CN113092764A - Tm9sf4作为生物标记物用于肿瘤相关的外泌体的用途 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了TM9SF4作为生物标记物用于肿瘤相关的外泌体的用途。本发明涉及用于确定受试者中肿瘤转化状况或肿瘤的存在的细胞外微泡生物标记物，以及涉及这种生物标记物的用途和涉及使用这种生物标记物的诊断方法。特别地，本发明的方法和用途包括分离TM9SF4‑阳性细胞外小泡以及检测优先选自由CD9蛋白、miR‑21和RNU6组成的组中的第二生物标记物的表达。

Description

TM9SF4作为生物标记物用于肿瘤相关的外泌体的用途
本申请是申请日为2015年6月5日的题为“TM9SF4作为生物标记物用于肿瘤相关的外泌体的用途”的中国专利申请No.201580042674.0的分案申请。
技术领域
外泌体生物标记物
本发明涉及用于确定受试者中肿瘤转化(tumor transformation)状况或肿瘤的存在的细胞外微泡(extracellular microvesicle)生物标记物，以及涉及这种生物标记物的用途和使用这种生物标记物的诊断方法。
背景技术
与恶性(或癌性)肿瘤相反，良性肿瘤一般是缺少侵入邻近组织的能力或者缺乏转移的细胞团。另外，良性肿瘤通常具有比恶性肿瘤更慢的生长速率，且肿瘤细胞经常是分化更多的。
尽管大部分的良性肿瘤并不会危及生命，但是许多类型的良性肿瘤具有通过称为肿瘤转化的过程变为癌性(恶性)的潜能。
未转移的癌症(初始的或复发的)是没有从身体内的初始部位(其开始的地方)扩散至身体的其他地方的癌症。
转移的癌症是已经从其开始的身体的部分(初始部位)扩散至身体的其他部分的癌症。
往往可以将良性神经纤维瘤的发展与施旺细胞系(Schwann cell lineage)的细胞中的NF1肿瘤抑制基因的突变联系起来1-3。这些肿瘤可以频繁经历进一步的转化，成为恶性末梢神经片瘤(MPNST)1-3。目前不清楚何种细胞类型特别易受MPNST形成(这是导致从神经纤维瘤发展为MPNST的分子改变)的影响，或者何种肿瘤环境中的其他因素可能促进肿瘤形成。另外，在NF1群体中看到频率升高的神经胶质瘤、特别是视神经的纤维性星形细胞瘤和白血病3。
MPNST具有非常不良的预后，因为它们对标准的化学或放射疗法没有响应并具有高转移倾向4-7。NF1患者及其家人很清楚这些事实，这是MPNST的发展为何是患有该疾病的患者最担心的并发症的原因8。然而，早期检测往往受限于这样的事实，即MPNST通常在之前已经存在的大神经纤维瘤内发展，使得即使用MRI也难以检测和区分新的生长或进展。相对于MPNST的偶然发生的对应物，这种诊断延迟可能是NF1中的MPNST的不良结果的原因。这构成了识别可以以非侵入方式检测并指示NF1患者中的MPNST起始和进展的分子变更的主要推动力，该识别将在筛查和早期诊断以及监测潜伏期和临床环境中的疾病或治疗结果是有用的。
通常认为存在多种神经纤维瘤亚型，它们在其位置和生长模式、它们与NF1的关联以及它们的恶性转化的潜能方面不同。许多临床和基础科学研究员将神经纤维瘤宽泛地分为皮肤或丛状变体1(plexiform variant)。丛状神经纤维瘤是几乎唯一出现在NF1患者中的神经纤维瘤变体并且被认为是先天的；它们通过它们的特征性丛状生长模式而不同于局部化的神经内神经纤维瘤。丛状神经纤维瘤具有恶性转化为MPNST的最高风险1。
与神经纤维瘤转化为MPNST类似，其他良性肿瘤具有转化为它们的恶性对应物的风险。例如，这种情况是：良性前列腺肥大(BPH)转化为前列腺癌、结肠息肉转化为结直肠癌(colorectal cancer)、良性的痣转化为黑色素瘤、非癌性乳房病症转化为乳腺癌(breastcancer)、肺结核转化为肺癌、初期星形细胞瘤转化为胶质母细胞瘤，以及良性卵巢肿瘤转化为卵巢癌。这些癌症中的大部分也能够转移。
细胞外小泡(细胞外囊泡，extracellular vesicle)(EV)是由多种细胞类型分泌的一类膜结合细胞器9。EV非限制性地包括(i)外泌体(外含小体，外来体，exosome)：30-100nm直径的内吞来源的膜状小泡，(ii)核外颗粒体(也称为脱落微泡，SMV)：直接从质膜(PM)脱落的大的膜状小泡(50-1000nm直径)和(iii)凋亡体(50-5000nm直径)：由死亡细胞释放。
外泌体(exosome)是以微调和功能有关方式由实际上所有的细胞类型产生和释放的天然的细胞外脂质纳米小泡，使得蛋白和mRNA组合物影响母细胞的类型和病症10-14。这些小泡具有固有的稳定性和跨越生物障碍的能力，使得在容易接触的生物流体，如血液中可以发现来自不同组织的外泌体15-17。考虑到它们的生物作用和特性，认为外泌体是细胞和组织动态平衡以及新陈代谢的变更的早期信息标记，并且外泌体是用于识别新型疾病有关的生物标记物以及显示液体活检范例中的已知的组织标记物的有吸引力的来源。这是在，例如癌症的复杂疾病的诊断中使用外泌体靶向测定的主要前提和希望。主要的挑战在于在特定的病症中外泌体相关的标记物(蛋白质和RNA两者)与特定组织的关联18-21，以及可靠的、可承受的、非侵入的外泌体靶向溶液的优化，和在临床研究及实践中可以实际进行的测试的优化。
目前对于能够确定肿瘤的存在(良性、恶性和转移的)或肿瘤的转化状况(良性至恶性和未转移的至转移的)的细胞外小泡生物标记物存在需要。
发明内容
由于，例如外泌体的细胞外小泡的微胞球体本质，可以在不裂解小泡的情况下检测存在于这些小泡中的某些生物分子，因为它们位于膜上，而其他的一些仅在裂解小泡之后可以检测，因为它们位于小泡内。
我们出乎意料地发现TM9SF4-阳性细胞外小泡(即容纳TM9SF4蛋白质的细胞外小泡)是可用于确定受试者中肿瘤的存在或肿瘤转化状态的用途非常多的工具，特别是如果使用选自表1的列表的生物标记物。
生物标记物 类型 由以下检测
CD9 蛋白 细胞外小泡膜
miR-21 miRNA 整个细胞外小泡
RNU6 snRNA 整个细胞外小泡
TM9SF4蛋白(SEQ ID NO:1)是属于跨膜-9超家族(Transmembrane-9 Superfamily，TM9SF)的近来描述的跨膜蛋白，跨膜-9超家族(TM9SF)是表征为大的亲水性N端结构域(之后是九个跨膜结构域)的限定明确的蛋白家族22。已知该蛋白在黑色素瘤和急性髓性白血病和脊髓发育不良综合征中过表达，后者是由于带有整个TM9SF4基因的染色体20片段(20q11.21)的三倍至十倍增殖23,24。在细菌的吞噬作用中和转移的黑色素瘤细胞的自食表型(同类相食表型，cannibal phenotype)中涉及TM9SF4，这是往往与不良预后有关的现象25,26。在胃癌和结肠癌中已经频繁检测到自食癌细胞27-30。
近来已经表明TM9SF4结合至在多种肿瘤中过表达的pH调节质子泵V-ATPase。该相互相用通过随之发生的pH梯度变更将质子泵异常地稳定在其活跃状态，这进而关系到耐药性和结肠癌细胞的侵入31。
CD9蛋白(SEQ ID NO:2)是跨膜4超家族的成员，跨膜4超家族也称为四跨膜蛋白家族(tetraspanin family)。四跨膜蛋白是具有与其他细胞表面蛋白形成多聚络合物的四个跨膜结构域的细胞表面糖蛋白。编码的蛋白在许多细胞过程，包括分化、粘附和信号转导中发挥作用，且该基因的表达在癌细胞运动性和转移的抑制中起重要作用。CD9蛋白发现于外泌体的表面并认为其是用于源自血浆的纳米小泡的定量分析的外泌体持家蛋白(housekeeping protein)。
MiRNA21(SEQ ID NO:3)miRNA是一类小的非编码RNA，其成熟产物约22核苷酸长。它们通过诱导翻译抑制或转录物降解负向调节基因表达32。发现miR-21在包括癌症和心血管病的许多病理学病症中上调33。miRNA的多种靶标(实际上是典型的致癌基因)或肿瘤抑制因子的鉴别已经产生被广泛接受的想法，即miRNA在癌症开始、进展和转移中起关键作用34,35。首次将miR-21记录为多种细胞系中的凋亡抑制因子36。
RNU6(SEQ ID NO:4)是在其他小核RNA(snRNA)的修饰中作用的非编码RNA(ncRNA)。微RNA(miRNA)的精确分布是用于理解这些小RNA在生理学和病理学过程中的功能意义的必要步骤。众所周知归一化(normalization)是qRT-PCR中的最关键的步骤之一，并且出于该目的，通常使用的基因(如U6和5S37)描述为在癌症中区别表达，这使得这些基因不适合作为内部对照。
因此，在本发明的第一方面，提供了用于体外确定受试者中的肿瘤的存在的方法，这种方法包括：
a)提供由该受试者获得的生物样品，
b)从所述样品中分离细胞外小泡，其中，该分离细胞外小泡的步骤包括分离TM9SF4-阳性细胞外小泡，
c)由在步骤b)中分离的细胞外小泡确定合适的生物标记物的水平或存在，以及
d)比较在步骤c)中确定的生物标记物的水平或存在与一个或多个参考值。
在一种实施方式中，怀疑受试者患有肿瘤。
在一种实施方式中，通过结合至抗-TM9SF4抗体分离TM9SF4-阳性细胞外小泡。
在另一实施方式中，细胞外小泡的至少一部分是外泌体。
在一个进一步的实施方式中，细胞外小泡是外泌体。
在一种实施方式中，肿瘤是恶性肿瘤。
在一种实施方式中，肿瘤是结肠癌。
在另一实施方式中，肿瘤是胃癌。
在另一实施方式中，肿瘤是乳腺癌。
在另一实施方式中，肿瘤是肺癌。
在另一实施方式中，肿瘤是黑色素瘤。
在另一实施方式中，肿瘤是胰腺癌。
在另一实施方式中，肿瘤是卵巢癌。
在另一实施方式中，肿瘤是前列腺癌。
在另一实施方式中，肿瘤是中枢神经系统肿瘤。
在具体的实施方式中，中枢神经系统肿瘤是胶质母细胞瘤(glioblastoma)。
在另一实施方式中，肿瘤是MPNST。
在一种实施方式中，步骤c)中的生物标记物是CD9蛋白。
在另一实施方式中，步骤c)中的生物标记物是miR-21。
在另一实施方式中，步骤c)中的生物标记物是RNU6。
在一种实施方式中，样品是肿瘤样品。
在另一实施方式中，样品是身体流体。
在具体的实施方式中，样品是血浆样品。
在具体的实施方式中，样品是血液样品。
在具体的实施方式中，样品是血清样品。
在具体的实施方式中，样品是尿液样品。
在具体的实施方式中，样品是唾液样品。
在一种实施方式中，受试者是人。
在另一实施方式中，受试者是哺乳动物。
在一种实施方式中，参考值是来自与步骤a)相同的受试者的早期样品中的步骤c)的相同生物标记物的水平或存在。
在另一实施方式中，参考值是由与步骤a)的受试者不同的受试者获得的样品中的步骤c)的相同生物标记物的水平或存在。
本发明的该第一方面的以上实施方式的任何组合代表本发明的进一步的实施方式。
在本发明的第二方面，提供了用于体外确定受试者中的肿瘤转化状况的方法，这种方法包括：
a)提供由该受试者获得的生物样品，
b)从所述样品中分离细胞外小泡，其中，该分离细胞外小泡的步骤包括分离TM9SF4-阳性细胞外小泡，
c)由在步骤b)中分离的细胞外小泡确定合适的生物标记物的水平或存在，以及
d)比较在步骤c)中确定的生物标记物的水平或存在与一个或多个参考值。
在一种实施方式中，由患有良性肿瘤的患者获得步骤a)的生物样品。
在具体的实施方式中，良性肿瘤是良性的结肠肿瘤。
在具体的实施方式中，良性肿瘤是丛状神经纤维瘤。
在另一实施方式中，通过结合至抗-TM9SF4抗体分离TM9SF4-阳性细胞外小泡。
在另一实施方式中，细胞外小泡的至少一部分是外泌体。
在进一步的实施方式中，细胞外小泡是外泌体。
在一种实施方式中，肿瘤转化状况是转化为MPNST。
在另一实施方式中，肿瘤转化状况是转化为结直肠癌。
在一种实施方式中，步骤c)中的生物标记物是CD9蛋白。
在另一实施方式中，步骤c)中的生物标记物是miR-21。
在另一实施方式中，步骤c)中的生物标记物是RNU6。
在一种实施方式中，样品是肿瘤样品。
在另一实施方式中，样品是体液流体。
在具体的实施方式中，样品是血浆样品。
在具体的实施方式中，样品是血液样品。
在具体的实施方式中，样品是血清样品。
在具体的实施方式中，样品是尿液样品。
在具体的实施方式中，样品是唾液样品。
在一种实施方式中，受试者是人。
在另一实施方式中，受试者是哺乳动物。
在一种实施方式中，参考值是来自与步骤a)相同的受试者的早期样品中的步骤c)的相同生物标记物的水平或存在。
在另一实施方式中，参考值是由与步骤a)的受试者不同的受试者获得的样品中的步骤c)的相同生物标记物的水平或存在。
本发明的该第二方面的以上实施方式的任何组合代表本发明的进一步的实施方式。
在本发明的第三方面，提供了用于在确定受试者中的肿瘤的存在或肿瘤转化状况的测试中使用的TM9SF4-阳性细胞外小泡。
在一种实施方式中，测试是体外测试。
在一种实施方式中，细胞外小泡是外泌体。
在一种实施方式中，肿瘤是恶性肿瘤。
在一种实施方式中，肿瘤是结肠癌。
在另一实施方式中，肿瘤是胃癌。
在另一实施方式中，肿瘤是乳腺癌。
在另一实施方式中，肿瘤是肺癌。
在另一实施方式中，肿瘤是黑色素瘤。
在另一实施方式中，肿瘤是胰腺癌。
在另一实施方式中，肿瘤是卵巢癌。
在另一实施方式中，肿瘤是前列腺癌。
在另一实施方式中，肿瘤是中枢神经系统肿瘤。
在具体的实施方式中，中枢神经系统肿瘤是胶质母细胞瘤。
在另一实施方式中，肿瘤是MPNST。
在一种实施方式中，肿瘤转化状况是转化为MPNST。
在另一实施方式中，肿瘤转化状况是转化为结直肠癌。
在一种实施方式中，受试者是人。
在另一实施方式中，受试者是哺乳动物。
本发明的该第三方面的以上实施方式的任何组合代表本发明的进一步的实施方式。
本发明的第四方面涉及TM9SF4-阳性细胞外小泡在确定受试者中的肿瘤的存在或肿瘤转化状况的测试中的用途。
在一种实施方式中，测试是体外测试。
在一种实施方式中，细胞外小泡的至少一部分是外泌体。
在进一步的实施方式中，细胞外小泡是外泌体。
在一种实施方式中，肿瘤是恶性肿瘤。
在一种实施方式中，肿瘤是结肠癌。
在另一实施方式中，肿瘤是胃癌。
在另一实施方式中，肿瘤是乳腺癌。
在另一实施方式中，肿瘤是肺癌。
在另一实施方式中，肿瘤是黑色素瘤。
在另一实施方式中，肿瘤是胰腺癌。
在另一实施方式中，肿瘤是卵巢癌。
在另一实施方式中，肿瘤是前列腺癌。
在另一实施方式中，肿瘤是中枢神经系统肿瘤。
在具体的实施方式中，中枢神经系统肿瘤是胶质母细胞瘤。
在另一实施方式中，肿瘤是MPNST。
在一种实施方式中，肿瘤转化状况是转化为MPNST。
在另一实施方式中，肿瘤转化状况是转化为结直肠癌。
在一种实施方式中，受试者是人。
在另一实施方式中，受试者是哺乳动物。
本发明的该第四方面的以上实施方式的任何组合代表本发明的进一步的实施方式。
在本发明的第五方面，提供了用于确定受试者中的肿瘤的存在或肿瘤转化状况的试剂盒，这种试剂盒包含抗-TM9SF4抗体。
在一种实施方式中，试剂盒进一步包含抗CD9-抗体。
在另一实施方式中，试剂盒进一步包含miR-21引物。
在另一实施方式中，试剂盒进一步包含抗RNU6引物。
在一种实施方式中，肿瘤是恶性肿瘤。
在一种实施方式中，肿瘤是结肠癌。
在另一实施方式中，肿瘤是胃癌。
在另一实施方式中，肿瘤是乳腺癌。
在另一实施方式中，肿瘤是肺癌。
在另一实施方式中，肿瘤是黑色素瘤。
在另一实施方式中，肿瘤是胰腺癌。
在另一实施方式中，肿瘤是卵巢癌。
在另一实施方式中，肿瘤是前列腺癌。
在另一实施方式中，肿瘤是中枢神经系统肿瘤。
在具体的实施方式中，中枢神经系统肿瘤是胶质母细胞瘤。
在另一实施方式中，肿瘤是MPNST。
在一种实施方式中，肿瘤转化状况是转化为MPNST。
在另一实施方式中，肿瘤转化状况是转化为结直肠癌。
在另一实施方式中，试剂盒进一步包括标签或单独的插入物形式的说明书用于合适的操作参数。
本发明的该第五方面的以上实施方式的任何组合代表本发明的进一步的实施方式。
附图说明
以下参考附图，仅举例说明本发明的详细描述，其中：
图1比较了在MPNST细胞系(S462，第一列)、丛状神经纤维瘤系(54836T_003，第二列)和皮肤神经纤维瘤细胞系(1201A078，第三列)上，通过FACS测量的生物标记物TM9SF4和CD9的水平。中值表明当从外泌体膜检测时，生物标记物可以区分良性(丛状神经纤维瘤、皮肤神经纤维瘤)和恶性(MPNST)病症。
图2示出了夹心Elisa测试的结果，其中，由来源于胶质母细胞瘤细胞系(U87)或三种MPNST细胞系(S462、T265和88-14)或来源于人胚肾细胞系(HEK293)的条件培养基的通过超速离心流程纯化的40、20、10和5μg外泌体用抗-TM9SF4抗体捕获并用抗-CD9抗体检测，表明这些生物标记物在外泌体膜上表达且可以使用该特定的夹心Elisa测定来检测恶性神经纤维瘤(MPNST)或其他源自实体瘤(例如，胶质母细胞瘤)的外泌体，以及不可检测HEK293纯化的外泌体。在纵轴上报告的与背景的比值对应于各样品的吸光度值除以背景平均吸光度(仅PBS，0μg＝与背景的比值1)。
图3A与健康的周围组织和肿瘤前病区(分别为增生息肉和管形绒毛状腺瘤和胃不典型增生)相比，在具有结直肠癌(CRC)和胃癌(GC)的受试者中的TM9SF4的IHC评估示出了早期和晚期阶段两者中的肿瘤组织的高度特异性的染色，在健康的或不典型增生的组织中没有表达或表达很少。检查的癌症的总体90％强烈表达TM9SF4且表达水平(IHC得分)与疾病阶段显著相关。图3B与健康的周围组织相比的乳房、肺和黑色素瘤癌症中的TM9SF4-阳性细胞/mm2的IHC染色。该图显示了在分析的所有癌症组织中显著较高数量的TM9SF4-阳性细胞/mm2。
图4示出了夹心ELISA测试的结果，其中，通过TM9SF4抗体涂覆的96孔板免疫捕获从早期(TNM类别T1-2N0M0)或晚期(TNM类别T3-4NxMx)肿瘤阶段患者中获得的100μl预澄清的(参见材料和方法)血浆样品。通过CD9抗体的检测显示了早期和晚期阶段两者中的肿瘤血浆样品的高度特异性的与背景值的比值，健康的供体血浆样品中的表达非常低。柱状图的数量对应于每研究组的观察数。通过样品吸光度值除以背景值(仅PBS在孔中，与背景的比值＝1)计算与背景的比值。
图5示出了夹心ELISA测试的结果，其中，通过TM9SF4抗体涂覆的96孔板免疫捕获从肿瘤患者中获得的100μl的预澄清的(参见材料和方法)血浆样品。通过CD9抗体的检测显示了肿瘤血浆样品的高度特异性的与背景值的比值，其中健康的供体血浆样品中的表达非常低。水平轴线中报告了肿瘤组和观察数(N)。通过样品吸光度值除以背景值(仅PBS在孔中，与背景的比值＝1)计算与背景的比值。
图6表示通过GraphPad Prism程序，使用图5中报告的结直肠癌症(CRC)数据计算的受试者工作特征(Receiver Operating Characteristic)(ROC)曲线。将健康的供体组用于计算特异性和血浆样品上的TM9SF4/CD9 ELISA夹心测试的最佳阈值。该图示出了假设阈值>6.925，测试具有灵敏度>92％和特异性>95％。
图7表示通过GraphPad Prism程序，使用图5中报告的胃癌数据计算的ROC曲线。将健康的供体组用于计算特异性和血浆样品上的TM9SF4/CD9 ELISA夹心测试的最佳阈值。该图示出了假设阈值>7.025，测试具有灵敏度>83.9％和特异性>95％。
图8表示通过GraphPad Prism程序，使用图5中报告的乳腺癌数据计算的ROC曲线。将健康的供体组用于计算特异性和血浆样品上的TM9SF4/CD9 ELISA夹心测试的最佳阈值。该图示出了假设阈值>7.004，测试具有灵敏度>88.2％和特异性>95％。
图9表示通过GraphPad Prism程序，使用图5中报告的前列腺癌数据计算的ROC曲线。将健康的供体组用于计算特异性和血浆样品上的TM9SF4/CD9 ELISA夹心测试的最佳阈值。该图示出了假设阈值>7.005，测试具有灵敏度>75.8％和特异性>95％。
图10示出了夹心ELISA测试的结果，其中，通过TM9SF4抗体涂覆的96孔板免疫捕获(immune capture)从肿瘤患者中获得的100μl的预澄清的(参见材料和方法)血清样品。通过CD9抗体的检测显示了当与健康的供体血清样品相比时，肿瘤血清样品的显著较高的与背景值的比值。这些结果表明测试ELISA TM9SF4/CD9也适用于胰腺癌血浆样品。
图11-A示出了夹心ELISA测试的结果，其中，通过TM9SF4抗体涂覆的96孔板免疫捕获从七个结直肠癌症(CRC#1-#7)和对照组(健康供体-HD)中获得的100μl的预澄清的(参见材料和方法)血浆样品。图11-B示出了来自100μl的相同组样品的源自细胞外小泡(EV)的miR-21的相对表达(归一化至miR-451)。使用抗-TM9SF4抗体涂覆的小珠捕获TM9SF4-阳性小泡，以及提取RNA并通过材料和方法部分描述的RT-qPCR分析。如之前所描述的设定用于ELISA测定的诊断阈值(水平线)(参见材料和方法)，以及对于miR-21测定，设置大于对照组的平均值的2倍的值。出乎意料地，7个CRC样品中的6个示出匹配的诊断结果，表明这两种基于TM9SF4免疫捕获的测定之间的相关性。
图12示出了来自癌症患者(结直肠癌(CRC)N＝7；胃癌N＝6；乳腺癌N＝6；前列腺疾病N＝5；黑色素瘤N＝5；卵巢N＝6；肺癌N＝6)和对照组(健康供体N＝11)的100μl血浆的源自EV的miR-21的相对表达(归一化至miR-451或miR-574)。使用抗-TM9SF4抗体涂覆的小珠捕获TM9SF4-阳性EV，以及提取RNA并通过材料和方法部分描述的RT-qPCR分析。数据指出源自EV的miR-21在癌症患者的血浆中过表达，以及miR-451和miR-574二者是用于确定来自EV的源自肿瘤的miRNA的相对表达的合适的参考miRNA。
图13示出了来自皮肤、丛状和MPNST细胞系的1mL浓缩的(10X)细胞上清液的源自EV的RNU6和源自EV的miR-21的相对表达(归一化至miR-223)。使用抗-TM9SF4抗体涂覆的小珠捕获TM9SF4-阳性EV，以及提取RNA并通过材料和方法部分描述的RT-qPCR分析。数据指出源自EV的RNU6和miR-21在人癌细胞系(MPNST)的上清液而不在源自良性肿瘤的细胞系(丛状)或正常细胞系(皮肤)的上清液中过表达。
图14-A示出了来自前列腺癌患者和健康供体的100μl血浆的源自EV的miR-21的相对表达(归一化至miR-451)。使用抗-CD9抗体涂覆的小珠或抗-TM9SF4抗体涂覆的小珠捕获EV。提取RNA并通过材料和方法部分中描述的RT-qPCR分析。图14-B示出了来自结直肠癌(CRC)患者和健康供体的100μl血清的源自EV的miR-21的相对表达(归一化至miR-451)。使用抗-CD9和抗-CD63抗体两者或抗-TM9SF4涂覆的小珠捕获EV，以及提取RNA并通过材料和方法部分中描述的RT-qPCR分析。图14-A和图14-B的数据表明用抗-TM9SF4抗体涂覆的小珠免疫捕获的源自肿瘤的EV在血浆和血清两者中富集miR-21(众所周知的癌症相关的miRNA)。相反地，用靶向通用EV标记物(CD9或CD63)的抗体的EV捕获没有富集miR-21。
图15示出了来自前列腺癌患者和健康供体的100μl血浆的源自EV的miR-21的相对表达(归一化至miR-451)。使用抗-TM9SF4抗体涂覆的小珠或涂覆有同位型匹配的IgG抗体(ISO)的小珠捕获EV，用于评估非特异性结合。提取RNA并通过材料和方法部分中描述的RT-qPCR分析。数据示出了使用抗-TM9SF4-Ab涂覆的小珠的TM9SF4-阳性EV的特异性富集，同时在癌症患者的血浆中观察到低的非特异性结合。
图16示出了夹心ELISA测试的结果，其中，通过CD9抗体涂覆的96孔板免疫捕获从肿瘤患者和健康供体中获得的100μl预澄清的(参见材料和方法)血浆样品。通过TM9SF4抗体的检测表明倒置在图5中使用的捕获和检测抗体不可用于区分肿瘤来源的血浆样品与健康供体的血浆样品。通过样品吸光度值除以背景值(仅PBS在孔中，与背景的比值＝1)计算与背景的比值。
具体实施方式
方法
接下来是在用于分离和分析外泌体的实施例中所使用的方法的描述。本领域技术人员将认识到可替换的、等价的方法存在。
通过超速离心方法的外泌体分离
应当由感兴趣的80-90％融合细胞(汇合细胞，confluent cell)采集用于外泌体制备和分析的条件培养基(conditioned medium)。
在无菌条件下采集来自细胞培养物的上清液并添加1:1.000稀释的蛋白酶抑制剂，通过过滤(0.2μm)预澄清，并在+4℃下以110.000g超速离心(ca.50mL/管)1.5小时。然后，去除上清液并丢弃。在稀释在50mL冰冷的1xPBS之前将沉淀物重新悬浮在100μl冰冷的PBS中，以及在+4℃下以110.000g超速离心1.5小时。将获得的沉淀物重新悬浮在100μl PBS中并在吸取用于实验之前涡旋30秒。
用于通过FACS分析检测蛋白标记物的标准方案
使用用于蛋白量化的Bradford方法量化外泌体的浓度。在4℃下用醛/硫酸乳胶小珠(4％w/v，4μm)以1:20的比值培育从细胞系上清液分离的外泌体整夜。在PBS中的洗涤步骤之后，用有关的一抗(最终浓度5μg/ml)在PBS+0.5％BSA中培育吸附在小珠表面上的外泌体并将其保持在4℃下1h。在用PBS+0.5％BSA的洗涤步骤之后，在4℃下用对应的二抗(1：1000稀释的AlexaFluor 488小鼠、兔或羊)培育样品45分。在PBS中的最后洗涤步骤之后，将样品重新悬浮在300μl PBS中并在FACSCalibur(BD)中分析。将同位型匹配的抗体或单独的二抗用作阴性对照。使用FLI通道读取各样品的中值荧光强度并针对其阴性对照归一化。
样品采集：
入选标准仅包括新诊断的癌症案例，患者之前都没有接受过放射或化学治疗或者在血液采集之前没有经历过手术。所有患者在归入研究之前都签署了同意书。该研究由Riga East大学医院进行并经当地伦理委员会批准，且其符合赫尔辛基宣言(Declarationof Helsinki)。将血液采集在10mL EDTA管中，温和地倒置并从采集血液时开始在1500g10’RT下离心30分钟。
北部爱沙尼亚医院(North Estonia Hospital)的血液中心提供健康的验证合格的供体血浆。
组织的免疫组织化学检查
免疫染色组织部分使得对TM9SF4为阳性的细胞可见。通过在科学微波下在pH＝9.0的Tris/EDTA缓冲液中培育切片30min实现抗原修复。通过3.0％H2O2封闭内源过氧化物酶活性10min。在培育抗体之前，用正常的马血清封闭非特异性的一抗结合。在4℃下用兔子的多克隆TM9SF4抗体(1:400稀释)培育切片整夜。在1:100稀释下在室温下培育切片1小时。使用EnVision试剂检测抗体结合(在室温下1小时)。通过用二氨基联苯胺培育切片7min显示免疫过氧化物酶反应颜色。每个实验包括省略一抗的阴性对照。
细胞的成像和定量
针对每个试样，根据核或细胞质染色的强度(没有染色＝0，弱的染色＝1，适度的染色＝2，强烈的染色＝3)和染色的细胞的程度(0％＝得分0；1–10％＝1；11–50％＝2；51>＝得分3)给出得分。阴性意味着0％面积的染色。集中阳性意味着1–80％的面积染色，分散性的阳性意味着81–100％面积的染色。已经针对乳房、肺和黑色素瘤计数了癌症阳性细胞/mm2的数量。
数据分析
将形态学数据的结果表示为平均值±SD。通过双因素方差分析(ANOVA)分析形态学和免疫组织化学数据，随后进行Bonferroni事后检验用于组之间的比较。通过Spearman测试来评估与临床和组织病理学数据的相关性。在所有测试中，认为<0.05的p值在统计上有显著意义。将SPSS 21.版本软件用于统计分析。
通过夹心ELISA测试用于检测蛋白标记物的标准方案
通过超速离心的条件培养基用于纯化的外泌体的ELISA测试：将分离的外泌体的40、20、10和5μg/100μl PBS和作为阴性对照(0μg)的100μl PBS加载至预涂覆有TM9SF4(2μg/ml)抗体的96孔板(透明板)上。简要地，用有关的捕获抗体预涂覆96孔板，用PBS+0.05％TWEEN(洗涤缓冲液)洗涤三次，添加分离的外泌体，以及在37℃下培育整夜。用洗涤缓冲液洗涤三次之后，在板上培育CD9检测抗体，在37℃下培育2小时，用洗涤缓冲液洗涤三次，在37℃下与对应的二抗培育一小时并用洗涤缓冲液洗涤三次。将100μl TMB(四甲基联苯胺)添加到各个孔中并在5分钟之后，通过添加终止溶液(1N硫酸)终止反应。
用M1000 Tecan在450nm处读取O/D吸光度。
用于生物流体(血浆和血清)的ELISA测试：
将血浆和血清样品存储在-80℃，在室温下解冻并在添加1:500蛋白酶抑制剂混合物之后在1200g 20’4℃下离心预澄清，将上清液转移至另一小瓶中，并再次在4℃下在10000g 30’下离心。获得的上清液称为预澄清的并用于以下分析。简单来说，在预涂覆有TM9SF4抗体(2μg/ml)的96孔板中在4℃下培育100μl预澄清的血浆或血清整夜。用洗涤缓冲液洗涤三次之后，在板上培育CD9检测抗体，在4℃下培育2小时，用洗涤缓冲液洗涤三次，在4℃下与对应的二抗培育一小时并用洗涤缓冲液洗涤三次。将100μl TMB(四甲基联苯胺)添加到各个孔中并在5分钟之后，通过添加终止溶液(1N硫酸)终止反应。
用M1000 Tecan在450nm处读取O/D吸光度。
TM9SF4涂覆小珠的制备
通过使用本领域技术人员已知的方法或其变型可以获得涂覆有TM9SF4抗体的小珠。
从免疫捕获的外泌体提取RNA和miRNA
通过经由TM9SF4预涂覆小珠的免疫捕获的外泌体分离：培养基或生物流体(血浆和血清)
向来自细胞培养物的10mL上清液中添加1:1000稀释的蛋白酶抑制剂并使用离心过滤器单元(微孔)富集10X。然后在4℃下用预涂覆有TM9SF4抗体的免疫小珠培育1mL 10X培养基整夜。
用PBS+Tween 0.01％将免疫捕获的EV洗涤三次并用0.7ml QIAZOL处理。
用900μl的PBS 1X稀释100μl的预澄清的血浆或血清，并在4℃下在旋转器中与10μl的TM9SF4预涂覆的小珠培育整夜。用PBS+Tween0.01％将小珠洗涤三次并用0.7ml QIAZOL处理。
使用总RNA提取试剂盒(Hansabiomed)提取总RNA并在Nanodrop中量化洗脱的RNA。
miRNA和snoRNA扩增和RT-qPCR分析
使用miScript II RT试剂盒(Qiagen)逆转录miRNA，以及通过CFX96TM实时PCR检测系统(BIORAD)中的qRT-PCR，利用miScript SYBR Green PCR试剂盒(Qiagen)，使用靶向miR-21(Cat.Num:MS00009079)、RNU6(Cat.Num:MS00033740)和参考miRNAs、miR-451(Cat.Num.:MS00004242)、miR-574(Cat.Num.:MS00032025)和miR-223(Cat.Num.:MS00003871)的miScript引物测试(Qiagen)来扩增0.3ng cDNA。
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序列表
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<130> PC1375EC
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 642
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Ala Thr Ala Met Asp Trp Leu Pro Trp Ser Leu Leu Leu Phe Ser
1 5 10 15
Leu Met Cys Glu Thr Ser Ala Phe Tyr Val Pro Gly Val Ala Pro Ile
20 25 30
Asn Phe His Gln Asn Asp Pro Val Glu Ile Lys Ala Val Lys Leu Thr
35 40 45
Ser Ser Arg Thr Gln Leu Pro Tyr Glu Tyr Tyr Ser Leu Pro Phe Cys
50 55 60
Gln Pro Ser Lys Ile Thr Tyr Lys Ala Glu Asn Leu Gly Glu Val Leu
65 70 75 80
Arg Gly Asp Arg Ile Val Asn Thr Pro Phe Gln Val Leu Met Asn Ser
85 90 95
Glu Lys Lys Cys Glu Val Leu Cys Ser Gln Ser Asn Lys Pro Val Thr
100 105 110
Leu Thr Val Glu Gln Ser Arg Leu Val Ala Glu Arg Ile Thr Glu Asp
115 120 125
Tyr Tyr Val His Leu Ile Ala Asp Asn Leu Pro Val Ala Thr Arg Leu
130 135 140
Glu Leu Tyr Ser Asn Arg Asp Ser Asp Asp Lys Lys Lys Glu Lys Asp
145 150 155 160
Val Gln Phe Glu His Gly Tyr Arg Leu Gly Phe Thr Asp Val Asn Lys
165 170 175
Ile Tyr Leu His Asn His Leu Ser Phe Ile Leu Tyr Tyr His Arg Glu
180 185 190
Asp Met Glu Glu Asp Gln Glu His Thr Tyr Arg Val Val Arg Phe Glu
195 200 205
Val Ile Pro Gln Ser Ile Arg Leu Glu Asp Leu Lys Ala Asp Glu Lys
210 215 220
Ser Ser Cys Thr Leu Pro Glu Gly Thr Asn Ser Ser Pro Gln Glu Ile
225 230 235 240
Asp Pro Thr Lys Glu Asn Gln Leu Tyr Phe Thr Tyr Ser Val His Trp
245 250 255
Glu Glu Ser Asp Ile Lys Trp Ala Ser Arg Trp Asp Thr Tyr Leu Thr
260 265 270
Met Ser Asp Val Gln Ile His Trp Phe Ser Ile Ile Asn Ser Val Val
275 280 285
Val Val Phe Phe Leu Ser Gly Ile Leu Ser Met Ile Ile Ile Arg Thr
290 295 300
Leu Arg Lys Asp Ile Ala Asn Tyr Asn Lys Glu Asp Asp Ile Glu Asp
305 310 315 320
Thr Met Glu Glu Ser Gly Trp Lys Leu Val His Gly Asp Val Phe Arg
325 330 335
Pro Pro Gln Tyr Pro Met Ile Leu Ser Ser Leu Leu Gly Ser Gly Ile
340 345 350
Gln Leu Phe Cys Met Ile Leu Ile Val Ile Phe Val Ala Met Leu Gly
355 360 365
Met Leu Ser Pro Ser Ser Arg Gly Ala Leu Met Thr Thr Ala Cys Phe
370 375 380
Leu Phe Met Phe Met Gly Val Phe Gly Gly Phe Ser Ala Gly Arg Leu
385 390 395 400
Tyr Arg Thr Leu Lys Gly His Arg Trp Lys Lys Gly Ala Phe Cys Thr
405 410 415
Ala Thr Leu Tyr Pro Gly Val Val Phe Gly Ile Cys Phe Val Leu Asn
420 425 430
Cys Phe Ile Trp Gly Lys His Ser Ser Gly Ala Val Pro Phe Pro Thr
435 440 445
Met Val Ala Leu Leu Cys Met Trp Phe Gly Ile Ser Leu Pro Leu Val
450 455 460
Tyr Leu Gly Tyr Tyr Phe Gly Phe Arg Lys Gln Pro Tyr Asp Asn Pro
465 470 475 480
Val Arg Thr Asn Gln Ile Pro Arg Gln Ile Pro Glu Gln Arg Trp Tyr
485 490 495
Met Asn Arg Phe Val Gly Ile Leu Met Ala Gly Ile Leu Pro Phe Gly
500 505 510
Ala Met Phe Ile Glu Leu Phe Phe Ile Phe Ser Ala Ile Trp Glu Asn
515 520 525
Gln Phe Tyr Tyr Leu Phe Gly Phe Leu Phe Leu Val Phe Ile Ile Leu
530 535 540
Val Val Ser Cys Ser Gln Ile Ser Ile Val Met Val Tyr Phe Gln Leu
545 550 555 560
Cys Ala Glu Asp Tyr Arg Trp Trp Trp Arg Asn Phe Leu Val Ser Gly
565 570 575
Gly Ser Ala Phe Tyr Val Leu Val Tyr Ala Ile Phe Tyr Phe Val Asn
580 585 590
Lys Leu Asp Ile Val Glu Phe Ile Pro Ser Leu Leu Tyr Phe Gly Tyr
595 600 605
Thr Ala Leu Met Val Leu Ser Phe Trp Leu Leu Thr Gly Thr Ile Gly
610 615 620
Phe Tyr Ala Ala Tyr Met Phe Val Arg Lys Ile Tyr Ala Ala Val Lys
625 630 635 640
Ile Asp
<210> 2
<211> 228
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Met Pro Val Lys Gly Gly Thr Lys Cys Ile Lys Tyr Leu Leu Phe Gly
1 5 10 15
Phe Asn Phe Ile Phe Trp Leu Ala Gly Ile Ala Val Leu Ala Ile Gly
20 25 30
Leu Trp Leu Arg Phe Asp Ser Gln Thr Lys Ser Ile Phe Glu Gln Glu
35 40 45
Thr Asn Asn Asn Asn Ser Ser Phe Tyr Thr Gly Val Tyr Ile Leu Ile
50 55 60
Gly Ala Gly Ala Leu Met Met Leu Val Gly Phe Leu Gly Cys Cys Gly
65 70 75 80
Ala Val Gln Glu Ser Gln Cys Met Leu Gly Leu Phe Phe Gly Phe Leu
85 90 95
Leu Val Ile Phe Ala Ile Glu Ile Ala Ala Ala Ile Trp Gly Tyr Ser
100 105 110
His Lys Asp Glu Val Ile Lys Glu Val Gln Glu Phe Tyr Lys Asp Thr
115 120 125
Tyr Asn Lys Leu Lys Thr Lys Asp Glu Pro Gln Arg Glu Thr Leu Lys
130 135 140
Ala Ile His Tyr Ala Leu Asn Cys Cys Gly Leu Ala Gly Gly Val Glu
145 150 155 160
Gln Phe Ile Ser Asp Ile Cys Pro Lys Lys Asp Val Leu Glu Thr Phe
165 170 175
Thr Val Lys Ser Cys Pro Asp Ala Ile Lys Glu Val Phe Asp Asn Lys
180 185 190
Phe His Ile Ile Gly Ala Val Gly Ile Gly Ile Ala Val Val Met Ile
195 200 205
Phe Gly Met Ile Phe Ser Met Ile Leu Cys Cys Ala Ile Arg Arg Asn
210 215 220
Arg Glu Met Val
225
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<400> 3
uagcuuauca gacugauguu ga 22
<210> 4
<211> 107
<212> DNA
<213> 智人
<400> 4
gtgctcgctt cggcagcaca tatactaaaa ttggaacgat acagagaaga ttagcatggc 60
ccctgcgcaa ggatgacacg caaattcgtg aagcgttcca tattttt 107

Claims (5)

1.抗-TM9SF4抗体和抗CD9-抗体在制备用于体外确定受试者中肿瘤的存在的试剂盒中的应用，所述肿瘤选自由以下各项组成的列表：结肠癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤和前列腺癌，所述确定包括
a)提供从所述受试者获得的生物样品，
b)从所述样品中捕获细胞外小泡，其中，捕获细胞外小泡的这个步骤由利用所述抗-TM9SF4抗体捕获TM9SF4-阳性细胞外小泡构成，
c)由在步骤b)中分离的所述细胞外小泡，通过与所述抗CD9-抗体结合，确定CD9蛋白的水平或存在，以及
d)比较在步骤c)中确定的CD9蛋白的水平或存在与一个或多个参考值，
其中，步骤b)在步骤c)之前进行。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述细胞外小泡的至少一部分是外泌体。
3.一种试剂盒，用于在体外确定样品中肿瘤来源的细胞外小泡的存在中应用，这种试剂盒包括抗-TM9SF4抗体作为所述细胞外小泡的捕获抗体和抗CD9-抗体作为所述细胞外小泡的检测抗体，所述肿瘤选自由以下各项组成的列表：结肠癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤和前列腺癌。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，进一步包括标签或单独的插入物形式的用于合适的操作参数的说明。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其中，所述细胞外小泡的至少一部分是外泌体。
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