TWI664412B - 維持細胞活性之組成物和方法 - Google Patents

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Abstract

本揭露提供一種包含明膠的穩定細胞的介質。所述穩定細胞的介質可以協助維持細胞的活性，例如使用於解凍後之生物材料。

Description

維持細胞活性之組成物和方法
本揭露大致涉及一個在體外維持生物性材料之活性的領域。更具體地說，本揭露涉及一種用於維持生物性材料（例如：細胞以及組織）之活性的組成物和方法，將其應用於從冷凍環境解凍之後的生物性材料。
0℃或0℃以下的低溫保存技術通常用於長期保存生物材料，例如：動物（包括人類細胞和組織）和植物的細胞和組織。（請參閱Thompson et al., Cryopreservation and Thawing of Mammalian Cells, December 2014, eLS, John Wiley & Sons, Ltd: Chichester. DOI: 10.1002/9780470015902.a0002561.pub2）有效長期儲存這些哺乳動物細胞對於可否將這些細胞成功的應用於臨床和作為研究工具是至關重要的。舉例來說，幹細胞可應用於細胞移植、組織工程和再生醫學。而冷凍保存的卵母細胞、精子和胚胎則可用於輔助生殖技術。另外，在移植醫學中則需要冷凍保存皮膚、眼角膜、胰島和心臟瓣膜等活體組織。
細胞可保存於零度以下（例如：-70℃以下）數月或數年。然而，細胞於解凍時以及解凍後並不穩定。主要原因為細胞的活性會隨著細胞在解凍過程中以及解凍之後所接觸的環境而變化。 許多證據已經指出解凍速率、滲透壓以及冷凍保護劑的毒性會在解凍後損傷細胞。（請參閱Thompson et al., Cryopreservation and Thawing of Mammalian Cells, December 2014, eLS, John Wiley & Sons, Ltd: Chichester. DOI: 10.1002/9780470015902.a0002561.pub2）如果上述解凍細胞未來將會被注射入受試者（例如：透過細胞治療、輸血或骨髓移植等方式），則如何於解凍後獲得較高細胞活性是非常重要的，因為如果注射的細胞是死亡或損傷是沒有效益的。同樣地，當細胞必須再重新培養時，細胞具有高度活性也是同等重要的。
當細胞從低溫狀態轉變為代謝活性狀態時，如何維持其活性是一項具有挑戰性的任務。因此，有必要改進用於維持解凍後的細胞活性的介質和方法。
本揭露提供一種含有大約5〜15.7 wt%、大約5〜7.5 wt%、大約10〜15.7 wt%、大約0.8〜15.7 wt%、大約2.4〜7 wt%或大約9.3〜14.6 wt%明膠的穩定細胞介質（前述之百分比為相對於穩定細胞介質的總重量百分比）。
本揭露還提供一種組成物，其包含一個生物性材料（例如：一個或是多個細胞、組織、器官和∕或病毒顆粒）以及含有大約0.8〜15.7 wt%、大約2.4〜7 wt%或大約9.3〜14.6 wt%的明膠。
在某些實施例中，所描述的是解凍後的生物性材料（例如：一個或是多個細胞、組織、器官和∕或病毒顆粒）。在某些實施例中，解凍後的細胞活性至少為70%或至少為80%。
本揭露提供一種用於生物性材料，維持其活性（例如：細胞活性）的方法，其方法包含：形成一個生物性材料（例如：一個或多個細胞、組織、器官和／或病毒顆粒）與穩定細胞介質的混合物[或形成一個穩定細胞介質和生物性材料（例如：一個或多個細胞、組織、器官和／或病毒顆粒）的化合物]。
本揭露提供一種用於維持細胞活性的方法，其方法包含：形成一個或多個細胞與穩定細胞介質的混合物[或形成一個穩定細胞介質和生物性材料（例如：一個或多個細胞、組織、器官和／或病毒顆粒）的化合物]，其中所述混合物（或化合物）含有大約0.8〜15.7 wt%、大約2.4〜7 wt%或大約9.3〜14.6 wt%的明膠。
在某些實施例中，於混合步驟之前，一個或多個細胞是被置於細胞懸浮液中。
在某些實施例中，於混合步驟中，所述穩定細胞介質與細胞懸浮液的體積比範圍大約6.25〜12.5或大約5〜10。
在某些實施例中，所述細胞於細胞懸浮液中的濃度大約7.5 x 105 〜7.5 x 107 cells/ml。
在某些實施例中，於混合步驟之前，所述方法還包含將穩定細胞介質置於大約25〜37℃的溫度。
在某些實施例中，於混合步驟之前，所述一個或多個細胞是在已解凍的冷凍保存組成物中。又在某些實施例中，所述冷凍保存狀態的溫度範圍大約為－70〜－200℃。
在某些實施例中，解凍後的細胞活性至少為70%或至少為80%。
在某些實施例中，所述冷凍保存組成物包含：甘油、二甲基亞碸（DMSO）和/或聚乙二醇（PEG）。
在某些實施例中，於混合步驟之後，所述混合物中細胞的濃度大約為105 〜107 cells/ml。
在某些實施例中，所述明膠具有平均分子質量（或分子量或平均分子重量）大約100〜200 kD。又在某些實施例中，所述明膠包含變性的膠原蛋白。
在某些實施例中，所述穩定細胞介質是具有狀健值（bloom value）大約190〜325的熱可逆水膠。
在某些實施例中，所述細胞是哺乳動物細胞。又在某些實施例中，所述細胞是人的、豬的、狗的、馬的或牛的細胞。又在某些實施例中，所述細胞包含腫瘤細胞。還在某些實施例中，所述細胞包含纖維母細胞。更在某些實施例中，所述細胞包含幹細胞。
在某些實施例中，所述穩定細胞介質還包含胺基酸、細胞激素、脂質、生長因子、抗生素、抗霉菌素、類固醇、賀爾蒙蛋白或以上任意之組合。
本揭露還提供一套組（kit），其套組包含本組成物或本穩定細胞介質。
本揭露提供一種包含例如明膠的穩定細胞介質。所述穩定細胞介質是用以協助維持細胞的活性，例如在生物材料解凍後。將如所述穩定細胞介質與細胞混合，則細胞在所期待的時間內可以維持活性。
然後可以將上述生物材料（例如：細胞）應用於各種研究和臨床試驗，舉例來說：用於細胞療法、輔助生殖技術或正在接受化學療法或放射療法的患者。在一個實施例中，所述生物材料可以施用於受試者。
在某些實施例中，所述生物材料（例如：細胞、組織、器官和／或病毒顆粒）是從冷凍保存（或從冷凍保存狀態）而解凍出（或已經被解凍）。在某些實施例中，所述生物材料已經是在冷凍狀態之下。在某些實施例中，生物材料是處在從冷凍狀態至解凍（或已經被解凍）的過程中與所述穩定細胞介質混合。在某些實施例中，細胞在與所述穩定細胞介質化合/混合過後，其解凍後的細胞活性至少大約50%、至少大約60%、至少大約70%、至少大約75%、至少大約80%、至少大約85%、至少大約90%或至少大約95%。
在某些實施例中，當生物材料（例如：細胞、組織、器官或病毒顆粒）從冷凍保存解凍（或已被解凍）時，生物材料是在含有一種或多種滲透性冷凍保護劑，和／或一種或多種非滲透性冷凍保護劑的冷凍保存組成物中。滲透性冷凍保護劑的例子包含甘油、二甲基亞碸（DMSO）、聚乙二醇、乙二醇和丙二醇（1,2-丙二醇、丙-1,2-二醇），但不限於此。非滲透性冷凍保護劑的例子包含醣類（例如：蔗糖、海藻糖、麥芽糖）、糖、澱粉（例如：羥乙基澱粉）和高分子量之分子，例如蛋白質（例如：白蛋白，例如血清白蛋白）、percoll、ficol、聚乙二醇、葡聚醣、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇(PVA)、血漿和其他大分子，但不限於此。 在某些實施方案中，冷凍保存組成物包含一種或多種冷凍保護劑，其包括甘油、二甲基亞碸（DMSO）和／或聚乙二醇（PEG），但不局限於此。
本文中的「冷凍保存狀態」是指處於冷凍溫度的狀態。
在某特定實施例中，冷凍保存溫度包括等於或低於大約0℃、等於或低於約－20℃、等於或低於大約－50℃、等於或低於大約－60℃、等於或低於大約－70℃、等於或低於大約－80℃、等於或低於大約－90℃、等於或低於大約－100℃、等於或低於大約－110℃、等於或低於大約－120℃、等於或低於大約－135℃、等於或低於大約－196℃、大約－70〜－200℃或在液氮中。
在某些實施例中，在與穩定細胞介質化合/混合之前，生物材料（例如：細胞、組織、器官或病毒顆粒）是處於低溫保存狀態。 在某些實施例中，在與穩定細胞介質化合/混合之前，生物材料（細胞、組織、器官）是處於凍乾狀態（lyophilized state）。
在某些實施例中，在與穩定細胞介質化合/混合之前，細胞是處於培養狀態下。細胞可以在長滿前、生長高峰期、長滿狀態或長滿後收取。
在某些實施例中，細胞於受試者（例如：病人）身上取下後與穩定細胞介質化合／混合。
在某些實施例中，在與本穩定細胞介質化合/混合之後，細胞活性具有至少大約50％、至少大約60％、至少大約70％、至少大約75％、至少大約80％、至少大約85％、至少大約90％或至少大約95％。
在某些實施例中，所述細胞包含腫瘤細胞。在某些實施例中，所述細胞包含纖維母細胞。在某些實施例中，所述細胞包含幹細胞。
在某些實施例中，所述細胞包含哺乳動物細胞，其包含人的、豬的、狗的、馬的或牛的細胞，但不局限於此。
在某些實施例中，本方法可進一步地包含經由所述穩定細胞介質處理過的生物性材料施用於受試者（例如病人）的步驟。
在某些實施例中，穩定細胞介質中含有大約5〜15.7 wt%明膠（前述之百分比為相對於全部穩定細胞介質的重量百分比）。在某些實施例中，穩定細胞介質中含有大約2〜20 wt%、大約3〜18 wt%、大約4〜17 wt%、大約5〜16 wt%、大約5〜15.7 wt%、大約5〜7.5 wt%、大約10〜15.7 wt%、大約5〜6 wt%、大約6〜7.5 wt%、大約7.5〜10 wt%、大約5〜10 wt%、大約6〜7.5 wt%、大約6〜10 wt%、大約6〜15.7 wt%、大約7.5〜10 wt%、大約7.5〜15.7 wt%、大約5 wt%、大約6 wt%、大約7.5 wt%、大約10 wt%、或大約15.7 wt%明膠（前述之百分比為相對於全部穩定細胞介質的重量百分比）。
在某些實施例中，穩定細胞介質中含有（或由其組成或基本上由其組成）大約5〜15.7 wt%明膠和溶劑（例如：培養基，例如：DMEM、水、緩衝液、鹽水溶液等）。 在某些實施例中，穩定細胞介質中含有（或由其組成或基本上由其組成）明膠濃度範圍為大約5〜15.7 wt%的明膠水溶液。
在某些實施例中，穩定細胞介質中含有（或由其組成或基本上由其組成）大約5〜15.7 wt%的明膠和緩衝系統（例如：生理緩衝液）。在某些實施例中，穩定細胞介質中含有（或由其組成或基本上由其組成）大約5〜15.7 wt%的明膠和鹽類溶液，和／或任何生理溶液。
在某些實施例中，穩定細胞介質中含有（或由其組成或基本上由其組成）大約5〜15.7 wt%的明膠和培養基（例如：細胞培養基）。
在某些實施例中，本穩定細胞介質中的明膠是與液體組成物所混合的。在某些實施例中，穩定細胞介質中含有（或由其組成或基本上由其組成）大約5〜15.7 wt%的明膠和液體組成物。液體組成物的例子包括水、培養基、培養基混合物、緩衝系統（例如：生理緩衝液）、鹽類溶液和／或任何生理溶液，但不局限於此。 在某些實施例中，所述液體組成物還包含補充劑、添加劑、額外的一些培養基成分等等。
在某些實施例中，穩定細胞介質中含有（或由其組成或基本上由其組成）兩種成分：第一種成分是明膠，其在穩定細胞介質中濃度大約為5〜15.7 wt%； 第二種成分是食鹽水溶液（例如：等張食鹽水溶液）、緩衝系統（例如：生理緩衝液）、水和／或培養基（例如：細胞培養基）。
本揭露還提供了一種用於生物性材料，維持其活性（例如：細胞活性）的方法。所述方法包括將生物性材料（例如：細胞、組織、器官或病毒顆粒）與穩定細胞介質混合以形成混合物的步驟。在某些實施例中，穩定細胞介質中含有大約5〜15.7 wt%明膠（前述之百分比為相對於全部穩定細胞介質的重量百分比）。
所述生物性材料（例如：細胞、組織、器官或病毒顆粒）可以藉由任何適當的方法與本穩定細胞介質結合。在某些實施例中，將穩定細胞介質加入至生物材料中。在某些實施例中，將生物材料加入至穩定細胞介質中。在一個實施例中，所述的方法包括將穩定細胞介質加入至(選擇性的混合)含有細胞的細胞懸浮液裡。在另一個實施例中，將含有細胞的細胞懸浮液加入至(選擇性的混合) 穩定細胞介質裡。
在某些實施例中，在與所述穩定細胞介質化合/混合之前，將細胞從培養基或保存培養基中移出（例如：利用離心、收取，並且可選擇性地在緩衝溶液中洗滌）。
在某些實施例中，在與所述穩定細胞介質混合之前，細胞是在細胞懸浮液裡。在某些實施例中，細胞是懸浮於培養基（例如：細胞培養基）、緩衝系統（例如：生理緩衝液），鹽類溶液和／或生理溶液中。
在某些實施例中，細胞在細胞懸浮液中的濃度範圍大約104 〜109 cells/ml、大約104 〜108 cells/ml、大約7.5x105 〜7.5x107 cells/ml、大約5x105 〜5x107 cells/ml、大約8x105 〜7.5x107 cells/ml、大約9x105 〜7.5x107 cells/ml、大約106 〜7.5x107 cells/ml、大約5x106 〜7.5x107 cells/ml、大約7.5x106 〜7.5x107 cells/ml、大約7.5x105 〜7.5x106 cells/ml、大約105 〜107 cells/ml、大約105 〜108 cells/ml、大約104 〜107 cells/ml、大約7.5x105 cells/ml、大約7.5x106 cells/ml、或大約7.5x107 cells/ml、大約105 cells/ml、大約106 cells/ml、或大約107 cells/ml。在某些實施例中，細胞在細胞懸浮液中的濃度範圍大約7.5x105 〜7.5x107 cells/ml。在某些實施例中，細胞在細胞懸浮液中的濃度大約7.5x106 cells/ml。細胞在細胞懸浮液中的濃度可以高於109 cells/ml或低於104 cells/ml。
在某些實施例中，細胞和所述穩定細胞介質混合而形成混合物。
本揭露提供一種維持細胞活性的方法。所述方法包括將一個或多個細胞與穩定細胞介質混合以形成混合物的步驟。 在某些實施例中，混合物中包含大約0.8〜15.7 wt%的明膠。
在某些實施方案中，細胞（其不一定要置於細胞懸浮液中）和所述穩定細胞介質（或是生物材料和穩定細胞介質的化合物）所組成的混合物中含有大約0.8〜15.7 wt%（相對於於混合物的總重量）的明膠。在某些實施例中，混合物（或化合物）中含有大約0.5〜20 wt%、大約0.6〜18 wt%、大約0.7〜17 wt%、大約0.8〜16 wt%、大約0.8〜15.7 wt%、大約0.5〜15.7 wt%、大約1〜17 wt%、大約2〜14 wt%、大約3〜9.5 wt%、大約4〜14 wt%、大約2.4〜7 wt%、大約9.3〜14.6 wt%、大約5〜7.5 wt%、大約10〜15.7 wt%、大約5〜6 wt%、大約6〜7.5 wt%、大約7.5〜10 wt%、大約5〜10 wt%、大約6〜7.5 wt%、大約6〜10 wt%、大約6〜15.7 wt%、大約7.5〜10 wt%、大約7.5〜15.7 wt%、大約5 wt%、大約6 wt%、大約7.5 wt%、大約10 wt%、或大約15.7 wt%相對於混合物（或化合物）總重量的明膠。
在某些實施例中，將細胞和所述穩定細胞介質混合形成混合物，其中混合物中細胞的濃度範圍大約104 〜109 cells/ml、大約104 〜108 cells/ml、大約105 〜107 cells/ml、大約106 〜107 cells/ml、大約105 〜106 cells/ml、大約105 〜108 cells/ml、大約104 〜107 cells/ml、大約105 cells/ml、大約106 cells/ml、或大約107 cells/ml。在某些實施例中，混合物中的細胞濃度是大約105 〜107 cells/ml。在某些實施例中，混合物中細胞的濃度大約106 cells/ml。混合物中細胞的濃度可以高於109 cells/ml或低於104 cells/ml。
在某些實施方案中，在混合步驟中，穩定細胞介質與細胞懸浮液（或含有生物材料的組成物）的體積比為大約3〜25、大約5〜20、大約6〜18、大約6〜15、大約6.25〜12.5、大約7〜12.5、大約6.25〜15、大約6.25〜20、大約8〜12.5、大約9〜12.5、大約5〜12.5、大約5〜10、大約5〜8、大約5、大約6、大約6.25、大約7、大約8、大約9、大約10、大約11、大約12、大約12.5、大約13、大約14或大約15。
在某些實施例中，生物材料（例如細胞不一定置於細胞懸浮液中）和所述穩定細胞介質組成的混合物在大約25℃、大約27℃、大約30℃或大約37℃的溫度下培養大約1~8小時、大約2〜8小時、大約3〜8小時、大約2〜4小時、大約1〜6小時、大約4〜8小時、大約1〜5小時、大約1〜4小時、大約1〜3小時、大約1〜2小時、大約2〜4小時、大約2〜3小時、大約3〜5小時、大約5〜20分鐘、大約5〜30分鐘、大約10分鐘〜1小時、大約20分鐘〜1小時、大約30分鐘、大約1小時、大約2小時、大約3小時、大約4小時、大約5小時、大約6小時、大約7小時或大約8小時，其細胞活性降低至小於大約40％、小於大約30％ 、小於大約20％、小於大約10％、小於大約9％、小於大約8％、小於大約7％、小於大約6％、小於大約5％、小於大約4％、小於大約3％、或小於大約1％。
在某些實施例中，生物材料（例如細胞不一定置於細胞懸浮液中）和所述穩定細胞介質組成的混合物在大約25℃、大約27℃、大約30℃或大約37℃的溫度下培養大約1~8小時、大約2〜8小時、大約3〜8小時、大約2〜4小時、大約1〜6小時、大約4〜8小時、大約1〜5小時、大約1〜4小時、大約1〜3小時、大約1〜2小時、大約2〜4小時、大約2〜3小時、大約3〜5小時、大約5〜20分鐘、大約5〜30分鐘、大約10分鐘〜1小時、大約20分鐘至約1小時、大約30分鐘、大約1小時、大約2小時、大約3小時、大約4小時、大約5小時、大約6小時、大約7小時或大約8小時，其細胞活性至少大約50%％、至少大約60％、至少大約70％、至少大約75％、至少大約80％、至少大約85％、至少大約90％或至少大約95％。
本揭露提供了一種組成物，其包含生物材料（例如：一個或多個細胞、組織、器官）和大約0.8〜15.7 wt%的明膠。在某些實施例中，組成物中含有約0.8〜15.7 wt%（相對於於組成物的總重量）的明膠。在某些實施例中，組成物中含有大約0.5〜20 wt%、大約0.6〜18 wt%、大約0.7〜17 wt%、大約0.8〜16 wt%、大約0.8〜15.7 wt%、大約0.5〜15.7 wt%％、大約1〜17 wt%、大約2〜14 wt%、大約3〜9.5 wt%、大約4〜14 wt%、大約2.4〜7 wt%、大約9.3〜14.6 wt%、大約5〜7.5 wt%、大約10〜15.7 wt%、大約5〜6 wt%、大約6〜7.5 wt%、大約7.5〜10 wt%、大約5〜10 wt%、大約6〜7.5 wt%、大約6〜10 wt%、大約6〜15.7 wt%、大約7.5〜10 wt%、大約7.5〜15.7 wt%、大約5 wt%、大約6 wt%、大約7.5 wt%、大約10 wt%、或大約15.7 wt%（相對於組成物總重量）的明膠。
在某些實施例中，生物材料（例如：細胞、組織、器官或病毒顆粒）是從冷凍保存（冷凍保存狀態）而解凍出（或已經被解凍）。在某些實施例中，生物材料已經處於低溫保存下。在某些實施方案中，生物材料是處在從冷凍狀態至解凍或已經被解凍的過程中。
所述穩定細胞介質可以是液體或固體。在某些實施例中，所述穩定細胞介質是濃縮組成物，例如以乾燥形式（例如：粉末、片劑、顆粒或其它任何合適的物理狀態）或液體形式，例如以2倍（2X）、3倍（3X）、4倍（4X）、5倍（5X）、6倍（6X）、7倍（7X）、8倍（8X）、9倍（9X）、10倍（10X）、15倍（15X）、20倍（20X）等濃縮液。而所述濃縮液可以使用例如：培養基、生理溶液、緩衝液、水等以2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍等進行稀釋。而乾燥形式的穩定細胞介質可以藉由添加例如：培養基、生理溶液、緩衝液、水等（例如：溶解於培養基、生理溶液、緩衝液、水等），將穩定細胞介質轉化為液體形式。
在某些實施例中，本文中所討論的組成物的濃度是指在本穩定細胞介質濃縮液中的濃度。在某些實施例中，本文中所討論的組成物的濃度是指在本穩定細胞介質使用溶液（working solution）中的濃度。
所述穩定細胞介質可以是溶液。在某些實施例中，穩定細胞介質是本文所討論的組成物中的水溶液。
在某些實施例中，當製備所述穩定細胞介質時，將本文所討論的組成物（例如：明膠、明膠衍生物和／或白蛋白）溶解於平衡電解質溶液（例如：生理食鹽水溶液、培養基（例如細胞培養基））。在某些實施例中，穩定細胞介質具有適當濃度的電解質（例如：鈉離子、鉀離子和／或氯離子）以維持正常的滲透壓。在一個實施例中，生理食鹽水溶液是磷酸鹽緩衝鹽溶液（PBS）。在一個實施例中，生理食鹽水溶液包含以下中的一種或多種：氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、磷酸鉀、氯化鈣和碳酸氫鈉。在一個實施例中，鹽水溶液是等滲透鹽類水溶液（例如：與血漿或體液具有相同滲透壓）。
本穩定細胞介質可以具有緩衝系統（例如：生理緩衝液）。 本穩定細胞介質可以包含平衡的鹽類溶液或任何生理溶液。
緩衝系統的例子包括磷酸緩衝液（例如：磷酸鹽緩衝鹽水（PBS））、BES、TES、乙酰胺基甘氨酸、甘氨酸酰胺、甘氨酰甘氨酸、TRICINE、TALP、三乙醇胺、佛羅拿（veronal）和HEPES，但不局限於此。
在某些實施例中，本穩定細胞介質中緩衝液的濃度範圍為大約1〜1000 mM、大約1〜200mM、大約5〜200mM或大約5〜50 mM。
培養基的例子包括Dulbecco's Modified Eagle培養基（DMEM），Minimal Essential Medium（MEM），Knockout-DMEM（KO-DMEM），Glasgow Minimal Essential Medium（G-MEM），Basal Medium Eagle（BME） 、DMEM / Ham's F12、Advanced DMEM / Ham's F12、Iscove's Modified Dulbecco's Media and Minimal Essential Media（MEM）、Ham's F-10、Ham's F-12、Medium 199、RPMI 1640培養基和其化合物和／或上述溶液之改良物，但不局限於此。在一個實施例中，細胞培養基是DMEM。
在某些實施例中，在室溫或周遭環境溫度下（例如：在25℃），本穩定細胞介質的pH值範圍大約6.0〜8.5、大約6.5〜8、大約6.9〜7.5或大約7.2〜7.4。
在某些實施例中，穩定細胞介質是以單位形式包裝。在一個實施例中，穩定細胞介質包裝成10ml、50ml、100ml、500ml或1L的體積。在某些實施例中，穩定細胞介質包裝成1倍、5倍、10倍或20倍濃縮溶液。
本細胞穩定介質可以透過混合本文中以固體形式存在的組成物而獲得，或是透過將組成物溶解於水、緩衝液、溶液、培養基等而形成水溶液而獲得。
本文中所使用的百分比「%（w/v）」是指重量除以體積的百分比（w是以公克計算，v是以毫升計算）。百分比「%（v/v）」是指體積百分比；百分比「%（w/w）」或「wt%」是指重量百分比。
關於數值的「大約」是指所述數值的+ 10%。 換句話說，數值可以在指定值的90%至110%的範圍內。
明膠
本穩定細胞介質可以包含明膠和／或明膠衍生物。如本文述「明膠」是指明膠或明膠衍生物。任何明膠或明膠衍生物都可用於本穩定細胞介質中。
在某些實施例中，本穩定細胞介質中明膠的分子量（或重均分子量或平均分子量）為大約15〜40kD、大約25〜40kD、大約25〜50kD、大約25〜45kD、大約40〜50kD、大約10〜100kD、大約40〜100kD、大約50〜100kD、大約100〜200kD、大約100〜250kD、大約80〜200kD、大約150〜200kD、大約100〜150kD、或大約50〜200kD。
在某些實施例中，本穩定細胞介質中明膠的等電點（pI）為大約4.5〜9、大約5〜9、大約5〜7、大約6〜7、大約5〜6、大約7〜9或大約4.7〜5.2。
在某些實施例中，明膠來自於哺乳動物組織。在某些實施例中，明膠來自於動物膠原蛋白。在某些實施例中，明膠可以來自於動物如牛、雞、豬和魚的皮膚、骨骼、結締組織、肌腱、韌帶等的原材料，但不局限於此。在一個實施例中，明膠來自於牛、豬或其組合。在某些實施例中，明膠來自於牛骨和豬皮、牛皮、豬肉、牛皮和／或魚皮。在一個實施例中，明膠來自於皮膚或骨頭。
在某些實施例中，明膠是部分膠原蛋白水解所產生的胜肽和蛋白質的混合物。在某些實施方案中，明膠是膠原蛋白的水解形式。在某些實施例中，明膠是變性膠原蛋白的其中一種形式。在某些實施例中，明膠包含變性膠原蛋白。
在某些實施例中，明膠可以是A型明膠或B型明膠。如本文中所使用，A型明膠是藉由酸處理原料所獲得的明膠；B型明膠是藉由鹼處理原料所獲得的明膠。
在某些實施例中，則透過化學水解和／或熱水解來進行膠原蛋白水解以產生明膠。在一個實施例中，將膠原煮沸（例如在水中）或加熱（高溫或長時間）以產生明膠。
在某些實施例中，則是藉由酸水解、鹼水解和／或酶水解來進行膠原蛋白水解來產生明膠。
在某些實施例中，明膠的製造過程包含三個主要階段：預處理、主要萃取步驟、精煉和回收處理。預處理步驟是將原料準備好以供主要萃取步驟使用，並去除可能對最終明膠產品的生理化學性質具有負面影響的雜質。主要萃取步驟則是用熱水或稀酸溶液作多階萃取而將膠原蛋白水解成明膠。精煉和回收處理則包括：過濾、澄清、蒸發、滅菌、乾燥、車轍（rutting）、研磨和／或篩分以從明膠溶液中除去水、混合所提取的明膠和／或獲得乾燥、混合和研磨的最終產品。
在某些實施例中，本穩定細胞介質所包含的分餾明膠，是經由特殊製備技術（例如超濾）從常規明膠獲得而來的。在某些實施例中，分餾明膠是透過去除胜肽／多胜肽的某(些)特定部分或透過混合胜肽／多胜肽的各個部分所獲得而來的。
明膠衍生物是化學改良的明膠，包括琥珀酰化（succinylated）明膠、硫醇化（thiolated）明膠，乙酰化（acetylated）明膠，鄰苯二甲酸化（phthalated）明膠，琥珀酰（succinyl）明膠，氧化聚（oxypolygelatin）明膠或尿素交聯（urea cross-linked）明膠，但不局限於此。在一個實施例中，琥珀酰化明膠是通過琥珀酸或其鹽或琥珀酸酐交聯的明膠。在某些實施例中，明膠衍生物是通過使明膠與酸酐（例如：琥珀酸（succinic），檸康酸（citraconic），衣康酸（itaconic），烏頭酸（aconitic）或馬來酸酐（maleic anhydride））反應而獲得而來的（請參閱美國專利8,865,397和6,103,269）。
多胜肽
本穩定細胞介質可包含任何適當的多胜肽。在某些實施例中，穩定細胞介質包含多胜肽成分和液體成分。
如本文中所述，多胜肽旨在包含任何由組織產生的或由合成產生的多胜肽，例如：膠原衍生的成分（例如：明膠）。在某些特定的實施例中，多胜肽可以包含（或由其構成）大約50〜30,000個氨基酸殘基、較佳地大約100〜20,000個氨基酸殘基、更佳地大約200〜10,000個氨基酸殘基、另一更佳地大約300〜5,000個氨基酸殘基，並且最佳地大約500〜2,000個氨基酸殘基。
在某些實施例中，多胜肽包含明膠、白蛋白或兩者之組合。
在某些實施例中，多胜肽是明膠或明膠衍生物（例如：琥珀酰化明膠）。在某些實施例中，所述多胜肽是其他似明膠成分，例如：角蛋白（keratin）、核心蛋白聚醣（decorin）、聚集蛋白聚醣（aggrecan）、彈性蛋白（elastin）、層粘連蛋白（laminin）、巢蛋白（nidogen）、纖維蛋白（fibulin）、原纖維蛋白（fibrillin）、膠原蛋白、分餾明膠、膠原蛋白水解物、植物蛋白質、植物蛋白水解物、彈性蛋白水解物、醣蛋白（包括蛋白聚醣）及其混合物。
也可以使用由其他類型組織而來的多胜肽。例如來自動脈、聲帶、胸膜、氣管、支氣管、肺泡隔膜、韌帶、耳廓軟骨或腹部筋膜的組織萃取物；肝的網狀網絡；腎的基底膜；或神經系統的神經、蛛網膜、硬腦膜或軟腦膜，但不局限於此。
多胜肽可以包含天然成分和／或合成成分。天然成分的示例包括天然存在的蛋白質和多胜肽，但不局限於此。
在某些實施例中，穩定細胞介質中含有大約2〜20 wt%、大約3〜18 wt%、大約4〜17 wt%、大約5〜16 wt%、大約5〜15.7 wt%、大約5〜7.5 wt%、大約10〜15.7 wt%、大約5〜6 wt%、大約6〜7.5 wt%、大約7.5〜10 wt%、大約5〜10 wt%、大約6〜7.5 wt%、大約6〜10 wt%、大約6〜15.7 wt%、大約7.5〜10 wt%、大約7.5〜15.7 wt%、大約5 wt%、大約6 wt%、大約7.5 wt%、大約10 wt%或大約15.7 wt%的一種或多種多胜肽（如本文中所述）（前述之百分比為相對於穩定細胞介質的總重量百分比）。
白蛋白
任何白蛋白或白蛋白衍生物均可用於本穩定細胞介質中。
白蛋白的例子包括血清白蛋白（例如：人血清白蛋白或HSA）、血漿白蛋白（例如：人血漿白蛋白）、牛血清白蛋白和／或合成血清白蛋白）、卵清蛋白、植物白蛋白或上述之組合，但不局限於此。白蛋白的例子還包括胎牛血清。
白蛋白可以是來自於天然產生的（例如從天然物純化出的）或由重組方式產生的（重組白蛋白）。在一個實施例中，透過來自於人類的生物性材料，經純化而產生出白蛋白。舉例來說，可以透過常規技術從血液分離出的血漿中獲得（請參閱Cohn et al., J. Am. Chem. Soc. 68 (1946) 459 pp），或者從人的胎盤中萃取出，（請參閱J. Liautaud et al. 13th International IABS Conference, Budapest; A: "Purification of proteins. Development of biological standard", Karger (ed.), Bale, 27 (1973) 107 pp）。在一個實施例中，在真核細胞的宿主中產生出重組白蛋白。
在一個實施例中，本文所述之「白蛋白」具有多樣性，包含人白蛋白所產生的任何天然變異體（variant）。
水膠（ Hydrogels ）
在某些實施例中，本穩定細胞介質是水膠。在某些實施例中，本穩定細胞介質是熱可逆水膠，其可對應於溫度的變化而從流動狀態（液態）轉變到凝膠的狀態。在某些實施例中，本穩定細胞介質在相轉變溫度或高於相轉變溫度時處於自由流動或液相，並在低於相轉變溫度時處於凝膠相（固相、非流動相）。（請參閱美國專利號6,231,881和6,730,315）
在某些實施例中，本穩定細胞介質在高於相轉變溫度時呈現流體相（例如：明膠溶液），並在處於或低於相轉變溫度時呈現凝膠相（例如：明膠水膠）。在某些實施例中，流體相和凝膠相之間的轉化是一連續性的過程。在某些實施例中，穩定細胞介質處在凝膠相時，其凝膠化程度提供了一種可操作式的水膠。在某些實施例中，相轉變溫度也可以是臨界溫度，在其溫度下可確保穩定細胞介質的稠度是呈現可操作式的水膠。在某些實施例中，相轉變溫度則是熔點。
在某些實施例中，穩定細胞介質的相轉變溫度範圍為大約20〜45℃、大約20〜40℃、大約21〜39℃、大約22〜38℃、大約23〜37℃、大約25〜37℃、大約28〜37℃、大約30〜37℃、大約32〜37℃、大約37℃以上或大約37℃。
在某些實施例中，液相的穩定細胞介質與生物材料（例如：細胞、組織、器官、病毒顆粒等）組合／混合以形成混合物。
在某些實施例中，將穩定細胞介質置於大約20〜45℃、大約20〜40℃、大約21〜39℃、大約22〜38℃、大約23〜37℃、大約25〜37℃、大約28〜37℃、大約30〜37℃、大約32〜37℃、大約37℃以上或約37℃，使其液化（或使其保持在液態），然後再與生物材料（例如：細胞、組織、器官、病毒顆粒等）混合以形成混合物。
在某些實施例中，穩定細胞介質的凝膠化時間為大約5分鐘〜1小時、大約5〜50分鐘、大約5〜40分鐘、大約5〜30分鐘、大約8〜30分鐘、大約10〜30分鐘、大約15〜25分鐘、大約20〜30分鐘或大約10〜20分鐘。 如本文中所述「膠凝時間」是指本穩定細胞介質從液相轉變成凝膠相所需的時間。
在某些實施例中，穩定細胞介質（凝膠相的穩定細胞介質）的狀健值（bloom value）為大約125〜225、大約175〜225、大約190〜225、大約175〜325、大約190〜325、大約225〜325、至少或等於大約175、至少或等於大約190、至少或等於大約225、大約190或大約200。
其他成分
在某些實施例中，穩定細胞介質還包含醣類、氨基酸、細胞激素、脂質、生長因子、抗生素（例如：青黴素、鏈黴素等）、抗霉菌素、類固醇激素、蛋白質激素、氨基酸類似物、氨基酸衍生物和二價陽離子螯合劑例如乙二胺四乙酸（EDTA）或其鹽類、蛋白質、鹽類、甲酰胺、甲氧基化化合物和／或聚合物（例如：聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇）或其組合。在某些實施例中，穩定細胞介質還包含甘氨酸、甘油、蔗糖、葡萄糖或其組合。
在某些實施例中，穩定細胞介質包含大約300〜8,000 mg/L、大約500〜7,000 mg/L、大約1,000〜6,000 mg/L、大約1,000〜4,500 mg/L、大約500〜2,300 mg/L、大約1,000 mg/L、大約4,500 mg/L、大約500 mg/L或大約2,300 mg/L的 葡萄糖。
醣類（ Saccharides ）
醣類包括：寡糖例如單醣、雙醣、多醣等。醣類包括糖。
醣類的示例包括：蔗糖、山梨醇、葡萄糖、果糖、半乳糖、海藻糖、甘露糖、棉子糖、水蘇糖、葡聚醣、木糖、阿拉伯糖、甘露醇、木糖醇、肌醇、乳糖、麥芽糖、纖維二糖、乳糖醇、麥芽糖醇、甲基纖維素、羧甲基纖維素、糖原、直鏈澱粉、支鏈澱粉、菊粉、海藻酸鈉、乙基纖維素、羥乙基纖維素、黃原膠、葡萄糖胺、半乳糖胺及其組合，但不局限於此。（請參閱美國專利號6,673,607和7,094,601）
胺基酸
本穩定細胞介質可包含或不包含一個或多個胺基酸。
所述氨基酸包括：旋光異構體（optical isomers），即右旋異構體（D-isomers）和左旋異構體（L-isomers）。氨基酸包括α-氨基酸、β-氨基酸、γ-氨基酸、δ-氨基酸和非天然氨基酸。氨基酸的非限制性示例包括：丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、酪氨酸、賴氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸以及上述任意之組合。（請參閱Cryobiology, 41(4):257-279 (2000)）
氨基酸衍生物也可用於本揭露的組成物和方法中。氨基酸衍生物的示例包括：氨基酸鹽類和氨基酸溶劑，但不局限於此。氨基酸鹽的示例包括：鹼金屬鹽類或鹼土金屬鹽類，例如：鈉鹽、鉀鹽和鈣鹽；氫鹵酸鹽類，例如：氫氟酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽和氫碘酸鹽；無機酸鹽類，例如：硝酸鹽、高氯酸鹽、硫酸鹽和磷酸鹽；和有機酸鹽類，例如：富馬酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、草酸鹽、馬來酸鹽、乙酸鹽、乳酸鹽和抗壞血酸鹽，但不局限於此。氨基酸溶劑的示例包括：水合物、醇鹽（例如：甲醇鹽、乙醇鹽）和醚化合物（例如：乙醚化合物），但不局限於此。
在某些實施例中，本穩定細胞介質中的氨基酸重量百分比濃度範圍為0.01〜10.0%或0.1〜1.0%。
維他命
在另一個實施例中，穩定細胞介質還包含一種或多種維生素。維生素的示例包括D-泛酸鈣（D-calcium pantothenate）、氯化膽鹼、葉酸、煙酰胺（niacinamide）、鹽酸吡哆醇（pyridoxine HCl）、鹽酸硫胺素（thiamine HCl）和核黃素，但不局限於此。
鹽類
在某些實施例中，所述穩定細胞介質還包含一種或多種鹽類，其包括無機鹽和／或有機鹽。無機鹽的示例包括：氯化鉀、碳酸氫鈉、氯化鈉和磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、碳酸氫鈉、氯化鈣、氯化鎂、碳酸氫鉀、單磷酸鉀及上述任意之組合，但不局限於此。
在某些實施例中，穩定細胞介質或組成物不包含血清。在某些實施例中，穩定細胞介質或組成物不包含直接從人或動物取得的任何原料或使用來自於人或動物所產生的成品。
穩定細胞介質或組成物可包含其他成分，其包括胜肽、其他蛋白質、糖醇、氨基糖、醣蛋白和醇、pH調控劑、保濕劑、防腐劑、稠度調控劑或上述任意之組合，但不局限於此。（請參閱U.S. Patent No. 9,055,739）
解凍（ Thawing ）
在某些實施例中，與本穩定細胞介質混合之前或期間，將生物材料（細胞、組織、器官）從冷凍保存（冷凍保存狀態）解凍（或已經解凍）。
保存生物材料時，其合適的條件可以包括維持生物材料的活性。所述條件可以包括：凍存溫度大約0℃或低於大約0℃、大約或低於大約－20℃、大約或低於大約－50℃、大約或低於大約－60℃、大約或低於大約－70℃、大約或低於大約－80℃、大約或低於大約－90℃、大約或低於大約－100℃、大約或低於大約－110℃、大約或低於大約－120℃、大約或低於大約－135℃、大約或低於大約－196℃或液氮中。對於低溫保存，溫度可以在0〜8℃之間。在冷凍乾燥樣品的情況下，溫度可以是0℃以上（例如：室溫、環境溫度等）或0℃以下的任何溫度，只要材料遠離濕氣即可。
生物材料可保存數天、數週、數月或數年（例如：冷凍保存狀態），直到需要生物材料。當需要時，冷凍保存的生物材料即可解凍與恢復。
在某些實施例中，冷凍保存組成物中的生物材料在大約42℃或以下、大約10〜40℃、大約20〜37℃、室溫或約37℃的水浴槽中解凍（例如：將冷凍管或冷凍瓶放置在水浴槽中）。
在一個實施例中，冷凍保存組成物中的生物材料在大約37℃的水浴槽中解凍。可選擇性地將其移至較低的溫度，例如：4℃或在冰上。
在某些實施例中，「逐步」解凍過程包含一個具有逐步升溫速率（或升溫增快速率）的步驟。舉例來說，在轉移到接近體溫的溫度（例如：溫度為大約37℃的水浴槽，或任何其他適當的溫度）之前，可以將冷凍管置於持續升溫的儲存環境中。
在某些實施例中，解凍冷凍保存組成物中的生物材料之升溫速率為大約5〜80℃/min、大約10〜70℃/min、大約10〜60℃/min、大約10〜50℃/min、大約10〜40℃/min、大約10〜30℃/min、大約10〜20℃/min、大約20〜40℃/min、大於大約20℃/min、大於大約25℃/min、大於大約30℃/min、大於大約35℃/min、大於大約40℃/min或大約30℃/min。
在某些實施例中，在與本穩定細胞介質處理之前或之後，先將解凍後的生物材料進行洗滌、懸浮於適當的介質中並且依據後續研究或臨床應用進行需要的處理。
在某些實施例中，解凍後的細胞經過本穩定細胞介質處理後，將細胞移至培養皿中進行再次培養。在研究或臨床應用之前，細胞可以在合適的條件下培養大約30分鐘、大約1小時、大約6小時、大約12小時、大約24小時、大約48小時、大約72小時、大約86小時、大約110小時、大約1週、大約2週，或者超過3週。（請參閱美國專利公開號20170196221）
在某些實施例中，在經過解凍和本穩定細胞介質處理後，復甦的貼壁細胞或半貼壁細胞是立即進行再次培養。
在某些實施例中，解凍後的生物材料經過本穩定細胞介質處理後，並不需要在經過培養步驟，因為生物材料是體內使用。
在某些實施例中，解凍後的細胞經過本穩定細胞介質處理後，細胞可以重新懸浮在液體或其他介質中，以符合預期用途。舉例來說，細胞可以重新懸浮在任何維持滲透性的溶液中。在某些實施例中，細胞可以重新懸浮在生理相容的緩衝液中，例如本文所述的緩衝液。較佳地，細胞可以重新懸浮於任何生理相容的材料，而其材料可提供一種便於體內遞送的組成物。
細胞活性（ Viability of Cells ）
本揭露維持細胞活性的組成物和方法。
如本文所使用的「活性」是指活的生物材料（例如：細胞，例如依據DNA和／或完整的細胞膜系統或活病毒）的百分比。在某些實施例中，具有活性的生物材料是指含有一些活細胞或部分細胞，其細胞在保存狀態釋放後具有代謝活性或將變成具有代謝活性。
在某些實施例中，生物材料（例如：細胞或病毒）的活性為至少大約50%、至少大約55%、至少大約60%、至少大約65%、至少大約70%、至少大約75%、至少大約80%、至少大約85%、至少大約90％或至少大約95%。
在某些實施例中，本組成物和方法確保有限量的或最小程度的細胞壞死和凋亡。 在某些實施例中，觀察到小於大約25%、小於大約20%、小於大約15%、小於大約10%、小於大約5%或小於大約1%的細胞壞死和／或凋亡。
所述活性可以藉由所屬領域已知的任何方法來進行測量。在某些實施例中，使用Trypan blue測試或透過攝取的碘化丙錠來測量活性。在某些實施例中，透過測定細胞的有效附著力（例如：附著測定）來評估活性。 在某些實施例中，可以使用增殖測定來評估附著的細胞是否可以如預期的那樣在經過冷凍保存後增殖。附著和增殖效率可以與沒有經過冷凍保存的對照細胞做比較。
所屬領域已有可用於測定細胞活性和功能的各種檢測方式。在某些實施例中，這些測試方式取決於細胞類型和細胞的預計用途。
對於幹細胞或前驅細胞（progenitor cells），本文所述的方法可進一步確保細胞維持其多能性（pluripotency）。可以透過檢測譜系特異性標記（lineage-specific markers）的表現來確定。舉例來說，間質幹細胞（mesenchymal stem cells）的功能表徵包括誘導脂肪的形成、成骨和軟骨形成分化，而使用市售的分化試劑和RT-PCR以體外方式檢測mRNA的譜系特異性表現，以代表誘導脂肪的形成、成骨和軟骨形成分化的能力。相似地，未分化幹細胞的品質可以透過分離mRNA並測試其細胞特異性標記。在一些特定實施例中，分化成特定譜系的細胞的能力是持續維持的，即與未分化的細胞沒有顯著差異。可以使用所屬領域已知的任何方法測試胚胎幹（ES）細胞的多能性，所述方法包括例如Oct4-GFP的表現、上升鹼性磷酸酶的表現和SSEA-1表面醣蛋白的表現。在實驗處理之後，可以應用幾種體外方法來評估幹細胞的恢復。這些評估可以包括但不限於細胞膜的完整性，代謝狀態和其他功能測定和／或培養生長以及螢光測定，例如SYTO/EB。在某些實施例中，可以使用分化測試、免疫表型分析和／或形態學檢查來檢測幹細胞和／或前驅細胞。
針對受精卵，可以確定卵裂速率以及與對照組比較後可知是否細胞已有損傷。卵母細胞的活性可以透過冷凍保存後細胞的形態學特徵做進一步確定。形態學上具有活性的卵母細胞會呈現完整的透明帶和質膜和折光的細胞質，而死亡的卵母細胞在光學顯微鏡下則呈現退化狀態（degenerated）。對於卵母細胞活性和功能的最終標準是它們能夠被健康的精子體外和體內受精，並且接著進行是卵裂、囊胚和／或孵化或胎兒發育。（請參閱美國專利號9,538,745）
在某些實施例中，本保存組成物、方法和生物材料可以用於研究和／或臨床應用（例如：細胞療法、移植、再生醫學、診斷和遺傳測試、細胞／組織庫用於監測、毒性測試和體外受精）。
生物材料
本文中所述「生物材料」指的為細胞、細胞聚集體、組織、器官、生物流體、病毒顆粒和任何其他膜狀實體，例如：（天然的或合成的）脂質體。
本組成物（例如：穩定細胞介質）和方法可以應用於處理任何類型的細胞或組織。
在某些實施例中，細胞是指哺乳動物細胞，包括人的細胞、鼠的細胞、豬的細胞、犬的細胞、馬的細胞和牛的細胞，但不侷限於此。這些細胞可能來自瀕危或受威脅物種的哺乳動物。細胞可以來自人類或非人類哺乳動物，例如：Cercopithecoidea family、Hominoidea superfamily、Canis familiaris、Felis catus、Cricetidae spp. 、Equus spp. （例如：Equus caballus、Equus assinus）、Equidae family、Bos taurus、Bos indicus、Bovidae family、Camelidae family、Bubalus bubalis、Capra aegagrus hircus、Cervidae family、Cervinae family、Ovis aries, Ovis canadensis、Capra hircus、Sus scrofa domestica、Mesocricetus spp. 、Mustela vison、Cavia porcellus、Meriones unguiculatus、Chinchilla laniger、Rattus norvegicus、Rattus spp. 、Mus musculus、Leporidae family、Oryctolagus cuniculus、Kobus spp. 、Gallus spp. 、Meleagria gallopavo、Anatidae spp. 、Mustela putorius、Columba domestica、Columba livia、Numida meleagris、Ornithorhynchus anatinus、Pavo cristatus、Bison spp. 、Struthio spp. 、Lama glama、Rhea spp. 、Dromiceius spp. 、Lama pacos、Rangifer tarandus、Bos grunniens、Camelus bactrianus、Camelus dromedarius以及任何瀕危或受威脅的物種。
本組成物和方法可用於處理微生物、細菌、非哺乳動物細胞（例如：昆蟲細胞、禽類細胞、魚類細胞等）或植物細胞。
細胞的示例包括幹細胞、前驅細胞、胚胎、精子、卵母細胞、配子母細胞和受精卵，但不侷限於此。
細胞可以是腫瘤細胞或非腫瘤細胞。在一個實施例中，細胞是纖維母細胞。
生物材料可以包括以下任何一種：纖維母細胞、幹細胞、前驅細胞、全血或其部分、紅血球、白血球、臍帶血或其部分、臍帶血細胞、骨髓、卵母細胞、精子、卵子、胚胎、軟骨、卵巢、心臟、皮膚、腎臟、肝臟、肺臟，但不侷限於此。另外，所述生物材料可以包含細胞生物體，其可以是真核生物或原核生物，其包括：細菌和酵母等。另外，生物材料還可以包含能夠存活於冷凍保存的所有多細胞生物，例如：線蟲。血液部分可以包括血液的任何部分，其包括血球細胞（白血球和／或紅血球）、血漿和／或溶質和／或細胞成分（例如：細胞的部分，例如：血小板、降解細胞成分等）、蛋白質、脂質、抗體等。
本組成物和方法可用於治療任何類型的細胞，包括由組織和器官衍伸的細胞材料，但不侷限於此， 包括胰島細胞、軟骨細胞、神經起源細胞、肝細胞、眼睛源細胞、骨起源細胞、結締組織細胞和生殖起源細胞，以及心臟和心血管起源的細胞，但不侷限於此。
幹細胞包括成體幹細胞、胚胎幹細胞、誘導多能幹細胞（iPSC）、週邊血幹細胞、臍帶血幹細胞、間質幹細胞，源自組織和器官的幹細胞或其他來源，包括胎兒和／或 胚胎來源，以及幹細胞與其他細胞和不同來源的混合物。成人幹細胞包括：骨髓幹細胞、造血幹細胞、皮膚幹細胞、眼睛幹細胞、神經幹細胞、心臟幹細胞等。
在某些實施例中，內胚層起源的幹細胞是指肺上皮幹細胞、胃腸道幹細胞、胰腺幹細胞或肝卵圓細胞和／或其祖細胞。在特定的實施例中，泌尿生殖來源的細胞或者被分類為乳腺和前列腺幹細胞或者卵巢和睾丸幹細胞和／或其前驅細胞。在特定的實施例中，中胚層來源的細胞是骨髓細胞、造血幹細胞、間質幹細胞或心臟幹細胞和／或其前驅細胞。在特定的實施例中，外胚層來源的細胞是神經幹細胞、皮膚幹細胞或其幹細胞和／或前驅細胞。
可以使用組成物（例如：穩定細胞介質）和本揭露方法治療的細胞類型包括：例如分化的細胞（例如：成纖維細胞、上皮細胞、心肌細胞、肝細胞、神經細胞、表皮細胞、角質形成細胞 、造血細胞、黑素細胞、軟骨細胞、B細胞、T細胞、紅血球、巨噬細胞，單核細胞或肌細胞）和未分化的細胞，（例如：胚胎幹細胞、間質幹細胞或成體幹細胞）。細胞可以是單倍體、二倍體或四倍體。其他細胞包括來自膀胱、腦、食管、輸卵管、心臟、腸、膽囊、腎、肝、肺、卵巢、胰腺、前列腺、脊髓、脾、胃、睾丸、胸腺、甲狀腺、氣管、輸尿管、 尿道或子宮。
在進一步特定的實施例中，細胞是來自成人的腦、骨髓、血管、骨骼肌、皮膚、牙齒、心臟、腸、肝臟或其他成人組織。在特定的實施例中，細胞選自內胚層、泌尿生殖器、中胚層或外胚層起源。
組織包括：角膜、軟骨、骨骼、皮膚、心臟瓣膜、朗格罕氏胰島、來自人類、動物、魚類、貝類和植物的胚胎以及來自人和動物的卵巢組織。本組成物和方法也可以應用於組織工程和組織建構建。
在某些實施例中，本組成物和方法可用於輔助生殖技術中的卵母細胞或精子的治療，或用於接受化療或放療的患者。所述方法也可用於幹細胞的治療，可作為幹細胞治療、細胞移植、組織工程和再生醫學的基礎。 所述方法還可用於治療罕見的或有可能滅絕的動物的卵母細胞或精子，以供將來用於輔助生殖技術用於物種的保存。所述方法可進一步用於畜牧業中（例如：動物的繁殖和飼養），舉例來說用於處理來自動物例如牛、豬和綿羊的胚胎幹細胞、配子母細胞、卵母細胞或精子。
生物材料可用於治療各種疾病。舉例來說，在幾個實施例中，眼細胞用於治療眼病，包括但不限於年齡相關性黃斑變性（濕或乾）、糖尿病性黃斑水腫、特發性脈絡膜新血管形成或高度近視性黃斑變性。在一些眼睛治療實例中，則使用RPE細胞。在幾個實施例中，心臟幹細胞用於治療心血管疾病，例如：心肌梗塞、缺血性心臟組織損傷、充血性心力衰竭、動脈瘤、動脈粥樣硬化誘發事件、腦血管意外（中風）和冠狀動脈疾病。在幾個實施例中，肝幹細胞用於治療肝病，例如：肝炎、肝硬化、癌症等。可使用本揭露的方法和裝置進行治療其他組織中的疾病，例如：腎、肺、胰臟、腸、骨和／或軟骨以及神經組織等。在一些實施例中，取得的骨髓幹細胞可以用於重建經由白血病、癌症或其他療法所造成減少的造血細胞。
本組成物和方法也可用於各種治療方法。細胞療法通常包括進行人或動物細胞的移植以替換或修復受損的組織和／或細胞。細胞療法已被用於重建關節損傷的軟骨、修復脊髓損傷、加強免疫系統減弱、治療自身免疫性疾病，並幫助神經系統疾病，例如：阿茲海默症、帕金森症和癲癇患者。其他用途還包括治療廣泛的慢性疾病，例如：動脈硬化、先天性缺陷和性功能障礙。
細胞療法通常包括注射異種的（xenogenic）、同種的（allogenic）（來自另一個人供體）或自體的（autologous）（其中細胞被取出並移植回相同的患者）的全細胞或細胞萃取物。
病毒或病毒顆粒可以是任何病毒。在某些實施例中，病毒或病毒顆粒包含：腺病毒、腺相關病毒、逆轉錄病毒、皰疹病毒等。在某些實施例中，病毒或病毒顆粒是可用於基因治療。
套組（ Kits ）
本揭露還提供了包含所述穩定細胞介質（以本文中所述的固體或液體形式存在）或所述組成物的試劑套組。 這樣的試劑套組可以包括一個或多個含有穩定細胞介質或本組成物的容器。在一個實施例中，試劑套組包含穩定細胞介質或本組成物（其可以包含或不包含生物材料）。在一個實施例中，試劑套組包含用於本穩定細胞介質的生物材料。
在一些實施例中，試劑套組可以包含使用的說明書且應用於本文中的任何方法中。在一個實施例中，試劑套組包含生物材料的說明書，用於穩定細胞介質和方法處理。所述試劑套組可以進一步包括依據識別受試者是否需要治療來選擇適合治療的受試者的描述。在一些實施例中，說明書包括向需要治療的受試者施用所述穩定細胞介質治療的生物材料的描述。在某些實施例中，試劑套組中提供的說明書是標籤或包裝說明書上的書面說明。標籤或包裝說明書還可以是指生物材料的臨床和／或研究應用方法。
試劑套組的一部分可以同時使用或按時間順序交錯使用，例如試劑套組的任何成分可以在不同的時間點和相同或不同的時間間隔使用。可依據所期望獲得的效果來選擇時間間隔。
本文所提供的試劑套組是置於合適的包裝中。其中，合適的包裝包括小瓶（例如：冷凍管）、瓶、安瓿、管（例如：低溫管）、袋、燒瓶、罐、軟包裝等，但不侷限於此。此外還包含了與特定裝置（例如：冷凍容器、冷凍管和／或低溫管）組合使用的包裝。
試劑套組可以選擇提供額外的成分，例如：緩衝液和說明資訊（interpretive information）。 通常試劑套組包括容器和容器上或與容器相關聯的標籤或包裝插頁。在一些實施例中，本揭露提供了包含上述試劑套組的內容物的製品。
以下是本揭露的範例，但不應成為限制條件。
範例一
實驗一
明膠是從GELITA購得（明膠是由牛皮所製備而成；批號：L600217）。將明膠溶解在DMEM中而製備出含有15.7 wt%的明膠的穩定細胞介質。
將保存於具有甘油的冷凍保存組成物中的胎兒皮膚纖維母細胞（FE002-SK2）從冷凍保存環境中解凍。然後將細胞懸浮液與穩定細胞介質混合以形成混合物。
製作控制組樣本則是將存於具有甘油的冷凍保存組成物中的細胞從冷凍保存中解凍，然後將細胞懸浮液與DMEM混合以形成混合物。
穩定細胞介質（或控制組樣本的DMEM）與細胞懸浮液的體積比為12.5。使用1000 μL PIPETMANÒ 和tips抽吸混合細胞（在細胞懸浮液中）和穩定細胞介質（或控制組樣本的DMEM）。
混合物在30˚C或37˚C中培養0小時（時間為0代表沒進行培養）、2小時或4小時。每種實驗條件的樣本均二重複。全部細胞總數、活細胞數和死細胞數則使用ADAM-MC自動細胞計數器（Digital Bio）進行測定。並且透過以下方程式計算細胞活性：
如表一中所揭示，將細胞置於具有明膠的穩定細胞介質中在30℃或37℃中培養2小時或4小時後其仍保持其活性。換句話說，在30℃或37℃培養2小時或4小時後，其細胞的活性與在時間0時的活性相似。相反地，在30℃或37℃下培養2小時或4小時後，與DMEM混合的細胞的活性減少了大約48%（2小時）或56%（4小時）。這個實驗證實了含有明膠的穩定細胞介質具有保護效果。
表一
實驗二
明膠是從GELITA購得（批號L600217）。將明膠溶解在水中而製備含有15.7 wt%的明膠的穩定細胞介質。
將保存於具有甘油的冷凍保存組成物中的細胞從冷凍保存環境中解凍，然後將細胞懸浮液與穩定細胞介質混合而形成混合物。穩定細胞介質與細胞懸浮液的體積比為12.5。使用1000 μL PIPETMANÒ 和tips抽吸混合細胞（在細胞懸浮液中）和穩定細胞介質。
混合物培養於37˚C中0小時（時間0代表沒進行培養）、1小時、2小時、4小時、8小時或24小時。每種實驗條件的樣本均二重複。全部細胞總數、活細胞數和死細胞數則使用ADAM-MC自動細胞計數器（Digital Bio）進行測定。並且透過如前述之方程式計算細胞活性。
如表二中所揭示，細胞在具有明膠的穩定細胞介質中培養於37℃中達4小時（1小時、2小時或4小時）後仍保持其活性。換句話說，在37℃培養達4小時後，其細胞的活性與時間0時的活性相似。在37℃中培養8小時後，細胞活性仍然可以維持70%以上。因此本實驗驗證了具有明膠的穩定細胞介質具有保護的作用。
表二
實驗三
明膠是從GELITA購得（批號：L600217）。將明膠溶解在水中而製備出含有15.7 wt%的明膠的穩定細胞介質。
將保存於具有DMSO的冷凍保存組成物中的細胞從冷凍保存環境中解凍。然後將細胞懸浮液與穩定細胞介質混合而形成混合物。製作控制組樣本則是將保存於含有DMSO的冷凍保存組成物中的細胞從冷凍保存環境中解凍，然後將細胞懸浮液與DMEM或10% FBS／DMEM混合而形成混合物。
穩定細胞介質（或控制組樣本的DMEM）與細胞懸浮液的體積比為10。使用1000 μL PIPETMANÒ 和tips抽吸混合細胞（在細胞懸浮液中）和穩定細胞介質（DMEM或控制組樣本的10% FBS／DMEM）。
混合物在℃中培養0小時（時間0代表沒進行培養）、2小時、4小時或8小時。每種實驗條件的樣本均二重複。全部細胞總數、活細胞數和死細胞數則使用ADAM-MC自動細胞計數器（Digital Bio）進行測定。並且透過如前述之方程式計算細胞活性。
如表三中所揭示，細胞在具有明膠的穩定細胞介質中培養於25℃中2小時或4小時後仍保持其活性。換句話說，在25℃中培養2小時或4小時後，細胞的活性與時間0時的活性相似。在25℃中培養8小時後，細胞活性仍然可以維持80%以上。相反地，在25˚C中培養達8小時後，與DMEM混合的細胞的活性減少了大約13%（2小時）、21%（4小時）或32%（8小時）。相似地，在25˚C下培養達8小時後，與10% FBS／DMEM混合的細胞的活性減少了大約19%（2小時）或34%（4小時或8小時）。因此，本實驗驗證了含有明膠的穩定細胞介質具有保護效果。
表三
實驗四
明膠是從Nippi購得（明膠是由牛、豬和／或魚等所製備而成；批號：S150806）。將明膠溶解在水中而製備出含有10 wt%的明膠的穩定細胞介質。
將保存於具有甘油的冷凍保存組成物中的細胞從冷凍保存環境中解凍。然後將細胞懸浮液與穩定細胞介質混合以形成混合物。穩定細胞介質與細胞懸浮液的體積比為12.5。
與實驗一至三不同的是，在本實驗中使用帶有針頭的注射器進行抽吸混合所述細胞（在細胞懸浮液中）與穩定細胞介質。在臨床使用的設置中，一個18G的針頭與針筒連接、用來進行抽吸混合細胞與穩定細胞介質。
混合物在37℃中培養0小時（時間為0代表沒進行培養）、2小時、4小時、6小時、8小時或24小時。每種實驗條件的樣本均二重複或三重複。全部細胞總數、活細胞數和死細胞數則使用ADAM-MC自動細胞計數器（Digital Bio）進行測定。並且透過如前述之方程式計算細胞活性。
如表四中所揭示，細胞在具有明膠的穩定細胞介質中培養於37℃中達6小時（2小時、4小時或6小時）後仍保持其活性。換句話說，在37℃培養達4小時後，其細胞的活性與時間0時的活性相似。在37℃中培養8小時後，細胞活性有稍微減少的趨勢。在37˚C中培養24小時後，細胞的活性減少剩大約30%。因此，本實驗驗證了含有明膠的穩定細胞介質具有保護效果。
表四
如本文所用，「SD」代表標準差。
實驗五
明膠是從Nippi購得（批號：S150806）。將明膠溶解在水中而製備出含有10 wt%的明膠的穩定細胞介質。
將保存於具有甘油的冷凍保存組成物中的細胞從冷凍保存環境中解凍。然後將細胞懸浮液與穩定細胞介質混合以形成混合物。穩定細胞介質與細胞懸浮液的體積比為12.5。
使用帶有針頭的注射器進行抽吸混合所述細胞（在細胞懸浮液中）與穩定細胞介質。在臨床使用的設置中，一個18G的針頭與針筒連接、用來進行抽吸混合細胞與穩定細胞介質。
混合物在25℃或30℃中培養0小時（時間為0代表沒進行培養）、2小時、4小時、6小時、8小時、24小時或72小時。每種實驗條件的樣本均二重複或三重複。全部細胞總數、活細胞數和死細胞數則使用ADAM-MC自動細胞計數器（Digital Bio）進行測定。並且透過如前述之方程式計算細胞活性。
如表五中所揭示，細胞在具有明膠的穩定細胞介質中培養於25℃中達24小時（2小時、4小時、6小時、8小時或24小時）後仍保持其活性。換句話說，在25℃培養達24小時後，其細胞的活性與時間0時的活性相似。細胞在具有明膠的穩定細胞介質中培養於30℃中達8小時後（2小時、4小時、6小時或8小時）後仍保持其活性。換句話說，在30℃培養達8小時後，其細胞的活性與時間0時的活性相似。在30℃中培養24小時後，細胞活性仍然可以維持70%以上。
表五
實驗六
明膠是從Nippi購得（批號：S150806）。將明膠溶解在水中而製備出含有5 wt%的明膠的穩定細胞介質。
將保存於具有甘油的冷凍保存組成物中的細胞從冷凍保存環境中解凍。然後將細胞懸浮液與穩定細胞介質混合以形成混合物。
製作控制組樣本則是將存於具有甘油的冷凍保存組成物中的細胞從冷凍保存中解凍，然後將細胞懸浮液與DMEM混合以形成混合物。
穩定細胞介質（或控制組樣本的DMEM）與細胞懸浮液的體積比為12.5。使用1000 μL PIPETMANÒ 和tips進行抽吸混合細胞（在細胞懸浮液中）和穩定細胞介質（或控制組樣本的DMEM）。
混合物在37˚C中培養0小時（時間為0代表沒進行培養）或2小時。全部細胞總數、活細胞數和死細胞數則使用ADAM-MC自動細胞計數器（Digital Bio）進行測定。並且透過如前述之方程式計算細胞活性。
如表六中所揭示，細胞在具有明膠的穩定細胞介質中在37℃中培養2小時後其活性高於與DMEM混合的細胞。
表六
實驗七
明膠是從Nippi購得（批號：S150806）。將明膠溶解在水中而製備出含有6 wt%的明膠的穩定細胞介質。
將保存於具有甘油的冷凍保存組成物中的細胞從冷凍保存環境中解凍。然後將細胞懸浮液與穩定細胞介質混合以形成混合物。
製作控制組樣本則是將存於具有甘油的冷凍保存組成物中的細胞從冷凍保存中解凍，然後將細胞懸浮液與DMEM混合以形成混合物。
穩定細胞介質（或控制組樣本的DMEM）與細胞懸浮液的體積比為12.5。使用1000 μL PIPETMANÒ 和tips抽吸混合細胞（在細胞懸浮液中）和穩定細胞介質（或控制組樣本的DMEM）。
混合物在37˚C中培養0小時（時間為0代表沒進行培養）或2小時。全部細胞總數、活細胞數和死細胞數則使用ADAM-MC自動細胞計數器（Digital Bio）進行測定。並且透過如前述之方程式計算細胞活性。
如表七中所揭示，細胞在具有明膠的穩定細胞介質中在37℃中培養2小時後其活性高於與DMEM混合的細胞。
表七
實驗八
明膠是從Nippi購得（批號：S150806）。將明膠溶解在水中而製備出含有7.5 wt%的明膠的穩定細胞介質。
將保存於具有甘油的冷凍保存組成物中的細胞從冷凍保存環境中解凍。然後將細胞懸浮液與穩定細胞介質混合以形成混合物。
製作控制組樣本則是將存於具有甘油的冷凍保存組成物中的細胞從冷凍保存中解凍，然後將細胞懸浮液與DMEM混合以形成混合物。
穩定細胞介質（或控制組樣本的DMEM）與細胞懸浮液的體積比為12.5。使用1000 μL PIPETMANÒ 和tips抽吸混合細胞（在細胞懸浮液中）和穩定細胞介質（或控制組樣本的DMEM）。
混合物在37˚C中培養0小時（時間為0代表沒進行培養）或2小時。全部細胞總數、活細胞數和死細胞數則使用ADAM-MC自動細胞計數器（Digital Bio）進行測定。並且透過如前述之方程式計算細胞活性。
如表八中所揭示，細胞在具有明膠的穩定細胞介質中在37℃中培養2小時後其活性高於與DMEM混合的細胞。
表八
實驗九
明膠是從GELITA購得（批號：L600217）。將明膠溶解在水中而製備出含有15.7 wt%的明膠的穩定細胞介質。
將保存於具有甘油的冷凍保存組成物中的細胞從冷凍保存環境中解凍。然後將細胞懸浮液與穩定細胞介質混合而形成混合物。
穩定細胞介質與細胞懸浮液的體積比為6.25。使用1000 μL PIPETMANÒ 和tips抽吸混合細胞（在細胞懸浮液中）和穩定細胞介質。
混合物在27℃或37℃中培養0小時（時間0代表沒進行培養）、2小時或4小時。每種實驗條件的樣本均二重複。全部細胞總數、活細胞數和死細胞數則使用ADAM-MC自動細胞計數器（Digital Bio）進行測定。並且透過如前述之方程式計算細胞活性。
如表九中所揭示，細胞在具有明膠的穩定細胞介質中在27℃或37℃中培養2小時或4小時後仍保持其活性。換句話說，在27℃或37℃中培養2小時或4小時後，細胞的活性與時間0時的活性相似。
表九
實驗十
明膠是從GELITA購得（批號：L600217）。將明膠溶解在水中而製備出含有15.7 wt%的明膠的穩定細胞介質。
將保存於具有甘油的冷凍保存組成物中的細胞從冷凍保存環境中解凍。然後將細胞懸浮液與穩定細胞介質混合而形成混合物。穩定細胞介質與細胞懸浮液的體積比為12.5。
使用帶有針頭的注射器進行抽吸混合所述細胞（在細胞懸浮液中）與穩定細胞介質。在臨床使用的設置中，一個18G的針頭與針筒連接、用來進行抽吸混合細胞與穩定細胞介質。
混合物在23℃、27℃或30℃中培養0小時（時間為0代表沒進行培養）、1小時或2小時。每種實驗條件的樣本均二重複。全部細胞總數、活細胞數和死細胞數則使用ADAM-MC自動細胞計數器（Digital Bio）進行測定。並且透過如前述之方程式計算細胞活性（所得出相對應細胞活性則如表十中所揭示）。
表十
範例二：明膠濃度和溫度對細胞活性的影響
相關實驗條件如表十一中所揭示。
表十一
首先先製備含有1 wt%、3 wt%或17 wt%明膠的穩定細胞介質。並且將穩定細胞介質置於37℃水浴槽中以確保在與細胞混合之前轉變成液相。
將細胞增殖、收取並冷凍保存。於實驗前，解凍3〜5個冷凍管的胎兒皮膚纖維母細胞（FE002-SK2細胞；第12代（P12））。每個冷凍管在0.4mL中含有3×106 個細胞。最後將所有3〜5個冷凍管的細胞混合。
製備DMEM組別：
（1）5倍稀釋組：將20 μL的細胞與80 μL的DMEM（細胞5倍稀釋）混合。計數解凍後細胞的數量。
（2）12.5倍稀釋組：將20 μL的細胞與230 μL的DMEM（細胞12.5倍稀釋）混合。計數解凍後細胞的數量。
製備穩定細胞介質（包含明膠）組別：
（1）5倍稀釋組，37℃ ：將200 μL的細胞與800 μL的穩定細胞介質（明膠溶液）加入至1.5 mL微量離心管（Eppendorf tube）中進行混合。在時間0時分析細胞活性。將剩餘的測試樣本培養於37℃的水浴槽中。在時間點:2小時後(T2)、4小時後(T4)和8小時後(T8)再次分析細胞活性。
（2）12.5倍稀釋組，37℃ ：將200 μL的細胞與2300 μL的明膠溶液加入至15 mL離心管中進行混合。在時間0時分析細胞活性。將剩餘的測試樣本培養於37℃的水浴槽中。在時間點:2小時後(T2)、4小時後(T4)和8小時後(T8)分析細胞活性。
相似地，5倍稀釋組和12.5倍稀釋組中的細胞於25℃中的細胞活性也一併進行檢測。
表十二：細胞在使用不同倍數（5倍和12.5倍）稀釋的明膠溶液中並且在25℃中培養後的細胞活性
表十三：細胞在使用不同倍數（5倍和12.5倍）稀釋的明膠溶液中並且在37℃中培養後的細胞活性
表十四：細胞在使用5倍稀釋的明膠溶液中並且在25℃中培養後的細胞活性（原始資料）
表十五：細胞在使用12.5 倍稀釋的明膠溶液中並且在25℃中培養後的細胞活性（原始資料）
表十六：細胞在使用5倍稀釋的明膠溶液中並且在37℃中培養後的細胞活性（原始資料）
表十七：細胞在使用12.5 倍稀釋的明膠溶液中並且在37℃中培養後的細胞活性（原始資料）
討論
由結果中顯示與DMEM組別相比之下，當細胞與包含1 wt%、3 wt%或17 wt%明膠的穩定細胞介質一起培養時，其解凍後的細胞活性較高。在25℃或37℃下，穩定細胞介質5倍稀釋組中的細胞比穩定細胞介質12.5 倍稀釋組中的細胞具有較高和更長久的細胞活性。
範例三：明膠使用濃度（ working concentrations ）對細胞活性的影響
表18和圖1〜9（依據範例1中的實驗1〜10和範例2的數據）中揭示了明膠的使用 濃度對細胞活性的影響。
表十八
範例四：比較以明膠為主要成分的溶液和其他溶液之間在解凍後維持細胞活性的差異
材料
ADAM Accuchip和ADAM溶液均從NanoEnTek購得。DMEM和胎牛血清（FBS）則從Gibco購得。牛血清白蛋白則從Sigma購得。
測試溶液（穩定細胞介質、DMEM或FBS）包括：
A溶液（Solution A）：DMEM
B溶液（Solution B）：DMEM中含有10 wt%明膠
C溶液（Solution C）：DMEM中含有5 wt%白蛋白
D溶液（Solution D）：DMEM中含有10 wt%白蛋白
E溶液（Solution E）：DMEM中含有15.7 wt%白蛋白
F溶液（Solution F）：FBS
細胞濃度7.5 x 106 cells/mL的纖維母細胞（FE002-SK2）冷凍於含有甘油的冷凍保存組成物中。
1150 μL的各測試A〜F溶液分別置於2 mL的微量離心管，此外每種溶液均準備三個微量離心管。
冷凍保存的纖維母細胞在37℃水浴槽中進行解凍。並且將所有的細胞懸浮液混合於一個管中。再來，向每個含有1150μL測試溶液的微量離心管中加入100μL解凍的細胞懸浮液以形成混合物。其中，測試溶液（穩定細胞介質、DMEM或FBS）與細胞懸液的體積比為11.5。
混合物在37℃中培養2小時。每種實驗條件的樣本均三重複。使用ADAM-MC自動細胞計數器（Digital Bio）測定細胞總數、活細胞數和死細胞數。 通過下式計算細胞活性：。
如表十九中所揭示，在37℃中培養2小時後，細胞在含有明膠的穩定細胞介質中的活性為大約77.3％。細胞在包含5 wt%、10 wt%或15.7 wt%白蛋白的穩定細胞介質中的活性分別為大約48.7%、49.7%和60.7%。因此，明膠為主要成分的溶液能夠比其他測試溶液具有更佳維持解凍細胞活性的能力。
表十九：細胞與各種測試溶液混合後的活性
本專利申請的範圍不受上述具體示例以及描述之限制。所屬領域之技術人員可以識別出針對於所述材料、形狀、結構和尺寸的示例的合適替代方案。在本揭露中引用和討論了許多參考文獻，包括專利和各種出版物。而所述參考文獻的引用和討論僅僅是為了闡明本揭露的描述，而不是承認任何參考文獻是構成本揭露的現有技術。在本說明書中引用和討論的所有參考文獻通過引用整體併入本文。在不脫離本揭露的精神和範圍的情況下，所屬領域之技術人員可以理解在此描述的變型、修改和其他實施方式。儘管已經揭示和描述了本揭露的某些實施例，但是對於所屬領域之具有通常知識者來說顯而易見的是，可以在不脫離本發明的精神和範圍的情況下進行改變和修改。在前面的描述中提出的內容僅作為說明而不是作為限制。
無
圖1揭示了明膠濃度、培養溫度、時間三者對解凍後細胞活性的影響。在實驗中，細胞一開始冷凍於以甘油為主（glycerol-based）的冷凍溶液中。將解凍的細胞懸浮液（在冷凍溶液中）和含有明膠的穩定細胞介質混合。將混合物在25℃下培養2小時，然後檢測解凍後的細胞活性。
圖2揭示了明膠濃度、培養溫度、時間三者對解凍後細胞活性的影響。在實驗中，細胞一開始冷凍於以甘油為主的冷凍溶液中。將解凍的細胞懸浮液（在冷凍溶液中）和含有明膠的穩定細胞介質混合。將混合物在25℃下培養4小時，然後檢測解凍後的細胞活性。
圖3揭示了明膠濃度、培養溫度、時間三者對解凍後細胞活性的影響。在實驗中，細胞一開始冷凍於以甘油為主的冷凍溶液中。將解凍的細胞懸浮液（在冷凍溶液中）和含有明膠的穩定細胞介質混合。而在控制組中，則是將解凍的細胞懸浮液（在冷凍溶液中）和DMEM混合。將混合物在30℃下培養2小時，然後檢測解凍後的細胞活性。
圖4揭示了明膠濃度、培養溫度、時間三者對解凍後細胞活性的影響。在實驗中，細胞一開始冷凍於以甘油為主的冷凍溶液中。將解凍的細胞懸浮液（在冷凍溶液中）和含有明膠的穩定細胞介質混合。而在控制組中，則是將解凍的細胞懸浮液（在冷凍溶液中）和DMEM混合。將混合物在30℃下培養4小時，然後檢測解凍後的細胞活性。
圖5揭示了明膠濃度、培養溫度、時間三者對解凍後細胞活性的影響。在實驗中，細胞一開始冷凍於以甘油為主的冷凍溶液中。將解凍的細胞懸浮液（在冷凍溶液中）和含有明膠的穩定細胞介質混合。將混合物在27℃下培養2小時，然後檢測解凍後的細胞活性。
圖6揭示了明膠濃度、培養溫度、時間三者對解凍後細胞活性的影響。在實驗中，細胞一開始冷凍於以甘油為主的冷凍溶液中。將解凍的細胞懸浮液（在冷凍溶液中）和含有明膠的穩定細胞介質混合。而在控制組中，則是將解凍的細胞懸浮液（在冷凍溶液中）和DMEM混合。將混合物在37℃下培養2小時，然後檢測解凍後的細胞活性。
圖7揭示了明膠濃度、培養溫度、時間三者對解凍後細胞活性的影響。在實驗中，細胞一開始冷凍於以甘油為主的冷凍溶液中。將解凍的細胞懸浮液（在冷凍溶液中）和含有明膠的穩定細胞介質混合。而在控制組中，則是將解凍的細胞懸浮液（在冷凍溶液中）和DMEM混合。將混合物在37℃下培養4小時，然後檢測解凍後的細胞活性。
圖8揭示了明膠濃度和培養時間二者對解凍後細胞活性的影響。在實驗中，細胞一開始冷凍於以甘油為主的冷凍溶液中。將解凍的細胞懸浮液（在冷凍溶液中）和含有明膠的穩定細胞介質混合。而在控制組中，則是將解凍的細胞懸浮液（在冷凍溶液中）和DMEM混合。將混合物培養在37℃下，然後檢測解凍後的細胞活性。
圖9揭示了明膠和培養時間二者對解凍後細胞活性的影響。在實驗中，細胞一開始冷凍於以二甲基亞碸（DMSO）為主的冷凍溶液中。將解凍的細胞懸浮液（在冷凍溶液中）和含有明膠的穩定細胞介質混合。而在控制組中，則是將解凍的細胞懸浮液（在冷凍溶液中）和DMEM或10% FBS/DMEM混合。將混合物培養在25℃下，然後檢測解凍後的細胞活性。
無

Claims (34)

  1. 一種用於維持細胞活性的方法，其包含：將一個或多個細胞與穩定細胞介質混合而形成混合物於20~39℃，其中所述穩定細胞介質包含明膠，並且所述混合物中所述明膠的濃度為相對於所述混合物總重0.8~15.7wt%，其中，所述混合之前所述一個或多個細胞是在已解凍狀態的冷凍保存組成物中。
  2. 如請求項1所述之方法，其中所述混合物包含相對於所述混合物總重2.4~14.6wt%的明膠。
  3. 如請求項1所述之方法，其中所述混合物包含相對於所述混合物總重5~10wt%的明膠。
  4. 如請求項1所述之方法，於所述混合步驟之前，所述一個或多個細胞是被置於所述冷凍保存組成物中的細胞懸浮液中。
  5. 如請求項4所述之方法，其中所述穩定細胞介質與細胞懸浮液的體積比範圍4~12.5。
  6. 如請求項4所述之方法，其中所述穩定細胞介質與細胞懸浮液的體積比範圍為3~15。
  7. 如請求項4所述之方法，其中所述一個或多個細胞於細胞懸浮液中的濃度為7.5 x 105~7.5 x 107cells/ml。
  8. 如請求項1所述之方法，其中所述冷凍保存狀態的溫度範圍為-70~-200℃。
  9. 如請求項1所述之方法，其中所述一個或多個細胞解凍後的活性至少70%。
  10. 如請求項1所述之方法，其中所述一個或多個細胞解凍後的活性至少80%。
  11. 如請求項1所述之方法，其中所述冷凍保存組成物包含：甘油、二甲基亞碸(DMSO)和/或聚乙二醇(PEG)。
  12. 如請求項1所述之方法，於混合步驟之前，其中還包含將所述穩定細胞介質的溫度保持於25~37℃。
  13. 如請求項1所述之方法，其中所述明膠具有平均分子質量100~200kD。
  14. 如請求項1所述之方法，其中所述明膠包含變性的膠原蛋白。
  15. 如請求項1所述之方法，其中所述穩定細胞介質是具有狀健值(bloom value)190~325的熱可逆水膠。
  16. 如請求項1所述之方法，其中所述一個或多個細胞是哺乳動物細胞。
  17. 如請求項1所述之方法，其中所述一個或多個細胞是人的、豬的、狗的、馬的或牛的細胞。
  18. 如請求項1所述之方法，其中所述一個或多個細胞包含腫瘤細胞。
  19. 如請求項1所述之方法，其中所述一個或多個細胞包含纖維母細胞。
  20. 如請求項1所述之方法，其中所述一個或多個細胞包含幹細胞。
  21. 如請求項1所述之方法，其中所述混合物中所述一個或多個細胞的濃度為105~107cells/ml。
  22. 如請求項1所述之方法，其中所述穩定細胞介質還包含胺基酸、細胞激素、脂質、生長因子、抗生素、抗霉菌素、類固醇、賀爾蒙蛋白或以上任意之組合。
  23. 一種用於維持細胞活性的組成物，其包含：冷凍保存組成物，其包含一個或多個細胞，其中所述冷凍保存組成物是在已解凍的狀態下；以及明膠，其濃度為相對於所述組成物總重0.8~15.7wt%，其中所述組成物的溫度為20~39℃。
  24. 如請求項23所述之組成物，其中所述明膠含量為相對於所述組成物總重2.4~14.6wt%。
  25. 如請求項23所述之組成物，其中所述明膠含量為相對於所述組成物總重5~10wt%。
  26. 如請求項23所述之組成物，其中所述一個或多個細胞解凍後的活性至少70%。
  27. 如請求項23所述之組成物，其中所述明膠具有平均分子質量100~200kD。
  28. 如請求項23所述之組成物，其中所述明膠包含變性的膠原蛋白。
  29. 如請求項23所述之組成物，其中所述一個或多個細胞是哺乳動物細胞。
  30. 如請求項23所述之組成物，其中所述一個或多個細胞是人的、豬的、狗的、馬的或牛的細胞。
  31. 如請求項23所述之組成物，其中所述一個或多個細胞包含腫瘤細胞。
  32. 如請求項23所述之組成物，其中所述一個或多個細胞包含纖維母細胞。
  33. 如請求項23所述之組成物，其中所述一個或多個細胞包含幹細胞。
  34. 一種用於維持細胞活性的試劑套組，其包含如請求項23~33中任一項所述之組成物。
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