BR112016028581B1 - Método para a determinação in vitro da presença de um tumor, método para a determinação in vitro do estado de transformação de tumor, uso de vesículas extracelulares tm9sf4-positivas e uso de kit para determinar in vitro da presença de um tumor ou um estado de transformação de tumor - Google Patents
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Abstract
MÉTODO PARA A DETERMINAÇÃO IN VITRO DA PRESENÇA DE UM TUMOR, MÉTODO PARA A DETERMINAÇÃO IN VITRO DO ESTADO DE TRANSFORMAÇÃO DE TUMOR, VESÍCULAS EXTRACELULARES TM9SF4-POSITIVAS E KIT PARA USO NA DETERMINAÇÃO IN VITRO DA PRESENÇA DE UM TUMOR OU UM ESTADO DE TRANSFORMAÇÃO DE TUMOR. A presente invenção refere-se a biomarcadores de microvesículas extracelulares para a determinação do estado de transformação de tumor ou a presença de um tumor em um indivíduo, e aos usos de tais biomarcadores e a métodos de diagnóstico que utilizam tais biomarcadores. Em particular, os métodos e usos da presente invenção envolvem o isolamento de vesículas extracelulares TM9SF4-positivas e a detecção da expressão de um segundo biomarcador, preferencialmente selecionado a partir do grupo que consiste em proteína CD9, miR-21 e RNU6.
Description
[0001] A presente invenção refere-se a biomarcadores de microvesículas extracelulares para a determinação do estado de transformação de tumor ou a presença de um tumor em um indivíduo, e aos usos de tais biomarcadores e a métodos de diagnóstico que utilizam tais biomarcadores.
[0002] Contrariamente aos tumores malignos (ou cancerosos), os tumores benignos são tipicamente massa de células que não possuem a habilidade de invadir os tecidos vizinhos ou metastizar. Além disso, os tumores benignos geralmente têm uma taxa de crescimento mais lenta do que os tumores malignos e as células de tumor são geralmente mais diferenciadas.
[0003] Embora a maioria dos tumores benignos não sejam fatais, muitos tipos de tumores benignos têm o potencial de se tornarem cancerosos (malignos) através de um processo conhecido como transformação de tumor.
[0004] O câncer não metastático (primário ou recorrente) é um câncer que não se espalhou a partir do sítio primário (local onde começou) para outros locais do corpo.
[0005] O câncer metastático é um câncer que se espalhou a partir da parte do corpo onde se iniciou (sítio primário) para outras partes do corpo.
[0006] O desenvolvimento de neurofibromas benignos pode muitas vezes estar relacionado a uma mutação do gene supressor de tumor NF1 em células da linhagem de células de Schwann 1'3. Estas neoplasias podem frequentemente sofrer uma transformação adicional paro tumor maligno da bainha de nervo periférico (MPNSTs)1-3. Atualmente não está claro quais os tipos celulares são particularmente suscetíveis à formação em MPNST, que são as alterações moleculares que causam o desenvolvimento de MPNSTs de neurofibromas, ou que outros fatores no ambiente tumoral podem contribuir para a neoplasia. Além disso, gliomas, particularmente astrocitomas pilocíticos do nervo ótico nervos, e leucemias, são vistos com maior frequência na população NF13.
[0007] MPNSTs têm prognóstico muito pobre uma vez que não respondem à quimioterapia ou radioterapia padrão e têm uma alta propensão para metástase4'7. Pacientes NF1 e suas famílias estão bem cientes desses fatos, razão pela qual o desenvolvimento de um MPNST é a complicação que é mais temida pelos pacientes que sofrem desta doença8. No entanto, a detecção precoce é muitas vezes dificultada pelo fato de que os MPNSTs frequentemente desenvolvem dentro de grandes neurofibromas pré-existentes, tornando um novo crescimento ou progressão difícil de detectar e distinguir mesmo com MRI. Este atraso no diagnóstico é provavelmente a causa do mau resultado de MPNST em NF1 no que diz respeito aos seus homólogos esporádicos. Este constitui o principal ímpeto para a identificação de alterações moleculares que possam ser detectadas de maneira não invasiva e que sejam indicativos da iniciação de MPNST e progressão em pacientes NF1 que seria útil no rastreio e diagnóstico precoce, bem como o monitoramento da doença ou resultado terapêutico em configurações pré-clínicas e clínicas.
[0008] É geralmente aceito que vários subtipos neurofibroma existem que diferem na sua localização e padrão de crescimento, sua associação com NF1 e seu potencial de transformação maligna. Muitos investigadores de ciência básica e clínica amplamente classificam neurofibromas como por variantes dérmicas ou plexiformes1. Neurofibromas plexiformes são variantes que ocorrem quase exclusivamente em pacientes NF1 e são considerados congênitos; eles são distintos de neurofibromas intraneurais localizados pelo seu padrão de crescimento plexiforme característico. Os neurofibromas plexiformes têm o maior risco para a transformação maligna em MPNST1.
[0009] Da mesma forma para a transformação de neurofibromas em MPNST, outros tumores benignos têm um risco de se transformar em seu homólogo maligno. Este é, por exemplo, o caso de hiperplasia prostática benigna (BPH) para câncer de próstata, pólipos no cólon para câncer colorretal, nevos benignos para melanoma, condições de mama não cancerosas para câncer de mama, nódulos pulmonares para câncer de pulmão, astrocitoma defase inicial para glioblastoma e tumores de ovário benignos para câncer de ovário. A maioria destes cânceres são também capazes de metastizar.
[0010] As vesículas extracelulares (EVs) são uma classe de organelas ligadas à membrana secretadas por vários tipos de células9. EVs não limitadamente incluem (i) exossomos: 30100 nm de diâmetro de vesículas membranosas de origem endocítica (ii) ectossomos (também referida como microvesículas de derramamento, SMVs): grandes vesículas membranosas (diâmetro de 50-1000 nm) que são derramadas diretamente da membrana plasmática (PM) e (iii) corpos apoptóticos (50 a 5000 nm de diâmetro): liberados pelas células agonizantes.
[0011] Exossomos são nanovesículas extracelulares lipídicas naturais produzidos e liberados por praticamente todos os tipos de células de uma forma finamente regulada e funcionalmente relevante para que a proteína e a composição de RNAm reflitam o tipo e condição de uma célula-mãe1014. Essas vesículas têm uma estabilidade intrínseca e capacidade de atravessar barreiras biológicas, de modo que os exossomos provenientes de diferentes tecidos podem ser encontrados em fluidos biológicos facilmente acessíveis, tais como o sangue15-17. Dadas as suas funções biológicas e características, os exossomos são considerados sentinelas precoces de alterações na homeostase celular e tecidual e metabolismo e são uma fonte atraente para a identificação de novos biomarcadores de doenças relevantes, bem como manifestação de marcadores de tecido conhecidos em um paradigma de biópsia líquida. Esta é uma maior premissa e promessa de usar ensaios exossomo alvo em diagnósticos de doenças complexas, como o câncer. O grande desafio reside na associação de marcadores associados a exossomo, ambos as proteínas e os RNAs, a um tecido particular, em uma condição particular e otimização de soluções de exossomo alvo confiáveis, acessíveis e não invasivas e ensaios que possam ser realisticamente implementados em pesquisa clínica e prática18-21.
[0012] Existe atualmente uma necessidade de biomarcadores de vesículas extracelulares que sejam capazes de determinar a presença de um tumor (seja ele benigno, maligno e metastático) ou o estado de transformação de um tumor (benigno para maligno e não metastático para metastático)
[0013] Devido à natureza micelar de vesículas extracelulares tais como exossomos, algumas biomoléculas presentes nestas vesículas podem ser detectadas sem a lise das vesículas, uma vez que residem na membrana, enquanto que alguns outros só podem ser detectados após a lise das vesículas, uma vez que estão localizados dentro da vesícula.
[0014] Verificou-se, surpreendentemente, que as vesículas extracelulares TM9SF4- positivas (isto é, vesículas extracelulares que abrigam a proteína TM9SF4) são ferramentas extremamente versáteis que podem ser usadas para determinar a presença de um tumor ou o estado de transformação de tumor em um indivíduo, particularmente se um biomarcador selecionado a partir da lista da tabela 1 for utilizado.
[0015] A proteína TM9SF4 (SEQ ID NO: 1) é uma proteína de transmembrana recentemente descrita que pertence a superfamília transmembrana-9 (TM9SF), uma família bem definida de proteínas caracterizadas por um domínio N-terminal hidrófilo grande seguido por nove domínios transmembranas22. Esta proteína é conhecida por ser sobreexpressa em melanomas e na leucemia mielóide aguda e síndromes mielodisplásicas, esta última devido a uma amplificação de três a dez vezes de um fragmento de cromossomo 20 (20qll.21) contendo todo o gene TMQSF^3^. O TM9SF4 está envolvido na fagocitose de bactérias e no fenótipo canibal de células de melanoma metastático, um fenômeno muitas vezes relacionado com prognóstico pobre25'26. Células cancerosas canibais têm sido frequentemente detectadas em cânceres gástricos e do cólon27'30
[0016] Demonstrou-se recentemente que TM9SF4 se liga à V-ATPase, uma bomba de próton de regulação de pH sobreexpressa em vários tumores. Essa interação aberrantemente estabiliza a bomba de próton em seu estado ativo com as consequentes alterações de gradiente de pH que, por sua vez, está associada a resistência aos medicamentos e capacidade de invasão das células de câncer de cólon31.
[0017] A proteína CD9 (SEQ ID NO: 2) é um membro da superfamília transmembrana 4, também conhecida como a família das tetraspaninas. AS tetraspaninas são glicoproteínas de superfície de células com quatro domínios de transmembrana que formam complexos multiméricos com outras proteínas da superfície das células. As funções das proteínas codificadas em muitos processos celulares, incluindo diferenciação, adesão e transdução de sinal, e expressão deste gene desempenham um papel crítico na supressão da motilidade de células cancerígenas e metástases. É encontrada na superfície de exossomos e é considerada proteína de arrumação de exossomo para a análise quantitativa de nanovesículas derivadas de plasma.
[0018] Os miRNA21 (SEQ ID NO: 3) são uma classe de pequenos RNAs não-codificantes, cujos produtos maduros têm cerca de 22 nucleotídeos de comprimento. Eles regulam negativamente a expressão do gene através da indução de inibição de translacional ou degradação de transcrito32. Verificou-se que o miR-21 regula positivamente em muitos estados patológicos, incluindo o câncer e as doenças cardiovasculares33. A identificação de vários alvos de miRNAs que na verdade são oncogenes clássicos ou supressores de tumor levou à ideia amplamente aceita de que miRNAs têm um papel central na iniciação do câncer, progressão e metastização34'35.0 miR-21 foi observado pela primeira vez como um supressor de apoptose em várias linhagens de células36.
[0019] O RNU6 (SEQ ID NO: 4) é uma molécula de RNA não codificante (RNAnc) que funciona na modificação de outros RNAs nucleares pequenos (RNAsn). O perfil preciso de microRNAs (miRNAs) é uma etapa essencial para compreender o significado funcional destes pequenos RNAs em ambos os processos fisiológicos e patológicos. É bem conhecido que a normalização é uma das etapas mais críticas na qRT-PCR e os genes comumente usados para este fim, tais como U6 e 5S37, já foram descritos como sendo expressos diferencialmente no câncer, o que torna estes genes não adequados como controles internos.
[0020] Assim, em um primeiro aspecto da presente invenção, é fornecido um método para a determinação in vitro da presença de um tumor em um indivíduo, tal método compreendendo: a) fornecer uma amostra biológica obtida a partir daquele indivíduo, b) isolar vesículas extracelulares a partir de dita amostra, em que esta etapa de isolamento de vesículas extracelulares compreende o isolamento de vesículas extracelulares TM9SF4-positivas, c) determinar, a partir das vesículas extracelulares isoladas na etapa b), o nível ou a presença de um biomarcador adequado, e d) comparar o nível ou a presença do biomarcador determinado na etapa c) com um ou mais valores de referência, caracterizado por as vesículas extracelulares TM9SF4-positivas são isoladas por meio de ligação a um anticorpo anti-TM9SF4.
[0021] Em uma realização, o indivíduo é suspeito de estar afetado por um tumor.
[0022] Em uma outra realização, pelo menos uma porção das vesículas extracelulares são exossomos.
[0023] Em uma realização adicional, as vesículas extracelulares são exossomos.
[0024] Em uma realização, o tumor é um tumor maligno.
[0025] Em uma realização, o tumor é câncer de cólon.
[0026] Em outra realização, o tumor é câncer gástrico.
[0027] Em outra realização, o tumor é câncer de mama.
[0028] Em outra realização, o tumor é câncer de pulmão.
[0029] Em outra realização, o tumor é melanoma.
[0030] Em outra realização, o tumor é câncer pancreático.
[0031] Em outra realização, o tumor é câncer de ovário.
[0032] Em outra realização, o tumor é câncer de próstata.
[0033] Em uma outra realização, o tumor é um tumor do sistema nervoso central.
[0034] Em uma realização particular, o tumor do sistema nervoso central é glioblastoma.
[0035] Em outra realização, o tumor é MPNST.
[0036] Em uma realização, o biomarcador da etapa c) é a proteína CD9.
[0037] Em uma outra realização, o biomarcador da etapa c) é o miR-21.
[0038] Em uma outra realização, o biomarcador da etapa c) é RNU6.
[0039] Em uma realização, a amostra é uma amostra de tumor.
[0040] Em uma outra realização, a amostra é um fluido corporal.
[0041] Em uma realização particular, a amostra é uma amostra de plasma.
[0042] Em uma realização particular, a amostra é uma amostra de sangue.
[0043] Em uma realização particular, a amostra é uma amostra de soro.
[0044] Em uma realização particular, a amostra é uma amostra de urina.
[0045] Em uma realização particular, a amostra é uma amostra de saliva.
[0046] Em uma realização, o indivíduo é um humano.
[0047] Em uma outra realização, o indivíduo é um mamífero.
[0048] Em uma realização, o valor de referência é o nível ou a presença do mesmo biomarcador da etapa c) em uma amostra anterior do mesmo indivíduo como na etapa a).
[0049] Em uma outra realização, o valor de referência é o nível ou a presença do mesmo biomarcador da etapa c) em amostras obtidas de indivíduos diferentes do que o indivíduo da etapa a).
[0050] Quaisquer combinações das realizações acima deste primeiro aspecto da presente invenção representam realizações adicionais da presente invenção.
[0051] Em um segundo aspecto da presente invenção, é fornecido um método para a determinação in vitro do estado de transformação de tumor em um indivíduo, tal método compreendendo: e) fornecer uma amostra biológica obtida a partir daquele indivíduo, f) isolar vesículas extracelulares a partir da dita amostra, em que esta etapa de isolamento de vesículas extracelulares compreende o isolamento de vesículas extracelulares TM9SF4-positivas, g) determinar, a partir das vesículas extracelulares isoladas na etapa b), o nível ou a presença de um biomarcador adequado, e h) comparar o nível ou a presença do biomarcador determinado na etapa c) com um ou mais valores de referência, caracterizado por as vesículas extracelulares TM9SF4-positivas são isoladas por meio de ligação a um anticorpo anti-TM9SF4.
[0052] Em uma realização, a amostra biológica da etapa a) é obtida a partir de um paciente afetado por um tumor benigno.
[0053] Em uma realização particular, o tumor benigno é um tumor do cólon benigno.
[0054] Em uma realização particular, o tumor benigno é um neurofibroma plexiforme.
[0055] Em uma outra realização, pelo menos uma porção das vesículas extracelulares são exossomos.
[0056] Em uma realização adicional, as vesículas extracelulares são exossomos.
[0057] Em uma realização, o estado de transformação de tumor é a transformação a um MPNST.
[0058] Em uma outra realização, o estado de transformação de tumor é a transformação a um câncer colorretal.
[0059] Em uma realização, o biomarcador da etapa c) é a proteína CD9.
[0060] Em uma outra realização, o biomarcador da etapa c) é miR-21.
[0061] Em uma outra realização, o biomarcador da etapa c) é RNU6.
[0062] Em uma realização, a amostra é uma amostra de tumor.
[0063] Em uma outra realização, a amostra é um fluido corporal.
[0064] Em uma realização particular, a amostra é uma amostra de plasma.
[0065] Em uma realização particular, a amostra é uma amostra de sangue.
[0066] Em uma realização particular, a amostra é uma amostra de soro.
[0067] Em uma realização particular, a amostra é uma amostra de urina.
[0068] Em uma realização particular, a amostra é uma amostra de saliva.
[0069] Em uma realização, o indivíduo é um humano.
[0070] Em uma outra realização o indivíduo é um mamífero.
[0071] Em uma realização, o valor de referência é o nível ou a presença do mesmo biomarcador da etapa c) em uma amostra anterior do mesmo indivíduo como na etapa a).
[0072] Em uma outra realização, o valor de referência é o nível ou a presença do mesmo biomarcador da etapa c) em amostras obtidas de indivíduos diferentes que o indivíduo da etapa a).
[0073] Quaisquer combinações das realizações acima deste segundo aspecto da invenção representam realizações adicionais da presente invenção.
[0074] Em um terceiro aspecto da presente invenção, é fornecido o uso de vesículas extracelulares TM9SF4-positivas em um teste para determinar a presença de um tumor ou o estado de transformação de tumor em um indivíduo, caracterizado por a presença do tumor ou o status de transformação do tumor ser determinado por um método como definido acima.
[0075] Em uma realização, o teste é um teste in vitro.
[0076] Em uma realização, as vesículas extracelulares são exossomos.
[0077] Em uma realização, o tumor é um tumor maligno.
[0078] Em uma realização, o tumor é câncer de cólon.
[0079] Em outra realização, o tumor é câncer gástrico.
[0080] Em outra realização, o tumor é câncer de mama.
[0081] Em outra realização, o tumor é câncer de pulmão.
[0082] Em outra realização, o tumor é melanoma.
[0083] Em outra realização, o tumor é câncer de pâncreas.
[0084] Em outra realização, o tumor é câncer de ovário.
[0085] Em outra realização, o tumor é câncer de próstata.
[0086] Em uma outra realização, o tumor é um tumor do sistema nervoso central.
[0087] Em uma realização particular, o tumor do sistema nervoso central é glioblastoma.
[0088] Em outra realização, o tumor é MPNST.
[0089] Em uma realização, o estado de transformação de tumor é a transformação a um MPNST.
[0090] Em uma outra realização, o estado de transformação de tumor é a transformação a um câncer colorretal.
[0091] Em uma realização, o indivíduo é um humano.
[0092] Em uma outra realização o indivíduo é um mamífero.
[0093] Quaisquer combinações das realizações acima deste terceiro aspecto da presente invenção representam realizações adicionais da presente invenção.
[0094] Em um quarto aspecto da presente invenção, é fornecido o uso de um kit para determinar a presença de um tumor ou um estado de transformação de tumor em um indivíduo, tal kit compreendendo um anticorpo anti-TM9SF4, e um reagente selecionado da lista que consiste em um anticorpo anti-CD9, um primer miR-21 ou um primer RNU6.
[0095] Em uma realização, o tumor é um tumor maligno.
[0096] Em uma realização, o tumor é câncer de cólon.
[0097] Em outra realização, o tumor é câncer gástrico.
[0098] Em outra realização, o tumor é câncer de mama.
[0099] Em outra realização, o tumor é câncer de pulmão.
[0100] Em outra realização, o tumor é melanoma.
[0101] Em outra realização, o tumor é câncer de pâncreas.
[0102] Em outra realização, o tumor é câncer de ovário.
[0103] Em outra realização, o tumor é câncer de próstata.
[0104] Em uma outra realização, o tumor é um tumor do sistema nervoso central.
[0105] Em uma realização particular, o tumor do sistema nervoso central é glioblastoma.
[0106] Em outra realização, o tumor é MPNST.
[0107] Em uma realização, o estado de transformação de tumor é a transformação a um MPNST.
[0108] Em uma outra realização, o estado de transformação de tumor é a transformação a um câncer colorretal.
[0109] Em uma outra realização, o kit compreende adicionalmente instruções para os parâmetros operacionais adequados na forma de uma etiqueta ou inserção separada.
[0110] Quaisquer combinações das realizações acima deste quinto aspecto da presente invenção representam concretizações adicionais da presente invenção.
[0111] Segue-se agora a título de exemplo apenas uma descrição detalhada da presente invenção com referência aos desenhos anexos, nos quais:
[0112] A Fig. 1 compara os níveis de biomarcadores TM9SF4 e CD9 medidos por FACS em uma linhagem celular MPNST (S462, primeira coluna), uma linha de neurofibroma plexiforme (54836T_003, segunda coluna) e uma linhagem de células de neurofibroma dérmico (1201A078, terceira coluna). Os valores medianos demonstram que os biomarcadores, quando detectados a partir da membrana de exossomo, podem se diferenciar entre condições benignas (neurofibroma plexiforme, neurofibroma dérmico) e malignas (MPNST).
[0113] A Fig. 2 mostra os resultados de um teste ELISA sanduíche, onde 40, 20, 10 e 5 μg de exossomos purificados por protocolo de ultracentrifugação a partir de meios condicionados originários a partir de uma linhagem celular de glioblastoma (U87) ou três linhagens celulares MPNST (S462, T265 e 88-14) ou a partir de uma linhagem celular de rim embrionário humano (HEK293) são capturados com um anticorpo anti-TM9SF4 e detectados com um anticorpo anti-CD9, mostrando que estes biomarcadores são expressos na membrana exossomal e que este teste ELISA de sanduíche em particular pode ser utilizado para detectar neurofibroma maligno (MPNST) ou outros exossomos derivados de tumores sólidos (por exemplo, glioblastoma) e exossomos purificados não HEK293. A Razão Alvo-Fundo relatada no eixo de ordenadas corresponde aos valores de absorbância de cada amostra dividida pela absorbância média de fundo (PBS sozinho, 0 μg = Razão Alvo-Fundo 1).
[0114] Fig. 3A. A verificação de IHC de TM9SF4 em indivíduos com câncer colo retal (CRC) e câncer gástrico (GC) em comparação comtecido circundante saudável e lesões pré- neoplásicas (pólipos hiperplásicos e adenoma túbulo-viloso e displasia gástrica, respectiva mente) revelou coloração altamente específica de tecido de tumor em ambos os estágios iniciais e avançados, com pouca ou nenhuma expressão em tecido saudável ou displásico. No geral, 90% dos cânceres examinados expressou fortemente TM9SF4 e o nível de expressão (pontuação IHC) significativamente correlacionou com o estágio da doença. Fig. 3B. Coloração IHC de células TM9SF4 positivas/mm2 em cânceres de mama, pulmão e melanoma em comparação com tecidos circundantes saudáveis. A figura revelou um número significativamente maior de células TM9SF4 positivas/mm2 em todos os tecidos cancerosos analisados.
[0115] A Fig. 4 mostra os resultados de um teste ELISA sanduíche, onde 100 μl de amostras de plasma pré-clarificadas (vide Materiais e Métodos) obtidas a partir de pacientes em estágio tumoral inicial (classificação TNM T1-2N0M0) ou avançado (classificação TNM T3- 4NxMx) foram imuno-capturadas através de placas de 96 poços revestidas com anticorpo TM9SF4. A detecção por anticorpo CD9 revelou valores de Razão Alvo-Fundo significativamente maiores de amostras de plasma de tumor em ambos os estágios iniciais e avançados, com uma expressão muito baixa em amostras de plasma de doadores saudáveis. Os números no gráfico de barras correspondem ao número de observações para cada grupo de estudo. A Razão Alvo-Fundo foi calculada dividindo-se os valores de absorbância de amostras pelo valor de fundo (apenas PBS no poço Razão Alvo-Fundo = 1).
[0116] A Fig. 5 mostra os resultados de um teste ELISA sanduíche, onde 100 μl de amostras de plasma pré-clarificadas (vide Materiais e Métodos) obtidas a partir de pacientes tumorais foram imuno-capturadas através de placas de 96 poços revestidas com anticorpo TM9SF4. A detecção por anticorpo CD9 revelou valores de Razão Alvo-Fundo significativamente maiores de amostras de plasma de tumor com uma expressão muito baixa em amostras de plasma de doadores saudáveis. No eixo horizontal é relatado o grupo de tumores e o número de observações (N). A Razão Alvo-Fundo foi calculada dividindo valores de absorbância amostras pelo valor de fundo (apenas PBS no poço de Razão Alvo-Fundo = 1).
[0117] A Fig. 6 representa uma curva Característica de Operação do Receptor (ROC) calculada pelo programa GraphPad Prism utilizando os dados de câncer colorretal (CRC) apresentados na Figura 5. O grupo de doador saudável foi utilizado para calcular a especificidade e o limiar ótimo de teste ELISA sanduíche de TM9SF4/CD9 em amostras de plasma. A figura mostra como assumindo um limiar > 6,925 o teste tem uma sensibilidade > 92% e uma especificidade > 95%.
[0118] A Fig. 7 representa uma curva ROC calculada pelo programa GraphPad Prism utilizando os dados de câncer gástrico apresentados na Figura 5. O grupo de doador saudável foi utilizado para calcular a especificidade e o limiar ótimo de teste ELISA sanduíche de TM9SF4/CD9 em amostras de plasma. A figura mostra como assumindo um limiar > 7,025 o teste tem uma sensibilidade > 83,9% e uma especificidade > 95%.
[0119] A Fig. 8 representa uma curva ROC calculada pelo programa GraphPad Prism utilizando os dados de câncer de mama apresentados na Figura 5. O grupo de doador saudável foi utilizado para calcular a especificidade e o limiar ótimo de teste ELISA sanduíche de TM9SF4/CD9 em amostras de plasma. A figura mostra como assumindo um limiar > 7,004 o teste tem uma sensibilidade > 88,2% e uma especificidade > 95%.
[0120] A Fig. 9 representa uma curva ROC calculada pelo programa GraphPad Prism utilizando os dados de câncer de próstata descritos na Figura 5. Grupo dador saudável foi utilizado para calcular a especificidade e o limiar ótimo de teste ELISA sanduíche de TM9SF4/CD9 em amostras de plasma. A figura mostra como assumindo um limiar > 7,005 o teste tem uma sensibilidade > 75,8% e uma especificidade > 95%.
[0121] A Fig. 10 mostra os resultados de um teste ELISA sanduíche, onde 100 μl de amostras de soro pré-clarificadas (vide Materiais e Métodos) obtidas de pacientes tumorais foram imuno-capturadas através de placas de 96 poços revestidas com anticorpo TM9SF4. A detecção por anticorpo CD9 revelou valores de Razão Alvo-Fundo significativamente maiores de amostras de soro de tumor quando comparados com as amostras de soro de doadores saudáveis. Estes resultados sugerem que o teste ELISA de TM9SF4/CD9 é também adequado para as amostras de plasma de câncer de pâncreas.
[0122] A Fig. 11-A mostra os resultados de um teste ELISA sanduíche, onde 100 μl de amostras de plasma pré-clarificadas (vide Materiais e Métodos) obtidas a partir de sete cânceres colorretais (CRC #1 a #7) e grupo controle (doadores saudáveis -HD) foram imuno-capturadas através de placas de 96 poços revestidas com anticorpo TM9SF4. A Figura 11-B mostra a expressão relativa de miR-21 derivado de vesícula extracelular (EV) (normalizado a miR-451) a partir de 100 μl do mesmo conjunto de amostras. As vesículas TM9SF4-positivas foram capturadas com esferas revestidas de anticorpo anti-TM9SF4 e o RNA foi extraído e analisado por RT-qPCR como descrito em Materiais e Métodos. O limiar de diagnóstico (linha horizontal) para o teste ELISA foi definido como anteriormente descrito (vide materiais e métodos) e para o ensaio de miR-21 foi fixado a um valor duas vezes maior do que o valor mediano do grupo controle. Surpreendentemente, 6 de 7 amostras de CRC mostraram resultados de diagnóstico combinados, sugerindo uma correlação entre esses dois ensaios baseados em TM9SF4 imunocapturado.
[0123] A Fig. 12 mostra a expressão relativa de miR-21 derivado de VE (normalizado para miR-451 ou para miR-574) a partir de 100 μl de plasma de pacientes com câncer (câncer Colorretal (CCR) N = 7; Câncer Gástrico N = 6; Câncer De Mama N = 6; Doença da Próstata N = 5; Melanoma N = 5; Ovário N = 6; Câncer De Pulmão N = 6) e grupo controle (doadores saudáveis N = 11). As VEs TM9SF4-positivas foram capturadas utilizando esferas revestidas de anticorpo anti-TM9SF4 e o RNA foi extraído e analisado por RT-qPCR como descrito na seção Materiais e Métodos. Os dados sugerem que miR-21 derivado de VE é sobreexpresso no plasma de pacientes com câncer e que tanto miR-451 quanto miR-574 são miRNAs de referência adequados para a determinação e a expressão relativa de miRNAs derivados de tumores a partir de VE.
[0124] A Fig. 13 mostra a expressão relativa de RNU6 derivado de VE e miR-21 derivado de VE (normalizado para miR-223) a partir de 1 ml (10X) de sobrenadante celular concentrado de linhagens celulares MPNST e plexiformes e dérmicas. As VE TM9SF4- positivas foram capturadas utilizando esferas revestidas de anticorpo anti-TM9SF4 e o RNA foi extraído e analisado por RT-qPCR como descrito na seção Materiais e Métodos. Os dados sugerem que RNU6 derivado de VE e miR-21 são sobreexpressos no sobrenadante de linhagens celulares de câncer humano (MPNST), mas não no sobrenadante de linhagens celulares derivadas de tumores benignos (plexiforme) ou linhagens celulares normais (dérmica).
[0125] A Fig. 14-A mostra a expressão relativa de miR-21 derivado de VE (normalizado para miR-451) a partir de 100 μl de plasma de um paciente com câncer de próstata e um dador saudável. As VEs foram capturadas utilizando esferas revestidas de anticorpo anti-CD9 ou esferas revestidas de anticorpos anti-TM9SF4.0 RNA foi extraído e analisado por RT-qPCR como descrito na seção Materiais e Métodos. A Figura 14-B mostra a expressão relativa de miR-21 derivado de VE (normalizado para miR-451) a partir de 100 μl de soro de um paciente com câncer colorretal (CRC) e um doador saudável. As VE foram capturadas utilizando esferas revestidas com ambos os anticorpos anti-CD9 e anti-CD63 ou esferas revestidas de anticorpo anti-TM9SF4 e o RNA foi extraído e analisado por RT-qPCR como descrito na seção Materiais e Métodos. Os dados da Figura 14-A e 14-B sugerem que a imunocaptura de VE derivadas de tumor com esferas revestidas de anticorpos anti-TM9SF4 enriquecem para miR-21 (um câncer associado com miRNA bem conhecido) em ambos o plasma e o soro. Por outro lado, a captura de VE com anticorpos dirigidos para marcadores de VEs genéricos (CD9 ou CD63) não enriquece para miR-21.
[0126] A Fig. 15 mostra a expressão relativa de miR-21 derivado de VE (normalizado para miR-451) a partir de 100 μl de plasma de um paciente de câncer de próstata e um doador saudável. As VEs foram capturadas utilizando esferas revestidas de anticorpo anti-TM9SF4 ou esferas revestidas com anticorpos do mesmo isotipo-IgG (ISO) para avaliar ligação específica. O RNA foi extraído e analisado por RT-qPCR como descrito na seção Materiais e Métodos. Os dados mostram o enriquecimento específico de VEs TM9SF4-positivas utilizando esferas revestidas de anti-TM9SF4-Ab enquanto baixa ligação específica foi observada no plasma do paciente com câncer.
[0127] A Figura 16 mostra os resultados de um teste ELISA sanduíche, onde 100 μl de amostras de plasma pré-clarifiçadas (vide Materiais e Métodos) obtidas a partir de pacientes tumorais e doadores saudáveis foram imuno-capturadas através de placas de 96 poços revestidas com anticorpo CD9. A detecção por anticorpo TM9SF4 revelou que a inversão da captura e a detecção de anticorpo utilizadas na Fig. 5 não é útil para distinguir amostras de plasma de origem tumoral a partir de amostras de plasma de doadores saudáveis. A Razão Alvo-Fundo foi calculada dividindo valores absorbância de amostras pelo valor de fundo (apenas PBS no poço Razão Alvo-Fundo = 1). MÉTODOS
[0128] O que se segue é uma descrição dos métodos utilizados nos exemplos para o isolamento e a análise dos exossomos. O técnico no assunto reconhecerá que métodos alternativos e equivalentes existem.
[0129] Meio condicionado para a preparação e a análise de exossomo devem ser coletadas de 80 a 90% de células confluentes de interesse.
[0130] O sobrenadante a partir de cultura de células é coletado em condições estéreis e adicionado com inibidores de protease diluídos 1:1.000, pré-darificado por filtração (0,2 μm) e ultracentrifugado (cerca de 50 ml/tubo) a 110.000 g durante 1,5 horas a + 4°C. O sobrenadante é então removido e descartado. O pellet é re-suspenso em 100 μl de PBS gelado antes da diluição em 50 IxPBS frio e ultracentrifugado a 110.000 g durante 1,5 horas a + 4°C. O pellet resultante é re-suspenso em PBS a 100 μl e submetido a escoamento giratório durante 30 segundos antes de pipetar para a experimentação.
[0131] A concentração exossomal é quantificada utilizando o método de Bradford para a quantificação de proteína.
[0132] Os exossomos isolados a partir de sobrenadantes linhagens de células são incubados a 4°C durante a noite com esferas de látex de aldeído/sulfato de (4% p/p, 4 μm) em uma razão 1:20. Após uma etapa de lavagem em PBS, os exossomos adsorvidos na superfície das esferas são incubados em PBS + BSA a 0,5% com o anticorpo primário relevante (para uma concentração final de 5 μg/ml) e mantidos por lh a 4°C. Após uma etapa de lavagem com PBS + BSA a 0,5%, as amostras são incubadas durante 45' a 4°C com o anticorpo secundário correspondente (488 AlexaFluor rato, coelho ou cabra diluído a 1:1000). Após uma etapa de lavagem final em PBS, as amostras foram re-suspensas em PBS a 300 μl e analisadas em FACSCalibur (BD). Anticorpos de isotipos combinados ou os anticorpos secundários sozinhos são utilizados como controle negativo. A intensidade de fluorescência média de cada amostra é lida utilizando canal FLI e normalizada para seu controle negativo.
[0133] Os critérios de inclusão compreenderam apenas caso recém diagnosticado de câncer, nenhum dos pacientes tinha recebido anteriormente tratamento de rádio ou quimioterapia ou submetido à cirurgia antes da coleta de sangue. Todos os pacientes deram consentimento assinado antes de incluídos no estudo. O estudo foi realizado pelo Hospital Universitário Riga East universidade e foi aprovado por um comitê de ética local e foi conformado à Declaração de Helsinki. Sangues foram coletados em tubos de 10 ml de EDTA, suavemente invertidos e centrifugados a 1500 g 10' RT em 30 minutos a partir do momento da coleta de sangue.
[0134] O Hemocentro do Hospital North Estonia forneceu plasma de doadores saudáveis certificados.
[0135] Seções de tecido foram imunocoradas para visualizar as células que foram positivas para TM9SF4. A recuperação de antígenos foi conseguida por incubação das lâminas em tampão Tris/EDTA a pH = 9,0 em microondas científico durante 30 min. A atividade da peroxidase endógena foi bloqueada com H2O2 a 3.0% durante 10 min. A ligação de anticorpo primário inespecífica foi bloqueada com soro de cavalo normal antes da incubação do anticorpo. As lâminas foram incubadas durante a noite a 4°C com anticorpo TM9SF4 policlonal de coelho (diluição 1:400). As lâminas foram incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora em uma diluição de 1:100. A ligação de anticorpos foi detectada utilizando 0 reagente Envision (1 hora à temperatura ambiente). A cor da reação de imunoperoxidase foi desenvolvida por incubação das lâminas com diaminobenzidina durante 7 min. Um controle negativo que omitiu 0 anticorpo primário foi incluído para cada experimento.
[0136] Para cada espécime foi dada uma pontuação de acordo com a intensidade da coloração nucleica ou citoplasmática (sem coloração = 0, coloração fraca = 1, coloração moderada = 2, coloração forte = 3) e a extensão de células coradas (0% = pontuação 0; 1 a 10% = pontuação 1; 11 a 50% = 2; 51 > = pontuação 3). Negativo significa coloração área de 0%. Focalmente positivo significa coloração de área de 1 a 80%, difusamente positivo significa coloração de área de 81 a 100%. Para mama, pulmão e melanoma foram contados o número de células de cânceres positivas/mm2.
[0137] Os resultados para os dados morfológicos foram expressos como a média ± DP. Dados morfológicos e de imunohistoquímicos foram analisados por ANOVA de duas rotas seguido de pós-teste Bonferroni para comparação entre os grupos. A correlação com dados clínicos e histopatológicos foi avaliada pelo teste de Spearman. Em todos os testes, o valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Software de versão SPSS 21. foi utilizado para a análise estatística.
[0138] Teste ELISA para exossomos purificado por meios condicionado ultracentrifugado: 40, 20, 10 e 5 μg/PBS a 100 μl de exossomos isolados e 100 μl de PBS como controle negativo (0 μg) são carregados em uma placa de 96 poços pré-revestidos com anticorpo TM9SF4 (2 μg/ml) (placa transparente). Resumidamente, placas de 96 poços são pré- revestidas com o anticorpo de captura relevante, lavados três vezes com PBS + Tween a 0,05% (tampão de lavagem), adicionados com os exossomos isolados e incubados durante a noite a 37°C. Depois de três lavagens com tampão de lavagem, os poços são incubados com o anticorpo de detecção CD9, incubados durante 2 horas a 37°C, lavados três vezes com tampão de lavagem, incubados durante 1 hora a 37°C com o anticorpo secundário correspondente e lavados três vezes com tampão de lavagem. TMB a 100 μl (tetrametilbenzidina) são adicionadas a cada poço e, depois de 5 minutos, a reação é parada por adição de 100 μl de solução de paragem (ácido sulfúrico a 1 N).
[0139] A absorbância O/D é lida com um Tecan M1000 a 450 nm.
[0140] Ensaio de ELISA para os fluidos biológicos (plasma e soro):
[0141] As amostras de plasma e de soro são armazenadas a -80°C, descongeladas à temperatura ambiente e pré-clarificadas após a adição de 1:500 de inibidores de protease centrifugando a 1200g 20' 4°C, transferindo o sobrenadante em um outro frasco e centrifugando novamente a 10000 g 30' a 4°C. O sobrenadante obtido é chamado de pré- clarificado e é utilizado para a análise seguinte. Resumidamente, 100 μl de plasma pré- clarificado ou soro são incubados durante a noite a 4°C em placas de 96 poços pré- revestidas com anticorpo TM9SF4 (2 μg/ml). Depois de três lavagens com tampão de lavagem, os poços são incubados com o anticorpo de detecção CD9, incubados durante 2 horas a 4°C, lavados três vezes com tampão de lavagem, incubados durante 1 hora a 4°C com o anticorpo secundário correspondente e lavados três vezes com tampão de lavagem. TMB a 100 μl (tetrametilbenzidina) são adicionadas a cada poço e, depois de 5 minutos, a reação é parada por adição de 100 μl de solução de paragem (ácido sulfúrico a 1 N).
[0142] A absorbância O/D é lida com um Tecan M1000 a 450 nm.
[0143] Esferas revestidas com um anticorpo TM9SF4 podem ser obtidas utilizando método conhecido pelo técnico no assunto ou suas modificações.
[0144] 10 ml de sobrenadante de cultura de células são adicionados com inibidores de protease diluída a 1:1000 e concentrados 10X utilizando unidades de filtro de centrífuga (Millipore). Meio 10X de 1 ml é, em seguida, incubado durante a noite a 4°C com esferas imunes pré-revestidas com anticorpo TM9SF4.
[0145] VEs imunocapturadas são lavadas três vezes com PBS + Tween a 0,01% e tratadas com 0,7 ml de QIAZOL.
[0146] 100 μl de plasma ou soro pré-clarificado são diluídos com 900 μl de PBS IX e incubados durante a noite a 4°C em um rotor com 10 μl de esferas pré-revestidas de TM9SF4. Esferas foram lavadas três vezes com PBS + Tween a 0,01% e tratadas com 0,7 ml de QIAZOL.
[0147] O RNA total é extraído utilizando o kit de extração de RNA total (Hansabiomed) e RNA eluído é quantificado no Nanodrop.
[0148] miRNAs foram retro-transcritos utilizando um kit miScript II RT (Qiagen) e 0,3 ng de DNAc foram amplificados por qRT-PCR em CFX96™ em sistema de detecção de PCR tempo real do (BIORAD) com o kit de PCR miScript SYBR Green (Qiagen), utilizando ensaios de primers miScript (Qiagen) dirigidos a miR-21 (Cat Num.: MS00009079), RNU6 (Cat Num.: MS00033740) e referências miR-451 (Cat. Num.: MS00004242), miR-574 (Cat Num.: MS00032025) e miR-223 (Cat. Num.: MS00003871). REFERÊNCIAS CITADAS 1. Carroll SL, Ratner N. How does the Schwann cell lineage from tumors in NFl?G\\a. 2008; 56(14): 1590-605. Epub 2008/09/23. doi: 10.1002/glia.20776. PubMed PMID: 18803326; PubMed Central PMCID: PMC2652636. 2. Evans DG, Baser ME, McGaughran J, Sharif S, Howard E, Moran A. Malignant peripheral nerve sheath tumours in neurofibromatosis 1. J Med Genet. 2002; 39(5): 311-4. Epub 2002/05/16. PubMed PMID: 12011145; PubMed Central PMCID: PMC1735122. 3. Korf BR. Malignancy in neurofibromatosis type 1. 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Lozupone F, Perdicchio M, Brambilla D Borghi M, S Bruni, Barco S, ML Marino, Logozzi M, C Federici, lessi E, de Milito A, Fais S. The human homologue of Dictyosteiium discoideum phgiA is expressed by human metastatic melanoma cells. EMBO Rep 2009 Dec; 10(12): 1348-1354. doi: 10.1038/EMBO Rep.2009.236. Epub 06 de novembro de 2009. 24. Mackinnon RN, Selan C, Wall M, Baker E, Nandurkar H, Campbell LJ. The paradox of 20qi 1.21 amplification in a subset of cases of myeloid malignancy with chromosome 20 deletion. Genes do câncer cromossomos. Novembro 2010; 49(11): 998-1013. doi: 10.1002/gcc.20806. 25. Fais S. Proton pump inhibitor-induced tumour cell death by inhibition of a detoxification mechanism.! Intern Med.2010 maio; 267(5): 515-25.doi: 10.1111/j.l365-2796.2010.02225.x. 26. Perrin J, Mortier M, Jacomin AC, Viargues P, Thevenon D, Fauvarque MO. 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Claims (16)
1. MÉTODO PARA A DETERMINAÇÀO IN VITRO DA PRESENÇA DE UM TUMOR em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que tal método compreende a) fornecer uma amostra biológica obtida a partir daquele indivíduo, b) isolar vesículas extracelulares a partir de dita amostra, em que esta etapa de isolamento de vesículas extracelulares compreende o isolamento de vesículas extracelulares TM9SF4-positivas, c) determinar, a partir das vesículas extracelulares isoladas na etapa b), o nível ou a presença de um biomarcador adequado, e d) comparar o nível ou a presença do biomarcador determinado na etapa c) com um ou mais valores de referência.
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as vesículas extracelulares TM9SF4-positivas são isoladas por meio de ligação a um anticorpo anti-TM9SF4.
3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma porção das vesículas extracelulares são exossomos.
4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o tumor é selecionado a partir da lista que consiste em câncer de cólon, câncer gástrico, câncer de mama, câncer de pulmão, melanoma, câncer de pâncreas, câncer de ovário, câncer de próstata, tumor do sistema nervoso central ou MPNST.
5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o biomarcador da etapa c) é selecionado a partir da lista de que consiste em proteína CD9, miR-21 ou RNU6.
6. MÉTODO PARA A DETERMINAÇÀO IN VITRO DO ESTADO DE TRANSFORMAÇÀO DE TUMOR em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende: a) fornecer uma amostra biológica obtida a partir daquele indivíduo, b) isolar vesículas extracelulares a partir da dita amostra, em que esta etapa de isolamento de vesículas extracelulares compreende o isolamento de vesículas extracelulares TM9SF4-positivas, c) determinar, a partir das vesículas extracelulares isoladas na etapa b), o nível ou a presença de um biomarcador adequado, e d) comparar o nível ou a presença do biomarcador determinado na etapa c) com um ou mais valores de referência.
7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica da etapa a) é obtida de um indivíduo afetado por um tumor benigno.
8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 7, caracterizado pelo fato de que as vesículas extracelulares TM9SF4-positivas são isoladas por meio de ligação a um anticorpo anti-TM9SF4.
9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma porção das vesículas extracelulares são exossomos.
10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de que o estado de transformação de tumor é a transformação a um MPNST ou a um câncer colorretal.
11. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 10, caracterizado pelo fato de que o biomarcador adequado é selecionado a partir da lista que consiste em proteína CD9, miR-21 ou RNU6.
12. KIT PARA USO NA DETERMINAÇÀO IN VITRO DA PRESENÇA DE UM TUMOR OU UM ESTADO DE TRANSFORMAÇÀO DE TUMOR em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que dito kit compreende um anticorpo anti-TM9SF4.
13. KIT, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um reagente selecionado a partir da lista que consiste em um anticorpo anti-CD9, um primer miR-21 ou um primer RNU6.
14. KIT, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 13, caracterizado pelo fato de que o tumor é selecionado a partir da lista que consiste em de câncer de cólon, câncer gástrico, câncer de mama, câncer de pulmão, melanoma, câncer de pâncreas, câncer de ovário, câncer de próstata, tumor do sistema nervoso central ou MPNST.
15. KIT, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que o estado de transformação de tumor é a transformação a um MPNST ou a um câncer colorretal.
16. KIT, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 15, caracterizado pelo fato de compreende ainda instruções para os parâmetros operacionais adequados na forma de uma etiqueta ou inserção separada.
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EP14171464.2 | 2014-06-06 | ||
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