CN1687405A - 人卵巢癌耐药细胞株及其培养方法 - Google Patents

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本发明涉及一种人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株SKOV3/TAX或拓扑替康耐药细胞株SKOV3/TOP及其培养方法，其特征是选择人卵巢癌细胞株SKOV3作为亲代细胞，选用TAX的终浓度为300ug/ml或TOP的终浓度为2160ng/ml作为大剂量冲击用量，以反复大剂量冲击方式间歇用药，建立SKOV3/TAX细胞耐药指数(RI)为10.57，除对TAX耐药外，对5－氟尿嘧啶有明显的交叉耐药，SKOV3/TO P细胞耐药指数(RI)为10.67，除对TOP耐药外，对米托蒽醌(MX)、喜树碱(CPT)、长春新碱(VCR)有明显的交叉耐药，与敏感细胞相比P＜0.01。

Description

人卵巢癌耐药细胞株及其培养方法
技术领域
本发明涉及一种选择人卵巢癌细胞株SKOV3作为亲代细胞，选用临床常用抗癌药物紫杉醇或拓扑替康作为诱导剂，以反复大剂量冲击方式间歇用药，建立了紫杉醇耐药细胞株SKOV3/TAX或拓扑替康耐药细胞株SKOV3/TOP的人卵巢癌耐药细胞株及其培养方法。
背景技术
卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤之一，目前以紫杉醇与铂类联合作为卵巢癌的一线化疗方案、拓扑替康与铂类联合作为二线化疗方案广泛用于临床。然而，常遇到对这些药物耐药的问题。目前有关耐药的研究多采用浓度梯度递增法在体外诱导耐药细胞株，但这种方法与临床化疗反复、间歇用药的特点相差甚远。
发明内容
本发明的目的是利用人卵巢癌细胞株SKOV3作为亲代细胞，选用临床常用抗癌药物紫杉醇或拓扑替康作为诱导剂，以反复大剂量冲击方式间歇用药，建立紫杉醇耐药细胞株SKOV3/TAX或拓扑替康耐药细胞株SKOV3/TOP。
本发明的细胞株是用如下方法培养的：
1、药物：选择拓扑替康(TOP)或紫杉醇(TAX)；
2、药剂量：根据公式[(60×D)/(5000)]×2×103[5]，其中60为平均成人体重(kg)，D临床用药剂量(mg.kg-1.d-1)，5000为平均成人血容量(ml)，2为除以血细胞比积50％，103将mg换成ug，参照卵巢癌病人临床化疗剂量，TOP 1.2mg/m2，TAX175/mg/m2，以临床大剂量冲击疗法的用药剂量为常用剂量的3倍为标准，采用TAX的终浓度为300ug/ml、TOP的终浓度为2160ng/ml作为大剂量冲击用量；
3、亲代细胞培养：人卵巢上皮癌细胞株SKOV3细胞生长于含15％小牛血清的RPMI1640培养基中，置入5％CO2、37℃培养箱中培养；
4、卵巢癌耐药细胞株诱导：取对数生长期细胞，0.25％的胰酶消化后计数，以5×105/ml细胞接种于培养瓶(以每瓶5ml接种)，24小时后细胞贴壁，再加入终浓度为300ug/ml的TAX或终浓度为2160ng/ml的TOP作用2小时，弃去培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3遍，更换新鲜培养液，待细胞恢复生长再进行第二次冲击。如此反复作用，TAX共加药冲击12次，或TOP共加药冲击13次，历时10个月建成人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/TAX、或SKOV3/TOP，所有耐药性实验均在细胞稳定生长后2个月后进行，细胞冻存3个月后复苏。
细胞株SKOV3/TAX、SKOV3/TOP保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号分别为CGMCCNo.1216，CGMCCNo.1217。
耐药性的测定：以MTT法测耐药指数，绘制细胞生长曲线，流式细胞仪测定细胞的凋亡率及细胞周期分布；透射电镜观察细胞的超微结构的改变。
1.细胞耐药指数(RI)：SKOV3/TAX细胞为10.57，与敏感细胞相比P＜0.01，除对TAX耐药外，对5-氟尿嘧啶有明显的交叉耐药，SKOV3/TOP耐药指数为10.67(P＜0.01)，对米托蒽醌(MX)、喜树碱(CPT)、长春新碱(VCR)有明显的交叉耐药。见表1，2。
               表1  SKOV3/TAX细胞耐药谱
药物                  IC50(μg/ml)                 RI
            SKOV3              SKOV3/TAX
TAX         0.152±0.002       1.607±0.002         10.57**
5-FU        1.110±0.002       3.499±0.003         3.15*
CTX         3.770±0.005       10.665±0.002        2.83
DDP         0.015±0.004       0.016±0.004         0.94
VCR         1.750±0.002       2.980±0.003         1.7
VP16        0.060±0.007       0.122±0.004         2.03
TOP         0.090±0.003       0.112±0.004         1.24
MTX        1.072±0.008      1.173±0.012      0.91
**P＜0.01，*P＜0.05
                  表2  SKOV3/TOP细胞耐药谱
药物              IC50(μg/ml)                RI
           SKOV3             SKOV3/TOP
TOP        0.545±0.069      5.816±1.047      10.67**
CPT        0.169±0.048      0.669±0.152      3.97*
MX         0.130±0.024      0.603±0.291      4.37*
VCR        3.621±1.324      11.010±4.329     3.04*
VP16       0.707±0.310      0.807±0.351      1.14
TAX        3.030±1.54       4.950±1.973      1.63
DDP        1.043±0.036      1.452±0.541      1.39
5-FU       12.647±4.387     10.037±3.876     0.794
MTX        1.869±0.784      0.657±0.329      0.352
**P＜0.01，*P＜0.05
2细胞生长曲线和群体倍增时间
细胞生长曲线及细胞周期显示，两种耐药细胞的生长增殖较亲本细胞明显减慢(P＜0.01)，见图1。
3.P-170糖蛋白功能检测结果
耐药细胞株SKOV3/TAX及SKOV3/TOP中的P-170糖蛋白含量明显增高(P＜0.01)，与其耐药指数相符。见表3-5及图2-4。
表3.SKOV3细胞检测结果
日期：23-Nov-04
标志     细胞数       ％比         均数      几何均数
所有     18284      100.00      1396.78       1030.10
M1期      2711       14.83       109.80         99.68
M2期     15577       85.19      1620.48       1546.17
表4.SKOV3/TAX细胞检测结果
日期：23-Nov-04
标志     细胞数       ％比         均数      几何均数
所有     13717      100.00        11.65          7.98
M1期     13708       99.93        11.21          7.96
M2期        10        0.07       644.16        468.07
表5.SKOV3/TOP细胞检测结果
日期：23-Nov-04
标志     细胞数       ％比         均数      几何均数
所有     18440      100.00      1487.90       1046.54
M1期      2565       13.91        97.89         81.78
M2期     15878       86.11      1712.22       1579.39
附图说明
图1细胞生长曲线
图2SKOV3细胞P-170糖蛋白流式细胞测定
图3SKOV3/TAX细胞P-170糖蛋白流式细胞测定
图4SKOV3/TOP细胞P-170糖蛋白流式细胞测定
具体实施方式
实施例1
以紫杉醇(TAX)药物诱导SKOV3细胞，建立SKOV3/TAX耐药细胞株。药物：紫杉醇(TAX)为北京四环医药科技有限公司产品。
1、用药剂量：根据公式[(60×D)/(5000)]×2×103，其中60为平均成人体重(kg)，D临床用药剂量(mg.kg-1.d-1)，5000为平均成人血容量(ml)，2为除以血细胞比积50％，103将mg换成ug。参照卵巢癌病人临床化疗剂量，TAX175/mg/m2，以临床大剂量冲击疗法的用药剂量为常用剂量的3倍为标准，采用TAX的终浓度为300ug/ml、作为大剂量冲击用量；
2、代细胞培养：人卵巢上皮癌细胞株SKOV3细胞生长于含15％小牛血清的RPMI1640培养基中，置入5％CO2、37℃培养箱中培养；
3、卵巢癌耐药细胞株诱导：取对数生长期细胞，0.25％的胰酶消化后计数，以5×105/ml细胞接种于培养瓶(以每瓶5ml接种)，24小时后细胞贴壁，再加入终浓度为300ug/ml的TAX作用2小时，弃去培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3遍，更换新鲜培养液，待细胞恢复生长再进行第二次冲击，如此反复作用，TAX共加药冲击12次，历时10个月建成人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/TAX，所有耐药性实验均在细胞稳定生长后2个月后进行，细胞冻存3个月后复苏，其耐药性仍然稳定。
细胞耐药指数(RI)：SKOV3/TAX细胞为10.57，与敏感细胞相比P＜0.01，
除对TAX耐药外，对5-氟尿嘧啶有明显的交叉耐药。
实施例2
以拓扑替康(TOP)药物诱导SKOV3细胞，建立SKOV3/TOP耐药细胞株。
药物：拓扑替康(TOP)为贵州汉方制药有限公司产品。
1.用药剂量：根据公式[(60×D)/(5000)]×2×103，其中60为平均成人体重(kg)，D临床用药剂量(mg.kg-1.d-1)，5000为平均成人血容量(ml)，2为除以血细胞比积50％，103将mg换成ug，参照卵巢癌病人临床化疗剂量，TOP 1.2mg/m2，以临床大剂量冲击疗法的用药剂量为常用剂量的3倍为标准，采用TOP的终浓度为2160ng/ml作为大剂量冲击用量；
2、代细胞培养：人卵巢上皮癌细胞株SKOV3细胞生长于含15％小牛血清的RPMI1640培养基中，置入5％CO2、37℃培养箱中培养。
3、巢癌耐药细胞株诱导：取对数生长期细胞，0.25％的胰酶消化后计数，以5×105/ml细胞接种于培养瓶(以每瓶5ml接种)，24小时后细胞贴壁，再加入终浓度为2160ng/ml的TOP作用2小时，弃去培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3遍，更换新鲜培养液，待细胞恢复生长再进行第二次冲击，如此反复作用，TOP共加药冲击13次，历时10个月建成人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/TOP。所有耐药性实验均在细胞稳定生长后2个月后进行，细胞冻存3个月后复苏，其耐药性仍然稳定。
SKOV3/TOP耐药指数为10.67(P＜0.01)，除对TOP耐药外，对米托蒽醌(MX)、喜树碱(CPT)、长春新碱(VCR)有明显的交叉耐药。

Claims (3)

1、一种人卵巢癌耐药细胞株培养方法，其特征在于：
(1)药物：拓扑替康(TOP)或紫杉醇(TAX)；
(2)用药剂量：采用TAX的终浓度为300ug/ml或TOP的终浓度为2160ng/ml作为大剂量冲击用量；
(3)亲代细胞培养：人卵巢上皮癌细胞株SKOV3细胞生长于含15％小牛血清的RPMI1640培养基中，置入5％CO2、37℃培养箱中培养；
(4)卵巢癌耐药细胞株诱导：取对数生长期细胞，0.25％的胰酶消化后计数，以5×105/ml细胞接种于培养瓶(以每瓶5ml接种)，24小时后细胞贴壁，再加入终浓度为300ug/ml的TAX或终浓度为2160ng/ml的TOP作用2小时，弃去培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3遍，更换新鲜培养液，待细胞恢复生长再进行第二次冲击，如此反复作用，TAX共加药冲击12次或TOP共加药冲击13次，历时10个月建成人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/TAX、或SKOV3/TOP。
2.一种人卵巢癌耐药细胞株，其特征在于：它是由权利要求1所述的方法培养的SKOV3/TAX细胞株，SKOV3/TAX细胞耐药指数(RI)为10.57，与敏感细胞相比P＜0.01，除对TAX耐药外，对5-氟尿嘧啶有明显的交叉耐药。
3.一种人卵巢癌耐药细胞株，其特征在于：它是由权利要求1所述的方法培养的SKOV3/TO P细胞株，SKOV3/TO P细胞耐药指数(RI)为10.67，与敏感细胞相比P＜0.01，除对TOP耐药外，对米托蒽醌(MX)、喜树碱(CPT)、长春新碱(VCR)有明显的交叉耐药。
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