ES2883191T3 - Anticuerpos y ensayos para la detección del receptor 1 de folato - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un epítopo de FOLR1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende las secuencias de polipéptidos de CDR1- 3 de VH y CDR1-3 de VL que se seleccionan del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO: 3-8, respectivamente; (b) SEQ ID NO: 9-14, respectivamente; (c) SEQ ID NO: 15-20, respectivamente; (d) SEQ ID NO: 21-26, respectivamente; (e) SEQ ID NO: 3-5 y SEQ ID NO: 59, 7 y 8, respectivamente; (f) SEQ ID NO: 3, 60 y 5 y SEQ ID NO: 6-8, respectivamente; (g) SEQ ID NO: 3, 61 y 5 y SEQ ID NO: 6-8, respectivamente; (h) SEQ ID NO: 3, 60 y 5 y SEQ ID NO: 59, 7 y 8, respectivamente; y (i) SEQ ID NO: 3, 61 y 5 y SEQ ID NO: 59, 7 y 8, respectivamente.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos y ensayos para la detección del receptor 1 de folato
Campo de la invención
El campo de esta invención se refiere en general a kits y ensayos de diagnóstico para terapias basadas en el receptor 1 de folato y anticuerpos que se unen al receptor 1 de folato humano.
Antecedentes de la invención
El cáncer es una de las causas principales de muerte en el mundo desarrollado, con más de un millón de personas diagnosticadas con cáncer y 500.000 muertes al año solamente en los Estados Unidos. Globalmente, se estima que más de 1 de 3 personas desarrollará alguna forma de cáncer durante su vida. Existen más de 200 tipos diferentes de cáncer, cuatro de los cuales-de mama, pulmón, colorrectal y de próstata-representan más de la mitad de todos los casos nuevos (Jemal et al., 2003, Cancer J. Clin. 53:5-26).
El receptor 1 de folato (FOLR1), también conocido como receptor de folato alfa o proteína de unión a folato, es una proteína N-glicosilada expresada en la membrana plasmática de las células. El FOLR1 tiene una alta afinidad por el ácido fólico y por varios derivados reducidos del ácido fólico. El FOLR1 media la administración del folato fisiológico, 5-metiltetrahidrofolato, al interior de las células.
El FOLR1 se sobreexpresa en la amplia mayoría de cánceres de ovario, así como también en varios cánceres uterinos, de endometrio, pancreáticos, renales, de pulmón y de mama, mientras la expresión del FOLR1 en tejidos normales se restringe a la membrana apical de las células epiteliales en los túbulos proximales del riñón, los neumocitos alveolares del pulmón, la vejiga, los testículos, los plexos coroideos y la tiroides (Weitman SD, et al, Cancer Res 52: 3396-3401 (1992); Antony AC, Annu Rev Nutr16: 501-521 (1996); Kalli KR, et al. Gynecol Oncol 108: 619-626 (2008)). Este patrón de expresión del FOLR1 lo convierte en una diana deseable para la terapia contra el cáncer dirigida a FOLR1.
Debido a que el cáncer de ovario es típicamente asintomático hasta el estadio avanzado, a menudo se diagnostica en un estadio tardío y tiene un pronóstico desfavorable cuando se trata con los procedimientos disponibles actualmente, típicamente fármacos quimioterapéuticos después de cirugía citorreductora (von Gruenigen V et al., Cancer 112: 2221­ 2227 (2008); Ayhan A et al., Am J Obstet Gynecol 196: 81 e81-86 (2007); Harry VN et al., Obstet Gynecol Surv 64: 548-560 (2009)). Por lo tanto, existe una clara necesidad médica no satisfecha de diagnósticos más eficaces para los cánceres de ovario.
Algunos ensayos previos usados para detectar FOLR1 diseminado no son suficientemente específicos para FOLR1. Por ejemplo, algunos ensayos no distinguen entre FOLR1 y otros miembros de la familia de los receptores de folato (FOLR2, 3 y 4) o informan de valores para la FBP (proteína de unión a folato) total. Adicionalmente, algunos ensayos requieren que las muestras humanas (p. ej., plasma) sean tratadas previamente con una etapa de lavado con ácido suave para disociar el ácido fólico del receptor. Algunos resultados de los ensayos pueden tener también inconsistencias debido a los efectos competitivos entre la terapia de anticuerpo y el anticuerpo de diagnóstico. Adicionalmente, muchos kits disponibles comercialmente no son tradicionalmente fiables tanto en sus reactivos como en su estabilidad entre lotes. Las evaluaciones de estos kits han dado resultados muy mezclados y se prevén únicamente para uso en investigación. Muchos requieren que la muestra humana se diluya previamente antes del análisis para reducir la probabilidad de falsos positivos debido al "efecto de la matriz". Por lo tanto, existe una clara necesidad de ensayos de diagnóstico precisos y altamente sensibles que puedan detectar un rango dinámico clínicamente relevante para FOLR1 como un auxiliar para terapias basadas en FOLR1.
Resumen de la invención
En la presente memoria se proporcionan anticuerpos anti-FOLR1 y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, así como métodos para detectar FOLR1, diagnosticar trastornos y enfermedades mediadas por FOLR1 (tal como el cáncer), monitorizar la eficacia de las terapias anti-FOLR1, optimizar las terapias anti-FOLR1 y estratificar a los pacientes.
Los anticuerpos anti-FOLR1 proporcionados en la presente memoria tienen un papel de diagnóstico. Por ejemplo, los anticuerpos anti-FOLR1 se proporcionan en la presente memoria para distinguir entre células o tejidos tumorales y no tumorales, o para identificar tipos, subtipos o grados de tumores. En una realización, un anticuerpo anti-FOLR1 proporcionado en la presente memoria y/o un ensayo de detección de FOLR1 proporcionado en la presente memoria puede usarse para distinguir entre subtipos de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), incluyendo adenocarcinoma y carcinoma de células escamosas, tal como se describe en la presente memoria. En otra realización, un anticuerpo anti-FOLR1 proporcionado en la presente memoria y/o un ensayo de detección de FOLR1 proporcionado en la presente memoria puede usarse para descartar un tipo de cáncer (p. ej., para determinar que una célula o un tejido no es de un tipo de cáncer), por ejemplo, sarcoma.
En algunas realizaciones, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionado en la presente memoria puede unirse específicamente a un epítopo de FOLR1, en donde el epítopo comprende al menos uno, al menos dos o tres aminoácidos N-glicosilados. La glicosilación puede ser crucial para la localización en la membrana. Véase, p. ej., Yan et al., J. Am. Soc. Nephol. 13: 1385-1389 (2002). De manera ventajosa, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden detectar la expresión de FOLR1 en membranas celulares y detectar un rango dinámico clínicamente relevante de FOLR1. La tinción más discreta obtenida con los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno proporcionados en la presente memoria permite discriminar entre muestras agrupadas todas conjuntamente como niveles de expresión alta (con una puntuación de 3) mediante el uso de anticuerpos que se unen a diferentes epítopos de FOLR1, carecen de especificidad suficiente y/o carecen de sensibilidad suficiente.
En algunas realizaciones, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionado en la presente memoria puede unirse específicamente al mismo epítopo de FOLR1 que un anticuerpo que se selecciona del grupo que consiste en: (a) un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO:27 y el polipéptido de la SEQ ID No:28; (b) un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO:29 y el polipéptido de la SEQ ID NO:30; (c) un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO:31 y el polipéptido de la SEQ ID NO:32; (d) un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO:62 y el polipéptido de la SEQ ID NO:63 o SEQ ID NO:64; y (e) un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO:65 y el polipéptido de la SEQ ID NO:66 o SEQ ID NO:67. En algunas realizaciones, el epítopo comprende un aminoácido N-glicosilado.
En algunas realizaciones, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionado en la presente memoria puede unirse específicamente a FOLR1, en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo inhibe de manera competitiva la unión a FOLR1 de un anticuerpo que se selecciona del grupo que consiste en: (a) un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO:27 y el polipéptido de la SEQ ID NO:28; (b) un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO:29 y el polipéptido de la sEq ID NO:30; (c) un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO:31 y el polipéptido de la SEQ ID NO:32; (d) un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO:62 y el polipéptido de la SEQ ID NO:63 o SEQ ID NO:64; y (e) un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO:65 y el polipéptido de la SEQ ID NO:66 o SEQ ID NO:67.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende las secuencias de polipéptidos CDR1-3 de VH y CDR1-3 de VL seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO:3-8, respectivamente; (b) SEQ ID NO:9-14, respectivamente; (c) SEQ ID NO:15-20, respectivamente; (d) SEQ ID NO:21-26, respectivamente; (e) SEQ ID NO: 3-5 y SEQ ID NO: 59, 7 y 8, respectivamente; (f) SEQ ID NO: 3, 60 y 5 y SEQ ID NO: 6-8, respectivamente; (g) SEQ ID NO: 3, 61 y 5 y SEQ ID NO: 6-8, respectivamente; (h) SEQ ID NO: 3, 60 y 5 y SEQ ID NO: 59, 7 y 8, respectivamente; y (i) SEQ ID No: 3, 61 y 5 y SEQ iD NO: 59, 7 y 8, respectivamente.
En algunas realizaciones, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionado en la presente memoria puede unirse específicamente a FOLR1, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende las secuencias de polipéptidos de CDR1-3 de VH y CDR1-3 de VL seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO:3-8, respectivamente; (b) SEQ ID NO:9-14, respectivamente; (c) SEQ ID NO:15-20, respectivamente; (d) SEQ ID NO:21-26, respectivamente; (e) SEQ ID NO: 3-5 y SeQ ID NO: 59, 7 y 8, respectivamente; (f) SEQ ID NO: 3, 60 y 5 y SEQ ID NO: 6-8, respectivamente; (g) SEQ ID NO: 3, 61 y 5 y SEQ ID NO: 6-8, respectivamente; (h) SEQ ID nO: 3, 60 y 5 y SEQ ID NO: 59, 7 y 8, respectivamente; (i) SEQ iD NO: 3, 61 y 5 y SEQ ID NO: 59, 7 y 8, respectivamente; y (j) variantes de (a) a (i) que comprenden 1, 2, 3 o 4 sustituciones conservativas de aminoácidos.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende secuencias de polipéptidos que son al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 99 % idénticas a las secuencias de polipéptidos seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO:27 y SEQ ID NO:28; (b) SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:30; (c) SEQ ID NO:31 y SEQ ID NO:32; (d) SEQ ID NO:62 y SEQ ID NO:63 o SEQ ID NO:64; (e) SEQ ID NO:65 y SEQ ID NO:66 o SEQ ID NO:67; (f) SEQ ID NO:68 y SEQ ID No :69. En algunas realizaciones, las secuencias de polipéptidos comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en los aminoácidos de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO:27 y SEQ ID NO:28; (b) SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:30; (c) SEQ ID NO:31 y SEQ ID NO:32; (d) SEQ ID NO:62 y SEQ ID NO:63 o SEQ ID NO:64; (e) SEQ ID NO:65 y SEQ ID NO:66 o SEQ ID NO:67; (f) SEQ ID NO:68 y SEQ ID NO:69.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionado en la presente memoria puede unirse específicamente a FOLR1, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una región variable de cadena pesada humanizada que comprende las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden los aminoácidos de la SEQ ID NO:51, SEQ ID nO:52 o 53, y SEQ ID NO:54, respectivamente, una región variable de cadena ligera humanizada que comprende las regiones cDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden los aminoácidos de la SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49 y SEQ ID NO:50, respectivamente, y una región constante murina. En algunas realizaciones, la región variable de cadena pesada humanizada comprende los aminoácidos de la SEQ ID NO:45, y la región variable de cadena ligera humanizada comprende los aminoácidos de la SEQ ID NO:47.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se produce mediante recombinación. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es murino, no humano, humanizado, quimérico, modificado en superficie o humano. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a FOLR1 humano, pero no a FOLR2 ni FOLR3. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo de longitud completa. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un fragmento de unión al antígeno. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende, consiste esencialmente en o consiste en un Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv de cadena simple o scFv, Fv unido por disulfuro, dominio V-NAR, IgNar, intracuerpo, IgGACH2, minicuerpo, F(ab')3, tetracuerpo, triacuerpo, diacuerpo, anticuerpo de dominio simple, DVD-Ig, Fcab, mAb2, (scFv)2 o scFv-Fc.
En algunas realizaciones, un polipéptido proporcionado en la presente memoria puede unirse específicamente a FOLR1, en donde el polipéptido comprende secuencias seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO:3-8, respectivamente; (b) Se Q ID NO:9-14, respectivamente; (c) SEQ ID NO:15-20, respectivamente; (d) SEQ ID NO:21-26, respectivamente; (e) SEQ ID NO: 3-5 y Se Q ID NO: 59, 7 y 8, respectivamente; (f) SEQ ID n O: 3, 60 y 5 y SEQ ID NO: 6-8, respectivamente; (g) SEQ ID No : 3, 61 y 5 y SEQ ID NO: 6-8, respectivamente (h) SEQ ID NO: 3, 60 y 5 y SEQ ID NO: 59, 7 y 8, respectivamente; (i) SEQ ID No : 3, 61 y 5 y SEQ iD NO: 59, 7 y 8, respectivamente; y (j) variantes de (a) a (i) que comprenden 1, 2, 3 o 4 sustituciones conservativas de aminoácidos. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende secuencias que son al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 99 % idénticas a las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO:27 y SEQ ID NO:28; (b) SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:30; (c) SEQ ID NO:31 y SEQ ID NO:32; (d) SEQ ID NO:62 y SEQ ID NO:63 o SEQ ID NO:64; (e) SEQ ID NO:65 y SEQ ID NO:66 o SEQ ID NO:67; y (f) SEQ ID NO:68 y SEQ ID NO:69. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende los aminoácidos de la (a) SEQ ID NO:27 y SEQ ID NO:28; (b) SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:30; (c) SEQ ID NO:31 y SEQ ID NO:32; (d) SEQ ID NO:62 y SEQ ID NO:63 o SEQ ID NO:64; (e) SEQ ID NO:65 y SEQ ID NO:66 o SEQ ID NO:67; o (f) SEQ ID NO:68 y SEQ ID NO:69.
En algunas realizaciones, el anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo o polipéptido se une a FOLR1 con una Kd de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10 nM. En algunas realizaciones, el anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo o polipéptido se une a un FOLR1 humano con una Kd de aproximadamente 1,0 nM, o mejor. En algunas realizaciones, la afinidad de unión se mide mediante citometría de flujo, Biacore, ELISA o radioinmunoensayo.
En algunas realizaciones, el anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo o polipéptido se une a un epítopo de FOLR1 que comprende un aminoácido que está N-glicosilado.
En algunas realizaciones, el anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo o polipéptido está marcado de manera detectable.
En algunas realizaciones, una célula proporcionada en la presente memoria produce el anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo o polipéptido. En algunas realizaciones, la célula está aislada.
También se proporcionan métodos para preparar el anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo o polipéptido. Los métodos pueden comprender (a) cultivar una célula proporcionada en la presente memoria; y (b) aislar el anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo o polipéptido de la célula cultivada.
También se proporcionan composiciones que comprenden el anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo o polipéptido. En algunas realizaciones, la composición comprende el anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo o polipéptido y un tampón seleccionado del grupo que consiste en: un tampón de FACS, un tampón de IHC y un tampón de ELISA.
También se proporcionan métodos para utilizar el anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo o polipéptido. En algunas realizaciones, un método para detectar la expresión de FOLR1 en una muestra comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, polipéptido o composición proporcionada en la presente memoria. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo está marcado de manera detectable. En algunas realizaciones, el marcaje se selecciona del grupo que consiste en marcaje inmunofluorescente, marcaje quimioluminiscente, marcaje fosforescente, marcaje enzimático, radiomarcaje, avidina/biotina, partículas de oro coloidal, partículas de color y partículas magnéticas. En algunas realizaciones, la expresión de FOLR1 se determina mediante radioinmunoensayo, ensayo de transferencia Western, citometría, ensayo de inmunofluorescencia, inmunoensayo enzimático, ensayo de inmunoprecipitación, ensayo de quimioluminiscencia, ensayo de inmunohistoquímica. En algunas realizaciones, la citometría es citometría de flujo. En algunas realizaciones, la expresión de FOLR1 se determina mediante IHC.
En algunas realizaciones, un método para aumentar la eficacia de la terapia contra el cáncer con un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende administrar el agente activo a un sujeto que tiene cáncer, en donde se ha detectado un aumento de la expresión de FOLR1 en una muestra cancerosa del sujeto mediante el uso de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, polipéptido o composición proporcionada en la presente memoria.
En algunas realizaciones, un método para identificar que un cáncer tiene probabilidad de responder a un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo comprende: (a) poner en contacto una muestra biológica que comprende células del cáncer con el anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, polipéptido o composición proporcionada en la presente memoria; (b) detectar la unión del anticuerpo, fragmento de anticuerpo o polipéptido a FOLR1 en la muestra biológica de (a); (c) asignar una puntuación a la unión de la etapa (b), donde la puntuación asignada se basa en una comparación con una o más muestras de referencia; y (d) comparar la puntuación de la etapa (c) con la puntuación de una célula o tejido de referencia, en donde una puntuación para el nivel de FOLR1 del cáncer que sea mayor que la puntuación para una muestra de referencia de expresión de FOLR1 normal o baja, o una puntuación para el nivel de FOLR1 del cáncer que sea igual o mayor que la puntuación para una muestra de referencia de expresión de FOLR1 elevada identifica que el cáncer tiene probabilidad de responder a un anticuerpo anti-FOLR1.
En algunas realizaciones, un método para tratar a un paciente que tiene cáncer comprende: (a) determinar una puntuación de expresión de FOLR1 a partir de la detección de la expresión de FOLR1 en una muestra cancerosa obtenida del paciente, en donde la detección se lleva a cabo mediante el uso de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, polipéptido o composición proporcionada en la presente memoria; y (b) administrar un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo al paciente si la puntuación indica que el paciente se beneficiaría de la administración del agente activo.
En algunas realizaciones, un método para tratar a un paciente que tiene cáncer comprende (a) determinar una puntuación de expresión de FOLR1 a partir de una detección de la expresión de FOLR1 en una muestra cancerosa obtenida del paciente, en donde la detección se lleva a cabo mediante el uso de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, polipéptido o composición proporcionada en la presente memoria; y (b) instruir a un proveedor de servicios sanitarios para administrar un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo al paciente si la puntuación indica que el paciente se beneficiaría de la administración del agente activo.
En algunas realizaciones, un método para tratar a un paciente que tiene cáncer comprende: (a) enviar una muestra cancerosa tomada de un paciente que tiene cáncer para determinar una puntuación de expresión de FOLR1 a partir de una detección de la expresión de FOLR1 mediante el uso de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, polipéptido o composición proporcionada en la presente memoria; y (b) administrar un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo al paciente si la puntuación indica que el paciente se beneficiaría de la administración del agente activo.
En algunas realizaciones, un método para tratar a un paciente que tiene cáncer comprende: (a) detectar la expresión de FOLR1 en una muestra cancerosa obtenida del paciente, en donde la detección se lleva a cabo mediante el uso de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, polipéptido o composición proporcionada en la presente memoria; (b) determinar una puntuación de expresión de FOLR1 para la muestra cancerosa; y (c) administrar un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo al paciente si la puntuación indica que el paciente se beneficiaría de la administración del agente activo.
En algunas realizaciones, un método para tratar a un paciente que tiene cáncer comprende: (a) administrar al paciente una dosis fija de un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo; (b) detectar el FOLR1 del paciente en relación con el nivel de FOLR1 en una muestra de referencia, en donde la detección se lleva a cabo mediante el uso de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, polipéptido o composición proporcionada en la presente memoria; y (c) aumentar la cantidad o frecuencia de las dosis fijas posteriores si el nivel de FOLR1 del paciente es elevado.
En algunas realizaciones, un método para optimizar un régimen terapéutico con un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo para un sujeto que tiene cáncer comprende: (a) administrar una dosis aumentada de un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo a un sujeto que tiene cáncer en donde se ha detectado un aumento en la expresión de FOLR1 en el sujeto mediante el uso de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, polipéptido o composición proporcionada en la presente memoria; o (b) administrar una dosis reducida del agente activo a un sujeto que tiene cáncer en donde se ha detectado una reducción en la expresión de FOLR1 en el sujeto.
En algunas realizaciones, un método para optimizar un régimen terapéutico con un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo para un sujeto que tiene cáncer comprende: (a) detectar el nivel de expresión de FOLR1 en una muestra cancerosa del sujeto mediante el uso de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, polipéptido o composición proporcionada en la presente memoria ; (b) determinar una puntuación de expresión de FOLR1 para la muestra cancerosa; y (c) administrar una dosis aumentada de un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo al sujeto si la puntuación es baja y administrar una dosis reducida del agente activo al sujeto si la puntuación es elevada.
En algunas realizaciones, el método para disminuir las células cancerosas que expresan FOLR1 en un paciente con cáncer comprende: (a) detectar el nivel de FOLR1 en una muestra cancerosa tomada del paciente en comparación con el nivel de FOLR1 en una muestra de referencia mediante el uso de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, polipéptido o composición proporcionada en la presente memoria; y (b) administrar al paciente una dosis fija de un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo si el nivel de FOLR1 del paciente es elevado en comparación con la muestra de referencia; en donde la administración del agente activo disminuye el número de células cancerosas que expresan FOLR1 en el paciente. En algunas realizaciones, un método para tratar el cáncer en un paciente comprende: (a) detectar el nivel de FOLR1 en una muestra cancerosa tomada del paciente en comparación con el nivel de FOLR1 en una muestra de referencia mediante el uso de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, polipéptido o composición proporcionada en la presente memoria; y (b) administrar al paciente una dosis fija de un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo si el nivel de FOLR1 del paciente es elevado en comparación con la muestra de referencia; en donde la administración del agente activo disminuye el tamaño de un tumor que expresa FOLR1 o disminuye los niveles de CA125.
En algunas realizaciones, un método para disminuir las células cancerosas que expresan FOLR1 en un paciente con cáncer comprende: (a) administrarle a un paciente que tiene cáncer una dosis fija de un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo; (b) detectar el nivel de FOLR1 del paciente en relación con el nivel de FOLR1 en una muestra de referencia mediante el uso de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, polipéptido o composición proporcionada en la presente memoria; y (c) aumentar la cantidad o frecuencia de las dosis fijas posteriores si el nivel de FOLR1 del paciente es elevado en comparación con la muestra de referencia; en donde la administración del agente activo disminuye el número de células cancerosas que expresan FOLR1 en el paciente. En algunas realizaciones, un método para tratar el cáncer en un paciente comprende: (a) administrarle a un paciente que tiene cáncer una dosis fija de un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo; (b) detectar el nivel de FOLR1 del paciente en relación con el nivel de FOLR1 en una muestra de referencia mediante el uso de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, polipéptido o composición proporcionada en la presente memoria; y (c) aumentar la cantidad o frecuencia de las dosis fijas posteriores si el nivel de FOLR1 del paciente es elevado en comparación con la muestra de referencia; en donde la administración del agente activo disminuye el tamaño de un tumor que expresa FOLR1 o disminuye los niveles de CA125.
En algunas realizaciones, un método para monitorizar la eficacia terapéutica de una dosis fija de un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo en un paciente comprende: (a) detectar un primer nivel de FOLR1 en una muestra biológica tomada de un paciente que tiene cáncer mediante el uso de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, polipéptido o composición proporcionada en la presente memoria; (b) administrarle al paciente una dosis fija de un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo; (c) detectar un segundo nivel de FOLR1 en una muestra biológica tomada del paciente después de la administración del agente activo, en donde la detección se lleva a cabo mediante el uso de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, polipéptido o composición proporcionada en la presente memoria; y (d) comparar el segundo nivel de FOLR1 con el primer nivel de FOLR1; en donde una disminución entre el primer y segundo nivel de FOLR1 indica la eficacia terapéutica.
En algunas realizaciones, un método para identificar a un sujeto que tiene un cáncer que tiene probabilidad de responder a un régimen de tratamiento anti-FOLR1 de dosis baja comprende: (a) poner en contacto una muestra biológica que comprende células del cáncer con un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, polipéptido o composición proporcionada en la presente memoria; (b) detectar la unión del anticuerpo, fragmento de unión al anticuerpo o polipéptido a la muestra biológica de (a); (c) asignar una puntuación a la unión de la etapa (b), en donde la puntuación asignada se basa en una comparación con una o más muestras de referencia; y (d) comparar la puntuación de la etapa (c) con la puntuación de una célula o tejido de referencia, en donde una puntuación para el nivel de FOLR1 de cáncer que sea mayor que la puntuación para una muestra de referencia de expresión de FOLR1 normal o baja, o una puntuación para el nivel de FOLR1 de cáncer que sea igual o mayor que la puntuación para una muestra de referencia de expresión de FOLR1 elevada identifica que el cáncer tiene probabilidad de responder a un tratamiento anti-FOLR1 de dosis baja.
En algunas realizaciones, un método para identificar un cáncer como sensible al tratamiento con un agente activo anti-FOLR1 comprende: (a) detectar el nivel de expresión de FOLR1 en una muestra cancerosa del cáncer mediante el uso de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, polipéptido o composición proporcionada en la presente memoria, en donde la detección comprende el uso de un método que distingue entre la intensidad de tinción y uniformidad de tinción en una muestra cancerosa que expresa FOLR1 en comparación con la intensidad de tinción o uniformidad de tinción en una o más muestras de referencia; (b) determinar una puntuación de intensidad de tinción o uniformidad de tinción de FOLR1 para la muestra cancerosa; y (c) comparar la puntuación de intensidad de tinción o uniformidad de tinción de FOLR1 determinada en la etapa (b) con un valor relativo determinado mediante la medición de la expresión de la proteína FOLR1 en al menos una muestra de referencia, en donde la al menos una muestra de referencia es una muestra de tejido, células o sedimento celular que no es sensible al tratamiento con un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo, y en donde una puntuación de intensidad de tinción de FOLR1 para la muestra cancerosa determinada en la etapa (b) que sea mayor que el valor relativo identifica que el cáncer es sensible al tratamiento con el agente activo.
En algunas realizaciones, un método para identificar un cáncer como sensible al tratamiento con un agente activo anti-FOLR1 comprende: (a) detectar el nivel de expresión de FOLR1 en una muestra cancerosa del cáncer mediante el uso de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, polipéptido o composición proporcionada en la presente memoria, en donde la detección comprende el uso de un método que tiñe específicamente FOLR1 de membrana en una muestra cancerosa que expresa FOLR1 en comparación con FOLR1 de membrana en una o más muestras de referencia; (b) determinar una puntuación de FOLR1 para la muestra cancerosa; y (c) comparar la puntuación de FOLR1 determinada en la etapa (b) con un valor relativo determinado mediante la medición de FOLR1 en al menos una muestra de referencia, en donde la al menos una muestra de referencia es una muestra de tejido, células o sedimento celular que no es sensible al tratamiento con un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo, y en donde una puntuación de FOLR1 para la muestra cancerosa determinada en (b) que sea mayor que el valor relativo identifica que el cáncer es sensible al tratamiento con el agente activo.
En algunas realizaciones, un método para identificar un cáncer como sensible al tratamiento con un agente activo anti-FOLR1 comprende: (a) detectar el nivel de expresión de FOLR1 en una muestra cancerosa del cáncer mediante el uso de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, polipéptido o composición proporcionada en la presente memoria, en donde la detección comprende el uso de un método que distingue entre la intensidad de tinción o uniformidad de tinción en una muestra cancerosa que expresa FOLR1 en comparación con la intensidad de tinción o uniformidad de tinción en una o más muestras de referencia; (b) determinar una puntuación de intensidad de tinción o uniformidad de tinción de FOLR1 para la muestra cancerosa; y (c) comparar la puntuación de intensidad de tinción o uniformidad de tinción de FOLR1 determinada en la etapa (b) con un valor relativo determinado mediante la medición de la expresión de la proteína FOLR1 en al menos una muestra de referencia, en donde la al menos una muestra de referencia es una muestra de tejido, células o sedimento celular que es sensible al tratamiento con un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo, y en donde una puntuación de intensidad de tinción de FOLR1 para la muestra cancerosa determinada en la etapa (b) que sea mayor o igual que el valor relativo identifica que el cáncer es sensible al tratamiento con el agente activo.
En algunas realizaciones, un método para identificar un cáncer como sensible al tratamiento con un agente activo anti-FOLR1 comprende: (a) detectar el nivel de expresión de FOLR1 en una muestra cancerosa del cáncer mediante el uso de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, polipéptido o composición proporcionada en la presente memoria, en donde la detección comprende el uso de un método tiñe específicamente FOLR1 de membrana en una muestra cancerosa que expresa FOLR1 en comparación con FOLR1 de membrana en una o más muestras de referencia; (b) determinar una puntuación de FOLR1 para la muestra cancerosa; y (c) comparar la puntuación de FOLR1 determinada en la etapa (b) con un valor relativo determinado mediante la medición de FOLR1 en al menos una muestra de referencia, en donde la al menos una muestra de referencia es una muestra de tejido, células o sedimento celular que es sensible al tratamiento con un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo, y en donde una puntuación de FOLR1 para la muestra cancerosa determinada en la etapa (b) que sea mayor o igual que el valor relativo identifica que el cáncer es sensible al tratamiento con el agente activo.
En algunas realizaciones, el método comprende además administrar un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo al sujeto del cual se obtuvo la muestra cancerosa o muestra biológica.
En algunas realizaciones, el nivel de FOLR1 del paciente se detecta en una muestra cancerosa o muestra biológica obtenida del paciente. En algunas realizaciones, la muestra cancerosa o muestra biológica es una muestra de fluido corporal, células o tejido. En algunas realizaciones, la célula es una célula tumoral circulante. En algunas realizaciones, el fluido corporal es sangre, ascitis, orina, plasma, suero o sangre periférica.
En algunas realizaciones, el FOLR1 es FOLR1 localizado en la membrana.
En algunas realizaciones, el FOLR1 es FOLR1 diseminado.
En algunas realizaciones, la detección se realiza mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).
En algunas realizaciones, la detección se realiza mediante inmunohistoquímica (IHC). En algunas realizaciones, la IHC es IHC calibrada que puede distinguir entre diferentes niveles de expresión de FOLR1. En algunas realizaciones, la IHC produce un rango de intensidad de tinción para muestras que tienen expresión baja de FOLR1 en la superficie celular, expresión intermedia de FOLR1 en la superficie celular, o expresión elevada de FOLR1 en la superficie celular. En algunas realizaciones, la IHC distingue entre intensidad de tinción y uniformidad de tinción en una muestra cancerosa o una muestra biológica que expresa FOLR1 en comparación con una muestra de referencia. En algunas realizaciones, la IHC detecta FOLR1 de membrana. En algunas realizaciones, la IHC se realiza de forma manual. En algunas realizaciones, la IHC se realiza mediante el uso de un sistema automatizado.
En algunas realizaciones, se determina una puntuación de FOLR1 a partir de la IHC.
En algunas realizaciones, una puntuación de al menos 1 indica un aumento de la expresión de FOLR1 e identifica que el cáncer tiene probabilidad de responder a un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
En algunas realizaciones, una puntuación de al menos 2, al menos 2 homo (>75 % de uniformidad) o al menos 2 hetero (25-75 % de uniformidad) identifica que el cáncer tiene probabilidad de responder a un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de pulmón o cáncer de endometrio. En algunas realizaciones, una puntuación de al menos 3, al menos 3 homo (>75 % de uniformidad) o al menos 3 hetero (25-75 % de uniformidad) identifica que el cáncer tiene probabilidad de responder a un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de pulmón, cáncer de endometrio o cáncer de ovario.
En algunas realizaciones, una puntuación H de al menos 50 identifica que un cáncer tiene probabilidad de responder a un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, una puntuación H de al menos 75 identifica un cáncer de ovario que tiene probabilidad de responder a un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, una puntuación H de al menos 50 identifica un NSCLC que tiene probabilidad de responder a un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, una puntuación H de al menos 50 identifica un cáncer de endometrio que tiene probabilidad de responder a un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En una realización, una puntuación H se determina mediante el uso de un anticuerpo FOLR1-2.1.
En algunas realizaciones, al menos un 25 % de expresión en membrana de FOLR1 en una muestra de tumor de ovario con una intensidad de al menos 3 identifica que el cáncer de ovario tiene probabilidad de responder a un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, al menos un 25 % de expresión en membrana de FOLR1 en una muestra de NSCLC con una intensidad de al menos 2 identifica que el NSCLC tiene probabilidad de responder a un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, al menos un 25 % de expresión en membrana de FOLR1 en una muestra de tumor de endometrio con una intensidad de al menos 2 identifica que el cáncer de endometrio tiene probabilidad de responder a un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En una realización, la puntuación de expresión se determina mediante el uso del anticuerpo FOLR1-2.1.
En algunas realizaciones, una puntuación de al menos 1 indica un aumento de la expresión de FOLR1 y que el paciente se beneficiará de la administración de un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, una puntuación de al menos 2, al menos 2 homo (>75 % de uniformidad) o al menos 2 hetero (25-75 % de uniformidad) indica que el paciente se beneficiará de la administración de un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de pulmón o cáncer de endometrio. En algunas realizaciones, una puntuación de al menos 3, al menos 3 homo (>75 % de uniformidad) o al menos 3 hetero (25-75 % de uniformidad) indica que el paciente se beneficiará de la administración de un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de pulmón, cáncer de endometrio o cáncer de ovario.
En algunas realizaciones, una puntuación H de al menos 50 indica que el paciente se beneficiará de la administración de un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, una puntuación H de al menos 75 indica que un paciente con cáncer de ovario se beneficiará de la administración de un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, una puntuación H de al menos 50 indica que un paciente con NSCLC se beneficiará de la administración de un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, una puntuación H de al menos 50 indica que un paciente con cáncer de endometrio se beneficiará de la administración de un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En una realización, una puntuación H se determina mediante el uso de un anticuerpo FOLR1-2.1.
En algunas realizaciones, al menos un 25 % de expresión en membrana de FOLR1 en una muestra de tumor de ovario con una intensidad de al menos 3 indica que el paciente se beneficiará de la administración de un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, al menos un 25 % de expresión en membrana de FOLR1 en una muestra de NSCLC con una intensidad de al menos 2 indica que el paciente se beneficiará de la administración de un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, al menos un 25 % de expresión en membrana de FOLR1 en una muestra de tumor de endometrio con una intensidad de al menos 2 indica que el paciente se beneficiará de la administración de un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En una realización, la puntuación de expresión se determina mediante el uso del anticuerpo FOLR1-2.1.
En algunas realizaciones, una puntuación de al menos 1 indica un aumento de la expresión de FOLR1. En algunas realizaciones, una puntuación de al menos 2, al menos 2 homo (>75 % de uniformidad) o al menos 2 hetera (25-75 % de uniformidad) indica que debería administrarse una dosis reducida del agente activo. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de pulmón o cáncer de endometrio. En algunas realizaciones, una puntuación de al menos 3, al menos 3 homo
(>75 % de uniformidad) o al menos 3 hetero (25-75 % de uniformidad) indica que debería administrarse una dosis reducida del agente activo. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de pulmón, cáncer de endometrio o cáncer de ovario.
En algunas realizaciones, una puntuación de al menos 1 indica un aumento de la expresión de FOLR1. En algunas realizaciones, una puntuación de al menos 2, al menos 2 homo (>75 % de uniformidad) o al menos 2 hetero (25-75 % de uniformidad) identifica que el cáncer tiene probabilidad de responder a un tratamiento anti-FOLR1 de dosis baja. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de pulmón o cáncer de endometrio. En algunas realizaciones, una puntuación de al menos 3, al menos 3 homo (>75 % de uniformidad) o al menos 3 hetero (25-75 % de uniformidad) identifica que el cáncer tiene probabilidad de responder a un tratamiento anti-FOLR1 de dosis baja. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de pulmón, cáncer de endometrio o cáncer de ovario.
En algunas realizaciones, una puntuación de al menos 2, al menos 2 homo (>75 % de uniformidad) o al menos 2 hetero (25-75 % de uniformidad) identifica que el cáncer es sensible al tratamiento con un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de pulmón o cáncer de endometrio. En algunas realizaciones, una puntuación de al menos 3, al menos 3 homo (>75 % de uniformidad) o al menos 3 hetero (25-75 % de uniformidad) identifica que el cáncer es sensible al tratamiento con un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de pulmón, cáncer de endometrio o cáncer de ovario.
En algunas realizaciones, una puntuación H de al menos 50 identifica que un cáncer es sensible al tratamiento con un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, una puntuación H de al menos 75 identifica que un cáncer de ovario es sensible al tratamiento con un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, una puntuación H de al menos 50 identifica que un NSCLC es sensible al tratamiento con un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, una puntuación H de al menos 50 identifica que un cáncer de endometrio es sensible al tratamiento con un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En una realización, una puntuación H se determina mediante el uso del anticuerpo FOLR1-2.1.
En algunas realizaciones, al menos un 25 % de expresión en membrana de FOLR1 en una muestra de tumor de ovario con una intensidad de al menos 3 identifica que el cáncer es sensible al tratamiento con un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, al menos un 25 % de expresión en membrana de FOLR1 en una muestra de NSCLC con una intensidad de al menos 2 identifica que el cáncer es sensible al tratamiento con un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, al menos un 25 % de expresión en membrana de FOLR1 en una muestra de tumor de endometrio con una intensidad de al menos 2 identifica que el cáncer es sensible al tratamiento con un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En una realización, la puntuación de expresión se determina mediante el uso del anticuerpo FOLR1-2.1.
En algunas realizaciones, la muestra de referencia es una muestra de referencia positiva o una muestra de referencia negativa. En algunas realizaciones, la muestra de referencia comprende células, sedimentos celulares o tejido.
En algunas realizaciones, el anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo o polipéptido comprende además un reactivo de detección que se selecciona del grupo que consiste en: una enzima, un fluoróforo, un marcaje radioactivo, y un luminóforo. En algunas realizaciones, el reactivo de detección se selecciona del grupo que consiste en: biotina, digoxigenina, fluoresceína, tritio, y rodamina.
En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer FOLR1 positivo. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de ovario, cerebral, de mama, uterino, de endometrio, pancreático, renal y de pulmón. En algunas realizaciones, el cáncer de pulmón es cáncer de pulmón de células no pequeñas o carcinoma bronquioalveolar. En algunas realizaciones, el cáncer de ovario es cáncer de ovario epitelial. En algunas realizaciones, el cáncer de ovario es resistente a platino, recidivante o refractario.
En algunas realizaciones, la expresión de FOLR1 se detecta mediante el uso de al menos un anticuerpo anti-FOLR1 adicional o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, la expresión de FOLR1 se mide mediante el uso de dos anticuerpos anti-FOLR1 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. En algunas realizaciones, al menos un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a un soporte sólido. En algunas realizaciones, al menos un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a una placa de microtitulación.
En algunas realizaciones, al menos un anticuerpo adicional o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un agente de detección. En algunas realizaciones, el agente de detección es un agente de detección cromogénico, un agente de detección fluorogénico, un agente de detección enzimático o un agente de detección electroquimioluminiscente. En algunas realizaciones, el agente de detección es peroxidasa de rábano picante (HRP). En algunas realizaciones, el análisis ELISA es un ELISA en sándwich.
En algunas realizaciones, el agente activo comprende el anticuerpo de FOLR1huMov19. En algunas realizaciones, el agente activo es un conjugado de anticuerpo y maitansinoide que comprende el anticuerpo de FOLR1 huMov19 (que comprende una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO:45 y una región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO:47), el maitansinoide DM4 y el enlazador escindible sulfo-SPDB (IMGN853).
En algunas realizaciones, un método para identificar que un cáncer tiene probabilidad de responder al tratamiento con un conjugado de anticuerpo y maitansinoide que comprende el anticuerpo de FOLR1 huMov19, el maitansinoide DM4 y un enlazador sulfo-SPDB (IMGN853), comprende medir FOLR1 mediante el uso de un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende los aminoácidos de la SEQ ID NO:27 y una cadena ligera que comprende los aminoácidos de la SEQ ID NO:28 en un ensayo de IHC, en donde una puntuación de al menos 2 hetero indica que el cáncer tiene probabilidad de responder al tratamiento.
En algunas realizaciones, un método para identificar que un cáncer tiene probabilidad de responder al tratamiento con un conjugado de anticuerpo y maitansinoide que comprende el anticuerpo de FOLR1 huMov19, el maitansinoide DM4 y un enlazador sulfo-SPDB (IMGN853), comprende medir FOLR1 mediante el uso de un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende los aminoácidos de la SEQ ID NO:27 y una cadena ligera que comprende los aminoácidos de la SEQ ID NO:28 en un ensayo de IHC, en donde una puntuación de al menos 1 indica que el cáncer tiene probabilidad de responder al tratamiento.
En algunas realizaciones, un artículo de fabricación proporcionado en la presente memoria comprende un agente terapéutico activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en la presente memoria, un recipiente y un prospecto o etiqueta que indica que el agente activo puede usarse para tratar un cáncer caracterizado por el aumento de la expresión de FOLR1. En algunas realizaciones, un artículo de fabricación proporcionado en la presente memoria comprende un agente terapéutico activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en la presente memoria, un recipiente y un prospecto o etiqueta que indica que el agente activo puede usarse para tratar un cáncer caracterizado por la expresión de FOLR1 a un nivel de 2 o 3 medido mediante el uso de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, polipéptido o composición proporcionada en la presente memoria. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-FOLR1 del agente activo está conjugado con una citotoxina. En algunas realizaciones, el prospecto o etiqueta indica que el agente activo puede usarse para tratar un cáncer caracterizado por la expresión de FOLR1 a un nivel de al menos 1. En algunas realizaciones, el prospecto o etiqueta indica que el agente activo puede usarse para tratar un cáncer caracterizado por la expresión de FOLR1 a un nivel de al menos 2, al menos 2 homo (>75 % de uniformidad) o al menos 2 hetero (25-75 % de uniformidad). En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de pulmón o cáncer de endometrio. En algunas realizaciones, el prospecto o etiqueta indica que el agente activo puede usarse para tratar un cáncer caracterizado por la expresión de FOLR1 a un nivel de al menos 3, al menos 3 homo (>75 % de uniformidad) o al menos 3 hetero (25-75 % de uniformidad). En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de pulmón, cáncer de endometrio o cáncer de ovario.
En algunas realizaciones, una combinación de kit de diagnóstico y farmacéutico proporcionada en la presente memoria comprende un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, polipéptido o composición proporcionada en la presente memoria para su uso en diagnóstico y un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en terapia. En algunas realizaciones, el anticuerpo de detección es capaz de detectar la expresión de FOLR1 mediante IHC. En algunas realizaciones, el anticuerpo de detección es capaz de detectar la expresión de FOLR1 mediante ELISA. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-FOLR1 en el agente activo está conjugado con una citotoxina.
En algunas realizaciones, un kit de diagnóstico proporcionado en la presente memoria comprende un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo o polipéptido proporcionado en la presente memoria, un reactivo para inmunohistoquímica (IHC) y una o más muestras de referencia estandarizadas, en donde las muestras de referencia estandarizadas comprenden muestras de células, sedimentos celulares o de tejido fijadas con formalina embebidas en parafina, y en donde la una o más muestras de referencia estandarizadas son de células, sedimentos celulares o tejidos que no expresan FOLR1, con expresión baja de FOLR1 o expresión elevada de FOLR1.
En algunas realizaciones, un kit de inmunoensayo para detectar FOLR1 diseminado en una muestra comprende: (a) un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, polipéptido o composición proporcionada en la presente y (b) un reactivo de detección. En algunas realizaciones, el kit comprende además un soporte sólido para el reactivo de captura. En algunas realizaciones, el reactivo de captura se inmoviliza sobre el soporte sólido. En algunas realizaciones, se coloca una capa del reactivo de captura en una placa de microtitulación. En algunas realizaciones, el reactivo de detección es un segundo anticuerpo de FOLR1. En algunas realizaciones, el reactivo de detección se detecta mediante el uso de un anticuerpo específico de la especie. En algunas realizaciones, el kit comprende además un medio de detección para el reactivo de detección. En algunas realizaciones, el medio de detección es colorimétrico. En algunas realizaciones, el kit comprende además un polipéptido FOLR1 como un estándar de antígeno. En algunas realizaciones, el polipéptido FOLR1 es FOLR1-Fc.
En la presente memoria también se proporcionan agentes activos. En algunas realizaciones, un agente activo comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en un método para tratar el cáncer, en donde dicho agente activo se administra a un sujeto que tiene cáncer, en donde se ha detectado un aumento de la expresión de FOLR1 en una muestra cancerosa obtenida de dicho sujeto mediante el uso de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, polipéptido o composición proporcionada en la presente memoria.
En algunas realizaciones, un agente activo comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en un método para tratar el cáncer que comprende: (a) determinar una puntuación de expresión de FOLR1 a partir de una detección de la expresión de FOLR1 en una muestra cancerosa obtenida del paciente, en donde la detección se lleva a cabo mediante el uso de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, polipéptido o composición proporcionada en la presente memoria; y (b) administrar un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo al paciente si la puntuación indica que el paciente se beneficiaría de la administración del agente activo.
En algunas realizaciones, un agente activo comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en un método para tratar el cáncer que comprende: (a) determinar una puntuación de expresión de FOLR1 a partir de una detección de la expresión de FOLR1 en una muestra cancerosa obtenida del paciente, en donde la detección se lleva a cabo mediante el uso de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, polipéptido o composición proporcionada en la presente memoria; y (b) instruir a un proveedor de servicios sanitarios para administrar un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo al paciente si la puntuación indica que el paciente se beneficiaría de la administración del agente activo.
En algunas realizaciones, un agente activo comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en un método para tratar el cáncer que comprende: (a) enviar una muestra cancerosa obtenida de un paciente que tiene cáncer para determinar una puntuación de expresión de FOLR1 a partir de una detección de la expresión de FOLR1 mediante el uso del anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, polipéptido o composición proporcionada en la presente memoria; y (b) administrar un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo al paciente si la puntuación indica que el paciente se beneficiaría de la administración del agente activo.
En algunas realizaciones, un agente activo comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en un método para tratar el cáncer que comprende: (a) detectar la expresión de FOLR1 en una muestra cancerosa obtenida de dicho paciente, en donde la detección se lleva a cabo mediante el uso del anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, polipéptido o composición proporcionada en la presente memoria; (b) determinar una puntuación de expresión de FOLR1 para dicha muestra cancerosa; y (c) administrar un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo al paciente si la puntuación indica que el paciente se beneficiaría de la administración del agente activo.
En algunas realizaciones, un agente activo comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en un método para tratar el cáncer que comprende: (a) administrar a un paciente una dosis fija de un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo; (b) detectar el nivel de expresión de FOLR1 en una muestra cancerosa obtenida del paciente en relación con el nivel de FOLR1 en una muestra de referencia, en donde la detección se realiza mediante el uso de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, polipéptido o composición proporcionada en la presente memoria; y (c) aumentar la cantidad o frecuencia de dosis fijas posteriores si el nivel de FOLR1 del paciente es elevado.
En algunas realizaciones, un agente activo comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en un método para tratar el cáncer que comprende la etapa de optimizar el régimen terapéutico de dicho agente activo que comprende: (a) administrar una dosis aumentada de un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo a un sujeto que tiene cáncer en donde se ha detectado un aumento en la expresión de FOLR1 en una muestra cancerosa de dicho sujeto mediante el uso del anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, polipéptido o composición proporcionada en la presente memoria; o (b) administrar una dosis reducida del agente activo a un sujeto que tiene cáncer en donde se ha detectado una reducción en la expresión de FOLR1 en una muestra cancerosa de dicho sujeto.
En algunas realizaciones, un agente activo comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en un método para tratar el cáncer que comprende la etapa de optimizar el régimen terapéutico de dicho agente activo que comprende: (a) detectar el nivel de expresión de FOLR1 en una muestra cancerosa de dicho sujeto mediante el uso de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, polipéptido o composición proporcionada en la presente memoria; (b) determinar una puntuación de expresión de FOLR1 para dicha muestra cancerosa; y (c) administrar una dosis aumentada de un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo al sujeto si la puntuación es baja o administrar una dosis reducida del agente activo al sujeto si la puntuación es elevada.
En algunas realizaciones, un agente activo comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en un método para tratar el cáncer, en donde se reducen las células cancerosas que expresan FOLR1 en un paciente con cáncer, en donde: (a) se detecta el nivel de FOLR1 en una muestra cancerosa obtenida del paciente mediante la comparación con el nivel de FOLR1 en una muestra de referencia mediante el uso de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, polipéptido o composición proporcionada en la presente memoria; y (b) se administra al paciente una dosis fija del agente activo si el nivel de FOLR1 del paciente es elevado; en donde la administración del agente activo disminuye el número de células cancerosas que expresan FOLR1 en el paciente.
En algunas realizaciones, un agente activo comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en un método para tratar el cáncer, en donde se reducen las células cancerosas que expresan FOLR1 en un paciente con cáncer, en donde: (a) se administra a un paciente que tiene cáncer una dosis fija del agente activo; (b) se detecta el nivel de FOLR1 en una muestra cancerosa obtenida del paciente en relación con el nivel de FOLR1 en una muestra de referencia mediante el uso de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, polipéptido o composición proporcionada en la presente memoria; y (c) se aumenta la cantidad o frecuencia de las dosis fijas posteriores si el nivel de FOLR1 del paciente es elevado en comparación con la muestra de referencia; en donde la administración del agente activo disminuye el número de células cancerosas que expresan FOLR1 en el paciente.
En la presente memoria también se proporcionan anticuerpos anti-FOLR1 y fragmentos de unión a antígeno de los mismos para su uso en métodos de monitorización y métodos de diagnóstico. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en un método para monitorizar la eficacia terapéutica de una dosis fija del agente activo en un paciente comprende: (a) detectar un primer nivel de FOLR1 en una muestra biológica tomada de un paciente que tiene cáncer mediante el uso de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, polipéptido o composición proporcionada en la presente memoria; (b) administrar al paciente una dosis fija del agente activo; (c) detectar un segundo nivel de FOLR1 en una muestra biológica tomada del paciente después de la administración del agente activo, en donde la detección se lleva a cabo mediante el uso de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, polipéptido o composición proporcionada en la presente memoria; y (d) comparar el segundo nivel de FOLR1 con el primer nivel de FOLR1; en donde una disminución entre el primer y segundo nivel de FOLR1 indica la eficacia terapéutica.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en un método para diagnosticar si un sujeto que tiene cáncer tiene probabilidad de responder a un régimen de tratamiento anti-FOLR1 de dosis baja comprende: (a) poner en contacto una muestra biológica que comprende células de dicho cáncer con un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, polipéptido o composición proporcionada en la presente memoria; (b) detectar la unión de dicho anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o polipéptido a dicha muestra biológica de (a); (c) asignar una puntuación a dicha unión de la etapa (b), en donde dicha puntuación se asigna en base a una comparación con una o más muestras de referencia; y (d) comparar dicha puntuación de la etapa (c) con la puntuación de una célula o tejido de referencia, en donde una puntuación para dicho nivel de FOLR1 de cáncer que sea mayor que la puntuación para una muestra de referencia de expresión de FOLR1 normal o baja, o una puntuación para dicho nivel de FOLR1 de cáncer que sea igual o mayor que la puntuación para una muestra de referencia de expresión de FOLR1 elevada identifica que dicho cáncer tiene probabilidad de responder a una dosis baja de un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en un método para diagnosticar si un cáncer es sensible al tratamiento con un tratamiento anti-FOLR1 comprende: (a) detectar el nivel de expresión de FOLR1 en una muestra cancerosa de dicho cáncer mediante el uso de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, polipéptido o composición proporcionada en la presente memoria, en donde dicha detección comprende el uso de un método que distingue entre la intensidad de tinción o uniformidad de tinción en una muestra cancerosa que expresa FOLR1 en comparación con la intensidad de tinción o uniformidad de tinción en una o más muestras de referencia; (b) determinar una puntuación de intensidad de tinción o uniformidad de tinción de FOLR1 para dicha muestra cancerosa; y (c) comparar la puntuación de intensidad de tinción o uniformidad de tinción de FOLR1 determinada en la etapa (b) con un valor relativo determinado mediante la medición de la expresión de la proteína FOLR1 en al menos una muestra de referencia, en donde dicha al menos una muestra de referencia es una muestra de tejido, células o sedimento celular que no es sensible al tratamiento con un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo, y en donde una puntuación de intensidad de tinción de FOLR1 para dicha muestra cancerosa determinada en la etapa (b) que sea mayor que dicho valor relativo identifica que dicho cáncer es sensible al tratamiento con el agente activo.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en un método para diagnosticar si un cáncer es sensible al tratamiento con un tratamiento anti-FOLR1 comprende: (a) detectar el nivel de expresión de FOLR1 en una muestra cancerosa de dicho cáncer mediante el uso de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, polipéptido o composición proporcionada en la presente memoria, en donde dicha detección comprende el uso de un método que distingue entre la intensidad de tinción o uniformidad de tinción en una muestra cancerosa que expresa FOLR1 en comparación con la intensidad de tinción o uniformidad de tinción en una o más muestras de referencia; (b) determinar una puntuación de intensidad de tinción o uniformidad de tinción de FOLR1 para dicha muestra cancerosa; y (c) comparar la puntuación de intensidad de tinción o uniformidad de tinción de FOLR1 determinada en la etapa (b) con un valor relativo determinado mediante la medición de la expresión de la proteína FOLR1 en al menos una muestra de referencia, en donde dicha al menos una muestra de referencia es una muestra de tejido, células o sedimento celular que es sensible al tratamiento con un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo, y en donde una puntuación de intensidad de tinción de FOLR1 para dicha muestra cancerosa determinada en la etapa (b) que sea mayor que dicho valor relativo identifica que dicho cáncer es sensible al tratamiento con el agente activo.
En algunas realizaciones, el uso de los agentes activos o anticuerpos anti-FOLR1 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprende además administrar un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de antígeno de este al sujeto del cual se obtuvo la muestra cancerosa o muestra biológica.
En algunas realizaciones, la muestra cancerosa o muestra biológica es una muestra de fluido corporal, células o tejido. En algunas realizaciones, la célula es una célula tumoral circulante. En algunas realizaciones, el fluido corporal es sangre, ascitis, orina, plasma, suero o sangre periférica.
En algunas realizaciones de los agentes activos o anticuerpos anti-FOLR1 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, la detección se realiza mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y/o mediante inmunohistoquímica (IHC). En algunas realizaciones, la IHC es IHC calibrada que puede distinguir diferentes niveles de expresión de FOLR1. En algunas realizaciones, la IHC produce un rango de intensidad de tinción para muestras que tienen expresión baja de FOLR1 en la superficie celular, expresión intermedia de FOLR1 en la superficie celular, o expresión elevada de FOLR1 en la superficie celular. En algunas realizaciones, la IHC distingue entre intensidad de tinción y uniformidad de tinción en una muestra cancerosa o una muestra biológica que expresa FOLR1 en comparación con una muestra de referencia. En algunas realizaciones, la IHC se realiza de forma manual. En algunas realizaciones, la IHC se realiza mediante el uso de un sistema automatizado. En algunas realizaciones, se determina una puntuación de FOLR1 a partir de la IHC. En algunas realizaciones, la IHC con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno descrito en la presente memoria produce un rango de tinción de las células que tienen aumento de la expresión de FOLR1, particularmente las que están dentro del nivel de tinción igual o mayor a 2.
En algunas realizaciones, una puntuación de al menos 2 indica que el paciente se beneficiará de la administración de un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, una puntuación de al menos 2 homo (>75 % de uniformidad) o al menos 2 hetero (25-75 % de uniformidad) indica que el paciente se beneficiará de la administración de un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de pulmón o cáncer de endometrio.
En algunas realizaciones, una puntuación de al menos 3 indica que el paciente se beneficiará de la administración de un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, una puntuación de al menos 3 homo (>75 % de uniformidad) o al menos 3 hetero (25-75 % de uniformidad) indica que el paciente se beneficiará de la administración de un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de pulmón, cáncer de endometrio o cáncer de ovario.
En algunas realizaciones, una puntuación de al menos 2 indica que el paciente se beneficiará de la administración de un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, una puntuación de al menos 2 homo (>75 % de uniformidad) o al menos 2 hetero (25-75 % de uniformidad) indica que el paciente se beneficiará de la administración de un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de pulmón, cáncer de endometrio o cáncer de ovario.
En algunas realizaciones, una puntuación de al menos 2 indica que debería administrarse una dosis reducida del agente activo. En algunas realizaciones, una puntuación de al menos 2 homo (>75 % de uniformidad) o al menos 2 hetero (25-75 % de uniformidad) indica que debería administrarse una dosis reducida del agente activo. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de pulmón, cáncer de endometrio o cáncer de ovario.
En algunas realizaciones, una puntuación de al menos 2 identifica que el cáncer tiene probabilidad de responder a un tratamiento anti-FOLR1 de dosis baja. En algunas realizaciones, una puntuación de al menos 2 homo (>75 % de uniformidad) o 2 hetero (25-75 % de uniformidad) identifica que el cáncer tiene probabilidad de responder a un tratamiento anti-FOLR1 de dosis baja. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de pulmón o cáncer de endometrio.
En algunas realizaciones, una puntuación de al menos 3 identifica que el cáncer tiene probabilidad de responder a un tratamiento anti-FOLR1 de dosis baja. En algunas realizaciones, una puntuación de al menos 3 homo (>75 % de uniformidad) o al menos 3 hetero (25-75 % de uniformidad) identifica que el cáncer tiene probabilidad de responder a un tratamiento anti-FOLR1 de dosis baja. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de pulmón, cáncer de endometrio o cáncer de ovario.
En algunas realizaciones, una puntuación de al menos 2 identifica que el cáncer tiene probabilidad de responder a un tratamiento anti-FOLR1 de dosis baja. En algunas realizaciones, una puntuación de al menos 2 homo (>75 % de uniformidad) o al menos 2 hetero (25-75 % de uniformidad) identifica que el cáncer tiene probabilidad de responder a un tratamiento anti-FOLR1 de dosis baja. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de pulmón, cáncer de endometrio o cáncer de ovario.
En algunas realizaciones, una puntuación de al menos 2 identifica que el cáncer es sensible al tratamiento con un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, una puntuación de al menos 2 homo (>75 % de uniformidad) o al menos 2 hetero (25-75 % de uniformidad) identifica que el cáncer es sensible al tratamiento con un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de pulmón o cáncer de endometrio.
En algunas realizaciones, una puntuación de al menos 3 identifica que el cáncer es sensible al tratamiento con un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, una puntuación de al menos 3 homo (>75 % de uniformidad) o al menos 3 hetero (25-75 % de uniformidad) identifica que el cáncer es sensible al tratamiento con un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de pulmón, cáncer de endometrio o cáncer de ovario.
En algunas realizaciones, una puntuación de al menos 2 identifica que el cáncer es sensible al tratamiento con un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, una puntuación de al menos 2 homo (>75 % de uniformidad) o al menos 2 hetero (25-75 % de uniformidad) identifica que el cáncer es sensible al tratamiento con un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de pulmón, cáncer de endometrio o cáncer de ovario.
En algunas realizaciones, una muestra de referencia es una muestra de referencia positiva o una muestra de referencia negativa. En algunas realizaciones, la muestra de referencia comprende células, sedimentos celulares o tejido.
En algunas realizaciones del agente activo o anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo para un uso proporcionado en la presente memoria, el anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o polipéptido proporcionado en la presente memoria comprende además un reactivo de selección que se selecciona del grupo que consiste en: una enzima, un fluoróforo, un marcaje radioactivo y un luminóforo. En algunas realizaciones, el reactivo de detección se selecciona del grupo que consiste en: biotina, digoxigenina, fluoresceína, tritio, y rodamina.
En algunas realizaciones del agente activo o anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo para un uso proporcionado en la presente memoria, el cáncer es un cáncer FOLR1 positivo. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de ovario, cerebral, de mama, uterino, de endometrio, pancreático, renal y de pulmón. En algunas realizaciones, el cáncer de pulmón es cáncer de pulmón de células no pequeñas o carcinoma bronquioalveolar. En algunas realizaciones, el cáncer de ovario es cáncer de ovario epitelial. En algunas realizaciones, el cáncer es resistente a platino, recidivante o refractario.
En algunas realizaciones del agente activo o anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo para un uso proporcionado en la presente memoria, la expresión de FOLR1 se detecta mediante el uso de al menos un anticuerpo anti-FOLR1 adicional o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, la expresión de FOLR1 se mide mediante el uso de dos anticuerpos anti-FOLR1 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. En algunas realizaciones, al menos un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a un soporte sólido. En algunas realizaciones, al menos un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a una placa de microtitulación. En algunas realizaciones, al menos un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un agente de detección. En algunas realizaciones, el agente de detección es un agente de detección cromogénico, un agente de detección fluorogénico, un agente de detección enzimático o un agente de detección electroquimioluminiscente. En algunas realizaciones, el agente de detección es peroxidasa de rábano picante (HRP). En algunas realizaciones, el ELISA es un ELISA en sándwich.
En algunas realizaciones del agente activo o anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo para un uso proporcionado en la presente memoria, el agente activo comprende el anticuerpo de FOLR1 huMov19 o es el anticuerpo de FOLR1 huMov19. En algunas realizaciones, el agente activo se administra como un conjugado de anticuerpo y maitansinoide que comprende adicionalmente el maitansinoide DM4 y el enlazador sulfo-SPDB escindible (IMGN853).
En algunas realizaciones, un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, polipéptido o composición proporcionada en la presente memoria se utiliza como diagnóstico.
En algunas realizaciones, un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, polipéptido o composición proporcionada en la presente memoria se utiliza en un método para diagnosticar el cáncer en un paciente que lo padece. En algunas realizaciones, el cáncer se asocia con niveles de FOLR1 elevados.
En algunas realizaciones, la afinidad de unión de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o polipéptido es una afinidad de unión obtenida en el Ejemplo 3 y/o que se muestra en la Figura 4, 5 y/o 6.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 proporciona imágenes de tinción IHC de muestras de NSCLC y adenocarcinoma endometrioide de ovario mediante el uso de los anticuerpos 353.2-1 y 353.9-20.
La Figura 2 proporciona imágenes de tinción IHC de muestras normales de glándula salivar y páncreas mediante el uso de los anticuerpos 353.2-1 y 353.9-20.
La Figura 3 proporciona imágenes de transferencias Western de lisados celulares mediante el uso de los anticuerpos 353.9-21, 353.2-1, 353.3-8 y 353.5-7.
La Figura 4 muestra la unión de los anticuerpos 353.2-1, 353.3-1, 353.5-7 y 353.9-21 a células KB desnaturalizadas (A) y células T47D no desnaturalizadas (B) mediante el uso de un clasificador de células activado por fluorescencia (FACS).
La Figura 5 muestra la unión de los anticuerpos 353.2-1, 353.3-1, 353.5-7 y 353.9-21 a FOLR1 humano recombinante mediante el uso de ELISA.
La Figura 6 muestra la unión de un anticuerpo anti-FOLR2 y los anticuerpos 353.2-1, 353.3-1, 353.5-7 y 353.9-21 a FOLR2 (A) y la unión de un anticuerpo anti-FOLR3 y los anticuerpos 353.2-1, 353.3-1, 353.5-7 y 353.9-21 a FOLR3 (B) mediante ELISA.
La Figura 7 muestra la unión de los anticuerpos anti-FOLR1 2.1 y huMov19 a FOLR1 humano recombinante no tratado y desglicosilado mediante ELISA.
La Figura 8 muestra la unión de los anticuerpos anti-FOLR1 2.1, huMov19 y BN3.2 a lisados desglicosilados y no tratados de células KB e Igrov-1 mediante análisis de transferencia Western.
La Figura 9 muestra los aminoácidos relevantes para la modificación en superficie del anticuerpo anti-FOLR1 FRIHC2-1 y la posición de kabat correspondiente a cada residuo.
La Figura 10 muestra la alineación de secuencias de anticuerpo FRIHC2-1 murino y humanizado para la modificación en superficie. Las secuencias de cadena pesada y ligera murina corresponden a las SEQ ID NO:27 y SEQ ID NO:28, respectivamente. La secuencia de cadena pesada humanizada modificada en superficie corresponde a la SEQ ID NO: 62 y las secuencias de la versión 1.0 y la versión 1.1 de cadena ligera humana modificada en superficie corresponden a las SEQ ID NO:63 y SEQ ID NO:64, respectivamente. El líder “S” en la secuencia de cadena ligera (posición de marco -1) no se considera para la humanización y no se utiliza en la secuencia de anticuerpo humanizada, así que no se muestra en la figura.
La Figura 11 muestra los aminoácidos relevantes para el injerto de CDR del anticuerpo anti-FOLR1 FRIHC2-1 y la posición de kabat correspondiente a cada residuo.
La Figura 12 muestra la alineación de secuencias de FRIHC2-1 murino y humanizado para el injerto de CDR. Las secuencias de cadena pesada y ligera murina corresponden a las SEQ ID NO:27 y SEQ ID NO:28, respectivamente. La secuencia de cadena pesada humanizada injertada corresponde a la SEQ ID NO: 65 y las secuencias de la versión 1.0 y la versión 1.1 de cadena ligera humana injertadas corresponden a las SEQ ID NO:66 y SEQ ID NO:67, respectivamente. El líder “S” en la secuencia de cadena ligera (posición de marco -1) no se considera para la humanización y no se utiliza en la secuencia de anticuerpo humanizada, así que no se muestra en la figura.
La Figura 13 proporciona imágenes de tinción de IHC de tejidos de adenocarcinoma de pulmón mediante el uso del anticuerpo FOLR1-2.1 (353-2.1) con diversas diluciones.
La Figura 14 proporciona imágenes de tinción de IHC de tejido normal positivo (trompa de falopio) (A) y células (células transfectadas con FOLR1 (B)) y células negativas (células no transfectadas (C)) mediante el uso del anticuerpo FOLR1-2.1 (353-2.1).
La Figura 15 proporciona imágenes de tinción de IHC de muestras de tejido de cáncer de ovario (A) y tejido de adenocarcinoma de pulmón (B) mediante el uso del anticuerpo FOLR1-2.1 (353-2.1).
La Figura 16 muestra la tinción de membrana de células tumorales en una muestra de cáncer de endometrio con el ensayo de FOLR1-2.1. Las células estromales no se tiñen.
La Figura 17 muestra una comparación de la diferencia de tinción y puntuación entre (A) el ensayo de FOLR1-2.1 y (B) el ensayo de BN3.2.
Descripción detallada de la invención
La presente descripción proporciona métodos para detectar el receptor 1 de folato humano (FOLR1), incluyendo FOLR1 de membrana, FOLR1 diseminado y FOLR1 en células tumorales circulantes, y mejorar la eficacia o la probabilidad de respuesta al tratamiento de cánceres caracterizados por la sobreexpresión de FOLR1. Los métodos de detección pueden detectar un rango dinámico clínicamente relevante de FOLR1 y, por lo tanto, pueden usarse para la estratificación de pacientes, para monitorizar o determinar la eficacia terapéutica o la probabilidad de respuesta al tratamiento de cánceres caracterizados por la sobreexpresión de FOLR1. También se describen polipéptidos de unión a FOLR1 novedosos, tales como anticuerpos, los cuales son útiles en los métodos de detección de FOLR1 (p. ej., IHC para FOLR1 asociado a células y unido a la membrana). También se proporcionan polipéptidos y polinucleótidos relacionados, composiciones que comprenden los agentes de unión a FOLR1 y métodos para preparar los agentes de unión a FOLR1.
I. Definiciones
Para facilitar el entendimiento de la presente invención, se definen a continuación varios términos y expresiones.
Los términos “receptor 1 de folato humano”, “FOLR1” o “receptor de folato alfa (FR-a)”, tal y como se usan en la presente memoria, se refieren a cualquier FOLR1 humano nativo, a menos que se indique lo contrario. Por lo tanto, todos estos términos se pueden referir ya sea a una secuencia de ácido nucleico o proteína tal como se indica en la presente memoria. El término “FOLR1” engloba FOLR1 “de longitud completa” no procesado, así como también cualquier forma de FOLR1 que resulte del procesamiento dentro de la célula. El término también engloba las variantes de origen natural de ácido nucleico o proteína de FOLR1, p. ej., variantes de corte y empalme, variantes alélicas e isoformas. Los polipéptidos y polinucleótidos de FOLR1 descritos en la presente memoria pueden aislarse de una variedad de fuentes, tal como de tipos de tejido humano o de otra fuente, o prepararse mediante métodos recombinantes o sintéticos. Los ejemplos de secuencias de FOLR1 incluyen, pero no están limitadas a, los números de referencia de NCBI P15328, NP_001092242.1, AAX29268.1, AAX37119.1, NP_057937.1 y NP_057936.1.
Los términos "antígeno diseminado" y "FOLR1 diseminado" se usan de manera intercambiable en la presente memoria. Estos términos se refieren a una proteína FOLR1 que es soluble y que no está asociada a la célula. En algunas realizaciones, incluye el dominio extracelular (ECD) y el enlazador de glicosilfosfatidilinositol (GPI). En una realización, el FOLR1 diseminado incluye solo el ECD. La proteína FOLR1 incluye un péptido de señal (aminoácidos 1-24), la cadena de proteína FOLR1 (aminoácidos 25-233 o 234) y un propéptido que se puede escindir (aminoácidos 235 a 257). La proteína madura FOLR1 carece del péptido de señal. El FOLR1 diseminado puede incluir los aminoácidos 1 a 257, 1 a 233, 1 a 234, 25 a 233, 25 a 234 o cualesquiera otros fragmentos de los mismos. En algunas realizaciones, la secuencia señal está escindida. En otras realizaciones, la parte de GPI y de ECD puede estar embebida en una membrana (p. ej., una balsa lipídica soluble). En una realización, el FOLR1 diseminado puede incluir los aminoácidos 1-233 o un fragmento de los mismos.
El término "anticuerpo" significa una molécula de inmunoglobulina que reconoce y se une específicamente a una diana, tal como una proteína, polipéptido, péptido, carbohidrato, polinucleótido, lípido o combinaciones de los anteriores, a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígeno dentro de la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Tal y como se usa en la presente memoria, el término “anticuerpo” engloba anticuerpos policlonales intactos, anticuerpos monoclonales intactos, fragmentos de anticuerpo (tales como fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv), mutantes de Fv monocatenarios (scFv), anticuerpos multiespecíficos tales como anticuerpos biespecíficos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, proteínas de fusión que comprenden una parte de determinación del antígeno de un anticuerpo, y cualquier otra molécula de inmunoglobulina modificada que comprende un sitio de reconocimiento del antígeno siempre que los anticuerpos presenten la actividad biológica deseada. Un anticuerpo puede pertenecer a cualquiera de las cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, o subclases (isotipos) de las mismas (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) de acuerdo a la identidad de sus dominios constantes de cadena pesada a los que se hace referencia como alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente. Las diferentes clases de inmunoglobulinas tienen estructuras de subunidades y configuraciones tridimensionales diferentes y muy conocidas. Los anticuerpos pueden estar desnudos o conjugados con otras moléculas, tales como toxinas, radioisótopos, etc.
En algunas realizaciones, un anticuerpo es un anticuerpo de origen no natural. En algunas realizaciones, se purifica un anticuerpo a partir de componentes naturales. En algunas realizaciones, un anticuerpo se produce de forma recombinante. En algunas realizaciones, un anticuerpo se produce mediante un hibridoma.
Un anticuerpo “bloqueador” o un anticuerpo “antagonista” es uno que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno al que se une, tal como FOLR1. En una realización determinada, los anticuerpos bloqueadores o antagonistas inhiben sustancial o completamente la actividad biológica del antígeno. De manera deseable, la actividad biológica se reduce en un 10 %, 20 %, 30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o incluso un 100 %.
El término “anticuerpo anti-FOLR1” o “un anticuerpo que se une a FOLR1” se refiere a un anticuerpo que es capaz de unirse a FOLR1 con suficiente afinidad, de modo que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico al dirigirse a FOLR1. A menos que se especifique lo contrario, el alcance de la unión de un anticuerpo anti-FOLR1 a una proteína distinta a FOLR1 no relacionada es menor que aproximadamente el 10 % de la unión del anticuerpo a FOLR1 tal como se mide, p. ej., mediante un radioinmunoensayo (RIA). En determinadas realizaciones, el anticuerpo que se une a FOLR1 tiene una constante de disociación (Kd) de <1 pM, <100 nM, <10 nM, <1 nM o <0,1 nM. En una realización, el anticuerpo anti-FOLR1 no se une a FOLR2, FOLR3, FOLR4, o al ácido fólico. Los ejemplos de anticuerpos de FOLR1 son conocidos en la técnica y se describen en las Solicitudes Publicadas de EE. Uu. No.
2012/0009181 y 2012/0282175, y las Solicitudes Provisionales de EE. UU. No. 61/695.791 y 61/756,254, y en la Publicación PCT WO2011/106528, cada una de las cuales se incorpora en la presente memoria por referencia. Las secuencias de anticuerpos anti-FOLR1 y fragmentos de unión a antígeno de los mismos se proporcionan en las Tablas 1-8.
El término “fragmento de anticuerpo” se refiere a una parte de un anticuerpo intacto y se refiere a las regiones variables determinantes antigénicas de un anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no están limitados a, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, anticuerpos lineales, anticuerpos de cadena simple y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. El término “fragmento de unión a antígeno” de un anticuerpo incluye uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno. Se ha mostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede realizarse mediante determinados fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión englobados en el término “fragmento de unión a antígeno” de un anticuerpo incluyen (sin limitación): (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1 (p. ej., un anticuerpo digerido con papaína proporciona tres fragmentos: dos fragmentos Fab de unión a antígeno y un fragmento Fc que no se une al antígeno); (ii) un fragmento F(ab')2 , un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos mediante un puente disulfuro a la región bisagra (p. ej., un anticuerpo digerido con pepsina proporciona dos fragmentos: un fragmento F(ab')2 bivalente de unión a antígeno y un fragmento pFc' que no se une al antígeno) y su unidad monovalente F(ab') relacionada; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1 (es decir, la porción de la cadena pesada que está incluida en el Fab); (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un brazo individual de un anticuerpo y el Fv relacionado unido por disulfuro; (v) un fragmento de dAb (anticuerpo de dominio) o sdAb (anticuerpo de dominio individual) (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989), que consiste en un dominio VH; y (vi) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada.
Un "anticuerpo monoclonal" se refiere a una población de anticuerpos homogénea que participa en el reconocimiento y unión altamente específicos de un determinante antigénico único o epítopo. Esto es opuesto a los anticuerpos policlonales que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes antigénicos. El término "anticuerpo monoclonal" engloba anticuerpos monoclonales tanto intactos como de longitud completa, así como fragmentos de anticuerpo (tales como Fab, Fab', F(ab')2, Fv), mutantes de cadena simple (scFv), proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo, y cualquier otra molécula de inmunoglobulina modificada que comprende un sitio de reconocimiento de antígeno. Además, "anticuerpo monoclonal" se refiere a dichos anticuerpos preparados de cualquier cantidad de maneras que incluyen, pero no están imitados a, hibridoma, selección de fago, expresión recombinante, y animales transgénicos.
El término "anticuerpo humanizado" se refiere a formas de anticuerpos no humanos (p. ej., murinos) que son cadenas específicas de inmunoglobulina, inmunoglobulinas quiméricas o fragmentos de las mismas, que contienen secuencias no humanas mínimas (p. ej., murinas). Típicamente, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas en las que los residuos de la región determinante de la complementariedad (CDR) se reemplazan por residuos de la CDR de una especie no humana (p. ej., ratón, rata, conejo, hámster) que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas (Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536). En algunos casos, los residuos de la región marco (FR) de Fv de una inmunoglobulina humana se reemplazan con los residuos correspondientes en un anticuerpo de una especie no humana que tiene la especificidad, afinidad y/o capacidad deseadas. El anticuerpo humanizado puede modificarse adicionalmente por la sustitución de residuos adicionales ya sea en la región marco de Fv y/o dentro de los residuos no humanos reemplazados para refinar y optimizar la especificidad, afinidad y/o capacidad del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos o tres, dominios variables que contienen todas, o sustancialmente todas, las regiones CDR que corresponden a la inmunoglobulina no humana mientras que todas, o sustancialmente todas, las regiones FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana de consenso. El anticuerpo humanizado también puede comprender al menos una parte de un dominio o región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Los ejemplos de métodos usados para generar anticuerpos humanizados se describen en las Pat. de EE. UU. 5.225.539 y 5.639.641, Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91(3):969-973 (1994), y Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895-904 (1996). En algunas realizaciones, un “anticuerpo humanizado” es un anticuerpo modificado en superficie. En algunas realizaciones, un “anticuerpo humanizado” es un anticuerpo con injerto de CDR.
Una "región variable" de un anticuerpo se refiere a la región variable de la cadena ligera del anticuerpo o a la región variable de la cadena pesada del anticuerpo, ya sea sola o en combinación. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera consisten cada una en cuatro regiones marco (FR) conectadas mediante tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR), también conocidas como regiones hipervariables. Las CDR de cada cadena se mantienen juntas muy próximas mediante las FR y, junto a las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos. Existen al menos dos técnicas para determinar las CDR: (1) un enfoque basado en variabilidad de secuencia entre especies (es decir, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5a ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)); y (2) un enfoque basado en estudios cristalográficos de complejos antígeno-anticuerpo (Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)). Asimismo, en la técnica algunas veces se usan combinaciones de estos dos enfoques para determinar las CDR.
El sistema de numeración de Kabat se usa generalmente cuando se hace referencia a un residuo en el dominio variable (aproximadamente los residuos 1-107 de la cadena ligera y residuos 1-113 de la cadena pesada) (p. ej., Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)).
La numeración de las posiciones de aminoácidos en Kabat se refiere al sistema de numeración utilizado para los dominios variables de cadena pesada o dominios variables de cadena ligera de la compilación de anticuerpos en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). Al usar este sistema de numeración, la secuencia de aminoácido lineal real puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales que corresponden a un acortamiento de, o inserción en, una FR o una CDR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir la inserción de un solo aminoácido (residuo 52a de acuerdo con Kabat) después del residuo 52 de H2 y los residuos insertados (p. ej., residuos 82a, 82b y 82c, etc. de acuerdo con Kabat) después del residuo 82 de FR de cadena pesada. La numeración de residuos de Kabat se puede determinar para un anticuerpo dado mediante la alineación en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia de numeración de Kabat “estándar”. Chothia, en cambio, se refiere a la ubicación de los bucles estructurales (Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). El final del bucle CDR-H1 de Chothia, cuando se numera mediante el uso de la convención de numeración de Kabat varía entre H32 y H34 dependiendo de la longitud del bucle (esto se debe a que el esquema de numeración de Kabat ubica las inserciones en H35A y H35B; si ni 35A ni 35B están presentes, el bucle finaliza en 32; si solo 35A está presente, el bucle termina en 33; si tanto 35A como 35B están presentes, el bucle termina en 34). Las regiones hipervariables AbM representan un punto medio entre las CDR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia y se usan por el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular.
Bucle Kabat AbM Chothia
L1 L24-L34 L24-L34 L24-L34
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L56
L3 L89-L97 L89-L97 L89-L97
H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32..34
(Numeración de Kabat)
H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32
(Numeración de Chothia)
H2 H50-H65 H50-H58 H52-H56
H3 H95-H102 H95-H102 H95-H102
El término “anticuerpo humano” significa un anticuerpo producido por un ser humano o un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a un anticuerpo producido por un ser humano preparado mediante la utilización de cualquier técnica conocida en la técnica. Esta definición de anticuerpo humano incluye anticuerpos intactos o de longitud completa, fragmentos de los mismos, y/o anticuerpos que comprenden al menos un polipéptido de cadena pesada y/o cadena ligera humano tal como, por ejemplo, un anticuerpo que comprende polipéptidos de cadena ligera murinos y polipéptidos de cadena pesada humanos.
El término "anticuerpos quiméricos" se refiere a anticuerpos en los que la secuencia de aminoácidos de la molécula de inmunoglobulina deriva de dos o más especies. Típicamente, la región variable de ambas cadenas ligera y pesada corresponde a la región variable de anticuerpos que derivan de una especie de mamíferos (p. ej., ratón, rata, conejo, etc.) con la especificidad, afinidad y capacidad deseadas, a la vez que las regiones constantes son homólogas a las secuencias en anticuerpos que derivan de otras (generalmente humanas) para evitar incitar una respuesta inmunitaria en dicha especie.
Los términos “epítopo” o “determinante antigénico” se usan de manera intercambiable en la presente memoria y se refieren a esa parte de un antígeno capaz de ser reconocida y de unirse específicamente por un anticuerpo particular. Cuando el antígeno es un polipéptido, los epítopos pueden formarse tanto a partir de aminoácidos contiguos como de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante el plegamiento terciario de una proteína. Generalmente, los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos se retienen durante el proceso de desnaturalización de la proteína, mientras que los epítopos formados a partir de plegamiento terciario generalmente se pierden durante la desnaturalización de la proteína. Un epítopo típicamente incluye al menos 3, y más normalmente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única.
“Afinidad de unión” generalmente se refiere a la fuerza de la suma total de las interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (p. ej., un anticuerpo) y su compañero de unión (p. ej., un antígeno). A menos que se indique lo contrario, tal y como se usa en la presente memoria, “afinidad de unión” se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de un par de unión (p. ej., anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X respecto a su compañera Y puede estar representada generalmente por la constante de disociación (Kd) o la concentración eficaz mitad de la máxima (CE50). La afinidad se puede medir mediante el uso de métodos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en la presente memoria. Los anticuerpos de baja afinidad por lo general se unen al antígeno lentamente y tienden a disociarse fácilmente, mientras que los anticuerpos de alta afinidad por lo general se unen al antígeno más rápidamente y tienden a permanecer unidos durante más tiempo. Se conocen en la técnica una variedad de métodos para medir la afinidad de unión, cualquiera de los cuales se puede utilizar a efectos de la presente invención. En la presente memoria se describen realizaciones ilustrativas específicas.
"O mejor", cuando se usa en la presente memoria para hacer referencia a la afinidad de unión, se refiere a una unión más fuerte entre una molécula y su compañero de unión. “O mejor”, cuando se usa en la presente memoria, se refiere a una unión más fuerte representada por un valor de Kd numérico menor. Por ejemplo, un anticuerpo que tiene una afinidad para un antígeno de "0,6 nM o mejor”, la afinidad del anticuerpo para el antígeno es <0,6 nM, es decir, 0,59 nM, 0,58 nM, 0,57 nM etc. o cualquier otro valor menor de 0,6 nM. En una realización, la afinidad del anticuerpo tal como se determina por una Kd será entre aproximadamente 10-3 a aproximadamente 10-12 M, entre aproximadamente 10-6 a aproximadamente 10-11 M, entre aproximadamente 10-6 a aproximadamente 10-10 M, entre aproximadamente 10-6 a aproximadamente 10-9 M, entre aproximadamente 10-6 a aproximadamente 10-8 M, o entre aproximadamente 10-6 a aproximadamente 10-7 M.
La expresión "sustancialmente similar" o "sustancialmente igual", tal y como se usa en la presente memoria, denota un grado suficientemente alto de similitud entre dos valores numéricos (generalmente uno asociado con un anticuerpo de la invención y el otro asociado con un anticuerpo de referencia/comparador) de modo que un experto en la técnica consideraría que la diferencia entre los dos valores tiene poca significancia biológica y/o estadística o ninguna dentro del contexto de las características biológicas medidas por dichos valores (p. ej., los valores de Kd). La diferencia entre dichos dos valores es menor de aproximadamente el 50 %, menor de aproximadamente el 40 %, menor de aproximadamente el 30 %, menor de aproximadamente el 20 %, o menor de aproximadamente el 10 % en función del valor para el anticuerpo de referencia/comparador.
El término "inmunoconjugado" o conjugado", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a un compuesto o un derivado del mismo que está unido a un agente de unión celular (es decir, un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento del mismo) y se define por una fórmula genérica: A-L-C, en donde C = citotoxina, L = enlazador, y A = agente de unión celular o anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de anticuerpo. Los inmunoconjugados también se pueden definir por la fórmula genérica en orden inverso: C-L-A.
Un “enlazador” es un resto químico que es capaz de unir un compuesto, normalmente un fármaco, tal como un maitansinoide, a un agente de unión celular tal como un anticuerpo anti-FOLR1 o un fragmento del mismo de forma estable y covalente. Los enlazadores pueden ser susceptibles o sustancialmente resistentes a la escisión inducida por ácido, la escisión inducida por luz, la escisión inducida por peptidasa, la escisión inducida por esterasa y la escisión de enlace de disulfuro, en condiciones en las que el compuesto o el anticuerpo permanece activo. Los enlazadores adecuados son muy conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos lábiles a ácido, grupos fotolábiles, grupos lábiles a peptidasa y grupos lábiles a esterasa. Los enlazadores también incluyen enlazadores cargados y formas hidrófilas de los mismos como se describe en la presente memoria y se conoce en la técnica.
Un polipéptido, anticuerpo, polinucleótido, vector, célula o composición que está “aislado” es un polipéptido, anticuerpo, polinucleótido, vector, célula o composición que se encuentra en una forma que no se encuentra en la naturaleza. Los polipéptidos, anticuerpos, polinucleótidos, vectores, células o composiciones aislados incluyen aquellos que han sido purificados hasta un grado en el que ya no se encuentran en una forma en la que se encuentran en la naturaleza. En algunas realizaciones, un anticuerpo, polinucleótido, vector, célula o composición que está aislado es sustancialmente puro.
Tal y como se usa en la presente memoria, "sustancialmente puro" se refiere a material que es al menos un 50 % puro (es decir, libre de contaminantes), al menos un 90 % puro, al menos un 95 % puro, al menos un 98 % puro o al menos un 99 % puro.
Los términos FOLR1 “elevado”, “aumento de la expresión” de FOLR1 y “sobreexpresión de FOLR1 se refieren a una muestra que contiene niveles elevados de expresión de FOLR1. El FOLR1 puede elevarse, aumentar o sobreexpresarse en comparación con un valor de control (p. ej., el nivel de expresión en una muestra biológica, tejido o célula de un sujeto sin cáncer, una muestra o cáncer que se sabe que no expresa FOLR1 o lo hace a un nivel bajo, una muestra normal, o un cáncer que no tiene valores elevados de FOLR1). Por ejemplo, una muestra con aumento de la expresión puede contener un aumento de al menos 2 veces, al menos 3 veces o al menos 5 veces en relación con valores de control.
La expresión de FOLR1 puede medirse mediante inmunohistoquímica y se le otorga una puntuación de intensidad de tinción o una puntuación de uniformidad de tinción en comparación con controles calibrados que exhiben puntuaciones definidas (p. ej., se le otorga una puntuación de intensidad de 3 a la muestra de ensayo si la intensidad es comparable con el nivel de control calibrado de nivel 3, o se le otorga una intensidad de 2 a la muestra de ensayo si la intensidad es comparable con el control calibrado de nivel 2). Por ejemplo, una puntuación de 1,2 o 3 (3+), preferentemente una puntuación de 2 o 3 (3+), mediante inmunohistoquímica indica un aumento de la expresión de FOLR1. Una uniformidad de tinción que sea heterogénea u homogénea también es indicativa de la expresión de FOLR1. Las puntuaciones de intensidad de tinción y uniformidad de tinción se pueden usar solas o en combinación (p. ej., 2 homo, 2 hetero, 3 homo, 3 hetero, etc.). Véase la Tabla 11. En otro ejemplo, un aumento en la expresión de FOLR1 se puede determinar mediante detección de un aumento de al menos 2 veces, al menos 3 veces, o al menos 5 veces en relación con valores de control (p. ej., nivel de expresión en un tejido o célula de un sujeto sin cáncer o con un cáncer que no tiene valores elevados de FOLR1).
Se puede utilizar una “muestra de referencia” para correlacionar y comparar los resultados obtenidos en los métodos de la invención a partir de una muestra de ensayo. Las muestras de referencia pueden ser células (p. ej., líneas celulares, sedimentos celulares) o tejido. Los niveles de FOLR1 en la “muestra de referencia” pueden ser una cantidad absoluta o relativa, un rango de cantidad, una cantidad mínima y/o máxima, una cantidad media y/o una cantidad mediana de FOLR1. Una “muestra de referencia” también puede servir como línea base de la expresión de FOLR1 con la cual se compara la muestra de ensayo. La “muestra de referencia” puede incluir una muestra anterior o muestra de línea base del mismo paciente, una referencia normal con un nivel conocido de expresión de FOLR1, o una referencia de una población de pacientes relevante con un nivel conocido de expresión de FOLR1. Los niveles de FOLR1 también pueden expresarse como valores en una curva estándar. Una curva estándar es un método cuantitativo de representar gráficamente datos de ensayo para determinar la concentración de FOLR1 en una muestra. En una realización, una muestra de referencia es un estándar de antígeno que comprende FOLR1 purificado o FOLR1-Fc. Los métodos de diagnóstico de la invención pueden implicar una comparación entre los niveles de expresión de FOLR1 en una muestra de ensayo y un “valor de referencia”. En algunas realizaciones, el valor de referencia es el nivel de expresión del FOLR1 en una muestra de referencia. Un valor de referencia puede ser un valor predeterminado y también se puede determinar a partir de muestras de referencia (p. ej., muestras biológicas o muestras de referencia de control) ensayadas en paralelo con las muestras de ensayo. Un valor de referencia puede ser un valor de corte individual, tal como un valor mediano o medio o un rango de valores, tal como un intervalo de confianza. Los valores de referencia se pueden establecer para varios subgrupos de individuos, tales como individuos predispuestos al cáncer, individuos que tienen cáncer en un estadio temprano o tardío, individuos masculinos y/o femeninos o individuos sometidos a terapia contra el cáncer. Los ejemplos de valores o muestras de referencia normales y valores o muestra de referencia positiva se describen en la presente memoria y también se describen en el Ejemplo 1 y los Ejemplos 8-10 de WO 2012/135675, incorporada en la presente memoria por referencia.
En algunas realizaciones, la muestra de referencia es una muestra de un tejido sano, en particular un tejido correspondiente que no está afectado por el cáncer, o un tejido correspondiente que no está afectado por un cáncer que sobreexpresa FOLR1, o un tejido correspondiente sano que se sabe que no expresa niveles detectables de FOLR. Estos tipos de muestras de referencia se denominan muestras de control negativo o muestras de referencia “normales”. En otras realizaciones, la muestra de referencia es una muestra de un tumor o tejido sano que expresa FOLR1 de forma detectable. Estos tipos de muestras de referencia se denominan muestras de control positivo o de referencia positiva. Las muestras de control positivo también se pueden usar como un indicador comparativo para el tipo (hetero frente a homo) y/o grado (0, 1,2, 3) de intensidad de tinción, que se correlaciona con el nivel de expresión de FOLR1. Las muestras comparativas de control positivo también se denominan muestras de referencia calibradas. Las referencias sin expresión de FOLR1 o con expresión baja se describen en la presente memoria en los Ejemplos y también incluyen todas las estructuras del esófago, islotes/células acinares del páncreas, tejido conectivo interalveolar del pulmón y células acinares de las glándulas salivales. Para las líneas celulares, los ejemplos de no expresión incluyen BxPC3, Panc-1 y ASPC1. Las referencias positivas para FOLR1 se describen en la presente memoria, por ejemplo, en los Ejemplos y también incluyen conductos del páncreas, epitelio respiratorio de pulmón normal y conductos intercalados de las glándulas salivales. En algunas realizaciones, las referencias positivas para FOLR1 incluyen conductos del páncreas y conductos intercalados de las glándulas salivales. Para las líneas celulares, los ejemplos con expresión elevada de FOLR1 se describen en la presente memoria, por ejemplo, en los Ejemplos y también incluyen células KB, HeLa y 300.19 transfectadas con FOLR1, Igrov-1 y Wish, y los ejemplos con expresión baja de FOLR1 incluyen Ovcar-3, Caov-3, SW620, T47D y Skov-3. Otra referencia positiva para FOLR1 elevado es una línea celular transfectada de forma estable o transitoria con FOLR1. Se describen muestras adicionales positivas y negativas para FOLR1 en la Tabla 13. Se pueden determinar los niveles de referencia positivos y negativos apropiados de FOLR1 para un cáncer particular mediante la medición de los niveles de FOLR1 en uno o más sujetos apropiados, y dichos niveles de referencia se pueden adaptar a poblaciones específicas de sujetos (p. ej., un nivel de referencia se puede hacer coincidir por edad, de manera que se puedan hacer comparaciones entre niveles de FOLR1 en muestras de sujetos de una determinada edad y niveles de referencia para un estado de enfermedad particular, fenotipo o falta del mismo en un determinado grupo de edad). Dichos niveles de referencia también pueden adaptarse a técnicas específicas que se utilizan para medir los niveles de FOLR1 en muestras biológicas (p. ej., inmunoensayos, etc.).
Tal y como se usa en la presente memoria, la “inmunohistoquímica” se refiere a métodos histoquímicos e inmunológicos utilizados para analizar, por ejemplo, células o tejidos. Por lo tanto, los términos “inmunohistoquímica”, “inmunocitoquímica” e “ inmunoquímica” se utilizan de manera intercambiable.
El término “anticuerpo primario” se refiere en la presente memoria a un anticuerpo que se une específicamente al antígeno de la proteína diana en una muestra. Un anticuerpo primario es generalmente el primer anticuerpo utilizado en un ensayo de ELISA o un procedimiento de IHC. En una realización, el anticuerpo primario es el único anticuerpo utilizado en un procedimiento de IHC. El término “anticuerpo secundario” se refiere en la presente memoria a un anticuerpo que se une específicamente a un anticuerpo primario, formando de esta manera un puente o enlace entre el anticuerpo primario y un reactivo posterior, si lo hubiera. El anticuerpo secundario es generalmente el segundo anticuerpo usado en un procedimiento inmunohistoquímico.
Una “muestra” o “muestra biológica” de la presente invención es de origen biológico, en realizaciones específicas, tal como de organismos eucariotas. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra humana, pero también se pueden usar muestras de animales. Las fuentes no limitativas de una muestra para su uso en la presente invención incluyen tejido sólido, aspirados de biopsia, ascitis, extractos de fluidos, sangre, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, linfa, las secciones externas de la piel, de los tractos respiratorio, intestinal, y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, tumores, órganos, cultivos celulares y/o constituyentes de cultivos celulares, por ejemplo. Una “muestra cancerosa” es una muestra que contiene una célula cancerosa. El método se puede utilizar para examinar un aspecto de la expresión de FOLR1 o un estado de una muestra incluyendo, pero no limitado a, la comparación de diferentes tipos de células o tejidos, la comparación de diferentes estadios de desarrollo y la detección o determinación de la presencia y/o tipo de enfermedad o anomalía.
Para los propósitos de la presente memoria, una “sección” de una muestra de tejido se refiere a una parte o pieza individual de una muestra de tejido, p. ej., una rebanada fina de tejido o de células cortadas de una muestra de tejido. Se entiende que se pueden tomar múltiples secciones de muestras de tejido y someterlas a análisis de acuerdo con la presente invención. En algunos casos, la porción o sección seleccionada de tejido comprende una población homogénea de células. En otros casos, la porción seleccionada comprende una región de tejido, p. ej., el lumen como un ejemplo no limitativo. La porción seleccionada puede ser tan pequeña como una célula o dos células, o puede representar muchos miles de células, por ejemplo. En la mayoría de los casos, la recogida de las células es importante, y mientras la invención ha sido descrita para su uso en la detección de componentes celulares, el método también se puede usar para detectar componentes no celulares de un organismo (p. ej., componentes solubles en la sangre como un ejemplo no limitativo).
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "reactivo de captura" se refiere a un reactivo capaz de unirse a y capturar una molécula diana en una muestra de modo que, en condiciones adecuadas, el complejo reactivo de captura-molécula diana se pueda separar del resto de la muestra. En una realización, el reactivo de captura está inmovilizado. En una realización, el reactivo de captura en un inmunoensayo en sándwich es un anticuerpo o una mezcla de diferentes anticuerpos contra un antígeno diana.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "anticuerpo detectable" se refiere a un anticuerpo que es capaz de ser detectado ya sea directamente a través de un marcaje amplificado por un medio de detección o indirectamente a través, p. ej., de otro anticuerpo que está marcado. Para el marcaje directo, el anticuerpo normalmente se conjuga con un resto que es detectable mediante algunos medios. En una realización, el anticuerpo detectable es un anticuerpo biotinilado.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "medio de detección" se refiere a un resto o técnica utilizada para detectar la presencia del anticuerpo detectable e incluye agentes de detección que amplifican el marcaje inmovilizado tal como un marcaje capturado en una placa de microtitulación. En una realización, el medio de detección es un agente de detección fluorimétrico tal como avidina o estreptavidina.
Comúnmente, un "ELISA en sándwich" emplea las siguientes etapas: (1) la placa de microtitulación se recubre con un anticuerpo de captura; (2) se añade la muestra y cualquier antígeno presente se une al anticuerpo de captura; (3) se añade el anticuerpo de detección y se une al antígeno; (4) se añade el anticuerpo secundario unido a la enzima y se une al anticuerpo de detección; y (5) se añade el sustrato y es convertido por la enzima hasta obtener una forma detectable.
El término “mareaje” cuando se usa en la presente memoria se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente al anticuerpo, de manera que se genera un anticuerpo “marcado”. El marcaje puede ser detectable por sí mismo (p. ej., marcajes con radioisótopos o marcajes fluorescentes) o, en el caso de un marcaje enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición de sustrato que es detectable.
Por “correlacionar” o “que correlaciona” se quiere decir, de cualquier manera, el rendimiento y/o los resultados de un primer análisis con el rendimiento y/o los resultados de un segundo análisis. Por ejemplo, se pueden usar los resultados de un primer análisis al realizar el segundo análisis y/o se pueden usar los resultados de un primer análisis para determinar si se debería realizar un segundo análisis y/o se pueden comparar los resultados de un primer análisis con los resultados de un segundo análisis. En una realización, el aumento de la expresión de FOLR1 se correlaciona con el aumento de la probabilidad de eficacia de una terapia anticancerosa dirigida a FOLR1.
Los términos “cáncer” y “canceroso” se refieren a o describen la afección fisiológica en mamíferos en la que una población de células se caracteriza por tener un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no están limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Más ejemplos particulares de dichos cánceres incluyen cánceres de origen endotelial, mesenquimal o epitelial, tal como cáncer de pulmón (p. ej., cáncer de células escamosas, cáncer de células pequeñas de pulmón, cáncer de células no pequeñas de pulmón, adenocarcinoma de pulmón, mesotelioma y carcinoma escamoso de pulmón), cáncer del peritoneo (p. ej., peritoneal primario) , cáncer hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario (seroso o endometrioide), cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, endometrioide (p. ej., adenocarcinoma endometrial) o carcinoma uterino, carcinoma de las glándulas salivales, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de la vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, cáncer de cerebro (p. ej., glioblastoma, tumores del plexo coroideo) y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, y también tumores de vasos sanguíneos y trompas de falopio. Los cánceres también engloban cánceres que contienen células que tienen niveles de expresión FOLR1 elevados. Dichos cánceres con FOLR1 elevado incluyen, pero no están limitados a, cáncer de ovarios, cáncer de pulmón de células no pequeñas (adenocarcinoma), cáncer uterino, del endometrio, pancreático, renal, pulmonar y de mama.
"Tumor" y "neoplasma" se refieren a cualquier masa de tejido que se produce por el crecimiento o proliferación celulares excesivos, ya sea benigno (no canceroso) o maligno (canceroso) que incluye lesiones precancerosas.
Los términos "célula cancerosa", "célula tumoral" y equivalentes gramaticales se refieren a la población total de células que derivan de un tumor o lesión precancerosa, que incluyen células no tumorogénicas, que comprenden la mayor parte de la población de células tumorales y células madre tumorogénicas (células madre cancerosas). Tal y como se usa en la presente memoria, el término "célula tumoral" se modificará por el término "no tumorogénico" cuando se refiere solamente a aquellas células tumorales que carecen de la capacidad de renovarse y diferenciarse para distinguir aquellas células tumorales de las células madre cancerosas.
El término "sujeto" se refiere a cualquier animal (p. ej., un mamífero), que incluye, pero no está limitado a, seres humanos, primates no humanos, roedores y similares, que será el receptor de un tratamiento particular. Típicamente, los términos “sujeto” y “paciente” se usan de modo intercambiable en la presente memoria para hacer referencia a un sujeto humano.
El término “formulación farmacéutica” se refiere a una preparación que está en una forma tal que permite que la actividad biológica del ingrediente activo sea eficaz, y que no contiene ningún componente adicional que sea inaceptablemente tóxico para un sujeto al cual se le administraría la formulación. Dicha formulación puede ser estéril. Una “cantidad eficaz” de un anticuerpo o inmunoconjugado tal como se describe en la presente memoria es una cantidad suficiente para llevar a cabo un propósito específicamente establecido. Una “cantidad eficaz” puede determinarse empíricamente y de una manera rutinaria, en relación al propósito establecido.
El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un anticuerpo u otro fármaco eficaz para "tratar" una enfermedad o trastorno en un sujeto o mamífero. En el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir, ralentizar hasta cierto punto y en una realización determinada, detener) la infiltración de células cancerosas en los órganos periféricos; inhibir (es decir, ralentizar hasta cierto punto y en una realización determinada, detener) la metástasis tumoral; inhibir, hasta cierto punto, el crecimiento del tumor; aliviar, hasta cierto punto, uno o más de los síntomas asociados con el cáncer; y/o tener como resultado una respuesta favorable tal como un aumento de la supervivencia libre de progresión (PFS), supervivencia libre de enfermedad (DFS), o supervivencia global (OS), respuesta completa (CR), respuesta parcial (PR), o en algunos casos, enfermedad estable (SD), una disminución en enfermedad progresiva (PD), una reducción del tiempo hasta la progresión (TTP), una disminución en CA125 en el caso de cáncer de ovarios, o cualquier combinación de los mismos. Véase la definición en la presente memoria de "tratar". En la medida en que el fármaco pueda prevenir el crecimiento y/o destruir las células cancerosas existentes, este puede ser citostático y/o citotóxico. En determinadas realizaciones, la identificación de niveles de FOLR1 aumentados permite la administración de menores cantidades del agente terapéutico dirigido a FOLR1 para lograr el mismo efecto terapéutico que se observa con dosificaciones mayores. Una “cantidad profilácticamente eficaz” se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente, aunque no necesariamente, dado que se utiliza una dosis profiláctica en sujetos antes de o en un estadio temprano de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.
El término “responde favorablemente” generalmente se refiere a ocasionar un estado beneficioso en un sujeto. Con relación al tratamiento del cáncer, el término se refiere a proporcionar un efecto terapéutico en el sujeto. Los efectos terapéuticos positivos sobre el cáncer se pueden medir de diversas formas (véase, W.A. Weber, J. Nucl. Med. 50:1S-10S (2009)). Por ejemplo, se pueden usar la inhibición del crecimiento tumoral, expresión de marcadores moleculares, expresión de marcadores séricos, y técnicas de imagenología molecular para evaluar la eficacia terapéutica de un agente terapéutico anticanceroso. Con respecto a la inhibición del crecimiento tumoral, de acuerdo con los estándares de NCI, un T/C < 42 % es el nivel mínimo de actividad antitumoral. Un T/C <10 % se considera un nivel de actividad antitumoral alto, con T/C (%) = mediana del volumen tumoral del tratado/mediana del volumen tumoral del control x 100. Se puede evaluar una respuesta favorable, por ejemplo, mediante un aumento de la supervivencia libre de progresión (PFS), supervivencia libre de enfermedad (DFS), o supervivencia global (OS), respuesta completa (CR), respuesta parcial (PR) o, en algunos casos, enfermedad estable (SD), una disminución en enfermedad progresiva (PD), una reducción en el tiempo hasta la progresión (TTP), una disminución en CA125 en el caso de cáncer de ovarios, o cualquier combinación de los mismos.
PFS, DFS, y OS se pueden medir con estándares establecidos por el Instituto Nacional del Cáncer y por la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU. para la aprobación de nuevos fármacos. Véase Johnson et al, (2003) J. Clin. Oncol. 21(7):1404-1411.
La "supervivencia libre de progresión" (PFS) se refiere al tiempo desde la inclusión en el estudio hasta la progresión de la enfermedad o la muerte. La PFS generalmente se mide mediante el uso del método de Kaplan-Meier y los estándares 1.1 de los Criterios de Evaluación de la Respuesta en Tumores Sólidos (RECIST). Generalmente, la supervivencia libre de progresión se refiere a la situación en la que un paciente permanece vivo, sin que el cáncer empeore.
El “tiempo para la progresión del tumor” (TTP) se define como el tiempo desde la inclusión en el estudio hasta la progresión de la enfermedad. El TTP se mide generalmente mediante el uso del criterio RECIST 1.1.
Una “respuesta completa” o “remisión completa” o “CR” indica la desaparición de todos los signos de tumor o cáncer en respuesta al tratamiento. Esto no siempre significa que el cáncer se ha curado.
Una “respuesta parcial” o “PR” se refiere a una disminución en el tamaño o el volumen de uno o más tumores o lesiones, o en la extensión del cáncer en el cuerpo, en respuesta al tratamiento.
“Enfermedad estable" se refiere a la enfermedad sin progresión o recidiva. En la enfermedad estable no hay suficiente encogimiento del tumor como para que se califique como respuesta parcial ni un suficiente aumento del tumor como para que se califique como enfermedad progresiva.
“Enfermedad progresiva” se refiere a la apariencia de una o más lesiones o tumores nuevos y/o la progresión inequívoca de lesiones no diana existentes. La enfermedad progresiva también se puede referir a un crecimiento tumoral de más del 20 por ciento desde que comenzó el tratamiento, ya sea debido a aumentos en la masa o la diseminación del tumor.
“Supervivencia libre de enfermedad” (DFS) se refiere a la cantidad de tiempo durante y después del tratamiento en el que el paciente permanece libre de enfermedad.
“Supervivencia global” (OS) se refiere al tiempo desde la inclusión del paciente hasta su muerte o censura en la fecha que se le vio vivo por última vez. La OS incluye una prolongación de la expectativa de vida en comparación con individuos o pacientes sin tratamiento previo o sin tratar. La supervivencia global se refiere a la situación en donde un paciente permanece vivo durante un período de tiempo definido, tal como un año, cinco años, etc., p. ej., desde el momento del diagnóstico o tratamiento.
Una “disminución en los niveles de CA125” se puede evaluar de acuerdo con las directrices del Intergrupo de Cáncer Ginecológico (GCIG). Por ejemplo, los niveles de CA125 se pueden medir antes del tratamiento para establecer un nivel CA125 de línea base. Los niveles de CA125 se pueden medir una o más veces durante o después del tratamiento, y una reducción en los niveles de CA125 con el tiempo en comparación con el nivel de línea base se considera una disminución en los niveles de CA125.
Los términos tales como “tratar” o “tratamiento” o "para tratar" o “aliviar” o "para aliviar" se refieren a medidas terapéuticas que curan, ralentizan, reducen los síntomas de, y/o detienen la progresión de una afección o trastorno patológico diagnosticado. Por lo tanto, los que necesitan tratamiento incluyen los que ya fueron diagnosticados con o se sospecha que padecen el trastorno. En determinadas realizaciones, un sujeto se "trata" exitosamente para el cáncer de acuerdo con métodos de la presente invención si el paciente muestra uno o más de lo siguiente: una reducción en el número de o ausencia total de células cancerosas; una reducción en el tamaño tumoral; inhibición o ausencia de infiltración de células cancerosas en órganos periféricos que incluyen, por ejemplo, la diseminación del cáncer en tejido blando y hueso; inhibición o ausencia de metástasis tumorales; inhibición o ausencia de crecimiento tumoral; alivio de uno o más síntomas asociados con el cáncer específico; morbilidad y mortalidad reducidas; mejora en la calidad de vida, reducción de tumorogenicidad, frecuencia tumorogénica o capacidad tumorogénica de un tumor; reducción en el número o frecuencia de células madre cancerosas en un tumor; diferenciación de células tumorogénicas a un estado no tumorogénico; aumento de la supervivencia libre de progresión (PFS), supervivencia libre de enfermedad (DFS), o supervivencia global (OS), respuesta completa (CR), respuesta parcial (PR), enfermedad estable (SD), una disminución en enfermedad progresiva (PD), una reducción del tiempo hasta la progresión (TTP), una disminución en CA125 en el caso de cáncer de ovarios, o cualquier combinación de los mismos.
Las medidas preventivas o profilácticas se refieren a medidas terapéuticas que previenen y/o ralentizan el desarrollo de una afección o trastorno patológico dirigido. Por lo tanto, los que necesitan medidas profilácticas o preventivas incluyen aquellos predispuestos a tener el trastorno y aquellos en quienes se debe prevenir el trastorno.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término “proveedor de servicios sanitarios” se refiere a individuos o instituciones que interactúan con y gestionan sujetos vivos, p. ej., pacientes humanos. Los ejemplos no limitativos de proveedores de servicios sanitarios incluyen doctores, enfermeras, técnicos, terapeutas, farmacéuticos, consejeros, practicantes de medicina alternativa, instituciones médicas, consultorios médicos, hospitales, salas de emergencia, centros de cuidado de urgencia, clínicas/instalaciones de medicina alternativa, y cualquier otra entidad que proporciona un tratamiento, evaluación, mantenimiento, terapia, medicación y/o asesoría general y/o especializada relacionada con la totalidad o una parte del estado de salud del paciente, incluyendo, pero no limitado a, tratamiento, evaluación, mantenimiento, terapia, medicación y/o asesoría médica general, médica especializada, quirúrgica y/o de otro tipo.
En algunos aspectos, un proveedor de servicios sanitarios puede administrar o instruir a otro proveedor de servicios sanitarios para administrar una terapia para tratar un cáncer. La “administración” de una terapia, tal y como se usa en la presente memoria, incluye prescribir una terapia a un sujeto, así como administrar, aplicar o proporcionar la terapia a un sujeto. Un proveedor de servicios sanitarios puede implementar o instruir a otro proveedor de servicios sanitarios o paciente para realizar las siguientes acciones: obtener una muestra, procesar una muestra, enviar una muestra, recibir una muestra, transferir una muestra, analizar o medir una muestra, cuantificar una muestra, proporcionar los resultados obtenidos después de analizar/medir/cuantificar una muestra, recibir los resultados obtenidos después de analizar/medir/cuantificar una muestra, comparar/puntuar los resultados obtenidos después de analizar/medir/cuantificar una o más muestras, proporcionar una comparación/puntuación de una o más muestras, obtener la comparación/puntuación de una o más muestras, administrar una terapia o agente terapéutico (p. ej., un agente de unión a FOLR1), comenzar la administración de una terapia, cesar la administración de una terapia, continuar la administración de una terapia, interrumpir temporalmente la administración de una terapia, aumentar la cantidad de un agente terapéutico administrado, disminuir la cantidad de un agente terapéutico administrado, continuar la administración de una cantidad de un agente terapéutico, aumentar la frecuencia de la administración de un agente terapéutico, disminuir la frecuencia de la administración de un agente terapéutico, mantener la misma frecuencia de dosificación de un agente terapéutico, reemplazar una terapia o agente terapéutico por al menos otra terapia o agente terapéutico, combinar una terapia o agente terapéutico con al menos otra terapia o agente terapéutico adicional. Estas acciones pueden ser llevadas a cabo por un proveedor de servicios sanitarios automáticamente mediante el uso de un método implementado por ordenador (p. ej., por medio de un servicio web o un sistema informático autónomo).
“Polinucleótido” o “ácido nucleico”, tal y como se usan de manera intercambiable en la presente memoria, se refieren a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos o bases modificados y/o sus análogos, o cualquier sustrato que pueda incorporarse en un polímero mediante polimerasa de ADN o ARN. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. De estar presente, la modificación de la estructura del nucleótido se puede impartir antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede ser interrumpida por componentes distintos de nucleótidos. Un polinucleótido puede modificarse adicionalmente después de la polimerización, tal como mediante conjugación con un componente de marcaje. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, “casquetes”, sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo, modificaciones internucleotídicas, tales como, por ejemplo, aquellas con enlaces no cargados (p. ej., fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (p. ej., fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.); aquellas que contienen restos laterales, tales como, por ejemplo, proteínas (p. ej., nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-L-lisina, etc.); aquellas con intercaladores (p. ej., acridina, psoralén, etc.); aquellas que contienen quelantes (p. ej., metales, metales radiactivos, boro, metales oxidativos, etc.); aquellas que contienen alquiladores; aquellas con enlaces modificados (p. ej., ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.); así como formas no modificadas del o de los polinucleótidos. Además, cualquiera de los grupos hidroxilo presentes comúnmente en los azúcares se puede reemplazar, por ejemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegerse con grupos protectores estándar o activarse para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales o se pueden conjugar a soportes sólidos. El OH del extremo 5' o 3' se puede fosforilar o sustituir con aminas o restos orgánicos del grupo casquete de 1 a 20 átomos de carbono. También se pueden derivar otros hidroxilos a grupos protectores estándar. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares de ribosa o desoxirribosa que generalmente son conocidos en la técnica, que incluyen, por ejemplo, 2'-O-metilo-, 2'-O-alilo, 2'-fluoro- o 2'-azidoribosa, análogos de azúcar carbocíclico, azúcares alfa-anoméricos, azúcares epiméricos, tales como, arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos de nucleósidos abásicos, tales como ribósido de metilo. Se puede reemplazar uno o más enlaces de fosfodiéster por grupos de enlace alternativos. Estos grupos de enlace alternativos incluyen, pero no están limitados a, realizaciones en donde el fosfato se reemplaza por P(O)S (“tioato”), P(S)S (“ditioato”), (O)NR2 (“amidato”), P(O)R, P(O)OR', CO o CH2 (“formacetal”), en los que cada R o R' es independientemente H o un alquilo (1-20 C) sustituido o no sustituido que contiene opcionalmente un enlace éter (--O--), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No necesariamente todos los enlaces en un polinucleótido son idénticos. La descripción que antecede se aplica a todos los polinucleótidos a los que se hace referencia en la presente memoria, incluyendo ARN y ADN.
El término “vector” significa una construcción que es capaz de administrar y expresar uno o más genes o secuencias de interés en una célula huésped. Los ejemplos de vectores incluyen, pero no están limitados a, vectores virales, vectores de expresión de ADN o ARN desnudos, vectores de plásmidos, cósmidos o fagos, vectores de expresión de ADN o ARN asociados con agentes de condensación catiónicos, vectores de expresión de ADN o ARN encapsulados en liposomas y determinadas células eucariotas, tal como células productoras.
Los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteína” se usan de manera intercambiable en la presente memoria y se refieren a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede estar ser interrumpido por no aminoácidos. Asimismo, los términos engloban un polímero de aminoácidos que ha sido modificado naturalmente o mediante intervención; por ejemplo, formación de enlace disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de marcaje. También se incluyen en la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Se entiende que, debido a que los polipéptidos de la presente invención se basan en anticuerpos, en determinadas realizaciones, los polipéptidos pueden aparecer como cadenas simples o cadenas asociadas. En algunas realizaciones, un polipéptido, péptido o proteína es de origen no natural. En algunas realizaciones, un polipéptido, péptido o proteína se purifica a partir de otros componentes de origen natural. En algunas realizaciones, el polipéptido, péptido o proteína se produce de forma recombinante.
Los términos “idéntico” o porcentaje de “identidad” en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o que tienen un porcentaje especificado de residuos de nucleótidos o de aminoácidos que son iguales, cuando se comparan y alinean (introduciendo huecos, de ser necesario) para una máxima correspondencia, sin considerar ninguna sustitución conservativa de aminoácidos como parte de la identidad de secuencia. El porcentaje de identidad puede medirse mediante el uso de software o algoritmos de comparación de secuencias o mediante inspección visual. En la técnica se conocen varios algoritmos y software que se pueden usar para obtener alineamientos de secuencias de aminoácidos o nucleótidos. Uno de estos ejemplos no limitativos de un algoritmo de alineamiento de secuencia es el algoritmo descrito en Karlin et al, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:2264-2268, según modificación en Karlin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90:5873-5877 e incorporado en los programas NBLAST y XBLAST (Altschul et al., 1991, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402). En determinadas realizaciones, se puede usar Gapped BLAST tal como se describe en Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. BLAST-2, WU-BLAST-2 (Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology, 266:460-480), ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, California) o Megalign (DNASTAR) son programas de software públicamente disponibles adicionales que se pueden usar para alinear secuencias. En determinadas realizaciones, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina mediante el uso del programa GAP en software GCG (p. ej., mediante el uso de una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de hueco de 40, 50, 60, 70 o 90 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6). En determinadas realizaciones alternativas, el programa GAP en el paquete de software GCG, que incorpora el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) se puede usar para determinar el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos (p. ej., mediante el uso de o bien una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250 y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5). De manera alternativa, en determinadas realizaciones, el porcentaje de identidad entre secuencias de nucleótidos o aminoácidos se determina mediante el uso del algoritmo de Myers y Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)). Por ejemplo, el porcentaje de identidad se puede determinar mediante el uso del programa ALIGN (versión 2.0) y el uso de un PAM120 con tabla de residuo, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4. Un experto en la técnica puede determinar los parámetros apropiados para un máximo alineamiento por un software de alineamiento particular. En determinadas realizaciones, se usan los parámetros por defecto del software de alineamiento. En determinadas realizaciones, el porcentaje de identidad "X" de una primera secuencia de aminoácidos con respecto a una segunda secuencia de aminoácidos se calcula como 100 x (Y/Z), donde Y es el número de residuos de aminoácidos puntuados como coincidencias idénticas en el alineamiento de la primera y la segunda secuencia (tal como se alinean por inspección visual o un programa de alineamiento de secuencias particular) y Z es el número total de residuos en la segunda secuencia. Si la longitud de una primera secuencia es mayor que la segunda secuencia, el porcentaje de identidad de la primera secuencia respecto a la segunda secuencia será mayor que el porcentaje de identidad de la segunda secuencia respecto a la primera secuencia.
A modo de ejemplo no limitativo, si algún polinucleótido particular tiene un determinado porcentaje de identidad de secuencia (p. ej., es al menos un 80 % idéntica, al menos un 85 % idéntica, al menos un 90 % idéntica y en algunas realizaciones, al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica) con respecto a una secuencia de referencia puede determinarse, en determinadas realizaciones, mediante el uso del programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). Bestfit usa el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482 489 (1981), para encontrar el mejor segmento de homología entre dos secuencias. Cuando se usa Bestfit o cualquier otro programa de alineamiento de secuencias para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, un 95 % idéntica a una secuencia de referencia de acuerdo con la presente invención, los parámetros se fijan de forma tal que el porcentaje de identidad se calcula sobre la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de referencia y se permiten huecos en la homología de hasta un 5 % del número total de nucleótidos en la secuencia de referencia.
En algunas realizaciones, dos ácidos nucleicos o polipéptidos de la invención son sustancialmente idénticos, lo que significa que tienen al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % y en algunas realizaciones al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad de residuos de nucleótidos o de aminoácidos, cuando se comparan y alinean para obtener una máxima correspondencia, tal como se mide mediante el uso de un algoritmo de comparación de secuencias o mediante inspección visual. En determinadas realizaciones, existe identidad en una región de las secuencias que tiene una longitud de al menos aproximadamente 10, aproximadamente 20, aproximadamente 40-60 residuos o cualquier valor entero intermedio, o puede ser en una región más larga de 60-80 residuos, al menos aproximadamente 90-100 residuos o las secuencias son sustancialmente idénticas en la longitud completa de las secuencias que se comparan, tal como la región codificadora de una secuencia de nucleótidos, por ejemplo.
Una “sustitución conservativa de aminoácidos” es una en la que un residuo de aminoácido se remplaza por otro residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares, que incluyen cadenas laterales básicas (p. ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (p. ej., asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (p. ej., glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales con ramificación beta (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por ejemplo, la sustitución de una fenilalanina por una tirosina es una sustitución conservativa. En determinadas realizaciones, las sustituciones conservativas en las secuencias de los polipéptidos y anticuerpos de la invención no suprimen la unión del polipéptido o anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos al o a los antígenos, es decir, el FOLR1 al que se une el polipéptido o anticuerpo. Se conocen en la técnica métodos para identificar sustituciones conservativas de nucleótidos y aminoácidos que no eliminan la unión al antígeno (véase, p. ej., Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1 187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999) y Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:.412-417 (1997)).
Tal y como se usan en la presente descripción y en las reivindicaciones, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen las formas plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.
Se entiende que donde sea que se describan las realizaciones en la presente memoria con la expresión "que comprende", también se proporcionan las realizaciones análogas descritas en términos de "que consiste en" y/o "que consiste esencialmente en".
El término "y/o" tal y como se usa en una frase tal como "A y/o B" en la presente memoria pretende incluir tanto "A y B", "A o B", "A" y "B". Asimismo, el término "y/o" tal y como se usa en una frase tal como "A, B y/o C" se pretende que englobe cada una de las siguientes realizaciones: A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo) y C (solo).
II. Agentes de unión a FOLR1
La presente invención proporciona agentes que se unen específicamente a FOLR1 humano. Estos agentes se refieren en la presente memoria como "agentes de unión a FOLR1". En determinadas realizaciones, los agentes de unión a FOLR1 son anticuerpos, inmunoconjugados o polipéptidos. Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos para el FOLR1 humano son conocidas en la técnica y también se proporcionan en la presente memoria según lo representado por la SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2.
Receptor 1 de folato humano:
MAQRMTTQLLLLLVWVAVVGEAQTRIAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEAH KDVSYLYRFNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQWWEDCRTS YTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNE EVARFYAAAMSGAGPWAAWPFLLSLALMLLWLLS (SEQ ID NO:1)
Secuencia de ácido nucleico del receptor 1 de folato humano:
atggctcagcggatgacaacacagctgctgctecttctagtgtgggtggctgtagtaggggaggctcagacaaggattgcatgggccaggactgagctteteaatgte tgcatgaacgccaagcaccacaaggaaaagccaggccccgaggacaagttgcatgagcagtgtcgaccctggaggaagaatgcctgctgttctaccaacacca gccaggaagcccataaggatgtttcctacctatatagattcaactggaaccactgtggagagatggcacctgcctgcaaacggcattteatecaggacacctgcctet acgagtgctcccccaacttggggccctggatccagcaggtggatcagagctggcgcaaagagcgggtactgaacgtgcccctgtgcaaagaggactgtgagcaa tggtgggaagattgtcgcacctcctacacctgcaagagcaactggcacaagggctggaactggacttcagggtttaacaagtgcgcagtgggagctgcctgccaac ctttccatttctacttccccacacccactgttctgtgcaatgaaatctggactcactcctacaaggtcagcaactacagccgagggagtggccgctgcatccagatgtgg ttcgacccagcccagggcaaccccaatgaggaggtggcgaggttctatgctgcagccatgagtggggctgggccctgggcagcctggcctttectgcttagcctggc cctaatgctgctgtggctgctcagc (SEQ ID NO:2)
Por lo tanto, en algunas realizaciones, los agentes de unión a FOLR1 se pueden unir a un epítopo de la SEQ ID NO:1. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-FOLR1 puede unirse específicamente a un epítopo de FOLR1 (SEQ ID NO:1), en donde el epítopo comprende un aminoácido N-glicosilado. Dichos anticuerpos, por lo tanto, se unirán a FOLR1 cuando esté glicosilado y no se unirán a FOLR1 cuando no esté glicosilado. En otras palabras, la unión de estos anticuerpos es dependiente del glicol. Estos anticuerpos son ventajosos, dado que pueden usarse para distinguir entre las formas glicosiladas y no glicosiladas de FOLR1. Dado que la glicosilación puede ser necesaria para la localización en la membrana, los anticuerpos pueden usarse ventajosamente para la tinción específica de membrana. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-FOLR1 puede unirse específicamente a un epítopo de FOLR1 que comprende el aminoácido 69 N-glicosilado de FOLR1. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-FOLR1 puede unirse específicamente a un epítopo de FOLR1 que comprende el aminoácido 161 N-glicosilado de FOLR1. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-FOLR1 puede unirse específicamente a un epítopo de FOLR1 que comprende el aminoácido 201 N-glicosilado de FOLR1.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-FOLR1 es el anticuerpo producido por el hibridoma depositado en la American Type Culture Collection (ATcC), ubicada en 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110 el 16 de abril de 2013 de conformidad con los términos del Tratado de Budapest y que tiene el no. de depósito de ATCC PTA-120196 (“FOLR1-9.20”, también referido como “IMGN 353.9-20”, “353.9-20” o “9.20”). En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-FOLR1 es el anticuerpo producido por el hibridoma depositado en la ATCC el 16 de abril de 2013 y que tiene el no. de depósito de ATCC PtA-120197 (“FOLR1-2.1”, también referido como “ IMGN 353.2-1”, “353.2-1”, “2.1” o “muFRIHC2-1”).
Los agentes de unión a FOLR1 incluyen agentes de unión a FOLR1 que comprenden las secuencias de CDR de cadena pesada y ligera de (i) muFRIHC2-1, que también se conoce como “FOLR1-2.1”, “ IMGN 353.2-1”, “353.2-1” o “2.1”, (ii) muFRIHC5-7, que también se conoce como “IMGN 353.5-7”, “353.5-7” o “5.7”, (iii) “muFRIHC9-20”, que también se conoce como “FOLR1-9.20”, “ IMGN 353.9-20”, “353.9-20” o “9.20”, (iv) huFRIHC2-1 modificado en superficie, versión 1.0 o 1.01, o (v) huFRIHC2-1 con injerto de CDR, versión 1.0 o 1.01, los cuales se proporcionan en las Tablas 1 y 2 a continuación. Los agentes de unión a FOLR1 también incluyen agentes de unión a FOLR1 que comprenden las secuencias de CDR de cadena pesada y ligera de las CDR compuestas proporcionadas en las Tablas 1 y 2 a continuación:
T l 1 n i min i DR n ri l
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T l 2 n i min i DR n li r ri l
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Las moléculas de unión a FOLR1 pueden ser anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a FOLR1, que comprenden las CDR del anticuerpo 2.1 (es decir, las SEQ ID NO: 3-8), 5.7 (es decir, las SEQ ID NO: 9-14) o 9.20 (es decir, las SEQ ID NO: 15-20), con hasta cuatro (es decir, 0, 1, 2, 3 o 4) sustituciones conservativas de aminoácidos por CDR. Las moléculas de unión a FOLR1 pueden ser anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a FOLR1, que comprenden las CDR de la secuencia compuesta que se mostró anteriormente (es decir, las SEQ ID NO: 21-26), con hasta cuatro (es decir, 0, 1, 2, 3 o 4) sustituciones conservativas de aminoácidos por CDR.
Las moléculas de unión a FOLR1 pueden ser anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a FOLR1, que comprenden las CDR del anticuerpo producido mediante el hibridoma del no. de depósito de la ATCC PTA-120196 o PTA-120197.
Los polipéptidos pueden comprender una de las cadenas ligeras variables o cadenas pesadas variables individuales que se describen en la presente memoria. Los anticuerpos y polipéptidos también pueden comprender tanto una cadena ligera variable como una cadena pesada variable. Las secuencias de cadena ligera variable y cadena pesada variable de los anticuerpos murinos 2.1, 5.7 y 9.20 y 2.1 humanizado se proporcionan en las Tablas 3 y 4 a continuación.
T l ^ n i min i n ri l
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T l 4 n i min i n li r ri l
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También se proporcionan polipéptidos que comprenden: (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO:27, 29, 31, 62 o 65; y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO:28, 30, 32, 63, 64, 66 o 67. En determinadas realizaciones, el polipéptido comprende un polipéptido que tiene al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO:27-32 o 62-67. Por lo tanto, en determinadas realizaciones, el polipéptido comprende (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente un 95 % de identidad de secuencia con las SEQ ID n O:27, 29, 31, 62 o 65, y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente un 95 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO:28, 30, 32, 63, 64, 66 o 67. En determinadas realizaciones, el polipéptido comprende (a) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO:27, 29, 31, 62 o 65; y/o (b) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO:28, 30, 32, 63, 64, 66 o 67. En determinadas realizaciones, el polipéptido es un anticuerpo y/o el polipéptido se une específicamente a FOLR1. En determinadas realizaciones, el polipéptido es un anticuerpo murino, quimérico o humanizado que se une específicamente a FOLR1. En determinadas realizaciones, el polipéptido que tiene un determinado porcentaje de identidad de secuencia con las SEQ ID NO:27-32 o 62-67 difiere de las SEQ ID NO:27-32 o 62-67 solo por sustituciones conservativas de aminoácidos.
También se proporcionan polipéptidos que comprenden una cadena ligera variable que es al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o al menos aproximadamente un 99 %, o es idéntica a la secuencia de cadena ligera variable del anticuerpo producido mediante el hibridoma que tiene el no. de depósito de la ATCC PTA-120196 o PTA-120197.
También se proporcionan polipéptidos que comprenden una cadena pesada variable que es al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o al menos aproximadamente un 99 %, o es idéntica a la secuencia de cadena pesada variable del anticuerpo producido mediante el hibridoma que tiene el no. de depósito de la ATCC PTA-120196 o PTA-120197.También se proporcionan anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que comprenden secuencias de cadena pesada variable y ligera variable que son al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o al menos aproximadamente un 99 %, o idénticas a las secuencias de cadena pesada variable y ligera variable del anticuerpo producido mediante el hibridoma que tiene el no. de depósito de la ATCC PTA-120196 o PTA-120197.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es el anticuerpo producido mediante el hibridoma que tiene el no. de depósito de la ATCC PTA-120196 o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En determinadas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es el anticuerpo producido mediante el hibridoma que tiene el no. de depósito de la ATCC PTA-120197 o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Los polipéptidos pueden comprender una de las cadenas ligeras o cadenas pesadas individuales que se describen en la presente memoria. Los anticuerpos y polipéptidos también pueden comprender tanto una cadena ligera como una cadena pesada. Las secuencias de cadena ligera y cadena pesada de los anticuerpos de 2.1, 5.7 y 9.20 se proporcionan en las Tablas 5 y 6 a continuación.
T l n i min i n l n i m l
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continuación
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T l n i min i n li r l n i m l
Figure imgf000030_0002
También se proporcionan polipéptidos que comprenden: (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO:33, 35 o 37; y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO:34, 36 o 38. En determinadas realizaciones, el polipéptido comprende un polipéptido que tiene al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO:33-38. Por lo tanto, en determinadas realizaciones, el polipéptido comprende (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente un 95 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO:33, 35 o 37, y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente un 95 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO:34, 36 o 38. En determinadas realizaciones, el polipéptido comprende (a) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO:33, 35 o 37; y/o (b) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO:34, 36 o 38. En determinadas realizaciones, el polipéptido es un anticuerpo y/o el polipéptido se une específicamente a FOLR1. En determinadas realizaciones, el polipéptido es un anticuerpo murino, quimérico o humanizado que se une específicamente a FOLR1. En determinadas realizaciones, el polipéptido que tiene un determinado porcentaje de identidad de secuencia con las SEQ ID NO:33-38 difiere de las SEQ ID NO:33-38 solo por sustituciones conservativas de aminoácidos.
También se proporcionan polipéptidos que comprenden una cadena ligera que es al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o al menos aproximadamente un 99 %, o es idéntica a la secuencia de cadena ligera del anticuerpo producido mediante el hibridoma que tiene el no. de depósito de la ATCC PTA-120196 o PTA-120197.
También se proporcionan polipéptidos que comprenden una cadena pesada que es al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o al menos aproximadamente un 99 %, o es idéntica a la secuencia de cadena pesada del anticuerpo producido mediante el hibridoma que tiene el no. de depósito de la ATCC PTA-120196 o PTA-120197.
También se proporcionan anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que comprenden secuencias de cadena pesada y ligera que son al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o al menos aproximadamente un 99 %, o idénticas a las secuencias de cadena pesada y ligera del anticuerpo producido mediante el hibridoma que tiene el no. de depósito de la ATCC PTA-120196 o PTA-120197.
La afinidad o avidez de un anticuerpo para un antígeno se puede determinar de forma experimental mediante el uso de cualquier método adecuado conocido en la técnica, p. ej., citometría de flujo, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o radioinmunoensayo (RIA), o cinética (p. ej., análisis BIACORE™). Se pueden emplear fácilmente los ensayos de unión directa, así como los formatos de ensayo de unión competitiva. (Véase, por ejemplo, Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions", En Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: Nueva York, N.Y. (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: Nueva York, N.Y. (1992); y los métodos descritos en la presente memoria. La afinidad medida de una interacción de anticuerpo-antígeno particular puede variar si se mide en diferentes condiciones (p. ej., concentración de sal, pH, temperatura). Por lo tanto, las mediciones de afinidad y otros parámetros de unión al antígeno (p. ej., KD o Kd, Kasoc, Kdisoc) se realizan con disoluciones estandarizadas de anticuerpo y antígeno, y un tampón estandarizado, tal como se conoce en la técnica y tal como se describe el tampón en la presente memoria.
En un aspecto, los ensayos de unión se pueden realizar mediante el uso de citometría de flujo en las células que expresan el antígeno FOLR1 en la superficie. Por ejemplo, las células positivas para FOLR1 tales como SKOV3 pueden incubarse con concentraciones variadas de anticuerpos anti-FOLR1 mediante el uso de 1 x 105 células por muestra en 100 pL de tampón FACS (medio RPMI-1640 suplementado con suero de cabra normal al 2 %). Después, las células pueden sedimentarse, lavarse e incubarse durante 1 h con 100 pL de anticuerpo IgG de cabra anti-humano o de cabra anti-ratón conjugado con FITC (el cual se puede obtener, por ejemplo, de Jackson Laboratory, 6 pg/mL en tampón de FACS). Las células se sedimentan entonces una vez más, se lavan con tampón de FACS y se resuspenden en 200 pl de PBS que contiene formaldehído al 1 %. Las muestras se pueden adquirir, por ejemplo, mediante el uso de un citómetro de flujo FACSCalibur con el muestreador de múltiples pocillos de HTS y se analizan mediante el uso de CellQuest Pro (todos de BD Biosciences, San Diego, EE. UU.). Para cada muestra, la intensidad media de fluorescencia para FL1 (MFI) se puede exportar y representar gráficamente frente a la concentración de anticuerpo en un gráfico semilogarítmico para generar una curva de unión. Se ajusta una curva de respuesta a la dosis sigmoidea para las curvas de unión y los valores de CE50 se calculan mediante el uso de programas tales como GraphPad Prism v4 con parámetros por defecto (software GraphPad, San Diego, CA). Los valores de CE50 se pueden utilizar como una medida para la constante de disociación aparente "Kd" o "KD" para cada anticuerpo.
Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar mediante el uso de métodos de hibridoma, tales como los descritos por Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495. Mediante el uso del método del hibridoma, se inmuniza un ratón, hámster u otro animal huésped adecuado para incitar la producción por los linfocitos de anticuerpos, los cuales se unirán específicamente a un antígeno inmunizante. Los linfocitos también se pueden inmunizar in vitro. Después de la inmunización, los linfocitos se aíslan y fusionan con una línea celular de mieloma adecuada mediante el uso de, por ejemplo, polietilenglicol, para formar células de hibridoma que se pueden seleccionar entonces de las células de mieloma y linfocitos no fusionados. Los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales dirigidos específicamente contra un antígeno seleccionado según se determina por inmunoprecipitación, inmunotransferencia o por un ensayo de unión in vitro (p. ej., radioinmunoensayo (RIA), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)) se pueden propagar en cultivo in vitro mediante el uso de métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986) o in vivo como tumores de ascitis en un animal. Los anticuerpos monoclonales se pueden purificar entonces a partir del medio de cultivo o fluido de ascitis tal como se describe para los anticuerpos policlonales.
De manera alternativa, los anticuerpos monoclonales también se pueden preparar mediante el uso de métodos de ADN recombinante tal como se describe en la Patente de EE. UU. 4.816.567. Los polinucleótidos que codifican un anticuerpo monoclonal se aíslan de células B maduras o células de hibridoma, tal como por RT-PCR mediante el uso de cebadores de oligonucleótidos que amplifican específicamente los genes que codifican las cadenas ligera y pesada del anticuerpo, y su secuencia se determina mediante el uso de procedimientos convencionales. Los polinucleótidos aislados que codifican las cadenas ligera y pesada se clonan entonces en vectores de expresión adecuados que, cuando se transfectan en células huésped, tales como las células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma, que de otra forma no producen proteína de inmunoglobulina, las células huésped generan anticuerpos monoclonales. Además, los anticuerpos monoclonales recombinantes o fragmentos de los mismos de las especies deseadas se pueden aislar de las bibliotecas de exposición de fagos que expresan las CDR de las especies deseadas, como se describe (McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554; Clackson et al., 1991, Nature, 352:624-628; y Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581-597).
El o los polinucleótidos que codifican un anticuerpo monoclonal se pueden modificar adicionalmente de distintas maneras mediante el uso de tecnología de ADN recombinante para generar anticuerpos alternativos. En algunas realizaciones, los dominios constantes de las cadenas ligera y pesada de, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de ratón, se pueden sustituir 1) por las regiones de, por ejemplo, un anticuerpo humano para generar un anticuerpo quimérico o 2) por un polipéptido distinto de inmunoglobulina para generar un anticuerpo de fusión. En algunas realizaciones, las regiones constantes se truncan o se eliminan para generar el fragmento de anticuerpo deseado de un anticuerpo monoclonal. Se puede usar mutagénesis dirigida al sitio o de alta densidad de la región variable para optimizar la especificidad, afinidad, etc. de un anticuerpo monoclonal.
En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal contra FOLR1 humano es un anticuerpo humanizado. En determinadas realizaciones, dichos anticuerpos se utilizan terapéuticamente para reducir la antigenicidad y las respuestas de HAMA (anticuerpo anti-ratón humano) cuando se administran a un sujeto humano.
Los métodos para diseñar por ingeniería, humanizar o modificar en superficie anticuerpos no humanos o humanos también se pueden utilizar y son conocidos en la técnica. Un anticuerpo humanizado, modificado en superficie o diseñado por ingeniería similarmente puede tener uno o más residuos de aminoácidos de una fuente que no es humana, p. ej., pero no limitado a, de ratón, rata, conejo, primate no humano u otro mamífero. Estos residuos de aminoácidos no humanos son reemplazados por residuos que usualmente son denominados residuos de "importación", que se toman típicamente de un dominio constante, variable de "importación" u otro domino de una secuencia humana conocida.
Dichas secuencias importadas se pueden utilizar para reducir la inmunogenicidad o para reducir, aumentar o modificar la unión, afinidad, tasa de asociación, tasa de disociación, avidez, especificidad, semivida y cualquier otra característica adecuada, como se conoce en la técnica. En general, los residuos de CDR están directamente y más sustancialmente implicados en influir en la unión a FOLR1. Por consiguiente, parte o la totalidad de las secuencias de CDR humanas o no humanas se mantienen, mientras que las secuencias no humanas de las regiones constante y variable se pueden reemplazar con aminoácidos humanos u otros.
Opcionalmente los anticuerpos pueden ser anticuerpos humanizados, modificados en superficie, diseñados por ingeniería o humanos diseñados por ingeniería con retención de alta afinidad para el antígeno FOLR1 y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, los anticuerpos anti-FOLR1 diseñados por ingeniería o humanizados (o humanos) y los anticuerpos modificados en superficie se pueden preparan opcionalmente mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y varios productos humanizados y diseñados por ingeniería conceptuales mediante el uso de modelos tridimensionales de las secuencias parentales, diseñadas por ingeniería y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales están disponibles comúnmente y son conocidos para los expertos en la técnica. Hay disponibles programas informáticos que ilustran y muestran estructuras de conformación tridimensional probables de secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. La inspección de estas visualizaciones permite el análisis del posible rol de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata de unirse a su antígeno, tal como FOLR1. De esta forma, los residuos marco (FR) se pueden seleccionar y combinar a partir de las secuencias de consenso e importación, de forma tal que se logre la característica del anticuerpo deseada, tal como una mejor afinidad por el o los antígenos diana.
La humanización, modificación en superficie o diseño por ingeniería de los anticuerpos de la presente invención se puede realizar mediante el uso de cualquier método conocido, tal como, pero no limitado a, aquellos descritos en Winter (Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), Pat. de EE. UU. No.
5.639.641, 5.723.323; 5.976.862; 5.824.514; 5.817.483; 5.814.476; 5.763.192; 5.723.323; 5.766.886; 5.714.352; 6.204.023; 6.180.370; 5.693.762; 5.530.101; 5.585.089; 5.225.539; 4.816.567; PCT/: US98/16280; US96/18978; US91/09630; US91/05939; US94/01234; GB89/01334; GB91/01134; GB92/01755; WO90/14443; WO90/14424; WO90/14430; EP 229246; 7.557.189; 7.538.195; y 7.342.110, cada una de las cuales se incorpora totalmente en la presente memoria por referencia, incluyendo las referencias citadas en las mismas.
En determinadas realizaciones alternativas, el anticuerpo frente a FOLR1 es un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanos se pueden preparar directamente mediante el uso de diversas técnicas conocidas en la técnica. Se pueden generar linfocitos B humanos inmortalizados inmunizados in vitro o aislados de un individuo inmunizado que produce un anticuerpo dirigido contra un antígeno diana (véase, p. ej., Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95; y la Patente de EE. UU. 5.750.373). Además, el anticuerpo humano se puede seleccionar de una biblioteca de fagos, donde dicha biblioteca de fagos expresa anticuerpos humanos, como se describe, por ejemplo, en Vaughan et al., 1996, Nat. Biotech., 14:309-314, Sheets et al., 1998, Proc. Nat'l. Acad. Sci., 95:6157-6162, Hoogenboom y Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381, y Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Las técnicas para la generación y uso de bibliotecas de fagos de anticuerpos también se describen en las Patentes de EE. UU. No. 5.969.108, 6.172.197, 5.885.793, 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915; 6.593.081; 6.300.064; 6.653.068; 6.706.484 y 7.264.963; y Rothe et al., 2007, J. Mol. Bio., doi:10.1016/j.jmb.2007.12.018 (cada una de las cuales se incorpora a la presente memoria en su totalidad por referencia). Las estrategias de maduración de la afinidad y las estrategias de transposición de cadenas (Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10:779-783, que se incorpora en su totalidad por referencia), son conocidas en la técnica y pueden emplearse para generar anticuerpos humanos de alta afinidad.
Los anticuerpos humanizados también se pueden preparar en ratones transgénicos que contienen loci de inmunoglobulina humana que, tras la inmunización, pueden producir el repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de la producción endógena de inmunoglobulinas. Este enfoque se describe en las Patentes de EE. UU.
5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425 y 5.661.016.
En determinadas realizaciones, se proporciona un fragmento de anticuerpo para, por ejemplo, aumentar la penetración en el tumor. Se conocen varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivan por medio de la digestión proteolítica de anticuerpos intactos (por ejemplo, Morimoto et al., 1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117; Brennan et al., 1985, Science, 229:81). En determinadas realizaciones, los fragmentos de anticuerpo se producen de manera recombinante. Los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv y scFv se pueden expresar todos en y secretar a partir de E. coli u otras células huésped, lo cual permite la producción de grandes cantidades de estos fragmentos. Dichos fragmentos de anticuerpo también se pueden aislar de bibliotecas de fagos de anticuerpo. El fragmento de anticuerpo también puede ser anticuerpos lineales tal como se describe en la Patente de EE. UU. 5.641.870, por ejemplo, y puede ser monoespecífico o biespecífico. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán evidentes para el practicante capacitado.
Para los propósitos de la presente invención, debe apreciarse que los anticuerpos modificados pueden comprender cualquier tipo de región variable que proporcione la asociación del anticuerpo con los polipéptidos de un FOLR1 humano. En este sentido, la región variable puede comprender o derivar de cualquier tipo de mamífero al que se puede inducir para que produzca una respuesta humoral y genere inmunoglobulinas contra el antígeno asociado al tumor deseado. Como tal, la región variable de los anticuerpos modificados puede ser, por ejemplo, de origen humano, murino, de primate no humano (p. ej., de monos cinomolgos, macacos, etc.) o lupino. En algunas realizaciones, tanto las regiones variables como las constantes de las inmunoglobulinas modificadas son humanas. En otras realizaciones, las regiones variables de anticuerpos compatibles (en general derivadas de una fuente no humana) se pueden diseñar por ingeniería o adaptarse específicamente para mejorar las propiedades de unión o reducir la inmunogenicidad de la molécula. A este respecto, las regiones variables útiles en la presente invención se pueden humanizar o alterar de otro modo a través de la inclusión de secuencias de aminoácidos importadas.
En determinadas realizaciones, los dominios variables tanto en la cadena pesada como en la ligera están alterados por el reemplazo al menos parcial de una o más CDR y, de ser necesario, por el reemplazo parcial de la región marco y modificación de la secuencia. Aunque las CDR pueden derivar de un anticuerpo de la misma clase o incluso subclase que el anticuerpo a partir del cual derivan las regiones marco, se prevé que las CDR derivarán de un anticuerpo de una clase diferente y en determinadas realizaciones de un anticuerpo de una especie diferente. Puede no ser necesario reemplazar todas las CDR por las CDR completas de la región variable donante para transferir la capacidad de unión al antígeno de un dominio variable a otro. En cambio, solo puede ser necesario transferir aquellos residuos que son necesarios para mantener la actividad del sitio de unión al antígeno. Dadas las explicaciones proporcionadas en las Pat. de EE. UU. No. 5.585.089, 5.693.761 y 5.693.762, será competencia de los expertos en la técnica, ya sea realizando experimentos rutinarios o mediante el método de ensayo y error, obtener un anticuerpo funcional con inmunogenicidad reducida.
A pesar de las alteraciones a la región variable, los expertos en la técnica entenderán que los anticuerpos modificados de esta invención comprenderán los anticuerpos (p. ej., los anticuerpos de longitud completa o los fragmentos inmunorreactivos de los mismos) en los que al menos una fracción de uno o más de los dominios de la región constante han sido eliminados o de otro modo alterados para proporcionar las características bioquímicas deseadas, tales como el aumento de la ubicación en el tumor o la reducción de la semivida sérica cuando se compara con un anticuerpo de aproximadamente la misma inmunogenicidad que comprende una región constante nativa o inalterada. En algunas realizaciones, la región constante de los anticuerpos modificados comprenderá una región constante humana. Las modificaciones de la región constante compatibles con esta invención comprenden adiciones, deleciones o sustituciones de uno o más aminoácidos en uno o más dominios. Es decir, los anticuerpos modificados descritos en la presente memoria pueden comprender alteraciones o modificaciones en uno o más de los tres dominios constantes de cadena pesada (CH1, CH2 o CH3) y/o el dominio constante de cadena ligera (CL). En algunas realizaciones, se contemplan regiones constantes modificadas en donde uno o más dominios se delecionan parcial o totalmente. En algunas realizaciones, los anticuerpos modificados comprenderán construcciones o variantes con el dominio delecionado en donde se ha eliminado todo el dominio de CH2 (construcciones ACH2). En algunas realizaciones, el dominio de región constante omitido se reemplazará con un espaciador de aminoácidos corto (p. ej., 10 residuos) que proporciona parte de la flexibilidad molecular típicamente impartida por la región constante ausente.
Se observará que en determinadas realizaciones, los anticuerpos modificados se pueden diseñar por ingeniería para que fusionen el dominio CH3 directamente con la región bisagra de los anticuerpos modificados respectivos. En otras construcciones, puede ser deseable proporcionar un espaciador de péptido entre la región bisagra y los dominios CH2 y/o CH3 modificados. Por ejemplo, se podrían expresar construcciones compatibles en donde se ha delecionado el dominio CH2 y el dominio CH3 restante (modificado o no modificado) se une a la región bisagra con un espaciador de 5-20 aminoácidos. Dicho espaciador se puede añadir, por ejemplo, para asegurar que los elementos reguladores del dominio constante permanezcan libres y accesibles o que la región bisagra permanezca flexible. Sin embargo, debe indicarse que los espaciadores de aminoácidos pueden, en algunos casos, demostrarse inmunogénicos y pueden incitar respuestas inmunes no deseadas contra la construcción. Por consiguiente, en determinadas realizaciones, cualquier espaciador que se añada a la construcción será relativamente no inmunogénico, o incluso se omitirá por completo, de manera de que mantengan las cualidades bioquímicas deseadas de los anticuerpos modificados.
Aparte de la deleción de los dominios completos de región constante, se apreciará que los anticuerpos de la presente invención se pueden proporcionar mediante la deleción o sustitución parcial de unos pocos aminoácidos o incluso un único aminoácido. Por ejemplo, la mutación de un solo aminoácido en áreas seleccionadas del dominio CH2 puede ser suficiente como para reducir de manera sustancial la unión de Fc y de esa manera aumentar la ubicación en el tumor. De modo similar, puede ser deseable delecionar simplemente esa parte de uno o más dominios de región constante que controlan la función efectora (p. ej., unión de complemento C1Q) que se va a modular. Dichas deleciones parciales de las regiones constantes pueden mejorar las características seleccionadas del anticuerpo (semivida sérica), mientras se dejan intactas otras funciones deseables asociadas con el dominio de la región constante objeto. Además, tal como se mencionó anteriormente, las regiones constantes de los anticuerpos descritos se pueden modificar mediante la mutación o sustitución de uno o más aminoácidos, que mejoran el perfil de la construcción resultante. En este sentido, puede ser posible la interrupción de la actividad proporcionada por un sitio de unión conservado (p. ej., la unión de Fc), mientras se mantienen de manera sustancial la configuración y el perfil inmunogénico del anticuerpo modificado. Determinadas realizaciones pueden comprender la adición de uno o más aminoácidos a la región constante para mejorar las características deseables, tales como la disminución o el incremento de la función efectora o para proporcionar más uniones de citotoxinas o carbohidratos. En dichas realizaciones, puede ser deseable la inserción o replicación de secuencias específicas derivadas de los dominios de regiones constantes seleccionados.
La presente invención engloba además variantes y equivalentes que son sustancialmente homólogos a los anticuerpos quiméricos, humanizados y humanos, o fragmentos de anticuerpo de los mismos, mostrados en la presente memoria. Estos pueden contener, por ejemplo, mutaciones de sustitución conservativa, es decir, la sustitución de uno o más aminoácidos por aminoácidos similares. Por ejemplo, la sustitución conservativa se refiere a la sustitución de un aminoácido por otro dentro de la misma clase general, tal como, por ejemplo, un aminoácido ácido por otro aminoácido ácido, un aminoácido básico por otro aminoácido básico o un aminoácido neutro por otro aminoácido neutro. Se conoce bien en la técnica lo que se pretende con una sustitución conservativa de aminoácidos.
Los polipéptidos de la presente invención pueden ser polipéptidos recombinantes, polipéptidos naturales o polipéptidos sintéticos que comprenden un anticuerpo, o fragmento del mismo, contra un FOLR1 humano. Se reconocerá en la técnica que algunas secuencias de aminoácidos de la invención pueden variarse sin efecto significativo de la estructura o función de la proteína. Por lo tanto, la invención incluye además variaciones de los polipéptidos que muestran actividad sustancial o que incluyen regiones de un anticuerpo, o fragmento del mismo, contra una proteína del receptor de folato humano. Dichos mutantes incluyen deleciones, inserciones, inversiones, repeticiones y sustituciones de tipo.
Los polipéptidos y análogos se pueden modificar adicionalmente para contener restos químicos adicionales que no son normalmente parte de la proteína. Estos restos derivatizados pueden mejorar la solubilidad, la semivida biológica o la absorción de la proteína. Los restos también pueden reducir o eliminar todo efecto secundario deseable de las proteínas y similares. Un resumen de dichos restos se puede encontrar en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 20a ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000).
Los polipéptidos aislados descritos en la presente memoria se pueden producir mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. Dichos métodos oscilan entre métodos sintéticos de proteínas directos hasta la construcción de una secuencia de ADN que codifica secuencias de polipéptido aisladas y expresar estas secuencias en un huésped transformado adecuado. En algunas realizaciones, se construye una secuencia de ADN mediante el uso de tecnología recombinante aislando o sintetizando una secuencia de ADN que codifica una proteína de tipo salvaje de interés. Opcionalmente, la secuencia se puede mutagenizar por medio de mutagénesis específica de sitio para proporcionar análogos funcionales de la misma. Véase, p. ej., Zoeller et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81:5662-5066 (1984) y la Pat. de EE. UU. No. 4.588.585.
En algunas realizaciones, se podría construir una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de interés mediante síntesis química mediante el uso de un sintetizador de oligonucleótidos. Dichos oligonucleótidos se pueden diseñar sobre la base de la secuencia de aminoácidos del polipéptido deseado y seleccionando aquellos codones que son favorecidos en la célula huésped en la que se producirá el polipéptido recombinante de interés. Se pueden aplicar métodos estándar para sintetizar una secuencia de polinucleótidos aislada que codifica un polipéptido aislado de interés. Por ejemplo, se puede usar una secuencia completa de aminoácidos para construir un gen retrotraducido. Además, se puede sintetizar un oligómero de ADN que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido aislado en particular. Por ejemplo, se pueden sintetizar y luego ligar varios oligonucleótidos pequeños que codifican partes del polipéptido deseado. Típicamente, los oligonucleótidos individuales contienen protuberancias en 5' o 3' para el ensamblaje complementario.
Una vez ensamblados (por medio de síntesis, mutagénesis dirigida a sitio u otro método), las secuencias de polinucleótidos que codifican un polipéptido aislado particular de interés se insertarán en un vector de expresión y se unirán operativamente a una secuencia de control de la expresión adecuada para la expresión de la proteína en un huésped deseado. Se puede confirmar el ensamblaje adecuado por medio de secuenciación de nucleótidos, mapeo de restricción y expresión de un polipéptido biológicamente activo en un huésped adecuado. Tal y como se conoce en la técnica, con el fin de obtener niveles elevados de expresión de un gen transfectado en un huésped, el gen debe encontrarse unido operativamente a las secuencias de control de la expresión de transcripción y traducción que son funcionales en el huésped de expresión elegido.
En determinadas realizaciones, se utilizan vectores de expresión recombinantes para amplificar y expresar el ADN que codifica los anticuerpos, o fragmentos de los mismos, contra FOLR1 humano. Los vectores de expresión recombinantes son construcciones de ADN replicables que tienen fragmentos de ADN sintético o derivados de ADNc que codifican una cadena de polipéptido de un anticuerpo anti-FOLR1, o fragmento del mismo, unido operativamente a elementos adecuados de regulación de la transcripción o traducción que derivan de genes de mamíferos, microbios, virus o insectos. En general, una unidad de transcripción comprende un ensamblaje de (1) un elemento o elementos genéticos que desempeñan un papel regulador en la expresión génica, por ejemplo, promotores o potenciadores de la transcripción, (2) una secuencia estructural o codificadora que se transcribe en ARNm y se traduce en una proteína y (3) secuencias adecuadas de iniciación y terminación de la transcripción y traducción. Dichos elementos de regulación pueden incluir una secuencia operadora para controlar la transcripción. Asimismo, se puede incorporar adicionalmente la capacidad de replicarse en un huésped, normalmente conferida por un origen de replicación, y un gen de selección para facilitar el reconocimiento de los transformantes. Las regiones de ADN se encuentran "unidas operativamente" cuando están relacionadas funcionalmente entre sí. Por ejemplo, el ADN de un péptido señal (líder de secreción) se encuentra unido operativamente al ADN de un polipéptido si se expresa como precursor que participa en la secreción del polipéptido; un promotor está unido operativamente a una secuencia codificadora si controla la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a un ribosoma se encuentra unido operativamente a una secuencia codificadora si se posiciona de manera que se permita la traducción. Los elementos estructurales destinados a ser utilizados en los sistemas de expresión de levadura incluyen una secuencia líder que permite la secreción extracelular de proteínas traducidas por una célula huésped. De manera alternativa, cuando la proteína recombinante se expresa sin una secuencia líder o de transporte, puede incluir un residuo de metionina N-terminal. Opcionalmente, este residuo se puede escindir posteriormente a partir de la proteína recombinante expresada para proporcionar un producto final. La elección de la secuencia de control de la expresión y del vector de expresión dependerá de la elección del huésped. Se puede emplear una amplia variedad de combinaciones de vector/huésped de expresión. Los vectores de expresión útiles para huéspedes eucariotas incluyen, por ejemplo, vectores que comprenden secuencias de control de la expresión de SV40, virus de papiloma bovino, adenovirus y citomegalovirus. Los vectores de expresión útiles para huéspedes bacterianos incluyen plásmidos bacterianos conocidos, tales como plásmidos de Esherichia coli, que incluyen pCR1, pBR322, pMB9 y sus derivados, plásmidos de rango más amplio de huéspedes, tal como M13 y fagos filamentosos de ADN de cadena simple.
Las células huésped adecuadas para la expresión de un polipéptido de unión a FOLR1 o anticuerpo (o una proteína FOLR1 para su uso como un antígeno) incluyen células procariotas, de levadura, de insecto o eucariotas superiores bajo el control de promotores adecuados. Las procariotas incluyen organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo, E. coli o bacilos. Las células eucariotas superiores incluyen líneas celulares establecidas de origen mamífero. También podrían utilizarse sistemas de traducción libres de células. Los vectores de clonación y de expresión adecuados para su uso con huéspedes celulares bacterianos, fúngicos, de levadura y de mamífero se describen por Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985), cuya descripción relevante se incorpora en el presente documento por referencia. La información adicional con respecto a los métodos de producción de proteínas, incluyendo la producción de anticuerpos, se puede encontrar, p. ej., en la Publicación de Patente de EE. UU. No. 2008/0187954, Patentes de EE. UU. No. 6.413.746 y 6.660.501, y Publicación de Patente Internacional No. WO 04009823, cada una de las cuales se incorpora en la presente memoria en su totalidad por referencia.
También se emplean ventajosamente varios sistemas de cultivo de células de mamífero o insecto para expresar proteínas recombinantes. Se puede realizar la expresión de proteínas recombinantes en células de mamífero debido a que dichas proteínas generalmente se encuentran correctamente plegadas, adecuadamente modificadas y son completamente funcionales. Los ejemplos de líneas celulares huésped de mamífero adecuadas incluyen HEK-293 y HEK-293T, las líneas COS-7 de células de riñón de mono, descritas por Gluzman (Cell 23:175, 1981), y otras líneas celulares que incluyen, por ejemplo, células L, líneas celulares de C127, 3T3, ovario de hámster chino (CHO), HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamíferos pueden comprender elementos no transcritos, tales como un origen de replicación, un promotor y un potenciador adecuados unidos al gen que se va a expresar y otras secuencias flanqueantes en 5' o 3' no transcriptas, y secuencias en 5' o 3' no traducidas, tales como sitios de unión al ribosoma necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios donantes y aceptores de corte y empalme y secuencias de terminación de la transcripción. Los sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insecto se examinan en Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47 (1988).
Las proteínas producidas por un huésped transformado se pueden purificar de acuerdo con cualquier método adecuado. Dichos métodos estándar incluyen cromatografía (p. ej., cromatografía en columna de intercambio iónico, de afinidad y de exclusión por tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial o mediante cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Las etiquetas de afinidad, tales como hexahistidina, dominio de unión a maltosa, secuencia de recubrimiento de influenza y glutatión S-transferasa, se pueden unir a la proteína para permitir una fácil purificación al pasar por una columna de afinidad adecuada. Asimismo, las proteínas aisladas pueden caracterizarse físicamente mediante el uso de técnicas tales como proteólisis, resonancia magnética nuclear y cristalografía de rayos X.
Por ejemplo, los sobrenadantes de sistemas que secretan proteínas recombinantes en medios de cultivo se pueden concentrar en primer lugar mediante el uso de un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Después de la etapa de concentración, se puede aplicar el concentrado a una matriz de purificación adecuada. De manera alternativa, se puede emplear una resina de intercambio aniónico, por ejemplo, una matriz o sustrato que tiene grupos dietilaminoetilo (DEAE) laterales. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos utilizados normalmente en la purificación de proteínas. De manera alternativa, se puede emplear una etapa de intercambio catiónico. Los intercambiadores catiónicos adecuados incluyen varias matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Por último, se pueden emplear una o más etapas de cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC) mediante el uso de medios hidrófobos de RP-HPLC, p. ej., gel de sílice con cadenas laterales metilo u otros grupos alifáticos, para purificar adicionalmente un agente de unión a FOLR1. Se pueden emplear también algunas o todas las etapas de purificación mencionadas anteriormente, en varias combinaciones, para proporcionar una proteína recombinante homogénea.
La proteína recombinante producida en cultivo bacteriano se puede aislar, por ejemplo, por extracción inicial de sedimentos celulares, seguido por una o más etapas de concentración, eliminación de sales, cromatografía de intercambio iónico acuoso o de exclusión por tamaño. También se puede usar cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para las etapas de purificación finales. Las células microbianas empleadas en la expresión de una proteína recombinante pueden disrumpirse por cualquier método conveniente, que incluye ciclo de congelacióndescongelación, sonicación, disrupción mecánica o el uso de agentes de lisado celular.
Los métodos conocidos en la técnica para purificar anticuerpos y otras proteínas también incluyen, por ejemplo, los que se describen en las Publicaciones de Patentes de EE. UU. No. 2008/0312425, 2008/0177048 y 2009/0187005, cada una de las cuales se incorpora en el presente documento en su totalidad por referencia.
III. Polinucleótidos
En determinadas realizaciones, la invención engloba polinucleótidos que comprenden polinucleótidos que codifican un polipéptido que se une específicamente a un receptor FOLR1 humano o un fragmento de dicho polipéptido. Por ejemplo, la invención proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo frente a un FOLR1 humano o codifica un fragmento de dicho anticuerpo. Los polinucleótidos de la invención pueden encontrarse en la forma de ARN o en la forma de ADN. El ADN incluye ADNc, ADN genómico y ADN sintético, y puede ser de cadena doble o de cadena simple, y, si es de cadena simple puede ser la cadena codificadora o la no codificadora (antisentido). En algunas realizaciones, el polinucleótido es un ADNc o un ADN que carece de uno o más intrones endógenos.
En algunas realizaciones, un polinucleótido es un polinucleótido de origen no natural. En algunas realizaciones, un polinucleótido se produce de forma recombinante.
En determinadas realizaciones, los polinucleótidos están aislados. En determinadas realizaciones, los polinucleótidos son sustancialmente puros. En algunas realizaciones, un polinucleótido se purifica a partir de componentes naturales. La invención proporciona un polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO:3-38 y 59-67. También se proporciona un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 % con las SEQ ID NO:3-38 y 59-67.
La invención proporciona además un polinucleótido que comprende una secuencia que se selecciona de las que se muestran en las Tablas 7 y 8 a continuación.
Tabla 7: Secuencias de polinucleótidos de cadena pesada variable
Figure imgf000037_0001
T l n i lin l i n li r ri l
Figure imgf000037_0002
continuación
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También se proporciona un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 % con una cualquiera de las SEQ ID NO:39-44.
También se proporcionan polinucleótidos que codifican una cadena ligera variable que es al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o al menos aproximadamente un 99 %, o es idéntica a la secuencia de cadena ligera variable del anticuerpo producido mediante el hibridoma que tiene el no. de depósito de la ATCC PTA-120196 o PTA-120197.
También se proporcionan polinucleótidos que comprenden una secuencia que codifica la cadena ligera variable que es al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o al menos aproximadamente un 99 %, o es idéntica a la secuencia que codifica la cadena ligera variable que codifica la cadena ligera variable del anticuerpo producido mediante el hibridoma que tiene el no. de depósito de la ATCC PTA-120196 o PTA-120197.
También se proporcionan polinucleótidos que codifican una cadena pesada variable que es al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o al menos aproximadamente un 99 %, o es idéntica a la secuencia de cadena pesada variable del anticuerpo producido mediante el hibridoma que tiene el no. de depósito de la ATCC PTA-120196 o PTA-120197.
También se proporcionan polinucleótidos que comprenden una secuencia que codifica la cadena pesada variable que es al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o al menos aproximadamente un 99 %, o es idéntica a la secuencia que codifica la cadena pesada variable que codifica la cadena pesada variable del anticuerpo producido mediante el hibridoma que tiene el no. de depósito de la ATCC PTA-120196 o PTA-120197.
En determinadas realizaciones, los polinucleótidos comprenden la secuencia codificadora para el polipéptido maduro fusionada en el mismo marco de lectura a un polinucleótido que asiste, por ejemplo, en la expresión y secreción de un polipéptido de una célula huésped (p. ej., una secuencia líder que funciona como secuencia secretora para controlar el transporte de un polipéptido desde la célula). El polipéptido que tiene una secuencia líder es una preproteína y la célula huésped puede escindir la secuencia líder para formar la forma madura del polipéptido. Asimismo, los polinucleótidos pueden codificar una proproteína que es la proteína madura más residuos de aminoácidos en 5' adicionales. Una proteína madura que tiene una prosecuencia es una proproteína y es una forma inactiva de la proteína. Una vez que se escinde la prosecuencia, permanece una proteína madura activa.
En determinadas realizaciones, los polinucleótidos comprenden la secuencia codificadora del polipéptido maduro fusionada en el mismo marco de lectura a una secuencia de marcador que permite, por ejemplo, la purificación del polipéptido codificado. Por ejemplo, la secuencia de marcador puede ser una etiqueta de hexa-histidina proporcionada por un vector pQE-9 para proporcionar la purificación del polipéptido maduro fusionado al marcador en el caso de un huésped bacteriano, o la secuencia de marcador puede ser una etiqueta de hemaglutinina (HA) derivada de la proteína hemaglutinina de influenza cuando se usa un huésped mamífero (p. ej., células COS-7).
La presente invención se refiere además a variantes de los polinucleótidos descritos anteriormente en la presente memoria que codifican, por ejemplo, fragmentos, análogos y derivados.
Las variantes de polinucleótidos pueden contener alteraciones en las regiones codificadoras, no codificadoras o ambas. En algunas realizaciones, las variantes de polinucleótidos contienen alteraciones que producen silenciosas, adiciones o deleciones sustituciones, pero no alteran las propiedades o actividades del polipéptido codificado. En algunas realizaciones, las variantes de nucleótidos son producidas por sustituciones silenciosas debido a la degeneración del código genético. Las variantes de polinucleótidos se pueden producir por una variedad de motivos, p. ej., para optimizar la expresión de codones de un huésped particular (cambiar los codones del ARNm humano a aquellos preferidos por un huésped bacteriano tal como E. coli).
Asimismo, se proporcionan los vectores y células que comprenden los polinucleótidos descritos en la presente memoria.
IV. Muestras biológicas
Las muestras biológicas normalmente se fijan con un fijador. Se usan típicamente fijadores de aldehído, tal como formalina (formaldehído) y glutaraldehído. Las muestras de tejido fijadas mediante el uso de otras técnicas de fijación tales como inmersión en alcohol (Battifora y Kopinski, J. Histochem. Cytochem. (1986) 34:1095) también son adecuadas. Las muestras usadas también se pueden embeber en parafina. En una realización, las muestras están fijadas con formalina y embebidas en parafina (FFPE). En otra realización, el bloque de FFPE se tiñe con hematoxilina y eosina antes de seleccionar una o más porciones para el análisis con el fin de seleccionar una o más áreas específicas para la muestra de núcleo de FFPE. Los métodos para preparar bloques de tejido a partir de estos especímenes particulados se han usado en estudios de IHC previos de varios factores de pronóstico, y/o son conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Abbondanzo et al., Am J Clin Pathol. mayo de 1990;93(5):698-702; Allred et al., Arch Surg. enero de 1990;125(1):107-13).
Brevemente, cualquier órgano o tejido intacto puede cortarse en piezas bastante pequeñas e incubarse en diversos fijadores (p. ej., formalina, alcohol, etc.) durante diversos períodos de tiempo hasta que el tejido quede “fijado”. Las muestras pueden ser virtualmente cualquier tejido intacto retirado quirúrgicamente del cuerpo. Las muestras se pueden cortar en una o más piezas razonablemente pequeñas que se ajustan al equipo usado de forma rutinaria en laboratorios histopatológicos. El tamaño de las piezas cortadas varía típicamente de unos pocos milímetros a unos pocos centímetros. La muestra biológica también puede ser extractos fluídicos, sangre, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, fluido linfático y/o preparaciones esplénicas.
V. Correlación entre la expresión de FOLR1 y la eficacia terapéutica
El conjugado de anticuerpo y maitansinoide (AMC), IMGN853, comprende el anticuerpo monoclonal de unión a FOLR1, huMov19 (M9346A), conjugado con el maitansinoide, d M4 (N(2')-desacetil-N2'-(4-mercapto-4-metil-1-oxopentil)-maitansina), unido a través del enlazador escindible sulfo-SPDB (N-succinimidil 4-(2-piridilditio)-2-sulfobutanoato). Las secuencias de anticuerpo de IMGN853 (huMov19) se proporcionan a continuación como las SEQ ID NO: 45 y 47, e IMGN853 y huMov19 se describen en la Pub. de Solic. de EE. UU. No. 2012/0009181 (actualmente 8.557.966), que se incorpora en su totalidad en la presente memoria por referencia.
SEQ ID NO:45 - huMov19 vHC
QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTGYFMNWVKQSPGQSLEWIGRIHPYDGDTFYNQKFQGKATLTVDKSS NTAHMELLSLTSEDFAVYYCTRYDGSRAMDYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO:46 - huMov19 vLCv1.00
DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLNI SPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKR
SEQ ID NO:47 - huMov19 vLCv1.60
DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLTI SPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKR
SEQ ID NO:48 - huMov19 vLC CDR1 KASQSVSFAGTSLMH
SEQ ID NO:49 - huMov19 vLC CDR2 RASNLEA
SEQ ID NO:50 - huMov19 vLC CDR3 QQSREYPYT
SEQ ID NO:51 - huMov19 vHC CDR1 GYFMN
SEQ ID NO:52 - huMov19 vHC CDR2 - definido por Kabat RIHPYDGDTFYNQKFQG
SEQ ID NO:53 -huM ov19 vHC CDR2 -definido por Abm RIHPYDGDTF
SEQ ID NO:54 - huMov19 vHC CDR3 YDGSRAMDY
SEQ ID NO:55 - secuencia de aminoácidos de HC de huMov19 QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTGYFMNWVKQSPGQSLEWIGRIHPYDGDTFYNQKFQGKATLTVDKSS NTAHMELLSLTSEDFAVYYCTRYDGSRAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFP EPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP CPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:56 - huMov19 LCv1.00 DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLNI SPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:57 - huMov19 LCv1.60 DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLTI SPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:58 - muMov19 vHC CDR2 - definido por Kabat RIHPYDGDTFYNQNFKD
IMGN853 se encuentra actualmente en desarrollo clínico para diversas indicaciones terapéuticas que incluyen cáncer de ovarios positivo para FOLR1, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer endometrial, cáncer renal y otras neoplasias malignas epiteliales. El cáncer de ovario exhibe la mayor penetración de FOLR1 y se considera la indicación principal para el tratamiento con IMGN853 (Antony AC. Ann Rev Nutr 16:501-21 (1996); Yuan Y et al. Hum Pathol 40(10):1453-1460 (2009)). La medición de los niveles de FOLR1 en muestras de plasma de pacientes puede ayudar a identificar las poblaciones de pacientes con mayor probabilidad de responder al tratamiento con AMC.
En determinadas realizaciones, la invención proporciona un método para identificar sujetos que tienen probabilidad de responder favorablemente a terapias anticancerosas dirigidas a FOLR1, debido a que se expresan niveles elevados de expresión de FOLR1 en el sujeto, en particular mediante el uso de anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos proporcionados en la presente memoria que puedan detectar un rango dinámico de niveles de expresión de FOLR1, p. ej., en IHC.
La evaluación de muestras de pacientes y la correlación con la eficacia in vivo usando modelos de xenoinjertos demuestra el poder del análisis de la expresión para seleccionar sujetos con más probabilidad de responder al tratamiento. La IHC proporciona una puntuación para la expresión de FOLR1 en células tumorales: 0 (sin expresión) hasta 3 (o 3+) (niveles muy elevados de expresión). Los datos in vivo que utilizan modelos de xenoinjertos demuestran que las muestras con una puntuación 2 o 3 (o 3+) para la expresión de FOLR1 tienen una probabilidad mayor de responder a las terapias anticancerosas dirigidas a FOLR1 con dosis clínicamente relevantes de inmunoconjugados de FOLR1 (véanse, p. ej., las Solicitudes Provisionales de EE. UU. No. 61/823.317 y 61/828.586, y la Solicitud Internacional No. PCT/US2014/037911, todas las cuales se incorporan en la presente memoria en su totalidad por referencia). Por lo tanto, la identificación de individuos que tienen una puntuación elevada de FOLR1 ayudaría a identificar a aquellos individuos que probablemente respondan a una dosificación clínicamente relevante. Además, los niveles de expresión más uniformes de FOLR1 proporcionan una correlación mejor con el beneficio terapéutico. Por lo tanto, una uniformidad de tinción homogénea o una combinación de mayor tinción con una uniformidad de tinción heterogénea puede indicar una mayor expresión de FOLR1. Por ejemplo, las puntuaciones mayores de 2 hetero pueden usarse como un criterio de selección de pacientes para el tratamiento con un agente terapéutico de FOLR1 (véase, por ejemplo, la Solicitud Publicada de EE. UU. No. 2012/0282175, la cual se incorpora a la presente memoria por referencia en su totalidad).
El análisis de la expresión de FOLR1 también identifica pacientes en los que la disminución de los niveles de una terapia anticancerosa dirigida a FOLR1 (“terapia de dosis baja”) puede ser eficaz para causar respuestas antitumorales. Como se aprecia en la técnica, los compuestos se administran generalmente a la dosificación más baja que logra la respuesta terapéutica deseada. Esto es específicamente importante para agentes terapéuticos que provocan efectos secundarios clínicos. La capacidad de reconocer a aquellos sujetos con niveles elevados de expresión de FOLR1 permite minimizar la dosificación del agente terapéutico dirigido a FOLR1, reduciendo de esta manera los posibles efectos secundarios, mientras se mantiene la eficacia terapéutica.
Por consiguiente, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno proporcionados en la presente memoria son particularmente ventajosos para su uso en dichos métodos debido a que son capaces de detectar un rango dinámico de niveles de expresión de FOLR1, p. ej., en IHC.
VI. Ensayo de antígeno diseminado
La medición de los niveles de antígeno circulante en muestras de plasma de pacientes (antígeno diseminado) puede ayudar a identificar las poblaciones de pacientes con mayor probabilidad de responder al tratamiento, p. ej., el tratamiento con un conjugado de anticuerpo y maitansinoide (AMC). Se ha informado que los niveles altos de antígeno diseminado afectan de forma marcada la farmacocinética de los anticuerpos terapéuticos (Tolcher A. et al. 20th Symposium on Molecular Targets and Cancer Therapeutics; octubre 21-24, 2008; Génova, Suiza: EORTC-NCI-AACR, p163, #514; Baselga J, et al. J Clin Oncol 14:737-744 (1996)). Es probable que los niveles de antígeno diseminado de las muestras de plasma de pacientes serán variables, dependiendo de factores tales como la diana del antígeno, indicaciones de la enfermedad y curso de la enfermedad. Los niveles de antígeno diseminado actualmente en indicaciones de enfermedad para el inmunoconjugado anti-FOLR1 IMGN853 han sido examinados de forma insuficiente mientras que la correlación con la expresión del tumor sólido es limitada. Mientras que se ha informado de la elevación de FOLR1 en adenocarcinomas de ovarios, los datos sugieren que no está elevado en otras indicaciones de tumor FOLR1+, tales como carcinoma de pulmón de células pequeñas (Mantovani LT, et al. Eur J Cancer 30A(3):363-9 (1994); Basal E, et al. PLoS ONE 4(7): e6292 (2009)). El presente método permite la detección del receptor FOLR1 en presencia de ácido fólico elevado, mediante el uso de anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se proporcionan en la presente memoria y que son capaces de detectar rangos dinámicos de FOLR1 diseminado. Los ensayos anteriores han utilizado Mov19 en el diseño del ensayo. Dado que IMGN853 contiene Mov19 y en una realización es la terapia dirigida de la invención, es vital que el método detecte FOLR1 en presencia o ausencia de Mov19. Los ensayos anteriores que utilizan Mov19 tienen efectos competitivos y detectarán considerablemente menos FOLR1 o nada en pacientes que reciben el tratamiento con IMGN853.
En una realización, el presente método para detectar FOLR1 en muestras de fluido de fuente humana utiliza un formato de análisis de ELISA en sándwich tradicional. En una realización, el método utiliza un agente de captura (es decir, anticuerpo) para FOLR1 unido a un soporte sólido. En una realización, el soporte sólido es una placa de microtitulación. A esto se le añade la muestra (fluidos de ascitis, plasma, etc.) sin dilución, y se detecta mediante un agente de detección diferente (un anticuerpo diferente), el cual no interfiere con la unión del primer agente de captura. El agente de detección se detecta entonces a través del uso de un agente de detección secundario (biotina / estreptavidina, anticuerpo mono o policlonal secundario anti-humano, etc.) que puede unirse más de una vez al primer agente de detección, amplificando de esta manera la señal de detección. Después, se cuantifica el agente de detección secundario mediante el uso de algunos otros medios (p. ej., TMB/peroxidasa, conteo de centelleo, sondas fluorescentes, etc.). De manera adicional, el ensayo detecta FOLR1 y no se ve influido de forma negativa por la presencia de Mov19, IMGN853, otros miembros de la familia FOLR1 o ácido fólico.
Los ensayos de la presente invención incluyen tanto ensayos para seleccionar pacientes elegibles para recibir terapia a base de FOLR1 como ensayos para monitorizar la respuesta del paciente. Los ensayos para la predicción de la respuesta se realizan antes de la selección de la terapia, y los niveles de FOLR1 pueden tener impacto sobre las decisiones de la terapia. Para monitorizar la respuesta del paciente, el ensayo se realiza al comienzo de la terapia para establecer los niveles de la línea base (o predeterminados) de FOLR1 en la muestra. La misma muestra se ensaya entonces y los niveles de FOLR1 se comparan con los niveles de la línea base o predeterminados. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "nivel predeterminado" generalmente se refiere a un valor de punto de corte del ensayo que se utiliza para evaluar los resultados diagnósticos al comparar los resultados del ensayo con el nivel predeterminado, y donde el nivel predeterminado ya se ha vinculado o asociado con varios parámetros clínicos (p. ej., monitorización de si un sujeto que se está tratando con un fármaco ha alcanzado un nivel en sangre eficaz del fármaco, monitorización de la respuesta de un sujeto que recibe tratamiento para el cáncer con un fármaco anticanceroso, monitorización de la respuesta de un tumor en un sujeto que recibe el tratamiento para dicho tumor, etc.). El nivel predeterminado puede ser un valor absoluto o un valor normalizado al sustraer el valor obtenido de un paciente antes del comienzo de la terapia. Un ejemplo de un nivel predeterminado que se puede utilizar es un nivel de línea base obtenido de uno o más sujetos que pueden padecer opcionalmente una o más enfermedades o afecciones. La comparación (o análisis informacional) del nivel del biomarcador ensayado con el nivel de línea base o predeterminado se puede realizar por un sistema automatizado, tal como un programa de software o sistema de inteligencia que es parte de, o es compatible con, el equipo (p. ej., una plataforma de ordenador) en el que se lleva a cabo el ensayo. De manera alternativa, esta comparación o análisis informacional puede ser realizado por un médico. En una realización, cuando los niveles siguen iguales o disminuyen, la terapia puede ser eficaz y se puede continuar. Cuando ocurre un aumento significativo sobre el nivel de línea base (o nivel predeterminado), el paciente puede que no esté respondiendo. En otra realización, un aumento en los niveles de FOLR1 diseminado puede ser indicativo de muerte celular aumentada y liberación aumentada del FOLR1 diseminado. En esta realización, un aumento en el FOLR1 diseminado es indicativo de la eficacia terapéutica.
Los ensayos de la presente invención pueden ser realizados por cualesquiera métodos de ensayo de proteínas. Los métodos de ensayo de proteínas útiles en la invención son bien conocidos en la técnica e incluyen métodos de inmunoensayo que implican la unión de un anticuerpo o proteína específico marcado o no marcado a la proteína o fragmento de FOLR1 expresado. Los métodos de inmunoensayos útiles incluyen ensayos de fase en disolución que se llevan a cabo mediante el uso de cualquier formato conocido en la técnica, tal como, pero no limitado a, Biacore, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia resuelta en el tiempo (TR-FRET), un formato ELISA, (en sándwich, inhibición competitiva directa y inversa) o un formato de polarización de fluorescencia, y ensayos en fase sólida tales como inmunohistoquímica. Los anticuerpos de FOLR1 y fragmentos de unión a antígeno de los mismos proporcionados en la presente memoria son particularmente útiles para estos métodos de inmunoensayo debido a que, por ejemplo, son capaces de detectar un rango dinámico de FOLR1.
VII. Ensayos de células tumorales circulantes
Los anticuerpos anti-FOLR1 descritos en la presente memoria pueden usarse también para la detección de FOLR1 en un ensayo de células tumorales circulantes. Las células tumorales circulantes (CTC) son células que se han diseminado en la vasculatura desde un tumor y circulan en el torrente sanguíneo. Las CTC están presentes en la circulación en cantidades extremadamente bajas. En general, las CTC se enriquecen a partir de la sangre o plasma del paciente mediante varias técnicas conocidas en la técnica. Las CTC pueden teñirse para detectar marcadores específicos mediante el uso de métodos conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitados a, métodos basados en la citometría de flujo y métodos basados en IHC. Las CTC pueden teñirse para detectar marcadores de proteínas únicos para las células tumorales, lo que permite la identificación y distinción de las CTC de las células sanguíneas normales. Las CTC también pueden teñirse para detectar FOLR1 mediante el uso de los anticuerpos proporcionados en la presente memoria, incluyendo, pero no limitado a, 2.1, 5.7 y 9.20. El análisis de las CTC también puede incluir el análisis cuantitativo del número de CTC y/o del número de CTC positivas para FOLR1. Los anticuerpos de FOLR1 descritos en la presente memoria pueden usarse para teñir las CTC aisladas a partir de un sujeto que tiene un cáncer para medir el FOLR1 presente en las CTC. Un aumento en las CTC que expresan FOLR1 puede ayudar a identificar que el sujeto tiene un cáncer que posiblemente responda a una terapia basada en FOLR1 o permitir la optimización de un régimen terapéutico con un anticuerpo o inmunoconjugado de FOLR1. La cuantificación de FOLR1 en CTC puede proporcionar información sobre el estadio del tumor, la respuesta a la terapia y/o la progresión de la enfermedad. Puede usarse como biomarcador de pronóstico, predictivo o farmacodinámico. Además, puede usarse la tinción de las CTC para FOLR1 mediante el uso de los anticuerpos proporcionados en la presente memoria como una biopsia líquida, ya sea sola o en combinación con análisis de marcadores tumorales adicionales de muestras de biopsias sólidas.
VIII. Detección
La presente invención proporciona además anticuerpos contra FOLR1, generalmente del tipo monoclonal, que están unidos al menos a un agente para formar un conjugado de anticuerpo de detección. Con el fin de aumentar la eficacia de las moléculas del anticuerpo como diagnóstico es convencional enlazar o unir covalentemente o formar complejos con al menos una molécula o resto deseado. Dicha molécula o resto puede ser, pero no está limitado a, al menos una molécula informadora. Una molécula informadora se define como cualquier resto que se puede detectar mediante el uso de un ensayo. Los ejemplos no limitativos de moléculas informadoras que se han conjugado con anticuerpos incluyen enzimas, marcadores radiactivos, haptenos, marcadores fluorescentes, moléculas fosforescentes, moléculas quimioluminiscentes, cromóforos, moléculas luminiscentes, moléculas de fotoafinidad, partículas coloreadas y/o ligandos, tales como biotina.
Determinados ejemplos de conjugados de anticuerpo son los conjugados en los cuales el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionado en la presente memoria está unido a un marcador detectable. Los “marcadores detectables” son compuestos y/o elementos que se pueden detectar debido a sus propiedades funcionales específicas y/o características químicas, donde el uso de estos permite que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno a que están unidos sea detectado y/o sea cuantificado adicionalmente si se desea.
Son conocidos en la técnica muchos agentes de imagenología apropiados, así como métodos para su unión a anticuerpos (véanse, p. ej., las Pat. de EE. UU. No. 5.021.236, 4.938.948 y 4.472.509, cada una incorporada en la presente memoria por referencia). Los restos de imagenología usados pueden ser iones paramagnéticos; isótopos radiactivos; fluorocromos; sustancias detectables por RMN; y/o imagenología de rayos X, por ejemplo.
Los ejemplos de marcadores fluorescentes contemplados para su uso como conjugados con agente de unión (p. ej., anticuerpo) incluyen Alexa 350, Alexa 430, Alexa 488, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, azul Cascade, Cy3, Cy5,6-FAM, Dylight 488, Isotiocianato de fluoresceína (FITC), proteína fluorescente verde (GFP), HEX, 6-JOe , verde Oregon 488, verde Oregon 500, verde Oregon 514, azul Pacific, ficoeritrina, REG, verde Rodamina, rojo Rodamina, tetrametil rodamina (TMR), Renografina, ROX, TAMRA, TET, Tetrametilrodamina, rojo Texas, y derivados de estos marcadores (es decir, análogos halogenados, modificados con isotiocianato u otro enlazador para conjugación, etc.), por ejemplo. Un ejemplo de marcador radiactivo es el tritio.
Los conjugados de detección de anticuerpo o fragmento de unión a antígeno contemplados en la presente invención incluyen los que se usan in vitro, donde el anticuerpo o fragmento está unido a un ligando de unión secundario y/o a una enzima (una etiqueta de enzima) que generará un producto coloreado tras el contacto con un sustrato cromogénico. Los anticuerpos de FOLR1 y fragmentos de unión a antígeno de los mismos proporcionados en la presente memoria son particularmente útiles para estos métodos de conjugados debido a que, por ejemplo, son capaces de detectar un rango dinámico de FOLR1. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen ureasa, fosfatasa alcalina, peroxidasa de hidrógeno (rábano picante) y/o glucosa oxidasa. En algunas realizaciones, los ligandos de unión secundarios son compuestos de biotina y/o avidina y estreptavidina. El uso de dichos marcadores es conocido por los expertos en la técnica y se describe, por ejemplo, en las Pat. de EE. UU. No. 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149 y 4.366.241; cada una de las cuales se incorpora en la presente memoria por referencia.
También pueden utilizarse moléculas que contienen grupos azido para formar enlaces covalentes con proteínas a través de intermedios de nitreno reactivo que se generan mediante luz ultravioleta de baja intensidad (Potter y Hayley, 1983). En particular, los análogos 2 y 8-azido de nucleótidos de purina se han usado como fotosondas dirigidas a sitio para identificar proteínas de unión a nucleótidos en extractos celulares brutos (Owens y Haley, 1987; Atherton et al., 1985). Los nucleótidos 2 y 8-azido también se han usado para mapear dominios de unión a nucleótidos de proteínas purificadas (Khatoon et al., 1989; King et al., 1989; y Dholakia et al., 1989) y se pueden usar como agentes de unión a anticuerpos.
Se conocen diversos métodos en la técnica para la unión o conjugación de un anticuerpo con su resto conjugado. Algunos métodos de unión implican el uso de un complejo de quelato metálico que emplea, por ejemplo, un agente de quelación orgánico tal como anhídrido del ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA); ácido etilentriaminotetraacético; N-cloro-p-toluenosulfonamida; y/o tetracloro-3a-6a-difenilglicouril-3 unido al agente de unión (p. ej., anticuerpo) (Pat. de EE. UU. No. 4.472.509 y 4.938.948, cada una de las cuales se incorpora en la presente memoria por referencia). Los anticuerpos monoclonales también se pueden hacer reaccionar con una enzima en presencia de un agente de acoplamiento tal como glutaraldehído o peryodato. Los conjugados de unión a proteínas (p. ej., anticuerpo) con marcadores de fluoresceína se preparan en presencia de estos agentes de acoplamiento o mediante la reacción con un isotiocianato. En Pat. de e E. UU. No. 4.938.948, la imagenología de tumores de mama, por ejemplo, se logra mediante el uso de anticuerpos monoclonales, y los restos de imagenología detectables se unen al anticuerpo mediante el uso de enlazadores tales como metil-p-hidroxibencimidato o N-succinimidil-3-(4-hidroxifenil)propionato.
En otras realizaciones, se contempla la derivación de inmunoglobulinas por la introducción selectiva de grupos sulfhidrilo en la región Fc de una inmunoglobulina mediante el uso de condiciones de reacción que no alteran el sitio de combinación del anticuerpo. Se describe que los conjugados de anticuerpo producidos de acuerdo con esta metodología presentan una longevidad, especificidad y sensibilidad mejoradas (Pat. de EE. UU. No. 5.196.066, que se incorpora en la presente memoria por referencia). La unión específica de sitio de las moléculas efectoras o informadoras, en donde la molécula informadora o efectora está conjugada con un residuo de carbohidrato en la región Fc, también se ha descrito en la bibliografía (O'Shannessy et al., 1987).
En otras realizaciones de la invención, las inmunoglobulinas se marcan radiactivamente con núclidos tales como tritio. En realizaciones adicionales, se usan nanopartículas de oro (tales como tamaños de aproximadamente 0,5 nm-40 nm) y/o puntos cuánticos (Hayward, Calif.).
Cuando se usa un formato de ensayo en sándwich, el anticuerpo de captura no estará marcado. El anticuerpo de detección estará marcado directamente o se detectará indirectamente mediante la adición (después de eliminar por lavado el exceso de anticuerpo de detección) de un exceso molar de un segundo anticuerpo marcado dirigido contra el primer anticuerpo.
El marcador utilizado para el anticuerpo de detección es cualquier funcionalidad detectable que no interfiera con la unión de los anticuerpos de FOLR1. Los ejemplos de marcadores adecuados son los numerosos marcadores conocidos por su uso en inmunoensayos, incluyendo restos que pueden ser detectados en forma directa, tales como fluorocromo, marcadores quimioluminiscentes y radiactivos, así como restos, tales como enzimas, que deben reaccionar o derivatizarse para ser detectados. Los ejemplos de dichos marcadores incluyen los radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H y 131I, fluoróforos tales como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luciferasas, p. ej., luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (Pat. de EE. UU. No. 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazinodionas, peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina, pgalactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas, p. ej., glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosasfosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas, tales como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de tinte tal como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, biotina/estreptavidina, biotina/estreptavidina-p-galactosidasa con MUG, marcadores de rotación, marcadores de bacteriófagos, radicales libres estables y similares. Tal y como se mencionó en la presente memoria, la detección fluorimétrica es un ejemplo.
Se encuentran disponibles métodos convencionales para unir estos marcadores de forma covalente a proteínas o polipéptidos. Por ejemplo, pueden emplearse agentes de acoplamiento tales como dialdehídos, carbodiimidas, dimaleimidas, bis-imidatos, bencidina bis-diazotizada y similares para etiquetar los anticuerpos con los marcadores fluorescentes, quimioluminiscentes y enzimáticos descritos en la presente memoria. Véanse, p. ej., las Pat. de EE. UU. No. 3.940.475 (fluorimetría) y 3.645.090 (enzimas); Hunter et al. Nature 144:945 (1962); David et al. Biochemistry 13:1014-1021 (1974); Pain et al. J. Immunol. Methods 40:219-230 (1981); y Nygren J. Histochem. and Cytochem.
30:407-412 (1982). En determinadas realizaciones, los marcadores de la presente memoria son fluorescentes para aumentar la amplificación y sensibilidad a 8 pg/ml, más preferentemente biotina con estreptavidina-p-galactosidasa y MUG para amplificar la señal. En determinadas realizaciones, se usa un marcador colorimétrico, p. ej., donde el anticuerpo detectable se biotinila y el medio de detección es avidina o estreptavidina-peroxidasa y 3,3',5,5'-tetrametil bencidina.
La conjugación de dicho marcador, que incluye las enzimas, con el anticuerpo es un procedimiento de manipulación estándar para un experto en las técnicas de inmunoensayo. Véase, por ejemplo, O'Sullivan et al. "Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay", en Methods in Enzymology, ed. J. J. Langone y H. Van Vunakis, Vol. 73 (Academic Press, Nueva York, N.Y., 1981), p. 147-166.
Después de la adición del último anticuerpo marcado, se determina la cantidad de anticuerpo unido mediante la eliminación del exceso de anticuerpo marcado no unido con lavados y la posterior medida de la cantidad del marcador unido usando un método de detección adecuado para el marcador, y la correlación de la cantidad medida con la cantidad de FOLR1 diseminado en la muestra biológica. Por ejemplo, en el caso de enzimas, la cantidad de color desarrollado y medido será una medida directa de la cantidad de FOLR1 diseminado presente. Específicamente, si el marcador es HRP, el color puede detectarse mediante el uso del sustrato 3,3',5,5'-tetrametil bencidina á 450 nm de absorción.
IX. Sustratos e indicadores
El uso de sustratos e indicadores está contemplado para la detección de FOLR1
La peroxidasa de rábano picante (HRP) es una enzima que forma en primer lugar un complejo con peróxido de hidrógeno y provoca entonces su descomposición, lo cual da como resultado agua y oxígeno atómico. Como muchas otras enzimas, la HRP y algunas actividades tipo HRP se pueden inhibir por exceso de sustrato. El complejo formado entre HRP y exceso de peróxido de hidrógeno es catalíticamente inactivo y en ausencia de un donante de electrones (p. ej., sustancia cromogénica) se inhibe de forma reversible. Es el exceso de peróxido de hidrógeno y la ausencia de un donante de electrones lo que ocasiona la inactivación de las actividades de HRP endógena. Cuando se usa en sistemas de ensayo, también puede usarse la HRP para convertir un sustrato definido en su cromógeno activado, mediante lo cual se produce un cambio de color. La enzima HRP puede conjugarse con un anticuerpo, péptido, polímero u otra molécula mediante varios métodos conocidos en la técnica. La adición de glutaraldehído a una disolución que contiene una mezcla de HRP y anticuerpo dará como resultado más moléculas de anticuerpo conjugadas entre sí que con la enzima. En el procedimiento de dos etapas, la HRP reacciona en primer lugar con reactivos bifuncionales. En la segunda etapa, únicamente se mezcla la HRP activada con el anticuerpo, lo cual da como resultado un marcaje mucho más eficaz y no produce polimerización. La HRP también se conjuga con (estrept)avidina mediante el uso de un procedimiento con glutaraldehído de dos etapas. Esta forma se usa en procedimientos en los que LAB y LSAB son sustratos, por ejemplo. La conjugación con biotina también implica dos etapas, ya que la biotina debe derivatizarse en primer lugar al éster de biotinil-N-hidroxisuccinimida o a la hidrazida de biotina antes de que se haga reaccionar con los grupos épsilon amino de la enzima HRP.
La 3,3'-diaminobencidina (DAB) es un sustrato para enzimas, tales como HRP, que produce un producto final marrón que es muy insoluble en alcohol y otros disolventes orgánicos. La oxidación de DAB también provoca polimerización, lo cual da como resultado la capacidad de reaccionar con tetróxido de osmio y por lo tanto aumenta su intensidad de tinción y densidad de electrones. De los varios metales y métodos usados para intensificar la densidad óptica de DAB polimerizada, el cloruro de oro en combinación con sulfuro de plata parece ser el más exitoso.
El 3-amino-9-etilcarbazol (AEC), es un sustrato para enzimas, tales como HRP que, al oxidarse, forma un producto final rosa-rojo que es soluble en alcohol. Por lo tanto, los especímenes procesados con AEC no se deben sumergir en alcohol o disoluciones alcohólicas (p. ej., hematoxilina de Harris). En cambio, se debería usar una contratinción y medio de montaje acuoso.
El 4-cloro-1-naftol (CN) es un sustrato para enzimas, tales como HRP, que precipita como un producto final azul. Dado que el CN es soluble en alcohol y otros disolventes orgánicos, el espécimen no se debe deshidratar, exponer a contratinciones alcohólicas, o cubrirse con cubreobjetos con medio de montaje que contiene disolventes orgánicos. A diferencia de DAB, el CN tiende a difundir desde el sitio de precipitación.
El dihidrocloruro de p-fenilendiamina/pirocatecol (reactivo de Hanker-Yates) es un sustrato para enzimas, tales como HRP, que proporciona un producto de reacción azul-negro que es insoluble en alcohol y otros disolventes orgánicos. Como la DAB polimerizada, este producto de reacción puede estar osmicado. Se han logrado diferentes resultados con el reactivo de Hanker-Yates en técnicas de inmunoperoxidasa.
La fosfatasa alcalina (AP) intestinal de ternera (peso molecular 100 kD) retira (mediante hidrólisis) y transfiere grupos fosfato de ésteres orgánicos al romper el enlace P-0; se forma brevemente un enlace enzima-sustrato intermedio. Los activadores metálicos principales para AP son Mg++, Mn++ y Ca++.
La AP no se ha usado ampliamente en inmunohistoquímica hasta la publicación del procedimiento sin marcaje de fosfatasa alcalina-anti-fosfatasa alcalina (APAAP). Los complejos inmunes solubles usados en este procedimiento tienen pesos moleculares de aproximadamente 560 kD. La mayor ventaja del procedimiento APAAP en comparación con la técnica de la peroxidasa anti-peroxidasa (PAP) es la ausencia de interferencia presentada por la actividad de peroxidasa endógena. La peroxidasa endógena puede bloquearse mediante el uso de una disolución diluida de peróxido de hidrógeno. Dada la distracción posible de la actividad de peroxidasa endógena en la tinción PAP, la técnica APAAP se recomienda para su uso en frotis de sangre y médula ósea. La actividad de fosfatasa alcalina endógena del hueso, riñón, hígado y algunas células blancas se puede inhibir mediante la adición de levamisol 1 mM a la disolución de sustrato, aunque se ha encontrado que 5 mM era más eficaz. Las fosfatasas alcalinas intestinales no se inhiben adecuadamente por levamisol.
En el método de tinción de fosfatasa inmunoalcalina, la enzima hidroliza ésteres de fosfato de naftol (sustrato) a compuestos fenólicos y fosfatos. Los fenoles se acoplan a sales incoloras de diazonio (cromógeno) para producir tintes azo insolubles y coloreados. Se han usado con éxito varias combinaciones diferentes de sustratos y cromógenos.
El sustrato de AP de fosfato AS-MX de naftol se puede usar en su forma ácida o como la sal de sodio. El sustrato de cromógeno Fast red TR y Fast Blue BB producen un producto final rojo o azul brillante, respectivamente. Ambos son solubles en disolventes alcohólicos y otros disolventes orgánicos, por lo que se debe usar un medio de montaje acuoso. Se prefiere Fast Red TR cuando se tiñen frotis celulares.
Los ejemplos adicionales de sustratos incluyen naftol AS-BI fosfato, naftol AS-TR fosfato y 5-bromo-4-cloro-3-indoxil fosfato (BCIP). Otros cromógenos posibles incluyen Fast Red LB, Fast Garnet GBC, Nitro Blue Tetrazolio (NBT) y yodonitrotetrazolio Violeta (INT), por ejemplo.
X. Métodos de inmunodetección
En más realizaciones adicionales, la presente invención se refiere a métodos de inmunodetección para unir, purificar, retirar, cuantificar y/o detectar en general de otro modo los componentes biológicos, tales como un ligando, tal como se contempla en la presente invención. Pueden emplearse los anticuerpos preparados de acuerdo con la presente invención. Algunos métodos de inmunodetección incluyen inmunohistoquímica, citometría de flujo, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), ensayo inmunoradiométrico, fluoroinmunoensayo, ensayo quimioluminiscente, ensayo bioluminiscente y transferencia Western, por mencionar algunos. Las etapas de varios métodos de inmunodetección útiles se han descrito en la bibliografía científica, tales como, p.ej., Doolittle M H y Ben-Zeev O, Methods Mol Biol. 1999;109:215-37; Gulbis B y Galand P, Hum Pathol. diciembre de 1993;24(12):1271-85; y De Jager R et al., Semin Nucl Med. abril de 1993;23(2):165-79, cada uno de los cuales se incorpora en la presente memoria por referencia.
En general, los métodos de inmunounión incluyen obtener una muestra que se sospecha que comprende proteína, polipéptido y/o péptido de ligando, y poner en contacto la muestra con un primer agente de unión a ligandos (p. ej., un anticuerpo anti-ligando) de acuerdo con la presente invención, según sea el caso, en condiciones eficaces para permitir la formación de inmunocomplejos.
En términos de la detección de antígeno, la muestra biológica analizada puede ser cualquier muestra en la que se desea detectar FOLR1, tal como extracto de fluido, sangre, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, fluido linfático, sección o espécimen de tejido, extracto de tejido homogenizado, aspirados de biopsia, una célula, composiciones que contienen formas separadas y/o purificadas de FOLR1, o cualquier fluido biológico. En algunas realizaciones, se usan muestras o extractos de sangre, plasma o linfa.
La puesta en contacto de la muestra biológica elegida con el anticuerpo en condiciones eficaces y durante un período de tiempo suficiente como para permitir la formación de complejos inmunes (complejos inmunes primarios) es generalmente cuestión de añadir simplemente la composición de anticuerpo a la muestra e incubar la mezcla durante un período de tiempo lo suficientemente extenso como para que los anticuerpos formen complejos inmunes con, es decir, se unan a, cualquier antígeno de proteína de ligando presente. Después de este tiempo, la composición de muestra-anticuerpo, tal como una sección de tejido, placa de ELISA, transferencia en punto o transferencia western, se lavará generalmente para retirar cualquier especie de anticuerpo unido no específicamente, lo cual permite que solo sean detectados aquellos anticuerpos unidos específicamente en de los complejos inmunes primarios.
En general, la detección de la formación de inmunocomplejos se conoce muy bien en la técnica y se puede lograr a través de la aplicación de varios enfoques. Estos métodos se basan generalmente en la detección de una etiqueta o marcador, tal como cualquiera de las etiquetas radioactivas, fluorescentes, biológicas y enzimáticas. Las Patentes de EE. UU. que se refieren al uso de dichas etiquetas incluyen las Pat. de EE. UU. No. 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149 y 4.366.241, cada una de las cuales se incorpora en la presente memoria por referencia. Por supuesto, se pueden encontrar ventajas adicionales a través del uso de un ligando de unión secundario tal como un segundo anticuerpo y/o una disposición de unión de ligando de biotina/avidina, como se conoce en la técnica.
El anticuerpo anti-ligando empleado en la detección puede por sí mismo unirse a un marcador detectable, en donde se detectaría simplemente este marcador, permitiendo de esta manera que se determine la cantidad de los complejos inmunes primarios en la composición. De manera alternativa, el primer anticuerpo, que se une en los complejos inmunes primarios, se puede detectar mediante un segundo agente de unión que tiene afinidad de unión por el anticuerpo. En estos casos, el segundo agente de unión puede estar unido a un marcador detectable. El segundo agente de unión es en sí mismo por lo general un anticuerpo, que por lo tanto se puede denominar anticuerpo "secundario". Los complejos inmunes primarios se ponen en contacto con el agente de unión segundario marcado, o anticuerpo, en condiciones eficaces y durante un período de tiempo suficiente como para permitir la formación de complejos inmunes secundarios. Los complejos inmunes secundarios se lavan entonces generalmente para retirar cualquier anticuerpo o ligando secundario marcado unido no específicamente, y se detecta entonces el resto del marcaje en los complejos inmunes secundarios.
Otros métodos incluyen la detección de complejos inmunes primarios mediante un enfoque de dos etapas. Un segundo agente de unión, tal como un anticuerpo, que tiene afinidad de unión por el anticuerpo, se usa para formar complejos inmunes secundarios, tal como se describe en la presente memoria. Después del lavado, los complejos inmunes secundarios se ponen en contacto con un tercer agente de unión o anticuerpo que tiene afinidad de unión por el segundo anticuerpo, nuevamente en condiciones eficaces y durante un período de tiempo suficiente como para permitir la formación de complejos inmunes (complejos inmunes terciarios). El tercer ligando o anticuerpo está unido a un marcador detectable, lo cual permite la detección de los complejos inmunes terciarios así formados. Este sistema puede proporcionar la amplificación de señal, si es esto lo que se desea.
En otra realización, se usa un anticuerpo monoclonal o policlonal biotinilado para detectar el o los antígenos diana, y un anticuerpo de segunda etapa se usa entonces para detectar la biotina unida a la biotina en complejo. En ese método, la muestra que se va a ensayar se incuba en primer lugar en una disolución que comprende el anticuerpo de primera etapa. Si el antígeno diana está presente, parte del anticuerpo se une al antígeno para formar un complejo de anticuerpo/antígeno biotinilado. El complejo de anticuerpo/antígeno se amplifica entonces por incubación en disoluciones sucesivas de estreptavidina (o avidina), ADN biotinilado, y/o ADN biotinilado complementario, añadiendo en cada etapa sitios de biotina adicionales al complejo de anticuerpo/antígeno. Las etapas de amplificación se repiten hasta que se logra un nivel adecuado de amplificación, y, en dicho punto, la muestra se incuba en una disolución que comprende el anticuerpo de segunda etapa contra biotina. Este anticuerpo de segunda etapa está marcado, como, por ejemplo, con una enzima que se puede usar para detectar la presencia del complejo de anticuerpo/antígeno por histoenzimología mediante el uso de un sustrato de cromógeno. Con la amplificación adecuada, se puede producir un conjugado que es macroscópicamente visible.
En una realización, se usa inmunohistoquímica (IHC) para la detección inmunológica. Mediante el uso de IHC, la detección de FOLR1 en una muestra se puede lograr al tomar como diana una muestra con una sonda, p. ej., un anticuerpo anti-FOLR1. La sonda puede estar unida ya sea directa o indirectamente a un marcador detectable o se puede detectar con otra sonda que está unida, ya sea directa o indirectamente a un marcador detectable.
En algunas realizaciones, la IHC puede distinguir entre diferentes niveles de expresión de proteínas, p. ej., IHC calibrada. En algunas realizaciones, la IHC puede distinguir la intensidad de tinción para muestras que tienen expresión baja de FOLR1, expresión intermedia de FOLR1 o expresión elevada de FOLR1.
En una realización, la detección inmunológica (mediante inmunohistoquímica) de FOLR1 se puntúa tanto para intensidad como para uniformidad (porcentaje de células teñidas - solo membrana). Las escalas comparativas para la expresión de FOLR1 para determinar la intensidad se correlacionan como 0 - Negativa, 0-1 - Muy débil, 1 - Débil, 1-2 - Débil a Moderada, 2 - Moderada, 2-3 - Moderada a Fuerte, 3 - Fuerte, 3+ - Muy fuerte. De manera cuantitativa, una puntuación de 0 representa que no se observa tinción de membrana. Una puntuación de 1 representa que se detecta una tinción de membrana apenas perceptible/débil. Para una puntuación de 2, se observa una tinción de membrana de débil a moderada completa. Finalmente, una puntuación de 3 (o 3+) representa que se observa una tinción de membrana moderada a completa. Las muestras con una puntuación de 0 o 1 para la expresión de FOLR1 se pueden caracterizar como que no tienen niveles elevados de expresión de FOLR1, mientras que aquellas muestras con una puntuación de 2 o 3 se pueden caracterizar como que sobreexpresan o tienen expresión elevada de FOLR1. En otra realización, mediante el uso de anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno de los mismos o polipéptidos proporcionados en la presente memoria, las muestras con una puntuación de 0 para la expresión de FOLR1 se pueden caracterizar como que no tienen expresión elevada de FOLR1, las muestras con una puntuación de 1 se pueden caracterizar como que tienen un aumento de expresión de FOLR1 y las muestras con puntuaciones de 2 o 3 se pueden caracterizar como que sobreexpresan o tienen una expresión elevada de FOLR1.
Las muestras que sobreexpresan FOLR1 también se pueden clasificar con puntuaciones inmunohistoquímicas que corresponden al número de copias de moléculas de FOLR1 expresadas por célula, o anticuerpos unidos por célula (ABC) y se pueden determinar bioquímicamente. Las escalas comparativas para la uniformidad de FOLR1 (porcentaje de tinción de membrana celular) son como sigue a continuación: Negativa = 0 %; Focal = <25 %; heterogénea (hetero) = 25-75 %, y homogénea (homo) = >75 %.
En una realización, la detección inmunológica (mediante inmunohistoquímica) de FOLR1 se puntúa mediante el uso de puntuaciones H. Las puntuaciones H combinan puntuaciones de intensidad de tinción (p. ej., una puntuación de 0 a 3, en donde 0 representa sin tinción y 3 representa tinción fuerte) con el porcentaje de células que son positivas para la tinción de membrana (es decir, uniformidad). Se puede calcular una puntuación H de la siguiente manera:
Puntuación H = [0*(porcentaje de tinción de células con intensidad 0)] [1*(porcentaje de tinción de células con intensidad 1)] [2*(porcentaje de tinción de células con intensidad 2)] [3*(porcentaje de tinción de células con intensidad 3)]. Por consiguiente, una puntuación H puede oscilar entre 0 (sin tinción de membranas celulares) a 300 (tinción de la totalidad de las membranas celulares con intensidad 3).
En una realización, un sujeto que tiene cáncer se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen de tratamiento anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor del sujeto es de al menos 50. En una realización, un sujeto que tiene cáncer se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen de tratamiento anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor del sujeto es de al menos 75. En una realización, un sujeto que tiene cáncer se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen de tratamiento anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor del sujeto es de al menos 100. En una realización, un sujeto que tiene cáncer se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen de tratamiento anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor del sujeto es de al menos 125. En una realización, un sujeto que tiene cáncer se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen de tratamiento anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor del sujeto es de al menos 150. En una realización, un sujeto que tiene cáncer se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen de tratamiento anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor del sujeto es de al menos 175. En una realización, un sujeto que tiene cáncer se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen de tratamiento anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor del sujeto es de al menos 200. En otra realización, un sujeto que tiene cáncer se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor del sujeto es de al menos 225. En otra realización, un sujeto que tiene cáncer se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor del sujeto es de al menos 250. En otra realización, un sujeto que tiene cáncer se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor del sujeto es de al menos 275. En otra realización, un sujeto que tiene cáncer se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor del sujeto es de 300.
En otra realización, un sujeto que tiene cáncer de ovario se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor de ovario del sujeto es de 75 a 300. En otra realización, un sujeto que tiene cáncer de ovario se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor de ovario del sujeto es de al menos 75. En otra realización, un sujeto que tiene cáncer de ovario se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor de ovario del sujeto es de al menos 100. En otra realización, un sujeto que tiene cáncer de ovario se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor de ovario del sujeto es de al menos 125. En otra realización, un sujeto que tiene cáncer de ovario se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor de ovario del sujeto es de al menos 150. En otra realización, un sujeto que tiene cáncer de ovario se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor de ovario del sujeto es de al menos 175. En otra realización, un sujeto que tiene cáncer de ovario se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor de ovario del sujeto es de al menos 200. En otra realización, un sujeto que tiene cáncer de ovario se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor de ovario del sujeto es de al menos 225. En otra realización, un sujeto que tiene cáncer de ovario se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor de ovario del sujeto es de al menos 250. En otra realización, un sujeto que tiene cáncer de ovario se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor de ovario del sujeto es de al menos 275. En otra realización, un sujeto que tiene cáncer de ovario se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen anti-FOLRI (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor de ovario del sujeto es de 300.
En otra realización, un sujeto que tiene NSCLC se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor de NSCLC del sujeto es de 50 a 300. En otra realización, un sujeto que tiene NSCLC se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor de NSCLC del sujeto es de al menos 50. En otra realización, un sujeto que tiene NSCLC se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor de NSCLC del sujeto es de al menos 75. En otra realización, un sujeto que tiene NSCLC se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLr en una muestra de tumor de NSCLC del sujeto es de al menos 100. En otra realización, un sujeto que tiene NSCLC se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor de NSCLC del sujeto es de al menos 125. En otra realización, un sujeto que tiene NSCLC se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor de NSCLC del sujeto es de al menos 150. En otra realización, un sujeto que tiene NSCLC se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor de NSCLC del sujeto es de al menos 175. En otra realización, un sujeto que tiene NSCLC se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLr en una muestra de tumor de NSCLC del sujeto es de al menos 200. En otra realización, un sujeto que tiene NSCLC se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor de NSCLC del sujeto es de al menos 225. En otra realización, un sujeto que tiene NSCLC se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor de NSCLC del sujeto es de al menos 250. En otra realización, un sujeto que tiene NSCLC se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor de NSCLC del sujeto es de al menos 275. En otra realización, un sujeto que tiene NSCLC se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLr en una muestra de tumor de NSCLC del sujeto es de 300.
En otra realización, un sujeto que tiene cáncer de endometrio se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor de endometrio del sujeto es de 50 a 300. En otra realización, un sujeto que tiene cáncer de endometrio se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor de endometrio del sujeto es de al menos 50. En otra realización, un sujeto que tiene cáncer de endometrio se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor de endometrio del sujeto es de al menos 75. En otra realización, un sujeto que tiene cáncer de endometrio se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor de endometrio del sujeto es de al menos 100. En otra realización, un sujeto que tiene cáncer de endometrio se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor de endometrio del sujeto es de al menos 125. En otra realización, un sujeto que tiene cáncer de endometrio se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor de endometrio del sujeto es de al menos 150. En otra realización, un sujeto que tiene cáncer de endometrio se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor de endometrio del sujeto es de al menos 175. En otra realización, un sujeto que tiene cáncer de endometrio se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor de endometrio del sujeto es de al menos 200. En otra realización, un sujeto que tiene cáncer de endometrio se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor de endometrio del sujeto es de al menos 225. En otra realización, un sujeto que tiene cáncer de endometrio se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor de endometrio del sujeto es de al menos 250. En otra realización, un sujeto que tiene cáncer de endometrio se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor de endometrio del sujeto es de al menos 275. En otra realización, un sujeto que tiene cáncer de endometrio se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando la puntuación H para la expresión de FOLR en una muestra de tumor de endometrio del sujeto es de 300.
A modo de ejemplo, una puntuación H en un sujeto que tiene cáncer de ovario puede ser como sigue:
Puntuación H = (75 % con intensidad 0) (0 % con intensidad 1) (0 % con intensidad 2) (25 % con intensidad 3) = 75; o
Puntuación H = (0 % con intensidad 0) (75 % con intensidad 1) (0 % con intensidad 2) (25 % con intensidad 3) = 150.
En otro ejemplo, una puntuación H en un sujeto que tiene cáncer de endometrio puede ser como sigue:
Puntuación H = (75 % con intensidad 0) (0 % con intensidad 1) (25 % con intensidad 2) (0 % con intensidad 3) = 50; o
Puntuación H = (0 % con intensidad 0) (75 % con intensidad 1) (25 % con intensidad 2) (0 % con intensidad 3) = 125.
En los cuatro ejemplos anteriores, podría identificarse el sujeto como candidato para el tratamiento con un régimen de tratamiento anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853).
En una realización, la detección inmunológica (mediante inmunohistoquímica) de FOLR1 se puntúa mediante el uso del porcentaje de positividad e intensidad en una muestra. En esta realización, la selección para el tratamiento con un régimen de tratamiento anti-FOLR1 se basa en el porcentaje de células en una muestra que se encuentra que expresa FOLR1 de membrana a un nivel especificado que refleja tanto la intensidad (p. ej., 1, 2 o 3) como la uniformidad (p. ej., heterogénea u homogénea (véase la Tabla 11)) de la tinción. Por ejemplo, una muestra que tiene al menos un 25 % (es decir, un 25-75 % o > 75 %) de tinción de células para positividad de FOLR1 con 3 podría caracterizarse como “3 hetero” y “3 homo” o, de forma colectiva, como “al menos 25 % positiva con 3”.
En una realización, un sujeto que tiene cáncer de ovario se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen de tratamiento anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando al menos el 25 % de la expresión en membrana de FOLR1 en una muestra de tumor del sujeto tiene una puntuación de intensidad de 3 mediante IHC. En una realización, la IHC se lleva a cabo mediante el uso del anticuerpo FOLR1-2.1.
En otra realización, un sujeto que tiene cáncer de endometrio se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen de tratamiento anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando al menos el 25 % de la expresión en membrana de FOLR en una muestra de tumor del sujeto tiene una puntuación de intensidad de al menos 2 mediante IHC. En una realización, la IHC se lleva a cabo mediante el uso del anticuerpo FOLR1-2.1.
En otra realización, un sujeto que tiene NSCLC se identifica como candidato para el tratamiento con un régimen de tratamiento anti-FOLR1 (p. ej., IMGN853) cuando al menos el 25 % de la expresión en membrana de FOLR en una muestra de tumor del sujeto tiene una puntuación de intensidad de al menos 2 mediante IHC. En un ejemplo, la IHC se lleva a cabo mediante el uso del anticuerpo FOLR1-2.1 para IHC.
La IHC se puede realizar de forma manual o mediante el uso de un sistema automatizado (p. ej., mediante el uso de un aparato automatizado de tinción). La IHC se puede realizar en células, sedimentos celulares, tejidos, preparaciones de sangre, plasma, suero, o fluido linfático, etc. En algunas realizaciones, las muestras son muestras fijadas. En algunas realizaciones, las muestras son muestras embebidas en parafina. En algunas realizaciones, las muestras son muestras fijadas con formalina y embebidas en parafina.
En una realización, se usa citometría de flujo para la detección inmunológica. Por lo tanto, por ejemplo, el número de anticuerpos unidos por célula (ABC) se puede evaluar mediante el uso de citometría de flujo. Un gran número de anticuerpos anti-FOLR1 unidos por célula puede indicar niveles de expresión de FOLR1 altos y una alta probabilidad de ser susceptible al tratamiento con un anticuerpo anti-FOLR1 o inmunoconjugado del mismo.
XI. Composiciones y kits
La invención también proporciona composiciones y kits para su uso en la puesta en práctica de la presente invención, tal como se describe en la presente memoria. Dichos kits pueden comprender recipientes, cada uno con uno o más de los diversos reactivos (típicamente en forma concentrada) utilizados en los métodos, incluyendo, por ejemplo, uno o más agentes de unión (anticuerpos), ya unidos a un marcador u opcionalmente con reactivos para acoplar un agente de unión a un anticuerpo (así como el marcador en sí mismo), tampones y/o reactivos e instrumentos para el aislamiento (opcionalmente mediante microdisección) para respaldar la puesta en práctica de la invención. Típicamente, también se incluirá una etiqueta o un indicador que describe, o un conjunto de instrucciones para el uso de, componentes de un kit en un método de detección de ligandos de la presente invención, donde las instrucciones se pueden asociar con un prospecto y/o el envase del kit o los componentes del mismo.
En otras realizaciones más, la presente invención se refiere a kits de inmunodetección para su uso con los métodos de inmunodetección descritos en la presente memoria. Debido a que los anticuerpos generalmente se usan para detectar FOLR1, los anticuerpos se incluirán generalmente en el kit. Por lo tanto, los kits de inmunodetección comprenderán, en un recipiente adecuado, un primer anticuerpo que se une a FOLR1 y/u, opcionalmente, un reactivo de inmunodetección y/o además, opcionalmente, una proteína FOLR1 o una muestra celular que contiene FOLR1.
Los reactivos de inmunodetección del kit pueden adoptar una de varias formas, incluyendo las etiquetas detectables que se asocian con y/o se unen al anticuerpo dado. También se contemplan las etiquetas detectables que se asocian con y/o se unen a un ligando de unión secundario. Ejemplos de ligandos secundarios son los anticuerpos secundarios que tienen afinidad de unión por el primer anticuerpo.
Otros reactivos de inmunodetección adecuados para su uso en los presentes kits incluyen el reactivo de dos componentes que comprende un anticuerpo secundario que tiene afinidad de unión por el primer anticuerpo, junto con un tercer anticuerpo que tiene afinidad de unión por el segundo anticuerpo, estando unido el tercer anticuerpo a una etiqueta detectable. Como se destaca en la presente memoria, se conoce en la técnica varias etiquetas ejemplares y/o todas dichas etiquetas pueden emplearse de forma adecuada en conexión con la presente invención.
Los kits también pueden comprender un agente terapéutico para el tratamiento del cáncer, tal como un inmunoconjugado anti-FOLR1.
El kit puede comprender además un reactivo de detección de FOLR1 usado para medir la expresión de FOLR1 en un sujeto que comprende un reactivo de detección de FOLR1 e instrucciones de uso. En una realización, el reactivo de detección de FOLR1 comprende un péptido de unión a FOLR1 o un anticuerpo anti-FOLR1. En otra realización, el kit comprende además un anticuerpo secundario que se une al anticuerpo anti-FOLR1.
En una realización, el anticuerpo específico de FOLR1 se incluye a una concentración de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 20 pg/mL, aproximadamente 0.1 a aproximadamente 15 pg/mL, aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 pg/mL, aproximadamente 0,5 a aproximadamente 20 pg/mL, aproximadamente 0,5 a aproximadamente 15 pg/mL, aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10 pg/mL, aproximadamente 1 a aproximadamente 20 pg/mL, aproximadamente 1 a aproximadamente 15 pg/mL, aproximadamente 1 a aproximadamente 10 pg/mL, aproximadamente 2 a aproximadamente 20 pg/mL, aproximadamente 2 a aproximadamente 15 pg/mL o aproximadamente 2 a aproximadamente 10 pg/mL. En otra realización, el anticuerpo específico de FOLR1 se incluye a una concentración de aproximadamente 1,5 pg/mL, aproximadamente 2 pg/mL, aproximadamente 3 pg/mL, aproximadamente 4 pg/mL, aproximadamente 5 pg/mL, aproximadamente 6 pg/mL, aproximadamente 7 pg/mL, aproximadamente 8 pg/mL, aproximadamente 9 pg/mL o aproximadamente 10 pg/mL. En otra realización, el anticuerpo específico de FOLR1 se incluye a una concentración de aproximadamente 2 pg/mL. En otra realización, el anticuerpo específico de FOLR1 se incluye a una concentración de aproximadamente 10 pg/mL.
En otra realización, el anticuerpo se incluye en una disolución concentrada con instrucciones de dilución para lograr una concentración final de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 pg/mL, aproximadamente 1 a aproximadamente 15 pg/mL, aproximadamente 1 a aproximadamente 10 pg/mL, aproximadamente 2 a aproximadamente 20 pg/mL, aproximadamente 2 a aproximadamente 15 pg/mL, o aproximadamente 2 a aproximadamente 10 pg/mL. En otra realización, el anticuerpo se incluye en una disolución concentrada con instrucciones de dilución para lograr una concentración final de aproximadamente 1,5 pg/mL, aproximadamente 2 pg/mL, aproximadamente 3 pg/mL, aproximadamente 4 pg/mL, aproximadamente 5 pg/mL, aproximadamente 6 pg/mL, aproximadamente 7 pg/mL, aproximadamente 8 pg/mL, aproximadamente 9 pg/mL o aproximadamente 10 pg/mL. En otra realización, el anticuerpo se incluye en una disolución concentrada con instrucciones de dilución para lograr una concentración final de aproximadamente 2 pg/mL. En otra realización, el anticuerpo se incluye en una disolución concentrada con instrucciones de dilución para lograr una concentración final de aproximadamente 10 pg/ml.
En otra realización, el kit comprende además un reactivo de detección que se selecciona del grupo que consiste en: una enzima, un fluoróforo, un marcador radioactivo y un luminóforo. En otra realización, el reactivo de detección se selecciona del grupo que consiste en: biotina, digoxigenina, fluoresceína, tritio y rodamina.
El kit también puede incluir instrucciones para la detección y puntuación de la expresión del FOLR1. El kit también puede incluir muestras de control o referencia. Los ejemplos no limitativos de muestras de control o referencia incluyen sedimentos celulares o líneas celulares de cultivo de tejidos derivadas de muestras normales (control normal) o de tumor (control positivo). Los ejemplos de líneas celulares incluyen líneas celulares transfectadas de forma estable o transitoria con un vector de expresión que expresa FOLR1. Los ejemplos adicionales incluyen sedimentos celulares y muestras de tejido descritas en los Ejemplos.
En algunas realizaciones, un kit es una combinación envasada que incluye los elementos básicos de: (a) reactivos de captura que comprenden los anticuerpos monoclonales contra FOLR1 humano; y (b) reactivos de detección que también pueden comprender anticuerpos monoclonales de FOLR1, pero también pueden comprender anticuerpos detectables (marcados o no marcados) que se unen a FOLR1. Estos elementos básicos se definen en la presente memoria.
En una realización, el kit comprende además un soporte sólido para los reactivos de captura, que puede proporcionarse como un elemento independiente o en el que los reactivos de captura ya se encuentran inmovilizados. De esta forma, los anticuerpos de captura en el kit pueden inmovilizarse en un soporte sólido o pueden inmovilizarse en dicho soporte que está incluido en el kit o se proporciona independientemente del kit.
En una realización, el reactivo de captura está recubierto en una placa de microtitulación. El reactivo de detección puede ser anticuerpos marcados detectados de forma directa o anticuerpos no marcados que se detectan por anticuerpos marcados dirigidos contra los anticuerpos no marcados producidos en una especie diferente. Cuando el marcador es una enzima, el kit incluirá normalmente sustratos y cofactores requeridos por la enzima, y cuando el marcador es un fluoróforo, un precursor de tinte que proporciona el cromóforo detectable. Cuando el reactivo de detección no está marcado, el kit puede comprender además un medio de detección para los anticuerpos detectables, tales como los anticuerpos marcados dirigidos a los anticuerpos no marcados, p. ej., en un formato detectado de manera fluorimétrica. Normalmente, cuando el marcador es una enzima, el kit incluirá sustratos y cofactores requeridos por la enzima, cuando el marcador es un fluoróforo, un precursor de tinte que proporciona el cromóforo detectable y cuando el marcador es biotina, una avidina tal como avidina, estreptavidina o estreptavidina conjugada con HRP o pgalactosidasa con MUG.
En una realización, el reactivo de captura es el anticuerpo de FOLR1 2.1, 5.7 o 9.20 o un anticuerpo que comprende las secuencias del anticuerpo 2.1, 5.7 o 9.20. En una realización, el reactivo de detección es el anticuerpo de FOLRI 2.1, 5.7 o 9.20 o un anticuerpo que comprende las secuencias del anticuerpo 2.1, 5.7 o 9.20. En otra realización, el reactivo de detección, que es el anticuerpo de FOLR1 2.1, 5.7 o 9.20 o un anticuerpo que comprende las secuencias del anticuerpo 2.1, 5.7 o 9.20, está biotinilado.
El kit también contiene típicamente instrucciones para llevar a cabo el ensayo, y/o proteína FOLR1, o fragmentos de la misma (p. ej., el dominio extracelular de FOLR1 o el dominio extracelular de FOLR1 y todo o una parte del dominio de unión de GPI) como un estándar de antígeno, así como otros aditivos tales como estabilizadores, tampones de incubación o lavado, y similares. En una realización, el estándar de antígeno de FOLR1 es una inmunoadhesina de FOLR1-Fc. El kit también puede incluir instrucciones para la detección y puntuación de la expresión de FOLR1.
Los componentes del kit se pueden proporcionar en proporciones predeterminadas y las cantidades relativas de los diversos reactivos variarán de forma adecuada para proporcionar concentraciones de los reactivos en disolución que maximicen de forma sustancial la sensibilidad del ensayo. En particular, los reactivos pueden proporcionarse en forma de polvos secos, usualmente liofilizados, que incluyen excipientes que, al disolverse, proporcionarán una disolución de reactivo con la concentración adecuada para combinarse con la muestra que se va a ensayar.
También se proporcionan composiciones que comprenden los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, descritos en la presente memoria. En una realización, una composición comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno descrito en la presente memoria y un tampón, p. ej., un tampón que se puede utilizar en un ensayo de detección, tal como FACS, IHC o ELISA. Dichos tampones son conocidos para los expertos en la técnica e incluyen diluyentes. A modo de ejemplo, determinados tampones de FACS se proporcionan en la presente memoria, p. ej., en los ejemplos de trabajo. Los tampones de FACS también pueden contener, por ejemplo, suero o albúmina (tal como suero de ternera, suero de cabra o BSA) y/o azida de sodio. Los tampones de FACS también pueden contener PBS, EDTA y/o ADNasa o cualquier combinación de los mismos. En la presente memoria también se proporcionan tampones de IHC y estos son conocidos para los expertos en la técnica. Los tampones de IHC pueden contener, por ejemplo, albúmina o suero de caseína (tal como suero de ternera, suero de cabra o BSA), Tween o Tritón, PBS y/o azida de sodio o cualquier combinación de los mismos. En la presente memoria también se proporcionan tampones de ELISA y estos son conocidos para los expertos en la técnica. Los tampones de ELISA pueden contener, por ejemplo, albúmina o suero (tal como suero de ternera, suero de cabra o BSA), leche en polvo desnatada, caseína y/o gelatina, o cualquier combinación de los mismos.
Las realizaciones de la presente descripción se pueden definir adicionalmente por referencia a los siguientes ejemplos no limitativos, que describen en detalle la preparación de determinados anticuerpos de la presente descripción y métodos para usar anticuerpos de la presente descripción. Será evidente para los expertos en la técnica que se pueden poner en práctica muchas modificaciones, tanto en los materiales como en los métodos, sin alejarse del alcance de la presente descripción.
Ejemplos
Se entiende que los ejemplos y realizaciones descritos en la presente memoria tienen propósitos meramente ilustrativos y que se sugerirán a los expertos en la técnica diversas modificaciones o cambios en vista de los mismos y deben incluirse dentro del espíritu y ámbito de esta solicitud.
Ejemplo 1: Generación de hibridomas de FOLR1
Los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales anti-FOLR1 humano que son adecuados para tinción por inmunohistoquímica (IHC) (anticuerpos de la invención) se seleccionaron a partir de más de 16.000 hibridomas. Los hibridomas se produjeron mediante inmunización de ratones Balb/c de tipo salvaje con diferentes antígenos, incluyendo: células 300-19 fijadas en formalina que se transfectaron con FOLR1 humano, proteína recombinante Fc de IgG2a murina y FOLR1 humano, y proteína recombinante de FOLR1 humano. La inmunización con las células 300 19 fijadas se llevó a cabo mediante inyección subcutánea de las células 300-19 transfectadas en PBS (5E6 células/ratón/inyección) en ausencia de adyuvante. La inmunización con proteínas recombinantes de FOLR1 se realizó mediante inyección subcutánea de la proteína emulsionada en adyuvante completo de Freund (CFA) o adyuvante incompleto de Freund para refuerzo (Sigma) o adyuvante de ratón Magic (Creative Diagnostics). En general, se inmunizaron los ratones cinco veces con intervalos de dos semanas antes de recibir un refuerzo final mediante inyección intraperitoneal del inmunógeno tres días antes de la fusión.
Se llevó a cabo un total de 16 fusiones independientes (incluyendo las fusiones 352, 353 y 354) mediante el uso de células del bazo que se originaron en los ratones Balb/c de tipo salvaje inmunizados o células P3X63Ag8.653 de mieloma murino (células P3). La fusión celular se llevó a cabo mediante el uso de una máquina de electrofusión ECM200 (BTX Harvard Apparatus) de acuerdo con protocolos estándar. Cada fusión proporcionó más de 1.000 hibridomas. Los anticuerpos producidos por estos hibridomas se cribaron y confirmaron mediante un método basado en FACS mediante el uso de células negativas para FOLR1 y positivas para FOLR1 desnaturalizadas. De los más de 16.000 hibridomas cribados, se descubrieron 14 hibridomas que eran positivos mediante cribado por FACS. Todos los hibridomas positivos se originaron de los ratones inmunizados con proteína recombinante Fc de IgG2a murina y FOLR1 humano.
De los 14 hibridomas que eran inicialmente positivos mediante cribado por FACS, solamente diez mostraron una concentración de IgG suficiente para un análisis adicional.
Ejemplo 2. Evaluación inmunohistoquímica de sobrenadantes de hibridomas
Diez de los 14 hibridomas iniciales se analizaron mediante IHC. El análisis se llevó a cabo mediante el uso del aparato automático de tinción Leica Bonc RX y los reactivos y condiciones enumerados en la Tabla 9.
Tabla 9 Reactivos condiciones del ensa o de IHC
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Se pusieron en un horno a 60 °C portaobjetos que contenían células embebidas en parafina y fijadas en formalina (FFPE), tejidos normales, biopsias de tumor de pulmón de pacientes y biopsias de tumor de ovario de pacientes y se desparafinaron mediante el uso de disolución de desparafinado Bond y etanol al 100 %. La recuperación de epítopos inducida por calor mediante el uso de Recuperación de epítopo Bond 2 (disolución a base de ácido etilendiaminotetraacético de pH 9,0) se llevó a cabo durante 20 minutos y se bloqueó la peroxidasa endógena con peróxido durante 5 minutos. Los portaobjetos se incubaron con anticuerpos generados por ImmunoGen, Inc. o anticuerpos de control muIgG1 de Leica/Novocastra a diversas concentraciones durante 15 minutos. Los anticuerpos unidos se detectaron mediante incubación con el sistema de detección de Bond Refine de Leica. Después de la aplicación de los anticuerpos, los portaobjetos se incubaron con reactivo Post Primary (IgG anti-ratón de conejo) durante 8 minutos, polímero (polímero anti-conejo de cabra) durante 8 minutos y DAB (tetrahidrocloruro de 3,3-diaminobencidina) durante 10 minutos, lo cual dio como resultado una señal de color marrón. Los portaobjetos se contratiñeron con hematoxilina durante 5 minutos.
Las muestras de tejido FFPE se derivaron de bloques de tejido humano obtenidos de Proteogenex y Cooperative Human Tissue Network (CHTN), tal como se describe a continuación. Las muestras de células FFPE se derivaron de la línea celular KB proporcionada por la American Tissue Culture Collection. Los portaobjetos que contenían secciones de muestras se prepararon a partir de bloques FFPE mediante el uso de un microtomo configurado a 5 pm y se montaron en portaobjetos con carga positiva. Estos portaobjetos se dejaron secar al aire durante la noche antes de la tinción.
Tabla 10. Muestras de ensa o FFPE
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continuación
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Se puntuaron los patrones de distribución e intensidad de tinción de FOLR1 en relación con la tinción de IgG de control (no específica). La intensidad se puntuó en una escala de 0 a 3, donde 0 = sin tinción, 1 = tinción débil, 2 = tinción moderada y 3 = tinción fuerte. La uniformidad de la tinción se puntuó como negativa (las células no presentan tinción positiva), focal (<25 % de las células se tiñeron), heterogénea (25-75 % de las células se tiñeron) y homogénea (>75 % de las células se tiñeron). Las escalas de puntuación e intensidad de tinción se describen a continuación. Toda la tinción fue evaluada por patólogo certificado por la junta.
Tabla 11. Intensidad uniformidad de la tinción
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Proceso de selección por IHC para identificar el o los hibridomas para IHC de FOLR1 FFPE
Los clones primarios positivos por FACS en células desnaturalizadas positivas para FOLR1 (diez clones en total) se evaluaron mediante iHc . Se obtuvieron dos clones a partir de la fusión 352 (clones 352.1 y 352.2). Se obtuvieron seis clones a partir de la fusión 353 (clones 353.1, 353.2, 353.3, 353.5, 353.9, 353.15), y se obtuvieron dos clones a partir de la fusión 354 (clones 354.1 y 354.2). Se recogieron los sobrenadantes de hibridomas de las células de hibridoma cultivadas y se usaron para el análisis. Las concentraciones de anticuerpo en los sobrenadantes de hibridomas se determinaron por ELISA mediante el uso de anticuerpo policlonal específico de anti-cadena L murina para capturar el anticuerpo monoclonal muestra del sobrenadante y anticuerpo policlonal específico de anti-Fc murino para detectar el anticuerpo capturado; se utilizó una muestra de IgG1 monoclonal murina con concentración conocida como estándar para calcular la concentración de IgG. Se observó que el medio de cultivo (sin diluir) no interfería con los métodos de tinción de IHC (no se observó fondo/tinción no específica cuando se utilizó el medio en lugar del anticuerpo primario). Se tiñeron diez sobrenadantes (IMGN 352.1, 352.2, 353.1, 353.2, 353.3, 353.5, 353.9, 353.15, 354.1 y 354.2) diluidos a diversas concentraciones de hasta 10 pg/mL en diluyente de anticuerpo Leica mediante el uso de muestras de control positivas conocidas de FOLR1 (pulmón humano normal, adenocarcinoma seroso papilar de ovario derivado de paciente y células KB) y se evaluaron para identificar clones candidatos positivos (clones que presentaran tinción de membrana y especificidad aceptables en muestras positivas para FOLR1). Cinco de los diez clones presentaron una tinción de membrana aceptable en muestras positivas para FOLR1 y una buena especificidad. Se determinó una concentración de tinción adecuada de forma experimental para cada uno de los cinco clones candidatos de la siguiente manera: 353.1 (0,7 pg/mL), 353.2 (2,3 pg/mL), 353.3 (2,3 pg/mL), 353.5 (2 pg/mL y 10 pg/mL) y 353.9 (2 pg/mL y 10 pg/mL). De los 5 clones restantes, el clon 353.15 (teñido con 2 y 10 pg/mL) presentó una tinción de membrana aceptable en células KB y tejido de pulmón normal; sin embargo, se observó tinción citoplasmática únicamente en el tejido ensayado de tumor de ovario de paciente. Los clones 352.1, 352.2 y 354.1 no presentaron una tinción visible en ninguna de las muestras y el clon 354.2 presentó únicamente tinción citoplasmática no específica aparente, todos ellos considerados no aceptables.
Se subclonaron adicionalmente los cinco clones candidatos. Se identificaron satisfactoriamente subclones para los cuatro clones (353.2, 353.3, 353.5 y 353.9), no se generaron subclones del clon 353.1. Se purificó un total de ocho subclones. Se obtuvieron dos subclones a partir del clon 353.5 (353.5-7 y 353.5-10). Se obtuvieron dos subclones a partir del clon 353.9 (353.9-20 y 353.9-21). Se obtuvieron dos subclones a partir del clon 353.3 (353.3-8 y 353.3-9), y se obtuvieron dos subclones a partir del clon 353.2 (353.2-1 y 353.2-12). (Cabe destacar que estos subclones también se mencionan como 5.7, 5.10, 9.20, 9.21, 3.8, 3.9, 2.1 y 2.12, respectivamente.) La caracterización por IHC de los subclones se llevó a cabo mediante el uso de los métodos descritos anteriormente (Tabla 9: Reactivos y condiciones del ensayo de IHC) a concentraciones de anticuerpo de 2 y 10 pg/mL. También se secuenciaron los ocho subclones como se describe en el Ejemplo 3, más adelante. Los subclones candidatos se evaluaron adicionalmente para identificar y clasificar la especificidad y tinción de membrana óptima, de la siguiente manera: se seleccionaron [353.2­ 1, 353.2-12], [353.9-20, 353.9-21], [353.5-7,353.5-10], y [353.3-8, 353.3-9] para su caracterización adicional (los subclones se agrupan conjuntamente entre paréntesis de acuerdo con su identidad de secuencia, tal como se describe en el Ejemplo 3).
Se seleccionaron dos subclones para la optimización adicional mediante ensayo de IHC: 353.2-1 y 353.9-20. Ambos anticuerpos se utilizaron para teñir pulmón humano normal, glándula salival humana normal, páncreas humano normal, biopsias de cáncer de ovario de paciente, biopsias de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) de paciente y biopsias de carcinoma de células renales de células claras de paciente. En condiciones óptimas (véase la Tabla 12 más adelante y la Figura 13), ambos subclones presentaron una tinción específica y sensible adecuada tanto en tejidos de tumor de paciente como en tejidos humanos normales. Los conductos del páncreas, epitelio respiratorio de pulmón normal y conductos intercalados presentaron una tinción positiva asociada a membrana. Los islotes/células acinares del páncreas, tejido conectivo interalveolar del pulmón y células acinares de las glándulas salivales que se esperaba que fuesen negativas no presentaron tinción positiva con ningún subclón. Las células tumorales de muestras de cáncer de ovario, NSCLC y carcinoma de células renales de células claras que se esperaba que fuesen positivas presentaron una tinción positiva asociada a membrana, la cual se localizó en las células tumorales. Las subestructuras tumorales que se esperaba que fuesen negativas (estroma, vasos y linfocitos) no presentaron tinción positiva con 353.2-1 ni 353.9-20. La tinción adicional de tejidos normales con 353-2.1 (FOLR1-2.1) se resume en la Tabla 13, más adelante y se muestra en la Figura 14. Tomados en conjunto, los datos de caracterización por IHC sugieren que 353.2­ 1 y 353.9-20 son específicos para FOLR1 en tejidos f Fp E (véanse la Figura 1 y la Figura 2).
Tabla 12. Condiciones de ensa o o timizadas
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Tabla 13. Condiciones de ensa o o timizadas
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Ejemplo 3. Caracterización de los anticuerpos anti-FOLR1 seleccionados
Tal y como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 2, de los catorce clones de hibridoma seleccionados en base al cribado de FACS primario y de confirmación, se analizaron diez clones primarios mediante análisis de inmunohistoquímica (IHC). De los diez clones primarios (es decir, 352.1, 352.2, 353.1, 353.2, 353.3, 353.5, 353.9, 353.15, 354.1 y 354.2), cinco fueron positivos por IHC (es decir, 353.1, 353.2, y 353.3, 353.5 y 353.9), y los cinco se derivaron de la misma fusión (fusión 353). Cuatro de los cinco se subclonaron con éxito. Se eligió un subclón del clon primario 353.2 y se denominó 353.2-1 (“2.1”). Se eligió un subclón del clon primario 353.3 y se denominó 353.3-8 (“3.8”). Se eligió un subclón del clon primario 353.5 y se denominó 353.5-7 (“5.7”), y se eligieron dos subclones del clon primario 353.9 y se denominaron 353.9-20 (“9.20”) y 353.9-21 (“9.21”). Los subclones 9.20 y 9.21 se secuenciaron y, como se esperaba, ambos subclones tenían la misma secuencia. Además, dos de los clones, 2.1 y 9.20, se depositaron en la ATCC como PTA-120197 y PTA-120196, respectivamente, el 16 de abril de 2013.
Especificidad de los anticuerpos anti-FOLR1 mediante transferencia Western
La especificidad de los anticuerpos generados se analizó mediante transferencia Western con un panel de lisados celulares preparados a partir de líneas celulares positivas para FOLR1 (Igrov-1, Ovcar-3, Caov-3, Wish y Skov-3) y negativas para FOLR1 (BxPC3, Panc-1 y ASPC1). Para el ensayo, se pasaron los lisados por electroforesis de gel de poliacrilamida SDS y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa mediante procedimientos estándar. La membrana se incubó con los anticuerpos anti-FOLRI de la invención, y los complejos de antígeno-anticuerpo formados se detectaron con anticuerpos anti-murinos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (hrp) (Figura 3). Todos los anticuerpos anti-FOLR1 ensayados reconocieron FOLR1 en las líneas celulares con niveles elevados de expresión de FOLR1 (es decir, Igrov-1 y Wish). El FOLR1 en las líneas celulares con expresión baja, Ovcar-3, Caov-3 y Skov-3, fue detectado únicamente por los clones anti-FOLR1 2.1 y 9.21; los clones 3.8 y 5.7 no tiñeron estos lisados celulares, quizás debido a la sensibilidad insuficiente de los anticuerpos. Los clones no detectaron bandas no específicas adicionales en las líneas celulares positivas para FOLR1; no se observó tinción de las líneas celulares negativas para FOLR1.
Unión de los anticuerpos anti-FOLR1 a células desnaturalizadas y no desnaturalizadas
La capacidad de los anticuerpos anti-FOLR1 de unirse a FOLR1 desnaturalizado y no desnaturalizado (confirmación nativa) se evaluó mediante FACS indirecto con células KB y T47D positivas para FOLR1. Las células se recogieron con versina y se lavaron con disolución salina tamponada con fosfato (PBS). Las células desnaturalizadas se prepararon mediante incubación de las células en PBS que contenía formaldehído al 10 % a 4 °C durante la noche, seguido de lavado con PBS e incubación a 95 °C durante 30 minutos. Las células desnaturalizadas y no desnaturalizadas se incubaron entonces con anticuerpos anti-FOLRI diluidos en tampón de FACS (medio RPMI-1640 suplementado con suero de cabra normal al 2 %) en hielo durante 2 horas. Las células se centrifugaron entonces, se lavaron con PBS y se incubaron durante 40 minutos con anticuerpo IgG anti-ratón de cabra conjugado con FITC. Las células se centrifugaron nuevamente, se lavaron con PBS y se resuspendieron en 0,2 ml de PBS que contenía formaldehído al 1 %. La fluorescencia asociada a las células se midió mediante el uso de un citómetro de flujo FACSCalibur con múltiples pocillos de HTS y se analizó mediante el uso de CellQuest Pro (BD Biosciences, San Diego, EE. UU.). Como se muestra en la Figura 4, todos los anticuerpos anti-FOLR1 se unieron tanto a las células desnaturalizadas como a las no desnaturalizadas.
Afinidad de los anticuerpos anti-FOLR1 mediante ELISA
Se examinó la afinidad de unión de los anticuerpos anti-FOLR1 mediante ELISA, donde se utilizó proteína recombinante Fc2a murina y FOLR1 humano como el antígeno. La proteína recombinante se inmovilizó en placas de microtitulación y los anticuerpos se añadieron a un rango de concentraciones a las placas. Las placas se incubaron durante dos horas a temperatura ambiente, se lavaron con PBS suplementado con Tween-20 al 0,05 % y se incubaron con anticuerpo secundario anti-murino de cabra marcado con hrp durante una hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con PBS/Tween-20 nuevamente y el anticuerpo conjugado con hrp unido se detectó mediante la adición de sustrato TMB de hrp (Bio-FX). Los resultados representativos se muestran en la Figura 5. Los anticuerpos anti-FOLR1 tuvieron una afinidad similar para FOLR1 humano a una concentración eficaz mitad de la máxima (CE50) de 0,5 a 0,9 nM.
No hay reactividad cruzada de los anticuerpos anti-FOLR1 con FOLR2 y FOLR3
El FOLR1 es un miembro de la familia de receptores de folato. Se evaluó la reactividad cruzada de los anticuerpos anti-FOLR1 con los otros miembros de la familia, FOLR2 y FOLR3, mediante ELISA. Se inmovilizó la proteína recombinante FOLR2-His o FOLR3-His (R&D Systems) en placas Ni-NTA (QIAGEN) y se añadieron los anticuerpos anti-FOLR1 a las placas y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Se utilizaron como controles positivos para el ELISA de FOLR2 y FOLR3 anticuerpos policlonales anti-FOLR2 y FOLR3 (R&D systems), respectivamente. Los complejos de anticuerpo-antígeno formados se detectaron con anticuerpo secundario anti-murino de cabra marcado con hrp. Tal y como se muestra en la Figura 6, los anticuerpos anti-FOLR1 de la invención no se unieron a FOLR2 o FOLR3, solamente los anticuerpos de control detectaron los antígenos correspondientes.
Ejemplo 4. Caracterización del epítopo del antígeno
El FOLR1 humano tiene tres sitios posibles de N-glicosilación en las posiciones 69, 161 y 201 (UniProt) y, según se informa en la bibliografía, los tres sitios están glicosilados. Para caracterizar la naturaleza de los epítopos reconocidos por los anticuerpos anti-FOLR1 descritos en la presente memoria, se realizaron experimentos de unión con el receptor desglicosilado y no tratado. De los clones anti-FOLR1 generados, solamente se utilizó el clon 2.1 en el estudio debido a que, basándose en los datos de secuenciación, los clones están relacionados y es posible que se unan al mismo epítopo. Además del clon 2.1, se incluyeron dos anticuerpos anti-FOLR1 más: huMov19 (2011/106528) y el clon BN3.2 (Leica). Con el fin de desglicosilar FOLR1, se trataron FOLR1 humano recombinante o lisados de células KB o Igrov-1 positivas para FOLR1 con una mezcla de enzimas de desglicosilación (kit enzimático DeGlycoMX, QA-bio) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después, las muestras de FOLR1 tratado y no tratado se usaron en análisis de ELISA y transferencia Western. Para el ELISA, se inmovilizó el FOLR1 desglicosilado y no tratado en placas de ELISA (Immulon) y se añadieron los anticuerpos anti-FOLR1 FRIHC2-1 (“2.1”) y huMov19. Después de 2 horas de incubación, se detectaron los complejos de anticuerpo-antígeno con anticuerpo secundario anti-murino (para 2.1) o anti-humano (para huMov19) de cabra marcado con hrp (Figura 7). Para el análisis de transferencia Western, se separaron las muestras de lisados desglicosilados y no tratados o de proteína recombinante huFOLR1 mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa mediante los procedimientos estándar. La membrana se incubó con los anticuerpos anti-FOLRI 2.1, huMov19 o BN3.2, y los complejos de antígeno-anticuerpo se detectaron con los anticuerpos secundarios anti-murinos o anti- humanos adecuados conjugados con peroxidasa de rábano picante (Figura 8). Tal y como se muestra en las Figuras 7 y 8, la unión del anticuerpo 21 a FOLR1 desglicosilado frente a no tratado se redujo significativamente, lo cual sugiere que el anticuerpo se une a un epítopo glicodependiente. En contraste, los otros dos anticuerpos anti-FOLR1, huMov19 y BN3.2, se unen de manera similar a un receptor desglicosilado y no tratado, lo cual indica que (i) la proteína FOLR1 no se dañó durante el procedimiento de desglicosilación y (ii) huMov19 y BN3.2 reconocen epítopos de proteína de FOLR1.
Ejemplo 5. Clonación y secuenciación de las regiones VL y VH de los anticuerpos anti-FOLR1 humano
Se preparó ARN celular total a partir de 5 x 106 células de los hibridomas de FOLR1 descritos en el Ejemplo 1, mediante el uso del kit RNeasy (QIAgen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se sintetizó posteriormente el ADNc de los ocho clones subclones (2.1, 2.12, 3.8, 3.9, 5.7, 5.10, 9.20 y 9.21) a partir del ARN total mediante el uso del kit de síntesis de ADNc SuperScript II (Invitrogen).
Los procedimientos de PCR para amplificar los ADNc de región variable del anticuerpo derivados de células de hibridoma se basaron en los métodos descritos por Wang et al. ((2000) J Immunol Methods. 233:167-77) y Co et al. ((1992) J Immunol. 148:1149-54). Las secuencias de cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH) se amplificaron mediante cebadores degenerados en el extremo 5' y cebadores específicos de la región constante kappa murina o constante de IgG1, respectivamente, en el extremo 3'. Las reacciones de PCR se pasaron entonces por un gel de agarosa de punto de fusión bajo al 1 %, seguido por la escisión de las bandas de amplicón de 300 a 400 pb que se purificaron posteriormente mediante el uso de mini columnas de ADN Zymo. Los amplicones purificados se enviaron a Beckman Coulter Genomics para su secuenciación mediante el uso de los mismos cebadores 5' y 3' de las reacciones de PCR, con el fin de generar las secuencias de ADNc de región variable a partir de ambas direcciones. Dado que los cebadores degenerados utilizados para clonar las secuencias de ADNc de VL y VH alteran el extremo 5', fueron necesarios esfuerzos adicionales de secuenciación para verificar las secuencias completas de ADNc. Las secuencias preliminares se introdujeron en una búsqueda del sitio IgBlast de la NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) para identificar las secuencias de línea germinal murina de las cuales se derivaron las secuencias de anticuerpo. Entonces, se diseñaron los cebadores de PCR para hibridar con la secuencia líder ligada a la línea germinal del anticuerpo murino, de manera que esta nueva reacción de PCR pueda proporcionar una secuencia de ADNc de región variable completa, sin alteraciones producidas por los cebadores de PCR. Las reacciones de PCR, purificaciones de bandas y secuenciación se llevaron a cabo como se ha descrito anteriormente.
Determinación de masa para la confirmación de la secuencia
Las secuencias de ADNc de región variable obtenidas para cada uno de los anticuerpos anti-FOLR1 se combinaron con secuencias de región constante de línea germinal para obtener secuencias de ADNc de anticuerpo de longitud completa. Los pesos moleculares de las cadenas pesada y ligera se calcularon entonces a partir de las traducciones de las secuencias de ADNc y se compararon con los pesos moleculares obtenidos a partir de los análisis de LC/MS de los anticuerpos anti-FOLR1 murinos purificados. La LC/MS se realiza mediante desglicosilación y reducción del anticuerpo para aislar péptidos completos de cadena ligera y cadena pesada. Los pesos moleculares observados para cada una de las cadenas pesadas coincidieron con lo esperado, pero cada una de las cadenas ligeras tuvo un desfase de aproximadamente 85 Da. El análisis posterior de fragmentación de péptidos mediante LC/MS de los fragmentos de cadena ligera indicó que la serina final del péptido líder de cadena ligera se conservó de hecho en la cadena ligera madura, lo cual añade aproximadamente 87 Da al PM esperado, lo cual confirma las secuencias de ADNc para cada uno de los anticuerpos de FOLR1.
Secuencias de CDR compuestas para los anticuerpos anti-FOLR1
Los alineamientos de las secuencias de anticuerpo para los 8 subclones revelaron que 3 de los 4 hibridomas originales habían producido anticuerpos relacionados estrechamente, pero únicos. Tal y como se esperaba, cada uno de los 4 pares hermanos de subclones eran idénticos. Además, dos conjuntos de subclones eran también idénticos, lo cual dio como resultado 3 secuencias únicas de anticuerpos (SEQ ID NO:27-32) (2.1, 5.7 y 9.20). Las secuencias de marco variables de cadena ligera y cadena pesada de estos 3 anticuerpos únicos están estrechamente relacionadas, pero cada anticuerpo contiene CDR únicas, probablemente como resultado de sustituciones somáticas de aminoácidos (véase la Tabla 14 más adelante). Debido a que se observó que estas variantes de CDR de los anticuerpos anti-FOLR1 murinos eran funcionalmente idénticas, proporcionan cierto conocimiento estructural respecto a la flexibilidad de secuencia de las CDR de los anticuerpos anti-FOLR1 de la invención. Las CDR 2 y 3 de cadena ligera eran idénticas en cada uno de los anticuerpos, lo cual sugiere que estas CDR altamente conservadas pueden proporcionar una base estructural consistente para la unión de FOLR1. Por otro lado, las sustituciones de aminoácidos en las CDR restantes, particularmente las de las CDR 2 y 3 de cadena pesada, sugieren que estas posiciones son cruciales para el refinamiento de la afinidad y especificidad de estos anticuerpos. Las sustituciones de residuo específicas en estas posiciones de CDR también proporcionan ejemplos de residuos que pueden incorporarse en las versiones modificadas por ingeniería de estos anticuerpos. La Tabla 14 proporciona un listado de secuencias de CDR compuestas recopilado a partir de los anticuerpos anti-FOLR1 de la invención. Las CDR compuestas identificadas en la presente memoria pueden usarse para el diseño de anticuerpos recombinantes que se esperaría que preservaran los atributos funcionales de los anticuerpos anti-FOLR1 de la presente invención.
Tabla 14 CDR com uestas
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Humanización de anticuerpos
El anticuerpo FRIHC2-1 se humanizó siguiendo los métodos de modificación en superficie descritos previamente, tal como, por ejemplo, en Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91(3):969-973 (1994) y Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895-904 (1996), que se incorporan en su totalidad en la presente memoria por referencia. La modificación en superficie implica la identificación de los residuos en superficie del marco de la región variable en las cadenas ligeras y en las pesadas, y su reemplazo con equivalentes humanos. Las CDR murinas se preservan en el anticuerpo modificado en superficie. Los ejemplos de CDR del anticuerpo FRIHC2-1 se definen como se indicó en la Tabla 14. Para minimizar las preocupaciones acerca del impacto de conjugar lisinas que se encuentran en las CDR, se reemplazaron la lisina 24 y la lisina 27 en la CDR1 de cadena ligera del anticuerpo FRIHC2-1 murino con arginina para la versión 1.0 humanizada (que se muestra en cursiva), de manera que se proporcionan ambas versiones de la CDR1 de LC. Además de la definición de CDR2 de cadena pesada de AbM que se emplea para la modificación en superficie, la tabla proporciona ejemplos de CDR2 de cadena pesada definidas por Kabat tanto para la versión murina como humana del anticuerpo f Rih C2-1. La secuencia subrayada marca la parte de la CDR2 de cadena pesada de Kabat que no se consideró una CDR para modificación en superficie.
Las posiciones de residuos en superficie se definieron como cualquier posición con una accesibilidad relativa del 30 % o mayor (Pedersen J.T. et al., J. Mol. Biol. 1994; 235: 959-973). Los residuos en superficie calculados se alinearon entonces con secuencias en superficie de la línea germinal humana para identificar la secuencia en superficie humana más homóloga. La secuencia de línea germinal humana usada como la superficie de reemplazo para los dominios VL del anticuerpo FRIHC2-1 fue IGKV2-30*01, mientras que se utilizó IHV1-69*10 como la superficie de remplazo para la VH del anticuerpo FRIHC2-1. Los cambios específicos de residuos en superficie de marco para el anticuerpo FRIHC2-1 se proporcionan en la Figura 9. Dado que la cadena ligera modificada en superficie incluía las sustituciones de lisina de CDR1 en la versión preferida, también se generó una versión modificada en superficie (v1.01) con lisinas murinas conservadas en CDR-L1. La Figura 10 muestra el alineamiento de las secuencias modificadas en superficie para el dominio variable de FRIHC2-1 tanto de la cadena ligera como pesada con sus contrapartes murinas.
Además de la humanización por modificación en superficie del dominio variable, el anticuerpo FRIHC2-1 también se humanizó siguiendo la tecnología de injerto de regiones determinantes de la complementariedad (CDR) (Jones et al., Nature 321: 604-608 (1986) y Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536 (1988)). El método de injerto de CDR consiste en injertar las CDR de un anticuerpo murino evolucionado naturalmente en las regiones de marco (FR) de Fv de un anticuerpo humano. El esquema de numeración de Kabat y las definiciones de CDR de Kabat se utilizaron para los injertos de CDR del anticuerpo FRIHC2-1. Los ejemplos de CDR de FRIHC2-1 para el injerto de CDR se proporcionan en la Tabla 14. La secuencia de línea germinal de inmunoglobulina humana con la mayor homología con el anticuerpo FRIHC2-1 murino se identificó mediante la herramienta interactiva, V-QUEST, del sistema internacional de información ImMunoGeneTics® (IMGT (http://imgt.cines.fr/) tal como se describe en Lefranc, Nucleic Acids Res. 29: 207-209 (2001). Las secuencias de línea germinal humana usadas como los marcos aceptores para los dominios VL y VH del anticuerpo FRIHC2-1 fueron IGKV2D-29*02 e IGHV1-2*02, respectivamente. Para minimizar las preocupaciones acerca del impacto de conjugar lisinas que se encuentran en las CDR, se reemplazaron la lisina 24 y la lisina 27 en la CDR1 de cadena ligera del anticuerpo FRIHC2-1 murino con arginina en las construcciones injertadas con CDR (Tabla 15). Los cambios específicos de residuo marco, así como la sustitución en CDR-L1 en el injerto de CDR del anticuerpo FRIHC2-1 se proporcionan en la Figura 11, y los alineamientos de las secuencias con injerto de CDR para los dominios variables del anticuerpo FRIHC2-1 con sus contrapartes murinas se ilustran en la Figura 12.
Tabla 15
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Ejemplo 6. Evaluación por IHC del anticuerpo 353-2.1 (FOLR1-2.1) mediante el uso de muestras de tumor humano.
Se evaluaron muestras de tumor humano representativas de cáncer de ovario (n=63), adenocarcinoma de pulmón (n=104) y adenocarcinoma endometrial (n=58) para determinar la expresión de FOLR1 por IHC mediante el uso del anticuerpo 353-2.1. La intensidad de la tinción de FOLR1 y la distribución de las puntuaciones se resumen en la Tabla 16, más adelante. La Figura 15 muestra un ejemplo de tinción de tejido de cáncer de ovario y adenocarcinoma de pulmón con el anticuerpo 353-2.1. Estos resultados demuestran la utilidad de 353-2.1 como un anticuerpo específico y sensible para su uso en ensayos de IHC para identificar pacientes como candidatos potenciales para la terapia con agentes dirigidos a FOLR1 (p. ej., IMGN853).
T l 1 Di ri i n n i n i i i
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La especificidad única y la afinidad de unión elevada para el antígeno del anticuerpo FOLR1-2.1 (FOLR1 353-2.1) se demostró adicionalmente mediante el uso de un ensayo de IHC adicional. Este ensayo de IHC utiliza el kit de detección OptiView DAB en un aparato automatizado de tinción de portaobjetos Ventana BenchMark XT para la determinación semi cuantitativa de la expresión de la proteína FOLR1 en muestras de tejidos embebidas en parafina y fijadas en formalina. El ensayo se optimizó y se validó con respecto a la especificidad, sensibilidad y precisión mediante el uso de controles de tejido normal y tumoral. Bajo la condición optimizada, se observó claramente una tinción marcada de la membrana en las células tumorales, mientras que los tejidos estromales normales fueron completamente negativos. (Figura 16). Además, este ensayo también logró un rango dinámico más amplio, permitiendo de esta manera una mejor discriminación de intensidad de tinción moderada (nivel 2, tinción marrón medio, Figura 17) de la intensidad de

Claims (18)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un epítopo de FOLR1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende las secuencias de polipéptidos de CDR1-3 de VH y CDR1-3 de VL que se seleccionan del grupo que consiste en:
(a) s Eq ID NO: 3-8, respectivamente;
(b) SEQ ID NO: 9-14, respectivamente;
(c) SEQ ID NO: 15-20, respectivamente;
(d) SEQ ID NO: 21-26, respectivamente;
(e) SEQ ID NO: 3-5 y SEQ ID NO: 59, 7 y 8, respectivamente;
(f) SEQ ID NO: 3, 60 y 5 y SEQ ID NO: 6-8, respectivamente;
(g) SEQ ID NO: 3, 61 y 5 y SEQ ID NO: 6-8, respectivamente;
(h) SEQ ID NO: 3, 60 y 5 y SEQ ID NO: 59, 7 y 8, respectivamente; y
(i) SEQ ID NO: 3, 61 y 5 y SEQ ID NO: 59, 7 y 8, respectivamente.
2. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a FOLR1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada humanizada que comprende las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden los aminoácidos de la SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52 o 53, y SEQ ID NO: 54, respectivamente, una región variable de cadena ligera humanizada que comprende las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden los aminoácidos de la SEQ ID NO: 48, SEQ ID n O: 49 y Se Q ID NO: 50, respectivamente, y una región constante murina, particularmente en donde la región variable de cadena pesada humanizada comprende los aminoácidos de la SEQ ID NO: 45, y la región variable de cadena ligera humanizada comprende los aminoácidos de la SEQ ID NO: 47.
3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende secuencias de polipéptidos que comprenden los aminoácidos de secuencias que se seleccionan del grupo que consiste en:
(a) SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28;
(b) SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30;
(c) SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32;
(d) SEQ ID NO: 62 y SEQ ID NO: 63 o SEQ ID NO: 64;
(e) SEQ ID NO: 65 y SEQ ID NO: 66 o SEQ ID NO: 67;
(f) SEQ ID NO: 68 y SEQ ID NO: 69.
4. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1 o 3,
i) en donde el anticuerpo se produce de forma recombinante; y/o
ii) en donde dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es murino, no humano, humanizado, quimérico, modificado en superficie, y/o
iii) en donde dicho anticuerpo se une a FOLR1 humano pero no a FOLR2 ni FOLR3; y/o
iv) que es un anticuerpo de longitud completa o que es un fragmento de unión a antígeno.
5. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4
i) que se une a un receptor 1 de folato humano con una Kd de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10 nM; y/o
ii) que se une a un receptor 1 de folato humano con una Kd de aproximadamente 1,0 nM o mejor; y/o iii) en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo está marcado de manera detectable.
6. Una célula que produce el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
7. Un método para preparar el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende (a) cultivar la célula de la reivindicación 6; y (b) aislar dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de dicha célula cultivada.
8. Una composición que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y un tampón seleccionado del grupo que consiste en: un tampón de FACS, un tampón de IHC y un tampón de ELISA.
9. Un método para detectar la expresión de FOLR1 en una muestra que comprende poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o la composición de la reivindicación 8;
particularmente en donde
a) dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo está marcado de manera detectable, especialmente en donde dicho marcador se selecciona del grupo que consiste en marcador inmunofluorescente, marcador quimioluminiscente, marcador fosforescente, marcador enzimático, marcador radiactivo, avidina/biotina, partículas de oro coloidal, partículas coloreadas y partículas magnéticas; y/o
b) en donde la expresión de FOLR1 se determina mediante radioinmunoensayo, transferencia Western, citometría, ensayo de inmunofluorescencia, inmunoensayo enzimático, ensayo de inmunoprecipitación, ensayo de quimioluminiscencia o ensayo de inmunohistoquímica, especialmente en donde b1) la citometría es citometría de flujo o b2) en donde la expresión de FOLR1 se determina mediante IHC.
10. Un método para identificar que un cáncer tiene probabilidad de responder a un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, donde dicho método comprende:
(a) poner en contacto una muestra biológica que comprende células de dicho cáncer con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o la composición de la reivindicación 8; y
(b) detectar la unión de dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno a FOLR1 en dicha muestra biológica de (a).
11. Un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en
(A) un método para aumentar la eficacia de la terapia contra el cáncer con un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprendiendo dicho método administrar el agente activo a un sujeto que tiene cáncer, en donde se ha detectado un aumento de la expresión de FOLR1 en una muestra cancerosa de dicho sujeto mediante el uso del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o la composición de la reivindicación 8,
o
B) un método para tratar a un paciente que tiene cáncer, comprendiendo dicho método:
(a) determinar una puntuación de expresión de FOLR1 a partir de la detección de la expresión de FOLR1 en una muestra cancerosa obtenida del paciente, en donde la detección se lleva a cabo mediante el uso de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o la composición de la reivindicación 8; y
(b) administrar dicho agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo al paciente si la puntuación indica que el paciente se beneficiaría de la administración del agente activo,
o
C) un método para tratar a un paciente que tiene cáncer, comprendiendo dicho método:
(a) detectar la expresión de FOLR1 en una muestra cancerosa obtenida de dicho paciente, en donde la detección se lleva a cabo mediante el uso de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o la composición de la reivindicación 8;
(b) determinar una puntuación de expresión de FOLR1 para dicha muestra cancerosa; y
(c) administrar dicho agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo al paciente si la puntuación indica que el paciente se beneficiaría de la administración del agente activo.
12. Un método para identificar que un cáncer es sensible al tratamiento con un agente activo anti-FOLR1, comprendiendo dicho método:
A)
(a) detectar el nivel de expresión de FOLR1 en una muestra cancerosa de dicho cáncer mediante el uso del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o la composición de la reivindicación 8, donde dicha detección comprende el uso de un método que distingue entre la intensidad de tinción o uniformidad de tinción en una muestra cancerosa que expresa FOLR1 en comparación con la intensidad de tinción o uniformidad de tinción en una o más muestras de referencia; (b) determinar una puntuación de intensidad de tinción de o de uniformidad de tinción de FOLR1 para dicha muestra cancerosa; y
(c) comparar la puntuación de intensidad de tinción o uniformidad de tinción de FOLR1 determinada en la etapa (b) con un valor relativo determinado mediante la medición de la expresión de la proteína FOLR1 en al menos una muestra de referencia, en donde dicha al menos una muestra de referencia es una muestra de tejido, células o sedimento celular que no es sensible al tratamiento con un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo, y en donde una puntuación de intensidad de tinción de FOLR1 para dicha muestra cancerosa determinada en la etapa (b) que es mayor que dicho valor relativo identifica que dicho cáncer es sensible al tratamiento con el agente activo.
o B)
(a) detectar el nivel de expresión de FOLR1 en membrana en una muestra cancerosa de dicho cáncer mediante el uso del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o la composición de la reivindicación 8, en comparación con el FOLR1 en membrana en una o más muestras de referencia;
(b) determinar una puntuación de FOLR1 para dicha muestra cancerosa; y
(c) comparar la puntuación de FOLR1 determinada en la etapa (b) con un valor relativo determinado mediante la medición de FOLRI en membrana en al menos una muestra de referencia, en donde dicha al menos una muestra de referencia es una muestra de tejido, células o sedimento celular que no es sensible al tratamiento con un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo, y en donde una puntuación de FOLR1 para dicha muestra cancerosa determinada en la etapa (b) que es mayor que dicho valor relativo identifica que dicho cáncer es sensible al tratamiento con el agente activo, o C)
(a) detectar el nivel de expresión de FOLR1 en una muestra cancerosa de dicho cáncer mediante el uso del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o la composición de la reivindicación 8, en donde dicha detección comprende el uso de un método que distingue entre la intensidad de tinción o uniformidad de tinción en una muestra cancerosa que expresa FOLR1 en comparación con la intensidad de tinción o uniformidad de tinción en una o más muestras de referencia; (b) determinar una puntuación de intensidad de tinción o de uniformidad de tinción de FOLR1 para dicha muestra cancerosa; y
(c) comparar la puntuación de intensidad de tinción o uniformidad de tinción de FOLR1 determinada en la etapa (b) con un valor relativo determinado mediante la medición de la expresión de la proteína FOLR1 en al menos una muestra de referencia, en donde dicha al menos una muestra de referencia es una muestra de tejido, células o sedimento celular que es sensible al tratamiento con un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLRI o fragmento de unión a antígeno del mismo, y en donde una puntuación de intensidad de tinción de FOLR1 para dicha muestra cancerosa determinada en la etapa (b) que es mayor o igual que dicho valor relativo identifica que dicho cáncer es sensible al tratamiento con el agente activo,
o D)
(a) detectar el nivel de expresión de FOLR1 en membrana en una muestra cancerosa de dicho cáncer mediante el uso del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o la composición de la reivindicación 8, en comparación con el FOLR1 en membrana en una o más muestras de referencia;
(b) determinar una puntuación de FOLR1 para dicha muestra cancerosa; y
(c) comparar la puntuación de FOLR1 determinada en la etapa (b) con un valor relativo determinado mediante la medición de FOLRI en membrana en al menos una muestra de referencia, en donde dicha al menos una muestra de referencia es una muestra de tejido, células o sedimento celular que es sensible al tratamiento con un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLRI o fragmento de unión a antígeno del mismo, y en donde una puntuación de FOLR1 para dicha muestra cancerosa determinada en la etapa (b) que es mayor o igual que dicho valor relativo identifica que dicho cáncer es sensible al tratamiento con el agente activo.
13. El método o agente activo para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12,
a) en donde el método comprende además administrar un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo al sujeto del cual se obtiene la muestra cancerosa o muestra biológica, o
b) en donde dicha muestra cancerosa o muestra biológica es una muestra de fluido corporal, células o tejido, particularmente en donde dicho fluido corporal es sangre, ascitis, orina, plasma, suero o sangre periférica.
14. El método o agente activo para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, 12A), 12C) y 13, en donde, a1) el FOLR1 es Fo Lr 1 en membrana o a2) el FOLR1 es FOLR1 diseminado; y/o
b) la detección se realiza mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), especialmente en donde dicho ELISA es un ELISA en sándwich.
15. El método o agente activo para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, en donde la detección se realiza mediante inmunohistoquímica (IHC); particularmente
a) en donde dicha IHC es IHC calibrada que puede distinguir diferentes niveles de expresión de FOLR1; y/o b) en donde dicha IHC distingue entre intensidad de tinción y uniformidad de tinción en una muestra cancerosa o muestra biológica que expresa FOLR1 en comparación con una muestra de referencia; y/o c1) en donde la IHC se realiza de forma manual o c2) en donde la IHC se realiza mediante el uso de un sistema automatizado: y/o
d) en donde se determina una puntuación de FOLR1 a partir de la IHC; especialmente
d-1) en donde una puntuación de al menos 2 identifica que el cáncer tiene probabilidad de responder a un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo o indica que el paciente se beneficiará de la administración de un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo, en particular en donde el cáncer es cáncer de pulmón o cáncer de endometrio, o
d-2) en donde una puntuación de al menos 2 homo identifica que el cáncer tiene probabilidad de responder a un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo o indica que el paciente se beneficiará de la administración de un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo, en particular en donde el cáncer es cáncer de pulmón o cáncer de endometrio, o
d-3) en donde una puntuación de al menos 2 hetera identifica que el cáncer tiene probabilidad de responder a un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo o indica que el paciente se beneficiará de la administración de un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo, en particular en donde el cáncer es cáncer de pulmón o cáncer de endometrio, o
d-4) en donde al menos el 25 % de la expresión en membrana de FOLR1 con una intensidad de al menos 2 identifica que el cáncer tiene probabilidad de responder a un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo o indica que el paciente se beneficiará de la administración de un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo, o
d-5) en donde más del 75 % de la expresión en membrana de FOLR1 con una intensidad de al menos 2 identifica que el cáncer tiene probabilidad de responder a un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo o indica que el paciente se beneficiará de la administración de un agente activo que comprende un anticuerpo anti-FOLR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo.
16. El método o agente activo para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 10, 11 y 12-15, en donde i) dicha muestra de referencia es una muestra de referencia positiva o una muestra de referencia negativa; y/o
ii) la muestra de referencia comprende células, sedimentos celulares o tejido.
17. El método o agente activo para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 10-16,
i) en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, comprende además un reactivo de detección que se selecciona del grupo que consiste en: una enzima, un fluoróforo, un marcador radioactivo y un luminóforo, particularmente en donde dicho reactivo de detección se selecciona del grupo que consiste en: biotina, digoxigenina, fluoresceína, tritio y rodamina; y/o
ii) en donde dicho cáncer es un cáncer positivo para FOLR1; y/o
iii) en donde dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de ovario, cerebro, mama, útero, endometrio, pancreático, renal, cáncer de peritoneo, y cáncer de pulmón, particularmente iii-a) en donde el cáncer de pulmón es cáncer de pulmón de células no pequeñas o carcinoma bronquioloalveolar o iii-b) en donde el cáncer de ovario es cáncer de ovario epitelial, especialmente en donde cáncer es resistente al platino, recidivante o refractario; y/o
iv) en donde dicha expresión de FOLR1 se detecta mediante el uso de al menos un anticuerpo anti-FOLR1 adicional o fragmento de unión a antígeno del mismo, particularmente iv-a) en donde dicha expresión de FOLR1 se mide mediante el uso de dos anticuerpos anti-FOLR1 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y/o iv-b1) en donde al menos un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo está unido a un soporte sólido o iv-b2) en donde al menos un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo está unido a una placa de microtitulación, y/o iv-c) en donde al menos un anticuerpo adicional o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un agente de detección, especialmente en donde el agente de detección es un agente de detección cromogénico, un agente de detección fluorogénico, un agente de detección enzimático o un agente de detección electroquimioluminiscente, y/o en donde el agente de detección es peroxidasa de rábano picante (HRP); y/o
v) en donde el agente activo comprende el anticuerpo de FOLR1 que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45 y región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 47, especialmente en donde el agente activo es un conjugado de anticuerpo y maitansinoide que comprende el anticuerpo de FOLR1, el maitansinoide DM4 y el enlazador escindible sulfo-SPDB.
18. Un método para identificar que un cáncer tiene probabilidad de responder al tratamiento con un conjugado de anticuerpo y maitansinoide que comprende el anticuerpo de FOLR1 que comprende una cadena región variable de pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 47, el maitansinoide DM4 y un enlazador sulfo-SPDB, en donde el método comprende
i) medir FOLR1 en una muestra obtenida del cáncer mediante el uso de un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende los aminoácidos de la SEQ ID NO: 27 y una cadena ligera que comprende los aminoácidos de la SEQ ID NO: 28 en un ensayo de IHC, en donde más del 75 % de expresión en membrana de FOLR1 con una intensidad de al menos 2 identifica que el cáncer tiene probabilidad de responder al tratamiento; o
ii) medir FOLR1 en una muestra obtenida del cáncer mediante el uso de un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende los aminoácidos de la SEQ ID NO: 27 y una cadena ligera que comprende los aminoácidos de la SEQ ID NO: 28 en un ensayo de IHC, en donde la expresión en membrana de FOLR1 con una intensidad de al menos 2 identifica que el cáncer tiene probabilidad de responder al tratamiento.
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