TR201808196T4 - Mcm5 bağlayan monoklonal antikorlar. - Google Patents

Abstract

Buluş, Mcm proteinlerine bağlanan monoklonal antikorlar, monoklonal antikorları içeren kompozisyonlar veya kitler ya da antikorların kullanılmasına ait metotları ile ilişkidir.

Description

Tarifname Antikor Mevcut bulus bir antikor temin etmektedir. "Antikor" terimi, tek zincirli antikor, kimerik antikor ya da insanlastirilmis antikor gibi dogal olarak olusan formlari ya da rekombinant antikoru ifade edebilir. "Antikor" ve "antikorlar" terimlerinin de ayni zamanda, Mcm5 benzeri bir Mcm proteini gibi bir hedef proteine baglanabilen antikor fragmentlerini kapsadigi düsünülebilir. Bu tür fragmentler, Fab'2, Fi(ab)2, Fv, tek zincirli antikor ya da diabodileri içerebilir. Tercih edilen bir uygulamada bulusa ait antikor dogal olarak olusan, tam uzunlukta antikordur (fragmentleri yerine). Tercih edilen bir uygulamada antikor bir fare antikorudur (yani, orijinal olarak fare dalak hücrelerinden elde edilen).

Genelde, antikorlar, iki agir zincirlerden ve iki hafif zincirlerden olusturulur. Her agir zincir, bir agir zincir sabit bölgesinden (CH) ve bir agir degisken bölgesinden (VH) olusur. Benzer bir sekilde her hafif zincir, bir hafif zincir sabit bölgesinden (CL) ve bir hafif degisken bölgesinden (VL) olusur. VH ve VL bölgeleri, tamamlayici tanimlama bölgelerini (CDR'ler) içerir. CDR'Ier primer olarak hedef proteine spesifik baglanmadan sorumludur.

Bulusa ait bir antikoru, herhangi bir sinifin, özellikle IgG, IgM ya da IgA'nin bir antikoru olabilir. Tercih edilen bir uygulamada antikor, bir IgG antikorudur. bir antikoru anlamina geldigi, yani dogal olarak olusan varyantlarin bir azinligi haricinde esdeger olan bir antikor popülasyonu anlamina geldigi amaçlamaktadir. Bir monoklonal antikor popülasyonu ayni epitopa baglanir. Monoklonal antikor, teknikte uzman kisilerce iyi bilinen çesitli teknikler ile ve "Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988) sayili belgede ve "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Application", SG Hurrell (CRC Press, 1982) sayili belgede açiklanan metotlarin dahil edilmesi ile üretilebilir. Bulusa ait antikor bir monoklonal antikordur.

Antikor hedefi Antikor, özellikle Mcm5'e baglanir. Antikor, SEK lD NO: 1 ya da SEK ID NO: 2'in en az birine baglanir. Antikor özellikle SEK lD NO: 1 ya da SEK lD NO: 2'in en az birine baglanir.

Mcm5, varsayilan bir DNA replikasyon belgelendirme faktörüdür ve MCM (minikromozom bakimi) protein ailesinin bir üyesidir. MCM proteinleri kromatine baglanir ve helikaz aktivitesi sergiledigine ve dolayisiyla DNA replikasyonunun çekirdek bilesenleri olduguna inanilmaktadir. Mcm5, hücre döngüsünün GOidan G1/S fazina geçiste yukari regüle edilir ve hücre döngüsü regülasyonuna aktif olarak katilabilir; Mcm5, MCM ailesinin en az iki üyesi ile etkilesime girebilir.

MCM proteinleri 2-7, daha sonra DNA replikasyonu için gerekli ön sartlar ya da belgelenme faktörleri olan ve kromatin üzerinde olusan ön-çogaltma komplekslerinin bir kismini içerir. MCM protein kompleksleri replikatif helikazlar olarak etki ederler ve bu nedenle DNA çogaltma makinelerinin çekirdek bilesenleridir. MCM'Ier, hücre döngüsünün GO'dan G1/S fazina geçiste yukari regüle edilir ve hücre döngüsü regülasyonuna aktif olarak katilir. MCM proteinleri kromatin etrafinda dairesel bir yapi olusturur.

(SEK lD NO: 35; UNIPROT P33992: INSAN DNA replikasyon belgelendirme faktörü MCM5) olusur. Buna ragmen, Mcm5 geni, bireyler arasindaki sekanslarda biraz farkli olabilir. Bu yüzden, “Mcm.5'ye baglanan” ifadesi, SEK ID NO: 35,9 baglanan antikor gelir. Tercih edilen bir uygulamada antikor, SEK ID NO: 35*e % 100 özdes bir polipeptide baglanir. Bundan baska, bulusa ait bir antikor, Mcm5tin bir epitopuna (fragment) baglanacaktir (örnegin SEK ID NO: 1 ya da SEK ID NO: 2). Dolayisiyla, sadece tek bir epitopuna baglanan bir antikor anlamina gelir.

Mevcut bulusun amaçlari için "baglanma afinitesi" terimi bir antikorun kendi hedefine baglanma yetenegi anlamina gelir. Mevcut bulusun amaçlari için, "spesifik olarak baglanir" terimi, hedef olmayan bir baska moleküle baglanmak için kendi baglanma afinitesinden en az 2-kat, 10-kat, 50-kat ya da 100-kat daha büyük olan bir baglanma afinitesi ile Mcm5 gibi bir hedefe baglanan bir antikor anlamina gelir. Bir uygulamada, hedef olmayan molekül, Mcm2 gibi Mcm5'ten baska bir Mcm proteinidir. Tercihen, bulusun bir antikoru, hedef olmayan bir baska moleküle baglanmak için kendi baglanma afinitesinden en az 2-kat, 10-kat, 50-kat ya da 100-kat daha büyük olan bir baglanma afinitesi ile, opsiyonel olarak Mcm5 gibi, bir Mcm proteine baglanabilmektedir. Yine de daha fazla tercihen, bulusun bir antikoru, hedef olmayan bir baska moleküle baglanmak için kendi baglanma afinitesinden en az 2-kat, 10-kat, 50-kat ya da 100-kat daha büyük olan bir baglanma afinitesi ile SEK ID NO: 1 ya da SEK ID NO: 2'ye baglanabilmektedir.

Mcm5 için baglanma afinitesinin degerlendirilmesi için tercih edilen bir metot, ELlSA Tercihen, bulusun bir antikoru, 2500 ng/ml ya da daha düsük, 1500 ng/ml ya da daha düsük, 1000 ng/ml ya da daha düsük, 600 ng/ml ya da daha düsük, 50 ng/ml ya da daha düsük, 30 ng/ml ya da daha düsük, 20 ng/ml ya da daha düsük, ya da 10 ng/ml ya da daha düsük Mcm5 (Ornek 2'de tarif edildigi üzere, EC50 ya da % 50 maksimum baglanma konsantrasyonu olarak ölçülen) için bir afiniteye sahiptir. EC50 tipik olarak 1 ng/ml'den daha yüksek olacaktir ve bu nedenle EC50, 1 ng/ml ve bir önceki cümlede belirtilmis üst sinirlardan herhangi biri arasinda olabilir. Hedeflere dogru antikor gibi Iigandlarin baglanma kabiliyetini degerlendirmek için diger standart analizler, örnegin, Western Blotlari, RIA'Iar ve akis sitometrisi analizi de dahil olmak üzere teknikte bilinmektedir. Antikorun baglanma kinetikleri (örnegin baglanma afinitesi) ayni zamanda Yüzey Plazmon Rezonansi (SPR) (Örnegin Biacore TM sistem) analizi gibi teknikte bilinen standart analizler ile degerlendirilebilir. Mcm5'ye 1/M araligindadir. Ayrisim hizi (kd) tercihen 1-10 x 10'3 1/s araligindadir. Bu degerler tipik olarak SPR (Yüzey Plazmon Rezonansi) ile belirlenebilir.

Tamamlayici belirleyici bölgeler (CDR'Ier) Bulusa ait bir antikor, antikor 12A7 ya da 4B4*e ait CDR'leri içerir, yani: a. SEK ID NO: 9*a ait bir sekansa sahip 12A7 CDRH1; b. SEK ID NO: 11ie ait bir sekansa sahip 12A7 CDRH2; c. SEK ID NO: 13,e ait bir sekansa sahip 12A7 CDRH3; d. SEK ID NO: 3ie ait bir sekansa sahip 12A7 CDRL1; e. SEK ID NO: 5,e ait bir sekansa sahip 12A7 CDRL2; ve f. SEK ID NO: 7,ye ait bir sekansa sahip 12A7 CDRL3; ya da 9. SEK ID NO: 21'e ait bir sekansa sahip 484 CDRH1; h. SEK ID NO: 23”e ait bir sekansa sahip 484 CDRH2; i. SEK ID NO: 25ie ait bir sekansa sahip 484 CDRH3; j. SEK ID NO: 15ie ait bir sekansa sahip 484 CDRL1; k. SEK ID NO: 17'ye ait bir sekansa sahip 484 CDRL2; ve I. SEK ID NO: 19ie ait bir sekansa sahip 484 CDRLS. 484 ve 12A7 antikor ile ayni CDR'ye sahip olan antikor, diger bölgelerdeki 484 ve 12A7 sekanslarindan büyük ölçüde farkli olabilir. Bu tür antikor, örnegin, antikor fragmentleri olabilir. ifadesi, SEK ID NO: 3'te tanimlanan bir amino asidin farkli bir amino asit ile yer degistirilmesi olasiligini ifade eder. Tercihen böyle bir yer degistirme, konservatif bir amino asit ornatmasidir. Asagidaki sekiz grup, her birinin birbiri için tipik olarak konservatif ornatmalar olan amino asitleri içerir: 1) Alanin, Glisin; 2) Aspartik asit, Glutamik asit; 3) Asparajin, Glutamin; 4) Arjinin, Lisin; ) Isolösin, Lösin, Metionin, Valin; 6) Fenilalanin, Tirosin, Triptofan; 7) Serin, Treonin; ve 8) Sistein, Metionin. tarifnamede bulusa ait antikor, 12A7*in agir zinciri arasindan en az iki CDR'leri ve 12A7'in hafif zinciri arasindan en az iki CDR'leri içerir. Bir tarifnamede bulusa ait antikor, 12A7'in agir zinciri arasindan tüm 'L'iç CDR*leri ve/ veya 12A7'in hafif zinciri arasindan tüm 'üç CDR'Ieri içerir. Bir tarifnamede bulusa ait antikor, 12A7 CDRL1 ve CDRL2 ya da hafif zinciri arasindan en az bir CDR içerir. Ayrica bir tarifnamede bulusa ait antikor, 4B4'ün agir zinciri arasindan en az iki CDR*leri ve 4B4'ün hafif zinciri arasindan en az iki CDR'leri içerir. Bir tarifnamede bulusa ait antikor, 4B4'ün agir zinciri arasindan tüm 'üç CDR'Ieri ve/ veya 4B4"ün hafif zinciri arasindan tüm 'üç CDRrleri içerir. Bir tarifnamede bulusa ait antikor, 4B4 CDRL1 ve CDRH2 ve 484 CDRH3 içerir.

Bir tarifnamede bulusa ait antikor, SEK ID NO: 3 (, SEK ID NO: 5 ait herhangi birinde tarif edilene özdes bir sekansa sahip en az bir CDR içerir. Bulusa ait bir antikor 12A7 CDRL2 içerdigi yerde, 12A7 CDRL2, SEK ID NO: 5rde tarif edilen sekanslara sahiptir. Bulusa ait bir antikor, 12A7 CDRL1 içerdigi yerde, 12A7 CDRL1, SEK ID NO: 3'de tarif edilen sekanslara sahiptir. Bulusa ait bir antikor, 12A7 CDRL3 içerdigi yerde, 12A7 CDRL3, SEK ID NO: 7'de tarif edilen sekanslara sahiptir. Bulusa ait bir antikor, 12A7 CDRH1 içerdigi yerde, 12A7 CDRH1, SEK ID NO: 9'da tarif edilen sekanslara sahiptir. Bulusa ait bir antikor, 12A7 CDRH2 içerdigi yerde, 12A7 CDRH2, SEK ID NO: 11fde tarif edilen sekanslara sahiptir. Bulusa ait bir antikor, sahiptir. Bulusa ait bir antikor, 4B4 CDRL1 içerdigi yerde, 484 CDRL1, SEK ID NO: 15rde tarif edilen sekanslara sahiptir. Bulusa ait bir antikor, 4B4 CDRL2 içerdigi yerde, 484 CDRL2, SEK ID NO: 17'de tarif edilen sekanslara sahiptir. Bulusa ait bir antikor, 4B4 CDRL3 içerdigi yerde, 484 CDRL3, SEK ID NO: 19'da tarif edilen sekanslara sahiptir. Bulusa ait bir antikor, 4B4 CDRH1 içerdigi yerde, 484 CDRH1, SEK ID NO: 21rde tarif edilen sekanslara sahiptir. Bulusa ait bir antikor, 4B4 CDRH2 içerdigi yerde, 484 CDRH2, SEK ID NO: 23'de tarif edilen sekanslara sahiptir. Bulusa ait bir antikor, 4B4 CDRH3 içerdigi yerde, 484 CDRH3, SEK lD NO: 25'de tarif edilen sekanslara sahiptir.

Tercihen 12A7 ya da 4B4'e ait CDR*Ierin en az birini ihtiva eden bir antikor, Mcm5'e (opsiyonel olarak özellikle baglanir) baglanir. Yine de daha fazla tercihen 12A7 ya da 4B4'e ait CDRtlerin en az birini ihtiva eden bir antikor, SEK ID NO: 1 ya da SEK ID NO: 2iye (opsiyonel olarak özellikle baglanir) baglanir.

Agir ve hafif zincir degisken bölgesi sekanslari bir sekansa sahip bir hafif zincir degisken bölgesini içerir. Benzer bir antikor bunun içinde “bulusa ait bir varyant" olarak adlandirilir.

Bir uygulamada antikor, SEK ID NO: 29'a en az % 95 özdes bir sekansa sahip bir agir zincir degisken bölgesini içerir. Ayrica bir uygulamada antikor, SEK ID NO: 29'a en az % 98 özdes bir sekansa sahip bir agir zincir degisken bölgesini içerir. Bir uygulamada antikor, SEK ID NO: 27iye en az % 95 özdes bir sekansa sahip bir hafif zincir degisken bölgesini içerir. Ayrica bir uygulamada antikor, SEK lD NO: 27'ye en az % 98 özdes bir sekansa sahip bir hafif zincir degisken bölgesini içerir.

Ayrica bir uygulamada antikor, SEK lD NO: 27'ye en az % 95 özdes bir sekansa sahip bir hafif zincir degisken bölgesini ve SEK lD NO: 299 en az % 95 özdes bir sekansa sahip bir agir zincir degisken bölgesini içerir. Tercih edilen bir uygulamada antikor, SEK ID NO: 29*a en az % 98 özdes bir sekansa sahip bir agir zincir degisken bölgesini ve SEK lD NO: 27'ye en az % 98 özdes bir sekansa sahip bir hafif zincir degisken bölgesini içerir.

Ayrica bir uygulamada antikor, SEK ID NO: 337e en az % 95 özdes bir sekansa sahip bir agir zincir degisken bölgesini içerir. Ayrica bir uygulamada antikor, SEK lD NO: 33'e en az % 98 özdes bir sekansa sahip bir agir zincir degisken bölgesini içerir.

Ayrica bir uygulamada antikor, SEK ID NO: 31'e en az % 95 özdes bir sekansa sahip bir hafif zincir degisken bölgesini içerir. Ayrica bir uygulamada antikor, SEK ID NO: 31ie en az % 98 özdes bir sekansa sahip bir hafif zincir degisken bölgesini içerir.

Ayrica bir uygulamada antikor, SEK ID NO: 33ie en az % 95 özdes bir sekansa sahip bir agir zincir degisken bölgesini içerir ve SEK ID NO: 31'e en az % 95 özdes bir sekansa sahip bir hafif zincir degisken bölgesini içerir. Tercih edilen bir uygulamada antikor, SEK ID NO: 33'e en az % 98 özdes bir sekansa sahip bir agir zincir degisken bölgesini içerir ve SEK ID NO: 31ie en az % 98 özdes bir sekansa sahip bir hafif zincir degisken bölgesini içerir.

Teknikte uzman kisilerce bilindigi 'üzere, antikor, çerçeve bölgeleri de dahil olmak üzere çok sayida bölgeleri içerir. Çerçeve bölgelerindeki amino asitlerin silinmesi ya da eklenmesi, antikorun hedefine baglanma yetenegini etkilemesi için olasiligi bulunmamaktadir. Diger yandan, CDR'Ierdeki mutasyonlarin, bir antikorun bir hedefe baglanma kabiliyetini etkileme olasiligi kayda deger bir sekilde yüksektir. Bu nedenle, varyant antikor, SEK lD NO: 1 ya da 2'e ait bir amino asit sekansina sahip olan bir epitopa baglanir ya da 12A7 ya da 484 antikoruna ait CDR'Iere özdes olan CDR'Iere sahiptir. Bulusa ait varyant antikoru, SEK ID NO: 27, 29, 31 ya da 33`de tarif edilenlerden anlamli bir sekilde farkli olan çerçeve bölgelerine sahip olabilir. 100 özdes bir sekansa sahip bir agir zincir degisken bölgesini içerdigi yerde, antikor tarafindan, hedef baglanma spesifisitesinin CDR'Ier tarafindan belirlendigi için, 12A7 CDR'lerini içeren bir antikorun, antikor sekanslarinin geri kalani oldukça degisken olsa bile halen Mcm5'e baglanabilecegi anlasilmaktadir. Bu nedenle, antikor, 12A7 CDRH1, 12A7 CDRH2 ve 12A7 CDRH3 içerdigi yerde, antikor tercihen SEK ID NO: 29,a en az % 90 özdes bir sekansa sahip bir agir zincir degisken bölgesini içerir.

Daha fazla tercih edilen uygulamada, bulusa ait antikor, 12A7 CDRH1, 12A7 CDRH2 ve 12A7 CDRH3 içerir ve SEK lD NO: 29,a en az % 95 özdes bir sekansa sahip bir agir zincir degisken bölgesini içerir. 100 özdes bir sekansa sahip bir agir zincir degisken bölgesini içerdigi yerde, antikor tarafindan, hedef baglanma spesifisitesinin CDR'Ier tarafindan belirlendigi için, 484 CDR'lerini içeren bir antikorun, antikor sekanslarinin geri kalani oldukça degisken olsa bile halen Mcm5'e baglanabilecegi anlasilmaktadir. Bu nedenle, antikor, 4B4 CDRH1, 4B4 CDRH2 ve 484 CDRH3 içerdigi yerde, antikor tercihen SEK ID NO: 33re en az % 90 özdes bir sekansa sahip bir agir zincir degisken bölgesini içerir.

Daha fazla tercih edilen uygulamada, bulusa ait antikor, 4B4 CDRH1, 4B4 CDRH2 ve 484 CDRH3 içerir ve SEK ID NO: 33'e en az % 95 özdes bir sekansa sahip bir agir zincir degisken bölgesini içerir. kisi tarafindan, hedef baglanma spesifisitesinin CDR'ler tarafindan belirlendigi için, 12A7 CDR'lerini içeren bir antikorun, antikor sekanslarinin geri kalani oldukça degisken olsa bile halen Mcm5'e baglanabilecegi anlasilmaktadir. Bu nedenle, SEK lD NO: 27tye en az % 90 özdes bir sekansa sahip bir hafif zincir degisken bölgesini içerir. Daha fazla tercih edilen uygulamada, bulusa ait antikor, 12A7 bir sekansa sahip bir hafif zincir degisken bölgesini içerir. 100 özdes bir sekansa sahip bir hafif zincir degisken bölgesini içerdigi yerde, antikor tarafindan, hedef baglanma spesifisitesinin CDR'ler tarafindan belirlendigi için, 484 CDR'lerini içeren bir antikorun, antikor sekanslarinin geri kalani oldukça degisken olsa bile halen Mcm5'e baglanabilecegi anlasilmaktadir. Bu nedenle, antikor, 4B4 en az % 90 özdes bir sekansa sahip bir agir zincir degisken bölgesini içerir. Daha fazla tercih edilen uygulamada, bulusa ait antikor, 4B4 CDRL1, 4B4 CDRL2 ve 484 CDRL3 içerir ve SEK ID NO: 31'e en az % 95 özdes bir sekansa sahip bir agir zincir degisken bölgesini içerir.

Ayrica bulusa ait bir uygulamada bulusa ait antikor asagidakileri içerir: (ii) SEK lD NO: 29*e en az % 95 özdes bir sekansa sahip bir agir zincir degisken bölgesi; (iv) SEK ID NO: 27*ye en az % 95 özdes bir sekansa sahip bir hafif zincir degisken bölgesi.

Ayrica bulusa ait bir uygulamada bulusa ait antikor asagidakileri içerir: (ii) SEK lD NO: 33*e en az % 95 özdes bir sekansa sahip bir agir zincir degisken bölgesi; (iv) SEK lD NO: 31*e en az % 95 özdes bir sekansa sahip bir agir zincir degisken bölgesi.

SEK ID NO: 29'a özdes bir agir zincir degisken sekansina sahip bir antikor ve SEK ID NO: 27'ye özdes bir hafif zincir degisken sekansi, antikor 12A7 olarak ifade edilebilir.

SEK ID NO: 33'e özdes bir agir zincir degisken sekansina sahip bir antikor ve SEK ID NO: 31'e özdes bir hafif zincir degisken sekansi, bir antikor 484 olarak ifade edilebilir.

Bazi uygulamalarda bulusa ait varyant antikoru, 12A7 antikor ile Mcm5'e baglanmasi için rekabet edecektir. Benzer bir sekilde, bulusun bazi uygulamalarda, bulusa ait varyant antikoru, McBS'e 4B4 antikoru ile baglanmasi için rekabet edecektir.

Mevcut bulusun amaçlari için, bir antikor, sekanslar, asagidaki parametreler ile ClustalW (Thompson ve dig., 1994) kullanilarak degerlendirildigine en az % 90, % 95, 98, % 99 ya da °/o 100 özdestir. Çift yönlü hizalama parametreleri -Metot: kesin, Matriks: PAM, Bosluk açik penalti: .00, Bosluk uzanti penalti: 0.10 Çoklu hizalama parametreleri - Matriks: PAM, Bosluk açik penalti: 10.00, gecikme için % özdes: 30, penalti hale getirilen uç bosluklari: açik, Bosluk ayrisma mesafesi: 0, Negatif matriks: yok, Bosluk uzanti penalti: 0.20, Kalintiya özgü bosluk penaltilari: açik, Hidrofilik bosluk penaltilar: açik, Hidrofilik kalintilar: GPSNDQEKR.

Mcm5'e baglanan varyant antikorlar nasil yapildigi teknikte uzman kisinin iyi bilgisi içerebilir. 'Silme' varyant antikoru, 1, 2, 3, 4, 5 ya da daha fazla amino asitlerin silinmesini, bazi durumlarda, SEK.ID. NO'Iar: 27, 29, 31 ya da 33"L'in tüm bölgelerinin silinmesini içerebilir. "Ornatma" varyantlari, ayni sayida yeni amino asitler ile 1, 2, 3, 4, 5 ya da daha fazla amino asitlerin yer degistirilmesini içerebilir.

Tercihen, varyant antikoru, konservatif amino asit ornatmalari (opsiyonel olarak sadece konservatif amino asit ornatmalari) ile SEK ID NOilar: 27, 29, 31 ya da 33 arasindan farklilasan sekanslari içerir. Teknikte uzman kisi, bu tür konservatif ornatmalarin, bir antikorun baglanma özelliklerini degistirmesinin olasi olmadiginin farkindadir.

Bulusa ait antikor ile rekabet eden antikor Tarifname ayrica bulusa ait bir antikor ile rekabet eden bir antikor temin edilmekte (i) SEK lD NO: 1 ya da 2'e ait bir amino asit sekansina sahip bir polipeptidi CDRL2, ve 484 CDRL3 ihtiva eden grup arasindan seçilen en az bir CDR içerir. rekabet eden bir antikor temin edilmektedir. Hatta daha fazla tercihen tarifname, SEK bölgesini ve SEK lD NO: 27 ya da 31'e % 100 özdes bir sekansa sahip bir hafif zincir degisken bölgesini içerir. Tarifname, antikor 12A7 ya da antikor 454 ile rekabet eden bir antikor temin edilmektedir.

Bir antikorun, bulusun baska bir antikoru ile rekabet edip etmedigini belirlemek, teknikte uzman kisinin yetenekleri dahilindedir. Örnegin, bir ELlSA testi, bir ELlSA plakasi üzerinde bir 484 ya da bir 12A7 antikor gibi referans antikorun immobilize edilmesiyle gerçeklestirilebilir. Plaka daha sonra uygun bir bloke edici ajan ile bloke edilir. Bir ikinci antikorun fazlasi ilave edilir (ikinci antikor, 484 ya da 12A7 antikor ile rekabet etme kabiliyetinin, örnegin 484 ya da 12A7 ile rekabet eden bulusa ait bir antikoru `üzerinde degerlendirilebilecek oldugu antikordur). Mcm5 ilave edilmistir.

Uygun bir inkübasyon periyodunu takiben, ELlSA plakasi yikanir ve bir Mcm5 tespit ajani, immobilize edilmis referans antikoruna baglanan Mcm5iin miktarini ölçmek için ilave edilir. Bir antikorun 484 ile rekabet edip etmedigini belirlemek için bu test kullanilacaksa, uygun bir tespit ayiraci etiketli bir 12A7 antikorudur. Benzer sekilde, bu testin bir antikorun 12A7 ile rekabet edip etmedigini saptamak için kullanilmasi durumunda, uygun bir belirleme ayiraci etiketli bir 484 antikorudur. % 50 inhibisyonun meydana geldigi konsantrasyon Ki olarak bilinir. 12A7 ya da 484 ile yarisan bir antikor, McmS'e baglanmayan bir antikordan bir Ki 2-kat, 5-kat, 10-kat, 50 kat ya da 100 kat daha düsük bir bag ile baglanabilir.

Bulusa ait bir antikor ile rekabet eden bir antikor, ayni epitopa (örnegin, SEK ID NO: 1 ya da SEK ID NO: 2) baglanan bir antikor olabilir. Bir antikorun, Mcm5 gibi hedef proteinin fragmentlere ayrildigi bir deney gerçeklestirerek hangi epitopun baglandigini belirlemek mümkündür (örnegin bakiniz asagidaki Ornek 3). 12A7 ve 484 antikorun fragmentlerin her birine baglandigi afinite daha sonra belirlenebilir. Ilk antikorun makul bir afinite ile baglandigi ilk fragment (epitopu temsil eden) belirlendikten sonra, epitop sentezlenebilir. Daha sonra, ikinci bir antikorun, bu ikinci antikorun fragmente baglanma afinitesini ölçerek ayni epitopa baglanabilme kapasitesinin olup olmadigini belirlemek mümkündür.

Etiketli antikor Bulusa ait bir antikor, bir etikete (örnegin Europium3+ ya da Kara turp Peroksidaz) konjuge edilebilir. Etiket direkt olarak baglanmis olabilir ya da bir baglayici (Adipik Asit Dihirazid (ADH) gibi) vasitasiyla baglanabilir.

Etiket kimyasal konjugasyon ile baglanabilir. Etiketlerin antikora konjuge edilme metotlari teknikte bilinmektedir. Ornegin, karbodiimid conjugation (Bauminger & konjuge edilmesi için kullanilabilir. Bir etiketin bir antikora konjuge edilmesi için baska metotlar da kullanilabilir. Ornegin, uygun ayiraçlarinin indirgeyici alkilasyonu ile takiben sodyum periodat oksidasyon glutaraldehit çapraz baglanabildigi için, kullanilabilir. Bununla birlikte, bulusun bir konjugatinin üretilmesi için hangi metodun seçildigine bakilmaksizin, konjuge antikorun hedefleme yetenegini sürdürdügü ve konjuge etiketin islevini sürdürdügü bir tespit yapilmalidir.

Tercih edilen bir uygulamada, bulusun antikoru, Europium'a konjuge edilerek etiketlenir. Bu, üreticinin protokolünü izleyen bir EG&G Wallac DELFIA (R) Eu etiketleme kiti kullanilarak gerçeklestirilebilir.

Kom pozisyonlar Bulusa ait ayrica bakis açilarinda, bulusun bir antikorunu içeren kompozisyonlar temin edilmektedir. Bu gibi kompozisyonlar ayrica antikorun çözelti içinde stabilize edilebilmesini saglayan uygun stabilize edici ajanlari içerebilir. Ornegin, kompozisyon, TAPS (3-{[tris(hidroksimetil)metil]amino}propansülfonik asit), Bisin (N,N-bis(2-hidroksietilglisin), Tris (tris(hidroksimetil)metilamin), Trisin (N- tris(hidroksimetil(metilglisin), TAPSO (3-[N-Tris(hidroksimetil)metilamino]-2- hidroksipropansülfonik asit), HEPES (4-2-hidr0ksietil-1-piperazinetansülfonik asit), fosfat tamponlu tuzlu su ve MOPS (3-(N-morfolino)pr0pansüIfonik asit ihtiva eden grup arasindan seçilen bir tamponu içerebilir. Tercih edilen bir uygulamada kompozisyon, 7.6 pH'da fosfatla tamponlanmis tuzlu suyu içerir. Ayrica tercih edilen bir uygulamada kompozisyon, % 0.01 ve % 0.09 sodyum azid arasinda ile fosfatla tamponlanmis tuzlu suyu içerir. Tercihen, kompozisyon, oda sicakliginda ya da 15 bulusa ait antikorun saklanmasi için uygun ajanlari içerir. Tercih edilen bir uygulamada, kompozisyon, 2 saklanmasi için uygun ajanlari içerir. Ayrica bir uygulamada, kompozisyon, örnegin laktoz ya da trehaloz olarak bir seker gibi stabilize edici ajani içerir.

Bulusa ait antikor konjuge edilirse, Örnegin bir Europium etiketine, kompozisyon içinde bir % 7.5 saflastirilmis BSA stabilize ediciyi içermesi avantajlidir.

N'ükleik asitler ve Vektörler Bir polinükleotid, bunun içinde tarif edildigi gibi herhangi bir antikoru kodlayan bir nükleik asit sekansi içerebilir. "Nükleik asit molekül'u" ve "polinükleotid" terimleri bunun içinde birbirinin yerine kullanilabilir ve herhangi bir uzunlugun, deoksiribonükleotidlerin, ribonL'ikleotidlerin ya da bunlari analoglarinin nukleotidlerinin polimerik bir formu anlamina gelir.

Bir seçici polipeptidi “enkodlayan” bir nükleik asit, uygun düzenleyici sekanslarin kontrolü altina yerlestirildiginde in vivo seklinde bir polipeptid içerisine transkribe edilen (DNA durumunda) ve çevrilebilen (mRNA durumunda) bir nükleik asit molekülüdür. Kodlama sekanslarinin sinirlari, 5' (amino) terminusundaki bir baslangiç kodonu ve 3' (karboksi) terminusunda bir translasyon durdurma kodonu ile belirlenir.

Ornegin, bulusa ait bir kompozisyon, SEK ID NO: 29 ya da 33*e en az % 98 özdes bir sekansa sahip bir degisken bölgesini içeren bir antikoru ve SEK ID NO: 27 ya da 31'e en az °/o 98 özdes bir sekansa sahip bir hafif zincir degisken bölgesini içeren bir antikoru enkodlayan bir nükleik asidi içerebilir. Bulusa ait bir polin'ukleotid, SEK ID NO: 293 en az % 98 özdes bir sekansa sahip hem bir polipeptidi ve SEK lD NO: 27iye en az % 98 özdes bir sekansa sahip hem de bir polipeptidi enkodlayabilir.

Alternatif olarak, bulusa ait bir polinükleotid, SEK ID NO: 33re en az % 98 özdes bir sekansa sahip hem bir polipeptidi ve SEK ID NO: 31'e en az % 98 özdes bir sekansa sahip hem de bir polipeptidi enkodlayabilir.

Bulusa ait bir örnek kompozisyonu, SEK ID NO: 28 ya da 32'ye en az % 98, % 99 ya da % 100 özdes bir nükleik asit sekanstan ve SEK lD NO: 30 ya da 34'e en az % 98, ya da % 100 özdes bir nükleik asit sekanstan olusur ya de içerir. Opsiyonel olarak bulusa ait polin'ükleotid, SEK ID NO: 28 'e en az % 98 özdes bir polin'ükleotid sekansi ve SEK lD NO: 30*a en az % 98 özdes bir polin'ükleotid sekansi içerir. Opsiyonel olarak bulusa ait polin'ukleotid, SEK ID NO: 32 'e en az % 98 özdes bir polin'ukleotid sekansi ve SEK ID NO: 34'e en az °/o 98 özdes bir polinükleotid sekansi içerir.

Bulusa ait bir antikor, dolayisiyla, bunu ifade edebilen bir polinükleotidden üretilebilir.

Eger antikor iki ya da daha fazla zincirinden olusuyorsa, bir polin'ükleotid bir antikor hafif zincirini ve bir antikor agir zincirini ya da her ikisini de kodlayabilir. Bir antikor hafif zincirini kodlayan ve digeri karsilik gelen antikor agir zincirini kodlayan iki polinükleotid temin edilmektedir. Böyle bir polin'L'ikleotid ya da bir çift polin'ükleotidler, bulusun bir antikorunun üretilecegi sekilde birlikte ifade edilebilir.

Bulusa ait polinükleotidler, Sambrook ve dig. (1989, Molecular Cloning - a laboratory day manual; Cold Spring Harbor Press) sayili belgede örnek araciligiyla tarif edildigi 'üzere, teknikte iyi bilinen metotlara göre sentezlenebilir.

Bulus ayrica, bulusun polin'ukleotidini içeren bir vektörü (örnegin bir plazmid ya da rekombinant viral vektörü gibi) saglar. Tipik olarak, vektör ayrica sokulan sekanslara islevsel olarak bagli bir kontrol sekansi içerir, böylece bulusun antikorunun in vivo seklinde ifade edilmesine izin verilir. Tercihen, bulusun vektör'u ayrica, uygun bir baslatici, arttirici, destekleyici ve bulusun bir polipeptidinin ifadesine imkan vermek için, dogru oryantasyonda konumlandirilabilen ve gerekli olabilen baska elementleri Hibridom hücre çizgileri Mevcut bulus ayrica bulusun bir antikorunu üretebilen bir hibridom hücre çizgisini saglar. Böyle bir hibridom hücre çizgisi, uygun kültür kosullarinda muhafaza edildiginde bulusun antikorunu üretecektir.

Teknikte uzman kisinin, bulusun bir antikorunu ifade eden bir hibridom gelistirmesi kabiliyetindedir. Bu, bir fare, tavsan ya da kobay faresi gibi bir memelinin bir antijenle (örnegin Mcm5) immünize edilmesiyle gerçeklestirilebilir. Freundtun tam adjuvani gibi bir adjuvanin dahil edilmesi faydali olabilir. Immünize edilmis memelinin dalak hücreleri çikarilir ve antikorlari salgilayan ve uygun kosullar verildiginde ölümsüz olan hibridom çizgileri olusturmak için miyelom hücreleriyle kaynastirilir. Hibridomlar tek klonlara ayrilir ve her klon tarafindan salgilanan antikor, Mcm5 proteinine baglanma yetenekleri açisindan degerlendirilir.

Konakçi hücre çizgileri Bulus, ayni zamanda, bulusa ait nükleik asitleri ya da vektörleri içeren konakçi hücreleri de temin etmektedir. Bu konakçi hücreler, bulusun bir antikorunu ifade etmek üzere modifiye edilmis hücreleri içerir. Bu tür konakçi hücreler, ökaryotik hücreler ya da prokaryotik hücreler olabilir. Örnegin, konakçi hücreler memeli hücreleri, böcek hücreleri, ya da bakteri hücreleri olabilir. Bulusun vektbrlerinin ya da nükleik asitlerinin yerlestirilmesiyle modifiye edilebilen konakçi hücrelerin belirli örnekleri, memeli HEK293T, CHO, HeLa, N80 ve 008 hücrelerini içerir. Alternatif olarak E. coIi gibi bakteriyel hücreler kullanilabilir.

Bu tür konakçi hücreler, bulusun bir antikorunu üretmek için rutin metotlar kullanilarak kültürlenebilir.

Antikor 'ü retimi Bulusun antikoru herhangi bir metot kullanilarak üretilebilir. Bir uygulamada, antikor dogrudan bir hibridom hücre çizgisinden üretilir. Bulusun bir baska uygulamasinda, antikor rekombinant olarak üretilir.

Bir hibridom hücre çizgisinden bir antikor üretmek için, hücre çizgisi in vitro olarak örnegin bir hücre kültür imbigi veya bir fermenter gibi bir kap içinde kültür edilebilir ve antikor teknikte bilinen konvansiyonel teknikleri kullanilarak kaptan izole edilebilir.

Mevcut bulusun amaçlari için, bir antikor, hibridom hücre çizgisi tarafindan üretilen bir antikordan türetilirse bir antikorun "bir hibridom hücre çizgisi tarafindan üretildigi" kabul edilecektir. Örnegin, bir hibridom hücre çizgisinden, antikorlarin amino asit sekanslarini ve CHO hücreleri ya da E. coli hücreleri gibi vektörleri kodlayan hücreler antikorun amino asit sekanslarindan bir antikoru elde etmek için teknikte uzman kisinin yetenekleri dahilindedir. Bu tür antikorun, hibridom hücre çizgisi tarafindan üretilen bir antikordan “türetilmis” oldugu düsünülebilir. Belirli bir uygulamada, bulusa ait antikor dogrudan hibridom hücre çizgisinin kendisinden üretilir.

Alternatif olarak bulusa ait antikoru, rekombinant teknikler kullanilarak üretilebilir.

Bulusa ait bir antikorun sekanslari, bulusa ait bir konakçi hücre çizgisinin transfekte edilmesi için kullanilabilir. Hücre çizgileri, bir imbik ya da fermenter içinde büyütülebilir ve hücre tarafindan ifade edilen antikor, standart teknikler (afinite kromatografisi gibi) kullanilarak izole edilebilir ve saflastirilabilir.

Ilk önce aritildiginda, antikor daha sonra bir kati destege immobilize edilebilir ya da bir radyo etiketine konjuge edilebilir. Uygun bir kati destege ait bir örnek, bir ELlSA plakasidir.

Bir örnekte Mcm5 konsantrasyonunu belirleme kitleri ve metotlari.

Bulusa ait antikor, bir kitin parçasi olarak kullanilabilir. Ornegin, antikor, bir örnekte, örnegin bir insandan Örnekte, Mcm5 konsantrasyonunun saptanmasinda kullanilmasina yönelik bir kitin bir parçasi olabilir, bu, numunenin alindigi bir denekte kanserin saptanmasina izin verebilir.

Alternatif olarak, bulusa ait antikor, bir numunedeki (ayni zamanda bulusun bir Mcm5 tespit metodu olarak da anilir) Mcm5 konsantrasyonunun ya da miktarinin tespit edilmesi için bir metotta kullanilabilir. Tercihen böyle bir metot asagidaki adimlari (i) bir kati destege immobilize edilmis bulusa ait bir antikor olan immobilize edilmis birinci antikorun temin edilmesi; (ii) immobilize edilmis Mcm5*i temin etmek için numunedeki Mcm5'in immobilize edilmis antikora baglanabildigi sekilde numunenin immobilize edilmis birinci antikora maruz kalmasi; (iii) bir etikete konjuge edilmis bulusa ait bir antikor olan etiketlenmis bir ikinci antikorun temin edilmesi; (iv) etiketlenmis ikinci antikorun Mcm5”e baglanabildigi sekilde immobilize edilmis Mcm5'in etiketlenmis ikinci antikora maruz kalmasi; ve (v) etiketlenmis ikinci antikorun konsantrasyonun tespit edilmesi.

Tercihen (v) adiminda konsantrasyonlari tespit edilen ikinci antikorun (iv) adiminda Mcm5'e bagli olmasini saglamak için (iv) ve (v) arasinda bir yikama adimi bulunmaktadir. Opsiyonel olarak, yikama adimi, kati destegin bir yikama tamponuna maruz birakilmasiyla gerçeklestirilir.

Bir uygulamada bulusa ait bir kit içinde mevcut olan ya da bulusa ait bir metotta kullanilan antikor, prostat kanseri ya da mesane kanseri gibi bir ürolojik kanseri tespit etmek için uygundur.

Tercihen, bir örnekte Mcm5'in konsantrasyonunun ya da miktarinin saptanmasi için bir metot kullanilir, ya da bulusun bir kiti, birbiriyle rekabet etmeyen bulusun iki antikorunu (Örnegin 484 ve 12A7 antikoru gibi) içerir ve tercihen ilgili antijenin farkli epitoplarina baglanir. Bu, yukarida tarif edilen gibi bir ELISA gerçeklestirilerek belirlenebilir. Iki antikordan biri, bir ELISA plakasi üzerine immobilize edilebilir. Plaka daha sonra uygun bir bloke edici ajan ile bloke edilir. Daha sonra diger antikorun bir fazlasi ilave edilir (birinci antikor ile rekabet etme kabiliyeti degerlendirilecek olan antikor). Mcm5 gibi hedef antijen daha sonra ilave edilir. Uygun bir inkübasyon periyodunun ardindan, ELISA plakasi yikanir ve immobilize edilmis antikora baglanan hedef antijenin miktarini ölçmek için hedef antijene baglanabilen bir tespit ajani ilave edilir. Eger iki antikor, immobilize edilmis antikora baglanan hedef antijenin miktari rekabet ettiginde, antikor rekabet etmediginden (ve opsiyonel olarak farkli epitoplara baglanir) daha düsük olacaktir. % 50 inhibisyonun meydana geldigi konsantrasyon Ki olarak bilinir. Tercih edilen bir uygulamada, bir baska antikor ile rekabet eden bir antikor, rekabet etmeyen bir antikordan bir Ki 2-kat, 5-kat, 10-kat, 50 kat ya da 100- kattan daha düsük biri ile baglanir.

Tercih edilen bir uygulamada bulusa ait bir Mcm5 tespit metodu bulusa ait bir birinci antikoru ve bulusun bir ikinci antikoru kullanir ya da bulusa ait bir kit bulusa ait bir birinci antikoru ve bulusun bir ikinci antikoru içerir. Birinci antikor, SEK lD NO: 1'e baglanabilir (opsiyonel olarak spesifik olarak baglanabilir) ve ikinci antikor, SEK ID NO: 2'ye baglanabilir (opsiyonel olarak spesifik olarak baglanabilir). Birinci antikor, CDRLBiin CDRtIerini içerir. Ikinci antikor, 4B4 CDRH1, 4B4 CDRH2, 4B4 CDRH3, 4B4 CDRL1, 4B4 CDRL2 ve 4B4 CDRLSrin CDR'lerini içerir. Tercihen, birinci antikor, ya da % 100 özdes bir sekansa sahip bir hafif zincir degisken bölgesini içerebilir. özdes bir sekansa sahip bir agir zincir degisken bölgesini ve SEK ID NO: 31'e en az Bir DELFlA tespit sistemi, bulusa ait bir Mcm5 tespit metodunda kullanilabilir. Bu tür uygulamalarda, birinci antikor ve ikinci antikor tercihen farkli epitoplari baglar. Bu tür uygulamalarda antikorun biri (birinci ya da ikinci monoklonal antikor) bir plaka üzerinde immobilize edilir. Test edilecek bir numune plakaya ilave edilir. Diger antikor, bir Europium etiketi gibi bir tespit ajanina konjuge edilmelidir. Zamana göre çözülmüs floresan spektroskopisi, hedef antijenin mevcut olup olmadigini (mevcut olan etiketli antikor miktarini ölçerek) belirlemek için kullanilabilir.

Buna bagli olarak, bulusa ait bir uygulamada, bulusa ait bir kit, örnegin Europium gibi bir radyo etikete konjuge edilen bulusa ait bir birinci ya da ikinci antikoru içerir.

Herhangi metot, birinci monoklonal antikor ya da ikinci monoklonal antikorun bir Europium etiketine konjuge edilmesi için kullanilabilir. Bu tür etiketlemenin gerçeklestirilmesi için kitler temin edilmektedir. Ornegin, birinci ya da ikinci monoklonal antikor, bir Eu-NI-ITC selat kullanilarak Europium'a konjuge edilebilir.

Bu gibi uygulamalarda, bulusa ait bir kit bir DELFIA tespit sisteminde kullanilmak üzere ayrica bilesenleri içerebilir. Bu gibi ayrica bilesenler, bir DELFIA gelisme çözümü ya da bir DELFIA tespit çözümünü içerebilir.

Tanimlar ve “dahil olmak üzere” gibi varyasyonlar, belirtilen bir bilesigin ya da kompozisyonun ya da adimin ya da bilesikler ya da adimlarin grubunun dahil edilmesi anlamina geldigi anlasilacaktir, ancak herhangi bir diger bilesikler, kompozisyon, adimlar ya da bunlarin grubunun hariç tutulmasi olmamaktadir.

Tablo 1: Sekanslar 1 WDETKGE (antikor 12A71in baglandiklari epitop) 2 DDRVAIH (antikor 4B4'in baglandiklari epitop) 3 12A7 hafif zincir CDR 1 polipeptid sekansi 4 12A7 hafif zincir CDR 1 nükleotid sekansi 12A7 hafif zincir CDR 2 polipeptid sekansi 6 12A7 hafif zincir CDR 2 nükleotid sekansi 7 12A7 hafif zincir CDR 3 polipeptid sekansi 8 12A7 hafif zincir CDR 3 n'ukleotid sekansi 9 12A7 agir zincir CDR 1 polipeptid sekansi 12A7 agir zincir CDR 1 nükleotid sekansi 11 12A7 agir zincir CDR 2 polipeptid sekansi 12 12A7 agir zincir CDR 2 nükleotid sekansi 13 12A7 agir zincir CDR 3 polipeptid sekansi 14 12A7 agir zincir CDR 3 nükleotid sekansi 434 hafif zincir CDR 1 polipeptid sekansi 16 484 hafif zincir CDR 1 nükleotid sekansi 17 484 hafif zincir CDR 2 polipeptid sekansi 18 484 hafif zincir CDR 2 nükleotid sekansi 19 484 hafif zincir CDR 3 polipeptid sekansi 454 hafif zincir CDR 3 nükleotid sekansi 21 484 agir zincir CDR 1 polipeptid sekansi 22 484 agir zincir CDR 1 nükleotid sekansi 23 484 agir zincir CDR 2 polipeptid sekansi 24 484 agir zincir CDR 2 nükleotid sekansi 434 agir zincir CDR 3 polipeptid sekansi 26 484 agir zincir CDR 3 nükleotid sekansi 27 12A7 tam hafif zincir degisken bölgesi sekansi (polipeptid) 28 12A7 tam hafif zincir degisken bölgesi sekansi (nükleotid) 29 12A7 tam agir zincir degisken bölgesi sekansi (polipeptid) 12A7 tam agir zincir degisken bölgesi sekansi (nükleotid) 454 tam hafif zincir degisken bölgesi sekansi (polipeptid) 32 484 tam hafif zincir degisken bölgesi sekansi (nükleotid) 33 484 tam agir zincir degisken bölgesi sekansi (polipeptid) 34 484 tam agir zincir degisken bölgesi sekansi (nükleotid) Mcm5 polipeptid sekansi 36 Mcm5 polinükleotid sekansi Örnekler Mcm57in klonlanmasi Safha I: Klonlama Stratejisi Insan MCM5 cDNA'sini içeren dogrulanmis bir IMAGE klonu, bir 648 bp'lik DNA fragmentinin amplifiye etmek için bir PCR sablonu olarak kullanilmistir ve elde edilmistir. Ileri PCR primer, n baslatma kodonunun yani sira modifiye edilmis patent almamis bir poIi-Histidin etiketini (HQ)4 enkodlar.

. PCR fragmenti, bir çift kisitli alan bölgesi stratejisi kullanilarak uyarilabilir ifade E. coli vektörü pTRCQQa'ya klonlanmistir. Bu vektör, hibrit trp/lac “trc” promoteri tarafindan yönlendirilen uyarilabilir ifadeye izin verir. Asagi akis.

Ncol klonlama alani tarafindan tedarik edilen bir baslatma ATG kodonundan optimize edilmis bir mesafede konumlandirilan bir lacZ ribozom baglama alanidir (RBS).

Safha IlA: Ifadesi ve Saflastirilmasi (küçük ölçekli - 10 ml) Mcm5 fragmenti içeren rekombinant plasmid, ifade edilen proteinin yüksek verimlerini saglamak için BL21 E. coli (nonADE3) içerisine dönüstürülür. 4. Birkaç küçük hacimli E. coli kültürleri, lPTG ile uyarilir. Hücreler, SDS- PAGE ile ayrilan SDS yükleme tamponu ve toplam protein içinde parçalanacaktir. Yüksek ifade edici klonlar, Urosens tarafindan tedarik edilen bir fare monoklonalin' in kullanilmasiyla Western blotlama ile tanimlanacaktir.

Safha IlB: Ifadesi ve Saflastirilmasi (büyük 'ölçekli - 500ml) . Yüksek seviyelerde rekombinant proteine sahip olan tanimlanmis klon, 0.5L ölçeginde kültürlenir ve IPTG ile indüklenir. Hücreler peletlenmis ve -70 ° C'de saklanmistir. Hücreler, Stoeber ve dig. J Natl Cancer Inst 2002 94 1071-9 sayili belge tarafindan tarif edilen bir denatüre Iizis tamponu içinde bozulur. 6. His-etiketli rekombinant protein, immobilize edilmis metal afinite (IMAC) kromatografi kolonu üzerinde denatüre edici kosullar altinda afinite ile saflastirilmistir. Protein, saklama tamponuna ( karsi diyaliz edilir ve bir asidik tampon kullanilarak elüte edilir. 7. Elüte edilen protein, Urosens tarafindan tedarik edilen bir fare monoklonal kullanilarak SDS-PAGE ve western blotlama ile analiz edilir.

Ornek 1 - MAb tarama ELISA Protein A saflastirilmis MAb'ler Welcome/CRUK Kanser ve Gelisim Biyolojisi Enstitüsü'nden elde edilir. Bu antikor, Mcm5'e baglanma yetenekleri açisindan Rekombinant HisG-etiketli Mcm5'in bir ELISA'si, Ni-NTA His-Sorb 96 çukurcuklu mikro titre ile kaplanmis plaka çukurcuklari (Qiagen) kullanilarak gerçeklestirilmistir.

BSA ile on-bloke edilmis Ni-NTA kaplanmis plakalar, Mcm5'in pasif adsorpsiyon plakasi ile elde edilecek çukurcuga rastgele sunumu ile karsilastirildiginda aralayiciya Nikel afinitesi boyunca baglanmasi yoluyla 6x His etiketli Mcm'nin konumlandirilmis bir sunumunu saglar. 625 ng/ml bir konsantrasyonda Mcm5, 125 ng hsMcm5/çukurcuk halinde elde edilen 200 ul/çukurcukta bir 96 çukurcuk plakanin Ni- NTA His-Sorb yüzeyine (Qiagen) immobilize edilmis Nikel afinitedir. Bu, bir titre >1OO ng/çukurcukta plaka çukurcuklarina bir His-6 etiketli protein ya da peptidin uygulanmasi için üreticinin talimatlari takiben yapilir. Bu, protein ya da peptidin Ab tespitine sinirlamadigindan emin olmak için yapilir. Bir Mcm5 lFMA'nin gelistirilmesi için MAb'lerin taranmasi, Mcm5'in bir enzim ile baglantili immünosorbent analizi (ELISA) ile gerçeklestirilmistir. MAb'leri taramak için, MAb'leri ifade eden hibridom kültürlerinden gelen süst fazlar, 3 saat boyunca oda sicakliginda mikrotitre çukurcuklarinda inkübe edilir ve daha sonra otomatik 96 çukurcuklu bir plaka yikayici ile yikanir. MAb'lerin Mcm5 Ag-Ab kompleksleri, 450 nanometrede (Abs 450 nm) isik absorbansinin ölçülmesi için HRP, TMB ayiraci ve 1M H2804 test durdurma çözeltisine konjuge edilmis keçi anti-fare IgG'si kullanilarak kolorimetrik bir ELlSA ile tespit edilir. Ni-NTA His-Sorb yüzeyi ve Mom5'e konjuge keçi anti-fare HRP konjugatinin spesifik olmayan baglanmasinin (NSB) yoklugu, MAbs'den arindirilmis çukurcuklarda ELISA gerçeklestirilerek dislanir. Ni-NTA kaplanmis polistiren çukurcuklarina taranan fare MAb'lerinin NSB derecesi, Mcm5 çukurcuklarinin, Mcm5'in mikrotitre Nikel çukurcuklara Nikel afinitesi immobilizasyonu ile çukurcuklardaki ELlSA gerçeklestirilmesine paralel olarak çukurcuklara çikarilmasi ile çukurcuklardaki ELlSA ile gerçeklestirilmesiyle belirlenmistir.

Hibridomlardan alinan ortam örneklerinde bir fare MAb'nin kolorimetrik ELISA'daki performansi (Tablo 2), vurgulanan klonlarin 12A7 ve 484 seçimi için kullanilmistir.

Seçilen MAb hibridomlari, üreticinin talimatlarina (Amersham Pharmacia Biotech Little Chalfont Buckinghamshire, Ingiltere) göre kati fazli protein-A ayrimi kullanilarak kültür üst fazdan saflastirmak için IgG üretmek üzere büyütülmüstür. 12A7 MAb, Mom5'e en büyük tepkiyi vermektedir.

Tablo 2: hibridom MAb tarama ELISA Abs 450-650 sonuçlari Mcm5 MAb Mcm5 çukurcuk yaniti NSB çukurcuk yaniti Mcm5 spesifik MAb rölatif afiniteleri Protein A saflastirilmis MAb'lerin rölatif afiniteleri, Ab konsantrasyonlarinin normalize edilmesiyle ve MAb'Ierin Ag- sinirlayici kosullar altinda kolorimetrik tarama testine uygulanmasi ile belirlenmistir. Ag sinirlayici kosullari, Ni-NTA His-Sorb mikrotitre plaka çukurcuklari boyunca Mcm5'in lineer titrasyonu ile belirlenir. Gözlemlenen maksimal Abs 450 nm < 3.000, Ag sinirlayici kosullarin göstergesidir, çünkü Ag sinirlayici olmadiginda elde edilebilen maksimum Abs 450 okumasi 4.000'dir. Ag titrasyonu ELISA yanitini 'ölçmek için tavsan Mcm5 PAb (101) ve Keçi anti Tavsan HRP kullanilarak gerçeklestirilir. Her bir Ni-NTA çukurcuguna baglanmasi için 25 ng Mcm5 temin eden bir konsantrasyon, PAb'nin ELISA Abs 450 yanitina sinirlandirmaktadir. Mcm5 epitoplarinin tam dizisinin, PAb tarafindan baglandigindan dolayi, tavsan PAb, fare MAb'larinin arastirilmasi için Ag sinirlayici kosullari belirlemek için seçilmistir. Bu, MAb'larin epitop rekabet derecesini belirlemek için kombine edilen ink'übasyon çalismalarinda arastirilabilmesini saglamistir.

Protein-A ile saflastirilmis MAb çözeltilerindeki IgG konsantrasyonu, bir spektrofotometrede Abs 280 nm ölçümü ile belirlenir ve MAb konsantrasyonlari, PBS içinde seyreltme ile normallestirilir. % 50 maksimum baglanma konsantrasyonu daha sonra, Mcm5 Ag sinirlayici kosullar altinda Nikel afinite Mcm5 çukurcuklarinin bir ELISA'sina uygulanan MAb'lerin dogrusal bir seyreltmesiyle belirlenir. Plakasi üzerinde 25 ng/çukurcuklu hsMcmSrf'ye baglanma sinyalinin platosunun gösterilmesi için, MAb 7A3, bir büyük konsantrasyon araligi `uzerinde ELISA'da yürütülür. 12A7 için % 50 maksimum baglanma yaniti, 20 ng/çukurcuklu bir konsantrasyonda elde edilir. 12A7, hsMcmS'e en yüksek nispi afiniteyi göstermek için % 50 maksimum baglanma konsantrasyonu ile gösterilir (Tablo 3).

Tablo 3: Ni-NTA'ye eslenik sinirli 25 ng/çukurcuklu antijene karsi Mab titrasyonlari nb/Çukurcuklu MAb 4B4 12A7 Iki alanli bir immünometrik analiz için, ayri epitoplara hedeflenen iki MAb gereklidir.

Ag sinirlayici kosullarinda, ayni epitop için rekabet eden bir çift MAbrlar, rakip MAb'nin yoklugunda inkübe edildiginde, daha yüksek nispi afinitenin Ab Abs 450 nm sinyaline esit bir ELISA Abs 450 nm ölçümü saglayacaktir, bununla birlikte, farkli epitoplara hedeflenen bir çift MAb'nin inkübasyonu, bir sterik engellemenin olmamasi kosuluyla, sinirli bir Ag'e verilen MAb 450 nm tepkilerinin toplamina esit bir Abs 450 Ölçümü temin edecektir. MAbtler 12A7 ve 484, en yüksek nispi afinite MAb 12A7'nin ng/çukurcugunun % 50 maksimum baglanma konsantrasyonuna normallesmektedir. Normalize edilmis konsantrasyondaki MAb'Ier, 25 ng/çukurcuklu Mcm5 Ag'yi sinirlayan Ni-NTA plakasi üzerinde hem bireysel hem de çiftlenmis Ab inkübasyonlari kullanilarak bir ELISA'ya tabi tutulur. Bir çift MAb'nin birlesik inkübasyonundan ölçülen en yüksek Abs 450 nm sinyali, iki alanli bir IFMA'da kullanim için en uygun MAb'Ierin göstergesi olacaktir.

Antikor epitop rekabeti sonuçlari Ab Ag epitop rekabet ELlSA çalisma sonuçlari (Tablo 4), MAb 4B4'ün, 12A7 ile iki alanli baglanma Için uyumlu ayri bir epitopa hedeflendigini göstermektedir. 4B4 tarafindan hedeflenen farkli epitop, Abs 450 yaniti ile, 4B4'ün diger MAb'Ier ile paralel olarak inkübe edildiginde, sinirlandirici Ag'ye baglanan her iki MAb'nin toplamina Tablo 4: Ab Ag epitop rekabet ELISA çalisma sonuçlari 12A7 1.375 484 1.244 12A7+4B4 2.693 MAb'Ier normalize edilmis bir konsantrasyonda 20 ng/çukurcuklu, en yüksek nispi afinite 12A7 ile MAb'nin °/o 50 maksimum baglanma konsantrasyonunda inkübe edilir.

Iki alanli immunoassay gelisimi için optimal MAb'ler mavi renkle vurgulanir ve ELISA Abs 450 yanitlari sari renkte vurgulanir.

Kullanilan materyaller: Mikroarray Içerigi: Antijen Mcm5'in (aa 367-582) sekanslari, bir peptit-peptit örtüsmesi ile 15 aa peptide çevrilir.

Numuneler: Fare monoklonal IgG antikor 12A7 ve 484 Yikama Tamponuz PBS, % 0.05 Tween 20 ile pH 7.4 (her analiz sonrasi 3x1 dak.) Bloke EdICI Tampon: Rockland bloke edici tamponu MB-07O (birinci analiz 'öncesi 30 Inkübasyon TamponU: PBS, % 0.05 Tween 20 ile ve % 10 Rockland bloke edici tamponu ile pH 7.4 Analiz Kosullari: Inkübasyon tamponunda 1 ug/ml ve 10 ug/ml Antikor konsantrasyonlari; 4 °C`de 16 saat inkübasyon ve Sekonder Antikor: Keçi anti-fare IgG (H+L) DyLight 680 antikoru; anti-FLAG(M2)-DyLight800 (1:500); içinde boyanan Tarayici: LI-CYA DA Odyssey Görüntüleme Sistemi; tarama offset 0.8 mm, rezolüsyon 21 um, tarama yogunlugu 5/7 kirmizi/yesil Peptid mikroarraylerin birinin ön boyanmasi, ana analizler ile müdahale edebilecek antijen türevli peptitler ile arka plan etkilesimlerini arastirmak üzere 1: 5000'Iik bir seyreltide sekonder keçi anti-fare lgG (H+L) DyLight680 antikor ile yapilir.

Inkübasyon tamponunda 1 ug/ mi ve 10 ug/ml konsantrasyonlarda fare monoklonal tarama yogunlugunda (kirmizi) sekonder antikor ve okuma ile boyamasiyla takip edilir. Peptit dizilerini çerçeveleyen HA ve Flag kontrol peptidleri, analiz kalitesini ve peptit mikroarray bütünlügünü (tarama yogunluklari kirmizi/yesil: 5/7) dogrulamak için nihai olarak iç kalite kontrol olarak boyanir.

Nokta yogunluklari ve peptit açiklamalarinin kantifikasyonu, PepSIide® Analizörü ile yapilir. Bir yazilim algoritmasi her bir noktanin floresan yogunluklarini ham, on plani ve arka plani sinyaline indirir ve on plandaki medyan yogunluklarinin standart sapmasini hesaplar. Ortalama ön plandaki medyan yogunluklarina dayanarak, yogunluk haritalari, yogunluklu renk kodunun vurguladigi peptit haritalarinda, düsük nokta yogunluklari için yüksek ve beyaz için kirmizi ile olusturulan etkilesimlerdir.

Ayrica, tüm nokta yogunluklari ve sinyal gürültü oranlarini görsellestirmek için N- ila C-terminalinden antijen sekanslarina karsi antikor 'örnekleri ile tüm analizlerin ortalama nokta yogunluklarini grafige çizilmistir. Yogunluk grafikleri, peptit ve yogunluk haritalari ile yani sira antikor örnekleri tarafindan taninan peptitleri ve epitoplari tanimlamak için mikroarray taramalarinin görsel olarak incelenmesi ile iliskilendirilir. Belirli bir amino asitin antikor baglanmasina katkida bulunup bulunmadigi net degildir.

Yikama tamponunda 15 dakika önceden sisirme ve bloke edici tamponda 30 dakika ardindan, peptit mikroarrayler, antijen türevli peptitlerle arka plan etkilesimlerini analiz etmek için oda sicakliginda 30 dakika boyunca 1: 5000'lik bir seyreltide sekonder keçi anti-fare lgG (H + L) DyLight680 antikor ile baslangiç olarak inkübe edilir. 5'lik bir tarama yogunlugunda, sekonder antikorun spesifik olmayan baglanmasi nedeniyle herhangi bir arka plan gözlemlemedik. PepSlide® Analizorü ile veri niceligi, ne olasidir ne de gereklidir, çünkü herhangi bir nokta desenin yoklugu, mikroarray izgarasinin hizalanmasini engeller.

Peptid mikroarrayler, 1 ug/ml ve 10 ug/ml (sag üst) konsantrasyonlarda fare monoklonal antikoru 12A7 ile inkübe edilir. Her inkübasyondan sonra, sekonder keçi anti-fare lgG (H+L) DyLight680 antikoru ile Iekelenme, 5 tarama yogunlugunda okunmasini takip eder. Mükemmel sinyalden gürültü oranlarina kadar bir konsensüs motifi ile komsu peptidlerin bir satir tarafindan olusturulmus güçlü ve iyi tanimlanmis bir epitop benzeri nokta model gözlemlenmistir.

Peptit mikroarray çerçeveleyen HA ve Flag kontrol peptidlerinin nihai boyanmasi, beklenen ve iyi tanimlanmis nokta modeline neden olmasini meydana getirir ve genel peptit mikroarray bütünlügünü dogrulanmistir.

Veri miktarini, 1 ug/ml ve 10 pg/ml konsantrasyonlarda fare monoklonal antikoru 12A7 olan deneyler için yogunlugun yani sira peptid ve yogunluk haritalarinin olusturulmasi izlemistir; sonuncusunun yogunluk grafigi daha net bir veri genel bakis saglamak için seviye haline getirilmistir. Sinyal, mikroarray taramasinda gözlenen epitop benzeri nokta modeline dayanarak, motif WDETKGE konsensüs motifleri ile peptitlere atfedilmistir.

Peptid mikroarrayler, 1 ug/ml ve 10 ug/ml konsantrasyonlarda fare monoklonal antikoru 484 ile inkübe edilir. Her inkübasyondan sonra, sekonder keçi anti-fare lgG (H+L) DyLight680 antikoru ile Iekelenme, 5 tarama yogunlugunda okunmasini takip eder. Mükemmel sinyalden gürültü oranlarina kadar bir konsensüs motifi ile komsu peptidlerin bir satir tarafindan olusturulmus güçlü ve iyi tanimlanmis bir epitop benzeri nokta model gözlemlenmistir. 10 pg/ml bir antikor konsantrasyonda epitop benzeri nokta modelinin ham yogunluklari benzerdir ancak etkilesimlerin arka plani, 1 - 10 ug/ml konsantrasyon araliginda antikorun bir sinyal doyumunu belirterek hafifçe artar. Peptit mikroarray çerçeveleyen HA ve Flag kontrol peptidlerinin nihai boyanmasi, beklenen ve iyi tanimlanmis nokta modeline neden olmasini meydana getirir ve genel peptit mikroarray bütünlügünü dogrulanmistir.

Veri miktarini, 1 ug/ml ve 10 ug/ml konsantrasyonlarda fare monoklonal antikoru 484 olan deneyler için yogunlugun yani sira peptid ve yogunluk haritalarinin olusturulmasi izlemistir; sonuncusunun yogunluk grafigi daha net bir veri genel bakis saglamak için seviye haline getirilmistir. 10 ug/ml bir antikor konsantrasyonda epitop benzeri nokta modelinin ham yogunluklari benzerdir ancak etkilesimlerin arka plani, azalan normallestirilmis sinyal yogunluklarina yol açarak hafifçe artar. Bu sinyaller, mikroarray taramasinda gözlenen epitop benzeri nokta modeline dayanarak, DDRVAIH ve WDETKGE konsensüs motifleri ile peptitlere atfedilmistir.

Sekans listesi SEKH3NOI1 WDETKGE QNLVQSNGNTY CAGAACCTTGTACAAAGTAATGGAAACACCTATTTA SQSTRVPYT GFSLSTSGMG GGGTTTTCACTGAGCACTTCTGGTATGGGT ARRSDYNYYSMDY GCGCGGCGAAGTGACTACAATTACTACTCTATGGACTAC LQYASSPPT GFTFSNYA ARHGYNYDDGAWFAN GCAAGACATGGATATAATTACGACGACGGGGCCTGGTTTGCTAAC DIMLTQSPLSL SVT LÜDQASIS( `RSSQhLVQSV( NTYLTWYLQK P( &OSPKV LNK VSNRI' Y ÜVPDRFSÜSGSGTm-'IT RISRVFAFDI CIWFCSQSTRVP\TFÜÜGTKI FIRR GATATCATGCTGACCCAATCTCCACTCTCCCTGTCTGTCACTCTTGGAGATCAGGCCTC QQDLQQSGPGILO PTQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQSSNMGLEWLAHIFWDDDKRY N PSI .RSRI .'l`l ISK I)'I`SSSQV H .M ITSV S'I`AI)SA'I`YYC`AR RSDY NY YSMI)YWGQG'I`A'V"1`VS S TGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGCACTTCTGGTATGGGTGTGAGTTGGATTC GTCAATCTTCAAATATGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTTCTGGGATGATGACAA D IMLTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQDIGSSLNWLQQEPDGTIKRI_ [YATSSL DSGVPKRFS GSRSGSDYSLTISSLESEDFVDYYCLQYASSPPTFGGGTKLEIK VKLQESGGGLVKPGG SL KLSC AASGFT FSNYAMSWVRQNPEKRLBVVVAT]SRGGSYTYY PDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQM'NSLRS EDTAIVI'I'FCARHGYNYDDGAVVFANW GQGTLV SEK ID NO:35: MSUFDDPÜIT YSDSFÜÜDAQ ADEUQARKSQ LQRRFKEFLR QYRVÜTDR TG FTFKYRDI-'îl K 71) Yil" VI" 11"" II!' III.' RH\ !NLGtYWI l-.VhklhDlJÄSI' [Ji-.DLADY LYK Ql'AhHIQIJJ: I'Ã:'\J\K}'I\".'\l)t\v" l RPRPSÜH-.V 13" NU ISH Icin I'm Ixri LQDIOVSILKS DASPSSIRSL KSDMMSHLVK IPOIIIAASA VRAKATRISI OCRSC'RNTLT fx IAMRPUL EU \ ALPRKCNTD QAGRPKtPLD PYFI\1PDK(`K ('VDFQTLK Li) ELPDAVPHGE MI'RHMQLYC'I) RYLCUKV'VPO NRV'I IMCiIYS !KM-`OL I'I SR üRl)RV(i\-'('ilR SS\ IRVLGIQ VITITXJSÜRSF AGA\~'SPOF.EF. H-'RRI .~\AI.P\I VYI-IVISKSM PSIFÜG'I'DWK K:\I»\('I I FGG 37'" `W) MU Jun 411› IM.LML GUI'G l'AlxSQl. I.M-`\›il-LRC`5P1 GVY [SGKGSS AAULTASV \1 R DPSSRNFIME (JGAMVLADGG \›'\<'(`IDEFDK.\I REDDRVAIHE AME(,}QTISIA kACiI'l'J'l'lNS MIFI\” KDEHVFFRIN' MLAKHVITLII 55" MJU VSALTQTQAV EOEIDLAKLK KFIAYCRVKC (iPRLSAEAAE KLKNRYII'HR SCIARQHI-IRDS I-ICii-'I'SQFDQpF MI SRIFKQLK RRF.~'\IGSQ\-'S I-'HSIIKDFTR OKYPf-.H-'XIHK VI Ol MT RRGF lQHlü-lQRle. YRLK SEK ID NO:36 Homo sapiens minikromozom bakim kompleksi bileseni 5 (MCMS), mRNA NCBI Referans Sekans: NM006739.3 6] gcllcggggg cgzicgcccag grcgacgugg_ ggüiggcwg ciiuulcgciig_ utgcuguggc NI tggaggaici ggocagcm gatgaggacc lggccgacla ctigtacaag cagccagccg Stil agcxcigca gcîgcîggag gmgctgcca .iggaggîagc Tgdîgaggîg acccggcccc Sol &tünelgg ggaggaggîg ctccaggaûi îccagglcai gctcaagicg gag-ocagi::: 421 clicciiguzit Icgtngccig uaigicggucu igulgtcucv cctgglgiuig :itcculggcu 541 ;crgccgcaa cuccctcacc ancungccu igcgcccigg chc-;dgggc tuigccclgc hill ccaggaagig caxicacagzit cagctgggc gccccuaig occanggac ccgtacnca (vol !cargcccga caaaigcaaa tgcgtggxi iccagaccci gaagcrgcag gagcigccig HIZI tcarcrcw gagcatcgcc CCCTCCarct nggggcac agacaigaag aaggccan_ l 141 &culcaacct gctgalgclu ggggaccdg ;ga-cagccua gicccagcn ctgaugmg 1521 tggrwrgsc Cgalggîggg gicgictgta irgacgagn igxaagaig cgagaagam URI accgtgiggc aatccxgaa gcmiggagc .::cagacmi ctcratcgcc a.i_-3crggga 1441 tcaccuccac cclgaaclcc cgcliS '-lccg Icclggctgc lgccaaclüi glgncggcc 1561 tcgmciilgdl cilcuîcgîc Mggalgagc acaatgagga gugggdlglg ulgclggcca 1031 rigaccrggc cugctgaag aagtmng «tacrgccg agîgaagtgr ggcccccs'gc 1741 iglcaiguigu &mg-ayi; aiaimtgimgzi ;aucgciiacut uutcatgcgg .igcggggut 311.!] tcuiciiziggu cüciiccaag üiguzmiix'c Cg-.jgugcuugc culcciiimug gtgctgcugr 23'” igoctgocat tg' ':iaigtt gctgggacct cigcctcccc :icigcagccc Icgazicilcc 240] ccgctlclag cgcggnctg ggaagîgigc Iîtrggca'tc cgîtaataat aaagccacgg 2461 lglgttcugg Iamaiuuiuuu uuuzizuumau auuiuuuuaau iuuiuuuuauiu iiziiiiiiuuiuuu 2521 uuuaaaaaam :ama <110> <120> <130> <140> <141> <150> <151> <160> <170> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> SEKANS LISTESI Arquer Diagnostics Ltd N403141VVO Patentin version 3.5 Yapaysekans 12A7 antikorunun baglandigi epitop <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> Yapaysekans 4B4 antikorunun baglandigi epitop <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> Yapaysekans 12A7 hafif zincir CDR 1 Polipeptit sekansi Gln Asn Leu Val Gln Ser Asn Gly Asn Thr Tyr <210> <211>36 <212> DNA <213> Yapay sekans <220> <223> 12A7 hafif zincir CDR 1 nükleotit sekansi <400> 4 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Yapay sekans <220> <223> 12A7 hafif zincir CDR 2 Polipeptit sekansi <220> <221> muhtelif özellikler <222> (4)..(4) <223> Xaa dogal olarak meydana gelen herhangi bir amino asit olabilir <400> 5 <210> 6 <211> 10 <212> DNA <213> Yapay sekans <220> <223> 12A7 hafif zincir CDR 2 nükleotit sekansi <400> 6 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Yapay sekans <220> <223> 12A7 hafif zincir CDR 3 Polipeptit sekansi <400> 7 Ser Gln Ser Thr Arg Val Pro Tyr Thr <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Yapay sekans <220> <223> 12A7 hafif zincir CDR 3 nükleotit sekansi <400> 8 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Yapay Sekans <220> <223> 12A7 agir zincir CDR 1 polileptit sekansi <400> 9 Giy Phe Ser Leu Ser Thr Ser Giy Met Gly <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Yapay sekans <220> <223> 12A7 agir zincir CDR1 nükleotitsekansi <400> 10 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Yapay sekans <220> <223> 12A7 agir zincir CDR 2 Polipeptit sekansi <400> 11 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Yapay sekans <220> <223> 12A7 agir zincir CDR 2 nükleotit sekansi <400> 12 <210> 13 <211> 13 <212> PRT <213> Yapay sekans <220> <223> 12A7 agir zincir CDR 3 Polipeptit sekansi <400> 13 Ala Arg Arg Ser Asp Tyr Asn Tyr Ty: Sex: Met Asp Ty:: <210> 14 <211> 39 <212> DNA <213> Yapay sekans <220> <223> 12A7 agir zincir CDR 3 nükleotit sekansi <400> 14 <210> 15 <211> 6 <212> PRT <213> Yapay sekans <220> <223> 4B4 hafif zincir CDR 1 Polipeptit sekansi <400> 15 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Yapay sekans <220> <223> 4B4 hafif zincir CDR 1 nükleotit sekansi <400> 16 <210> 17 <211> 4 <212> PRT <213> Yapay sekans <220> <223> 4B4 hafif zincir CDR 2 Polipeptit sekansi <220> <221› muhtelif özellikler <222> (4)..(4) <223> Xaa dogal olarak meydana gelen herhangi bir amino asit olabilir <400>17 <210> 18 <211> 10 <212> DNA <213> Yapaysekans <220> <223> 4B4 hafif zincir CDR 2 nükleotit sekansi <220> <221> muhtelif özellikler <222> (10)(10) <223> n a, 0, 9, ya da t*dir <400> 18 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Yapay sekans <220> <223> 4B4 hafif zincir CDR 3 Polipeptit sekansi Leu Gln Tyr Ala Sar Ser Pro Pro Thr <400> 19 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Yapay sekans <220> <223> 4B4 hafif zincir CDR 3 nükleotit sekansi <400> 20 <210> 21 <211> 8 <212> PRT <213> Yapay sekans <220> <223> 4B4 agir zincir CDR 1 Polipeptit sekansi <400> 21 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Yapay sekans <220> <223> 4B4 agir zincir CDR 1 nükleotit sekansi <400> 22 <210> 23 <211> 8 <212> PRT <213> Yapay sekans <220> <223> 4B4 agir zincir CDR 2 Polipeptit sekansi <400> 23 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Yapay sekans <220> <223> 4B4 agir zincir CDR 2 nükleotit sekansi <400> 24 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Yapay sekans <220> <223> 4B4 agir zincir CDR 3 Polipeptit sekansi <400> 25 Ala Arg His Gly Tyr Asn Tyr Asp Asp Gly Ala Trp Phe Ala Asn 1 5 10 15 <210> 26 <211> 45 <212> DNA <213> Yapay sekans <220> <223> 4B4 agir zincir CDR 3 nükleotit sekansi <400> 26 <210> 27 <211> 113 <212> PRT <213> Yapaysekans <220> <223> 12A7 tamamen degisken hafif zincir sekansi (Polipeptit) <400> 27 <210> 28 <211> 338 <212> DNA .!' 11. 5.!' <213> Yapaysekans <220> <223> 12A7 tamamen degisken hafif zincir sekansi (nükleotit) <400> 28 <210> 29 ciigctqgai :tangacq <211> 121 <212> PRT <213> Yapay sekans <220> <223> 12A7 tamamen degisken agir zincir sekansi (Polipeptit) <400> 29 <210> 30 <211> 363 <212> DNA <213> Yapay sekans <220> 8.: Lyi <223> 12A7 tamamen degisken agir zincir sekansi (nükleotit) <400> 30 itatqqqtct quaqtqqctq ccctgiggaq ccqactcacg tcnccaqtgt qaqtactçca atcictactc titQQiCCCC tqacaigcgc <210> 31 <211> 107 <212> PRT <213> Yapay sekans <220> <223> 4B4 tamamen degisken hafif zincir sekansi (Polipeptit) <400> 31 Asp Il. Miz Lan Thr Gin Sor Pro Sor Sor Liu Sir kia s.: Lou Giy 1 5 10 15 Giu Arg Vai Sor Lou Thr Cys Arg Ala Sor Gin Asp Iio Giy Sor Sor 25 30 Leu Asn Trp Leu Gln Bln Glu Pro Asp Gly Thr Ile Lya Axq Leu Ile 40 45 Tyr Ala ?hr Sor Sor Lev Asp Sor Gly Vai Pro Lyi Arq Ph. Sor Ciy 50 55 60 Sir Arq Sor Gly Sor Aip ?yt Sor Lou ?hr Il. Sor Sor Lou Glu S.: 65 70 75 80 Glu Aip Ph. Vii Aip Tyr Ty: Cyi Lou Gln Ty: Ala Sir Sir ?:0 ?to 85 90 95 Thr Ph. Gly Gly Gly ?hr Lys Lou Glu Il. Lys 100 105 <210> 32 <211> 322 <212> DNA <213> Yapay sekans <220> <223> 4B4 tamamen degisken hafif zincir sekans(n`ükleotit ) <400> 32 <210> 33 <211> 121 <212> PRT <213> Yapay sekans <220> <223> 4B4 tamamen degisken agir zincir sekansi (Polipeptit) <400> 33 Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vil Lou Lyi Lou Sor Cyi Ala A1: Sor Gly Ph. ?hr Mon Sor Trp vii Arq Gln Ain Pro 010 Lyi Arq Giy Arg Ph. Thr 110 S.: Arg Asp Asn Ala Lys 65 70 75 Gin Hot Asn Sor Lou Arg Sor Giu Asp Thr Ala Arq His Gly Tyr Asn Ty: Asp Asp Giy Ala Trp 100 105 Gln Gly Thr LOu Val Thr Val Sor Ala 115 120 <210> 34 <211> 366 <212> DNA <213> Yapay sekans <220> <223> 4B4 tamamen degisken agir zincir sekansi (nükleotit ) <400> 34 <210> 35 <211> 734 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Mcm5 (Polipeptit) <400> 35 1`459 <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> 36

Claims (1)

1. ISTEMLER . Ozellikle Mcm5'e baglanan bir monoklonal antikor olup, özelligi; (ii) SEK lD NO: 1*e ait bir amino asit sekansina sahip olan bir epitopa baglanmasidir. . Ozellikle Mcmsie baglanan bir monoklonal antikor olup, özelligi; SEK ID NO: sahip olan 4B4 CDRH2, SEK lD NO: 25'e ait bir sekansa sahip olan 454 CDRHS, SEK ID NO: 15ie ait bir sekansa sahip olan 4B4 CDRLi, SEK ID NO: 17iye ait bir sekansa sahip olan 484 CDRL2 ve SEK lD NO: 19ia ait bir sekansa sahip olan 4B4 CDRL3 içermesidir. . Ozellikle Mcm5'e baglanan bir monoklonal antikor olup, özelligi; SEK ID NO: 99 ait bir sekansa sahip olan 12A7 CDRH1, SEK ID NO: 11'e ait bir sekansa sahip olan 12A7 CDRH2, SEK ID NO: 13re ait bir sekansa sahip olan 12A7 CDRHS, SEK ID NO: 3'e ait bir sekansa sahip olan 12A7 CDRLi, SEK ID NO: 5'e ait bir sekansa sahip olan 12A7 CDRL2 ve SEK ID NO: 7ie ait bir sekansa sahip olan 12A7 CDRL3 içermesidir. . Istemler 1- 3 arasinda herhangi birine ait antikor olup, özelligi; 1 - 10 nM araliginda Mcm5 için bir afiniteye sahip olmasidir. . Istem 1 (ii) ya da istem &e ait antikor olup, özelligi; içerisinde antikorun, SEK lD NO: 297a en az % 98 özdes bir sekansa sahip bir agir zincir degisken bölgesini içermesidir ve antikorun, SEK lD NO: 27yye en az % 98 özdes bir sekansa sahip bir hafif zincir degisken bölgesini içermesidir. . istem 1 (i) ya da istem Z'ye ait antikor olup, özelligi; içerisinde antikorun, SEK lD NO: 33fe en az % 98 özdes bir sekansa sahip bir agir zincir degisken bölgesini içermesidir ve antikorun, SEK lD NO: 31re en az % 98 özdes bir sekansa sahip bir hafif zincir degisken bölgesini içermesidir. . Istemler 1 - 6 arasinda herhangi birine ait antikoru ihtiva eden bir kom pozisyondur. . Bir kompozisyon olup, özelligi; (i) SEK ID NO: 28re en az % 98, % 99, ya da % 100 özdes bir nükleik asit sekansini ve SEK ID NO: 30'e en az % 98, % 99, ya da % 100 özdes bir nükleik asit sekansini; ya da (ii) SEK lD NO: 32'ye en az % 98, % 99, ya da % 100 özdes bir nükleik asit sekansini ve SEK ID NO: 34=e en az % 98, % 99, ya da % 100 özdes bir nükleik asit sekansini; ya da (iii) SEK lD NO: 28'e ait bir nükleik asit sekansini ve SEK ID NO: 303 ait bir nükleik asit sekansini; ya da (iv) SEK lD NO: 32'ye ait bir nükleik asit sekansini ve SEK ID NO: 347e ait bir nükleik asit sekansini içermesidir. 9. istem 8'e ait nükleik asidi ihtiva eden bir konakçi hücre olup, özelligi; opsiyonel olarak içerisinde konakçi hücrenin bir CHO hücresi ya da bir E.koIi hücresi olmasidir. 10. Bir antikorun yapilmasina ait bir metot olup, özelligi; (i) istem 9,3 ait bir konakçi hücrenin büyütülmesini; ve (ii) konakçi hücreden bir antikorun izole edilmesini içermesidir. 11. istem 10'e ait metot olup, özelligi; (i) antikorun bir radyo etiketine konjuge edilmesiyle antikorun bir etiketleme adimini ayrica içermesi; ya da (ii) antikorun bir kati destege immobilize edilme adimini ayrica içermesidir. 12. Bir kit olup, özelligi; (i) istemler 1(i), 2 ya da 6 arasinda herhangi birine göre bir birinci antikoru ihtiva eden bir kompozisyonu; ve (ii) istemler 1(ii), 3 ya da 5 arasinda herhangi birine göre bir ikinci antikoru ihtiva eden bir kompozisyonu içermesidir. 13. Bir numunede Mcm5'in konsantrasyonunu ya da miktarini belirlenmesine ait bir metot olup; asagidaki adimlari: (i) bir kati destege immobilize edilmis istemler 1 - 6 arasinda herhangi birine ait bir antikoru olan immobilize edilmis bir birinci antikorun temin edilmesi; (ii) numunedeki Mcm5'in immobilize edilmis Mcm5'in temin edilmesi için immobilize edilmis antikora baglanabildigi sekliyle immobilize edilmis birinci antikora numunenin maruz birakilmasi, (iii) bir etikete konjuge edilmis istemler 1 - 6 arasinda herhangi birine ait bir antikor olan etiketlenmis ikinci antikorun temin edilmesi; (iv) etiketlenmis ikinci antikorun Mcm5'e baglanabildigi sekliyle etiketlenmis ikinci antikora immobilize edilmis Mcm5,e maruz birakilmasi; ve (v) etiketlenmis ikinci antikorun konsantrasyonunun tespit edilmesini içermekte olup; özelligi; içerisinde birinci antikor ve ikinci antikorun her ikisinin de Mcm5'e baglanmasi ancak birinci antikor ve ikinci antikorun Mcm5iin farkli epitoplara baglanmasidir. 14.Istem 12'ye ait kit ya da istem 13*e ait metot olup, özelligi; içerisinde birinci antikor ve ikinci antikorun her ikisinin de Mcm5'e baglanmasi ancak birinci antikor ve ikinci antikorun Mcm5iin farkli epitoplara baglanmasidir; ve (a) (i) birinci antikor SEK lD NO: 1'e baglanir ve ikinci antikor SEK ID NO: 2rye baglanir; ya da (ii) birinci antikor SEK ID NO: Z'ye baglanir ve ikinci antikor SEK lD NO: 179 baglanir; ve/ veya (b) birinci antikor, bir ELISA plakasina immobilize edilmistir; ve/ veya (0) ikinci antikor bir ELlSA plakasina immobilize edilmistir; ve/ veya (d) ikinci antikor, bir radyo etiketine konjuge edilir, opsiyonel olarak içerisinde radyoaktif etiket is Europium 3* 'dir; ve/ veya (e) birinci antikor, radyoaktif etikete konjuge edilir, opsiyonel olarak içerisinde radyoaktif etiket is Europium 3* 'dir. 15. istemler 13 - 14 arasinda herhangi birine göre metot olup, özelligi; içerisinde etiketlenmis ikinci antikorun konsantrasyonunun tespit edilmesine ait adiminin, Eu3+ “in immunofloresan tespitini içermesidir.