JP2018520127A - Ｍｃｍ５に結合するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

本発明は、Mcm5に結合する抗体に関する。本発明はさらに、当該抗体を含む組成物又はキット、当該抗体を発現することができるハイブリドーマ、当該抗体をコードするポリヌクレオチド、ポリペプチド及びベクター、並びに当該抗体を作製する方法に関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、Mcmタンパク質に結合するモノクローナル抗体、当該モノクローナル抗体を含む組成物若しくはキット、又は当該抗体を使用する方法に関する。

泌尿器がん(場合によっては「泌尿器系がん」と呼ばれる)は、増加しつつある主要な疫学的問題である。経済上最も重要な泌尿器がんのうち2つが膀胱がん及び前立腺がんである。

前立腺がんは、男性で非黒色腫皮膚がんに次いで2番目に多いがんであり、英国では毎年35,000人超の新患が診断されており、毎年約10,200人の死亡が前立腺がんによるものである。毎年、欧州で約300,000人、米国で190,000人及び世界中で670,000人の新患が発生している。Cancer Research UKは、英国の男性で診断されたがんの新患全てのうち4分の1が前立腺がんであり、新たな診断の60%が70才超の男性であることを報告している。この疾患の最も一般的な形態は腺癌である。5年生存率は英国でほぼ80%である。環境的要因は知られていないが、前立腺がん又は乳がんの近親者がいる者は、この疾患を発症するリスクがより高い。西アフリカ及びアフリカ系カリブ人男性では、前立腺がんリスクが増加している。

前立腺がんの症状は前立腺の良性腫大によるものと類似しており、尿意切迫、尿が通過する際の困難又は痛み、及びまれに、尿又は精液中の血液を含む。しかし、多くの男性において、痛みを伴う転移が主に骨で生じるまで疾患は無症状のままである。

治療は、腫瘍のステージ及びグレード、並びに患者の全身の健康状態及び年齢によって決まる。選択肢には、積極的監視、部分的又は根治的前立腺摘除、精巣摘除、ホルモン治療、及び小線源療法などの放射線療法が含まれる。精巣摘除及びホルモン治療は、腫瘍増殖に不可欠なテストステロンの産生を低下させるか根絶する。

前立腺がんの確定診断には多面的な手法が必要である。至適基準となる現行の前立腺がん診断検査は生検材料の組織学的検査である。生検を行うかどうかの決定は、加齢に関連する血清(前立腺特異抗原)PSAレベル及び/又は異常直腸指診(DRE)に基づく。DREは腺を経直腸的に触診して異常な形態を検査するものであり、非特異的でもある。腺の形態を変化させるのに小さ過ぎる腫瘍は検出されず、また、非悪性状態によっても異常な形態又は腫大が引き起こされる。これは当技術分野における問題である。前立腺試料は通常、TRUS(経直腸的超音波)ガイド下針生検を使用して採取される。採取される腺の面積を最大にするため、複数の針コアが通常最大12採取される。この手順は外来で、泌尿器科医により、看護師又は医療アシスタントと協力して、局所麻酔下で実施される。この手順は、患者にとってある程度痛みを伴うこと、並びに患者を敗血症及び/又は出血のリスクにさらすことを含む欠点を抱えている。組織コアは、実験室で悪性細胞の存在について顕微鏡的に検査されるが、これには、労力を要し、高度に熟練した細胞学者が必要であり、ヒューマンエラーの影響を受けやすいという問題がある。

生検は侵襲性かつ費用がかかることが理解できる。前立腺がんなどの泌尿器がんの診断及び/又は監視のため、より費用対効果が高く、信頼でき、かつ/又は非侵襲性の手段が当技術分野で必要とされている。前立腺がん用の、代替となりかつ/又は侵襲性が低い既知の診断法は、特定の生物学的マーカー(「バイオマーカー」)の分析を伴う。

前立腺がんの核酸バイオマーカーの例は、PCA3(前立腺がん遺伝子3)試験である。この泌尿器アッセイでは、前立腺がんで過剰発現したPCA3遺伝子由来のノンコーディングmRNAを特定する(Hessels & Schalken、The use of PCA3 in the diagnosis of prostate cancer. Nat Rev Urol, 6, 255-61; 2009)。PCA3試験(Gen-Probe, Inc)は、上皮細胞を含む前立腺分泌物を尿道中にしぼり出すために使用される、規定の形態の前立腺マッサージ後に産生される初尿検体の分析によるものである。前立腺がん診断方法として、PCA3は、以下で論じるPSA試験と同様のROC(受信者動作特性曲線)値0.68を有する(Chun et al, Prostate Cancer Gene 3 (PCA3): development and internal validation of a novel biopsy nomogram. Eur Urol; 2009 vol 56 p659-668)。しかし、PCA3試験は費用がかかり、かつポイントオブケアでの使用に適しておらず、このことがこの先行技術における問題となっている。

前立腺がんの存在を示すのに頻繁に使用されるタンパク質バイオマーカーの例はPSA(前立腺特異抗原)である。プライマリーケアにかかっている、症状のある患者は通常、血清PSA試験及びDREを受ける。しかし、PSAは前立腺がんに特異的なものではない。PSAは恒常的に発現される組織特異的細胞内酵素である。健康な前立腺を有する男性の血清中にも低濃度のPSAが存在する。血清中のPSAレベルの上昇は前立腺からの漏出により発生し、腺の相対的サイズを示すものである。PSAの上昇は、良性前立腺肥大症及び前立腺炎などの非悪性状態でも、前立腺がんでも発生しうる。男性が年をとるにつれて腺の体積は増加し、その結果、悪性疾患非存在下でPSAレベルが上昇する。最近の研究で、「陽性」PSA試験(血清PSAレベル4ng/mL超)の60〜70%ががんに関連していないことが判明した(Kilpelainen et al., False-positive screening results in the Finnish prostate cancer screening trial, British Journal of Cancer. 102, 469-474; 2010)。高い偽陽性率という結果から、多くの不要な生検操作がなされ、また試験が集団スクリーニングに適さないものとなっている。さらに、PSA試験は、特に若い男性における有意な数の前立腺がんの症例を検出することができない。ROC(受信者動作特性)分析で測定されたPSA試験の精度は0.678(Thompson et al., Operating characteristics of a prostate-specific antigen in men with an initial PSA level of 3.0 ng/ml or lower. JAMA, 294, 66-70; 2005)である。英国では、迅速なポイントオブケアアッセイが利用可能であるにもかかわらず、通常は、病院検査室でPSA試験が実施される。

膀胱がんは、男性では4番目に多いがん、女性では9番目に多いがんであり、有意な罹患率及び死亡率をもたらしている(Jemal et al. CA Cancer J Clin. 2007. 57:43-66.)。膀胱がん患者のほとんどが、肉眼的若しくは顕微鏡的血尿、又は頻度及び排尿障害などのその他の刺激性排尿症状を呈した後に診断を受ける。初期診断では、患者の約70%が、上皮又は上皮下結合組織に限定される膀胱がんを有する。これらのがんは、内視鏡的切除及び膀胱内療法で処置可能である。これらの腫瘍の再発率は50%〜70%の範囲であり、症例のうち10%〜15%が5年の期間を過ぎて筋層浸潤に進行する(Shariat et al., 2008. Rev Urol. 10:120-135)。再発は、数年後であっても局所的に、よりまれには上部尿路に見られ、生涯にわたる監視が必要である。残りの30%の患者は初期診断で筋層浸潤性がんを有する。この集団のうち、50%が2年以内に遠隔転移を有し、60%が治療にもかかわらず5年以内に死亡する。

膀胱がんの確定診断には、手順の組合せが必要である。現在のところ、早期の膀胱がんの存在について正確かつ容易に特定する方法は存在しない。泌尿器科にかかった、適切な症状を有する患者における膀胱がんのスクリーニングは現在、検尿、膀胱鏡検査、及び腹部超音波、静脈性尿路造影、コンピュータ断層撮影又は磁気共鳴画像法などのスキャニング法により行われる。場合により、尿試料由来の細胞を顕微鏡的に検査する尿細胞診が使用される。膀胱がん検出の主力である膀胱鏡検査は、局所尿道麻酔により実施される、比較的短期間で外傷性が最小限の手順であり、ほぼ全ての乳頭状病変及び無茎性病変を特定する。それでもやはりこれは依然として侵襲性であり、患者にとっての不快及び苦痛の原因となる。さらに膀胱鏡検査は、特に留置カテーテル又は活動性炎症を有する患者における膀胱粘膜の肉眼的に異常な外観によって時折確定的でない場合があり、尿管内のがんを検出することができない。膀胱尿路上皮を直接可視化し生検することができるため、膀胱鏡検査は膀胱がん診断のための至適基準と考えられるものの、操作者エラー、又は検出が困難でありうる小面積の「インサイチューでの癌腫」のいずれかにより、相当の偽陰性率を有する(van der Poel & Debruyne. Curr Opin Urol. 2001; 11:503-509; Herr. BJU Int. 1999; 84:1102-1103.)。

膀胱がんの尿細胞診において、特定の細胞表面抗原、核形態、遺伝子発現又はその他の生物学的マーカーの存在について剥離細胞を調べることができる。尿細胞診は高悪性度の膀胱がんの検出について高い感度及び特異度を有するが、低悪性度の腫瘍を検出するための感度を有しない(Wiener et al. Acta Cytol. 1993;37:163-169)。膀胱がん再発の予測における尿細胞診の精度は、一つには結果の解釈に主観的要素があるため、広範に変動する可能性がある。したがって、細胞診は膀胱がんのスクリーニング及び監視に理想的ではない。

Mcm5はがんのバイオマーカーである(WO99021014)。尿沈渣中の、Mcm5などのMcmタンパク質レベルの上昇は、前立腺における悪性変化と関連している。したがって、これらのMcmタンパク質レベルの上昇が、前立腺がんを検出するのに使用可能となった。2抗体法に、DELFIA(登録商標)(Dissociation-Enhanced Lanthanide Fluorometric Immunoassay)、並びに抗Mcm5モノクローナル抗体4B4及び12A7を使用して、Dudderidgeら(BJC, 103, 701-707; 2010)は、前立腺がん検出における泌尿器バイオマーカーとしてのMcm5の使用について調べ、これが「前立腺がん患者を特定するための簡便で正確かつ非侵襲性の方法と考えられる」と結論付けた。特異度30%を有するPSA試験と比較して、Mcm5の特異度は73%〜93%の間と推定された。重要なことには、PSA試験の短所である偽陽性結果が良性前立腺肥大症で生じなかった。

しかし、きわめて特異的にMcm5に結合し、そのためMcm5用の高親和性アッセイをデザインするのに適した抗体の配列については開示されていない。

本発明は、きわめて特異的に、Mcmタンパク質、例えばMcm5などのバイオマーカーに結合する抗体を提供する。これらの抗体はバイオマーカーレベルを検出するのに有用である。例えば、これらの抗体は泌尿器がんを検出するための診断検査に使用可能である。

現在のところ、泌尿器がん、特に前立腺がん又は膀胱がんの検出は困難であり、侵襲性の技術が必要である場合がある。Mcm5はがんのバイオマーカーである。本発明者らは、Mcm5に結合するが、互いに異なるエピトープに結合する2種類の抗体を開発した(12A7は配列番号1に結合し、4B4は配列番号2に結合する)。このような抗体は、Mcm5(又はこれらのエピトープを含む類似のMcmタンパク質)を検出するためのアッセイに使用可能であるため有利である。具体的には、これらの抗体は、Mcm5抗原の固定化が必要なアッセイで使用可能である。例えば、2部位免疫測定法を使用してMcm5を検出することができる。Mcm5に結合する第1の抗体をプレートに結合することができる。このプレートを、尿試料などの試料に曝露することができる。試料中のあらゆるMcm5が第1の抗体により固定化される(「捕捉される」)。次いでプレートを洗浄し、第1の抗体に結合した固定化されたMcm5を残して、あらゆるその他の混入物を除去することができる。Mcm5に結合する第2の抗体を使用して、結合したMcm5の濃度を検出することができる。この第2の抗体は、Eu³⁺などの検出剤にコンジュゲートさせるべきである。プレートを第2の抗体に曝露することができ、第2の抗体は固定化されたMcm5に結合する。過剰量の抗体を洗浄により除去することができる。残った第2の抗体の量を、存在するEu³⁺の量を測定する蛍光定量化により検出することができる。残った第2の抗体の量は、試料中のMcm5濃度に比例する。

しかし、このようなアッセイを開発するには、Mcm5に結合する2種類の抗体が特定されなければならない。さらに、これらの2種類の抗体が互いに異なるエピトープに結合しなければならないだけでなく、2種類の抗体が結合する2種類の異なるエピトープが、両抗体がMcm5に同時に(実質的な立体障害なしに)結合することができるように、空間をあけて位置付けられなければならない。本発明者らは、2種類のこのような抗体(12A7及び4B4と命名)を開発した。これらの2種類の抗体は、それぞれ配列番号1及び配列番号2に結合する。配列番号1及び配列番号2は、2種類の抗体がMcm5に同時に結合することができるようにMcm5に空間をあけて配置される、2種類の異なるMcm5エピトープの代表である。このことは実施例2及び3で実証される。本発明者らは、各エピトープに対する抗体が同時に結合することができるように配置される2種類のMcm5エピトープを特定した第一人者である。さらに本発明者らは、Mcm5に独立に結合することができる2種類の抗体の配列を提供した第一人者でもある。

したがって、本発明の第1の態様において、
(i)配列番号1又は2のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合し、
(ii)a.配列番号9の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号9と異なる配列を有する12A7 CDRH1、
b.配列番号11の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号11と異なる配列を有する12A7 CDRH2、
c.配列番号13の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号13と異なる配列を有する12A7 CDRH3、
d.配列番号3の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号3と異なる配列を有する12A7 CDRL1、
e.配列番号5の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号5と異なる配列を有する12A7 CDRL2、
f.配列番号7の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号7と異なる配列を有する12A7 CDRL3、
g.配列番号21の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号21と異なる配列を有する4B4 CDRH1、
h.配列番号23の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号23と異なる配列を有する4B4 CDRH2、及び
i.配列番号25の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号25と異なる配列を有する4B4 CDRH3、
j.配列番号15の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号15と異なる配列を有する4B4 CDRL1、
k.配列番号17の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号17と異なる配列を有する4B4 CDRL2、
l.配列番号19の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号19と異なる配列を有する4B4 CDRL3
からなる群から選択される少なくとも1つのCDRを含み、
(iii)配列番号29又は33に対し少なくとも85%、90%、95%、98%、99%又は100%同一である配列を有する重鎖可変領域を含み、
(iv)配列番号27又は31に対し少なくとも85%、90%、95%、98%、99%又は100%同一である配列を有する軽鎖可変領域配列を含み、又は
(v)(i)、(ii)、(iii)又は(iv)の抗体と競合する
抗体が提供される。

本発明の第2の態様において、本発明の抗体を含む組成物が提供される。

本発明の第3の態様において、本発明の抗体を産生することができるハイブリドーマ細胞株が提供される。

本発明の第4の態様において、本発明の抗体の重鎖を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドが提供される。

本発明の第5の態様において、本発明の抗体の軽鎖を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドが提供される。

本発明の第6の態様において、配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32又は34に対し少なくとも85%、90%、95%、98%、99%、又は100%同一である核酸配列を含むポリヌクレオチドが提供される。

本発明の第7の態様において、配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32又は34の核酸配列を含むポリヌクレオチドが提供される。

本発明の第8の態様において、本発明の核酸を含むベクターが提供される。

本発明の第9の態様において、本発明の核酸又はベクターを含む宿主細胞が提供される。

本発明の第10の態様において、
(i)本発明のハイブリドーマ細胞株又は宿主細胞を増殖させるステップ、及び
(ii)ハイブリドーマ細胞株又は宿主細胞から抗体を単離するステップ
を含む、抗体を作製する方法が提供される。

本発明の第11の態様において、
(i)本発明の第1の抗体を含む組成物、及び
(ii)Mcm5に結合する第2の抗体を含む組成物
を含むキットが提供される。

本発明の第12の態様において、
(i)本発明の第1の抗体を含む組成物、及び
(ii)本発明の第2の抗体を含む組成物
を含むキットが提供される。

本発明の第13の態様において、試料中のMcm5の濃度を決定する方法であって、
(i)固体支持体に固定化された本発明の抗体である、固定化された第1の抗体を用意するステップ、
(ii)固定化された第1の抗体に試料中のMcm5が結合できるように、固定化された第1の抗体に試料を曝露して、固定化されたMcm5を用意するステップ、
(iii)標識にコンジュゲートさせた本発明の抗体である、標識された第2の抗体を用意するステップ、
(iv)標識された第2の抗体がMcm5に結合できるように、標識された第2の抗体に固定化されたMcm5を曝露するステップ、及び
(v)標識された第2の抗体の濃度を検出するステップ
を含む方法が提供される。

抗体
本発明は抗体を提供する。「抗体」という語は、天然に存在する形態、又は一本鎖抗体、キメラ抗体若しくはヒト化抗体などの組換え抗体を指すことができる。「抗体(antibody)」及び「抗体(antibodies)」という語は、Mcm5などのMcmタンパク質などの標的タンパク質に結合しうる抗体フラグメントも包含すると考えられる。このようなフラグメントには、Fab'₂、F'(ab)₂、Fv、一本鎖抗体又はダイアボディ(diabody)が含まれうる。好ましい実施形態において、本発明の抗体は天然に存在する全長抗体(フラグメントではなく)である。好ましい実施形態において、抗体はマウス抗体(すなわちマウス脾細胞由来)である。

一般的に、抗体は2本の重鎖及び2本の軽鎖より形成される。各重鎖は重鎖定常領域(CH)及び重鎖可変領域(VH)から構成される。同様に各軽鎖は軽鎖定常領域(CL)及び軽鎖可変領域(VL)から構成される。VH及びVL領域は相補性決定領域(CDR)を含む。CDRは標的タンパク質への特異的結合に主に関与する。

本発明の抗体は、任意のクラス、特にIgG、IgM又はIgAの抗体とすることができる。好ましい実施形態において、抗体はIgG抗体である。

「モノクローナル抗体」という語は、実質的に同様の抗体の集団、すなわち天然に存在する少数の変異体を除いて同一である抗体の集団から得られる抗体を指すことを意図される。モノクローナル抗体の集団は同じエピトープに結合する。モノクローナル抗体は、"Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", H Zola(CRC Press, 1988)及び"Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Application", SG Hurrell(CRC Press, 1982)で開示される方法を含む、当業者に周知の様々な技術により産生可能である。一実施形態において、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。

抗体標的
好ましくは、抗体はMcm5に特異的に結合する。さらにより好ましくは、抗体は配列番号1又は配列番号2のうち少なくとも1つに結合する。任意選択で、抗体は配列番号1又は配列番号2のうち少なくとも1つに特異的に結合する。

Mcm5は推定上のDNA複製ライセンシング因子であり、MCM(ミニ染色体維持)タンパク質ファミリーのメンバーである。MCMタンパク質はクロマチンに結合し、また、ヘリカーゼ活性を示し、そのためDNA複製のコア成分であると考えられている。Mcm5は細胞周期のG0からG1/S期への移行においてアップレギュレートされ、細胞周期の調節に活発に関与している可能性がある。Mcm5はMCMファミリーの少なくとも2つのその他のメンバーと相互作用することができる。

MCMタンパク質2〜7は、その後のDNA複製のための、クロマチンで形成され不可欠な必要条件である複製前複合体、又はライセンシング因子の一部を含む。MCMタンパク質複合体は複製ヘリカーゼとして作用し、ゆえにDNA複製機構のコア成分である。MCMは細胞周期のG0からG1/S期への移行においてアップレギュレートされ、細胞周期の調節に活発に関与する。MCMタンパク質は、クロマチンの周囲に環状構造を形成する。

ヒトMcm5遺伝子は22q13.1に位置し、成熟Mcm5タンパク質はアミノ酸734個からなる(配列番号35、UNIPROT P33992:ヒトDNA複製ライセンシング因子MCM5)。しかし、Mcm5遺伝子は個体間で配列がわずかに異なる可能性がある。この理由から、「Mcm5に結合する」という用語は、配列番号35に結合する抗体だけでなく、配列番号35に対し少なくとも90%、95%、95%、98%、99%又は100%同一である配列を有するポリペプチドに結合する抗体も指す。好ましい実施形態において、抗体は配列番号35に対し100%同一であるポリペプチドに結合する。さらに、本発明の抗体はMcm5のエピトープ(フラグメント)(例えば配列番号1又は配列番号2)に結合する。したがって、「Mcm5に結合する抗体」という用語は、配列番号1又は配列番号2などの、Mcm5の単一のエピトープにのみ結合する抗体を指す。

本発明の目的において、「結合親和性」という用語は、抗体がその標的に結合する能力を指す。本発明の目的において、「特異的に結合する」という用語は、別の非標的分子への結合における結合親和性と比較して少なくとも2倍、10倍、50倍又は100倍大きい結合親和性で、Mcm5などの標的に結合する抗体を指す。一実施形態において、非標的分子はMcm2などの、Mcm5以外のMcmタンパク質である。好ましくは、本発明の抗体は、別の非標的分子への結合における結合親和性と比較して少なくとも2倍、10倍、50倍又は100倍大きい結合親和性で、Mcmタンパク質、任意選択でMcm5に結合することができる。さらにより好ましくは、本発明の抗体は、別の非標的分子への結合における結合親和性と比較して少なくとも2倍、10倍、50倍又は100倍大きい結合親和性で、配列番号1又は配列番号2に結合することができる。

Mcm5に対する結合親和性を評価するための好ましい方法はELISAによるものである。好ましくは、本発明の抗体は、2500ng/ml若しくはそれ未満、1500ng/ml若しくはそれ未満、1000ng/ml若しくはそれ未満、600ng/ml若しくはそれ未満、50ng/ml若しくはそれ未満、30ng/ml若しくはそれ未満、20ng/ml若しくはそれ未満、又は10ng/ml若しくはそれ未満のMcm5に対する親和性(実施例2に記載されるように、EC50すなわち50%最大結合濃度として測定される)を有する。EC50は通常1ng/ml超であり、ゆえにEC50は、1ng/mlから前文で指定された上限値のいずれかの間となりうる。抗体などのリガンドが標的に結合する能力を評価するその他の標準的なアッセイが、例えば、ウェスタンブロット、RIA、及びフローサイトメトリー分析を含めて当技術分野で既知である。抗体の結合動態(例えば結合親和性)も、表面プラズモン共鳴(SPR)(例えばBiacore(商標)システム)分析などの、当技術分野で既知の標準的なアッセイにより評価することができる。Mcm5への結合における親和定数(KD)は、好ましくは1〜10000nM、1〜1000nM、1〜500nM、1〜100nM、1〜50nM又は1〜10nMの範囲である。会合速度(ka)は、好ましくは0.4〜3.4x10⁶ 1/Mの範囲である。解離速度(kd)は、好ましくは1〜10x10^-3 1/sの範囲である。これらの値は通常、SPR(表面プラズモン共鳴)により決定可能である。

相補性決定領域(CDR)
本発明の抗体は、好ましくは抗体12A7又は4B4のCDR、すなわち:
a.配列番号9の配列、又は1、2若しくは3アミノ酸置換により配列番号9と異なる配列を有する12A7 CDRH1、
b.配列番号11の配列、又は1、2若しくは3アミノ酸置換により配列番号11と異なる配列を有する12A7 CDRH2、
c.配列番号13の配列、又は1、2若しくは3アミノ酸置換により配列番号13と異なる配列を有する12A7 CDRH3、
d.配列番号3の配列、又は1、2若しくは3アミノ酸置換により配列番号3と異なる配列を有する12A7 CDRL1、
e.配列番号5の配列、又は1、2若しくは3アミノ酸置換により配列番号5と異なる配列を有する12A7 CDRL2、
f.配列番号7の配列、又は1、2若しくは3アミノ酸置換により配列番号7と異なる配列を有する12A7 CDRL3、
g.配列番号21の配列、又は1、2若しくは3アミノ酸置換により配列番号21と異なる配列を有する4B4 CDRH1、
h.配列番号23の配列、又は1、2若しくは3アミノ酸置換により配列番23と異なる配列を有する4B4 CDRH2、
i.配列番号25の配列、又は1、2若しくは3アミノ酸置換により配列番号25と異なる配列を有する4B4 CDRH3、
j.配列番号15の配列、又は1、2若しくは3アミノ酸置換により配列番号15と異なる配列を有する4B4 CDRL1、
k.配列番号17の配列、又は1、2若しくは3アミノ酸置換により配列番号17と異なる配列を有する4B4 CDRL2、及び
l.配列番号19の配列、又は1、2若しくは3アミノ酸置換により配列番号19と異なる配列を有する4B4 CDRL3
からなる群から選択されるCDRのうち少なくとも1つを含む。

4B4及び12A7抗体と同じCDRを有する抗体は、その他の領域において4B4及び12A7の配列と実質的に異なっていてもよい。このような抗体は、例えば抗体フラグメントであってもよい。

「1アミノ酸置換(単一アミノ酸置換)により配列番号3と異なる配列」という用語は、配列番号3で規定されるアミノ酸1つが、異なるアミノ酸で置き換えられる可能性を指す。好ましくは、このような置き換えは保存的アミノ酸置換である。以下の8つの群はそれぞれ、互いに通常保存的置換であるアミノ酸を含む:
1)アラニン、グリシン、
2)アスパラギン酸、グルタミン酸、
3)アスパラギン、グルタミン、
4)アルギニン、リジン、
5)イソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン、
6)フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、
7)セリン、スレオニン、及び
8)システイン、メチオニン。

一実施形態において、本発明の抗体は、12A7の重鎖由来の少なくとも1つのCDR(12A7 CDRH1、12A7 CDRH2又は12A7 CDRH3)、及び12A7の軽鎖由来の少なくとも1つのCDR(12A7 CDRL1、12A7 CDRL2又は12A7 CDRL3)を含む。さらなる実施形態において、本発明の抗体は、12A7の重鎖由来の少なくとも2つのCDR、及び12A7の軽鎖由来の少なくとも2つのCDRを含む。好ましい実施形態において、本発明の抗体は、12A7の重鎖由来の3つ全てのCDR、及び/又は12A7の軽鎖由来の3つ全てのCDRを含む。一実施形態において、本発明の抗体は、12A7 CDRL1及び12A7 CDRL2、12A7 CDRL1及び12A7 CDRL3、12A7 CDRL1及び12A7 CDRH1、12A7 CDRL1及び12A7 CDRH2、12A7 CDRL1及び12A7 CDRH3、12A7 CDRL2及び12A7 CDRL3、12A7 CDRL2及び12A7 CDRH1、12A7 CDRL2及び12A7 CDRH2、12A7 CDRL2及び12A7 CDRH3、12A7 CDRL3及び12A7 CDRH1、12A7 CDRL3及び12A7 CDRH2、12A7 CDRL3及び12A7 CDRH3、12A7 CDRH1及び12A7 CDRH2、12A7 CDRH1及び12A7 CDRH3、又は12A7 CDRH2及び12A7 CDRH3を含む。

一実施形態において、本発明の抗体は、4B4の重鎖由来の少なくとも1つのCDR(4B4 CDRH1、4B4 CDRH2又は4B4 CDRH3)、及び4B4の軽鎖由来の少なくとも1つのCDR(4B4 CDRL1、4B4 CDRL2又は4B4 CDRL3)を含む。さらなる実施形態において、本発明の抗体は、4B4の重鎖由来の少なくとも2つのCDR、及び4B4の軽鎖由来の少なくとも2つのCDRを含む。好ましい実施形態において、本発明の抗体は、4B4の重鎖由来の3つ全てのCDR、及び/又は4B4の軽鎖由来の3つ全てのCDRを含む。一実施形態において、本発明の抗体は、4B4 CDRL1及び4B4 CDRL2、4B4 CDRL1及び4B4 CDRL3、4B4 CDRL1及び4B4 CDRH1、4B4 CDRL1及び4B4 CDRH2、4B4 CDRL1及び4B4 CDRH3、4B4 CDRL2及び4B4 CDRL3、4B4 CDRL2及び4B4 CDRH1、4B4 CDRL2及び4B4 CDRH2、4B4 CDRL2及び4B4 CDRH3、4B4 CDRL3及び4B4 CDRH1、4B4 CDRL3及び4B4 CDRH2、4B4 CDRL3及び4B4 CDRH3、4B4 CDRH1及び4B4 CDRH2、4B4 CDRH1及び4B4 CDRH3、又は4B4 CDRH2及び4B4 CDRH3を含む。

好ましい実施形態において、本発明の抗体は、配列番号3(12A7 CDRL1)、配列番号5(12A7 CDRL2)、配列番号7(12A7 CDRL3)、配列番号9(12A7 CDRH1)、配列番号11(12A7 CDRH2)、配列番号13(12A7 CDRH3)、配列番号15(4B4 CDRL1)、配列番号17(4B4 CDRL2)、配列番号19(4B4 CDRL3)、配列番号21(4B4 CDRH1)、配列番号23(4B4 CDRH2)又は配列番号25(4B4 CDRH3)のうちいずれか1つに記載されるものに対し同一である配列を有する、少なくとも1つのCDRを含む。本発明の抗体が12A7 CDRL2を含む一実施形態において、12A7 CDRL2は配列番号5に記載される配列を有する。本発明の抗体が12A7 CDRL1を含むさらなる実施形態において、12A7 CDRL1は配列番号3に記載される配列を有する。本発明の抗体が12A7 CDRL3を含むさらなる実施形態において、12A7 CDRL3は配列番号7に記載される配列を有する。本発明の抗体が12A7 CDRH1を含むさらなる実施形態において、12A7 CDRH1は配列番号9に記載される配列を有する。本発明の抗体が12A7 CDRH2を含むさらなる実施形態において、12A7 CDRH2は配列番号11に記載される配列を有する。本発明の抗体が12A7 CDRH3を含むさらなる実施形態において、12A7 CDRH3は配列番号13に記載される配列を有する。本発明の抗体が4B4 CDRL1を含むさらなる実施形態において、4B4 CDRL1は配列番号15に記載される配列を有する。本発明の抗体が4B4 CDRL2を含むさらなる実施形態において、4B4 CDRL2は配列番号17に記載される配列を有する。本発明の抗体が4B4 CDRL3を含むさらなる実施形態において、4B4 CDRL3は配列番号19に記載される配列を有する。本発明の抗体が4B4 CDRH1を含むさらなる実施形態において、4B4 CDRH1は配列番号21に記載される配列を有する。本発明の抗体が4B4 CDRH2を含むさらなる実施形態において、4B4 CDRH2は配列番号23に記載される配列を有する。本発明の抗体が4B4 CDRH3を含むさらなる実施形態において、4B4 CDRH3は配列番号25に記載される配列を有する。

好ましくは、12A7又は4B4のCDRのうち少なくとも1つを含む抗体が、Mcm5に結合する(任意選択で特異的に結合する)。さらにより好ましくは、12A7又は4B4のCDRのうち少なくとも1つを含む抗体が、配列番号1又は配列番号2に結合する(任意選択で特異的に結合する)。

重鎖及び軽鎖可変領域配列
本発明の抗体は、好ましくは、配列番号29若しくは33に対し少なくとも85%、90%、95%、98%、99%若しくは100%同一である配列を有する重鎖可変領域、及び/又は配列番号27若しくは31に対し少なくとも85%、90%、95%、98%、99%若しくは100%同一である配列を有する軽鎖可変領域配列を含む。このような抗体は、本明細書で「本発明の変異体抗体」と呼ばれる。

一実施形態において、抗体は、配列番号29に対し少なくとも95%同一である配列を有する重鎖可変領域を含む。さらなる実施形態において、抗体は、配列番号29に対し少なくとも98%同一である配列を有する重鎖可変領域を含む。一実施形態において、抗体は、配列番号27に対し少なくとも95%同一である配列を有する軽鎖可変領域を含む。さらなる実施形態において、抗体は、配列番号27に対し少なくとも98%同一である配列を有する軽鎖可変領域を含む。さらなる実施形態において、抗体は、配列番号27に対し少なくとも95%同一である配列を有する軽鎖可変領域、及び配列番号29に対し少なくとも95%同一である配列を有する重鎖可変領域を含む。好ましい実施形態において、抗体は、配列番号29に対し少なくとも98%同一である配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号27に対し少なくとも98%同一である配列を有する軽鎖可変領域を含む。

さらなる実施形態において、抗体は、配列番号33に対し少なくとも95%同一である配列を有する重鎖可変領域を含む。さらなる実施形態において、抗体は、配列番号33に対し少なくとも98%同一である配列を有する重鎖可変領域を含む。さらなる実施形態において、抗体は、配列番号31に対し少なくとも95%同一である配列を有する軽鎖可変領域を含む。さらなる実施形態において、抗体は、配列番号31に対し少なくとも98%同一である配列を有する軽鎖可変領域を含む。さらなる実施形態において、抗体は、配列番号33に対し少なくとも95%同一である配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号31に対し少なくとも95%同一である配列を有する軽鎖可変領域を有する。好ましい実施形態において、抗体は、配列番号33に対し少なくとも98%同一である配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号31に対し少なくとも98%同一である配列を有する軽鎖可変領域を有する。

当業者には既知であるように、抗体は、フレームワーク領域を含めた複数の領域を含む。フレームワーク領域におけるアミノ酸の欠失又は付加は、抗体がその標的に結合する能力に影響を及ぼす可能性が低い。一方で、CDRにおける突然変異は、抗体が標的に結合する能力に影響を及ぼす可能性がかなり高い。したがって、本発明の特定の実施形態において、変異体抗体は、12A7又は4B4抗体のCDRに対し同一であるCDRを有するか、1アミノ酸置換(好ましくは保存的アミノ酸置換)によってのみ異なるCDRを有する。本発明の変異体抗体は、配列番号27、29、31又は33に記載されるものときわめて顕著に配列が異なるフレームワーク領域を有していてよい。

任意選択で、本発明の抗体が配列番号29に対し少なくとも85%、90%、95%、98%、99%又は100%同一である配列を有する重鎖可変領域を含む場合、抗体は12A7 CDRH1、12A7 CDRH2又は12A7 CDRH3のうち少なくとも1つをさらに含む。標的結合特異性はCDRにより決定されるため、12A7のCDRを含む抗体は、抗体配列の残りがきわめて可変であってもやはりMcm5に結合可能である、ということを当業者は理解している。この理由から、抗体が12A7 CDRH1、12A7 CDRH2又は12A7 CDRH3のうち少なくとも1つを含む場合、抗体は好ましくは、配列番号29に対し少なくとも90%同一である配列を有する重鎖可変領域を含む。より好ましい実施形態において、本発明の抗体は、12A7 CDRH1、12A7 CDRH2及び12A7 CDRH3を含み、配列番号29に対し少なくとも95%同一である配列を有する重鎖可変領域を含む。

任意選択で、本発明の抗体が配列番号33に対し少なくとも85%、90%、95%、98%、99%又は100%同一である配列を有する重鎖可変領域を含む場合、抗体は4B4 CDRH1、4B4 CDRH2又は4B4 CDRH3のうち少なくとも1つをさらに含む。標的結合特異性はCDRにより決定されるため、4B4のCDRを含む抗体は、抗体配列の残りがきわめて可変であってもやはりMcm5に結合可能である、ということを当業者は理解している。この理由から、抗体が4B4 CDRH1、4B4 CDRH2又は4B4 CDRH3のうち少なくとも1つを含む場合、抗体は好ましくは、配列番号33に対し少なくとも90%同一である配列を有する重鎖可変領域を含む。より好ましい実施形態において、本発明の抗体は、4B4 CDRH1、4B4 CDRH2及び4B4 CDRH3を含み、配列番号33に対し少なくとも95%同一である配列を有する重鎖可変領域を含む。

任意選択で、本発明の抗体が配列番号27に対し少なくとも85%、90%、95%、98%、99%又は100%同一である配列を有する軽鎖可変領域を含む場合、抗体は12A7 CDRL1、12A7 CDRL2又は12A7 CDRL3のうち少なくとも1つをさらに含む。標的結合特異性はCDRにより決定されるため、12A7のCDRを含む抗体は、抗体配列の残りがきわめて可変であってもやはりMcm5に結合可能である、ということを当業者は理解している。この理由から、抗体が12A7 CDRL1、12A7 CDRL2又は12A7 CDRL3のうち少なくとも1つを含む場合、抗体は好ましくは、配列番号27に対し少なくとも90%同一である配列を有する軽鎖可変領域を含む。より好ましい実施形態において、本発明の抗体は、12A7 CDRL1、12A7 CDRL2及び12A7 CDRL3を含み、配列番号27に対し少なくとも95%同一である配列を有する軽鎖可変領域を含む。

任意選択で、本発明の抗体が配列番号31に対し少なくとも85%、90%、95%、98%、99%又は100%同一である配列を有する軽鎖可変領域を含む場合、抗体は4B4 CDRL1、4B4 CDRL2又は4B4 CDRL3のうち少なくとも1つをさらに含む。標的結合特異性はCDRにより決定されるため、4B4のCDRを含む抗体は、抗体配列の残りがきわめて可変であってもやはりMcm5に結合可能である、ということを当業者は理解している。この理由から、抗体が4B4 CDRL1、4B4 CDRL2又は4B4 CDRL3のうち少なくとも1つを含む場合、抗体は好ましくは、配列番号31に対し少なくとも90%同一である配列を有する重鎖可変領域を含む。より好ましい実施形態において、本発明の抗体は、4B4 CDRL1、4B4 CDRL2及び4B4 CDRL3を含み、配列番号31に対し少なくとも95%同一である配列を有する重鎖可変領域を含む。

本発明のさらなる実施形態において、本発明の抗体は:
(i)12A7 CDRH1、12A7 CDRH2及び12A7 CDRH3、
(ii)配列番号29に対し少なくとも95%同一である配列を有する重鎖可変領域、
(iii)12A7 CDRL1、12A7 CDRL2及び12A7 CDRL3、並びに
(iv)配列番号27に対し少なくとも95%同一である配列を有する軽鎖可変領域
を含む。

さらなる実施形態において、本発明の抗体は:
(i)4B4 CDRH1、4B4 CDRH2及び4B4 CDRH3、
(ii)配列番号33に対し少なくとも95%同一である配列を有する重鎖可変領域、
(iii)4B4 CDRL1、4B4 CDRL2及び4B4 CDRL3、並びに
(iv)配列番号31に対し少なくとも95%同一である配列を有する重鎖可変領域
を含む。

配列番号29に対し同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号27に対し同一である軽鎖可変領域配列を有する抗体を抗体12A7と呼ぶことができる。配列番号33に対し同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号31に対し同一である軽鎖可変領域配列を有する抗体を抗体4B4と呼ぶことができる。

一部の実施形態において、本発明の変異体抗体は、Mcm5への結合において12A7抗体と競合する。同様に、本発明の一部の実施形態において、本発明の変異体抗体は、Mcm5への結合において4B4抗体と競合する。

本発明の目的において、以下のパラメータでClustalW(Thompson et al., 1994)を使用して評価した場合、配列が少なくとも90%、95%、98%、99%又は100%の同一性を有していれば、抗体は、もう1つの抗体に対し「少なくとも90%、95%、98%、99%又は100%」同一である:
ペアワイズアラインメントパラメータ -方法:accurate、マトリックス:PAM、ギャップオープンペナルティ:10.00、ギャップ伸長ペナルティ:0.10、
マルチプルアラインメントパラメータ -マトリックス:PAM、ギャップオープンペナルティ:10.00、遅延についての同一性%(%identity for delay):30、ペナライズエンドギャップ(Penalize end gaps):on、ギャップ分離距離(Gap separation distance):0、ネガティブマトリックス:no、ギャップ伸長ペナルティ:0.20、残基特異的ギャップペナルティ(Residue-specific gap penalties):on、親水性ギャップペナルティ(Hydrophilic gap penalties):on、親水性残基:GPSNDQEKR。

Mcm5に結合する、本発明の変異体抗体を作製する方法については、当業者の知識の十分に範囲内である。このような変異体抗体は、配列番号27、29、31又は33と比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50又は100個の置換又は欠失突然変異を含んでいてよい。「欠失」変異体抗体は、1、2、3、4、5若しくはそれ超のアミノ酸の欠失、又は、一部の場合では、配列番号27、29、31若しくは33の領域全体の欠失を含んでいてよい。「置換」変異体は、1、2、3、4、5又はそれ超のアミノ酸の、同じ数の新たなアミノ酸による置き換えを含んでいてよい。

好ましくは、本発明の変異体抗体は、保存的アミノ酸置換により(任意選択で保存的アミノ酸置換のみにより)、配列番号27、29、31又は33と異なる配列を含む。当業者は、このような保存的置換では抗体の結合特性が変化する可能性が低いことを十分に知っている。

本発明の抗体と競合する抗体
本発明は、本発明の抗体と競合する抗体をさらに提供する。例えば、本発明は:
(i)配列番号1又は2のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合し、
(ii)12A7 CDRH1、12A7 CDRH2、12A7 CDRH3、12A7 CDRL1、12A7 CDRL2、12A7 CDRL3、4B4 CDRH1、4B4 CDRH2、4B4 CDRH3、4B4 CDRL1、4B4 CDRL2、及び4B4 CDRL3からなる群から選択される少なくとも1つのCDRを含み、
(iii)配列番号29又は33に対し少なくとも85%、90%、95%、98%、99%又は100%同一である配列を有する重鎖可変領域を含み、又は
(iv)配列番号27又は31に対し少なくとも85%、90%、95%、98%、99%又は100%同一である配列を有する軽鎖可変領域配列を含む
抗体と競合する抗体を提供する。

好ましくは、本発明は、12A7 CDRH1、12A7 CDRH2、12A7 CDRH3、12A7 CDRL1、12A7 CDRL2、及び12A7 CDRL3を含む抗体、又は4B4 CDRH1、4B4 CDRH2、4B4 CDRH3、4B4 CDRL1、4B4 CDRL2、及び4B4 CDRL3を含む抗体と競合する抗体を提供する。さらにより好ましくは、本発明は、配列番号29又は33に対し100%同一である配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号27又は31に対し100%同一である配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体と競合する抗体を提供する。最も好ましい実施形態において、本発明は、抗体12A7又は抗体4B4と競合する抗体を提供する。

抗体が本発明の別の抗体と競合するかどうかを決定することは、当業者の能力の範囲内である。

例えば、4B4又は12A7抗体などの参照抗体をELISAプレートに固定化することにより、ELISAアッセイを実施することができる。次いでプレートを適切なブロッキング剤でブロッキングする。過剰量のもう1つの抗体を添加する(もう1つの抗体は、4B4又は12A7抗体と競合する能力が評価される抗体、例えば4B4又は12A7と競合する本発明の抗体である)。Mcm5を添加する。適切なインキュベーション期間の後ELISAプレートを洗浄し、Mcm5検出剤を添加して、固定化された参照抗体に結合したMcm5の量を測定する。抗体が4B4と競合するかどうかを検出するためにこの試験を使用することになる場合、適切な検出試薬は標識された12A7抗体である。同様に、抗体が12A7と競合するかどうかを検出するためにこの試験を使用することになる場合、適切な検出試薬は標識された4B4抗体である。50%阻害が発生する濃度はKiとして知られている。好ましい実施形態において、12A7又は4B4と競合する抗体は、Mcm5に結合しない抗体と比較して、2分の1、5分の1、10分の1、50分の1又は100分の1のKiで結合する。

一実施形態において、本発明の抗体と競合する抗体は、同じエピトープ(例えば配列番号1又は配列番号2)に結合する抗体である。Mcm5などの標的タンパク質がフラグメントに消化される実験(例えば以下の実施例3を参照のこと)を実施することにより、どのエピトープに抗体が結合するかを決定することができる。次いで、12A7及び4B4抗体が各フラグメントに結合する親和性を決定することができる。第1の抗体が適度な親和性で結合するフラグメント(エピトープを表す)が決定されると、エピトープが合成可能となる。次いで、フラグメントに対する第2の抗体の結合親和性を測定することにより、第2の抗体が同じエピトープに結合することができるかどうかを決定することができる。

標識された抗体
本発明の抗体を、標識(例えばユーロピウム³⁺又は西洋ワサビペルオキシダーゼ)にコンジュゲートさせることができる。標識は直接付着させても、リンカー(アジピン酸ジヒドラジド(ADH)など)を介して付着させてもよい。

標識は、化学的コンジュゲーションによって付着させることができる。標識を抗体にコンジュゲートさせる方法は当技術分野で既知である。例えば、カルボジイミドコンジュゲーション(Bauminger & Wilchek (1980) Methods Enzymol. 70、151-159)を使用して、標識を抗体にコンジュゲートさせることができる。標識を抗体にコンジュゲートさせるその他の方法も使用可能である。例えば、適切な反応物質の過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化、その後の還元的アルキル化が使用可能であり、グルタルアルデヒド架橋も使用可能である。しかし、本発明のコンジュゲートを産生するどの方法が選択されるかに関わらず、コンジュゲートされた抗体が標的指向能力を維持しているか、コンジュゲートされた標識が機能を維持しているかの決定がなされなければならないことが認識される。

好ましい実施形態において、本発明の抗体は、ユーロピウムにコンジュゲートさせることにより標識される。これは、EG&G Wallac DELFIA(登録商標)Eu-labellingキットを使用し、製造業者のプロトコールに従って成し遂げられる。

組成物
本発明のさらなる態様において、本発明の抗体を含む組成物が提供される。このような組成物は、溶液中で抗体を安定化させることができる適切な安定化剤をさらに含んでいてよい。例えば、組成物は、TAPS(3-{[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アミノ}プロパンスルホン酸)、ビシン(N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン)、トリス(トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミン)、トリシン(N-トリス(ヒドロキシメチル(メチルグリシン)))、TAPSO(3-[N-トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ]-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)、HEPES(4-2-ヒドロキシエチル-1-ピペラジンエタンスルホン酸)、リン酸緩衝生理食塩水及びMOPS(3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸)からなる群から選択される緩衝液を含んでいてよい。好ましい実施形態において、組成物はpH7.6のリン酸緩衝生理食塩水を含む。さらに好ましい実施形態において、組成物は、0.01%〜0.09%の間のアジ化ナトリウムを含有するリン酸緩衝生理食塩水を含む。好ましくは、組成物は、本発明の抗体を室温又は15℃、10℃、7℃、5℃、0℃、-10℃、若しくは-25℃以下の温度で保存するのに適した薬剤を含む。好ましい実施形態において、組成物は、本発明の抗体を2℃〜8℃の間の温度で保存するのに適した薬剤を含む。さらなる実施形態において、組成物は、糖、例えばラクトース又はトレハロース、などの安定化剤を含む。

本発明の抗体を例えばユーロピウム標識にコンジュゲートさせる場合、組成物中に7.5%の精製済みBSA安定化剤を含むことが有利である。

核酸及びベクター
本発明は、本発明の抗体をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドにも関する。したがって、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載される任意の抗体をコードする核酸配列を含んでいてよい。「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」という用語は本明細書で互換可能に使用され、ヌクレオチドの任意の長さの高分子形態、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、又はそれらのアナログを指す。

選択されたポリペプチドを「コードする」核酸は、適切な制御配列の制御下に置かれると、インビボでポリペプチドに転写(DNAの場合)及び翻訳(mRNAの場合)される核酸分子である。コード配列の境界は、5'(アミノ)末端の開始コドン及び3'(カルボキシ)末端の翻訳終止コドンにより決定される。

例えば、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号29若しくは33に対し少なくとも95%同一である配列を有する可変領域を含む抗体、又は配列番号27若しくは31に対し少なくとも95%同一である配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体をコードする核酸を含んでいてよい。本発明のポリヌクレオチドは、配列番号29に対し少なくとも95%同一である配列を有するポリペプチド、及び配列番号27に対し少なくとも95%同一である配列を有するポリペプチドの両方をコードしていてよい。あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号33に対し少なくとも95%同一である配列を有するポリペプチド、及び配列番号31に対し少なくとも95%同一である配列を有するポリペプチドの両方をコードしていてよい。

本発明のポリヌクレオチドの例は、配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32又は34に対し少なくとも85%、90%、95%、98%、99%又は100%同一である核酸配列を含むか、これらからなる。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号28、30、32又は34に対し少なくとも85%、90%、95%、98%、99%又は100%同一である核酸配列を含むか、これらからなる。任意選択で、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号28に対し少なくとも95%の同一性を有するポリヌクレオチド配列、及び配列番号30に対し少なくとも95%の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。任意選択で、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号32に対し少なくとも95%の同一性を有するポリヌクレオチド配列、及び配列番号34に対し少なくとも95%の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。

したがって、本発明の抗体は、これをコードし、発現することができるポリヌクレオチドから産生されうる。抗体が2つ以上の鎖を含む場合、本発明のポリヌクレオチドは抗体軽鎖、及び抗体重鎖、又はそれら両方をコードしていてもよい。一方が抗体軽鎖をコードし、他方が対応する抗体重鎖をコードする、2種類のポリヌクレオチドが提供されてもよい。このようなポリヌクレオチド又は一対のポリヌクレオチドが、本発明の抗体が生成されるように共に発現されてよい。

本発明のポリヌクレオチドは、例としてSambrook et al (1989, Molecular Cloning - a laboratory manual; Cold Spring Harbor Press)に記載されるように、当技術分野で周知の方法に従って合成することができる。

本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター(プラスミド又は組換えウイルスベクターなど)をさらに提供する。ベクターは通常、挿入された配列に作動可能に連結された制御配列をさらに含み、ゆえにインビボで本発明の抗体の発現を可能にする。好ましくは、本発明のベクターは、本発明のポリペプチドの発現を可能にするため、適切なイニシエーター、プロモーター、エンハンサー、及び正しい方向に位置づけられた必要でありうるその他のエレメントをさらに含む。

ハイブリドーマ細胞株
本発明は、本発明の抗体を産生することができるハイブリドーマ細胞株をさらに提供する。このようなハイブリドーマ細胞株は、適切な培養状態で維持されると、本発明の抗体を産生する。

本発明の抗体を発現するハイブリドーマを開発することは、当業者の能力の十分に範囲内である。これは、マウス、ウサギ又はモルモットなどの哺乳動物を、抗原(例えばMcm5)で免疫化することにより実施可能である。Freund完全アジュバントなどのアジュバントを含めると有益となりうる。免疫化された哺乳動物の脾細胞を取り出して骨髄腫細胞と融合させ、適切な条件を前提として不死の、抗体を分泌するハイブリドーマ株を形成させる。ハイブリドーマを単一クローンに分け、各クローンにより分泌された抗体を、Mcm5タンパク質に対する結合能力について評価する。

宿主細胞株
本発明は、本発明の核酸又はベクターを含む宿主細胞も提供する。このような宿主細胞には、本発明の抗体を発現するように改変された細胞が含まれる。このような宿主細胞は、真核細胞であっても原核細胞であってもよい。例えば、宿主細胞は哺乳動物細胞、昆虫細胞、又は細菌細胞とすることができる。本発明のベクター又は核酸の挿入により改変されうる宿主細胞の特定の例には、哺乳動物HEK293T、CHO、HeLa、NS0及びCOS細胞が含まれる。あるいは、大腸菌(E.coli)などの細菌細胞が使用可能である。

このような宿主細胞は、本発明の抗体を産生する通常の方法を使用して培養することができる。

抗体産生
本発明の抗体は任意の方法を使用して産生可能である。一実施形態において、抗体はハイブリドーマ細胞株から直接産生される。本発明のさらなる実施形態において、抗体は組換えにより産生される。

ハイブリドーマ細胞株から抗体を産生するため、細胞株をインビトロで、例えば細胞培養フラスコ又は発酵槽などの容器中で培養することができ、当技術分野で既知の従来技術を使用して容器から抗体を単離することができる。本発明の目的において、ある抗体がハイブリドーマ細胞株により産生された抗体由来である場合、その抗体は「ハイブリドーマ細胞株により産生された」とみなされる。例えば、ハイブリドーマ細胞株から抗体を得て、抗体のアミノ酸配列を配列決定し、抗体のアミノ酸配列をコードするベクターをCHO細胞又は大腸菌細胞などの細胞にトランスフェクトすることは、当業者の能力の十分に範囲内である。このような抗体は、ハイブリドーマ細胞株により産生された抗体「に由来する」とみなすことができる。特定の一実施形態において、本発明の抗体は、ハイブリドーマ細胞株自体から直接産生される。

あるいは、組換え技術を使用して本発明の抗体を産生することができる。本発明の抗体の配列を使用して、本発明の宿主細胞株にトランスフェクトすることができる。フラスコ又は発酵槽で細胞株を増殖させることができ、細胞により発現された抗体を、標準的な技術(アフィニティークロマトグラフィーなど)を使用して単離及び精製することができる。

精製すると、次いで抗体を放射標識にコンジュゲートさせるか、固体支持体に固定化することができる。適切な固体支持体の例はELISAプレートである。

試料中のMcm5濃度を決定するキット及び方法
本発明の抗体は、キットの一部として使用可能である。例えば、抗体を試料、例えばヒト由来の試料中のMcm5濃度を検出するのに使用するためのキットの一部とすることができ、これにより、試料が採取された対象におけるがんの検出が可能になる。

あるいは、本発明の抗体を、試料中のMcm5の濃度又は量を検出する方法(本発明のMcm5検出方法とも呼ばれる)に使用することができる。好ましくは、このような方法は、
(i)固体支持体に固定化された本発明の抗体である、固定化された第1の抗体を用意するステップ、
(ii)固定化された第1の抗体に試料中のMcm5が結合できるように、固定化された第1の抗体に試料を曝露して、固定化されたMcm5を用意するステップ、
(iii)標識にコンジュゲートさせた本発明の抗体である、標識された第2の抗体を用意するステップ、
(iv)標識された第2の抗体がMcm5に結合できるように、標識された第2の抗体に固定化されたMcm5を曝露するステップ、及び
(v)標識された第2の抗体の濃度を検出するステップ
を含む。

好ましくは、その濃度がステップ(v)において検出される第2の抗体が、ステップ(iv)でMcm5に確実に結合するように、ステップ(iv)及び(v)の間に洗浄ステップが入る。任意選択で、過剰量の第1の抗体を除去するためステップ(i)後に、及び/又は過剰量のMcm5を除去するためステップ(ii)後に、さらなる洗浄ステップが入る。任意選択で、洗浄ステップは固体支持体を洗浄緩衝液に曝露することにより実施される。

一実施形態において、本発明のキットに存在するか本発明の方法に使用される抗体は、前立腺がん又は膀胱がんなどの泌尿器がんを検出するのに適している。

好ましくは、試料中のMcm5の濃度又は量を検出する方法は、互いに競合せず(4B4及び12A7抗体など)、好ましくは目的の抗原の異なるエピトープに結合する本発明の2種類の抗体を使用し、又は、本発明のキットはこれらを含む。これは、上記のものなどのELISAを実施することにより決定可能である。2種類の抗体のうち1種類をELISAプレートに固定化することができる。次いで、適切なブロッキング剤でプレートをブロッキングする。次いで、過剰量の他方の抗体(第1の抗体と競合する能力について評価される抗体)を添加する。次いで、Mcm5などの標的抗原を添加する。適切なインキュベーション期間後、ELISAプレートを洗浄し、標的抗原に結合することができる検出剤を添加して、固定化された抗体に結合した標的抗原の量を測定する。2種類の抗体が競合する場合、固定化された抗体に結合する標的抗原の量は、抗体同士が競合しない(及び任意選択で、異なるエピトープに結合する)場合よりも小さくなる。50%阻害が発生する濃度はKiとして知られる。好ましい実施形態において、別の抗体と競合する抗体は、競合しない抗体と比較して、2分の1、5分の1、10分の1、50分の1又は100分の1のKiで結合する。

好ましい実施形態において、本発明のMcm5検出方法は、本発明の第1の抗体及び本発明の第2の抗体を使用し、又は、本発明のキットはこれらを含む。第1の抗体は配列番号1に結合する(任意選択で、特異的に結合する)ことができ、第2の抗体は配列番号2に結合する(任意選択で、特異的に結合する)ことができる。第1の抗体は、12A7 CDRH1、12A7 CDRH2、12A7 CDRH3、12A7 CDRL1、12A7 CDRL2、及び12A7 CDRL3からなる群から選択される少なくとも1つのCDRを含んでいてよい。第2の抗体は、4B4 CDRH1、4B4 CDRH2、4B4 CDRH3、4B4 CDRL1、4B4 CDRL2及び4B4 CDRL3からなる群から選択される少なくとも1つのCDRを含んでいてよい。好ましくは、第1の抗体は12A7 CDRH1、12A7 CDRH2、12A7 CDRH3、12A7 CDRL1、12A7 CDRL2、及び12A7 CDRL3を含む。好ましくは、第2の抗体は12A7 CDRH1、12A7 CDRH2、12A7 CDRH3、12A7 CDRL1、12A7 CDRL2、及び12A7 CDRL3を含む。一実施形態において、第1の抗体は、配列番号29に対し少なくとも85%、90%、95%、98%、99%又は100%同一である配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号27に対し少なくとも85%、90%、95%、98%、99%又は100%同一である配列を有する軽鎖可変領域配列を含む。一実施形態において、第2の抗体は、配列番号33に対し少なくとも85%、90%、95%、98%、99%又は100%同一である配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号31に対し少なくとも85%、90%、95%、98%、99%又は100%同一である配列を有する軽鎖可変領域配列を含む。

本発明のMcm5検出方法において、DELFIA検出システムを使用することができる。このような実施形態において、第1の抗体及び第2の抗体は、好ましくは異なるエピトープに結合する。このような実施形態において、抗体のうち一方(第1又は第2のモノクローナル抗体)をプレートに固定化することができる。試験される試料をプレートに添加することができる。次いで、他方の抗体(プレートに固定化されなかった第1又は第2の抗体)を添加することができる。他方の抗体はユーロピウム標識などの検出剤にコンジュゲートさせるべきである。次いで、時間分解蛍光分光法を使用して、(存在する標識された抗体の量を測定することにより)標的抗原が存在するかどうかを決定することができる。

したがって、本発明の一実施形態において、本発明のキットは、放射標識、例えばユーロピウムにコンジュゲートさせた本発明の第1又は第2の抗体を含む。第1のモノクローナル抗体又は第2のモノクローナル抗体をユーロピウム標識にコンジュゲートさせるため、任意の方法が使用可能である。このような標識を実施するためのキットが利用可能である。例えば、Eu-NI-ITCキレートを使用して、第1又は第2のモノクローナル抗体をユーロピウムにコンジュゲートさせることができる。

このような実施形態において、本発明のキットは、DELFIA検出システムで使用するためのさらなる成分を含んでいてよい。このようなさらなる成分は、DELFIA増強溶液又はDELFIA検出溶液を含んでいてよい。

定義
「含む(comprises)」という用語は、「含む(includes)」を意味する。したがって、「含む(comprises)」という用語、並びに「含む(comprise)」、及び「含む(comprising)」などの変化形は、明記される化合物又は組成物又はステップ、又は化合物若しくはステップの群を含むことを含意するが、任意のその他の化合物、組成物、ステップ又はそれらの群を除外することは含意しないことが理解されるものである。

上記の明細書で言及される出版物全てが、参照によって本明細書に組み入れられる。記載される本発明の態様及び実施形態についての各種改変及び変更が、本発明の範囲から逸脱することなく当業者にとって明らかであるものである。本発明は特定の好ましい実施形態に関して記載されるが、請求項に係る本発明がこのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際、本発明を実施するための記載される様式についての、当業者にとって明らかな各種改変は、以下の特許請求の範囲内にあることが意図される。

Mcm5のクローニング
ステージI:クローニング戦略
1. DNAの648bpフラグメントを増幅するため、ヒトMCM5 cDNAを含む検証済みIMAGEクローンを得て、PCR鋳型として使用した。フォワードPCRプライマーは、n開始コドン及び特許を受けていない改変ポリヒスチジンタグ(HQ)₄をコードしていた。

2. 2制限部位戦略を使用して、PCRフラグメントを誘導発現大腸菌ベクターpTRC99aにクローニングした。このベクターにより、ハイブリッドtrp/lac「trc」プロモーターにより誘導される誘導発現が可能となる。下流には、NcoIクローニング部位によりもたらされる、開始ATGコドンから最適化された距離に位置するlacZリボソーム結合部位(RBS)がある。

ステージIIA:発現及び精製(小規模-10ml)
3. 高収量の発現タンパク質を確実にするため、Mcm5フラグメントを含む組換えプラスミドをBL21大腸菌(非λDE3)に形質転換した。

4. いくつかの小容量大腸菌培養物をIPTGで誘導した。細胞をSDSローディング緩衝液中で溶解させ、総タンパク質をSDS-PAGEで分離する。Urosensから供給されたマウスモノクローナルを使用するウェスタンブロッティングにより、高発現クローンを特定する。

ステージIIB:発現及び精製(大規模-500ml)
5. 特定された、高レベルの組換えタンパク質を有するクローンを0.5L規模で培養し、IPTGで誘導した。細胞をペレットにし、-70℃で保存した。Stoeber et al. J Natl Cancer Inst 2002 94 1071-9により記載される変性溶解緩衝液中で細胞を崩壊させた。

6. Hisタグ付き組換えタンパク質を、固定化金属アフィニティー(IMAC)クロマトグラフィーカラムで、変性条件下でアフィニティー精製した。タンパク質を、酸性緩衝液を使用して溶出し、保存緩衝液(0.3SDSを含むPBS)で透析した。

7. SDS-PAGE、及びUrosensから供給されたマウスモノクローナルを使用するウェスタンブロッティングにより、溶出されたタンパク質を分析及び定量した。

[実施例1]
MAbスクリーニングELISA
Welcome/CRUK Institute for Cancer and Developmental Biologyから、プロテインAで精製されたMAbを得た。これらの抗体を、Mcm5に結合する能力についてスクリーニングした。

Ni-NTA His-Sorb 96ウェルマイクロタイターコーティング済みプレートウェル(Qiagen)を使用して、組換えHis6タグ付きMcm5のELISAを実施した。BSAで予めブロッキングされたNi-NTAコーティング済みプレートにより、受動的吸着プレートコーティングで成し遂げられる、ウェルに対するMcm5のランダム提示と比較して、スペーサーへのニッケルによる親和性結合を介して6x Hisタグ付きMcmの配向した提示が確実となる。濃度625ng/mlのMcm5を、200μl/ウェルで96ウェルプレートのNi-NTA His-Sorb表面(Qiagen)にニッケルにより親和性固定化し、125ng hsMcm5/ウェルとした。製造業者の説明書に従ってこれを行い、His-6タグ付きタンパク質又はペプチドをプレートウェルに100ng/ウェルを超える力価で付着させた。これは、タンパク質又はペプチドがAb検出に制限的でないことを確実にするために行った。Mcm5 IFMAを開発するためのMAbスクリーニングを、Mcm5の酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)により実施した。MAbをスクリーニングするため、MAbを発現するハイブリドーマ培養物由来の上清をRTで3時間、マイクロタイターウェル中でインキュベートし、次いで自動96ウェルプレート洗浄機で洗い流した。MAbのMcm5 Ag-Ab複合体を、450ナノメートルでの吸光度(Abs 450nm)を測定するための、HRPにコンジュゲートさせたヤギ抗マウスIgG、TMB試薬及び1M H₂SO₄アッセイ停止液を使用する比色分析ELISAにより検出した。Ni-NTA His-Sorb表面及びMcm5に対する、ヤギ抗マウスHRPコンジュゲートの非特異的結合(NSB)が存在しないことを、MAb不含のウェルでのELISAを実施することにより排除した。マイクロタイターウェルにMcm5をニッケルにより親和性固定化させたウェルでELISAを実施することと並行して、Mcm5ウェルを除いたウェルでのELISAを実施することにより、Ni-NTAコーティング済みポリスチレンウェルに対する、スクリーニングされるマウスMAbのNSBの程度を確立した。

ハイブリドーマから採取された培地試料中のマウスMAbの、比色分析ELISAにおける作用(表2)を、強調されるクローンである12A7及び4B4の選択に使用した。選択されたMAbハイブリドーマを増殖させ、製造業者の説明書(Amersham Pharmacia Biotech Little Chalfont Buckinghamshire, UK)に従い、固相プロテインA分離を使用して培養上清から精製するためのIgGを産生させた。12A7 MAbが、Mcm5に対し最も大きい応答を引き起こした。

MAbの相対的親和性
プロテインAで精製されたMAbの相対的親和性を、Ab濃度の正規化、及びAg制限条件下での比色分析スクリーニングアッセイへのMAbの適用により決定した。Ni-NTA His-Sorbマイクロタイタープレートウェル全体でのMcm5のリニアタイトレーション(linear titration)により、Ag制限条件を決定した。Agが制限されない場合、得られる最大Abs 450読取り値が4.000となるため、観察される最大Abs 450nm 3.000未満がAg制限条件を示す。ウサギMcm5 PAb(101)及びヤギ抗ウサギHRPを使用してAgタイトレーションを実施し、ELISA応答を測定した。各Ni-NTAウェルに対する結合に利用可能であるMcm5 25ngをもたらした濃度は、PAbのELISA Abs 450応答に制限的であった。全て揃ったMcm5エピトープがPAbにより結合されるため、マウスMabの研究のためのAg制限条件を決定するためにウサギPAbを選択した。これにより、エピトープ競合の程度を決定するための、組合せインキュベーション研究において、MAbを調べることができることが確実となった。

プロテインAで精製されたMAb溶液中のIgG濃度を、分光光度計でのAbs 280nm測定により決定し、PBSでの希釈によりMAb濃度を正規化した。次いで、Mcm5 Ag制限条件下でニッケル親和性Mcm5ウェルのELISAに適用されたMAbの直線希釈(linear dilution)により、50%最大結合濃度を決定した。プレートでの25ng/ウェルhsMcm5rfに対する結合シグナルのプラトーを実証するため、ELISAでMAb 7A3をより大きな濃度範囲で流した。12A7についての50%最大結合応答は濃度20ng/ウェルで得られた。hsMcm5に対する最も高い相対的親和性を実証するため、12A7を50%最大結合濃度で示す(表3)。

[実施例2]
抗体のエピトープ競合
2部位免疫測定法のため、別個のエピトープを標的とする2種類のMAbが必要である。Ag制限条件においては、同じエピトープについて競合する一対のMAbにより、より大きい相対的親和性のAbの、競合するMAb非存在下でインキュベートされた場合のAbs 450nmシグナルに等しいELISA Abs 450nm測定値がもたらされる。しかし、別個のエピトープを標的とする一対のMAbをインキュベートすると、立体障害が存在しないという条件で、利用可能な制限されたAgに対するMAbの個々のAbs 450nm応答両方の合計に等しいAbs 450測定値がもたらされる。最大相対的親和性のMAb 12A7の、20ng/ウェルという50%最大結合濃度に対し、MAb 12A7及び4B4を正規化した。25ng/ウェルMcm5 Ag制限Ni-NTAプレートで、個々の及び一対のAbインキュベーション両方を使用するELISAを、正規化された濃度のMAbで行った。一対のMAbの組合せインキュベーションから測定される最も大きいAbs 450nmシグナルは、2部位IFMAにおいて使用するのに最も適したMAbを示す。

抗体エピトープ競合結果
Ab Agエピトープ競合ELISA研究結果(表4)は、MAb 4B4が、12A7との2部位結合に適合する別個のエピトープを標的とすることを示している。4B4をその他のMAbと並行してインキュベートすると、制限的なAgに対する両MAbの結合の合計に等しいAbs 450応答により、4B4が標的とする別個のエピトープが実証される。

最大相対的親和性の12A7とともに、MAbの50%最大結合濃度である20ng/ウェルを正規化した濃度でMAbをインキュベートした。2部位イムノアッセイの開発に最適なMAbを青色で強調し、そのELISA Abs 450応答を黄色で強調する。

[実施例3]
エピトープマッピング
使用した物品:

1:5000の希釈で二次ヤギ抗マウスIgG(H+L)DyLight680抗体により、ペプチドマイクロアレイのうち1つの事前染色を行って、主要なアッセイを妨害する可能性のある、抗原由来のペプチドとのバックグラウンド相互作用について調べた。その後、ペプチドマイクロアレイを、インキュベーション緩衝液中で、濃度1μg/ml及び10μg/mlのマウスモノクローナルIgG抗体12A7及び4B4とともにインキュベートし、その後、二次抗体で染色してスキャニング強度5(赤)で出力した。最後に、アッセイの質及びペプチドマイクロアレイの完全性を裏付けるため、ペプチドアレイを囲むHA及びFlag対照ペプチドを内部の品質管理として染色した(スキャニング強度 赤/緑:5/7)。

スポット強度の定量化及びペプチドアノテーションをPepSlide(登録商標)Analyzerで行った。ソフトウェアアルゴリズムは、各スポットの蛍光強度を未加工のフォアグラウンド及びバックグラウンドシグナルに分解し、フォアグラウンド強度中央値の標準偏差を算出する。平均フォアグラウンド強度中央値に基づいて強度マップを作成し、ペプチドマップにおける相互作用を、高いスポット強度は赤、低いスポット強度は白の強度カラーコードで強調した。

さらに我々は、N末端からC末端の抗原配列に対する抗体試料によるアッセイ全ての平均スポット強度をプロットし、全体のスポット強度及びシグナル対ノイズ比を可視化した。強度プロットはペプチドマップ及び強度マップ、並びに抗体試料により認識されたペプチド及びエピトープを特定するためのマイクロアレイスキャンの目視検査と相関関係にあった。特定のアミノ酸が抗体結合に寄与するかどうかが明らかとならなかった場合。

洗浄緩衝液中で15分間、ブロッキング緩衝液中で30分間事前に膨潤させた後、まずペプチドマイクロアレイのうち1つを、1:5000の希釈で二次ヤギ抗マウスIgG(H+L)DyLight680抗体とともに室温で30分間インキュベートし、抗原由来のペプチドとのバックグラウンド相互作用を分析した。スキャニング強度5では、我々は二次抗体の非特異的結合によるバックグラウンドを観察しなかった。スポットパターンが存在しないことによりマイクロアレイグリッドのアラインメントが妨害されるため、PepSlide(登録商標)Analyzerでのデータ定量化は不可能であり、かつ必要でなかった。

ペプチドマイクロアレイを、濃度1μg/ml及び10μg/mlのマウスモノクローナル抗体12A7とともにインキュベートした(右上)。各インキュベーション後、二次ヤギ抗マウスIgG(H+L)DyLight680抗体で染色し、その後スキャニング強度5で出力した。我々は、優れたシグナル対ノイズ比で、コンセンサスモチーフを有する隣接したペプチドの列により形成された、強力かつ明瞭なエピトープ様のスポットパターンを観察した。

ペプチドマイクロアレイを囲むHA及びFlag対照ペプチドの最終染色により、予期された明瞭なスポットパターンが生じ、ペプチドマイクロアレイ全体の完全性が検証された。

データを定量化し、その後、ペプチドマップ及び強度マップ、並びに濃度1μg/ml及び10μg/mlのマウスモノクローナル抗体12A7によるアッセイについての強度プロットを作成した。後者の強度プロットは、より明確なデータ概要をもたらすように均一化した。シグナルは、マイクロアレイスキャンで観察され、コンセンサスモチーフWDETKGEを有するペプチドに起因するエピトープ様のスポットパターンに基づくものであった。

ペプチドマイクロアレイを、濃度1μg/ml及び10μg/mlのマウスモノクローナル抗体4B4とともにインキュベートした。各インキュベーション後、二次ヤギ抗マウスIgG(H+L)DyLight680抗体で染色し、その後スキャニング強度5で出力した。我々は、優れたシグナル対ノイズ比で、コンセンサスモチーフを有する隣接したペプチドの列により形成された、強力かつ明瞭なエピトープ様のスポットパターンを2つ観察した。抗体濃度10μg/mlでは、エピトープ様のスポットパターンの未加工の強度は同様であったが、バックグラウンド相互作用がわずかに増加したことから、濃度範囲1〜10μg/mlの抗体のシグナル飽和が示される。ペプチドマイクロアレイを囲むHA及びFlag対照ペプチドの最終染色により、予期された明瞭なスポットパターンが生じ、ペプチドマイクロアレイ全体の完全性が検証された。

データを定量化し、その後、ペプチドマップ及び強度マップ、並びに濃度1μg/ml及び10μg/mlのマウスモノクローナル抗体4B4によるアッセイについての強度プロットを作成した。後者の強度プロットは、より明確なデータ概要をもたらすように均一化した。抗体濃度10μg/mlでは、エピトープ様のスポットパターンの未加工の強度は同様であったが、バックグラウンド相互作用がわずかに増加したことから、正規化されたシグナル強度の低下につながった。シグナルは、マイクロアレイスキャンで観察され、コンセンサスモチーフDDRVAIH及びWDETKGEを有するペプチドに起因するエピトープ様のスポットパターンに基づくものであった。

配列表

Claims (53)

1. Mcm5に特異的に結合する抗体であって、
   (i)配列番号2又は1のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合し、
   (ii)
   a.配列番号21の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号21と異なる配列を有する4B4 CDRH1、
   b.配列番号23の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号23と異なる配列を有する4B4 CDRH2、
   c.配列番号25の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号25と異なる配列を有する4B4 CDRH3、
   d.配列番号15の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号15と異なる配列を有する4B4 CDRL1、
   e.配列番号17の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号17と異なる配列を有する4B4 CDRL2、
   f.配列番号19の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号19と異なる配列を有する4B4 CDRL3、
   g.配列番号9の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号9と異なる配列を有する12A7 CDRH1、
   h.配列番号11の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号11と異なる配列を有する12A7 CDRH2、
   i.配列番号13の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号13と異なる配列を有する12A7 CDRH3、
   j.配列番号3の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号3と異なる配列を有する12A7 CDRL1、
   k.配列番号5の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号5と異なる配列を有する12A7 CDRL2、及び
   l.配列番号7の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号7と異なる配列を有する12A7 CDRL3
   から成る群から選択される少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含み、
   (iii)配列番号33又は29に対し少なくとも85%、90%、95%、98%、99%又は100%同一である配列を有する重鎖可変領域を含み、
   (iv)配列番号31又は27に対し少なくとも85%、90%、95%、98%、99%又は100%同一である配列を有する軽鎖可変領域配列を含み、又は
   (v)(i)、(ii)、(iii)又は(iv)の抗体と競合する、前記抗体。
2. 1〜10nMの範囲のMcm5に対する親和性を有する、請求項１記載の抗体。
3. Fab'₂、F'(ab)₂、Fv、一本鎖抗体又はダイアボディである、請求項１又は２記載の抗体。
4. 配列番号1のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する、請求項１〜３のいずれか１項記載の抗体。
5. 配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する、請求項１〜３のいずれか１項記載の抗体。
6. 12A7 CDRH1、12A7 CDRH2、12A7 CDRH3、12A7 CDRL1、12A7 CDRL2、及び12A7 CDRL3から成る群から選択される、2つ以上、3つ以上、4つ以上、又は5つ以上のCDRを含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の抗体。
7. 12A7 CDRH1、12A7 CDRH2、及び12A7 CDRH3を含む、請求項６記載の抗体。
8. 12A7 CDRL1、12A7 CDRL2及び12A7 CDRL3を含む、請求項６又は７記載の抗体。
9. 配列番号9の配列を有する12A7 CDRH1、配列番号11の配列を有する12A7 CDRH2、及び配列番号13の配列を有する12A7 CDRH3を含む、請求項６〜８のいずれか１項記載の抗体。
10. 配列番号3の配列を有する12A7 CDRL1、配列番号5の配列を有する12A7 CDRL2、及び配列番号7の配列を有する12A7 CDRL3を含む、請求項６〜９のいずれか１項記載の抗体。
11. 4B4 CDRH1、4B4 CDRH2、4B4 CDRH3、4B4 CDRL1、4B4 CDRL2、及び4B4 CDRL3から成る群から選択される、2つ以上、3つ以上、4つ以上、又は5つ以上のCDRを含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の抗体。
12. 4B4 CDRH1、4B4 CDRH2、及び4B4 CDRH3を含む、請求項１１記載の抗体。
13. 4B4 CDRL1、4B4 CDRL2及び4B4 CDRL3を含む、請求項１１又は１２記載の抗体。
14. 配列番号21の配列を有する4B4 CDRH1、配列番号23の配列を有する4B4 CDRH2、及び配列番号25の配列を有する4B4 CDRH3を含む、請求項１１〜１３のいずれか１項記載の抗体。
15. 配列番号15の配列を有する4B4 CDRL1、配列番号17の配列を有する4B4 CDRL2、及び配列番号19の配列を有する4B4 CDRL3を含む、請求項１１〜１４のいずれか１項記載の抗体。
16. 配列番号29に対し少なくとも95%同一である配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項１、２、３、４又は６〜１０のいずれか１項記載の抗体。
17. 配列番号29に対し少なくとも98%同一である配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項１、２、３、４、６〜１０又は１６のいずれか１項記載の抗体。
18. 配列番号27に対し少なくとも95%同一である配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１、２、３、４、６〜１０又は１６〜１７のいずれか１項記載の抗体。
19. 配列番号27に対し少なくとも98%同一である配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１、２、３、４、６〜１０又は１６〜１８のいずれか１項記載の抗体。
20. 配列番号33に対し少なくとも95%同一である配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項１、２、３、５又は１１〜１５のいずれか１項記載の抗体。
21. 配列番号33に対し少なくとも98%同一である配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項１、２、３、５、１１〜１５又は２０のいずれか１項記載の抗体。
22. 配列番号31に対し少なくとも95%同一である配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１、２、３、５、１１〜１５又は２０〜２１のいずれか１項記載の抗体。
23. 配列番号31に対し少なくとも98%同一である配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１、２、３、５、１１〜１５又は２０〜２２のいずれか１項記載の抗体。
24. 請求項１〜２３のいずれか１項記載の抗体を含む組成物。
25. 請求項１〜２３のいずれか１項記載の抗体を産生することができるハイブリドーマ細胞株。
26. 抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜２５のいずれか１項記載の抗体、組成物又はハイブリドーマ。
27. 抗体が放射標識で標識されている、請求項１〜２６のいずれか１項記載の抗体、組成物又はハイブリドーマ。
28. 放射標識がユーロピウムである、請求項２７記載の抗体、組成物、又はハイブリドーマ。
29. 請求項１〜２３又は２６のいずれか１項記載の抗体の重鎖を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
30. 請求項１〜２３又は２６のいずれか１項記載の抗体の軽鎖を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
31. 配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32又は34に対し少なくとも85%、90%、95%、98%、99%、又は100%同一である核酸配列を含むポリヌクレオチド。
32. 配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32又は34の核酸配列を含むポリヌクレオチド。
33. 請求項２９〜３２のいずれか１項記載の核酸を含むベクター。
34. 請求項２９〜３２のいずれか１項記載の核酸又は請求項３３記載のベクターを含む宿主細胞。
35. CHO細胞又は大腸菌細胞である、請求項３４記載の宿主細胞。
36. (i)請求項２５記載のハイブリドーマ細胞株又は請求項３４若しくは３５記載の宿主細胞を増殖させるステップ、及び
    (ii)ハイブリドーマ細胞株又は宿主細胞から抗体を単離するステップ
    を含む、抗体を作製する方法。
37. 抗体を放射標識にコンジュゲートさせることにより抗体を標識するステップをさらに含む、請求項３６記載の方法。
38. 抗体を固体支持体に固定化するステップをさらに含む、請求項３６記載の方法。
39. (i)請求項１〜２３のいずれか１項記載の第1の抗体を含む組成物、及び
    (ii)Mcm5に結合する第2の抗体を含む組成物
    を含むキット。
40. (i)請求項４、６〜１０又は１６〜１９のいずれか１項記載の第1の抗体を含む組成物、及び
    (ii)請求項５、１１〜１５又は２０〜２３のいずれか１項記載の第2の抗体を含む組成物
    を含むキット。
41. 試料中のMcm5の濃度又は量を決定する方法であって、
    (i)固体支持体に固定化された、請求項１〜２３又は２６のいずれか１項記載の抗体である、固定化された第1の抗体を用意するステップ、
    (ii)固定化された第1の抗体に試料中のMcm5が結合できるように、固定化された第1の抗体に試料を曝露して、固定化されたMcm5を用意するステップ、
    (iii)標識にコンジュゲートさせた、請求項１〜２３又は２６〜２８のいずれか１項記載の抗体である、標識された第2の抗体を用意するステップ、
    (iv)標識された第2の抗体がMcm5に結合できるように、標識された第2の抗体に固定化されたMcm5を曝露するステップ、及び
    (v)標識された第2の抗体の濃度を検出するステップ
    を含む、前記方法。
42. 第1の抗体及び第2の抗体がともにMcm5に結合するが、第1の抗体及び第2の抗体がMcm5の異なるエピトープに結合する、請求項３９若しくは４０記載のキット又は請求項４１記載の方法。
43. 第1の抗体が配列番号1に結合する、請求項３９又は４１〜４２のいずれか１項記載のキット又は方法。
44. 第1の抗体が配列番号2に結合する、請求項３９又は４１〜４２のいずれか１項記載のキット又は方法。
45. 第2の抗体が配列番号1に結合する、請求項３９、４１〜４２又は４４のいずれか１項記載のキット又は方法。
46. 第2の抗体が配列番号2に結合する、請求項３９又は４１〜４４のいずれか１項記載のキット又は方法。
47. 第1の抗体がELISAプレートに固定化されている、請求項３９〜４６のいずれか１項記載のキット又は方法。
48. 第2の抗体がELISAプレートに固定化されている、請求項３９〜４０又は４２〜４６のいずれか１項記載のキット。
49. 第2の抗体が放射性標識にコンジュゲートしている、請求項３９〜４７のいずれか１項記載のキット又は方法。
50. 第1の抗体が放射性標識にコンジュゲートしている、請求項３９〜４０、４２〜４６又は４８のいずれか１項記載のキット。
51. 放射性標識がユーロピウム³⁺である、請求項４９又は５０記載のキット又は方法。
52. 標識された第2の抗体の濃度を検出するステップが、Eu³⁺の免疫蛍光検出を含む、請求項４１〜５１のいずれか１項記載の方法。
53. 請求項４１〜４７又は４９のいずれか１項記載の方法の実施における、請求項３９〜４０若しくは４２〜５１のいずれか１項記載のキット又は請求項１〜２３若しくは２６のいずれか１項記載の抗体の使用。