TWI221421B - Artificial kidney having function of metabolizing protein and method of constructing the same - Google Patents

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A7 1221421 五、發明說明（/ ) 技術領域 本發明係關於一種具有蛋白代謝機能之人工腎臟及其 製作方法，該人工腎臟之特徵爲：以注入有水凝膠（含有促 進血管新生之生長因子）之海棉片與表面上表現梅加林 (megalin)之細胞做爲構成成分。 背景技術 日本之末期腎功能不全治療由於腎臟捐贈者不足，係 以血液透析療法爲主體。但由於血液透析療法無法充分補 償原本之腎臟機能，故會引起各種倂發症，影響患者之生 活品質(QOL)與存活年數。 血液透析療法之弱點爲無法補償近端轍尿管細胞所具 有之絲球體過濾蛋白代謝機能。因此，原本該細胞能代謝 之低分子量蛋白質會堆積在血液透析患者之體內，並且以 尿毒蛋白的形式作用，引發各種病症。代表例爲因β2-微 球蛋白（β2-ιη)之堆積所造成之透析澱粉樣變性病 (amyloidosis)，會造成骨關節障礙或臟器功能不全。又， 血液透析患者亦會堆積糖化修飾蛋白AGE，此與動脈硬化 或臟器障礙有關。近年來，雖進行血液透析膜或血液過濾 法之改良、及達成(3-2m吸附管柱之實用化，但是其仍有極 限，是以開發能夠持續性充分補償蛋白代謝機能之人工腎 臟是被期待的。 相對於此，爲補償近端輸尿管細胞機能而利用細胞之 系統已被開發。比如，Humes HD等（Nature Biotech 17, _____3__ ______ _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線 A7 1221421 五、發明說明（；X ) 452-453(1999))報告之人工腎臟’其將血液過濾器與不死 化近端輸尿管上皮細胞著生於中空纖維內腔之模組做組合 ，使過濾血液在培養了輸尿管細胞之內腔中循環’又’齋 藤明等人(第44屆日本透析醫學會（1999))則報告了利用遠 端輸尿管上皮細胞之人工腎臟（輸尿管）。但該等皆爲體外 型之裝置，並不能克服間歇性血液處理之體外循環療法的 弱點。 發明之簡單說明 本發明係爲解決上述問題點，提供具有蛋白代謝機能 之體內型人工腎臟及其製作方法。又，本發明爲利用與低 分子蛋白或激素等結合而拉入細胞內之所謂”梅加林 (megalin)”之機能以提供具蛋白代謝機能之人工腎臟。 亦即，本發明係關於一種具有蛋白代謝機能之體內型 人工腎臟，其特徵在於，其構成成分係海棉片與細胞，該 海棉片注入有水凝膠（含有促進血管新生之生長因子），該 細胞表面能發現梅加林，其爲扮演近端輸尿管蛋白代謝機 能之中心角色之入胞作用受體。 又，本發明係關於一種具有蛋白代謝機能之體內型人 工腎臟之製作方法，其特徵在於，係採用：注入有水凝膠( 含促進血管新生之生長因子）之海棉片、以及表面上表現梅 加林之細胞。再者，本發明係關於上述體內型人工腎臟之 製作方法，其包含：將水凝膠(含促進血管新生之生長因子 )注入海棉片之製程；將該海棉片埋植於皮下之製程；以及 __________4 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

' --------訂---------U 1221421 A7 _____ B7 _ 五、發明說明（今） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ，將表面上表現梅加林之細胞注入已埋植之該海棉片中之 製程。 再者，本發明係關於具有以下特徵之上述人工腎臟及 其製作方法。促進血管新生之生長因子爲鹼性纖維芽細胞 增殖因子(bFGF);該bFGF係以基因工程手法所製造之人類 bFGF;水凝膠爲明膠;該明膠係以等電點在4.5〜5.5之明膠 爲主成分;海棉片係由膠原構成;表面有梅加林之細胞爲人 類近端輸尿管上皮細胞及/或藉基因導入來大量表現梅加林 之人類近端輸尿管上皮細胞；梅加林之表現爲依據基因操 作。 發明之詳細揭示 以下詳述本發明。 本發明中具有蛋白代謝機能之體內型人工腎臟，其特 徵在於，係以注入有水凝膠(含有促進血管新生之生長因子 )之海棉片與表面上表現梅加林(megalin)之細胞做爲構成成 分。 本發明所用之促進血管新生之生長因子有鹼性纖維芽 細胞增殖因子(bFGF;basic fibroblast growth factor)、酸性 纖維芽細胞增殖因子（aFGF; acidic fibroblast growth factor) 、上皮細胞增殖因子(EGF; epidermal growth factor)、轉形 增殖因子（TGF-α; transforming growth factor-α)、血管內皮 細胞增殖因子(VEGF; vascular endothial growth factor)、血 小板由來增殖因子（PDGF-BB; platelet-derived growth _____5_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 1221421 A7 _____ _B7_____ 五、發明說明（令） factor-BB)、肝細胞增殖因子（HGF;hepatocyte growth factor)等。 再者，本發明中之上述促進血管新生之生長因子可僅 使用一種或使用複數之組合。又亦可與其他具有生物學活 性之因子組合使用。 上述之生長因子中，以bFGF、PDGF-BB可發揮較強 之增殖活性的觀點看來，此等爲較佳者。又bFGF爲廣泛 爲人知之血管新生促進因子，故爲較佳使用之生長因子之 -* 〇 本發明所用之bFGF含有從腦下垂體、腦、腎、副腎 、胎盤、骨基質、軟骨、內皮細胞、纖維芽細胞等臟器中 所萃取者、以基因置換等基因工程手法所製造者、或該等 之修飾體、具有纖維芽細胞增殖因子的作用者。其中以利 用基因工程手法所製作的人類bFGF在品質與供給安定性 的觀點爲特別較佳者。又，上述修飾體包括以萃取或基因 工程方式所得到之在bFGF胺基酸配列上添加胺基酸者、 胺基酸有部分以其他胺基酸取代者、或有部分胺基酸欠缺 者。本發明中可單獨或混合使用該等bFGF。 本發明中所用之水凝膠係藉將所含有之促進血管新生 、之生長因子徐徐釋放至周圍以持續血管新生之效果。 本發明中所使用之水凝膠原料有比如纖維素、葡聚糖 、瓊脂、茁黴多糖(pullulan)、澱粉、透明質酸、藻酸、幾 丁質、幾丁聚糖等多糖類，及以羥基乙基纖維素或羧基甲 基纖維素等爲首之多糖類衍生物;聚天冬胺酸、聚麩胺酸、 __ 6 本紙張尺度適^中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） -- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -------訂·-------- A7 1221421 -------B7___— 五、發明說明（（） 聚離胺酸等聚胺基酸;明膠、膠原、纖維原蛋白、谷蛋白等 之多肽；聚乙烯基醇、聚丙烯醯胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚 (2-羥基乙基甲基丙烯酸酯）、聚乙烯甲基醚、聚(N_乙稀基 乙醯胺）、聚丙烯酸、聚(異丁烯順丁烯二酸）、聚(2-丙烯基 醯胺-2-甲基丙烷磺酸）、聚丙烯氧基丙烷磺酸、聚乙烯基 細酸、聚（甲基丙燦釀氧基乙基四級錢膠體）、聚乙燦基口比 啶、聚(N，N-二甲基-N-(2-甲基丙烯醯基氧乙基擴丙 基)銨內鹽)等具有親水性側鏈之合成高分子;聚乙二醇、聚 二氧雜戊環、聚乙烯亞胺等主鏈爲親水性的合成高分子。 本發明中將可該等材料單獨或將複數個適當組合，甚 至以其他化合物修飾(改質)來使用亦可。 前述水凝膠原材料中，纖維素、透明質酸、藻酸、幾 丁質、幾丁聚糖等多糖類、聚天冬胺酸、聚麩胺酸、聚離 胺酸等胺基酸、明膠、膠原、纖維原蛋白等之多肽等，由 於具有活體吸收性故較佳。特別是明膠，從加工容易性、 維持所包含之生長因子之生物學活性、且於活體內之分解 速度(生長因子之緩釋性)之觀點看來，爲較佳使用者。 明膠係以將活體中所含有之膠原以酸或鹼等進行適當 前處理後，以溫水加熱萃取所得到者，本發明中只要爲普 通可取得者即可使用，並無特別限定。該種明膠有比如等 電點爲4.5〜5.5之鹼處理明膠、等電點爲8〜9之酸處理明 膠等。血管新生促進因子使用bFGF時，因bFGF等電點 爲約9，在中性水溶液中會帶正電，故由bFGF之保持性 觀點，以等電點爲4.5〜5.5之鹼處理明膠爲較佳使用者。 ______7 ___ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ' 訂--------- A7 1221421 ____B7___ 五、發明說明（纟） 又，明膠不僅一種，也可以將不同原料者或溶解性、分子 量及等電點等物性不同者混合使用。再者，亦可含有其他 之添加劑，比如特開平8-325160所揭示般，亦可使用用以 賦予bFGF緩釋性而添加之聚陰離子化合物等。又，以 bFGF作爲血管新生促進因子時，使用明膠以外之上述水 凝膠時，以bFGF保持性之觀點，以水凝膠之等電點較低 者爲佳。 血管新生效果之持續時間可依所使用水凝膠之生物分 解性與含水率來加以變化。 又，水凝膠之含水率以促進血管新生之生長因子之緩 釋觀點，以在水中使膨潤時含水率爲80%以上爲較佳， 85〜99%爲更佳，90〜98%又更佳。 水凝膠之含水率w可利用以下方法求出。 水凝膠之形狀爲粒子狀時，以冷凍乾燥水凝膠之放液 (tapping，將水凝膠置於量筒，對量筒進行物理性刺激， 使水凝膠緊密充塡)後之體積當成VD，於37°C下於水中使 膨潤24小時之水凝膠其放液後體積當成Vw，依 w[%]=l〇〇x(Vw-VD)/Vw 來計算。再者，Vw、VD之測定方法比如有，反覆進 行將量筒由約5公分之高度落下之操作，並讀取其體積不 再變化時之體積的方法。又，Vw因爲在水中之水凝膠之 沉降有時需要時間，故以進行上述之落下操作約10次’ 並靜置30分鐘以讀取體積不變時之體積來測定。 又，水凝膠之形狀非粒子狀時，可於37°C下於水中使 ____8____ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------訂--------- 1221421 A7 B7 五、發明說明（ 膨潤24小時後，將水凝膠之附著水或水凝膠粒子間之間 隙水以吸引過濾法或離心法除去，將此時之重量當作濕潤 重量Ww，又繼續乾燥至重量不再變化時的重量當作乾燥 重量WD，利用 w[%] = 10〇x(Ww-WD)/Ww 來算出。 再者，具體求出濕潤重量之方法有比如將水凝膠放在 玻璃過濾器內，以吸氣器(aspirator)來吸引，將吸引時間與 重量之關係作成重量減少曲線，一旦經過曲線之斜率變緩 之吸引時間後再測定重量等方法。又，乾燥方法只要能達 成恆量化即不特別限定，但是於105。(：以上之常壓乾燥因 不需要特別裝置可簡便的採用。惟，當因該溫度下之乾燥 會產生分解時’亦可採用凍結乾燥等低溫下之減壓乾燥方 法。 本發明中所用之水凝膠若前述原材料爲水溶性時係以 使其非水溶化來得到，但依材料之來源或性質等，亦可使 用熱處理、紫外線或γ射線照射、以及與硬化劑反應等之 交聯方法。 硬化齊I雖不特別限定’但比如使用之水凝膠爲明膠時 ’可舉出含鋁或鐵等多價金屬離子之鹽等無機化合物;戊二 醛、甲醛等酸類、1_乙基_3_(3·二甲基胺基丙基）碳化二亞 胺鹽酸鹽、環己基-31嗎咐代乙基）碳化二亞胺I對 甲本石貝酸酯等碳化二亞胺類、環氧氯醜、丁三醇二縮水 甘/由__化合物、六亞甲基二異氰酸酯等異氰酸酯類 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) —訂---------線* (210 x 297 公釐） A7 1221421 B7 ----- - --- -------^ — ... - ------- I ....._ _ 五、發明說明（€ ) 、酸酐等之有機化合物。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明中使用之水凝膠形狀有柱狀、片狀、碟狀 '球 狀、粒子狀、無定形等，但由注入海棉片之容易度的觀點 ，以球狀、粒子狀、無定形者爲較佳使用者。 又，水凝膠之大小以平均粒徑爲1〇μπι〜200μπι者爲較 佳，20μπι〜150μιη者爲更佳。 本發明所使用之海棉片係用於將含有促進血管新生之 生長因子之水凝膠加以固定，且將表面顯現梅加林之細胞 加以保持之多孔質片材。 海棉片之原材料除前述之水凝膠原料之外，可舉出如 聚乙二醇酸、聚乳酸、聚己內酯、聚二噁酮、聚羥基醋酸 、聚羥基戊酸等聚酯類、聚三亞甲基碳酸酯、聚(α-氰基丙 烯酸酯)等活體吸收性材料、聚氨酯等。本發明中可將該等 材料單獨使用或者將複數種組合，再者亦可以其他化合物 修飾使用。 前述海棉片原材料中，膠原、聚乙二醇酸、聚乳酸等 以活體適合性材料之實際效果的觀點來看爲較佳者。特別 是膠原海棉片因細胞之著生性良好故爲較佳被使用者。 本發明所使用之海棉片具有多孔構造，以新生血管侵 入之容易度、對被注入細胞供給氧氣或養分之容易度觀點 看來，以具有連通孔之全多孔構造者爲較佳。 其平均細孔徑以60〜400μιη爲較佳，70〜150μιη爲更佳 〇

梅加林爲本發明者齋藤等於大鼠中成功的進行cDNA _________10_^___ 本紙張尺度適i中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐) ' 1221421 B7 五、發明說明（f ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 選殖，係一種扮演全一次構造已解析之近端輸尿管細胞其 蛋白代謝機能之中心角色的入胞作用受體（Pr〇C. Nat1·

Acad· Sci· USA 91，ρ·ρ· 9725-9729(1994))。其後，Hjalm G 等將人類之梅加林/gp330選殖並將其全一次構造解析(Eur· J. Biochem. 239，ppl3-137，（1996))。人類梅加林推定爲 4655個胺基酸(分子量519,636)，由N-末端(25個胺基酸) 、細胞外區(4398個胺基酸）、膜貫通域(23個胺基酸）、C 末端細胞質內區(209個胺基酸)形成，細胞外區具有3種 形式之富含胱胺酸區，已知屬於低密度脂蛋白受體基因之 家族。

梅加林據報告可與PAI-1、PAI-1尿激酶、PAI-1-tPA 、原尿激酶、脂蛋白脂酶、抑肽酶等酵素或酵素抑制劑類 、維生素D結合蛋白、視黃醇結合蛋白等維生素結合蛋白 類、載脂蛋白B、載脂蛋白E等載脂蛋白類、胺基葡萄糖 苷類或多黏菌素B等鹼性多肽、副甲狀腺激素、胰島素、 β2-ιη、上皮生長因子、催乳激素、卵磷脂、細胞染色質C 等低分子量蛋白或激素類等結合，爲一種多機能之入胞受 體。 再者，梅加林在人類除了腎之近端輸尿管上皮細胞之 外，亦確認存在於副甲狀腺（上皮小體）細胞、胎盤絨毛間 腔中之上皮性細胞層、精巢上體上皮細胞、II型肺泡上皮 細胞、乳房上皮細胞、甲狀腺小胞細胞、眼球毛狀體上皮 細胞等表面。亦即，該等細胞可說是梅加林表現細胞之例 子。做爲梅加林表現細胞在上述細胞中，以由自體所殘存 ____ _η___ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） A7 1221421 ------------------ - B7___ _ 五、發明說明（β ) 之腎中所抹取之近端輸尿管上皮細胞爲特別較佳使用的。 本發明中所使用之表面上表現梅加林的細胞除自體及 異體之上述梅加林表現細胞以外，還有進行將基因導入自 體或他體之上述梅加林表現細胞之大量表現梅加林之細胞 、進行將基因導入自體或異體之非梅加林表現細胞之梅加 林表現細胞、甚至由胚細胞或幹細胞分化誘導爲梅加林表 現細胞之細胞等。再者，基因導入之方法可使用已知物理 方法、化學方法、生物方法等。又，分化誘導之方法有給 予分化誘導物質之方法，與其他細胞共同培養之方法，改 變溫度、壓力、pH、滲透壓等環境之方法等。 上述表面上表現梅加林的細胞中，以埋植於體內之細 胞其被排除性之觀點來看，以自體細胞爲較佳。再者，人 類近端輸尿管上皮細胞及/或以基因導入大量表現梅加林之 近端輸尿管上皮細胞更佳。 非梅加林表現之細胞，由技巧之簡便性來說以由自體 末稍血而來之高吞噬能力之巨噬體狀細胞爲較佳使用者。 又，梅加林之表現以基因操作者爲佳。 其次，說明本發明之具有蛋白代謝機能的體內型人工 腎臟其製作方法。 本發明之人工腎臟係利用已注入水凝膠（含促進血管 新生之生長因子）之海棉片與表面上表現梅加林之細胞所製 作。較佳爲，該人工腎臟之製作方法包括下述製程：將含 促進血管新生之生長因子之水凝膠注入海棉片的製程；將 該海棉片埋植於皮下之製程；在已埋植之該海棉片注入表 _ 12 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線· 1221421 A7 ___ B7__ 五、發明說明（l() 面上表現梅加林之細胞的製程。 水凝膠之製作方法可使用已知方法而並沒有特別的限 制。比如利用氫鍵、離子鍵、配位鍵等分子間物理凝集之 方法、利用交聯劑之化學性交聯方法、以光或放射線照射 之交聯方法等。又，水凝膠之成型（製劑化）方法不特別限 定，比如製作粒子狀物質時可使用乳化法、熔融成型法、 噴霧乾燥法等。 使水凝膠內含有促進血管新生之生長因子之方法只要 是對促進血管新生之生長因子之生物活性沒有顯著損害之 方法即無特別的限制。比如，製作水凝膠後，將水凝膠乾 燥，再使其吸收含生長因子之溶液之方法；或者，於水凝 膠製作後並不將其乾燥而是直接含浸於含生長因子之溶液 中之方法；更者，於水凝膠製作時於該原液中使生長因子 存在的方法等。 含有促進血管新生之生長因子之水凝膠可利用比如注 射器等注入海棉片。 海棉片係用來將含有促進血管新生之生長因子之水凝 膠加以固定，及將表面上表現梅加林之細胞加以保持，而 埋植於皮下等活體內來使用，但亦可將含有促進血管新生 之生長因子之水凝膠注入海棉片之後再進行埋植，又亦可 埋植海棉片後再將該水凝膠注入其中。 本發明之體內型人工腎臟可利用對含促進血管新生之 生長因子、且埋植於活體內之海棉片，將表面上表現有梅 加林之細胞注入來製作。 ____ 13___ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---------------------訂---------^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 1221421 B7 ___ 五、發明說明（f ) 表面上表現有梅加林之細胞可利用比如注射器、微毛 細管等注入海棉片。 表面上表現梅加林之細胞的注入時間雖沒有特別的限 制，但是，爲確實使表面上表現梅加林之細胞著生並增殖 ，乃希望在將含有血管新生促進之生長因子的水凝膠注入 之海棉片埋植後，或者對已埋植之海棉片注入含有血管新 生促進之生長因子之水凝膠後，經過血管新生必需的數天 之後再行注入。血管新生所必需之日數依所使用之促進血 管新生之生長因子及水凝膠性質而定，但比如使用含 bFGF之鹼處理水凝膠時大槪爲3〜8天。 圖式之簡單說明 圖1爲實施例與比較例中對組織拉入標記1251之β2-m之圖。再者，圖中符號說明如下。

Transpl·;實施例，cont·;比較例，T:移植細胞腫瘤，L; 肝臟，P;肺，H;心臟，S滑骼肌。 圖2爲移植細胞中拉入之標記1251之β2-ιη其SDS-聚 丙烯醯胺凝膠電泳分析結果圖。再者，圖中各泳道之試樣 如下。 泳道1;腹腔內投藥時使用之標記1251之β2-ιη， 泳道2;試驗後所採取之移植細胞腫瘤其均質物， 泳道3;試驗後所採取之細胞移植家鼠的血液。 圖3爲表示實施例與比較例中血液之三氯醋酸(TCA) 沉澱中的放射性同位素讀値之結果圖。再者，圖中符號說 明如下。 --14 ____ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) —A__w--------訂---------線 ' 1221421 A7 _— _B7___ 五、發明說明（〇)

Control group;比較例，

Transplanted group;實施例。 用以實施發明之最佳形態 以下，依實施例對本發明作具體之說明，但是，本發 明不受該等實施例之限定。 (實施例） (1)調製含有bFGF之明膠粒子 含有bFGF之明膠粒子係以田火田等之方法（Tabata， Y·，et al·，J· Biomateri. Sci· Polymer Edn.，10:957-968，1999) 調製。亦即，將預熱至4(TC之10wt%鹼處理明膠lOmL(等 電點5.0)水溶液(新田明膠製)與25wt%戊二醛水溶液25μί 混合，於40°C、425rpm之攪拌條件下滴入375ml之橄欖 油中，以使形成w/o乳膠。之後以25°C繼續攪拌24小時 使明膠進行化學性交聯。添加100ml丙酮於其中後，將所 得到之粒子進行離心分離(4t、3000rpm、5分鐘）以收集 ，再以於丙酮中離心5次以洗淨。讓洗淨後之粒子於含 0.1wt%Tween80之l〇〇mM甘胺酸水溶液l〇〇ml中在37°C 下保持1小時，以密封戊二醛之未反應醛基。所得到之交 聯明膠粒子於蒸餾水以離心洗淨2次後，使凍結乾燥，再 以環氧乙烷氣體來滅菌。在水中以37°C下使膨潤24小時 後之明膠其含水率爲95%。·又，光學顯微鏡下測量粒子徑( 直徑)之結果爲60〜13〇μΐη。將l〇mg/ml之等電點爲9.6的 重組bFGF水溶液(科硏製藥股份有限公司製）10μί滴入上 ______15__ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公釐） I ϋ ϋ n n n n n n ϋ 1 * ϋ n 1 ϋ i-— n n^-OJ· ϋ n n i l n ϋ I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1221421 五、發明說明（v々） 述得到之2mg乾燥明膠粒子，於25°C下放置丨小時，得 到含有bFGF之明膠粒子。 (2) 膠體海棉片之調製 將0.3%之動脈膠原鹽酸溶液(ΡΗ3·0)以冷藏均質器以 1800〜2000rpm攪拌60分鐘。將起泡之溶液流入模具於_4〇 °C下使急速凍結，再經48小時凍結乾燥，再於減壓下， 於105°C下乾燥24小時。接著，於0.2%戊二醛/〇·〇5Μ醋 酸溶液中於4°C使其交聯24小時後，以磷酸緩衝化生理食 鹽水（PBS)(PH7.4)洗淨，再浸於15%之乙醇水溶液。於_ 135°C下使其急速凍結，並凍結乾燥(48小時）後，以環氧 乙烷氣體滅菌，得到膠原海棉片。 (3) 梅加林表現細胞之皮下移植 將上述⑴所得到之含bFGF明膠粒子懸浮於 PBS0.15mL中，然後以lmL用注射器（23G注射針)注入上 述(2)中得到之lxlx〇.5cm膠原海棉片。將該海棉片埋植於 因吸入二乙醚而麻醉之5週齡雌裸家鼠(BALB/cA Jd-xm; 曰本克雷耳)的背側皮下。 經過一週後，對處在麻醉狀態之家鼠所植入之已經過 病理學上確認血管新生之海棉片以lml用注射器(23G注射 針）注入下述細胞懸浮液（lxl〇7/ml)0.15ml。該細胞懸浮液 係於已添加10%(v〇l/v〇l)之新生胎牛血淸之杜貝克氏修飾 易格培養基（Dulbecco，s Modified Eagle Medium) (LIFE TECHNOLOGIES，GIBCO BRL，Rockville，MD，USA)中培 養之表面上表現梅加林之大鼠卵黃囊上皮癌細胞由來細胞 _______16_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公釐） I ---------------------訂·-------- i^w— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 1221421 ________B7______ 五、發明說明（（<) (L2細胞)懸浮於PBS中所得者，。細胞注入之2週後，將 細胞腫瘤生長至最長徑爲2cm以上的家鼠兩腎於麻醉下’ 由背側以外科手術摘出，使成爲腎功能不全狀態。又，移 植之L2細胞被認爲沒有轉移。 (比較例） 在上述實施例(3)中，除不注入細胞懸浮液，僅將,PBS 注入膠原海棉片之外，與實施例同樣進行。 (試驗例） 使用上述實施例及比較例所得到之腎功能不全狀態的 家鼠，分別進行以下之試驗。 (1) 將β2-微球蛋白（東方酵母股份有限公司製)以IODO-GEN(皮爾思社製）進行1125標記。碘化之比活性爲 6xl03cpm/ng蛋白質。將1125標記β2-τη以含有0.5%牛血 淸白蛋白（BSA)之PBS稀釋使其濃度爲lltig/μΐ。對上述腎 功能不全狀態之15隻家鼠之腹腔內投予1125標記β2-ιη(2·8μ§/250μΙ〇，並爲了評價以下之各項目，於投予1125 標記β2-ιη後之3、6及14小時後，分別將5隻家鼠施以全 身生理食鹽水灌流並屠殺。 (2) 從屠殺後之各家鼠，採取被移植之細胞腫瘤、心臟 、肺、肝臟及骨骼肌，測定各組織器官之重量，以供於冷 凍離心管中丫射線之計數。其結果如圖1所示。 圖1爲表示實施例與比較例之在組織中拉入1251標 記β2-ιη之圖。縱軸爲每單位組織重量之1251讀値。被移 植之細胞之1251讀値於已測定之任一時間中皆比心臟、肺 ____17_' _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) #--------訂---------線 1221421 A7 ___ B7_ 五、發明說明（（6) 、肝臟及骨骼肌明顯較高（*:p<〇.05)。另一方面，於心臟、 肺、肝臟及骨骼肌之1251讀値方面，實施例與比較例中所 測定之任一時間皆無明顯差異。此係表示1251標記β2-ηι 被有效的拉入移植細胞中。 (3) 再者，讓移植之細胞腫瘤於添加有2%β-锍乙醇之 拉姆利(Laemmli)樣本緩衝液中，以ULTRA TURRAX(IKA LABORTECHNIK，Staufen，Germany)均質化，以供 SDS-聚 丙烯醯胺膠體電泳之分析。其結果如圖2所示。 圖2爲表示被拉入移植細胞之1251標記β2-ηι其SDS-聚丙烯醯胺膠體電泳圖。由與腹腔內投藥所使用之1251標 記β2-ιη進行比較，可以產生移植細胞含有1251標記β2-ιη 單體及其分解物。另一方面，接受細胞移植之家鼠其血液 樣本除分解物之外被認爲β2-ιη鏈狀體亦較移植細胞中爲多 。此意味著移植細胞中之放射性同位素讀値並非來自血液 中之不純物，而是由移植細胞所攝入之β2-χη所分解者。 (4) 又，由屠殺後之家鼠分別採取血液，將1〇μί之血 液樣本與含有1%BSA之PBS15pL混合之後，再與100% 三氯醋酸(以下稱TCA)75pL混合，然後將未分解蛋白沉澱 並離心分離後，藉γ計數器計數沉澱蛋白，以評價血液中 未分解之1251標記β2-τη量。結果如圖3所示。 圖3係表示實施例與比較例中血液之TCA沉澱中放 射性同位素讀値結果圖。血液之TCA沉澱中放射性同位 素讀値在1125標記β2-ιη投藥後6及14小時後，實施例相 較於比較例有顯著(*:ρ<0.05)之減少。此表示與比較例相比 _____18____ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ----------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1221421 A7 ____B7_ 五、發明說明（1 ) ，實施例中Π25標記β2-πι有較大量之分解。也就是說， 被移植之細胞發揮了蛋白質代謝功能。 產業上之可利用性 本發明之具蛋白代謝機能之人工腎臟可在體內發揮功 會g，對腎功能不全患者其QOL之改善是有用的。 _19 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ----------------------訂 *-------1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Claims (1)

1221421 A8 B8 C8 D8 _____ 六、申請專利範圍 .........................II (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 其包含：將水凝膠(含促進血管新生之生長因子）注入、海乎帛 片之製程；將該海棉片埋植於皮下之製程； 上表現梅佳林之細胞注入已埋植之該海棉片中° 11. 如申請專利範圍第9項之人工腎臟製作方法’其 中促進血管新生之生長因子爲鹼性纖維芽細胞 (bFGF) 〇 12. 如申請專利範圍第11項之人工腎臟之製作方法 ，其中，鹼性纖維芽細胞增殖因子(bFGF)係以基因工程之 手法製造之人類鹼性纖維芽細胞增殖因子(bFGF) ° 13. 如申請專利範圍第9項之人工腎臟之製作方法’ 其中，水凝膠爲明膠。 14. 如申請專利範圍第13項之人工腎臟之製作方法 ，其中，明膠係以等電點4.5〜5.5之明膠爲主成分。 15·如申請專利範圍第9項之人工腎臟之製作方法，其 中，海棉片係由膠原所構成。 16·如申請專利範圍第9項之人工腎臟之製作方法， 其中，表面上表現梅佳林之細胞係人類近端輸尿管上皮細 胞及/或以基因導入來大量表現梅佳林之人類近端輸尿管上 皮細胞。 17·如申請專利範圍第9項之人工腎臟製作方法，其中 ，梅佳林之表現係依據基因操作。 2 適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐)