CN101454670A

CN101454670A - 测量人巨蛋白的方法

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Publication number: CN101454670A
Application number: CNA2007800194819A
Authority: CN
Inventors: 小笠原真也; 三浦州平; 斋藤亮彦; 竹田彻朗
Original assignee: Denka Seiken Co Ltd; Niigata University NUC
Current assignee: Denka Co Ltd; Niigata University NUC
Priority date: 2006-03-28
Filing date: 2007-03-28
Publication date: 2009-06-10
Anticipated expiration: 2027-03-28
Also published as: AU2007239885A1; US8703430B2; JP2007263750A; AU2007239885B2; CN101454670B; ES2459165T3; RU2008142534A; US7955809B2; US20110195523A1; KR101500756B1; US20090117594A1; BRPI0709271A2; EP2006683B1; CA2647580C; RU2463608C2; EP2006683A4; BRPI0709271B8; EP2006683A1; BRPI0709271B1; KR20090015030A

Abstract

本发明提供了测量人巨蛋白的方法，与传统方法比较，这种方法可以在较短的时间较简单地完成，而且还可以定量人巨蛋白。本发明还提供了直接在疾病部位早期诊断细胞、组织或器官特异性功能疾病的方法。本发明还公开了通过测定人巨蛋白而检测特征性地观测到巨蛋白表达的器官疾病的方法。

Description

测量人巨蛋白的方法

技术领域

本发明涉及测量人巨蛋白(megalin)的方法。更详细地说，本发明涉及检测人巨蛋白的方法，其包括对观测到巨蛋白表达的细胞、组织和器官中的局部而特异地表达的巨蛋白，以快速而简单的方式进行定量检测，从而能够直接和早期诊断细胞、组织和器官受影响的程度，并且通过治疗改善病状和预后并防止其恶化。本发明可用于诊断其中观测到有巨蛋白表达的器官的疾病，如肾病或肺病。

背景材料

1.巨蛋白的克隆

1982年，作为对Heymann肾炎(其为实验膜性肾病的模型)病因抗原的研究结果，Kerjaschki，D.和Farquhar，M.G.鉴定了一种细胞膜蛋白质-gp330(Kerjaschki D.，Farquhar M.G.，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，79，5557-5561)。1994年，Saito，A.等测定了大鼠gp330的完整一级结构，并将其命名为巨蛋白，因为它是脊椎动物中已克隆的最大细胞膜蛋白质(Saito A.等，，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，91，9725-9729)。

2.巨蛋白表达位点

巨蛋白也被称为糖蛋白330(gp330)或低密度脂蛋白(LDL)受体相关蛋白2(LRP-2)。它是分子量约600kDa的糖蛋白，在肾近端小管上皮细胞中表达，也在其它组织和细胞如II型肺泡细胞、精巢、子宫内膜、胎盘、或内耳上皮、肾上皮、生殖卵黄腺和神经外胚层(参见Christensen E.I.，Willnow，T.E.，1999；J.Am.Soc.Nephrol.10，2224-2236；Juhlin C.，Klareskog L.等，1990，J.Biol.Chem.265，8275-8279；和Zheng G，McCluskey R.T.等，1994，J.Histochem.Cytochem.42，531-542)。在肾脏，巨蛋白作为内吞受体，与排尿前近端肾小管的内吞和蛋白质重吸收等相关联。重吸收的蛋白质等随后被溶酶体降解(参见Mausbach A.B.，Christensen E.I.，1992，Handbook ofPhysiology：Renal Physiology，Windhager，editor，New York，OxfordUniversity Press，42-207)。

3.巨蛋白的核苷酸序列

巨蛋白是一种糖蛋白，其表达最常见于哺乳动物肾近端小管上皮细胞膜上。其cDNA编码序列与Korenberg，J.R.等(1994)公开的基因登录号U04441的人巨蛋白cDNA序列或Hjaeln，G.等(1996)公开的基因登录号U33837的人巨蛋白cDNA序列(参见Korenberg J.R.等，1994，Genomics 22，88-93；和Hjalm G.等，1996，Eur.J.Biochem.239，132-137)有核苷酸同一性。

此外，Saito等(1994)已公开了与人巨蛋白具有同源性的大鼠巨蛋白，其基因登录号L34049的cDNA序列也已被公开(参见Saito A.等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，91，9725-9729)。

4.巨蛋白的氨基酸序列和蛋白结构

巨蛋白是一种巨大的细胞膜蛋白，由4,655个氨基酸(就人巨蛋白而言)或4,660个氨基酸(就大鼠而言)组成。由氨基酸序列推算的分子量为约520kDa，含有糖链时可能高达约600kDa(参见Saito A.等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，91，9725-9729)。巨蛋白属于LDL受体基因家族，其巨大的胞外区有4个功能域，胞外区通过单一跨膜区与小的胞内区相连。巨蛋白主要存在于肾小球的披网格蛋白小窝(大鼠)，或近端小管的上皮管腔膜(luminal membrane)(肾小球上皮细胞的管腔膜和基底膜)、II型肺泡细胞、附睾腺、甲状腺、甲状旁腺、卵黄囊膜、内耳、小肠或脉络膜，因此，它与细胞摄入不同配体及其代谢相关(参见Farquhar M.G.等，1995，J.Am.Soc.Nephrol.6，35-47；和Christensen E.I.等，2002，Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.3，256-266)。巨蛋白敲除小鼠会发生低分子量蛋白尿、骨代谢紊乱、呼吸衰竭、脑畸形和其他疾病(参见Willnow T.E.等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，93，8460-8464)。在线虫(秀丽隐杆线虫(C.elegans))中也存在巨蛋白同源物，其生物学重要性也已被暗示(参见Yochem J.等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，90，4572-4576)。

5.作为肾炎起因的巨蛋白的重要性

巨蛋白为实验膜性肾病(Heymann肾炎)的主要致病抗原，是一种上皮清道夫受体，其生物学和病理学作用已被阐明。用动物模型来阐明人膜性肾病发展的机制已有很长时间，大鼠Heymann肾炎就是膜性肾病的一种模型。与其它任何模型相比，对Heymann肾炎的分析取得了更大进步。Saito A.等公开了对Heymann肾炎的病理学表位和配体结合域的分析结果，他们还展示了巨蛋白的主要抗原区和巨蛋白上对结合配体有主要贡献的功能域(参见Kerjaschki D.等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89，11179-11183；Saito A.，Farquhar M.G.等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，93，8601-8605；Yamazaki H.，Farquhar M.G.等，1998，J.Am.Soc.Nephrol.9，1638-1644；和Orlando R.A.，Farquhar M.G.等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，94，2368-2373)。

6.巨蛋白的各种配体

在体内，巨蛋白在近端小管上皮细胞的管腔侧表达最丰富。在人类肾脏，在近端小管上皮细胞以外的部位(包括在肾小球)未观察到巨蛋白的表达。巨蛋白通过内吞作用将由肾小球过滤的各种配体(例如低分子量蛋白或药物)摄入细胞中，并将他们运输到溶酶体，之后它们通过再循环重新呈现在细胞表面(参见Farquhar M.G.等，1995，J.Am.Soc.Nephrol.6，35-47；和Christensen E.I.等，2002，Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.3，256-266)。此外，巨蛋白与从管腔面向基底膜侧的转胞吞作用有关。巨蛋白还与结合蛋白(如维生素A、维生素B12和维生素D)的摄入和代谢有关(参见Christensen E.I.等2002，Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.3，256-266)。Christensen和Willnow证实巨蛋白介导三种维生素载体蛋白-维生素D结合蛋白(DBP)、视黄醇结合蛋白(RBP)和钴胺传递蛋白(TC)以及与此相关的维生素即(OH)维生素25D₃、维生素A(视黄醇)和维生素B₁₂的重吸收(参见Christensen E.I.，Willnow T.E.，1999，J.Am.Soc.Nephrol.10，2224-2236)。Saito A.等证实，瘦蛋白(其由脂肪细胞分泌，在肥胖患者的血液中水平增加)作为巨蛋白的配体被近端小管上皮细胞摄入并代谢(参见Saito A.，Gejyo F.等，2004，Endocrinology.145，3935-3940)。脂肪细胞(也就是积累的内脏脂肪)可导致复合性病理病症，即代谢综合症。瘦蛋白为由脂肪细胞分泌的脂肪细胞因子，在代谢综合症患者的血液中水平增加。有研究认为，肾脏是血液中瘦蛋白最有可能积累的器官，而且瘦蛋白展现了肾病的作用(参见Tarzi R.M.Lord G.M.等，2004，Am.J.Pathol.164，385-390)。还在近端小管和收集管之间的区域(位于巨蛋白发挥功能的区域的下游)发现了所谓的瘦蛋白受体。

术语“代谢综合症”被定义为内脏肥胖、血压升高、高脂血症、糖耐量低减和其他症状的疾病并发症，其主要的危险因素是胰岛素抵抗。该病症非常有可能导致动脉粥样硬化症和蛋白尿症的发生，并可能导致有肾小球及肾小管肥大的组织学特征的肾病发生。当这种状况结合明显的糖尿病时，就会进一步出现高血糖特征，表现出糖尿病性肾病，这种病状还可能会进一步变得严重。II型糖尿病基本上是在代谢综合症之前或同时发生。因此，肾病的特征可以包含与代谢综合症相关的肾病。

Saito A.等用源自大鼠卵黄囊上皮的细胞(L2细胞，巨蛋白在其中有高水平表达)进行了一项实验，发现抗巨蛋白抗体可以显著抑制L2细胞对¹²⁵I标记的AGE(渐进性糖化终产物)(来自葡萄糖)的摄入。因此，他们证明了，巨蛋白与该摄入途径关联(参见Saito A.Gejyo F.等，2003，J.Am.Soc.Nephrol.14，1123-1131)。作为糖尿病性肾病发生的机制，渐进性糖化终产物(AGE)通过美拉德反应与糖化和修饰型蛋白质的相关性已经有报道。血液中低分子量的AGE由肾小球过滤，被近端小管上皮细胞重吸收和代谢。如果肾病的进一步发展，则更高分子量的AGE也被肾小球过滤，在近端小管上皮细胞中积累，而施加超量的代谢负荷。进一步，Saito A.等还表明，除了葡萄糖之外，巨蛋白还与细胞对由甲基乙二醛、甘油醛、乙醇醛衍生的AGE的摄入有关。此外，代谢综合症往往伴随肝病，如脂肪肝。在肝脏中大量存在的肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)被释放到健康人的血液中。在肝病时，更多的L-FABP被释放，血液中含量增加。Saito A.等也表明，血液中的L-FABP被肾小球迅速过滤，并借助巨蛋白被近端小管上皮细胞重吸收(参见Takeda T.，Gejyo F.，Saito A.等，2005，Lab.Invest.85，522-531)。

7.与巨蛋白相互作用的功能性蛋白

为了阐明巨蛋白在细胞中的运输机制，研究了与巨蛋白胞内结构域结合的衔接分子，已鉴定出各种蛋白，如Dab2、ANKRA、MAGI-1、GAIP、GIPC、Gα3、MegBP和ARH(参见Oleinikov A.V.等，2000，Biochem.J.347，613-621；Rader K.，Farquhar M.G.等，2000，J.Am.Soc.Nephrol.11，2167-2178；Patrie K.M.，Margolis B.等，2001，J.Am.Soc.Nephrol.12，667-677；Lou X.，Farquhar M.G.等，2002，J.Am.Soc.Nephrol.13，918-927；Petersen H.H.，Willnow T.E.，2003，J.Cell.Sci.116，453-461；和Takeda T.，Farquhar M.G.等，2003，Mol.Biol.Cell.14，4984-4996)。通过这些分子，巨蛋白与内吞或转胞吞关联，也和与此相关的信号传递关联。此外，在近端小管上皮细胞中，巨蛋白的功能还与一种细胞膜受体即cubilin相结合，以进一步参与细胞对各种配体的摄入(参见Saito A.等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，91，9725-9729)。例如，cubilin是直接结合转铁蛋白、白蛋白、内源性维生素B₁₂等的受体，而巨蛋白间接参与了对它们的内吞作用。此外，已知在近端小管上皮细胞中巨蛋白与Na⁺-H⁺交换转运蛋白同种型3(Na⁺-H⁺exchanger isoform 3，NHE3)相互作用(参见Biemesderfer D.等，1999，J.Biol.Chem.274，17518-17524)。NHE3是在Na+的重吸收中起重要作用的一种反向转运蛋白，NHE3还影响一种巨蛋白对配体的摄入(参见Hryciw D.H.等，2004，Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.31，372-379)。巨蛋白还可能涉及NHE3的失活和代谢。在糖尿病性肾病或代谢综合症相关性肾病的早期，肾小球滤过变为过量。推导其首要原因是近端小管上皮对Na+重吸收增强(参见Vallon V.等2003，J.Am.Soc.Nephrol.14，530-537)，NHE3在这种情况下发挥了关键作用，NHE3被巨蛋白失活和代谢被认为与此有关(参见Hryciw D.H.等，2004，Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.31，372-379)。

8.巨蛋白尿排泄和巨蛋白配体尿排泄的相关性

Leheste等揭示，巨蛋白敲除小鼠和近端小管功能减弱的范可尼(Fanconi)综合症患者将经历尿中蛋白质和视黄醇的排泄增加(参见Leheste J.等，1999，Am.J.Pathol.155，1361-1370)。此外，Moestrup S.K.等表明，范可尼综合症患者尿中排出的巨蛋白量显著低于健康个体的排出量。这导致巨蛋白功能和在近端小管中表达的削弱，从而增加排泄在尿中的含视黄醇结合蛋白的肾小球滤过蛋白的量(参见Anthony G.W.，Moestrup S.K.等，2002，J.Am.Soc.Nephrol.13，125-133)。

9.通过使用尿毒症模型和器官再生模型的实验发现巨蛋白功能的重要性

如上所述，巨蛋白参与将各种低分子量蛋白质摄入近端小管上皮细胞并且参与其代谢。当病理病症发展为肾衰竭时，代谢机制被扰乱，低分子蛋白质因此在血液和组织作为尿毒症蛋白积累。其代表性例子是β2-微球蛋白(β2-m)，它可能导致长期透析患者的透析相关性淀粉状蛋白病(参见Gejyo F.，Schmid K.等，1985，Biochem.Biophys.Res.Commun.129，701-706)。上述AGE由于其在肾衰竭或透析患者的血中积累，也被认为是动脉粥样硬化或器官衰竭的病因，并且AGE被认为是一种类型的尿毒症蛋白(参见Henle T.，Miyata T.，2003，Adv.Ren.Replace Ther.10，321-331)。此外，瘦蛋白在透析患者的血中积聚，因此被认为与营养不良或免疫妥协有关。Tabata Y.和Gejyo F.等公开了利用巨蛋白功能的尿毒症蛋白代谢模式的效果和有效性(参见Saito A.，Tabata Y.，Gejyo F.等，2003，J.Am.Soc.Nephrol.14，2025-2032和WO02/091955)。即，巨蛋白表达细胞在体内被移植作为支架蛋白，从外周血管(新生血管)渗漏的低分子量蛋白在巨蛋白的帮助下被摄入细胞以进行代谢。用于移植的巨蛋白表达细胞(即卵黄囊上皮来源的L2细胞)在巨蛋白帮助下摄入和代谢β₂-m(参见Saito A.，Tabata Y.，Gejyo F.等，2003，J.Am.Soc.Nephrol.14，2025-2032)。将皮下移植了L2细胞的裸鼠的两个肾脏摘除，诱导肾衰竭病症，测定移植组织块和器官中经腹腔注射的¹²⁵I标记β2-m的细胞摄入。结果发现，与其它器官比较，移植了L2细胞的细胞块更显著地摄入¹²⁵I标记的β2-m；并且发现，与无L2细胞移植的对照组比较，在L2细胞移植组中¹²⁵I标记β2-m的清除有显著加强(参见Saito A.，Tabata Y.，Gejyo F.等，2003，J.Am.Soc.Nephrol.14，2025-2032)。

10.巨蛋白的蛋白水解和尿排泄

近年来，已经提出了巨蛋白在Notch样信号转导途径中被蛋白水解的可能性(参见Zou Z.，Biemesderfer D.等.，2004，J.Biol.Chem.279，34302-34310；和Grigorenko A.P.等，2004，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，101，14955-14960)。这还包括一个两步切割系统：由金属蛋白酶介导的外结构域的脱落和γ-分泌酶介导的膜内蛋白水解。

此外，已知巨蛋白在II型肺泡细胞中表达。

因此，巨蛋白与器官(如肾脏)代谢的相关性已被广泛地研究。然而，器官(包括肾脏)的疾病和巨蛋白间的相关性尚未被阐明，巨蛋白的表达或其排泄入体液与各种器官疾病的相关性也尚未被研究。

迄今为止，作为检测巨蛋白的方法，业已知晓使用多克隆抗体的组织染色法或免疫印迹法，其中该多克隆抗体通过对免疫动物(如兔子)免疫而获得。

但是，该技术涉及到细胞或借助电泳分离的蛋白的染色，这需要非常复杂的程序，并需要长时间来固定组织、准备组织切片、电泳并转移到膜上。因此，它难以定量巨蛋白。

从诊断组织或器官的功能紊乱(尤其就肾病而言)程度的角度看，没有以特异性且简单的方式来诊断肾小管衰竭的有效方法。目前，已使用了许多诊断方法，检测尿液或血液中的白蛋白、肌酐、β2-微球蛋白、L-FABP等作为肾病的诊断标志。但是，这些诊断标志并非源自肾组织，它们仅仅缘于在肾脏肾小球滤过和肾脏肾小管重吸收过程中的所有现象和功能。也就是说，即使使用这种标志，也难以鉴别肾脏的肾小球衰竭与肾小管衰竭。此外，这种标志是一种来自肾脏以外的器官的间接标志。因此，对疾病早期诊断的有效性差。这同样适用于KL-6(急性炎症的标志物)，KL-6是现有的肺病(特别是炎症)诊断标志。

本发明的公开内容

本发明提供了测量人巨蛋白的方法，与传统技术比较，这种方法可以在较短的时间以较简单方法完成，而且还可以定量人巨蛋白。本方法还使得能够在早期以定点方式诊断功能疾病，这种方法对细胞、组织或器官是特异性的。特别是，本发明提供了一种测定尿中巨蛋白水平以检测肾病的方法。

如上所述，已有许多关于人巨蛋白的报道，并已提示其与器官(如肾或肺)代谢的相关性。然而，目前还不了解在器官功能受损时巨蛋白表达变化的方式和巨蛋白流行性改变的方式。

本发明人在用快速方式高灵敏度测定人巨蛋白的方面进行了大量研究。他们因此发现了一种方法，使用能与人巨蛋白结合的配体，尤其是抗人巨蛋白抗体，可以准确测量体液样本(如尿)中的巨蛋白。

进一步，本发明人测定了器官功能受损患者体液中的人巨蛋白，发现人巨蛋白可能是检测和诊断器官疾病的标志。这导致了本发明的完成。

具体来说，本发明如下。

[1]使用结合于固体支持物上的能结合人巨蛋白的第一配体和能结合人巨蛋白的第二配体测定样本中人巨蛋白的方法，该方法包括：使样本与结合于固体支持物上的能结合人巨蛋白的第一配体发生反应，使样本与能结合人巨蛋白的第二配体发生反应，对因该样本中的人巨蛋白与能结合人巨蛋白的配体形成复合物而被结合于固体支持物上的能结合人巨蛋白的第二配体进行测定。

[2]按照[1]所述的测定样本中人巨蛋白的方法，其包括以下两个步骤：结合于固体支持物上的能与人巨蛋白结合的第一配体与样本之间的反应，以及随后的能与人巨蛋白结合的第二配体与样本之间的反应。

[3]按照[1]所述的测定样本中人巨蛋白的方法，其中，结合于固体支持物上的能结合人巨蛋白的第一配体与样本之间的反应以及能结合人巨蛋白的第二配体与样本之间的反应是在一个的步骤中进行。

[4]按照[1]至[3]中任一项所述的测定样本中人巨蛋白的方法，其中，能结合人巨蛋白的第一配体和能结合人巨蛋白的第二配体都是抗体。

[5]按照[1]至[3]中任一项所述的测定样本中人巨蛋白的方法，其中，能结合人巨蛋白的第一配体是特异地针对人巨蛋白的糖链的凝集素，而能结合人巨蛋白的第二配体是抗体。

[6]按照[1]至[3]中任一项所述的测定样本中人巨蛋白的方法，其中，能结合人巨蛋白的第一配体是抗体，而能结合人巨蛋白的第二配体是特异地针对人巨蛋白糖链的凝集素。

[7]按照[1]至[6]中任一项所述的测定样本中人巨蛋白的方法，其中，能结合人巨蛋白的第一配体和/或能结合人巨蛋白的第二配体是选自下列物质：维生素结合蛋白，其为钴胺传递蛋白-维生素B₁₂、维生素D结合蛋白或视黄醇结合蛋白；脂蛋白，其为载脂蛋白B、载脂蛋白E、载脂蛋白J/簇蛋白、或载脂蛋白H；激素，其为甲状旁腺激素(PTH)、胰岛素、上皮生长因子(EGF)、催乳素、瘦蛋白或甲状腺球蛋白，上述任一种的受体或这类激素的受体；免疫或应激反应相关蛋白，其为免疫球蛋白轻链、PAP-1或β₂-微球蛋白；酶，其为PAI-I、PAI-I-尿激酶、PAI-I-tPA、尿激酶原、脂蛋白脂肪酶、纤溶酶原、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α₁-微球蛋白或溶菌酶，上述任一种的抑制剂或这种酶的抑制剂；药物或毒素，其为氨基糖苷类、多粘菌素B、抑肽酶或天花粉蛋白；载体蛋白，其为白蛋白、乳铁蛋白、血红蛋白、气味结合蛋白、甲状腺素视黄质运载蛋白(transthyretin)或L-FABP；和受体相关蛋白(RAP)，其为细胞色素c、钙(Ca²⁺)、渐进性糖化终产物(AGE)、cubilin或Na⁺-H⁺交换转运蛋白同种型3(NHE3)；或这些物质中的结合片段。

[8]使用结合于固体支持物上的人巨蛋白或人巨蛋白的部分片段以及能结合人巨蛋白的配体测定样本中人巨蛋白的方法，该方法包括：使样本与能结合人巨蛋白的配体发生反应，使该反应产物与结合于固体支持物上的人巨蛋白反应，对结合于固体支持物上的能结合人巨蛋白的配体进行测定，并根据结合于固体支持物上的能结合人巨蛋白的配体的减少百分率，来竞争性定量样本中的人巨蛋白。

[9]按照[8]所述的测定样本中人巨蛋白的方法，其中，能结合人巨蛋白的配体是抗人巨蛋白抗体。

[10]使用能结合人巨蛋白的配体测定样本中人巨蛋白的方法，该方法包括：使样本与结合于微粒上的能结合人巨蛋白的配体发生反应以诱导凝集，并根据导致凝集的程度来测量人巨蛋白。

[11]按照[10]所述的测定人巨蛋白的方法，其中，能结合人巨蛋白的配体是抗人巨蛋白抗体，凝集是免疫凝集。

[12]用[1]至[11]中任一项的方法测定人巨蛋白以检测其中观测到有巨蛋白表达的器官的疾病的方法。

[13]按照[12]所述的检测器官疾病的方法，其中，其中观测到有巨蛋白表达的器官的疾病是肺病。

[14]按照[12]所述的检测器官疾病的方法，其中，其中观测到有巨蛋白表达的器官的疾病是肾病。

[15]按照[14]所述的检测肾病的方法，其中，肾病是肾小管性疾病。

[16]按照[14]或[15]中的方法，其中，样本是尿液。

[17]用于检测其中观测到有巨蛋白表达的器官疾病的试剂盒，其包含能结合人巨蛋白的配体。

[18]按照[17]所述的用于检测其中观测到有巨蛋白表达的器官疾病的试剂盒，其中，能结合人巨蛋白的配体是抗人巨蛋白抗体。

[19]按照[18]所述的用于检测其中观测到有巨蛋白表达的器官疾病的试剂盒，其中，其中观测到有巨蛋白表达的器官疾病是肺病。

[20]按照[18]所述的用于检测其中观测到有巨蛋白表达的器官疾病的试剂盒，其中，其中观测到有巨蛋白表达的器官疾病是肾病。

[21]按照[20]所述的用于检测肾病的试剂盒，其中，肾病是肾小管性疾病。

[22]用于检测其中观测到有巨蛋白表达的器官疾病的疾病检测标志，其包含人巨蛋白。

[23]按照[22]所述的疾病检测标志，其中，其中观测到有巨蛋白表达的器官疾病是肺病。

[24]按照[22]所述的疾病检测标志，其中，其中观测到有巨蛋白表达的器官疾病是肾病。

[25]按照[24]所述的疾病检测标志，其中，肾病是肾小管性疾病。

[26]人巨蛋白作为用于检测其中观测到有巨蛋白表达的器官疾病的疾病检测标志的用途。

[27]按照[26]所述的人巨蛋白作为疾病检测标志的用途，其中，其中观测到有巨蛋白表达的器官疾病是肺病。

[28]按照[26]所述的人巨蛋白作为疾病检测标志的用途，其中，其中观测到有巨蛋白表达的器官疾病是肾病。

[29]按照[28]所述的人巨蛋白作为疾病检测标志的用途，其中，肾病是肾小管性疾病。

本发明的效果

本发明的方法能够以高灵敏度和准确性测量样本(如尿)中的人巨蛋白。当表达巨蛋白的细胞、组织或器官的功能受损时，巨蛋白从细胞中逸出并在样本中积累。具体说来，样本中人巨蛋白的测量使得可以直接检测和诊断细胞、组织或器官的功能障碍，而不是间接的检测和诊断。因此，用本发明的方法测量样本中人巨蛋白，使得可以在早期以高准确性检测观察到巨蛋白表达的器官的疾病，如肾或肺疾病。

本说明书包括日本专利申请号2006-089306的说明书和/或附图中所公开的部分或全部内容，该专利申请是本申请的优先权文件。

附图简述

图1显示人巨蛋白的基因座和一般蛋白结构。

图2显示使用标准人巨蛋白检测人巨蛋白的ELISA校准曲线。

图3显示尿中人巨蛋白的临床结果(第1部分)。

图4显示尿中人巨蛋白的临床结果(第2部分)。

实施本发明的最佳模式

本发明涉及测量样本中人巨蛋白的方法。SEQ ID NO：1显示了人巨蛋白的核苷酸序列，SEQ ID NO：2显示了人巨蛋白的氨基酸序列。

在本发明中，使用结合于固体支持物上的能结合人巨蛋白的第一配体来测量人巨蛋白。用于常规免疫分析的任何固体支持物都可以使用。例如，塑料微量滴定板的孔或磁性微粒可能优选被使用。

能结合人巨蛋白的配体的一个例子是抗人巨蛋白抗体，单克隆抗体或多克隆抗体均可使用。

此外，特异针对人巨蛋白糖链的凝集素可用作能结合人巨蛋白的配体。凝集素的例子包括但不仅限于：伴刀豆球蛋白A、麦胚凝集素(WGA)、蓖麻(Ricinus communis)凝集素(RCA)和小扁豆凝集素(LCA)。

另外，能结合人巨蛋白的配体的例子包括选自下列的物质：维生素结合蛋白，如钴胺传递蛋白-维生素B₁₂、维生素D结合蛋白或视黄醇结合蛋白；脂蛋白，如载脂蛋白B、载脂蛋白E、载脂蛋白J/簇蛋白、或载脂蛋白H；激素，如甲状旁腺激素(PTH)、胰岛素、上皮生长因子(EGF)、催乳素、瘦蛋白或甲状腺球蛋白，上述任一种的受体或这类激素的受体；免疫或应激反应相关蛋白，如免疫球蛋白轻链、PAP-1或β₂-微球蛋白；酶，如PAI-I、PAI-I-尿激酶、PAI-I-tPA、尿激酶原、脂蛋白脂肪酶、纤溶酶原、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α₁-微球蛋白或溶菌酶，上述任一种的抑制剂或这类酶的抑制剂；药物或毒素，如氨基糖苷类、多粘菌素B、抑肽酶或天花粉蛋白；载体蛋白，如白蛋白、乳铁蛋白、血红蛋白、气味结合蛋白、甲状腺素视黄质运载蛋白或L-FABP；和受体相关蛋白(RAP)，如细胞色素c、钙(Ca²⁺)、渐进性糖化终产物(AGE)、cubilin或Na⁺-H⁺交换转运蛋白同种型3(NHE3)]或这些物质的结合片段。用于此处的术语“结合片段”是指上述物质中包含结合人巨蛋白的位点的片段。

能结合人巨蛋白的配体，如抗人巨蛋白抗体，可以通过本领域众所周知的技术结合到固体支持物上。当将配体结合到微量滴定板孔上时，将约3-10μg/ml(优选约5μg/ml)的能结合人巨蛋白的配体(如抗体)施加到固体支持物，然后使生成物在4℃静置过夜(优选12小时或更长时间)。当固定全长抗体时，根据理论确定出上述提到的固体支持物的推荐密度。

根据下述公式确定密度：

Q＝(2/√3)·(MW/N)·(2r)^-2·10⁹(ng/cm²)

Q：分子量密度(ng/cm²)

MW：分子量(道尔顿：Da)

N：阿伏伽德罗数＝6·10²³(mole^-1)

r：分子的斯托克斯半径＝(R·T₂₀)/(6·π·η₂₀·D₂₀·N)(cm)

R：气体常数＝8.3·10⁷(g·cm²·sec^-2·°K^-1·mole^-1)

T₂₀：室温(20℃)＝293°K

η₂₀：在20℃时水的粘度＝1·10^-2(g·cm^-1·sec^-1)

D₂₀：在20℃时分子参考物对水的差分系数(cm²·sec^-1)

在借助物理吸附进行固定时这种值是适用的。当固定能结合人巨蛋白的配体时，确定相应固体支持物的理论密度，该密度受上述变异系数(如各自的分子量)影响。所以，密度随各个固体支持分子的类型、固相的构造或其它条件而变化。因此，密度并不限于上述的值。此外，当通过共价结合附着于固体支持物上时，在本发明中使用该密度。在这种情况下，存在于吸附表面并用于共价结合的官能团数目也被纳入考虑。固体支持物的密度并没有限制。基于常规技术，在结合后，用牛血清白蛋白(以下简称为“BSA”)或酪蛋白进行封闭，目的是封闭蛋白质的非特异性吸附位点。当固体支持物是磁珠时，用与微量滴定板同样的方法处理固体支持物。

使结合于固体支持物上的能结合人巨蛋白的配体(如抗人巨蛋白抗体)与样本反应，样本中的人巨蛋白通过配体-受体结合反应，如抗原抗体反应，借助于结合于固体支持物上的能结合人巨蛋白的配体而结合于固体支持物。具体地讲，形成结合于固体支持物上的能结合人巨蛋白的第一配体(如抗人巨蛋白抗体)和人巨蛋白的复合物。任何样本均可使用，只要它含有人巨蛋白。样本的实例包括尿、肺泡洗液、血液、血清、血浆和呼出空气的凝结物。该抗原抗体反应可在4℃至45℃进行，更优选在20℃至40℃、进一步优选在25℃至38℃进行。反应的持续时间是大约10分钟至18小时，更优选10分钟至1小时，进一步优选30分钟到1小时。

在洗涤后，使能结合人巨蛋白的第二配体与结合于固体支持物的样本中的人巨蛋白反应。具体地讲，形成结合于固体支持物上的能结合人巨蛋白的第一配体(如抗人巨蛋白抗体)、人巨蛋白和能结合人巨蛋白的第二配体的复合物。作为能结合人巨蛋白的第二配体，可以使用与用作能结合人巨蛋白的第一配体相同的物质，如抗人巨蛋白抗体。但是，当能结合人巨蛋白的第一配体和能结合人巨蛋白的第二配体都是抗人巨蛋白的单克隆抗体时，被第一抗人巨蛋白抗体识别和结合的表位需要与被第二抗人巨蛋白抗体识别和结合的表位不同。第一抗人巨蛋白抗体和第二抗人巨蛋白抗体的组合可以是下列任意组合：单克隆抗体和单克隆抗体、单克隆抗体和多克隆抗体、多克隆抗体和单克隆抗体以及多抗体和多克隆抗体。反应可在4℃至45℃进行，更优选在20℃至40℃、进一步优选在25℃至38℃进行。反应的持续时间是大约10分钟至18小时，更优选10分钟至1小时，进一步优选30分钟到1小时。于是，能结合人巨蛋白的第二配体，借助于人巨蛋白和能结合人巨蛋白的第一配体而被结合于固体支持物。

经过洗涤后，测量结合于固体支持物上的能与人巨蛋白结合的第二配体(如第二抗人巨蛋白抗体)。这可以借助在免疫分析领域普遍采用的各种各样技术来进行。例如，将能结合人巨蛋白的第二配体标记上酶、荧光、生物素或放射性标记，以制备酶标记物质。通过分析这类标记，可以测量能与结合于固体支持物的人巨蛋白结合的第二配体。特别优选用酶或荧光来标记。酶的例子包括过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶；荧光的例子是异硫氰酸荧光素(FITC)，虽然标记并不仅限于此。标记的检测可以如下进行：使相应底物与酶标记的物质发生反应，然后测量所产生的染料、荧光、发射等。当能与人巨蛋白结合的第二配体未被标记时，使带标记的第三抗体与能结合人巨蛋白的第二配体发生反应，可以基于这种标记来测量第三抗体。于是，也可以测量能结合人巨蛋白的第二配体。

固体支持物或用于标记的抗人巨蛋白抗体可以是对人巨蛋白有特异性的免疫球蛋白片段(如Fab或F(ab’)₂)，或以表达为重组子的重组抗体(如scFv、dsFv、双倍体或微型抗体(minibody))。在本发明中，术语“抗体”还指对人巨蛋白有特异性的片段。制备这类片段的方法是本领域众所周知的。

上述方法包含以下两个步骤：结合于固体支持物上的能与人巨蛋白结合的第一配体(如抗人巨蛋白抗体)与样本之间的反应，随后是在洗涤后能与人巨蛋白结合的第二配体与样本之间的反应。可替代地，也可以采用包含单一步骤的方法，其中结合于固体支持物上的能结合人巨蛋白的第一配体(如抗人巨蛋白抗体)与样本之间的反应，和能结合人巨蛋白的第二配体与样本之间的反应同时进行。

本发明还包括用人巨蛋白或人巨蛋白的部分片段和能结合人巨蛋白的配体来测量样本中人巨蛋白的方法，其中所述人巨蛋白或人巨蛋白部分片段被结合于固体支持物上，该方法包括：使样本与能结合人巨蛋白的配体反应，使反应产物与结合于固体支持物上的人巨蛋白反应，测量能与被结合于固体支持物的人巨蛋白结合的配体，根据能与被结合于固体支持物的人巨蛋白结合的配体百分率的减少，竞争性定量样本中的人巨蛋白。此方法需要将人巨蛋白结合到固体支持物，这种结合可按照将物质结合到固体支持物的方法进行。此外，对人巨蛋白的部分片段并没有限制，可以使用能结合人巨蛋白的配体所结合的人巨蛋白部分片段。作为人巨蛋白的部分片段，SEQ ID NO：2所示的人巨蛋白氨基酸序列的部分序列可以通过化学合成或基因工程来制备。可以使用上述能结合人巨蛋白的配体，特别优选抗人巨蛋白抗体。在竞争性方法中，结合于固体支持物的人巨蛋白或人巨蛋白部分片段和能结合人巨蛋白的配体的用量是重要的。竞争性方法是已知的技术，可以基于已知技术可以适当地确定该量。

进一步，本发明包含用能结合人巨蛋白的配体来测量人巨蛋白的方法，该方法包括：使样本同能与结合于微粒上的人巨蛋白结合的配体发生反应以诱导凝集，基于所导致的凝集程度测量人巨蛋白。

用于本方法的微粒的例子包括直径为0.05-10μm的微粒，优选直径为0.1-0.4μm的乳胶微粒、直径在0.5-10μm的明胶微粒和动物红细胞。可以通过本领域众所周知的方法如物理吸附或共价结合，将抗体结合到微粒上，。

在此方法中，如在黑色载玻片上将结合有抗人巨蛋白抗体的微粒与样本混合，观察由于凝聚而产生的微粒沉淀。于是，可检测样本中的人类巨蛋白。此外，可测量凝集的吸收以定量人巨蛋白。此外，也可以通过脉冲免疫测定法来检测人巨蛋白。

本发明的测量人巨蛋白的方法使得不仅可以测量完整的人巨蛋白，还可以测量人巨蛋白的片段。

通过测量样本中的人巨蛋白，可评估从中获取样本的受试者在表达人巨蛋白的细胞、组织、器官中是否患有疾病。具体地讲，可检测或诊断器官疾病等。

任何细胞、组织或器官都可以是靶标，只要其中观察到巨蛋白表达。优选肺和肾，更优选肾脏。就肾病而言，可特别检测肾炎或肾小管性疾病。另外，糖尿病性肾病也能够得到充分检测。此外，这些细胞、组织或器官也可用于检测代谢综合症或代谢综合症相关性肾病。

在上述患有细胞、组织或器官功能障碍的受试者中，人巨蛋白从细胞泄露，样本中人巨蛋白量增加。当体外测量取自受试者的样本中的人巨蛋白，而且与取自健康个体的人巨蛋白浓度比较，样本中人巨蛋白的浓度显著增强时，该受试者可以被诊断为患有细胞、组织或器官功能障碍。

如上所述，尿、肺泡洗液、血液、血清、血浆、呼出的空气冷凝等均可用作样本。在欲检测肺病时，特别优选使用肺泡洗液。在欲检测肾脏病时，优选使用尿液。

此外，测量从受试者取得的样本中的人巨蛋白，使得可以评估患有细胞、组织或器官功能障碍如肾病的危险性。当体外测量取自受试者的样本中的人巨蛋白，而且与取自健康个体的人巨蛋白浓度比较，样本中人巨蛋白的浓度显著增强时，该受试者可被评估为很可能患有有细胞、组织或器官功能障碍。也就是说，测量样本中人巨蛋白使得能够筛选很有可能患病的受试者，如将出现肾病的患者，并提供适当的治疗。

进一步，定期测量从受试者获得的样本中人巨蛋白和监测人巨蛋白浓度，使得可以控制器官功能。

人巨蛋白可用作标志，用于检测或诊断其中观测有人巨蛋白表达的细胞、组织或器官的功能障碍。本发明包括人巨蛋白的应用，用作用于检测功能障碍、即其中观测有巨蛋白表达的器官的疾病的标志。本发明还进一步包括疾病检测/诊断标志，用于检测和诊断功能紊乱，即其中观测有巨蛋白表达的细胞、组织或器官的疾病。

此外，当检测或诊断功能紊乱、即其中观测有巨蛋白表达的细胞、组织或器官的疾病时，也可以通过测量人巨蛋白的片段以及完整的人巨蛋白。

实施例

以下将参考实施例更详细地描述本发明，尽管本发明并不限于这些实施例。应该指出的是，实施例中使用的酶联免疫吸附测定(ELISA)，自Engvall E.和PerlmannP.在1971年首次报道后，迄今为止已有许多研究人员报道。这种技术的使用已有坚实的基础(Engvall E，Perlmann P.，1971，Immunochemistry，8，871-874)。

以下将参考实施例更详细地描述本发明，尽管本发明并不限于这些实施例。

借助酶联免疫吸附测定(ELISA)检测尿中的人巨蛋白

(1)制备小鼠抗人巨蛋白单克隆抗体

用50μg带佐剂的人巨蛋白经腹腔免疫小鼠几次，确认了血清效价升高。在加强注射(静脉免疫)后3天，取出脾脏并获得脾细胞。在聚乙二醇3500存在下，将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合(10:1)以制备杂交瘤细胞。将产生的细胞在CO₂存在下于37℃培养1周，监测在培养液上清中是否存在抗人巨蛋白抗体。通过限制稀释法对其中观察有抗体产生的阳性孔内的细胞进行稀释，将产物培养2周，以同样的方式检查培养液上清中是否存在抗人巨蛋白抗体。此后，通过限制稀释法对其中观察到有抗体产生的阳性孔内的细胞进行稀释，并以同样的方式培养产物。在这一阶段，将其中有抗人巨蛋白抗体产生的细胞在烧瓶中培养，将其中的部分悬浮在含10％二甲基亚砜(DMSO)(5×10⁶细胞/ml)的胎牛血清(FCS)，将产物储存在液氮中。

随后，用孔内的上清检查培养液上清内产生的抗人巨蛋白抗体的反应性。将人巨蛋白溶解于140mM氯化钠、2.7mM氯化钾、10mM磷酸氢二钠和1.8mM磷酸二氢钾(pH值7.3；以下简称“PBA，pH7.3”)。向塑料微量滴定板(Nunc-Immuno^TMModule F8 Maxisorp^TM Surfaceplate，Nalge Nunc International)的孔内，每孔加入100μl人巨蛋白的PBS溶液(pH7.3)；然后，将人巨蛋白以3pmol/孔的浓度固定在微量滴定板上，于4℃固定12小时。之后，通过倾析去除已经加入孔内的人巨蛋白的PBS溶液(pH7.3)，将145mM氯化钠、3.6mM磷酸氢二钠、1.4mM磷酸二氢钾和0.05％(v./v.)吐温20(以下简称为“PBS-T”)加入微量滴定板的孔内(200μl/孔)，通过倾析去除PBS-T，洗去孔内超量吸附的人巨蛋白。该洗涤程序总共进行两次。随后，加入含145mM氯化钠、7.2mM磷酸氢二钠、2.8mM磷酸二氢钾、1％(wt./v.)BSA和5％(wt./v.)乳糖(以下简称为“抗原结合化板的封闭溶液)，200μl/孔，将已结合有人巨蛋白的微量滴定板孔内壁于4℃封闭12个小时。此后，将所得物储存在4℃。为了检查培养上清内抗体的反应性，可使用封闭处理后已结合有人巨蛋白的微量滴定板。向固定有人巨蛋白的微量滴定板孔内加入100μl/孔的杂交瘤细胞培养液上清，将微量滴定板在37℃加热1个小时。此后，通过倾析去除已加入孔内的培养液上清，将PBS-T以200μl/孔加入微量滴定板的孔内，通过倾析去除PBS-T，并洗涤孔的内壁。该洗涤程序总共进行三次。此后，将过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠免疫球蛋白(DAKO)以100μl/孔加入孔内(2000倍稀释，0.55μg/ml)，将产物在37℃加热1小时。用145mM氯化钠、3.6mM磷酸氢二钠、1.4mM磷酸二氢钾、0.05％(v./v.)吐温20和0.5％(wt./v.)BSA的溶液(以下简称为“酶标记抗体的稀释液”)稀释酶标记抗体。此后，通过倾析去除已加入孔内的酶标记抗体，将PBS-T以200μl/孔加入微量滴定板的孔内，通过倾析去除PBS-T，并且洗涤孔的内壁。该洗涤程序总共进行三次。此后，将3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(以下简称“TMB”)溶液(TMB一步法底物系统：DAKO)加入孔内(100μl/孔)，作为过氧化物酶反应的底物溶液，使产物在25℃静置30分钟。紧接着，将313mM的H₂SO₄溶液(以下简称为“反应终止液”)以100μl/孔加入到孔内的反应底物溶液中，以终止孔内的酶反应。此后，测量各孔的吸光度，用450nm的吸光度减去630nm的吸光度，得到的值被指定为反应性评价指标(Josephy P.D.，Mason R.P.等，1982，J.Biol.Chem.257，3669-3675)。自Bos E.S.等在1981年首次报道后，迄今为止，已有许多有关基于TMB的比色法的报导，该技术的使用有坚实的基础(Bos E.S.等，1981，J.Immunoassay，2，187-204)。

结果，筛选出了对固定化人巨蛋白表现出强反应活性的抗人巨蛋白抗体的单克隆杂交瘤细胞，用小鼠免疫球蛋白分类试剂盒(WakoPure Chemical Industries，Ltd.)，在培养液上清中检查了有关来自100μl贮存培养液上清溶液的每一个克隆的免疫球蛋白类别和亚类。基于所述结果，从所得的单克隆细胞库中筛选出IgG类克隆，然后按如下所述程序进行腹水制备。

随后，在25毫升烧瓶中培养这些细胞，然后在75毫升烧瓶中培养。将这些细胞腹腔注射到经姥鲛烷处理的小鼠，并抽取腹水样本。

(2)纯化小鼠抗人巨蛋白单克隆(IgG)抗体

将获得的腹水(10毫升)按1:1.5体积比与混浊血清处理试剂[FRIGEN(注册商标)II：Kyowa Pure Chemical Co.，Ltd.]混合，振荡和搅拌生成物1-2分钟以使腹水脱脂。将腹水以3000rpm(1930×g)离心10分钟，分级分离出澄清腹水的离心上清液(10ml)。将该腹水离心上清(10ml)在冰浴中用硫酸铵分级分离(终浓度：50％饱和硫酸铵)1小时，用PBS悬浮并溶解沉淀的免疫球蛋白部分。此硫酸铵分级分离过程共进行两次，以从腹水中获得免疫球蛋白组分粗制品。将所得的免疫球蛋白组分粗制品(10ml)与等量的20mM磷酸钠[pH7.0；以下简称“20mM NaPB(pH7.0)”]混合，然后用G蛋白柱(HiTrap Protein GHP，5ml；Amersham BioSciences)进行亲和纯化。将样本吸附在G蛋白柱后，用20mM NaPB(pH7.0，50ml)冲洗该G蛋白柱，样本中除IgG以外的杂质被洗去。然后，亲和吸附在G蛋白柱的IgG抗体用0.1M盐酸甘氨酸(pH2.7)洗脱，洗脱后即刻从柱中流出的洗脱部分用1M三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(pH9.0)中和并回收(以下“三(羟甲基)氨基甲烷”缩写为“Tris”)。中和后，在4℃用以500倍于亲和纯化产物的量的PBS透析该亲和纯化产物6小时，此透析过程共进行两次。透析用的透析膜是透析用纤维素管(Viskase Companies)。所得的IgG洗脱部分被称为纯化的抗人巨蛋白单克隆抗体，并储存于4℃，再进行如下所述的程序。通过将上述G蛋白柱以恒定流速1ml/min连接到BioLogicLP System(Bio Rad Laboratories)，进行纯化过程。

(3)制备固定有抗人巨蛋白单克隆抗体的微量滴定板

用PBS(pH7.3)溶解纯化抗人巨蛋白单克隆抗体，使其终浓度为5μg/ml。向塑料微量滴定板(Nunc-Immuno^TMModule F8 Maxisorp^TMSurface plate，Nalge Nunc International)的孔内，加入抗人巨蛋白单克隆抗体的PBS溶液(pH7.3)，每孔100μl，并使抗人巨蛋白单克隆抗体在微量滴定板上于4℃固定12小时。之后，通过倾析去除孔内的抗人巨蛋白单克隆抗体的PBS溶液(pH7.3)，将PBS-T加入微量滴定板的孔内(200μl/孔)，通过倾析去除PBS-T，洗去孔内超量吸附的抗人巨蛋白单克隆抗体。该洗涤程序总共进行两次。然后，加入86mM氯化钠、100mM Tris、0.5％(wt./v.)BSA和0.05％(v./v.)吐温20(以下简称为“抗体固定化板的封闭溶液”)，200μl/孔，将已固定有抗人巨蛋白单克隆抗体的微量滴定板孔内壁于4℃封闭12个小时。然后，将生成物储存于4℃。

(4)制备过氧化物酶标记的抗人巨蛋白单克隆抗体

将辣根过氧化物酶(以下简称为“HRP”)(源自辣根的过氧化物酶，VI型，Sigma)以4mg/ml溶解于纯水，向500μl HRP溶液(2mg)加入100μl的100mM偏过碘酸钠溶液，在室温搅拌混合物20分钟。用体积量500倍于该HPR溶液的1mM醋酸钠溶液(pH4.0)(以下称为“1mM醋酸缓冲液”)透析此生成物，4℃透析6小时，该程序进行两次。透析用的透析膜是透析用纤维素管(Viskase Companies)。随后，将抗人巨蛋白单克隆抗体溶解于2.4mM碳酸钠和7.6mM碳酸氢钠的溶液(pH9.6)(以下简称为“10mM碳酸缓冲液”)，浓度为8mg/ml。向500μlHRP溶液(2mg)加入1/3体积的120mM碳酸钠和380mM碳酸氢钠的溶液(pH9.6)(以下简称为“0.5M碳酸缓冲液”)，再加入500μl上述抗人巨蛋白单克隆抗体(4mg)，此生成物在室温下搅动2小时。此后，加入50μl硼氢化钠溶液(4mg/ml)，此生成物在室温下搅动2小。在冰浴中将此生成物用硫酸铵分级分离(终浓度：50％饱和硫酸铵)1小时，沉淀部分悬浮和溶解在1ml的100mM Tris、145mM氯化钠和1％(v./v.)BSA溶液(pH7.6)(以下被称为“标记抗体的悬浮液”)中。该硫酸铵分级分离处理共进行两次，将2.8mM磷酸二氢钾、7.2mM磷酸氢二钠、145mM氯化钠、1％(wt./v.)BSA、0.02％(v./v.)苯酚和40％(wt./v.)D-山梨醇溶液(以下被称为“标记抗体储存液”)，按标记抗体溶液的3/4体积，加入到标记抗体溶液(以下被称作“标记抗体储存液”)中。获得HRP标记的抗人巨蛋白单克隆抗体。自从Nakane，P.K.和Kawaoi，A.在1974年首次报导后，已有许多关于HRP标记方法的报导。因此，该技术的使用有坚实基础(Nakane，P.K.，Kawaoi，A.，1974，J.Histochem.Cytochem.22，1084)。

(5)测量尿中的人巨蛋白

使用上述固定有抗人巨蛋白单克隆抗体的微量滴定板和HRP标记的抗人巨蛋白单克隆抗体来测量尿液中的人巨蛋白。首先，将90μl肾小球滤过液与10μl 2M Tris和0.2M乙二胺-N，N，N’，N’-四乙酸溶液(以下“乙二胺-N，N，N’，N’-四乙酸”缩写为EDTA，pH为8.0)混合，将100μl所得溶液加入到固定有抗人巨蛋白单克隆抗体的微量滴定板的孔中。使生成物在37℃静置1小时，通过倾析去除孔中已加入的尿样溶液，向微量滴定板的孔中加入PBS-T(200ml/孔)，通过倾析去除PBS-T，然后洗涤。洗涤过程进行三次。此后，加入HRP标记的抗人巨蛋白单克隆抗体溶液(用稀释标记抗体溶液将上述储存液稀释10000倍)，100μl/孔。使生成物在37℃静置1小时，通过倾析去除孔中已加入的HRP标记抗体溶液，向微量滴定板的孔中加入PBS-T(200μl/孔)，通过倾析去除PBS-T，然后洗涤。洗涤过程进行三次。随后，将100μl/孔的TMB溶液(TMB一步法底物系统；DAKO)加入孔中作为过氧化物酶反应的底物溶液，让生成物在25℃静置30分钟。紧接着，将反应终止液加入到孔内的底物溶液中，100μl/孔，以终止孔内的酶反应。此后，测量孔内的吸光度，450nm的吸光度减去630nm的吸光度得到的值被指定作为评价尿中人巨蛋白测量值的指标。作为校准曲线的参考样本，在使用抗人巨蛋白单克隆抗体制剂时，使用人巨蛋白作为免疫抗原，分析结果示于表1和图2。尿液中人巨蛋白的实际临床测量结果示于表2、图3和图4。结果发现，与健康个体相比，肾病患者和将患肾病的患者排出到尿液中的人巨蛋白量显著增高(图3和4)。有关排出到尿液中的巨蛋白量的肌酐清除试验也得到类似结果。这表明，尿排泄时间的浓度将无关紧要(图3和4)。本发明提供了测量人巨蛋白的方法，与传统的技术比较，这种方法可以在较短的时间以较简单方法完成，而且还可以定量人巨蛋白。进一步，本发明使得能够在早期以定点方式诊断细胞、组织或器官特有的功能性疾病的方法。上述临床结果明显支持本发明的这种特征。

表1

表2

此文中引用的所有出版物、专利和专利申请的全部内容在此引作参考。

序列表

<110>NIIGATA UNIVERSITY；DENKA SEIKEN Co.，Ltd.

<120>检测人巨蛋白的方法

<130>PH-3116-PCT

<150>JP 2006-089306

<151>2006-03-28

<160>2

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>13968

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>1

<210>2

<211>4655

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>2

Claims

1.使用结合于固体支持物上的能结合人巨蛋白的第一配体以及能结合人巨蛋白的第二配体来测定样本中人巨蛋白的方法，该方法包括：使样本与结合于固体支持物上的能结合人巨蛋白的第一配体发生反应，使样本与能结合人巨蛋白的第二配体发生反应，对因该样本中人巨蛋白与能结合人巨蛋白的配体形成复合物而被结合于固体支持物的、能结合人巨蛋白的第二配体进行测定。

2.权利要求1所述的测定样本中人巨蛋白的方法，其包括以下两个步骤：结合于固体支持物上的能与人巨蛋白结合的第一配体与样本之间的反应，和随后的能与人巨蛋白结合的第二配体与样本之间的反应。

3.权利要求1所述的测定样本中人巨蛋白的方法，其中，结合于固体支持物上的能结合人巨蛋白的第一配体与样本之间的反应，和能结合人巨蛋白的第二配体与样本之间的反应，是在单一的步骤中进行的。

4.权利要求1至3中任一项所述的测定样本中人巨蛋白的方法，其中，能结合人巨蛋白的第一配体和能结合人巨蛋白的第二配体都是抗体。

5.权利要求1至3中任一项所述的测定样本中人巨蛋白的方法，其中，能结合人巨蛋白的第一配体是特异地针对人巨蛋白糖链的凝集素，而能结合人巨蛋白的第二配体是抗体。

6.权利要求1至3中任一项所述的测定样本中人巨蛋白的方法，其中，能结合人巨蛋白的第一配体是抗体，而能结合人巨蛋白的第二配体是特异地针对人巨蛋白糖链的凝集素。

7.权利要求1至6中任一项所述的测定样本中人巨蛋白的方法，其中，能结合人巨蛋白的第一配体和/或能结合人巨蛋白的第二配体是选自下列物质：维生素结合蛋白，其为钴胺传递蛋白-维生素B₁₂、维生素D结合蛋白或视黄醇结合蛋白；脂蛋白，其为有载脂蛋白B、载脂蛋白E、载脂蛋白J/簇蛋白、或载脂蛋白H；激素，其为甲状旁腺激素(PTH)、胰岛素、上皮生长因子(EGF)、催乳素、瘦蛋白或甲状腺球蛋白，上述任一种的受体或这类激素的受体；免疫或应激反应相关蛋白，其为免疫球蛋白轻链、PAP-1或β₂-微球蛋白；酶，其为PAI-I、PAI-I-尿激酶、PAI-I-tPA、尿激酶原、脂蛋白脂肪酶、纤溶酶原、α-淀粉酶、β-淀粉酶，α₁-微球蛋白或溶菌酶，上述任一种的抑制剂或这类酶的抑制剂；药物或毒素，其为氨基糖苷类、多粘菌素B、抑肽酶或天花粉蛋白；载体蛋白，其为白蛋白、乳铁蛋白、血红蛋白、气味结合蛋白、甲状腺素视黄质运载蛋白或L-FABP；和受体相关蛋白(RAP)，其为细胞色素c、钙(Ca²⁺)、渐进性糖化终产物(AGE)、cubilin或Na⁺-H⁺交换转运蛋白同种型3(NHE3)；或这些物质中的结合片段。

8.使用结合于固体支持物的人巨蛋白或人巨蛋白的部分片段以及能结合人巨蛋白的配体来测定样本中人巨蛋白的方法，该方法包括：使样本与能结合人巨蛋白的配体发生反应，让反应产物与结合于固体支持物的人巨蛋白发生反应，对结合于固体支持物的能与人巨蛋白结合的配体进行测定，并根据结合于固体支持物的能结合人巨蛋白的配体的减少百分率来竞争性定量样本中的人巨蛋白。

9.权利要求8所述的测定样本中人巨蛋白的方法，其中，能结合人巨蛋白的配体是抗人巨蛋白抗体。

10.使用能结合人巨蛋白的配体测定样本中人巨蛋白的方法，该方法包括：使样本与结合于微粒上能结合人巨蛋白的配体发生反应以诱导凝集，并根据导致凝集的程度来测量人巨蛋白。

11.权利要求10所述的测定人巨蛋白的方法，其中，能结合人巨蛋白的配体是抗人巨蛋白抗体，凝集是免疫凝集。

12.通过权利要求1至11中任一方法测定人巨蛋白以检测其中观测到有巨蛋白表达的器官的疾病的方法。

13.权利要求12所述的检测器官疾病的方法，其中，其中观测到有巨蛋白表达的器官的疾病是肺病。

14.权利要求12所述的检测器官疾病的方法，其中，其中观测到有巨蛋白表达的器官的疾病是肾病。

15.权利要求14所述的检测肾脏疾病的方法，其中，肾病是肾小管性疾病。

16.权利要求14或[15]所述的方法，其中，样本是尿液。

17.用于检测其中观测到有巨蛋白表达的器官疾病的试剂盒，其包含能结合人巨蛋白的配体。

18.权利要求17所述的用于检测其中观测到有巨蛋白表达的器官疾病的试剂盒，其中，能结合人巨蛋白的配体是抗人巨蛋白抗体。

19.权利要求18所述的用于检测其中观测到有巨蛋白表达的器官疾病的试剂盒，其中，其中观测到有巨蛋白表达的器官疾病是肺病。

20.权利要求18所述的用于检测其中观测到有巨蛋白表达的器官疾病的试剂盒，其中，其中观测到有巨蛋白表达的器官疾病是肾病。

21.权利要求20所述的用于检测肾病的试剂盒，其中，肾病是肾小管性疾病。

22.用于检测其中观测到有巨蛋白表达的器官疾病的疾病检测标志，其包含人巨蛋白。

23.权利要求22中的疾病检测标志，其中，其中观测到有巨蛋白表达的器官疾病是肺病。

24.权利要求22中的疾病检测标志，其中，其中观测到有巨蛋白表达的器官疾病是肾病。

25.权利要求24中的疾病检测标志，其中，肾病是肾小管性疾病。

26.人巨蛋白的用途，用作用于检测其中观测到有巨蛋白表达的器官疾病的疾病检测标志。

27.权利要求26所述的人巨蛋白作为疾病检测标志的用途，其中，其中观测到有巨蛋白表达的器官疾病是肺病。

28.权利要求26所述的人巨蛋白作为疾病检测标志的用途，其中，其中观测到有巨蛋白表达的器官疾病是肾病。

29.权利要求28所述的人巨蛋白作为疾病检测标志的用途，其中，肾病是肾小管性疾病。