVDVQELVRRSIGRLTIIRQTFPVPQNISQRCFRGNHRISSTLCDPKDPFAQNMEISNLYIYDTVLLLANAFHKKLEDRKWHSMASLSCIRKNSKPWQGGRSMLETIKKGGVSGLTGELEFGENGGNPNVHFEILGTNYGEELGRGVRKLGCWNPVTGLNGSLTDKKLENNMRGVVLRVVTVLEEPFVMVSENVLGKPKKYQGFSIDVLDALSNYLGFNYEIYVAPDHKYGSPQEDGTWNGLVGELVFKRADIGISALTITPDRENVVDFTTRYMDYSVGVLLRRAEKTVDMFACLAPFDLSLWACIAGTVLLVGLLVYLLNWLNPPRLQMGSMTSTTLYNSMWFVYGSFVQQGGEVPYTTLATRMMMGAWWLFALIVISSYTANLAAFLTITRIESSIQSLQDLSKQTEIPYGTVLDSAVYEHVRMKGLNPFERDSMYSQMWRMINRSNGSENNVLESQAGIQKVKYGNYAFVWDAAVLEYVAINDPDCSFYTIGNTVADRGYGIALQHGSPYRDVFSQRILELQQNGDMDILKHKWWPKNGQCDLYSSVDTKQKGGALDIKSFAGVFCILAAGIVLSCFIAMLETWWNKRKGSRVPSKEDDKEIDLEHLHRRVNSLCTDDDSPHKQFSTSSIDLTPLDIDTLPTRQALEQISDFRNTHITTTTFIPEQIQTLSRTLSAKAASGFTFGNVPEHRTGPFRHRAPNGGFFRSPIKTMSSIPYQPTPTLGLNLGNDPDRGTSI(SEQ ID NO.1)。
使用阳性(神经母细胞瘤伴副肿瘤性神经系统综合征)和阴性患者(不伴有神经母细胞瘤的具有副肿瘤性神经系统综合征症状(小脑性共济失调患者)的脑脊液进行了上述测试，核心症状是小脑共济失调，患者信息见表1。
表1患者信息
| 病患1 | 病患2 | |
| 年龄 | 5 | 7 |
| 性别 | 女 | 女 |
| 肿瘤 | 神经母细胞瘤 | 无 |
| 临床表现 | 小脑共济失调,眼阵挛,肌阵挛 | 小脑性共济失调 |
| 脑脊液白细胞计数(×106/L) | 5 | 5 |
| CSF特异性寡克隆区带 | 阳性 | 阳性 |
| 磁共振成像 | 正常 | 正常 |
通过双标CBA实验。即红色信号为使用商业化抗GRID2抗体(1:500,ab198499,Abcam)配合商业化的二抗(711-605-152,Jackson ImmunoResearch；109-165-064,JacksonImmunoResearch)对转染细胞进行染色。取出制备好的24孔板，吸去封闭液。每孔为一个检测单元。在每个单元内加入病人脑脊液至液面覆盖玻片。常温孵育1小时。吸去液体，使用PBS清洗3遍。加入封闭液1:500稀释的商业化抗GRID2抗体(1:500,ab198499,Abcam)200μl，常温孵育1小时。吸去液体，使用PBS洗3遍。加入封闭液体1:500稀释的商业化二抗(即711-605-152,Jackson ImmunoResearch与109-165-064,Jackson ImmunoResearch)200μl，常温避光孵育1小时。PBS清洗5遍。将盖玻片取出，倒置在滴加了封片剂FluoroshieldTMcontaining DAPI(F6057-20ML,Sigma-Aldrich)的载玻片上完成封片。使用荧光显微镜或共聚焦显微镜(图1使用共聚焦拍摄TCS-SP8，Leica)进行拍摄。647通道标记为红色信号，对应二抗711-605-152,Jackson ImmunoResearch与商业化GRID2一抗信号。Cy3通道标记为绿色信号，对应二抗109-165-064,Jackson ImmunoResearch与病人脑脊液中的自免疫抗体信号。
被红色信号标记的细胞是确定表达GRID2的细胞。绿色信号是使用患者的生物样本，此处即为脑脊液，配合商业化二抗对转染细胞进行染色的结果。若存在被绿色细胞标记，即生物样本(此处为患者脑脊液)中存在与阳性细胞反应的抗体。红色和绿色信号重合说明患者脑脊液中的抗体即为抗GRID2抗体。
结果显示神经母细胞瘤患者1的脑脊液中存在特异性的生物标志物：抗GRID2抗体；患者2中不存在抗GRID2抗体(图1)。
其中患者1患有神经母细胞瘤，即患者1可能是由副肿瘤性神经系统综合征产生的神经症状。
实施例2
使用患者1的脑脊液对小鼠小脑组织切片进行免疫荧光染色。小鼠取材自C57BL/6J野生型小鼠脑组织。对小鼠麻醉后使用冰PBS与冰PBS溶解的4％ PFA进行心脏灌注。灌注充分后解剖取小鼠小脑组织。使用振动切片机切片至100μm厚度。切片被收集至封闭液中浸泡一小时。将处理好的切片转移至24孔板中进行染色，每个每孔为一个检测单元。在每个单元内加入病人脑脊液至液面覆盖切片组织。常温孵育1小时。吸去液体，使用PBS清洗3遍。加入封闭液1:500稀释的商业化抗GRID2抗体(1:500,ab198499,Abcam)200μl，常温孵育1小时。吸去液体，使用PBS洗3遍。加入封闭液体1:500稀释的商业化二抗(即711-605-152,Jackson ImmunoResearch与109-165-064,Jackson ImmunoResearch)200μl，常温避光孵育1小时。PBS清洗5遍。将染色完成的切片捞出铺平在载玻片上，使用FluoroshieldTMcontaining DAPI(F6057-20ML,Sigma-Aldrich)进行作为封片剂进行封片。使用共聚焦显微镜拍摄(TCS-SP8，Leica)。647通道标记为红色信号，对应二抗711-605-152,JacksonImmunoResearch与商业化GRID2一抗信号。Cy3通道标记为绿色信号，对应二抗109-165-064,Jackson ImmunoResearch与病人脑脊液中的自免疫抗体信号。结果如图2。患者1的脑脊液对小鼠小脑切片进行免疫荧光染色，小脑浦肯野细胞(白色圈出)及分子层患者1脑脊液免疫荧光呈阳性(绿色信号)，与GRID2商业化抗体染色信号对应(红色信号)，这说明了CBA检测方法的准确性，也说明了患者1脑脊液中存在抗神经元的相关抗体。
实施例3
1、使用患者1的神经母细胞瘤病理样本进行免疫荧光染色。同时使用一例没有产生神经症状的神经母细胞瘤病理样本进行免疫荧光染色。临床手术中对神经母细胞瘤进行了切除，患者1存在神经性症状(即副肿瘤综合征)，对照患者同样患神经母细胞瘤，但是并未存在神经症状。取两位患者的肿瘤病理切片(石蜡切片)，进行脱蜡、复水处理。处理好的切片，进行免疫荧光染色。使用保湿盒，对病理组织进行染色。在载玻片对应的病理组织上加入病人脑脊液至液面覆盖切片组织，并使用封口膜覆盖以防止蒸发。常温孵育1小时。吸去液体，使用PBS清洗3遍。加入封闭液1:500稀释的商业化抗GRID2抗体(1:500,ab198499,Abcam)至覆盖组织，使用封口膜覆盖并常温孵育1小时。吸去液体，使用PBS洗3遍。加入封闭液体1:500稀释的商业化二抗(即711-605-152,Jackson ImmunoResearch与109-165-064,Jackson ImmunoResearch)至覆盖组织，使用封口膜覆盖常温避光孵育1小时。PBS清洗5遍。使用FluoroshieldTM containing DAPI(F6057-20ML,Sigma-Aldrich)进行作为封片剂进行封片。使用共聚焦显微镜拍摄(TCS-SP8，Leica)。647通道标记为红色信号，对应二抗711-605-152,Jackson ImmunoResearch与商业化GRID2一抗信号。Cy3通道标记为绿色信号，对应二抗109-165-064,Jackson ImmunoResearch与病人脑脊液中的自免疫抗体信号。
结果如图3，图3中，患者1肿瘤中高表达了GRID2蛋白(红色信号在患者1中高表达，但对照中无信号)。患者1的脑脊液对且仅对患者1的神经母细胞瘤产生了阳性反应，且信号与抗GRID2商业化抗体重合。进一步确认患者1存在抗GRID2抗体，也说进一步明神经母细胞瘤是导致神经相关症状出现的病因。
2、进一步使用50例阴性对照(包括自身免疫性脑炎和小脑性共济失调)验证，结果显示50例阴性对照(的检测结果均为抗GRID2抗体阴性。
综上说明，抗GRID2抗体为神经母细胞瘤伴副肿瘤性神经系统综合征的特异性标志物，可以用来区分副肿瘤性神经系统综合征相关的神经症状是否是神经母细胞瘤伴副肿瘤性神经系统综合征产生的，还可以用来区分肿瘤患者是否伴有副肿瘤性神经系统综合征。
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (10)
1.检测抗GRID2抗体的试剂在制备诊断副肿瘤性神经系统综合征的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为神经母细胞瘤。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测抗GRID2抗体的试剂包括通过CBA、免疫印迹、膜条法、ELISA、化学发光、放射免疫法、液相芯片法、侧向层析、电化学、流式细胞中的至少一种方法检测抗GRID2抗体的试剂。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括GRID2蛋白，或能够表达所述GRID2蛋白的载体或细胞。
5.根据权利要求1～4任一项所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂、试剂盒、试纸、芯片中的至少一种。
6.根据权利要求1～4任一项所述的应用，其特征在于，所述检测的样本包括脑脊液、血液或血清。
7.一种检测产品，所述产品包括检测抗GRID2抗体的试剂。
8.根据权利要求7所述的检测产品，其特征在于，所述试剂包括GRID2蛋白，或能够表达所述GRID2蛋白的载体或细胞。
9.根据权利要求8所述的检测产品，其特征在于，所述产品还包括洗涤液、封闭液、通透液、固定液、阳性对照、阴性对照、二抗、封片剂中的至少一种。
10.一种非诊断目的的检测抗GRID2抗体的方法，包括以下步骤：
S1：构建表达GRID2蛋白的细胞，固定、通透、封闭，得细胞爬片；
S2：将步骤S1的细胞爬片与样本混合孵育后加入二抗，荧光显微镜观察。
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