JP7333121B2 - 幹細胞を非凍結で保存または輸送するための方法 - Google Patents

幹細胞を非凍結で保存または輸送するための方法 Download PDF

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Description

本開示は、幹細胞を保存または輸送する技術に関する。
現在、日本では複数の幹細胞を用いた再生医療等製品が開発・および一部承認されており、これらは治療法が無かった疾患（重度熱傷・脊髄損傷・頭部外傷・脳梗塞・脳出血・パーキンソン病等）に対して新たな希望をもたらしており、今後も大きな発展が見込まれる。しかし、これらの製品の多くは、超低温（－１７０℃）で凍結保存された状態で輸送されている。これには（１）細胞品質（細胞生存率・栄養因子分泌力）の低下、（２）輸送コスト（液体窒素コストや超低温輸送機器購入・維持）の問題が存在する。一方、常温で細胞を輸送した場合、細胞代謝が通常通り進行する事から輸送液中の酸素・栄養が枯渇してしまうという問題と、細胞が完全に固定されている状態ではないため振動による物理的ダメージが生じるという問題が存在し、長時間（1日以上）における生存率は非常に低くなる。低温で輸送した場合には代謝が抑えられるものの、振動に対しては改善されていない。細胞の生存率を保った状態で、振動などの輸送条件に耐えうる安価な輸送を可能にする方法が求められている。
本開示者らは、鋭意工夫した結果、幹細胞を高い生存率で保存する方法を見出すに至った。具体的には、本開示者らは、幹細胞をゲル化剤と共に保存することで、凍結させることなく、高い生存率および栄養因子を分泌する能力を維持することを見出した。したがって、本開示による保存方法によれば、治療用の幹細胞を、凍結することなく低温（例えば、４℃）で輸送することを可能にする。
したがって、本開示は以下を提供する。
（項目１）
幹細胞を保存するための方法であって、該方法は、
１）ゲル化温度より高い温度でゲル化剤を含むｐＨが約５．０～約８．０である保存液を準備するステップと、
２）該保存液中に該幹細胞を入れた後該ゲル化剤のゲル化温度に下げるステップと、
３）該幹細胞を含む該保存液を該ゲル化剤のゲル維持温度で保存するステップと
を含む、方法。
（項目１Ａ）
幹細胞を保存するための方法であって、該方法は、
１）ゲル化温度より高い温度でゲル化剤を非ゲル状態で含むｐＨが約５．０～約８．０である保存液を準備するステップと、
２）該保存液中に該幹細胞を入れた後該ゲル化剤のゲル化温度に下げるステップと、
３）該幹細胞を含む該保存液を該ゲル化剤のゲル維持温度で保存するステップと
を含む、方法。
（項目２）
前記ゲル化剤が、ペプチドを含む、上記項目に記載の方法。
（項目３）
前記ゲル化剤が、コラーゲン、変性コラーゲン、コラーゲン様ペプチド、ゼラチンまたはこれらの任意の組み合わせを含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目４）
前記ゲル化剤がコラーゲン様ペプチドを含み、該コラーゲン様ペプチドが、Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列の繰り返しを含み、ＸおよびＹはそれぞれ独立して同一または異なるアミノ酸である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目５）
前記ゲル化剤が、約１％（ｗ／ｗ）以上の濃度で前記保存液中に含まれる、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目６）
前記ゲル化剤が、約１％（ｗ／ｗ）～約１０％（ｗ／ｗ）の濃度で前記保存液中に含まれる、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記ゲル化剤が、約２．５％（ｗ／ｗ）の濃度で前記保存液中に含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目８）
前記保存液は、細胞培養液、生理食塩水、または電解質溶液である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目９）
前記保存液のｐＨが、約６．０～約７．５である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
前記保存液のｐＨが、約６．４～約７．４である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
前記ゲル維持温度が、約０℃～約３７℃である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
前記ゲル維持温度が、約０℃～約２４℃である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１３）
前記幹細胞が、間葉系幹細胞である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１４）
前記間葉系幹細胞が、骨髄、脂肪組織、胎盤組織、滑膜組織、臍帯組織（例えば、臍帯血）、歯髄、または羊膜由来の間葉系幹細胞幹細胞、あるいは、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞から分化させた間葉系幹細胞である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１５）
前記間葉系幹細胞が、骨髄由来間葉系幹細胞である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１６）
前記幹細胞が、細胞注入療法および創薬研究において使用される細胞であって、該細胞注入療法を受ける被験体から得られた細胞である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１７）
非ゲル化処理するステップをさらに含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１８）
前記非ゲル化処理するステップが、ゲル化剤の融点またはそれより高い温度まで温度を上げることを含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１９）
前記幹細胞を回収するステップをさらに含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２０）
前記幹細胞を回収するステップが、前記保存液を２～２０倍に希釈すること、前記幹細胞と前記保存液とを分離することを含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２１）
前記幹細胞が、約１×１０６～約１×１０７個／ｍｌの細胞密度で保存される、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２２）
幹細胞を保存するためのキットであって、該キットは、
（１）ゲル化剤を含む保存液と、
（２）該保存液のｐＨを約５．０～約８．０に調節するための緩衝液と
を含み、該幹細胞が、ゲル維持温度で保存される、キット。
（項目２３）
ゲル化剤を含む、幹細胞を保存するための組成物。
（項目２４）
前記組成物は、幹細胞を保存する際に、ｐＨ約５．０～約８．０で使用される、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（項目２５）
前記組成物は、幹細胞を保存する際に、前記ゲル化剤のゲル化温度で保存されるように使用される、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（項目２６）
ゲル化剤と幹細胞とを含み、ｐＨが約５．０～約８．０である、製剤。
（項目２９）
Ready-to-Use製剤である、上記項目のいずれかに記載の製剤。
（項目３０）
組織または臓器を保存するための方法であって、該方法は、
１）ゲル化温度より高い温度でゲル化剤を含むｐＨが約５．０～約８．０である保存液を準備するステップと、
２）該保存液中に該組織または臓器を入れた後該ゲル化剤のゲル化温度に下げるステップと、
３）該組織または臓器を含む該保存液を該ゲル化剤のゲル維持温度で保存するステップと
を含む、方法。
（項目３０Ａ）
組織または臓器を保存するための方法であって、該方法は、
１）ゲル化温度より高い温度でゲル化剤を非ゲル状態で含むｐＨが約５．０～約８．０である保存液を準備するステップと、
２）該保存液中に該組織または臓器を入れた後該ゲル化剤のゲル化温度に下げるステップと、
３）該組織または臓器を含む該保存液を該ゲル化剤のゲル維持温度で保存するステップと
を含む、方法。
（項目３１）
組織または臓器を保存するためのキットであって、該キットは、
（１）ゲル化剤を含む保存液と、
（２）該保存液のｐＨを約５．０～約８．０に調節するための緩衝液と
を含み、該組織または臓器が、ゲル維持温度で保存される、キット。
（項目３２）
ゲル化剤を含む、組織または臓器を保存するための組成物。
（項目３３）
前記組成物は、組織または臓器を保存する際に、ｐＨ約５．０～約８．０で使用される、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（項目３４）
幹細胞を運搬するための方法であって、該方法は、
１）ゲル化温度より高い温度でゲル化剤を含むｐＨが約５．０～約８．０である保存液を準備するステップと、
２）該保存液中に該幹細胞を入れた後該ゲル化剤のゲル化温度に下げるステップと、
３）該幹細胞を含む該保存液を該ゲル化剤のゲル維持温度で運搬するステップと
を含む、方法。
（項目３３）
幹細胞を保存するためのゲル化剤であって、該ゲル化剤が、該幹細胞を保存する際に、ｐＨ約５．０～約８．０で、該ゲル化剤のゲル維持温度で使用される、ゲル化剤。
（項目３４）
組織または臓器を保存するためのゲル化剤であって、該ゲル化剤が、該組織または臓器を保存する際に、ｐＨ約５．０～約８．０で、該ゲル化剤のゲル維持温度で使用される、ゲル化剤。
本開示において、上記１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供されうることが意図される。本開示のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
図１は、ＲＣＰ存在下または非存在下における保存７２時間後および再播種７２時間後の細胞生存率のグラフを示す。 図２は、異なる濃度のＲＣＰ存在下での保存における保存７２時間後および再播種７２時間後の細胞生存率のグラフを示す。 図３は、ＲＣＰを含む異なる保存液における保存７２時間後および再播種７２時間後の細胞生存率のグラフを示す。 図４は、異なる温度での保存における保存７２時間後および再播種７２時間後の細胞生存率のグラフを示す。 図５は、異なる保存日数の保存における保存７２時間後および再播種７２時間後の細胞生存率のグラフを示す。 図６は、異なるゲル化剤を含む保存液における保存７２時間後および再播種７２時間後の細胞生存率のグラフを示す。 図７は、異なるｐＨでの保存における保存７２時間後および再播種７２時間後の細胞生存率のグラフを示す。 図８は、細胞を輸送した後の細胞生存率および静置して保存した後の細胞生存率のグラフを示す。 図９は、保存後の細胞を保存液で１倍希釈および５倍希釈した場合の細胞生存率のグラフを示す。
以下、本開示を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
（定義）
本明細書において、「約」とは、後に続く値の±１０％を意味する。
本明細書において「幹細胞」とは、自己複製能及び分化・増殖能を有する未熟な細胞を意味する。幹細胞には、分化能力に応じて、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅ１１）、複能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅ１１）、単能性幹細胞（ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅ１１）等の亜集団が含まれる。多能性幹細胞とは、それ自体では個体になることができないが、生体を構成する全ての組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。複能性幹細胞とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。単能性幹細胞とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。
本明細書において「間葉系幹細胞」とは、間葉系間質細胞ともいい、骨芽細胞、脂肪細胞、筋細胞、軟骨細胞など、間葉系に属する細胞への分化能をもつ幹細胞を指す。間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪組織、胎盤組織、滑膜組織、臍帯組織（例えば、臍帯血）、歯髄、または羊膜由来の間葉系幹細胞幹細胞、あるいは、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞から分化させた間葉系幹細胞を包含し得る。
本明細書において、「組織」とは、卵巣組織、精巣組織、臍帯組織、胎盤組織、結合組織、心臓組織、角膜組織、筋肉、軟骨または骨由来の組織、内分泌組織および神経組織などの任意の種類の細胞型およびその組合せを含む任意の組織型を指す。
本明細書において、「臓器」とは、肺、肝臓、腎臓、心臓、卵巣、膵臓および臍帯を指す。臓器は、ヒトの臓器であってもよいし、非ヒト動物の臓器であってもよい。また、非ヒト動物は、マウスおよびラットを含む齧歯類、ブタ、ヤギ、およびヒツジを含む有蹄類、チンパンジーを含む非ヒト霊長類、その他の非ヒトほ乳動物であってもよいし、ほ乳動物以外の動物であってもよい。
本明細書において「保存」とは、任意の目的（例えば、細胞注入療法、組織または臓器移植またはそのための輸送）のために容器中に一定期間保管することを意味し、細胞を増殖させることを目的とせず、細胞、組織または臓器の機能を維持しつつ容器中に維持することを指す。保存は、細胞を増殖させることを目的とする「培養」とは異なる。また、細胞の保存は、投与直前に細胞をシリンジ等の容器に移し入れて一時的の保持することも、投与前に用時調製するために容器内に一時的に保持することも意味しない。
本明細書において「保存液」とは、細胞を一定期間維持するための溶液を指し、細胞が生存できる程度の生理的な浸透圧と電解質を有する溶液を指す。
本明細書において「ゲル化剤」とは、保存液をゲル化させるための薬剤を指す。本明細書で使用されるゲル化剤としては、通常の環境で（例えば、ゲル化温度より高い温度（例えば、ゲル化温度が２４℃以下の場合、３７℃などであり得る）、保存液に含まれている場合においてゲルでない状態をとり、ゲル化温度にしたときに、ゲル化される性質を持つものが有利に使用され得る。
本明細書において「ゲル化温度」とは、非ゲル化状態からゲル状態に変化する際の温度を指す。
本明細書において、「ゲル維持温度」とは、ゲル化した後、融解せずにゲルが維持される温度を指す。
本明細書において「非ゲル化」とは、加温する、または溶媒で希釈することにより、あるいはこれらの組み合わせにより、ゲル状態を解除することを指す。また、ゲル状態が解除されている状態を「非ゲル状態」ともいう。「ゲル化解除温度」ゲル化状態から非ゲル化状態に変化する際の温度を指す。ゲル化解除温度は通常ゲル化温度よりも高い。
本明細書において「コラーゲン」とは、アミノ酸からなる三本のポリペプチド鎖が三重らせん構造をとった動物由来のタンパク質であり、ヒトでは確認されているコラーゲンは２８種類あり、これら以外にも存在する。コラーゲンを加熱すると、熱変性しポリペプチド鎖が解けてゼラチンになる。コラーゲンには「変性」と「非変性」の２つのタイプがあり、本明細書では単に「コラーゲン」と称した場合特に言及しない限り「非変性」コラーゲンをさすが、文脈に応じて「変性」および「非変性」の両方を包含する。「変性」は熱を加えたもので、体内に吸収された時にコラーゲンと認識されなくなるのに対して、「非変性」は、熱を加えずに抽出したため、体内でコラーゲンとして認識され、そのまま吸収されてコラーゲンとして体内で利用される。コラーゲンはゲル化剤の一種である。
本明細書において「変性コラーゲン」とは、コラーゲンが熱変性、化学変性（例えば、コラゲナーゼによる変性）または機械的損傷による変性によってできたものであり、一部がコラーゲンの構造を維持するものも指す。変性コラーゲンは、コラーゲンが完全に変性しゼラチンに変化したものは包含しない。変性コラーゲンはゲル化剤の一種である。
本明細書において、「ゼラチン」とは、コラーゲンが完全に熱変性し、コラーゲン特有の三重らせん構造を持たないものを指す。ゼラチンはゲル化剤の一種である。
本明細書において「コラーゲン様ペプチド」とは、コラーゲン分子を特徴づけている特異な三重らせん構造を模倣するようにデザインされた化学合成ペプチドを指す。コラーゲン様ペプチドはゲル化剤の一種である。
本明細書において「ＲＣＰ」とは、組換えコラーゲン様ペプチド（recombinantcollagen peptide）の略称であり、組換え発現されたコラーゲン様ペプチドを指す。ＲＣＰは、コラーゲン様ペプチドと構造は同一であり、組換え発現されたものを指す。ＲＣＰはゲル化剤の一種である。
本明細書において「細胞注入療法」とは、疾患（例えば、脳梗塞）の治療のために細胞（例えば、幹細胞）を注入する治療方法を指す。
本明細書において「Ready-to-Use製剤」とは、保存後の治療用細胞をさらに培養することなくそのまま使用可能な製剤を指す。
（好ましい実施形態）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本開示の例示であり、本開示の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本開示の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。これらの実施形態について、当業者は適宜、任意の実施形態を組み合わせ得る。
（幹細胞保存方法）
１つの態様において、本開示は、幹細胞を保存するための方法であって、該方法は、１）ゲル化温度より高い温度でゲル化剤を非ゲル状態で含むｐＨが約５．０～約８．０である保存液を準備するステップと、２）該保存液中に該幹細胞を入れた後該ゲル化剤のゲル化温度に下げるステップと、３）該幹細胞を含む該保存液を該ゲル化剤のゲル維持温度で保存するステップとを含む、方法を提供する。本開示の保存方法によれば、高い生存率および栄養因子を分泌する能力を維持しつつ、幹細胞を保存することができる。保存時の振動によって、生存率が低下しないことが見出され、本開示の保存方法により、振動が生じ得る輸送にも応用可能である。
いくつかの実施形態において、保存は、運搬を伴うものであってもよい。
いくつかの実施形態において、ゲル化剤は保存液をゲル化させる任意の物質であり、例えば、ペプチド、コラーゲン、変性コラーゲン、コラーゲン様ペプチド、ゼラチン、フィブリン、シリコーン、グリコサミノグリカン、ＶｉｔｒｏＧｅｌＴＭ３Ｄ、ＶｉｔｒｏＧｅｌＴＭ３Ｄ－ＲＧＢ（ＴｈｅＷｅｌｌ ＢＩＯＳＩＥＮＣＥ社）、ＢＤマトリゲルＴＭマトリクス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、カルボキシビニルポリマー類、アクリルコポリマー類（例えばアクリラート／アクリル酸アルキルのコポリマー類）、ポリアクリルアミド類、多糖類、天然ガム類、脂肪酸の金属塩、疎水性シリカ、ポリエチレン、架橋アクリル酸重合体（例えばカルボマー、カルボキシポリアルキレン、カルボポール（登録商標））、ポリエチレンオキシド、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレン共重合体、ポリビニルアルコール、セルロース系重合体（例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びメチルセルロース）、ゴム類（例えばトラガカントゴム及びキサンタンガム）、アルギン酸ナトリウム、ジェランガム、寒天、カラギーナン、ペクチン、ファーセレラン、アルギン酸またはその塩、グルコマンナン、タラガム、ローカストビーンガム、タマリンド、プルラン、グアーガム、デンプンリン酸塩、ポリアクリル酸塩、アラビアガム、カードラン、ガティガム、アエロモナスガム、タマリンド種子多糖などが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、ゲル化剤は、コラーゲン、変性コラーゲン、コラーゲン様ペプチド、ゼラチンからなる群から選択される少なくとも１つであり得る。
特定の実施形態において、ゲル化剤は、コラーゲン様ペプチドであり得る。コラーゲン様ペプチドは、市販のもの、例えば、新田ゼラチン（ｂｅＭＡＴＲＩＸ（登録商標）Ｃｏｌｌａｇｅｎ）または富士フイルム（リコンビナントペプチド（RCP））により提供されるものを使用してもよい。コラーゲン様ペプチドは、Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列の繰り返しを含み、ＸおよびＹはそれぞれ独立して同一のアミノ酸であってもよく、異なるアミノ酸であってもよい。
さらなる実施形態において、ゲル化剤は、組換えコラーゲン様ペプチド（ＲＣＰ）であり得る。特定の実施形態において、ＲＣＰは、配列番号１に記載のアミノ酸配列、またはこれと少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり得る、または含み得る。ＲＣＰは、国際公開第２０１８／１５９７９７号に従って適宜作製するか、または購入することが可能である（富士フイルム）。
組換えコラーゲン様ペプチドの分子量は、特に限定されないが、好ましくは２０００以上１０００００以下（２ｋＤａ（キロダルトン）以上１００ｋＤａ以下）であり、より好ましくは２５００以上９５０００以下（２．５ｋＤａ以上９５ｋＤａ以下）であり、さらに好ましくは５０００以上９００００以下（５ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）であり、最も好ましくは１００００以上９００００以下（１０ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）である。
組換えコラーゲン様ペプチドは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列の繰り返しを有することが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙにおいて、Ｇｌｙはグリシンを表し、ＸおよびＹは、任意のアミノ酸（好ましくは、グリシン以外の任意のアミノ酸）を表す。コラーゲンに特徴的なＧｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列とは、ゼラチン・コラーゲンのアミノ酸組成および配列における、他のタンパク質と比較して非常に特異的な部分構造である。この部分においてはグリシンが全体の約３分の１を占め、アミノ酸配列では３個に１個の繰り返塊なっている。グリシンは最も簡単なアミノ酸であり、分子鎖の配置への束縛も少なく、ゲル化に際してのヘリックス構造の再生に大きく寄与している。ＸおよびＹで表されるアミノ酸はイミノ酸（プロリン、オキシプロリン）が多く含まれ、全体の１０％～４５％を占めることが好ましい。好ましくは、組換えコラーゲン様ペプチドの配列の８０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸が、Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙの繰り返し構造である。
一般的なゼラチンは、極性アミノ酸のうち電荷を持つものと無電荷のものが１：１で存在する。ここで、極性アミノ酸とは具体的にシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシンおよびアルギニンを指し、このうち極性無電荷アミノ酸とはシステイン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンおよびチロシンを指す。本開示で用いる組換えコラーゲン様ペプチドにおいては、構成する全アミノ酸のうち、極性アミノ酸の割合が１０～４０％であり、好ましくは２０～３０％である。且つ上記極性アミノ酸中の無電荷アミノ酸の割合が好ましくは５％以上２０％未満であり、より好ましくは５％以上１０％未満である。さらに、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシンおよびシステインのうちいずれか１アミノ酸、好ましくは２以上のアミノ酸を配列上に含まないことが好ましい。
一般にポリペプチドにおいて、細胞接着シグナルとして働く最小アミノ酸配列が知られている（例えば、株式会社永井出版発行「病態生理」Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．７（１９９０年）５２７頁）。本開示で用いる組換えコラーゲン様ペプチドは、これらの細胞接着シグナルを一分子中に２以上有するものでもよい。具体的な配列としては、接着する細胞の種類が多いという点で、アミノ酸一文字表記で表される、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、およびＨＡＶ配列の配列が好ましい（配列番号２～９）。さらに好ましくはＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列およびＨＡＶ配列、特に好ましくはＲＧＤ配列である。ＲＧＤ配列のうち、好ましくはＥＲＧＤ配列である。
本開示で用いる組換えコラーゲン様ペプチドにおけるＲＧＤ配列の配置としては、ＲＧＤ間のアミノ酸数が０～１００の間、好ましくは２５～６０の間で均一でないことが好ましい。
この最小アミノ酸配列の含有量は、タンパク質１分子中３～５０個が好ましく、さらに好ましくは４～３０個、特に好ましくは５～２０個である。最も好ましくは１２個である。
本開示で用いる組換えコラーゲン様ペプチドにおいて、アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は少なくとも０．４％であることが好ましい。リコンビナントゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合、３５０のアミノ酸の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含むことが好ましい。アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は、より好ましくは少なくとも０．６％であり、さらに好ましくは少なくとも０．８％であり、さらに一層好ましくは少なくとも１．０％であり、特に好ましくは少なくとも１．２％であり、最も好ましくは少なくとも１．５％である。リコンビナントペプチド内のＲＧＤモチーフの数は、２５０のアミノ酸あたり、好ましくは少なくとも４、より好ましくは６、さらに好ましくは８、特に好ましくは１２以上１６以下である。ＲＧＤモチーフの０．４％という割合は、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも１つのＲＧＤ配列に対応する。ＲＧＤモチーフの数は整数であるので、０．４％の特徴を満たすには、２５１のアミノ酸からなるゼラチンは、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含まなければならない。好ましくは、本発明のリコンビナントゼラチンは、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含み、より好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも３つのＲＧＤ配列を含み、さらに好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも４つのＲＧＤ配列を含む。本発明のリコンビナントゼラチンのさらなる態様としては、少なくとも４つのＲＧＤモチーフ、好ましくは６つ、より好ましくは８つ、さらに好ましくは１２以上１６以下のＲＧＤモチーフを含む。
組換えコラーゲン様ペプチドは部分的に加水分解されていてもよい。
より好ましくは、本開示で用いるポリペプチドは、下記式２で示される。
Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）６３］３－Ｇｌｙ
式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、６３個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
繰り返し単位には天然に存在するコラーゲンの配列単位を複数結合することが好ましい。ここで言う天然に存在するコラーゲンとは天然に存在するものであればいずれでも構わないが、好ましくはＩ型、II型、III型、IV型、またはV型コラーゲンである。より好ましくは、I型、II型、またはIII型コラーゲンである。別の形態によると、上記コラーゲンの由来は好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、マウスまたはラットであり、より好ましくはヒトである。
本開示で用いる組換えコラーゲン様ペプチドの等電点は、好ましくは５～１０であり、より好ましくは６～１０であり、さらに好ましくは７～９．５である。リコンビナントゼラチンの等電点の測定は、等電点電気泳動法（Ｍａｘｅｙ，Ｃ．Ｒ．（１９７６；Ｐｈｉｔｏｇｒ．Ｇｅｌａｔｉｎ２，ＥｄｉｔｏｒＣｏｘ，Ｐ．Ｊ．Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌ．参照）に記載されたように、１質量％ペプチド溶液をカチオンおよびアニオン交換樹脂の混晶カラムに通したあとのｐＨを測定することで実施することができる。
好ましくは、組換えコラーゲン様ペプチドは脱アミン化されていない。
好ましくは、組換えコラーゲン様ペプチドはテロペプタイドを有さない。
好ましくは、組換えコラーゲン様ペプチドは、アミノ酸配列をコードする核酸により調製された実質的に純粋なポリペプチドである。
組換えコラーゲン様ペプチドは、特に好ましくは、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列；または
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上（好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上）の配列同一性を有し、生体親和性を有するアミノ酸配列：
を有する。
本明細書おいて、配列同一性は、以下の式で計算される値を指す。
％配列同一性＝［（同一残基数）／（アラインメント長）］×１００
２つのアミノ酸配列における配列同一性は当業者に公知の任意の方法で決定することができ、ＢＬＡＳＴ（(Basic Local Alignment SearchTool)）プログラム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０，１９９０）等を使用して決定することができる。
組換えコラーゲン様ペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するアミノ酸配列を有するものでもよい。
「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」における「１若しくは数個」とは、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個を意味する。
組換えコラーゲン様ペプチドは、当業者に公知の遺伝子組み換え技術によって製造することができ、例えばＥＰ１０１４１７６Ａ２号公報、米国特許第６９９２１７２号公報、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３号、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号等に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、所定の組換えコラーゲン様ペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、組換えコラーゲン様ペプチドが産生されるので、培養物から産生された組換えコラーゲン様ペプチドを回収することにより、本発明で用いる組換えコラーゲン様ペプチドを調製することができる。
いくつかの実施形態において、ゲル化剤が、約１％（ｗ／ｗ）以上、例えば、約１％（ｗ／ｗ）～約１０％（ｗ／ｗ）、約２％（ｗ／ｗ）～約１０％（ｗ／ｗ）、約１％（ｗ／ｗ）～約９％（ｗ／ｗ）、約２％（ｗ／ｗ）～約９％（ｗ／ｗ）、約１％（ｗ／ｗ）～約８％（ｗ／ｗ）、約２％（ｗ／ｗ）～約８％（ｗ／ｗ）、約１％（ｗ／ｗ）～約７％（ｗ／ｗ）、約２％（ｗ／ｗ）～約７％（ｗ／ｗ）、約１％（ｗ／ｗ）～約６％（ｗ／ｗ）、約２％（ｗ／ｗ）～約６％（ｗ／ｗ）、約１％（ｗ／ｗ）～約５％（ｗ／ｗ）、約２％（ｗ／ｗ）～約５％（ｗ／ｗ）、約１％（ｗ／ｗ）～約４％（ｗ／ｗ）、約２％（ｗ／ｗ）～約４％（ｗ／ｗ）、約１％（ｗ／ｗ）～約３％（ｗ／ｗ）、または約２％（ｗ／ｗ）～約３％（ｗ／ｗ）の濃度で保存液中に含み得る。いくつかの実施形態において、ゲル化剤が、約２．５％（ｗ／ｗ）の濃度で保存液中に含み得る。さらなる実施形態において、ゲル化剤が、２．５±１．５％（ｗ／ｗ）、２．５±１％（ｗ／ｗ）、２．５±０．５％（ｗ／ｗ）の濃度で保存液中に含み得る。
いくつかの実施形態において、保存液は、細胞培養液、生理食塩水、または電解質溶液であり得る。いくつかの実施形態において、保存液のｐＨは、約５．０～約８．０、約６．０～約８．０、約６．０～約７．５、約６．１～約７．４、約６．２～約７．４、約６．３～約７．４、約６．４～約７．４、約６．４～約７．３、約６．４～約７．２、約６．４～約７．１、約６．４～約７．０、約６．４～約６．９、約６．４～約６．８、約６．４～約６．７、約６．４～約６．６、または約６．４～約６．５であり得る。特定の実施形態において、保存液のｐＨは、約６．４～約７．４であり得る。
いくつかの実施形態において、保存液は細胞培養液であってもよい。保存液は、増殖因子を含んでいてもよく、含まなくてもよい。本開示の方法では、細胞は低温で保存されるため、増殖因子の有無にかかわらず細胞増殖は生じない。保存液としては、ＭＥＭα、生理食塩水、ＰＢＳ、ＤＭＥＭ、ＣＥＬＳＩＯＲ（登録商標）ＣＯＬＤ ＳＴＯＲＡＧＥ ＳＯＬＵＴＩＯＮ（セルシオ液）（ＷＡＴＥＲＳ ＭＥＤＩＣＡＬ ＳＹＳＴＥＭＳ）、臓器組織保存液ＥＴＫ（登録商標）（ＥＴＫ液）（大塚製薬株式会社）、およびベルザーＵＷ（登録商標）冷保存液（ＵＷ液）（アステラル製薬株式会社）等が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、ゲル維持温度は、約０℃～約３７℃、約０℃～約３０℃、約０℃～約２４℃、約０℃～約２０℃、約０℃～約１５℃、または約０℃～約１０℃であり得る。さらなる実施形態において、ゲル維持温度は、約４℃であり得る。特定の実施形態において、ゲル維持温度は、４±２．０℃、４±１．５℃、４±１．０℃、または４±０．５℃であり得る。
いくつかの実施形態において、ゲル化温度とゲル維持温度は同一であっても、異なってもよい。
いくつかの実施形態において、保存される細胞は、任意の起源（例えば、骨髄、脂肪組織、胎盤組織、滑膜組織、臍帯組織（例えば、臍帯血）、歯髄、または羊膜由来）の間葉系幹細胞、あるいはＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞から分化させた間葉系幹細胞であり得る。特定の実施形態において、間葉系幹細胞は骨髄由来間葉系幹細胞であり得る。さらなる実施形態において、幹細胞は、細胞注入療法および創薬研究において使用される細胞であり得る。さらなる実施形態において、細胞注入療法を受ける被験体から得られた細胞であり得る。
本開示の保存方法は、保存液を非ゲル化処理するステップをさらに含んでもよい。非ゲル化処理するステップは、ゲル化剤の融点またはそれより高い温度まで保存液の温度を上げることを含む。ゲル化剤の融点は、ゲル化剤の濃度、ｐＨ等によって変わり得るが、ゲル化剤の融点は３７℃以下であり得る。非ゲル化処理する際の温度は、ゲル化剤の融点または融点以上であり、適宜決定することができる。特定の実施形態において、ゲル化剤は、組換えコラーゲン様ペプチドであり、非ゲル化処理するステップにおける保存液の温度は、約１０℃～約３０℃、約１５℃～２５℃、または約２０℃であり得る。
本開示の保存方法は、幹細胞を回収するステップをさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、幹細胞を回収するステップが、保存後の前記保存液を２～２０倍、例えば、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１１倍、約１２倍、約１３倍、約１４倍、約１５倍、約１６倍、約１７倍、約１８倍、約１９倍、または約２０倍希釈することを含み得る。好ましい実施形態において、保存後の前記保存液を約５倍以上、最大約２０倍希釈し得る。いくつかの実施形態において、幹細胞を回収するステップが、幹細胞と保存液とを分離（例えば、遠心分離）することを含み得る。理論に束縛されることは望まないが、保存液を融点またはそれ以上に温度を上げて非ゲル化状態にした場合、保存液の粘度が高く、細胞の回収率が低くなるため、保存液を希釈することが好ましく、典型的には５倍以上で希釈することで細胞の回収率が高くなる。希釈するための溶液は、ゲル化剤を含まない保存液であり得る。
いくつかの実施形態において、幹細胞は、約１×１０５～約１×１０８個／ｍｌ、好ましくは約５×１０５～約５×１０６個／ｍｌ、より好ましくは、約１×１０６～約１×１０７個／ｍｌの細胞密度で保存され得る。
（幹細胞保存剤）
別の態様において、本開示は、ゲル化剤を含む、幹細胞を保存するための組成物（例えば、保存液）を提供する。本開示の組成物（例えば、保存液）は、幹細胞を保存する際に、ｐＨ約５．０～約８．０で使用され得る。本開示の組成物（例えば、保存液）は、幹細胞を保存する際に、前記ゲル化剤のゲル維持温度で保存されるように使用され得る。本開示の組成物は、上記実施形態における１または複数の特徴を有し得る。
（幹細胞保存キット）
さらなる態様において、本開示は、幹細胞を保存するためのキットであって、該キットは、（１）ゲル化剤を含む保存液と、（２）該保存液のｐＨを約５．０～約８．０に調節するための緩衝液とを含み、該幹細胞が、ゲル維持温度で保存される、キットを提供する。本開示のキットは、上記実施形態における１または複数の特徴を有し得る。
（細胞製剤）
さらなる態様において、本開示は、ゲル化剤と幹細胞とを含み、ｐＨが約５．０～約８．０である、製剤を提供し得る。製剤は、幹細胞を保存する際に、前記ゲル化剤のゲル維持温度で保存されるように使用され得る。製剤はゲル化されたものであり得る。本開示の製剤は、Ready-to-Use製剤であり得る。
（組織または臓器の保存）
さらなる態様において、本開示は、組織または臓器を保存するための方法であって、該方法は、１）ゲル化温度より高い温度でゲル化剤を非ゲル状態で含むｐＨが約５．０～約８．０である保存液を準備するステップと、２）該保存液中に該組織または臓器を入れた後該ゲル化剤のゲル化温度に下げるステップと、３）該組織または臓器を含む該保存液を該ゲル化剤のゲル維持温度で保存するステップとを含む、方法を提供する。
さらに別の態様において、本開示は、組織または臓器を保存するためのキットであって、該キットは、（１）ゲル化剤を含む保存液と、（２）該保存液のｐＨを約５．０～約８．０に調節するための緩衝液とを含み、該組織または臓器が、ゲル維持温度で保存される、キットを提供する。組織および臓器は、細胞の集合体であり、本明細書に記載されるように、細胞の保存が本開示の技術によって達成されることから、その集合体である組織および臓器は、同様の条件によって、本開示の技術を適用することで、保存することができる。その際、当業者は、各種組織および／または臓器の各々の特性に応じて、本明細書の開示に照らし、適宜最適な条件を調整することができることが理解される。
さらに別の態様において、本開示は、ゲル化剤を含む、組織または臓器を保存するための組成物を提供する。組織または臓器の保存においては、保存液として組織または臓器用の保存液を使用し得る。組織または臓器用の保存液としては、臓器組織保存液ＥＴＫ（登録商標）（ＥＴＫ液）（大塚製薬株式会社）、およびベルザーＵＷ（登録商標）冷保存液（ＵＷ液）（アステラル製薬株式会社）、セルシオ液が挙げられるが、これらに限定されない。この保存液にゲル化剤を溶解し使用され得る。
いくつかの実施形態において、ＥＴＫ液は、グルコン酸ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸ニカリウム、ヒドロキシエチルデンプン、トレハロース水和物、および水酸化カリウムを含み得る。特定の実施形態において、ＥＴＫ液は、１０００ｍＬ中、グルコン酸ナトリウム２１．８１４ｇ、リン酸二水素カリウム０．８８５ｇ、リン酸ニカリウム３．２２２ｇ、ヒドロキシエチルデンプン、３０．０ｇ、トレハロース水和物４５．３ｇ、および水酸化カリウム適量を含み得る。
いくつかの実施形態において、ＵＷ液は、ペンタフラクション、ラクトビオン酸(ラクトンとして)、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム七水和物、ラフィノース五水和物、アデノシン、アロプリノール、総グルタチオン、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム／塩酸（ｐＨ調製用）、および注射用水を含み得る。特定の実施形態において、ＵＷ液は、ペンタフラクション５０ｇ／Ｌ、ラクトビオン酸(ラクトンとして)３５．８３ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム３．４ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物１．２３ｇ／Ｌ、ラフィノース五水和物１７．８３ｇ／Ｌ、アデノシン１．３４ｇ／Ｌ、アロプリノール０．１３６ｇ／Ｌ、総グルタチオン０．９２２ｇ／Ｌ、水酸化カリウム５．６１ｇ／Ｌ、水酸化ナトリウム／塩酸（ｐＨ７．４に調製）、および注射用水適量を含み得る。
いくつかの実施形態において、セルシオ液は、マンニトール、ラクトビオン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、塩化カルシウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、水酸化ナトリウム、還元型グルタチオン、および注射用水を含み得る。特定の実施形態において、セルシオ液は、マンニトール１０．９３０ｇ／Ｌ、ラクトビオン酸２８．６６４ｇ／Ｌ、グルタミン酸２．９４２ｇ／Ｌ、ヒスチジン４．６５０ｇ／Ｌ、塩化カルシウム０．０３７ｇ／Ｌ、塩化カリウム１．１１８ｇ／Ｌ、塩化マグネシウム２．６４２ｇ／Ｌ、水酸化ナトリウム４．０００ｇ／Ｌ、還元型グルタチオン０．９２１ｇ／Ｌ、および注射用水適量を含み得る。
上記の細胞の保存に関して記載される１または複数の実施形態は、適切な場合、組織または臓器の保存の態様における実施形態として採用される。
（運搬方法）
さらなる態様において、本開示は、幹細胞を運搬するための方法であって、該方法は、１）ゲル化温度より高い温度でゲル化剤を非ゲル状態で含むｐＨが約５．０～約８．０である保存液を準備するステップと、２）該保存液中に該幹細胞を入れた後該ゲル化剤のゲル化温度に下げるステップと、３）該幹細胞を含む該保存液を該ゲル化剤のゲル維持温度で運搬するステップとを含む、方法を提供する。本開示の方法によれば、凍結することなく、細胞の生存率を保った状態で、振動などの運搬条件に耐えうる運搬を可能にする。運搬は、陸上輸送、海上輸送、航空輸送、またはこれらの組み合わせの輸送を含み得る。
（細胞）
さらなる態様において、本開示は、上記方法に従って保存された幹細胞、あるいは上記方法にしたがって運搬された幹細胞を含む、被験体における疾患、障害または症状を治療または予防するための組成物を提供する。いくつかの実施形態において、幹細胞を用いた再生医療に治療され得るもの、例えば、重度熱傷、脊髄損傷、頭部外傷、脳梗塞、脳出血、パーキンソン病が挙げらえるがこられに限定されない。
（シリンジ製剤）
さらなる態様において、本開示は、幹細胞の懸濁液と、シリンジとを含む、上記方法による該幹細胞の保存または運搬後、さらなる処理を必要とすることなく被験体に投与可能なシリンジ製剤を提供する。
（治療方法）
さらなる態様において、本開示は、被験体における疾患、障害または症状を治療または予防する方法であって、該方法は、上記方法に従って幹細胞を保存または運搬する工程と、該保存または運搬された幹細胞を、それを必要とする該被験体に投与する工程とを含む、方法を提供する。
（使用）
さらなる態様において、本開示は、被験体における疾患、障害または症状を治療または予防するための医薬（例えば、上記シリンジ製剤）の製造における、上記方法に従って保存または運搬された幹細胞の使用を提供する。
以上、本開示を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本開示の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
以下、実施例に基づいて本開示をより具体的に説明する。
（測定方法）
以下の実施例において、細胞数の測定は保存後と再播種後の２回行っており、保存後の細胞生存率は、「保存後細胞生存率＝保存後細胞数÷保存前細胞数」により算出され、再播種後の細胞生存率は、保存後、前細胞をフラスコに播種し、培養液（ＭＥＭα＋ＰＬ（血小板溶解物））を入れて７２時間培養を行い、「再播種後細胞生存率＝再播種後細胞数÷保存前細胞数」により算出される。
細胞数の測定は、LunaAutomated Cell counter （https://logosbio.com/automated-cell-counters/brightfield/luna）を用いて蛍光的に生細胞と死細胞を測定した。
（実施例１：ＲＣＰタンパク質存在下で４℃で７２時間の振動を行っても、凍結保存と同等もしくはそれ以上の生存が可能）
（材料および方法）
・材料
以下の市販の試薬または細胞を用いた。
ＲＣＰ（組換えコラーゲン様ペプチド）：富士フイルム社製試薬（https://www.fujifilm.com/jp/ja/business/materials/rm/rcp）
ヒト骨髄幹細胞・ＰＬ（血小板溶解物）：北海道大学において健康ボランティアより採取・倫理委員会認定・同意書獲得済
ＭＥＭα：カタログ番号：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， ３２５７１－０３６， ＵＳＡ
ＭＥＭαＰＬ液：ＰＬは健康ボランティアより採取した血小板液より自家作成
凍結保存液バンバンカー（登録商標）カタログ番号：ＣＳ－０２－００１（日本ジェネティクス）
・方法
健康ボランティアから入手した骨髄液より分離培養したヒト骨髄幹細胞５０万個を、それぞれ、（１）ＭＥＭα中に希釈しｐＨ７．０前後に調整し、（２）ＭＥＭαＰＬ液にＲＣＰ（最終濃度２．５％）を溶解しｐＨ７．０前後に調整し、（３）凍結保存液バンバンカー（登録商標）（日本ジェネティクス）に希釈した。その後、（１）と（２）を４℃冷蔵庫内でボルテックスマシーン（Ｈｅａｔｈｒｏｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社 ＨＳ１２０３１８ ３０００ｒｐｍ）で７２時間振動を加えながら保存した。（３）は－８０℃の実験用冷凍庫）内に静置保存した。
（結果）
結果を図１に示す。ＲＣＰ非存在下では、４℃で振動を加えた細胞の生存率はほぼ０％で、再播種後も増殖が認められなかった。一方ＲＣＰによりゲル化した保存液中の細胞は９５％の生存率で再播種後も１．６倍近くまで増殖することが出来、これは凍結保存と同等の成績であった。
（実施例２：保存液中のＲＣＰ濃度の検討）
（材料および方法）
健康ボランティアから入手した骨髄液より分離培養したから入手したヒト骨髄幹細胞５０万個を０，０．５，１．０，２．５，５．０，１０．０％の濃度のＲＣＰ溶液に溶解してｐＨ７．０前後に調整し、この溶液を４℃冷蔵庫内でボルテックスマシーン（Ｈｅａｔｈｒｏｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社 ＨＳ１２０３１８ ３０００ｒｐｍ）で７２時間振動を加えながら保存した。７２時間後に２０℃で液体化し、細胞数を測定した。液体化は以下のとおり行った。
２０℃のインキュベータ内に静置することで、ゲルを液体に戻した。その後５倍量の培地（ＭＥＭα）を入れることで希釈して、遠心して細胞をペレットにして遠心管の下に集めた。上清を全て吸引して、ゲルの成分のＲＣＰを除去し、培地（ＭＥＭα）を少量（１ｍｌ）入れて攪拌した状態で細胞数を数えた。２０℃に静置して液体化し、そのまま遠心して細胞をペレットとして下に落した場合、一部の細胞が上清の中に残ってしまい、回収率が悪くなる。
（結果）
結果を図２に示す。保存後の生存率はＲＣＰの濃度に依存して上昇したが、再播種後の生存率は２．５％で最も高かった。
（実施例３：ＲＣＰを溶解する媒体の検討）
（材料および方法）
健康ボランティアから入手した骨髄液より分離培養したから入手したヒト骨髄幹細胞５０万個を保存するため２．５％のＲＣＰを希釈する媒体をＭＥＭαＰＬ、生理食塩水、ベルザーＵＷ冷保存液（臓器保存液、アステラス製薬）、Ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｏｓｏｌ－ＦＲＳ（低温細胞保存試薬、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、リン酸化食塩水（ＰＢＳ；市販品）、または５％ブドウ糖液（市販品）に溶解してｐＨ７．０前後に調整後、４℃冷蔵庫内でボルテックスマシーンで７２時間振動を加えながら保存した。７２時間後に２０℃で液体化し、細胞数を測定した。
（結果）
結果を図３に示す。いずれの溶媒も保存後の生存率に悪影響はないと考えられる。ＰＢＳおよびブドウ糖は、播種後の生存率が低かった。したがって、保存液の種類によっては、保存後再播種を行わないことが望ましい。いずれにしても、いずれの保存液を用いた場合でも、高い生存率を維持したため、目的の細胞数が達成される限り、再播種は行わなくてもよい。
（実施例４：保存時の温度の検討）
（材料および方法）
健康ボランティアから入手した骨髄液より分離培養したから入手したヒト骨髄幹細胞５０万個を２．５％のＲＣＰを溶解したＭＥＭαＰＬ（ｐＨ７．０）において、－２０℃、４℃、２４℃または３７℃で７２時間保存した。７２時間後に２０℃で液体化し、細胞数を測定した。その後、全ての細胞をフラスコに播種し、培養液（ＭＥＭαＰＬ）中で７２時間培養を行い、増殖能を確認した。
（結果）
結果を図４に示す。４℃では、１００％以上の７２時間保存後および再播種後７２時間後の細胞生存率を維持した。－２０℃では、７２時間保存後の細胞生存率が約７０％であったが、再播種後７２時間後にはほとんど細胞が生存していなかった。これは、保存直後は細胞が生存しているが、何らかの損傷を受けていたことが示唆される。本開示の保存方法においては、凍結せずに保存することが好ましいことが示唆される。また、２４℃での保存は、７２時間保存後の細胞生存率は約２０％と低かったが、再播種後の細胞生存率は約１００％であった。３７℃では、７２時間保存後および再播種後７２時間後の細胞生存率は５０％以下であった。以上より、保存時の温度は、凍結しない温度（例えば０℃以上）であり、３７℃未満（例えば２４℃以下）であることが好ましく、４℃が最適であった。
（実施例５：保存日数の検討）
（材料および方法）
健康ボランティアから入手した骨髄液より分離培養したから入手したヒト骨髄幹細胞５０万個を２．５％のＲＣＰを溶解したＭＥＭαＰＬ（ｐＨ７．０）において、１日間、３日間、５日間、７日間、または１４日間４℃で振動を加えながら保存した。既定の日数後に２０℃で液体化し、細胞数を測定した。
（結果）
結果を図５に示す。いずれの日数においても保存後の生存率は概ね同様であるが、再播種後の生存率は１～３日で特に良く、以後は時間が経過するにつれて低下したが、１４日でも約８０％の生存率は維持される。
（実施例６：ゲル化剤の種類の検討）
（材料および方法）
健康ボランティアから入手した骨髄液より分離培養したから入手したヒト骨髄幹細胞５０万個を保存するために、ＭＥＭαＰＬに２．５，５％，１０％のビーマトリックスゼラチン（新田ゼラチン、ＬＳ－２５０）、クックゼラチン（森永製菓）、ゼライスゼラチンパウダー（マルハニチロ）、ＲＣＰを溶解し、約ｐＨ７．０に調整した。ビーマトリックスとＲＣＰについては４℃で振動を加えながら保存し、クックゼラチンとゼライスゼラチンパウダーは静置保存し、その後細胞数を測定した。
（結果）
結果を図６にしめす。ビーマトリックスゼラチン・クックゼラチン・ゼライス全てのゼラチンで細胞保存が可能であった。したがって、保存液はゲル化することが重要と考えられる。
（実施例７：保存時のｐＨの検討）
（材料および方法）
健康ボランティアから入手した骨髄液より分離培養したから入手したヒト骨髄幹細胞５０万個を保存するためＭＥＭαＰＬに２．５％ＲＣＰ、クックゼラチン、ライスゼラチンパウダーを溶解した保存液を使用した。ｐＨ４．４～８．４に調整し４℃で振動もしくは静置保存し、その後細胞数を測定した。
（結果）
結果を図７に示す。ｐＨ無調整（約９）では細胞はほとんど生存できなかった。また、ｐＨ５．４～８．４では高い生存率を示したが、ｐＨ４．４では細胞はほとんど生存できなかった。播種後は、ｐＨ６．４および７．４で生存率が高かった。
（実施例８：組織および臓器の保存）
（材料および方法）
・材料
組織臓器保存液ＥＴＫ（登録商標）（ＥＴＫ液）：大塚製薬株式会社、または
ベルザーＵＷ（登録商標）冷保存液（ＵＷ液）：アステラル製薬株式会社
ＲＣＰ（組換えコラーゲン様ペプチド）：富士フイルム社製試薬（https://www.fujifilm.com/jp/ja/business/materials/rm/rcp）
・方法
ＲＣＰ（最終濃度２～１０％）をＥＴＫ液またはＵＷ液に溶解し、ｐＨ７前後に調整する。ＥＴＫ液またはＵＷ液が入った容器に組織（例えば、角膜組織、皮膚組織等）あるいは臓器（例えば、肺、腎臓、肝臓、膵臓等）を入れ無菌的に密閉し、組織あるいは臓器を入れた容器を冷却する。
（実施例９：細胞の運搬）
本実施例では、実際に飛行機で運搬し、輸送後の生存率を測定した。
（材料および方法）
・材料
ＭＥＭα＋２．５％ＲＣＰ
５０ｍｌファルコンチューブまたは１００ｍｌ滅菌瓶
骨髄幹細胞
規格定温輸送パッケージＴＡＣＰａｃｋ０２０８Ｆ（玉井化成株式会社）
・方法
ＲＣＰ２．５％（最終濃度）をＭＥＭαに溶解し、ｐＨ６．０５に調整し、保存液とした。細胞密度が１．０×１０６個／ｍｌとなるように細胞を保存液が入った容器（５０ｍｌファルコンチューブ）に入れ、 内部を５％ＣＯ２（Ｏ２ ２０％ Ｎ２ ７５％）の空気に置換した後、無菌的に密閉し、４℃に容器を冷却した。容器を横置きで規格定温輸送パッケージＴＡＣＰａｃｋ０２０８Ｆ（玉井化成株式会社）に収容し、４℃に維持しながら輸送を実施した。札幌から細胞を発送し、２日後に和歌山に到着し、１日４℃で保存された後、３日後に和歌山から細胞を発送し、５日後に札幌に到着した。本輸送は、陸上輸送および航空輸送を経た。コントロールとして、静置して細胞を保存した。
（結果）
結果を図８に示す。示されるように、輸送した細胞は静置して保存された細胞と同等の細胞生存率を示した。また、保存後の細胞は、脂肪、骨、および軟骨へ正常に分化したことが確認された。したがって、本発明の保存液により、凍結することなく、細胞の生存率を保った状態で、振動などの輸送条件に耐えうる輸送を可能にする。
（実施例１０：細胞回収時の保存液の希釈による生存率の変化）
本実施例では、細胞を回収する際に保存液を希釈することにより細胞生存率が変化するかどうかを確認した。
（材料および方法）
・材料
ＭＥＭα＋２．５％ＲＣＰ
５０ｍｌファルコンチューブまたはフローズバッグ（登録商標）（Ｎｉｐｒｏ）
ヒト骨髄幹細胞
・方法
ＲＣＰ２．５％（最終濃度）をＭＥＭαに溶解し、ｐＨ７．４～８．０に調整し、保存液とした。細胞密度が１．０×１０６個／ｍｌとなるように細胞を保存液が入った容器（５０ｍｌファルコンチューブまたはフローズバッグ（登録商標））に入れ、無菌的に密閉し、４℃に容器を冷却し、４℃で７２時間静置して保存した。融解は３７℃で１０分～３時間かけて実施した。
保存後、ＭＥＭαを入れることで希釈して（１倍もしくは５倍希釈）、遠心して細胞をペレットにして遠心管の下に集めた。上清を全て吸引して、ゲルの成分のＲＣＰを除去し、培地（ＭＥＭα）を少量（１ｍｌ）入れて攪拌した状態で細胞数を数えた。
（結果）
結果を図９に示す。示されるように、細胞を回収する際に保存液を５倍に希釈することにより、１倍希釈と比較して、細胞生存率が上昇した。理論に束縛されることを望まないが、５倍希釈による細胞生存率の上昇は、ゲル化剤の粘性によるものと考えられる。遠心分離を行ったとしても高い粘性を有する状態の液体では十分に細胞を沈殿させることが出来ず、回収率が下がる事が想定される。５倍以上希釈する事によって、粘性が下がり、通常用いられる遠心方法（１０００Ｇ）を用いてほぼ全ての細胞を沈殿・回収する事が可能になると考えられる。
以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
本出願は、令和３年８月２日に出願された特願２０２１－１２６７０６の優先権の利益を請求し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
高い生存率で細胞を維持することができる保存方法が提供される。保存された細胞は細胞注入療法に使用されるため、製薬等の分野において利用可能である。
配列番号１：組換えコラーゲン様ペプチド（ＲＣＰ）のアミノ酸配列
配列番号２：細胞接着シグナル配列（ＲＥＤＶ）
配列番号３：細胞接着シグナル配列（ＹＩＧＳＲ）
配列番号４：細胞接着シグナル配列（ＰＤＳＧＲ）
配列番号５：細胞接着シグナル配列（ＲＹＶＶＬＰＲ）
配列番号６：細胞接着シグナル配列（ＬＧＴＩＰＧ）
配列番号７：細胞接着シグナル配列（ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ）
配列番号８：細胞接着シグナル配列（ＩＫＶＡＶ）
配列番号９：細胞接着シグナル配列（ＤＧＥＡ）

Claims (18)

  1. 骨髄由来間葉系幹細胞を保存するための方法であって、該方法は、
    １）ゲル化温度より高い温度でゲル化剤を含むｐＨが６．０～７．０である保存液を準備するステップと、
    ２）該保存液中に該幹細胞を入れた後該ゲル化剤のゲル化温度に下げるステップと、
    ３）該幹細胞を含む該保存液を該ゲル化剤のゲル維持温度で保存するステップと
    を含み、該ゲル化剤が、コラーゲン、変性コラーゲン、コラーゲン様ペプチド、ゼラチンまたはこれらの任意の組み合わせを含み、該ゲル維持温度が、４℃～２４℃であり、該保存液がＭＥＭαまたは生理食塩水である、方法。
  2. 前記ゲル化剤がコラーゲン様ペプチドを含み、該コラーゲン様ペプチドが、Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列の繰り返しを含み、ＸおよびＹはそれぞれ独立して同一または異なるアミノ酸である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ゲル化剤が、約１％（ｗ／ｗ）以上の濃度で前記保存液中に含まれる、請求項１に記載の方法。
  4. 前記ゲル化剤が、約２．５％（ｗ／ｗ）～約１０％（ｗ／ｗ）の濃度で前記保存液中に含まれる、請求項３に記載の方法。
  5. 前記ゲル化剤を、約２．５％（ｗ／ｗ）の濃度で前記保存液中に含む、請求項４に記載の方法。
  6. 前記保存液のｐＨが、６．４～７．０である、請求項１に記載の方法。
  7. 前記幹細胞が、細胞注入療法および創薬研究において使用される細胞であって、該細胞注入療法を受ける被験体から得られた細胞である、請求項１に記載の方法。
  8. 非ゲル化処理するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  9. 前記非ゲル化処理するステップが、ゲル化剤の融点またはそれより高い温度まで温度を上げることを含む、請求項８に記載の方法。
  10. 前記幹細胞を回収するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  11. 前記幹細胞を回収するステップが、前記保存液を２～２０倍に希釈すること、前記幹細胞と前記保存液とを分離することを含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記幹細胞が、約１×１０６～約１×１０７個／ｍｌの細胞密度で保存される、請求項１に記載の方法。
  13. 骨髄由来間葉系幹細胞を保存するためのキットであって、該キットは、
    （１）ゲル化剤を含む保存液と、
    （２）該保存液のｐＨを６．０～７．０に調節するための緩衝液と
    を含み、該幹細胞が、ゲル維持温度で保存され、該ゲル化剤が、コラーゲン、変性コラーゲン、コラーゲン様ペプチド、ゼラチンまたはこれらの任意の組み合わせを含み、該ゲル維持温度が、４℃～２４℃であり、該保存液が、ＭＥＭαまたは生理食塩水である、キット。
  14. ゲル化剤を含む、骨髄由来間葉系幹細胞を保存するための組成物であって、該組成物は、幹細胞を保存する際に、ゲル維持温度およびｐＨ６．０～７．０で使用され、該ゲル化剤が、コラーゲン、変性コラーゲン、コラーゲン様ペプチド、ゼラチンまたはこれらの任意の組み合わせを含み、ゲル維持温度が、４℃～２４℃であり、該ゲル化剤がＭＥＭαまたは生理食塩水中に含まれる、組成物。
  15. ゲル化剤と骨髄由来間葉系幹細胞とを含み、ｐＨが６．０～７．０である、製剤であって、該製剤が、ゲル維持温度で保存され、該ゲル化剤が、コラーゲン、変性コラーゲン、コラーゲン様ペプチド、ゼラチンまたはこれらの任意の組み合わせを含み、該ゲル維持温度が、４℃～２４℃であり、該ゲル化剤がＭＥＭαまたは生理食塩水中に含まれる、製剤。
  16. Ready-to-Use製剤である、請求項１５に記載の製剤。
  17. 骨髄由来間葉系幹細胞を運搬するための方法であって、該方法は、
    １）ゲル化温度より高い温度でゲル化剤を含むｐＨが６．０～７．０である保存液を準備するステップと、
    ２）該保存液中に該幹細胞を入れた後該ゲル化剤のゲル化温度に下げるステップと、
    ３）該幹細胞を含む該保存液を該ゲル化剤のゲル維持温度で運搬するステップと
    を含み、該ゲル化剤が、コラーゲン、変性コラーゲン、コラーゲン様ペプチド、ゼラチンまたはこれらの任意の組み合わせを含み、該ゲル維持温度が、４℃～２４℃であり、該保存液がＭＥＭαまたは生理食塩水である、方法。
  18. 骨髄由来間葉系幹細胞を保存するためのゲル化剤であって、該ゲル化剤が、該骨髄由来間葉系幹細胞を保存する際に、ｐＨ６．０～７．０で、該ゲル化剤のゲル維持温度で使用され、該ゲル化剤が、コラーゲン、変性コラーゲン、コラーゲン様ペプチド、ゼラチンまたはこれらの任意の組み合わせを含み、該ゲル維持温度が、４℃～２４℃であり、該ゲル化剤がＭＥＭαまたは生理食塩水中に含まれる、ゲル化剤。
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