ES2678049T3 - Anticuerpos monoclonales de unión a mcm5 - Google Patents

Anticuerpos monoclonales de unión a mcm5 Download PDF

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ES2678049T3 ES16727798.7T ES16727798T ES2678049T3 ES 2678049 T3 ES2678049 T3 ES 2678049T3 ES 16727798 T ES16727798 T ES 16727798T ES 2678049 T3 ES2678049 T3 ES 2678049T3
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Abstract

Un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a Mcm5, que se une a un epítopo que tiene una secuencia de aminoácidos de (i) la SEQ ID NO: 2; o (ii) la SEQ ID NO: 1.

Description

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DESCRIPCION
Anticuerpos monoclonales de union a mcm5 Campo de la invencion
La invencion se refiere a anticuerpos monoclonales que se unen a protefnas Mcm, a composiciones o a kits que comprenden los anticuerpos monoclonales, o a metodos de uso de los anticuerpos.
Antecedentes de la invencion
Los canceres urologicos (en ocasiones denominados ‘canceres del aparato urinario') son un problema epidemiologico importante y en aumento continuo. Dos de los canceres urinarios de mayor importancia economica son el cancer de vejiga y el cancer de prostata.
El cancer de prostata es el segundo cancer mas comun en hombres despues del cancer de piel no melanoma, con mas de 35.000 nuevos casos diagnosticados cada ano en el RU; el cancer de prostata provoca aproximadamente 10.200 muertes al ano. Cada ano se producen alrededor de 300.000 casos nuevos en Europa, 190.000 en los Estados Unidos y 670.000 en todo el mundo. Cancer Research UK informa que un cuarto de todos los casos nuevos de cancer diagnosticados en hombres en el RU son canceres de prostata y que el 60 % de los nuevos diagnosticos son en hombres de mas de 70 anos. La forma mas comun de la enfermedad es el adenocarcinoma. La tasa de supervivencia a 5 anos es de casi el 80 % en el RU. No se conoce una causa ambiental, pero las personas con parientes cercanos con cancer de prostata o de mama tienen mas riesgo de desarrollar la enfermedad. Los hombres de Africa Occidental y afrocaribenos tienen un mayor riesgo de cancer de prostata.
Los sfntomas del cancer de prostata son similares a los provocados por la hiperplasia benigna de la prostata e incluyen la necesidad imperiosa de orinar, dificultad o disuria, y rara vez, sangre en la orina o en el semen. Sin embargo, en muchos hombres, la enfermedad permanece asintomatica hasta que se forman metastasis dolorosas, predominantemente en los huesos.
El tratamiento depende del estadio y del grado de malignidad del tumor, y de la salud general y edad del paciente. Las opciones incluyen vigilancia activa, prostatectomfa parcial o radical, orquiectomfa, el tratamiento hormonal y radioterapia, tal como la braquirradioterapia. La orquiectomfa y el tratamiento hormonal reducen o eliminan la produccion de testosterona, que es esencial para el crecimiento tumoral.
El diagnostico definitivo de cancer de prostata precisa un enfoque multifacetico. La prueba de diagnostico de referencia actual para el cancer de prostata es el examen histologico del material de biopsia. La decision de tomar una biopsia esta basada en el nivel serico del APS (antfgeno prostatico especffico) relacionado con la edad y/o en tacto rectal (TR) anomalo. El TR, en el cual se palpa la glandula por via transrectal para examinar la morfologfa anomala, tambien es inespecffico. Los tumores que son demasiado pequenos para alterar la morfologfa de la glandula no se detectaran, y las afecciones benignas tambien provocan una morfologfa o agrandamiento anomalos. Este es un problema en la tecnica. Habitualmente, las muestras de prostata se toman con biopsia de prostata por puncion dirigida por ecograffa transrectal TRUS (forma siglada del ingles transrectal ultrasound, ecograffa transrectal). Se toman varias muestras con aguja gruesa, normalmente hasta 12, para maximizar el area de glandula de la que se toma una muestra. El procedimiento lo lleva a cabo un urologo en el servicio de consultas externas, con anestesia local, con la ayuda de personal de enfermerfa o un auxiliar de clfnica. Este procedimiento tiene inconvenientes, que incluyen ser algo doloroso para el paciente y exponer al paciente a un riesgo de sepsis y/o hemorragia. Las muestras de tejido con aguja gruesa se examinan al microscopio en el laboratorio en cuanto a la presencia de celulas malignas, lo que tiene el problema de ser laborioso y de precisar citologos muy entrenados, ademas de ser susceptible de error humano.
Se puede apreciar que las biopsias son invasivas y costosas. Existe una necesidad en la tecnica de una herramienta mas rentable, fiable y/o no invasiva para el diagnostico y/o vigilancia del cancer urinario, tal como el cancer de prostata. Los procedimientos conocidos de diagnostico alternativos y/o menos invasivos para el cancer de prostata implican el analisis de marcadores biologicos especfficos (‘biomarcadores').
Un ejemplo de un biomarcador de acido nucleico del cancer de prostata es la prueba de PCA3 (gen de cancer de prostata 3). Este ensayo urinario identifica el ARNm no codificante del gen PCA3, que se sobrexpresa en el cancer de prostata (Hessels y Schalken, The use of PCA3 in the diagnosis of prostate cancer. Nat Rev Urol, 6, 255-61; 2009). La prueba PCA3 (Gen-Probe, Inc) se basa en el analisis de una muestra de ensayo de la primera miccion producida despues de una forma definida de masaje prostatico, utilizado para expresar secreciones prostaticas, que contienen celulas epiteliales de la uretra. Como diagnostico del cancer de prostata PCA3 tiene un valor de curva ROC (curva de eficacia diagnostica) de 0,68 (Chun et al, Prostate Cancer Gene 3 (PCA3): development and internal validation of a novel biopsy nomogram. Eur Urol; 2009 vol 56 pag. 659-668), que es similar al de la prueba de PSA analizada a continuacion. Sin embargo, la prueba PCA3 es costosa y no es apta para el uso como analisis de diagnostico inmediato, que son los problemas con esta tecnica de la tecnica anterior.
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Un ejemplo de biomarcador proteico, que se usa con frecuencia para indicar la presencia de cancer de prostata, es el PSA (antfgeno prostatico especffico). A los pacientes sintomaticos que se presentan en atencion primaria generalmente se les realiza una prueba de PSA serica y un TR. Sin embargo, el PSA no es especffico para el cancer de prostata. El PSA es una enzima intracelular especffica de tejido expresada constitutivamente. El PSA esta presente a bajas concentraciones en el suero de hombres con una prostata sana. Un nivel elevado de PSA en suero se produce debido a la filtracion procedente de la prostata y es una indicacion del tamano relativo de la glandula. El PSA elevado puede producirse en afecciones benignas, tales como la hiperplasia prostatica benigna y la prostatitis, y tambien en el cancer de prostata. A medida que los hombres se hacen mayores, el volumen de la glandula aumenta, lo que da como resultado un aumento de los niveles de PSA, en ausencia de neoplasia maligna. En un estudio reciente, se encontro que el 60-70 % de las pruebas de PSA 'positivas' (nivel serico de PSA mayor a 4 ng/ml) no estaban asociadas con cancer (Kilpelainen et al., False-positive screening results in the Finnish prostate cancer screening trial, British Journal of Cancer. 102, 469-474; 2010). La alta tasa de resultados positivos falsos conduce a muchas operaciones de biopsia innecesarias y hace que la prueba sea inapropiada para el cribado poblacional. Ademas, la prueba de PSA no detecta un numero significativo de casos de cancer de prostata, particularmente en hombres mas jovenes. La precision de la prueba de PSA medida en el analisis ROC (curva de eficacia diagnostica) es de 0,678 (Thompson et al., Operating characteristics of a prostate-specific antigen in men with an initial PSA level of 3.0 ng/ml or lower. JAMA, 294, 66-70; 2005). En el RU, Habitualmente, las pruebas de PSA se llevan a cabo en laboratorios de hospitales, aunque estan disponibles analisis de diagnostico inmediato rapidos.
El cancer de vejiga es el cuarto cancer mas comun en los hombres y el noveno cancer mas comun en las mujeres, y da como resultado una morbilidad y mortalidad significativas (Jemal et al. CA Cancer J Clin. 2007. 57:43-66.). La mayorfa de los pacientes con cancer de vejiga reciben el diagnostico despues de presentar hematuria macroscopica o microscopica, o con otros sfntomas de miccion irritativa, tal como la frecuencia y la disuria. En el diagnostico inicial, aproximadamente el 70 % de los pacientes tienen canceres de vejiga que estan restringido al epitelio o al tejido conectivo subepitelial. Estos canceres se pueden tratar con reseccion endoscopica y terapia intravesical. La tasa de recidiva de estos tumores varfa del 50 % al 70 %, y del 10 % al 15 % de los casos progresa a invasion muscular a lo largo de un perfodo de 5 anos (Shariat et al., 2008. Rev Urol. 10:120-135). La recidiva se puede ver de forma local y mas raramente en las vfas urinarias superiores, incluso despues de varios anos, necesitando una vigilancia de por vida. El 30 % restante de los pacientes tiene cancer musculo invasivo en el momento del diagnostico inicial. De esta poblacion, el 50 % tiene metastasis a distancia dentro de los 2 anos y el 60 % muere dentro de los 5 anos, a pesar del tratamiento.
El diagnostico definitivo de cancer de vejiga requiere una combinacion de procedimientos. Actualmente no existen metodos para identificar con precision y facilidad la presencia de cancer de vejiga temprano. El cribado de cancer de vejiga en pacientes que se presentan en el consultorio de urologfa con los sfntomas apropiados se realiza actualmente con analisis de orina, cistoscopia y un procedimiento de exploracion tal como ecograffa abdominal, urograffa intravenosa, tomograffa computarizada o resonancia magnetica. La citologfa de orina, en que se examinan microscopicamente celulas de muestras de orina, se usa de forma ocasional. La cistoscopia, el pilar para la deteccion del cancer de vejiga, es un procedimiento relativamente corto, mfnimamente traumatico, realizado con anestesia local de la uretra, que identifica casi todas las lesiones papilares y sesiles. No obstante, sigue siendo invasivo y una causa de malestar y angustia para el paciente. Ademas, en ocasiones la cistoscopia puede no ser concluyente debido a al aspecto anomalo macroscopico de la mucosa de la vejiga, especialmente en pacientes con una sonda permanente o inflamacion activa, y es incapaz de detectar canceres dentro de los ureteres. Aunque se considera se la considera el diagnostico de referencia del cancer de vejiga debido a que permite la visualizacion directa y la biopsia del urotelio de la vejiga, la cistoscopia tiene una tasa de negativos falsos considerable ya sea por error del tecnico o por las areas pequenas de "carcinoma in situ", que puedes ser diffciles de detectar. (van der Poel y Debruyne. Curr Opin Urol. 2001; 11:503-509; Herr. BJU Int. 1999; 84:1102-1103.)
En la citologfa urinaria para el cancer de vejiga, se pueden investigar celulas exfoliadas en cuanto a la presencia de antfgenos especfficos de la superficie celular, la morfologfa nuclear, expresion genica u otros marcadores biologicos. La citologfa urinaria tiene una alta sensibilidad y especificidad para la deteccion del cancer de vejiga de gran malignidad, pero carece de sensibilidad para detectar tumores de baja malignidad (Wiener et al., Acta Cytol. 1993; 37:163-169). La precision de la citologfa urinaria para predecir la recidiva del cancer de vejiga puede variar ampliamente, en parte debido a que hay un elemento de subjetividad en la interpretacion de los resultados. Por lo tanto, la citologfa no es ideal para cribar y vigilar el cancer de vejiga.
Mcm5 es un biomarcador de cancer (documento WO99021014). Un nivel aumentado de protefnas Mcm, tal como Mcm5, en el sedimento urinario esta asociado con cambios malignos en la prostata. Por lo tanto, los niveles aumentados de estas protefnas Mcm podrfan usarse para detectar el cancer de prostata. Usando el DELFIA® (forma siglada de dissociation-enhanced lanthanide fluorometric immunoassay inmunoensayo fluorometrico de intensificacion disociativa de la fluorescencia por lantanido) y los anticuerpos monoclonales anti Mcm5 4B4 y 12A7 en un doble ensayo de anticuerpos, Dudderidge et al. (BJC, 103, 701 - 707; 2010) investigaron el uso de Mcm5 como un biomarcador urinario para la deteccion del cancer de prostata y concluyeron que 'parece ser un metodo simple, preciso y no invasivo para la identificacion de pacientes con cancer de prostata'. En comparacion con la prueba de PSA, que tiene una especificidad del 30 %, la especificidad de Mcm5 se estimo como de entre el 73 % y
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93 %. Es importante destacar que, la hiperplasia prostatica benigna no genero resultados positivos falsos, lo cual es una desventaja de la prueba de PSA.
Sin embargo, no hay una divulgacion de secuencias de anticuerpos que se unan a Mcm5 de una manera altamente especffica y, por lo tanto, que sean adecuadas para disenar un ensayo de alta afinidad para Mcm5.
Sumario de la invencion
La presente invencion proporciona anticuerpos que se unen a biomarcadores tales como una protefna Mcm, por ejemplo Mcm5, de una manera altamente especffica. Estos anticuerpos son utiles para detectar los niveles del biomarcador. Por ejemplo, estos anticuerpos pueden usarse en pruebas de diagnostico para detectar canceres urologicos.
Actualmente, la deteccion de los canceres urologicos, en particular del cancer de prostata o de vejiga, es diffcil y puede precisar tecnicas invasivas. Mcm5 es un biomarcador de cancer. Los presentes inventores han desarrollado dos anticuerpos que se unen a Mcm5, pero se unen a epftopos distintos entre si (12A7 se une a la SEQ ID NO: 1 y 4B4 se une a la SEQ ID NO: 2). Dichos anticuerpos son ventajosos dado que pueden usarse en ensayos para detectar Mcm5 (o protefnas Mcm similares que contienen estos epftopos). En particular, estos anticuerpos pueden usarse en un ensayo que precisa la inmovilizacion del antfgeno Mcm5. Por ejemplo, Mcm5 podrfa detectarse usando un ensayo inmunometrico con dos sitios. Podrfa unirse a una placa un primer anticuerpo que se une a Mcm5. Esta placa podrfa exponerse a una muestra, tal como una muestra de orina. Cualquier Mcm5 en la muestra sera inmovilizada ("capturado") por el primer anticuerpo. Despues, la placa puede lavarse, dejando el Mcm5 inmovilizada unida al primer anticuerpo, pero eliminando cualquier otro contaminante. Puede usarse un segundo anticuerpo que se une a Mcm5 para detectar la concentracion de Mcm5 unida. Este segundo anticuerpo debe estar conjugado con un agente de deteccion, tal como Eu3+. La placa puede exponerse al segundo anticuerpo y el segundo anticuerpo se unira a Mcm5 inmovilizada. Cualquier exceso de anticuerpo puede eliminarse mediante lavado. La cantidad restante de segundo anticuerpo se puede detectar mediante cuantificacion de fluorescencia, que medira la cantidad de Eu3+ presente. La cantidad restante de segundo anticuerpo sera proporcional a la concentracion de Mcm5 en la muestra.
Sin embargo, para que desarrollar tal ensayo, deben identificarse dos anticuerpos que se unan a Mcm5. Adicionalmente, estos dos anticuerpos deben unirse a epftopos distintos entre sf, pero ademas los dos epftopos distintos a los que se unen los dos anticuerpos deben estar ubicados desde el punto de vista espacial de forma que ambos anticuerpos puedan unirse a Mcm5 al mismo tiempo (sin impedimento esterico sustancial). Los presentes inventores han desarrollado dos de tales anticuerpos (llamados 12A7 y 4B4). Estos dos anticuerpos se unen a la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, respectivamente. La SEQ ID NO: 1 y la sEq ID NO: 2 representan dos epftopos de Mcm5 distintos que estan dispuestos de forma espacial en Mcm5 como para permitir que los dos anticuerpos se unan a Mcm5 al mismo tiempo. Esto se demuestra en los Ejemplos 2 y 3. Los presentes inventores son los primeros en identificar dos epftopos de Mcm5 que estan dispuestos de forma que los anticuerpos para cada epftopo puedan unirse simultaneamente. Adicionalmente, los inventores son los primeros en proporcionar secuencias de dos anticuerpos que pueden unirse independientemente a Mcm5.
Por consiguiente, en un primer aspecto de la invencion se proporciona un anticuerpo que:
(i) se une a un epftopo que tiene una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1 o 2; o
(ii) comprende:
a.

la CDRH1 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 9;

la CDRH2 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 11;

la CDRH3 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 13;

la CDRL1 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 3;
la CDRL2 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 5; y la CDRL3 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 7; o
b.
la CDRH1 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 21;
la CDRH2 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 23;
la CDRH3 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 25;
la CDRL1 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 15;
la CDRL2 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 17; y la CDRL3 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 19.
En un segundo aspecto de la invencion, se proporciona una composicion que comprende el anticuerpo de la invencion.
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En un tercer aspecto de la invencion, se proporciona una linea celular de hibridoma que tiene la capacidad de producir el anticuerpo de la invencion.
En un cuarto aspecto de la invencion, se proporciona una composicion que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido que comprende la cadena pesada de un anticuerpo de la invencion y una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido que comprende la cadena ligera de un anticuerpo de la invencion.
En un quinto aspecto de la invencion, se proporciona una composicion que comprende una secuencia de acido nucleico al menos el 98 %, 99 % o 100 % identica a 28 o 32, y una secuencia de acido nucleico al menos el 98 %, 99 % o 100 % identica a la SEQ ID NO: 30 o 34.
En un sexto aspecto de la invencion, se proporciona una composicion que comprende una secuencia de acido nucleico de la SEQ ID NO: 28 o 32, y una secuencia de acido nucleico de la SEQ ID NO: 30 o 34.
En un septimo aspecto de la invencion, se proporciona un vector que comprende un acido nucleico de la invencion.
En un octavo aspecto de la invencion, se proporciona una celula hospedadora que comprende un acido nucleico o vector de la invencion.
En un noveno aspecto de la invencion, se proporciona un metodo para fabricar un anticuerpo, que comprende:
(i) cultivar una linea celular de hibridoma o una celula hospedadora de la invencion; y
(ii) aislar un anticuerpo de la linea celular de hibridoma o de la celula hospedadora.
En un decimo aspecto de la invencion, se proporciona un kit que comprende:
(i) una composicion que comprende un primer anticuerpo de la invencion; y
(ii) una composicion que comprende un segundo anticuerpo que se une a Mcm5.
En un undecimo aspecto de la invencion, se proporciona un kit que comprende:
(i) una composicion que comprende un primer anticuerpo de la invencion; y
(ii) una composicion que comprende un segundo anticuerpo de la invencion.
En un duodecimo aspecto de la invencion, se proporciona un metodo para determinar la concentracion de Mcm5 en una muestra, que comprende las siguientes etapas:
(i) proporcionar un primer anticuerpo inmovilizado, que es un anticuerpo de la invencion inmovilizado en un soporte solido;
(ii) exponer la muestra al primer anticuerpo inmovilizado, de forma que la Mcm5 en la muestra se pueda unir al anticuerpo inmovilizado para proporcionar la Mcm5 inmovilizada;
(iii) proporcionar un segundo anticuerpo marcado, que es un anticuerpo de la invencion conjugado con un marcador;
(iv) exponer la Mcm5 inmovilizada al segundo anticuerpo marcado, de forma que el segundo anticuerpo marcado se pueda unir a la Mcm5; y
(v) detectar la concentracion del segundo anticuerpo marcado.
Descripcion detallada
Anticuerpo
La presente invencion proporciona un anticuerpo. El termino 'anticuerpo' puede referirse a formas de origen natural o a anticuerpos recombinantes tales como anticuerpos monocatenarios, anticuerpos quimericos o anticuerpos humanizados. Puede considerarse que los terminos ‘anticuerpo’ y ‘anticuerpos’ tambien abarcan fragmentos de anticuerpos que pueden unirse a una protefna diana, tal como una protefna Mcm como Mcm5. Dichos fragmentos pueden incluir un Fab'2, un F'(ab)2, un Fv, anticuerpos monocatenarios o diacuerpos. En una realizacion preferente, los anticuerpos de la invencion son de origen natural, anticuerpos de longitud completa (en lugar de fragmentos). En una realizacion preferente, el anticuerpo es un anticuerpo de raton (es decir, obtenido originalmente de celulas de bazo de raton).
En general, los anticuerpos estan formados por dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Cada cadena pesada esta compuesta por una region constante de la cadena pesada (CH) y una region variable de la cadena pesada (VH). De forma similar, cada cadena ligera esta compuesta por una region constante de la cadena ligera (CL) y una region variable de la cadena ligera (VL). Las regiones VH y VL comprenden regiones que definen la complementariedad (CDR). Las CDR principalmente son responsables de la union especffica a la protefna diana.
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Un anticuerpo de la invencion puede ser un anticuerpo de cualquier clase, en particular una IgG, IgM o IgA. En una realizacion preferente, el anticuerpo es un anticuerpo IgG.
La expresion "anticuerpo monoclonal" pretende referirse a un anticuerpo que se obtiene a partir de una poblacion de anticuerpos sustancialmente similares, es decir, a partir de una poblacion de anticuerpos que son identicos, excepto por una minorfa de variantes naturales. Una poblacion de anticuerpos monoclonales se unira al mismo epftopo. Los anticuerpos monoclonales se pueden producir mediante una diversidad de tecnicas bien conocidas por el experto en la materia y que incluyen los metodos divulgados en "Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988) y en "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Application", SG Hurrell (CRC Press, 1982). El anticuerpo de la invencion es un anticuerpo monoclonal.
Diana del anticuerpo
El anticuerpo se une especfficamente a Mcm5. El anticuerpo se une a al menos una de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2. El anticuerpo se une especfficamente a al menos una de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2.
Mcm5 es un supuesto factor permisivo de la replicacion de ADN y un miembro de la familia de protefnas MCM (mantenimiento de minicromosomas). Las protefnas MCM se unen a la cromatina y se cree que presentan actividad helicasa y, por lo tanto, son componentes centrales de la replicacion del ADN. Mcm5 esta regulada al alza en la transicion de la fase G0 a G1/S del ciclo celular y puede participar activamente en la regulacion del ciclo celular; Mcm5 puede interactuar con al menos otros dos miembros de la familia MCM.
Las protefnas MCM 2 - 7 comprenden parte de los complejos de prerreplicacion que se forman en la cromatina y que son requisitos previos esenciales, o factores permisivos, para la posterior replicacion del ADN. Los complejos de protefnas MCM actuan como helicasas replicativas y, por lo tanto, son componentes centrales de la maquinaria de replicacion del ADN. Las MCM estan reguladas al alza en la transicion de la fase G0 a G1/S del ciclo celular y participan activamente en la regulacion del ciclo celular. Las protefnas MCM forman una estructura anular alrededor de la cromatina.
El gen de Mcm5 humana mapea en 22q13.1 y la protefna Mcm5 madura consiste en 734 aminoacidos (SEQ ID NO: 35; UNIPROT P33992: factor permisivo de replicacion MCM5, ADN HUMANO). Sin embargo, las secuencias del gen Mcm5 puede diferir ligeramente en entre individuos. Por este motivo, la frase "se une a Mcm5" se refiere a anticuerpos que se unen a la SEQ ID NO: 35, pero tambien a anticuerpos que se unen a un polipeptido que tiene secuencias de al menos el 90 %, 95 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a la SEQ ID NO: 35. En una realizacion preferente, el anticuerpo se une a un polipeptido el 100 % identico a la SEQ ID NO: 35. Adicionalmente, un anticuerpo de la invencion se unira a un epftopo (fragmento) de Mcm5 (por ejemplo, la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2). Por lo tanto, la expresion "anticuerpo que se une a Mcm5" se refiere a un anticuerpo que se une a un unico epftopo de Mcm5, tal como la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2.
Para los fines de la presente invencion, la expresion 'afinidad de union’ se refiere a la capacidad de un anticuerpo de unirse a su diana. Para los fines de la presente invencion, la expresion 'se une especfficamente’ se refiere a un anticuerpo que se une a una diana, tal como Mcm5, con una afinidad de union que es al menos 2 veces, 10 veces, 50 veces o 100 veces mayor que su afinidad de union por la union a otra molecula no diana. En una realizacion, la molecula no diana es una protefna Mcm, distinta de Mcm5, tal como Mcm 2. Preferentemente, un anticuerpo de la invencion tiene la capacidad de unirse a una protefna Mcm, de forma opcional a Mcm5, con una afinidad de union que es al menos 2 veces, 10 veces, 50 veces o 100 veces mayor que su afinidad de union por la union a otra molecula no diana. Incluso mas preferentemente, un anticuerpo de la invencion tiene la capacidad de unirse a la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2 con una afinidad de union que es al menos 2 veces, 10 veces, 50 veces o 100 veces mayor que su afinidad de union por la union a otra molecula no diana.
Un metodo preferente para la evaluacion de la afinidad de union para Mcm5 es mediante ELISA. Preferentemente, un anticuerpo de la invencion tiene una afinidad por Mcm5 (medida como una CE50 o el 50 % de la concentracion de union maxima, como se describe en el Ejemplo 2) de 2500 ng/ml o menor, 1500 ng/ml o menor, 1000 ng/ml o menor, 600 ng/ml o menor, 50 ng/ml o menor, 30 ng/ml o menor, 20 ng/ml o menos, o 10 ng/ml o menor. La CE50 normalmente sera superior a 1 ng/ml y, por lo tanto, la CE50 puede estar entre 1 ng/ml y cualquiera de los lfmites superiores especificados en la oracion precedente. Se conocen en la tecnica otros ensayos convencionales para evaluar la capacidad de union de ligandos, tales como anticuerpos para con sus dianas, incluyendo, por ejemplo, transferencia de Western, los RIA y los analisis por citometrfa de flujo. La cinetica de union (por ejemplo, la afinidad de union) del anticuerpo tambien se puede evaluar mediante ensayos convencionales conocidos en la tecnica, tal como mediante analisis de resonancia de plasmon superficial (RPS) (por ejemplo, sistema Biacore ™). La constante de afinidad (KD) para la union a Mcm5 esta preferentemente en el intervalo de 1-10 000 nM, 1-1000 nM, 1-500 nM, 1-100 nM, 1-50 nM o 1-10 nM. La constante de asociacion (ka) esta preferentemente en el intervalo de 0,4-3,4 x 106 1/M. La constante de disociacion (kd) esta preferentemente en el intervalo de 1-10 x 10-3 1/s. Normalmente, estos valores pueden determinarse por RPS (resonancia de plasmon superficial).
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Regiones determinantes de complementariedad (las CDR)
Un anticuerpo de la invencion comprende las CDR de los anticuerpos 12A7 o 4B4, es decir:
a. la CDRH1 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 9;
b. la CDRH2 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 11;
c. la CDRH3 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 13;
d. la CDRL1 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 3;
e. la CDRL2 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 5; y
f. la CDRL3 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 7; o
g. la CDRH1 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 21;
h. la CDRH2 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 23;
i. la CDRH3 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 25;
j. la CDRL1 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 15;
k. la CDRL2 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 17; y
l. la CDRL3 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 19.
Los anticuerpos que tienen las mismas CDR que los anticuerpos 4B4 y 12A7 pueden diferir sustancialmente de las secuencias de 4B4 y 12A7 en otras regiones. Dichos anticuerpos pueden, por ejemplo, ser fragmentos de anticuerpos.
La frase "secuencia que difiere de la SEQ ID NO: 3 en una unica sustitucion de aminoacido" se refiere a la posibilidad de reemplazar un aminoacido definido en la SEQ ID NO: 3 por un aminoacido distinto. Preferentemente, tal reemplazo es una sustitucion conservativa de aminoacidos. Los siguientes ocho grupos contienen cada uno aminoacidos que son sustituciones normalmente conservativas entre si:
1) Alanina, Glicina;
2) Acido aspartico, Acido glutamico;
3) Asparagina, Glutamina;
4) Arginina, Lisina;
5) Isoleucina, Leucina, Metionina, Valina;
6) Fenilalanina, Tirosina, Triptofano;
7) Serina, Treonina; y
8) Cistefna, Metionina.
En una divulgacion, el anticuerpo de la invencion comprende al menos una CDR de la cadena pesada de 12A7 (la CDRH1 de 12A7, la CDRH2 de 12A7 o la CDRH3 de 12A7), asf como al menos una CDR de la cadena ligera de 12A7 (la CDRL1 de 12A7, la CDRL2 de 12A7 o la CDRL3 de 12A7). En una divulgacion adicional, el anticuerpo de la invencion comprende al menos dos CDR de la cadena pesada de 12A7 y al menos dos CDR de la cadena ligera de 12A7. En una divulgacion, el anticuerpo de la invencion comprende las tres CDR de la cadena pesada de 12A7 y/o las tres CDR de la cadena ligera de 12A7. En una divulgacion el anticuerpo de la invencion comprende la CDRL1 de 12A7 y la CDRL2 de 12A7, la CDRL1 de 12A7 y la CDRL3 de 12A7, la CDRL1 de 12A7 y la CDRH1 de 12A7, la CDRL1 de 12A7 y la CDRH2 de 12A7, la CDRL1 de 12A7 y la CDRH3 de 12A7, la CDRL2 de 12A7 y la CDRL3 de 12A7, la CDRL2 de 12A7 y la CDRH1 de 12A7, la CDRL2 de 12A7 y la CDRH2 de 12A7, la CDRL2 de 12A7 y la CDRH3 de 12A7, la CDRL3 de 12A7 y la CDRH1 de 12A7, la CDRL3 de 12A7 y la CDRH2 de 12A7, la CDRL3 de 12A7 y la CDRH3 de 12A7, la CDRH1 de 12A7 y la CDRH2 de 12A7, la CDRH1 de 12A7 y la CDRH3 de 12A7, o la CDRH2 de 12A7 y la CDRH3 de 12A7.
En una divulgacion, el anticuerpo de la invencion comprende al menos una CDR de la cadena pesada de 4B4 (la CDRH1 de 4B4, la CDRH2 de 4B4 o la CDRH3 de 4B4), asf como al menos una CDR de la cadena ligera de 4B4 (la CDRL1 de 4B4, la CDRL2 de 4B4 o la CDRL3 de 4B4). En una divulgacion adicional, el anticuerpo de la invencion comprende al menos dos CDR de la cadena pesada de 4B4 y al menos dos CDR de la cadena ligera de 4B4. En una divulgacion, el anticuerpo de la invencion comprende las tres CDR de la cadena pesada de 4B4 y/o las tres CDR de la cadena ligera de 4B4. En una divulgacion el anticuerpo de la invencion comprende la CDRL1 de 4B4 y la CDRL2 de 4B4, la CDRL1 de 4B4 y la CDRL3 de 4B4, la CDRL1 de 4B4 y la CDRH1 de 4B4, la CDRL1 de 4B4 y la

CDRH2 de 4B4, la CDRL1 de 4B4 y la CDRH3 de 4B4, la CDRL2 de 4B4 y la CDRL3 de 4B4, la CDRL2 de 4B4 y la

CDRH1 de 4B4, la CDRL2 de 4B4 y la CDRH2 de 4B4, la CDRL2 de 4B4 y la CDRH3 de 4B4, la CDRL3 de 4B4 y la

CDRH1 de 4B4, la CDRL3 de 4B4 y la CDRH2 de 4B4, la CDRL3 de 4B4 y la CDRH3 de 4B4, la CDRH1 de 4B4 y la
CDRH2 de 4B4, la CDRH1 de 4B4 y la CDRH3 de 4B4, o la CDRH2 de 4B4 y la CDRH3 de 4B4.
En una divulgacion, el anticuerpo de la invencion comprende al menos una CDR que tiene una secuencia identica a la descrita en una cualquiera de la SEQ ID NO: 3 (CDRL1 de 12A7), la SEQ ID NO:5 (12A7 CDRL2), la SEQ ID NO: 7 (CDRL3 de 12A7), la SEQ ID NO: 9 (CDRH1 de 12A7), la SEQ ID NO: 11 (CDRH2 de 12A7), la SEQ ID NO: 13 (CDR H3 de 12A7), la SEQ ID NO: 15 (CDRL1 de 4B4), la SEQ ID NO: 17 (CDRL2 de 4B4), la SEQ ID NO: 19 (CDRL3 de 4B4), la SEQ ID NO: 21 (CDRH1 de 4B4), la SEQ ID NO: 23 (CDRH2 de 4B4) o la SEQ ID NO:25 (CDRH3 de 4B4). Cuando un anticuerpo de la invencion comprende la CDRl2 de 12A7, la CDRL2 de 12A7 tiene la
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secuencia descrita en la SEQ ID NO: 5. Cuando un anticuerpo de la invencion comprende la CDRL1 de 12A7, la CDRL1 de 12A7 tiene la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 3. Cuando un anticuerpo de la invencion comprende la CDRL3 de 12A7, la CDRL3 de 12A7 tiene la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 7. Cuando un anticuerpo de la invencion comprende la CDRH1 de 12A7, la CDRH1 de 12A7 tiene la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 9. Cuando un anticuerpo de la invencion comprende la CDRH2 de 12A7, la CDRH2 de 12A7 tiene la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 11. Cuando un anticuerpo de la invencion comprende la CDRH3 de 12A7, la CDRH3 de 12A7 tiene la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 13. Cuando un anticuerpo de la invencion comprende la CDRL1 de 4B4, la CDRL1 de 4B4 tiene la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 15. Cuando un anticuerpo de la invencion comprende la CDRL2 de 4B4, la CDRL2 de 4B4 tiene la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 17. Cuando un anticuerpo de la invencion comprende la CDRL3 de 4B4, la CDRL3 de 4B4 tiene la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 19. Cuando un anticuerpo de la invencion comprende la CDRH1 de 4B4, la CDRH1 de 4B4 tiene la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 21. Cuando un anticuerpo de la invencion comprende la CDRH2 de 4B4, la CDRH2 de 4B4 tiene la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 23. Cuando un anticuerpo de la invencion comprende la CDRH3 de 4B4, la CDRH3 de 4B4 tiene la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 25.
Preferentemente, un anticuerpo que comprende al menos una de las CDR de 12A7 o de 4B4 se une (de forma opcional se une especfficamente) a Mcm5. Aun mas preferentemente, un anticuerpo que comprende al menos una de las CDR de 12A7 o de 4B4 se une (de forma opcional se une especfficamente) a la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2.
Secuencias de la region variable de las cadenas pesada y ligera
El anticuerpo de la invencion comprende preferentemente una region variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a la SEQ ID NO: 29 o 33 y/o una secuencia de la region variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a la SEQ ID NO: 27 o 31. Dicho anticuerpo se denomina en el presente documento "anticuerpo variante de la invencion".
En una realizacion, el anticuerpo comprende una region variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 95 % identica a la SEQ ID NO: 29. En una realizacion adicional, el anticuerpo comprende una region variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 98% identica a la SEQ ID NO: 29. En una realizacion, el anticuerpo comprende una region variable de la cadena ligera que tiene una secuencia al menos el 95 % identica a la SEQ ID NO: 27. En una realizacion adicional, el anticuerpo comprende una region variable de la cadena ligera que tiene una secuencia al menos el 98% identica a la SEQ ID NO: 27. En una realizacion adicional, el anticuerpo comprende una region variable de la cadena ligera que tiene una secuencia al menos el 95% identica a la SEQ ID NO: 27 y una region variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 95 % identica a la SEQ ID NO: 29. En una realizacion preferente, el anticuerpo comprende una region variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 98 % identica a la SEQ ID NO: 29 y una region variable de la cadena ligera que tiene una secuencia al menos el 98% identica a la SEQ ID NO: 27.
En una realizacion adicional, el anticuerpo comprende una region variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 95% identica a la SEQ ID NO: 33. En una realizacion adicional, el anticuerpo comprende una region variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 98% identica a la SEQ ID NO: 33. En una realizacion adicional, el anticuerpo comprende una region variable de la cadena ligera que tiene una secuencia al menos el 95% identica a la SEQ ID NO: 31. En una realizacion adicional, el anticuerpo comprende una region variable de la cadena ligera que tiene una secuencia al menos el 98% identica a la SEQ ID NO: 31. En una realizacion adicional, el anticuerpo tiene una region variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 95 % identica a la SEQ ID NO: 33 y una region variable de la cadena ligera que tiene una secuencia al menos el 95% identica a la SEQ ID NO: 31. En una realizacion preferente, el anticuerpo tiene una region variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 98 % identica a la SEQ ID NO: 33 y una region variable de la cadena ligera que tiene una secuencia al menos el 98% identica a la SEQ ID NO: 31.
Como saben los expertos en la materia, los anticuerpos contienen multiples regiones, que incluyen las regiones marco conservadas. Es poco probable que la delecion o adicion de aminoacidos en las regiones marco conservadas afecte la capacidad del anticuerpo para unirse a su diana. Por otro lado, es considerablemente mas probable que las mutaciones en las CDR afecten la capacidad de un anticuerpo de unirse a una diana. Por lo tanto, los anticuerpos variantes se unen a un epftopo que tiene una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1 o 2, o tienen CDR que son identicas a las CDR de los anticuerpos 12A7 o 4B4. Los anticuerpos variantes de la invencion pueden tener regiones marco conservadas que difieren en secuencia de forma bastante significativa de las descritas en la SEQ ID NO: 27, 29, 31 o 33. Cuando un anticuerpo de la invencion comprende una region variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a la SEQ ID NO: 29, el anticuerpo comprende adicionalmente la CDRH1 de 12A7, la CDRH2 de 12A7 y la CDRH3 de 12A7. Un experto en la materia entiende que, dado que la especificidad de union a la diana esta determinada por las CDR, un anticuerpo que comprende las CDR de 12A7 aun puede unirse a Mcm5 incluso si el resto de la secuencia del anticuerpo es bastante variable. Por este motivo, cuando el anticuerpo comprende la CDRH1 de 12A7, la CDRH2 de 12A7 y la CDRH3 de 12A7, el anticuerpo comprende preferentemente una region variable de la cadena pesada que tiene una
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secuencia al menos el 90 % identica a la SEQ ID NO: 29. En una realizacion mas preferente, el anticuerpo de la invencion comprende la CDRH1 de 12A7, la CDRH2 de 12A7 y la CDRH3 de 12a7, y comprende una region variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 95 % identica a la SEQ ID NO: 29.
Cuando un anticuerpo de la invencion comprende una region variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a la SEQ ID nO: 33, el anticuerpo comprende adicionalmente la CDRH1 de 4B4, la CDRH2 de 4B4 y la CDRH3 de 4B4. Un experto en la materia entiende que, dado que la especificidad de union a la diana esta determinada por las CDR, un anticuerpo que comprende las CDR de 4B4 aun puede unirse a Mcm5 incluso si el resto de la secuencia del anticuerpo es bastante variable. Por este motivo, cuando el anticuerpo comprende la CDRH1 de 4B4, la CDRH2 de 4B4 y la CDRH3 de 4B4, el anticuerpo comprende preferentemente una region variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 90 % identica a la SEQ ID NO: 33. En una realizacion mas preferente, el anticuerpo de la invencion comprende la CDRH1 de 4B4, la CDRH2 de 4B4 y la CDRH3 de 4B4, y comprende una region variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 95 % identica a la SEQ ID NO: 33.
Cuando un anticuerpo de la invencion comprende una region variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a la SEQ ID NO: 27, el anticuerpo comprende adicionalmente la CDRL1 de 12A7, la CDRL2 de 12A7 y la CDRL3 de 12A7. Un experto en la materia entiende que, dado que la especificidad de union a la diana esta determinada por las CDR, un anticuerpo que comprende las CDR de 12A7 aun puede unirse a Mcm5 incluso si el resto de la secuencia del anticuerpo es bastante variable. Por este motivo, cuando el anticuerpo comprende la CDRL1 de 12A7, la CDRL2 de 12A7 y la CDRL3 de 12A7, el anticuerpo comprende preferentemente una region variable de la cadena ligera que tiene una secuencia al menos el 90 % identica a la SEQ ID NO: 27. En una realizacion mas preferente, el anticuerpo de la invencion comprende la CDRL1 de 12A7, la CDRL2 de 12A7 y la CDRL3 de 12A7, y comprende una region variable de la cadena ligera que tiene una secuencia al menos el 95 % identica a la SEQ ID NO: 27.
Cuando un anticuerpo de la invencion comprende una region variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a la SEQ ID NO: 31, el anticuerpo comprende adicionalmente la CDRL1 de 4B4, la CDRL2 de 4B4 y la CDRL3 de 4B4. Un experto en la materia entiende que, dado que la especificidad de union a la diana esta determinada por las CDR, un anticuerpo que comprende las CDR de 4B4 aun puede unirse a Mcm5 incluso si el resto de la secuencia del anticuerpo es bastante variable. Por este motivo, cuando el anticuerpo comprende la CDRL1 de 4B4, la CDRL2 de 4B4 y la CDRL3 de 4B4, el anticuerpo comprende preferentemente una region variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 90 % identica a la SEQ ID NO: 31. En una realizacion mas preferente, el anticuerpo de la invencion comprende la CDRL1 de 4B4, la CDRL2 de 4B4 y la CDRL3 de 4B4, y comprende una region variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 95 % identica a la SEQ ID NO: 31.
En una realizacion adicional de la invencion, el anticuerpo de la invencion comprende:
(i) la CDRH1 de 12A7, la CDRH2 de 12A7 y la CDRH3 de 12A7;
(ii) una region variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 95 % identica a la SEQ ID NO:
29;
(iii) la CDRL1 de 12A7, la CDRL2 de 12A7 y la CDRL3 de 12A7; y
(iv) una region variable de la cadena ligera que tiene una secuencia al menos el 95 % identica a la SEQ ID NO:
27.
En una realizacion adicional, el anticuerpo de la invencion comprende:
(i) la CDRH1 de 4B4, la CDRH2 de 4B4 y la CDRH3 de 4B4;
(ii) una region variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 95 % identica a la SEQ ID NO:
33;
(iii) la CDRL1 de 4B4, la CDRL2 de 4B4 y la CDRL3 de 4B4; y
(iv) una region variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 95 % identica a la SEQ ID NO:
31.
Un anticuerpo que tiene una secuencia variable de la cadena pesada identica a la SEQ ID NO: 29 y una secuencia variable de la cadena ligera identica a la SEQ ID NO: 27, puede denominarse anticuerpo 12A7. Un anticuerpo que tiene una secuencia variable de la cadena pesada identica a la SEQ ID NO: 33 y una secuencia variable de la cadena ligera identica a la SEQ ID NO: 31, puede denominarse un anticuerpo 4B4.
En algunas realizaciones, el anticuerpo variante de la invencion competira por la union a Mcm5 con el anticuerpo 12A7. De manera similar, en algunas realizaciones de la invencion, el anticuerpo variante de la invencion competira por la union a Mcm5 con el anticuerpo 4B4. Para los fines de la presente invencion, un anticuerpo es 'al menos el 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % identico’ a un segundo anticuerpo si las secuencias tienen al menos el 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad cuando se evalua usando ClustalW (Thompson et al., 1994) con los siguientes parametros:
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Parametros de alineacion por pares -Metodo: preciso, Matriz: PAM, Penalizacion de apertura de hueco: 10,00, Penalizacion de extension de hueco: 0,10;
Parametros de alineacion multiple -Matriz: PAM, Penalizacion de apertura de hueco: 10,00, identidad % para retraso: 30, Penalizar huecos finales: en funcionamiento, Distancia de separacion de huecos: 0, Matriz negativa: no, Penalizacion de extension de hueco: 0,20, Penalizaciones de huecos especfficas de restos: en funcionamiento, Penalizaciones de huecos hidrofilos: en funcionamiento, Restos hidrofilos: GPSNDQEKR.
Es parte del conocimiento de la persona experta en la materia como fabricar anticuerpos variantes que se unen a Mcm5. Dichos anticuerpos variantes pueden comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50 o 100 mutaciones de sustitucion o delecion, en comparacion con las SEQ ID NO: 27, 29, 31 o 33. Los anticuerpos variantes de 'deiecidn' pueden comprender la delecion de 1, 2, 3, 4, 5 o mas aminoacidos o, en algunos casos, la delecion de regiones completas de las SEQ ID NO: 27, 29, 31 o 33. Las variantes de 'sustitucion' pueden comprender el reemplazo de 1,2, 3, 4, 5 o mas aminoacidos por el mismo numero de aminoacidos nuevos.
Preferentemente, los anticuerpos variantes comprenden secuencias que difieren de las SEQ ID NO: 27, 29, 31 o 33 en sustituciones de aminoacidos conservativas (de forma opcional solo en sustituciones de aminoacidos conservativas). El experto en la materia es consciente de que es poco probable que tales sustituciones conservativas modifiquen las propiedades de union de un anticuerpo.
Anticuerpos que compiten con los anticuerpos de la invencion
La divulgacion proporciona adicionalmente un anticuerpo que compite con un anticuerpo de la invencion que:
(i) se une a un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1 o 2.
(ii) comprende al menos una CDR seleccionada del grupo que consiste en: la CDRH1 de 12A7, la CDRH2 de 12A7, la CDRH3 de 12A7, la CDRL1 de 12A7, la CDRL2 de 12A7 y la CDRL3 de 12A7, o la CDRH1 de 4B4, la CDRH2 de 4B4, la CDRH3 de 4B4, la CDRL1 de 4B4, la CDRL2 de 4B4 y la CDRL3 de 4B4.
Preferentemente, la divulgacion proporciona un anticuerpo que compite con un anticuerpo que comprende la CDRH1 de 12A7, la CDRH2 de 12A7, la CDRH3 de 12A7, la CDRL1 de 12A7, la CDRL2 de 12A7 y la CDRL3 de 12A7, o un anticuerpo que comprende la CDRH1 de 4B4, la CDRH2 de 4B4, la CDRH3 de 4B4, la CDRL1 de 4B4, la CDRL2 de 4B4 y la CDRL3 de 4B4. Incluso mas preferentemente, la divulgacion proporciona un anticuerpo que compite con un anticuerpo que comprende una region variable de la cadena pesada que tiene una secuencia el 100 % identica a la SEQ ID NO: 29 o 33, y una region variable de la cadena ligera que tiene una secuencia el 100 % identica a la SEQ ID NO: 27 o 31. La divulgacion proporciona un anticuerpo que compite con el anticuerpo 12A7 o con el anticuerpo 4B4.
Esta dentro de las competencias de los expertos en la materia determinar si un anticuerpo compite con otro anticuerpo de la invencion.
Por ejemplo, se puede realizar un ensayo de ELISA inmovilizando el anticuerpo de referencia, tal como un anticuerpo 4B4 o 12A7, en una placa ELISA. Despues, la placa se bloquea con un agente bloqueante adecuado. Se anade un exceso de un segundo anticuerpo (el segundo anticuerpo es el anticuerpo cuya capacidad para competir con el anticuerpo 4B4 o 12A7 se evaluara, por ejemplo un anticuerpo de la invencion que compite con 4B4 o 12A7). Se anade Mcm5.
Despues de un perfodo de incubacion adecuado, la placa ELISA se lava y se anade un agente de deteccion de Mcm5 para medir la cantidad de Mcm5 unida al anticuerpo de referencia inmovilizado. Si esta prueba se va a utilizar para detectar si un anticuerpo compite con 4B4, un reactivo de deteccion adecuado es un anticuerpo 12A7 marcado. De forma similar, si esta prueba se va a utilizar para detectar si un anticuerpo compite con 12A7, un reactivo de deteccion adecuado es un anticuerpo 4B4 marcado. La concentracion a la que se produce el 50 % de inhibicion se conoce como Ki. Un anticuerpo que compite con 12A7 o 4B4 puede unirse con una Ki 2 veces, 5 veces, 10 veces, 50 veces o 100 veces mas baja que un anticuerpo que no se une a Mcm5.
Un anticuerpo que compite con un anticuerpo de la invencion puede ser un anticuerpo que se une al mismo epftopo (por ejemplo, la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2). Es posible determinar a que epftopo se une un anticuerpo realizando un experimento en que la protefna diana, tal como Mcm5, se digiere para dar fragmentos (por ejemplo, ver el Ejemplo 3 a continuacion). Despues puede determinarse la afinidad con la que los anticuerpos 12A7 y 4B4 se unen a cada uno de los fragmentos. Una vez que se ha determinado el fragmento (que representa el epftopo) al que el primer anticuerpo se une con una afinidad razonable, el epftopo puede sintetizarse. Despues, es posible determinar si un segundo anticuerpo tiene la capacidad de unirse al mismo epftopo midiendo la afinidad de union de ese segundo anticuerpo al fragmento.
Anticuerpos marcados
Un anticuerpo de la invencion se puede conjugar con un marcador (por ejemplo, Europio3+ o peroxidasa de rabano
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picante). El marcador puede unirse directamente o puede unirse a traves de un enlazador (tal como acido adfpico dihidrazida (ADH por sus siglas en ingles: adipic acid dihydrazide)).
El marcador se puede unir por conjugacion qufmica. Se conocen en la tecnica metodos de conjugacion de marcadores con anticuerpos. Por ejemplo, la conjugacion de carbodiimida (Bauminger y Wilchek (1980) Methods Enzymol. 70, 151-159) se pueden usar para conjugar marcadores a anticuerpos. Ademas, se pueden usar otros metodos para conjugar un marcador con un anticuerpo. Por ejemplo, se puede usar la oxidacion con peryodato de sodio seguida de alquilacion reductora de reactivos apropiados, al igual que la reticulacion con glutaraldehfdo. Sin embargo, se reconoce que, independientemente de que metodo de produccion de un conjugado de la invencion se seleccione, debe hacerse una determinacion de que el anticuerpo conjugado mantiene su capacidad de direccionamiento y de que el marcador conjugado mantiene su funcion.
En una realizacion preferente, el anticuerpo de la invencion se marca por conjugacion con Europio. Esto se puede lograr utilizando un kit de marcaje con Eu DELFIA(R) de EG&G Wallac y siguiendo el protocolo del fabricante.
Composiciones
En aspectos adicionales de la invencion, se proporcionan composiciones que comprenden un anticuerpo de la invencion. Dichas composiciones pueden comprender adicionalmente agentes estabilizadores adecuados que tengan la capacidad de estabilizar el anticuerpo en solucion. Por ejemplo, la composicion puede comprender un tampon seleccionado del grupo que consiste en TAPS (acido 3-{[tris(hidroximetil)metil]amino} propanosulfonico), Bicina (N,N-bis(2-hidroxietil)glicina), Tris (tris(hidroximetil)metilamina), Tricina (N-tris(hidroximetil(metilglicina), TAPSO (3-[acido N-Tris(acido hidroximetil)metilamino]-2-hidroxipropanosulfonico), HEPES (acido 4-2-hidroxietil-1- piperazinetanosulfonico), solucion salina tamponada con fosfato y MOPS (acido 3-(N-morfolino)propanosulfonico. En una realizacion preferente, la composicion comprende solucion salina tamponada con fosfato a pH 7,6. En una realizacion preferente adicional, la composicion comprende solucion salina tamponada con fosfato con azida sodica entre el 0,01 % y el 0,09 %. Preferentemente, la composicion comprende agentes adecuados para almacenar los anticuerpos de la invencion a temperatura ambiente o a una temperatura inferior o igual a 15 °C, 10 °C, 7 °C, 5 °C, 0 °C, -10 °C o -25 °C. En una realizacion preferente, la composicion comprende agentes adecuados para almacenar los anticuerpos de la invencion a una temperatura de entre 2 °C y 8 °C. En una realizacion adicional, la composicion comprende un agente estabilizador tal como un azucar, por ejemplo lactosa o trehalosa.
Si el anticuerpo de la invencion esta conjugado, por ejemplo, a un marcador de Europio, es ventajoso incluir en la composicion un estabilizador de BSA purificada al 7,5 %.
Acidos nucleicos y vectores
Un polinucleotido puede comprender una secuencia de acido nucleico que codifica cualquier anticuerpo como se describe en el presente documento. Las expresiones "molecula de acido nucleico" y "polinucleotido" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a una forma polimerica de nucleotidos de cualquier longitud, desoxirribonucleotidos, ribonucleotidos o analogos de los mismos.
Un acido nucleico que "codifica" un polipeptido seleccionado es una molecula de acido nucleico que se transcribe (en el caso del ADN) y se traduce (en el caso de ARNm) para dar un polipeptido in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los lfmites de la secuencia codificante estan determinados mediante un codon de iniciacion en el extremo 5' (amino) y un codon de terminacion de la traduccion en el extremo 3' (carboxilo).
Por ejemplo, una composicion de la invencion puede comprender un acido nucleico que codifica un anticuerpo que comprende una region variable que tiene una secuencia al menos 98 % identica a la SEQ ID NO: 29 o 33, y un anticuerpo que comprende una region variable de la cadena ligera que tiene una secuencia al menos el 98 % identica a la SEQ ID NO: 27 o 31. Un polinucleotido de la invencion puede codificar tanto un polipeptido que tiene una secuencia al menos el 98 % identica a la SEQ ID NO: 29 como un polipeptido que tiene una secuencia al menos el 98 % identica a la SEQ ID NO: 27. Como alternativa, un polinucleotido de la invencion puede codificar tanto un polipeptido que tiene una secuencia al menos el 98 % identica a la SEQ ID NO: 33 como un polipeptido que tiene una secuencia al menos el 98 % identica a la SEQ ID NO: 31.
Un ejemplo de una composicion de la invencion comprende o consiste en una secuencia de acido nucleico al menos el 98%, 99 % o 100 % identica a la SEQ ID NO: 28 o 32, y una secuencia de acido nucleico al menos el 98 %, 99 % o 100 % identica a la SEQ ID NO: 30 o 34. El polinucleotido de la divulgacion comprende o consiste en una secuencia de acido nucleico al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a la SEQ ID NO: 28, 30, 32 o 34. De forma opcional, el polinucleotido de la invencion comprende una secuencia de polinucleotido que tiene al menos el 98 % de identidad con la SEQ ID NO: 28 y una secuencia polinucleotido que tiene al menos el 98 % de identidad con la SEQ ID NO: 30. De forma opcional, el polinucleotido de la invencion comprende una secuencia de polinucleotido que tiene al menos el 98 % de identidad con la SEQ ID NO: 32 y una secuencia polinucleotido que tiene al menos el 98 % de identidad con la SEQ ID NO: 34.
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Por lo tanto, un anticuerpo de la invencion puede producirse a partir de un polinucleotido que lo codifica y tiene la capacidad de expresarlo. Cuando el anticuerpo comprende dos o mas cadenas, un polinucleotido puede codificar una cadena ligera de anticuerpo y una cadena pesada de anticuerpo, o ambas. Se pueden proporcionar dos polinucleotidos, uno de los cuales codifica una cadena ligera de anticuerpo y el otro codifica la cadena pesada de anticuerpo correspondiente. Dicho polinucleotido o pareja de polinucleotidos se pueden expresar juntos, de forma que se genera un anticuerpo de la invencion.
Los polinucleotidos de la invencion se pueden sintetizar de acuerdo con metodos bien conocidos en la tecnica, como se describe a modo de ejemplo en Sambrook et al (1989, Molecular Cloning - a laboratory manual; Cold Spring Harbor Press).
La invencion proporciona adicionalmente un vector (tal como un plasmido o vector vfrico recombinante) que comprende al polinucleotido de la invencion. Normalmente, el vector comprende adicionalmente una secuencia de control unida operativamente a la secuencia insertada, permitiendo asf la expresion del anticuerpo de la invencion in vivo. Preferentemente, el vector de la invencion comprende adicionalmente iniciadores, promotores, potenciadores y otros elementos apropiados que pueden ser necesarios y que se colocan en la orientacion correcta, para permitir la expresion de un polipeptido de la invencion.
Lfneas celulares de hibridomas
La presente invencion proporciona adicionalmente una lfnea celular de hibridoma que tiene la capacidad de producir un anticuerpo de la invencion. Dicha lfnea celular de hibridoma producira el anticuerpo de la invencion cuando se mantenga en condiciones de cultivo adecuadas.
Esta dentro de las competencias del experto en la materia desarrollar un hibridoma que exprese un anticuerpo de la invencion. Esto se puede realizar inmunizando a un mamffero, tal como un raton, conejo o cobaya, con un antfgeno (por ejemplo, Mcm5). Puede ser beneficioso incluir un adyuvante, tal como el adyuvante completo de Freund. Las celulas del bazo del mamffero inmunizado se retiran y se fusionan con celulas de mieloma para formar lfneas de hibridoma que son inmortales dadas las condiciones apropiadas y que secretan anticuerpos. Los hibridomas se separan en clones individuales y los anticuerpos secretados por cada clon se evaluan en cuanto a su capacidad de union a la protefna Mcm5.
Lfneas celulares hospedadoras
La invencion tambien proporciona celulas hospedadoras que comprenden los acidos nucleicos o vectores de la invencion. Dichas celulas hospedadoras incluyen celulas que se han modificado para expresar un anticuerpo de la invencion. Dichas celulas hospedadoras pueden ser celulas eucariotas o celulas procariotas. Por ejemplo, las celulas hospedadoras pueden ser celulas de mamffero, celulas de insecto o celulas bacterianas. Los ejemplos particulares de celulas hospedadoras que pueden modificarse mediante la insercion de vectores o acidos nucleicos de la invencion incluyen a las celulas HEK293T, CHO, HeLa, NS0 y COS de mamffero. Como alternativa, pueden usarse celulas bacterianas tales como E. coli.
Dichas celulas hospedadoras pueden cultivarse usando los metodos de rutina para producir un anticuerpo de la invencion.
Produccion de anticuerpos
Los anticuerpos de la invencion se pueden producir usando cualquier metodo. En una realizacion, los anticuerpos se producen directamente a partir de una lfnea celular de hibridoma. En una realizacion adicional de la invencion, los anticuerpos se producen de forma recombinante.
Para producir un anticuerpo a partir de una lfnea celular de hibridoma, la lfnea celular puede cultivarse in vitro, por ejemplo, en un recipiente tal como un matraz de cultivo celular o un fermentador, y el anticuerpo se puede aislar del recipiente usando tecnicas convencionales conocidas en la tecnica. Para los fines de la presente invencion, se considerara que un anticuerpo se ha "producido mediante una lfnea celular de hibridoma" si el anticuerpo se obtiene de un anticuerpo que se produjo mediante la lfnea celular de hibridoma. Por ejemplo, esta dentro de las competencias del experto en la materia obtener un anticuerpo de una lfnea celular de hibridoma, secuenciar la secuencia de aminoacidos del anticuerpo, y transfectar celulas tales como celulas CHO o celulas de E. coli con vectores que codifican la secuencia de aminoacidos del anticuerpo. Se puede considerar que tales anticuerpos se han "obtenido" a partir de un anticuerpo que se produjo mediante la lfnea celular de hibridoma. En una realizacion particular, los anticuerpos de la invencion se producen directamente a partir de la propia lfnea celular de hibridoma.
Como alternativa, los anticuerpos de la invencion se pueden producir usando tecnicas recombinantes. La secuencia de un anticuerpo de la invencion se puede usar para transfectar una lfnea de celulas hospedadoras de la invencion. Las lfneas celulares pueden cultivarse en un matraz o un fermentador, y el anticuerpo expresado por las celulas puede aislarse y purificarse usando tecnicas convencionales (tales como cromatograffa de afinidad).
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Una vez purificados, los anticuerpos pueden conjugarse entonces con un radiomarcador o inmovilizarse en un soporte solido. Un ejemplo de un soporte solido adecuado es una placa de ELISA.
Kits y metodos para determinar la concentracion de Mcm5 en una muestra.
Los anticuerpos de la invencion pueden usarse como parte de un kit. Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser parte de un kit para su uso en la deteccion de la concentracion de Mcm5 en una muestra, por ejemplo, una muestra de un ser humano, esto puede permitir la deteccion de un cancer en un sujeto del cual se toma la muestra.
Como alternativa, los anticuerpos de la invencion pueden usarse en un metodo para detectar la concentracion o cantidad de Mcm5 en una muestra (tambien denominado metodo de deteccion de Mcm5 de la invencion). Preferentemente, tal metodo comprende las siguientes etapas:
(i) proporcionar un primer anticuerpo inmovilizado, que es un anticuerpo de la invencion inmovilizado en un soporte solido;
(ii) exponer la muestra al primer anticuerpo inmovilizado, de forma que la Mcm5 en la muestra se pueda unir al anticuerpo inmovilizado para proporcionar la Mcm5 inmovilizada;
(iii) proporcionar un segundo anticuerpo marcado, que es un anticuerpo conjugado con un marcador;
(iv) exponer la Mcm5 inmovilizada al segundo anticuerpo marcado, de forma que el segundo anticuerpo marcado se pueda unir a la Mcm5; y
(v) detectar la concentracion del segundo anticuerpo marcado.
Preferentemente, hay una etapa de lavado entre las etapas (iv) y (v), para asegurar que el segundo anticuerpo, cuya concentracion se detecta en la etapa (v), se una a la Mcm5 en la etapa (iv). De forma opcional, hay una etapa de lavado adicional tras la etapa (i) para eliminar el exceso del primer anticuerpo y/o tras de la etapa (ii) para eliminar el exceso de Mcm5. De forma opcional, la etapa de lavado se realiza exponiendo el soporte solido a un tampon de lavado.
En una realizacion, los anticuerpos presentes en un kit de la invencion o usados en un metodo de la invencion son adecuados para detectar un cancer urologico, tal como cancer de prostata o un cancer de vejiga.
Preferentemente, un metodo para detectar la concentracion o cantidad de Mcm5 en una muestra usa, o un kit de la invencion comprende, dos anticuerpos de la invencion que no compiten entre si (tales como los anticuerpos 4B4 y 12A7), y preferentemente se unen a distintos epftopos del antfgeno de interes. Esto se puede determinar realizando un ELlSA, tal como el descrito anteriormente. Uno de los dos anticuerpos puede inmovilizarse en una placa de ELISA. Despues, la placa se bloquea con un agente bloqueante adecuado. Despues, se anade un exceso del otro anticuerpo (el anticuerpo cuya capacidad para competir con el primer anticuerpo debe evaluarse). A continuacion se anade el antfgeno diana, tal como Mcm5. Despues de un perfodo de incubacion adecuado, se lava la placa de ELISA y se anade un agente de deteccion que tenga la capacidad de unirse al antfgeno diana, para medir la cantidad del antfgeno diana unido al anticuerpo inmovilizado. Si los dos anticuerpos compiten, la cantidad del antfgeno diana unido al anticuerpo inmovilizado sera menor que si los anticuerpos no compitieran (y, de forma opcional, se unieran a epftopos distintos). La concentracion a la que se produce el 50 % de inhibicion se conoce como Ki. En una realizacion preferente, un anticuerpo que compite con otro anticuerpo se une con una Ki 2 veces, 5 veces, 10 veces, 50 veces o 100 veces mas baja que un anticuerpo que no compite.
En una realizacion preferente, un metodo de deteccion de Mcm5 de la invencion usa, o un kit de la invencion comprende, un primer anticuerpo de la invencion y un segundo anticuerpo de la invencion. El primer anticuerpo se puede unir (de forma opcional, se une especfficamente) a la SEQ ID NO: 1 y el segundo anticuerpo se puede unir (de forma opcional, se une especfficamente) a la SEQ ID NO: 2. El primer anticuerpo puede comprender las CDR de la CDRH1 de 12A7, la CDRH2 de 12A7, la CDRH3 de 12A7, la CDRL1 de 12A7, la CDRL2 de 12A7 y la CDRL3 de 12A7. El segundo anticuerpo puede comprender las CDR de la CDRH1 de 4B4, la CDRH2 de 4B4, la CDRH3 de 4B4, la CDRL1 de 4B4, la CDRL2 de 4b4 y la CDRL3 de 4B4. Preferentemente, el primer anticuerpo comprende la CDRH1 de 12A7, la CDRH2 de 12A7, la CDRH3 de 12A7, la CDRL1 de 12A7, la CDRL2 de 12A7 y la CDRL3 de 12A7. Preferentemente, el segundo anticuerpo comprende la CDRH1 de 12A7, la CDRH2 de 12A7, la CDRH3 de 12A7, la CDRL1 de 12A7, la CDRL2 de 12A7 y la CDRL3 de 12A7. El primer anticuerpo puede comprender una region variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a la SEQ ID NO: 29 y una secuencia de la region variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a la SEQ ID NO: 27. El segundo anticuerpo puede comprender una region variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a la SEQ ID NO: 33 y una secuencia de la region variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a la SEQ ID NO: 31.
En un metodo de deteccion de Mcm5 de la invencion se puede usar un sistema de deteccion DELFIA. En tales realizaciones, el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo se unen preferentemente a distintos epftopos. En tales realizaciones, uno de los anticuerpos (el primer o el segundo anticuerpo monoclonal) se puede inmovilizar en una placa. Se puede anadir a la placa una muestra a analizar. Despues puede anadirse el otro anticuerpo (el primer o el
segundo anticuerpo que no se inmovilizo en la placa). El otro anticuerpo debe estar conjugado con un agente de deteccion, tal como un marcador de Europio. Despues, para determinar si el antfgeno diana esta presente se puede usar espectroscopfa de fluorescencia resuelta en el tiempo (midiendo la cantidad del anticuerpo marcado que esta presente).
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Por consiguiente, en una realizacion de la invencion, un kit de la invencion comprende un primer o segundo anticuerpo de la invencion que esta conjugado con un radiomarcador, por ejemplo Europio. Para conjugar el primer anticuerpo monoclonal o el segundo anticuerpo monoclonal con un marcador de Europio se puede usar cualquier metodo. Los kits para realizar tal marcaje estan disponibles. Por ejemplo, el primer o segundo anticuerpo monoclonal 10 se puede conjugar con Europio usando un quelato de Eu-NI-ITC.
En tales realizaciones, un kit de la invencion puede comprender componentes adicionales para su uso en un sistema de deteccion DELFIA. Dichos componentes adicionales pueden incluir una solucion de potenciacion de DELFIA o una solucion de deteccion de DELFIA.
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Definiciones
El termino "comprende" significa "incluye". Por lo tanto, la palabra "comprende" y las variaciones tales como "comprenden" y "que comprende" se entenderan que implican la inclusion de un compuesto o composicion o etapa 20 establecido, o un grupo de compuestos o etapas, pero no la exclusion de algun otro compuesto, composicion, etapas o grupos de los mismos.
Tabla 1: Secuencias
SEQ ID NO
Nucleotido/Polipeptido
1
WDETKGE (epftopo al que se une el anticuerpo 12A7)
2
DDRVAIH (epftopo al que se une el anticuerpo 4B4)
3
secuencia polipeptfdica de la CDR 1 de la cadena ligera de 12A7
4
secuencia nucleotfdica de la CDR 1 de la cadena ligera de 12A7
5
secuencia polipeptfdica de la CDR 2 de la cadena ligera de 12A7
6
secuencia nucleotfdica de la CDR 2 de la cadena ligera de 12A7
7
secuencia polipeptfdica de la CDR 3 de la cadena ligera de 12A7
8
secuencia nucleotfdica de la CDR 3 de la cadena ligera de 12A7
9
secuencia polipeptfdica de la CDR 1 de la cadena pesada de 12A7
10
secuencia nucleotfdica de la CDR 1 de la cadena pesada de 12A7
11
secuencia polipeptfdica de la CDR 2 de la cadena pesada de 12A7
12
secuencia nucleotfdica de la CDR 2 de la cadena pesada de 12A7
13
secuencia polipeptfdica de la CDR 3 de la cadena pesada de 12A7
14
secuencia nucleotfdica de la CDR 3 de la cadena pesada de 12A7
15
secuencia polipeptfdica de la CDR 1 de la cadena ligera de 4B4
16
secuencia nucleotfdica de la CDR 1 de la cadena ligera de 4B4
17
secuencia polipeptfdica de la CDR 2 de la cadena ligera de 4B4
18
secuencia nucleotfdica de la CDR 2 de la cadena ligera de 4B4
19
secuencia polipeptfdica de la CDR 3 de la cadena ligera de 4B4
20
secuencia nucleotfdica de la CDR 3 de la cadena ligera de 4B4
21
secuencia polipeptfdica de la CDR 1 de la cadena pesada de 4B4
22
secuencia nucleotfdica de la CDR 1 de la cadena pesada de 4B4
23
secuencia polipeptfdica de la CDR 2 de la cadena pesada de 4B4
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secuencia nucleotfdica de la CDR 2 de la cadena pesada de 4B4
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SEQ ID NO
Nucleotido/Polipeptido
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secuencia polipeptfdica de la CDR 3 de la cadena pesada de 4B4
26
secuencia nucleotfdica de la CDR 3 de la cadena pesada de 4B4
27
secuencia completa de la region variable de la cadena ligera de 12A7 (polipeptfdica)
28
secuencia completa de la region variable de la cadena ligera de 12A7 (nucleotfdica)
29
secuencia completa de la region variable de la cadena pesada de 12A7 (polipeptfdica)
30
secuencia completa de la region variable de la cadena pesada de 12A7 (nucleotfdica)
31
secuencia completa de la region variable de la cadena ligera de 4B4 (polipeptfdica)
32
region variable de la secuencia de la region variable de la cadena ligera de 4B4 completa (nucleotfdica)
33
secuencia completa de la region variable de la cadena pesada de 4B4 (polipeptfdica)
34
secuencia completa de la region variable de la cadena pesada de 4B4 (nucleotfdica)
35
secuencia polipeptfdica de Mcm5
36
secuencia polinucleotfdica de Mcm5
Ejemplos
Clonacion de Mcm5
Estadio I: Estrategia de clonacion
1. Se obtuvo un clon verificado por IMAGE que contenfa el ADNc de MCM5 humano y que se uso como molde de PCR para amplificar un fragmento de ADN de 648 pb. El cebador de PCR directo codificaba el codon de iniciacion, asf como una etiqueta de polihistidina sin patentar modificada (HQ)4.
2. El fragmento de PCR se clono en el vector de expresion inducible de E. coli pTRC99a, utilizando una estrategia de doble sitio de restriccion. Este vector permite la expresion inducible dirigida por el promotor hfbrido trp/lac "trc". Cadena abajo hay un sitio de union al ribosoma (SUR) de lacZ que esta situado a una distancia optimizada de un codon de iniciacion ATG, que se suministra mediante el sitio de clonacion NcoI.
Estadio IIA: Expresion y purificacion (a pequena escala - 10ml)
3. El plasmido recombinante que contenfa el fragmento Mcm5 se transformo en E. coli BL21 (no ADE3 para asegurar altos rendimientos de protefna expresada.
4. Se indujeron varios cultivos de E. coli de pequeno volumen con IPTG. Las celulas se lisaran en tampon de carga de SDS y la protefna total se separara por SDS-PAGE. Los clones de alta expresion se identificaran mediante transferencia de Western usando un anticuerpo monoclonal de raton suministrado por Urosens.
Estadio IIB: Expresion y purificacion (a gran escala - 500ml)
5. El clon identificado con altos niveles de protefna recombinante se cultivo en la escala de 0,5 l y se indujo con IPTG. Las celulas se sedimentaron y conservaron a -70 °C. Las celulas se rompieron en un tampon de lisis desnaturalizante descrito por Stoeber et al. J Natl Cancer Inst 2002 94 1071-9.
6. La protefna recombinante etiquetada con His se purifico por afinidad en condiciones desnaturalizantes en una columna de cromatograffa de afinidad por metales inmovilizados (IMAC). La protefna se eluyo usando un tampon acido y se dializo frente a tampon de conservacion (PBS que contenfa SDS 0,3).
7. La protefna elufda se analizo y se cuantifico mediante SDS-PAGE y transferencia de western usando un anticuerpo monoclonal de raton suministrado por Urosens.
Ejemplo 1 - ELISA de exploracion de Acm
Los Acm purificados por Protefna A se obtuvieron del Institute for Cancer and Developmental Biology Welcome/CRUK. Estos anticuerpos se analizaron en cuanto a su capacidad para unirse a Mcm5.
Se realizo un ELISA de Mcm5 recombinante etiquetada con 6 His usando pocillos de una placa de microtitulacion de 96 pocillos recubierta con His-Sorb Ni-NTA (Qiagen). Las placas recubiertas con Ni-NTA, prebloqueadas con BSA,
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50
garantizan una presentacion orientada de la Mcm etiquetada con 6 His a traves de la union de afinidad del nfquel al espaciador, en comparacion con la presentacion aleatoria de la Mcm5 en el pocillo que se lograrfa mediante el recubrimiento por adsorcion pasiva de la placa. La Mcm5, a una concentracion de 625 ng/ml, se inmovilizo por afinidad con nfquel en la superficie de Ni-NTA His-Sorb (Qiagen) de una placa de 96 pocillos, a 200 pl/pociNo, dando como resultado 125 ng de frsMcm5/pocillo. Esto se realizo siguiendo las instrucciones del fabricante para aplicar una protefna o peptido etiquetado con 6 His a los pocillos de la placa, con un tftulo >100 ng/pocillo. Esto se hizo para garantizar que la protefna o peptido no sea limitante para la deteccion del Ac. El analisis de los Acm para el desarrollo de un IFMA (sigla de immunofluorometric assay, ensayo inmunofluorometrico) para Mcm5 se realizo con un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) de Mcm5. Para analizar los Acm, los sobrenadantes de los cultivos de hibridoma que expresaban los Acm se incubaron en los pocillos de microtitulacion a TA durante 3 h y despues se retiraron con una lavadora automatica de placas de 96 pocillos. Los complejos de Ag Mcm5-Ac de los Acm se detectaron mediante un ELISA colorimetrico que usaba IgG de cabra anti raton conjugada con HRP, reactivo TMB y solucion de parada de ensayo de H2SO4 1 M, para la medicion de la absorbancia de luz a 450 nanometros (Abs a 450 nm). Se excluyo la ausencia de union no especffica (UNE) del anti raton de cabra conjugado con HRP a la superficie de Ni-NTA His-Sorb y Mcm5 realizando el ELISA en pocillos sin los Acm. El grado de UNE a los pocillos de poliestireno recubiertos con Ni-NTA de los Acm de raton analizados se establecio realizando el ELISA en pocillos con la omision de pocillos de Mcm5, en paralelo a la realizacion del ELISA en pocillos con la inmovilizacion a los pocillos de microtitulacion por afinidad con Nfquel de Mcm5.
El rendimiento en el ELISA colorimetrico de un Acm de raton en las muestras de medios tomadas de los hibridomas (Tabla 2) se uso para la seleccion de los clones destacados, 12A7 y 4B4. Los hibridomas de los Acm seleccionados se cultivaron para producir IgG para la purificacion a partir del sobrenadante de cultivo, usando separacion por protefna A en fase solida, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Amersham Pharmacia Biotech Little Chalfont Buckinghamshire, RU). El Acm 12A7 dio lugar a la mayor respuesta frente a la Mcm5.
Tabla 2: resultados de Abs a 450-650 del ELISA de analisis de Acm de hibridomas
Acm para Mcm5
respuesta del pocillo a Mcm5 respuesta del pocillo de UNE respuesta especffica a Mcm5
12A7
1,404 0,421 0,983
4B4
1,622 1,040 0,582
Afinidades relativas de los Acm
Las afinidades relativas de los Acm purificados por protefna A se determinaron mediante la normalizacion de las concentraciones de Ac y la aplicacion de los Acm al ensayo de analisis colorimetrico en condiciones limitantes de Ag. Las condiciones limitantes de Ag se determinaron mediante titulacion de la Mcm5 en los pocillos de la placa de microtitulacion His-Sorb de Ni-NTA. Una Abs a 450 nm maximo observado de <3,000 es indicativa de condiciones limitantes de Ag, debido a que la lectura maxima de Abs a 450 que se puede obtener cuando el Ag no es limitante es 4,000. La titulacion del Ag se realizo usando Apc (anticuerpo policlonal) de conejo frente a Mcm5 (101) y cabra anti conejo HRP para medir la respuesta de ELISA. Una concentracion que proporciono 25 ng de Mcm5 disponible para la union a cada pocillo de Ni-NTA estaba limitando la respuesta de Abs a 450 del ELISA del Acp. El Acp de conejo se escogio para determinar las condiciones limitantes de Ag para la investigacion de los Acm de raton, dado que el Acp se une a la serie completa de epftopos de Mcm5. Esto garantizo que los Acm pudieran investigarse en estudios de incubacion combinados para determinar el grado de competencia epitopica.
La concentracion de IgG en las soluciones de Acm purificadas por protefna A se determino por medicion en un espectrofotometro de la Abs a 280 nm y las concentraciones de Acm se normalizaron mediante dilucion en PBS. Despues, se determino el 50 % de la concentracion de union maxima mediante una dilucion lineal de los Acm aplicada a un ELISA de pocillos con Mcm5 con afinidad al nfquel en condiciones limitantes de Ag Mcm5. Para demostrar la meseta de la senal de union a frsMcm5rf 25 ng/pocillo en la placa, el Acm 7A3 se proceso en el ELISA a un mayor intervalo de concentracion. El 50 % de respuesta de union maxima para 12A7 se obtuvo a una concentracion de 20 ng/pocillo. 12A7 se muestra por su 50 % de concentracion de union maxima para demostrar la mayor afinidad relativa a frsMcm5. (Tabla 3).
Tabla 3: Titulaciones de Acm contra antfgeno limitante 25 ng/pocillo acoplado a Ni-NTA
Acm
Acm nb/pocillo
4B4 12A7
0
0,086 0,051
0,25
0,108 0,189
5
10
15
20
25
30
Acm
2,5
0,464 0,762
25
0,966 1,804
500
1,848 2,808
1000
2,414 3,099
Ejemplo 2 - Competicion de los anticuerpos por los epftopos
Para un ensayo inmunometrico de dos sitios, se precisan dos Acm que esten dirigidos a epftopos distintos. En condiciones limitantes de Ag, un pareja de Acm que compiten por el mismo epftopo proporcionaran una medicion de Abs a 450 nm en ELISA igual a la senal de Abs a 450 nm del Ac de afinidad relativa mas alta, cuando se incuba en ausencia del Acm competidor, sin embargo, la incubacion de una pareja de Acm dirigidos a epftopos distintos proporcionara una medicion de Abs a 450 igual a la suma de las respuestas de Abs a 450 nm individuales de los Acm al Ag limitado disponible, siempre que haya una ausencia de impedimento esterico. Los Acm 12A7 y 4B4 se normalizaron al 50% de la concentracion de union maxima de 20 ng/pocillo del Acm 12A7 de mayor afinidad relativa. Los Acm a la concentracion normalizada se sometieron a un ELISA usando incubaciones de Ab individuales y emparejados en la placa de Ni-NTA de Ag Mcm5 limitante 25 ng/pocillo. La senal mas alta de Abs a 450 nm medida a partir de una incubacion combinada de una pareja de Acm serfa indicativa de los Acm mas adecuados para su uso en una IFMA de dos sitios.
Resultados de la competicion de los anticuerpos por los epftopos
Los resultados del estudio de ELISA de competicion de los Ac por epftopos del Ag (Tabla 4) muestran que el Acm 4B4 esta dirigido a un epftopo distinto, lo que es compatible para la union a dos sitios con el 12A7. Se demuestra que el epftopo que es el objetivo 4B4 es distinto ya que la respuesta de Abs a 450 es igual a la suma de ambos Acm uniendose al Ag limitante, cuando se incubo 4B4 en paralelo a los otros Acm.
Tabla 4: Resultados del estudio de ELISA de competicion de los Ac por epftopos del Ag
Incubacion con Acm 20 ng/pocillo
Respuesta de Abs a 450-650 con Mcm5 25 ng/pocillo
12A7
1,375
4B4
1,244
12A7+4B4
2,693
Los Acm se incubaron a una concentracion normalizada de 20 ng/pocillo, el 50% de la concentracion de union maxima del Acm 12A7 con la mayor afinidad relativa. Los Acm optimos para el desarrollo de un inmunoensayo de dos sitios se destacan en azul y sus respuestas de Abs a 450 en ELISA se destacan en amarillo.
Ejemplo 3 - Mapeo epitopico
Materiales usados:
Contenido de la micromatriz:
La secuencia del antfgeno Mcm 5 (aa 367-582) se tradujo para dar peptidos de 15 aa con un solapamiento peptido-peptido
Muestras:
Anticuerpos IgG monoclonales de raton 12A7 y 4B4
Tampon de lavado:
PBS, pH 7,4 con Tween 20 al 0,05 % (3x1 min despues de cada ensayo)
Tampon de bloqueo:
Tampon de bloqueo MB-070 de Rockland (30 min antes del primer ensayo)
Tampon de incubacion:
PBS, pH 7,4 con Tween 20 al 0,05 % y tampon de bloqueo de Rockland al 10 %
Condiciones de ensayo:
Concentraciones de anticuerpos de 1 pg/ml y 10 pg/ml en tampon de incubacion; incubacion durante 16 h a 4 °C y
Anticuerpo secundario:
Anticuerpo de cabra anti raton IgG (H+L) DyLight 680;
Anticuerpos de control:
Monoclonal anti HA (12CA5)-DyLight680 (1:1000), monoclonal anti FLAG (M2)-DyLight800 (1:500); tincion en
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Escaner:
LI-COR Odyssey Imaging System; 0,8 mm de desplazamiento de barrido, 21 pm de
resolucion, intensidad de barrido rojo/verde de 5/7
La pretincion de una de las micromatrices de peptidos se realizo con el anticuerpo secundario anti IgG de raton (H+L) de cabra DyLight680 a una dilucion de 1:5000, para investigar las interacciones de fondo con los peptidos procedentes del antfgeno que podrfan interferir con los ensayos principales. La incubacion posterior de las micromatrices de peptidos con los anticuerpos IgG monoclonales de raton 12A7 y 4B4 a, concentraciones de 1 pg/ml y 10 pg/ml en tampon de incubacion, se siguio de la tincion con el anticuerpo secundario y la lectura a una intensidad de barrido de 5 (rojo). Los peptidos de control HA y Flag que enmarcaban las matrices de peptidos se tineron finalmente como un control de calidad interno, para confirmar la calidad del ensayo y la integridad de la micromatriz de peptidos (intensidades de barrido rojo/verde: 5/7).
La cuantificacion de las intensidades de los puntos y la anotacion de los peptidos se realizaron con el analizador PepSlide®. Un algoritmo de programa informatico descompone las intensidades de fluorescencia de cada punto para dar las senales sin procesar, la de primer plano y la de fondo, y calcula la desviacion tfpica de las medianas de las intensidades de primer plano. Basandose en las medianas de las intensidades de primer plano promediadas, se generaron mapas de intensidad y se destacaron las interacciones en los mapas de peptidos mediante un codigo de intensidad de color, con rojo para alto y blanco para intensidades de punto bajas.
Los inventores representaron adicionalmente las intensidades de los punto promediadas de todos los ensayos con las muestras de anticuerpos frente a la secuencia del antfgeno desde el extremo N hasta el extremo C, para visualizar las intensidades globales de los puntos y las proporciones de la senal con respecto al ruido. Los graficos de intensidad se correlacionaron con mapas de peptidos e intensidad, asf como con la inspeccion visual de los barridos de las micromatrices, para identificar los peptidos y epftopos que fueron reconocidos por las muestras de anticuerpos. En caso de que no fuese claro si un determinado aminoacido contribufa a la union del anticuerpo.
Despues de 15 min de prehinchamiento en tampon de lavado y 30 min en tampon de bloqueo, una de las micromatrices de peptidos se incubo inicialmente con el anticuerpo secundario de cabra anti IgG de raton (H+L) DyLight680 a una dilucion de 1:5000 durante 30 min, a temperatura ambiente, para analizar las interacciones de fondo con los peptidos procedentes del antfgeno. A una intensidad de escaneo de 5, los inventores no observaron ningun fondo debido a la union no especffica del anticuerpo secundario. La cuantificacion de los datos con el analizador PepSlide® no fue posible ni necesaria, dado que la ausencia de un patron de puntos obstaculizo la alineacion de la rejilla de la micromatriz.
Las micromatrices peptfdicas se incubaron con el anticuerpo monoclonal de raton 12A7 a concentraciones de 1 pg/ml y 10 pg/ml (parte superior derecha). Despues de cada incubacion, la tincion con el anticuerpo secundario de cabra anti IgG de raton (H+L) DyLight680 se siguio de la lectura a una intensidad de barrido de 5. Los inventores observaron un patron de puntos de tipo epftopo fuerte y bien definido, formado por una fila de peptidos adyacentes con un motivo consenso con excelentes proporciones de la senal con respecto al ruido.
La tincion final de los peptidos de control de HA y Flag que enmarcaban la micromatriz de peptidos dio lugar al patron de puntos esperado y bien definido, y valido la integridad global de la micromatriz de peptidos.
La cuantificacion de los datos se siguio de la generacion de mapas de peptidos y de intensidad, asf como de graficos de intensidad para los ensayos con el anticuerpo monoclonal de raton 12A7 a concentraciones de 1 pg/ml y 10 pg/ml; el grafico de intensidad de este ultimo se nivelo para proporcionar una vision de conjunto mas clara de los datos. Las senales se basaron en el patron de puntos de tipo epftopo observado en el barrido de la micromatriz y se atribuyeron a peptidos con el motivo consenso WDETKGE.
Las micromatrices de peptidos se incubaron con el anticuerpo monoclonal de raton 4B4 a concentraciones de 1 pg/ml) y 10 pg/ml. Despues de cada incubacion, la tincion con el anticuerpo secundario de cabra anti IgG de raton (H+L) DyLight680 se siguio de la lectura a una intensidad de barrido de 5. Los inventores observaron dos patrones de puntos de tipo epftopo fuertes y bien definidos, formados por una fila de peptidos adyacentes con motivos consenso con excelentes proporciones de la senal con respecto al ruido. A una concentracion de anticuerpo de 10 pg/ml, las intensidades sin procesar del patron de puntos de tipo epftopo fueron similares, pero las interacciones de fondo aumentaron ligeramente indicando una saturacion de senal del anticuerpo en el intervalo de concentracion de 1-10 pg/ml. La tincion final de los peptidos de control de HA y Flag que enmarcaban la micromatriz de peptidos dio lugar al patron de puntos esperado y bien definido, y valido la integridad global de la micromatriz de peptidos.
La cuantificacion de los datos se siguio de la generacion de mapas de peptidos y de intensidad, asf como de graficos de intensidad para los ensayos con el anticuerpo monoclonal de raton 4B4 a concentraciones de 1 pg/ml y 10 pg/ml; el grafico de intensidad de este ultimo se nivelo para proporcionar una vision de conjunto mas clara de los datos. A una concentracion de anticuerpo de 10 pg/ml, las intensidades sin procesar del patron de puntos de tipo epftopo fueron similares, pero las interacciones de fondo aumentaron ligeramente, conduciendo intensidades de senal normalizadas reducidas. Las senales se basaron en los patrones de puntos de tipo epftopo observados en el barrido
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
de la micromatriz y se atribuyeron a peptidos con los motivos consenso DDRVAIH y WDETKGE. Listado de secuencias
SEQ ID NO: 1 WDETKGE SEQ ID NO: 2 DDRVAIH SEQ ID NO: 3 QNLVQSNGNTY SEQ ID NO: 4
CAGAACCTTGTACAAAGTAATGGAAACACCTATTTA
SEQ ID NO: 5
KVS
SEQ ID NO: 6:
AAGTTTCCAA SEQ ID NO: 7:
SQSTRVPYT SEQ ID NO: 8:
TCTCAAAGTACACGTGTTCCGTACACA SEQ ID NO: 9:
GFSLSTSGMG SEQ ID NO: 10:
GGGTTTTCACTGAGCACTTCTGGTATGGGT SEQ ID NO: 11:
IFWDDDK SEQ ID NO: 12:
ATTTTCTGGGATGATGACAAG SEQ ID NO: 13:
ARRSDYNYYSMDY SEQ ID NO: 14:
GCGCGGCGAAGTGACTACAATTACTACTCTATGGACTAC SEQ ID NO: 15:
QDIGSS SEQ ID NO: 16:
CAGGACATTGGTAGTAGC SEQ ID NO: 17:
ATS
SEQ ID NO: 18:
GCCACATCC SEQ ID NO: 19:
LQYASSPPT SEQ ID NO: 20:
CTACAATATGCTAGTTCTCCTCCGACG SEQ ID NO: 21:
GFTFSNYA SEQ ID NO: 22:
GGATTCACTTTCAGTAACTATGCC SEQ ID NO: 23:
ISRGGSYT SEQ ID NO: 24:
ATTAGTCGTGGTGGTAGTTACACC SEQ ID NO: 25:
ARHGYNYDDGAWFAN SEQ ID NO: 26:
GCAAGACATGGATATAATTACGACGACGGGGCCTGGTTTGCTAAC SEQ ID NO: 27:
DIMLTQSPLSLSVTLCDQASISCRSSQNLVQSNGNTYLTWYLQKPGQSPKVLINKVSNRFY
GVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDLGIYFCSQSTRVPYTFGGGTKLEIRR
SEQ ID NO: 28:
GATATCATGCTGACCCAATCTCCACTCTCCCTGTCTGTCACTCTTGGAGATCAGGCCTC
CATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAACCTTGTACAAAGTAATGGAAACACCTATTTAACTT
GGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGGTCCTGATCAACAAAGTTTCCAACCG
ATTTTATGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTC
AGGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAATTTATTTCTGCTCTCAAAGTACAC
GTGTTCCGTACACATTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAGACG
SEQ ID NO: 29:
QQDLQQSGPGILQPTQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQSSNMGLEWLAHIFWDDDKRY
NPSLRSRLTLSKDTSSSQVFLMITSVSTADSATYYCARRSDYNYYSMDYWGQGTAVTVSS
5
SEQ ID NO: 30:
CAGCAAGATCTGCAGCAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGCCCACCCAGACCCTCAGTC T GACTT GTT CTTTCT CTGGGTTTTCACT GAGCACTTCTGGT ATGGGT GTG AGTT GGATT C GTCAATCTTCAAATATGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTTCTGGGATGATGACAA G CGCTATAAT CCCT CCCT GAGGA GCC GACT CACGCTCT CCAAGG ATACCT CCAGTAGC CAGGTATTTCTCATGATCACC AGTGTG AGT ACTGC AGATTCTGCCACAT ACTACTGTGC GCGGCGAAGTGACTACAATTACTACTCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCGCAGTC ACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO: 31:
dimltqspsslsaslgervsltcrasqdigsslnwlqqepdgtikrliyatssldsgvpkrfs
GSRSGSDYSLTISSLESEDFVDYYCLQYASSPPTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO: 32:
GATATCATGCTGACCCAATCTCCATCCTCCTTATCTGCCTCTCTGGGAGAAAGAGTCAG
TCTCACTTGTCGGGCAAGTCAGGACATTGGTAGTAGCTTAAACTGGCTTCAACAGGAA
CCAGATGGAACTATTAAACGCCTAATCTACGCCACATCCAGTTTAGATTCTGGTGTCCC
CAAAAGGTTCAGTGGCAGTAGGTCTGGGTCAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTT
GAGTCTG AAG ATTTTGT AGACT ATT ACTGTCT ACA AT ATGCT AGTTCTCCTCCG ACGTT
CGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAC
15 SEQ ID NO: 33:
VKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASCFTFSNYAMSWVRQNPEKRLEWVATISRGGSYTYY
PDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRSEDTAMYFCARHGYNYDDGAWFANWGQGTLV
TVSA
SEQ ID NO: 34:
TAGGTGAAACTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAA
CTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCA
GAATCCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTCGTGGTGGTAGTTACAC
CTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGTCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAAC
ACCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTTCTGTG CAAGACATGGATATAATTACGACGACGGGGCCTGGTn GCTAACTGGGGCCAAGGGA
SEQ ID NO: 35:

10 20 30 40 50 60
MSGFDDPGIF YSDSFGGDAQ ADEGQARKSQ LQRRFKEFLR QYRVGTDRTG FTFKYRDELK

70 80 90 100 110 120
RHYNLGEYWI EVEMEDLASF DEDLADYLYK QPAEHLQLLE EAAKEVADEV TRPRPSGEEV

130 140 150 160 170 180
LQDIQVMLKS DASPSSIRSL K.SDMMSHLVK. IPG1I1AASA VRAKATR1S1 QCRSCRNTLT

190 200 210 220 230 240
N1AMRPGLEG YALPRK.CNTD QAGRPKCPLD PYFIMPDKCK. CVDFQTLfCLQ ELPDAVPHGE

250 260 270 280 290 300
MPRHMQLYCD RYLCDKVVPG NRVT1MGIYS 1KKFGLTTSR GRDRVGVGIR SSYIRVLGIQ

310 320 330 340 350 360
VDTDGSGRSF AGAVSPQEEE EFRRLAALPN VYEViSKSlA PS1FGGTDMK KAIACLLFGG

370 380 390 400 410 420
SRKRLPDGLT RRGDINLLML GDPGTAKSQL LKFVEKCSP1 GVYTSGKGSS AAGLTASVMR

430 440 450 460 470 480
DPSSRNFIME GGAMVLADGG VVCIDEFDK.M REDDRVAIHE AMEQQTISIA KAG1TTTLNS

490 500 510 520 530 540
RCSVLAAANS VFGRWDETKG EDN1DFMPT1 LSRFDM1F1V KDEHNEERDV MLAKHV1TLH

550 560 570 580 590 600
VSALTQTQAV EGEIDLAKLK KFIAYCRVKC GPRLSAEAAE KLKNRY1IMR SGARQHERDS

610 620 630 640 650 660
DRRSS1PITV RQLEAIVRIA EALSRMKLQP FATEADVEEA LRLFQVSTLD AALSGTLSGV

670 680 690 700 710 720
EGFTSQEDQpE MLSR1EKQLK RRFA1GSQVS EHSI1KDFTK QKYPEHAIHK VLQLMLRRGE
730
IQHRMQRKVL YRLK SEQ ID NO:36
Componente 5 del complejo de mantenimiento de minicromosomas (MCM5) de Homo sapiens, Secuencia de 5 referencia del NCBI del ARNm: NM 006739.3
1 ggaaaaccag aggcgcagtc atgtcgggat tcgacgatcc tggcattttc tacagcgaca 61 gcttcggggg cgacgcccag gccgacgagg ggcaggcccg caaatcgcag ctgcagaggc 121 gcttcaagga gttcctgcgg cggtaccgag tgggcaccga ccgcacgggc ttcaccttca 181 aatacaggga tgaactcaag cggcattaca acctggggga gtactggatt gaggtggaga 241 tggaggatct ggccagcttt gatgaggacc tggccgacta cttgtacaag cagccagccg 301 agcacctgca gctgctggag gaagctgcca aggaggtagc tgatgaggtg acccggcccc 361 ggccttctgg ggaggaggtg ctccaggaca tccaggtcat gctcaagtcg gacgccagcc 421 cttccagcat tcgtagcctg aagtcggaca tgatgtcaca cctggtgaag atccctggca 481 tcatcatcgc ggcctctgcg gtccgtgcca aggccacccg catctctatc cagtgccgca 541 gctgccgcaa caccctcacc aacattgcca tgcgccctgg cctcgagggc tatgccctgc 601 ccaggaagtg caacacagat caggctgggc gccccaaatg cccattggac ccgtacttca 661 tcatgcccga caaatgcaaa tgcgtggact tccagaccct gaagctgcag gagctgcctg 721 atgcagtccc ccacggggag atgcccagac acatgcagct ctactgcgac aggtacctgt 781 gtgacaaggt cgtccctggg aacagggtta ccatcatggg catctactcc atcaagaagt 841 ttggcctgac taccagcagg ggccgtgaca gggtgggcgt gggcatccga agctcctaca 901 tccgtgtcct gggcatccag gtggacacag atggctctgg ccgcagcttt gctggggccg 961 tgagccccca ggaggaggag gagttccgtc gcctggctgc cctcccaaat gtctatgagg 1021 tcatctccaa gagcatcgcc ccctccatct ttgggggcac agacatgaag aaggccattg 1081 cctgcctgct ctttgggggc tcccgaaaga ggctccctga tggacttact cgccgaggag 1141 acatcaacct gctgatgcta ggggaccctg ggacagccaa gtcccagctt ctgaagtttg 1201 tggagaagtg ttctcccatt ggggtataca cgtctgggaa aggcagcagc gcagctggac 1261 tgacagcctc ggtgatgagg gacccttcgt cccggaattt catcatggag ggcggagcca 1321 tggtcctggc cgatggtggg gtcgtctgta ttgacgagtt tgacaagatg cgagaagatg 1381 accgtgtggc aatccacgaa gccatggagc agcagaccat ctctatcgcc aaggctggga 1441 tcaccaccac cctgaactcc cgctgctccg tcctggctgc tgccaactca gtgttcggcc 1501 gctgggatga gacgaagggg gaggacaaca ttgacttcat gcccaccatc ttgtcgcgct 1561 tcgacatgat cttcatcgtc aaggatgagc acaatgagga gagggatgtg atgctggcca 1621 agcatgtcat cactctgcac gtgagcgcac tgacacagac acaggctgtg gagggcgaga 1681 ttgacctggc caagctgaag aagtttattg cctactgccg agtgaagtgt ggcccccggc 1741 tgtcagcaga ggctgcagag aaactgaaga accgctacat catcatgcgg agcggggccc 1801 gtcagcacga gagggacagt gaccgccgct ccagcatccc catcactgtg cggcagctgg 1861 aggccattgt gcgcatcgcg gaagccctca gcaagatgaa gctgcagccc ttcgccacag 1921 aggcagatgt ggaggaggcc ctgcggctct tccaagtgtc cacgttggat gctgccttgt 1981 ccggtaccct gtcaggggtg gagggcttca ccagccagga ggaccaggag atgctgagcc 2041 gcatcgagaa gcagctcaag cgccgctttg ccattggctc ccaggtgtct gagcacagca 2101 tcatcaagga cttcaccaag cagaaalacc cggagcacgc catccacaag gtgctgcagc 2161 tcatgctgcg gcgcggcgag atccagcatc gcatgcagcg caaggttctc taccgcctca 2221 agtgagtcgc gccgcctcac tggaclcatg gactcgccca cgcctcgccc ctcctgccgc 2281 tgcctgccat tgacaatgtt gctgggacct ctgcctcccc actgcagccc tcgaacttcc 2341 caggcaccct cctttctgcc ccagaggaag gagctgtagt gtcctgctgc ctctgggcgc 2401 ccgcclctag cgcggttctg ggaagtgtgc ttttggcatc cgttaataat aaagccacgg 2461 tgtgttcagg taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2521 aaaaaaaaaa aaaa
LISTADO DE SECUENCIAS 5 <110> Arquer Diagnostics Ltd
<120> ENSAYO DE MCM5 <130> N403141WO
10
<140> tbc <141>tbc
<150>tbc
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<151> tbc <160> 36
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Epftopo al que se une el anticuerpo 12A7 <400> 1
Trp Asp Glu Thr Lys Gly Glu 1 5
<210>2 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Epftopo al que se une el anticuerpo 4B4 <400> 2
Asp Asp Arg Val Ala lie His 1 5
<210>3 <211> 11 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia polipeptfdica de la CDR 1 de la cadena ligera de 12A7 <400> 3
Gin Asn Leu Val Gin Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 15 10
<210>4 <211> 36 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia nucleotfdica de la CDR 1 de la cadena ligera de 12A7 <400> 4
cagaaccttg tacaaagtaa tggaaacacc tattta 36
<210>5 <211>4 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<223> Secuencia polipeptidica de la CDR 2 de la cadena ligera de 12A7 <220>
<221> misc_feature <222> (4)..(4)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural <400> 5
Lys Val Ser Xaa 1
<210>6 <211> 10 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia nucleotfdica de la CDR 2 de la cadena ligera de 12A7 <400> 6
Aagtttccaa 10
<210>7 <211>9 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia polipeptidica de la CDR 3 de la cadena ligera de 12A7 <400> 7
Ser Gin Ser Thr Arg Val Pro Tyr Thr 1 5
<210>8 <211> 27 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia nucleotfdica de la CDR 3 de la cadena ligera de 12A7 <400> 8
tctcaaagta cacgtgttcc gtacaca 27
<210>9 <211> 10 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia polipeptidica de la CDR 1 de la cadena pesada de 12A7 <400> 9
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly 15 10
<210> 10 <211> 30 <212> ADN
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia nucleotfdica de la CDR 1 de la cadena pesada de 12A7 <400> 10
gggttttcac tgagcacttc tggtatgggt 30
<210> 11 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia polipeptfdica de la CDR 2 de la cadena pesada de 12A7 <400> 11
lie Phe Trp Asp Asp Asp Lys 1 5
<210> 12 <211> 21 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia nucleotfdica de la CDR 2 de la cadena pesada de 12A7 <400> 12
attttctggg atgatgacaa g 21
<210> 13 <211> 13 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia polipeptfdica de la CDR 3 de la cadena pesada de 12A7 <400> 13
Ala Arg Arg Ser Asp Tyr Asn Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr 15 10
<210> 14 <211> 39 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia nucleotfdica de la CDR 3 de la cadena pesada de 12A7 <400> 14
gcgcggcgaa gtgactacaa ttactactct atggactac 39
<210> 15 <211>6 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Gin Asp lie Gly Ser Ser 1 5
<210> 16 <211> 18 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia nucleotfdica de la CDR 1 de la cadena ligera de 4B4 <400> 16
caggacattg gtagtagc 18
<210> 17 <211>4 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia polipeptfdica de la CDR 2 de la cadena ligera de 4B4 <220>
<221> misc_feature <222> (4)..(4)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural <400> 17
Ala Thr Ser Xaa
1
<210> 18 <211> 10
<212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia nucleotfdica de la CDR 2 de la cadena ligera de 4B4 <220>
<221> misc_feature <222> (10)..(10)
<223> n es a, c, g o t
<400> 18 gccacatccn 10
<210> 19 <211>9 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia polipeptfdica de la CDR 3 de la cadena ligera de 4B4 <400> 19
Leu Gin Tyr Ala Ser Ser Pro Pro Thr 1 5
<210> 20 <211> 27
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia nucleotfdica de la CDR 3 de la cadena ligera de 4B4 <400> 20
ctacaatatg ctagttctcc tccgacg 27
<210> 21 <211>8 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia polipeptfdica de la CDR 1 de la cadena pesada de 4B4 <400> 21
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala 1 5
<210> 22 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia nucleotfdica de la CDR 1 de la cadena pesada de 4B4 <400> 22
ggattcactt tcagtaacta tgcc 24
<210> 23 <211>8 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia polipeptfdica de la CDR 2 de la cadena pesada de 4B4 <400> 23
lie Ser Arg Gly Gly Ser Tyr Thr 1 5
<210> 24 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia nucleotfdica de la CDR 2 de la cadena pesada de 4B4 <400> 24
attagtcgtg gtggtagtta cacc 24
<210> 25 <211> 15 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
5
10
15
20
25
30
Ala Arg His Gly Tyr Asn Tyr Asp Asp Gly Ala Trp Phe Ala Asn 15 10 15
<210> 26 <211> 45 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia nucleotfdica de la CDR 3 de la cadena pesada de 4B4 <400> 26
gcaagacatg gatataatta cgacgacggg gcctggtttg ctaac 45
<210> 27 <211> 113 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia completa de la cadena ligera variable de 12A7 (polipeptidica) <400> 27
imagen1
<210> 28 <211>338 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
5
10
15
20
25
gatatcatgc
tgacccaatc tccactctco ctgtctgtca ctcttggaga tcaggcctcc 60
atctcttgca
gatctagtca gaaccttgta caaagtaatg gaaacaccta tttaacttgg 120
tacctgcaga
agccaggcca gtctccaaag gtcctgatca acaaagtttc caaccgattt 130
tatggggtcc
cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaggatc 240
agcagagtgg
aggctgagga tctgggaatt tatttctgct ctcaaagtac acgtgttccg 300
tacacattcg
gaggggggac caagctggaa ataagacg 338
<210> 29 <211> 121 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia completa de la cadena pesada variable de 12A7 (polipeptfdica) <400> 29
Gin Gin Asp Leu Gin Gin Ser Gly 1 5
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe 20
Gly Met Gly Val Ser Trp lie Arg
35 40
Trp Leu Ala His lie Phe Trp Asp 50 55
Leu Arg Ser Arg Leu Thr Leu Ser 65 70
Phe Leu Met lie Thr Ser Val Ser 85
Cys Ala Arg Arg Ser Asp Tyr Asn 100
Gin Gly Thr Ala Val Thr Val Ser 115 120
Pro Gly lie Leu Gin Pro Thr Gin 10 15
Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 25 30
Gin Ser Ser Asn Met Gly Leu Glu 45
Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser 60
Lys Asp Thr Ser Ser Ser Gin Val 75 80
Thr Ala Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr 90 95
Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly 105 110
Ser
<210> 30 <211> 363 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
5
10
15
20
25
cageaagate
tgcagcagtc tggccctggg atattgeage ccacccagac cctcagtctg 60
acttgttott
tctctgggtt ttcactgago acttctggta tgggtgtgag ttggattcgt 120
caatcttcaa
atatgggtct ggagtggctg gcacacattt tctgggatga tgacaagcgc 180
tataatccct
ccctgaggag ccgactcacg ctctccaagg atacctccag tagccaggta 240
tttctcatga
tcaccagtgt gagtactgca gattctgcca catactactg tgegeggega 300
agtgactaca
attactactc tatggactac tggggtcaag gaaocgcagt caccgtctcc 360
tea
363
<210>31 <211> 107 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia completa de la cadena ligera variable de 4B4 (polipeptfdica)
<400> 31

Asp lie Met Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15

Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp He Gly Ser Ser 20 25 30

Leu Asn Trp Leu Gin Gin Glu Pro Asp Gly Thr lie Lys Arg Leu He 35 40 45

Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Ser 65 70 75 80

Glu Asp Phe Val Asp Tyr Tyr Cys Leu Gin Tyr Ala Ser Ser Pro Pro 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105
<210> 32 <211> 322 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
5
10
15
gatatcatgc
ctcacttgtc
gatggaacta
aggttcagtg
gaagattttg
ggcaccaagc
tgacccaatc
tccatcctcc ttatctgcct ctctgggaga aagagtcagt 60
gggcaagtca
ggacattggt agtagcttaa actggcttca acaggaacca 120
ttaaacgcct
aatctacgcc acatccagtt tagattctgg tgtccccaaa 180
gcagtaggtc
tgggtcagat tattctctca ccatcagcag ccttgagtct 240
tagactatta
ctgtctacaa tatgctagtt ctcctccgac gttcggtgga 300
tggaaatcaa
ac 322
<210> 33 <211> 121 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia completa de la cadena pesada variable de 4B4 (polipeptfdica)
<400> 33
Val Lys Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser 15 10 15
Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala 20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gin Asn Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala 35 40 45
Thr lie Ser Arg Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Ala 85 90 95
Arg His Gly Tyr Asn Tyr Asp Asp Gly Ala Trp Phe Ala Asn Trp Gly 100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120
<210> 34 <211>366 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
5
10

taggtgaaac tgcaggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aactatgcca tgtcttgggt tcgccagaat 120

ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtcgtg gtggtagtta cacctactat 180

ccagacagtg tgaagggtcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtat 24 0

ctgcaaatga aaagtctgag gtctgaggao acggccatgt atttctgtgc aagacatgga 300

tataattacg acgacggggc ctggtttgct aactggggcc aagggactct ggtcactgtc 360

tctgca 366
<210> 35 <211> 734 <212> PRT <213> Homo sapiens
<220>
<223> Mcm5 (polipeptido)
<400> 35

Claims (16)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Un anticuerpo monoclonal que se une especfficamente a Mcm5, que se une a un epftopo que tiene una secuencia de aminoacidos de
    (i) la SEQ ID NO: 2; o
    (ii) la SEQ ID NO: 1.
  2. 2. Un anticuerpo monoclonal que se une especfficamente a Mcm5, que comprende la CDRH1 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 21, la CDRH2 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 23, la cDrH3 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 25, la CDRL1 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 15, la CDRL2 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 17 y la CDRL3 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 19.
  3. 3. Un anticuerpo monoclonal que se une especfficamente a Mcm5, que comprende la CDRH1 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 9, la CDRH2 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 11, la CDRH3 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 13, la CDRL1 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO:
  4. 3. la CDRL2 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 5 y la CDRL3 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 7.
  5. 4. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que tiene una afinidad por Mcm5 en el intervalo de 110 nM.
  6. 5. El anticuerpo de la reivindicacion 1 (ii) o la reivindicacion 3, en donde el anticuerpo comprende una region variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 98 % identica a la SEQ ID NO: 29, y el anticuerpo comprende una region variable de la cadena ligera que tiene una secuencia al menos el 98 % identica a la SEQ ID NO: 27.
  7. 6. El anticuerpo de la reivindicacion 1 (i) o la reivindicacion 2, en donde el anticuerpo comprende una region variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 98 % identica a la SEQ ID NO: 33, y el anticuerpo comprende una region variable de la cadena ligera que tiene una secuencia al menos el 98 % identica a la SEQ ID NO: 31.
  8. 7. Una composicion que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
  9. 8. Una composicion que comprende:
    (i) una secuencia de acido nucleico al menos el 98 %, 99 % o 100 % identica a la SEQ ID NO: 28 y una
    secuencia de acido nucleico al menos el 98 %, 99 % o 100 % identica a la SEQ ID NO: 30; o
    (ii) una secuencia de acido nucleico al menos el 98 %, 99 % o 100 % identica a la SEQ ID NO: 32 y una
    secuencia de acido nucleico al menos el 98 %, 99 % o 100 % identica a la SEQ ID NO: 34; o
    (iii) una secuencia de acido nucleico de la SEQ ID NO: 28 y una secuencia de acido nucleico de la SEQ ID NO: 30; o
    (iv) una secuencia de acido nucleico de la SEQ ID NO: 32 y una secuencia de acido nucleico de la SEQ ID NO: 34.
  10. 9. Una celula hospedadora que comprende el acido nucleico de la reivindicacion 8, de forma opcional, en donde la celula hospedadora es una celula CHO o una celula E.coli.
  11. 10. Un metodo de fabricacion de un anticuerpo que comprende:
    (i) cultivar una celula hospedadora de la reivindicacion 9; y
    (ii) aislar un anticuerpo a partir de la celula hospedadora.
  12. 11. El metodo de la reivindicacion 10:
    (i) que comprende adicionalmente una etapa de marcaje del anticuerpo conjugando el anticuerpo con un radiomarcador; o
    (ii) que comprende adicionalmente una etapa de inmovilizacion del anticuerpo a un soporte solido.
  13. 12. Un kit que comprende:
    (i) una composicion que comprende un primer anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 (i), 2 o 6; y
    (ii) una composicion que comprende un segundo anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 (ii), 3 o 5.
    5
    10
    15
    20
    25
    30
  14. 13. Un metodo de determinacion de la concentracion o cantidad de Mcm5 en una muestra que comprende las siguientes etapas:
    (i) proporcionar un primer anticuerpo inmovilizado, que es un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 inmovilizado en un soporte solido;
    (ii) exponer la muestra al primer anticuerpo inmovilizado, de forma que la Mcm5 en la muestra se pueda unir al anticuerpo inmovilizado para proporcionar la Mcm5 inmovilizada;
    (iii) proporcionar un segundo anticuerpo marcado, que es un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 conjugado con un marcador;
    (iv) exponer la Mcm5 inmovilizada al segundo anticuerpo marcado, de forma que el segundo anticuerpo marcado se pueda unir a la Mcm5; y
    (v) detectar la concentracion del segundo anticuerpo marcado;
    en donde tanto el primer anticuerpo como el segundo anticuerpo se unen a Mcm5, pero el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo se unen a distintos epftopos de Mcm5.
  15. 14. El kit de reivindicacion 12 o el metodo de la reivindicacion 13, en donde tanto el primer anticuerpo como el segundo anticuerpo se unen a Mcm5, pero el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo se unen a distintos epftopos de Mcm5; y
    (a)
    (i) el primer anticuerpo se une a la SEQ ID NO: 1 y el segundo anticuerpo se une a la SEQ ID NO: 2; o
    (ii) el primer anticuerpo se une a la SEQ ID NO: 2 y el segundo anticuerpo se une a la SEQ ID NO: 1; y/o
    (b) el primer anticuerpo esta inmovilizado en una placa de ELISA; y/o
    (c) el segundo anticuerpo esta inmovilizado en una placa de ELISA; y/o
    (d) el segundo anticuerpo esta conjugado con un marcador radioactivo, de forma opcional, en donde el marcador radioactivo es Europio 3+; y/o
    (e) el primer anticuerpo esta conjugado con un marcador radioactivo, de forma opcional, en donde el marcador radioactivo es Europio 3+.
  16. 15. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 13-14, en donde la etapa de deteccion de la concentracion del segundo anticuerpo marcado comprende la deteccion inmunofluorescente de Eu3+.
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