CN104630132B - 一种培养Marc‑145细胞用的培养基及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种培养Marc‑145细胞用的培养基，其由如下成分组成：DMEM、酶解明胶溶液、氨基酸DMEM溶液和胎牛血清；所述DMEM、酶解明胶溶液、氨基酸DMEM溶液和胎牛血清的体积比为：酶解明胶溶液：氨基酸DMEM溶液：胎牛血清：DMEM＝1‑2:1‑5:2‑5:100。本发明还提供该培养基的制备方法：根据配方的体积比分别量取DMEM、酶解明胶溶液、氨基酸DMEM溶液和胎牛血清，混合，得到培养基。本发明的培养Marc‑145细胞用的培养基，能够大幅降低Marc‑145细胞培养过程中牛血清的使用量，降低了生产成本，同时制备方法简单、易操作。

Description

一种培养Marc-145细胞用的培养基及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种培养基及其制备方法，具体涉及一种培养Marc-145细胞用的培养基及其制备方法。
背景技术
猪蓝耳病又称“猪繁殖与呼吸障碍综合征”，是由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒引起，以成年猪生殖障碍、早产、流产和死胎，以及仔猪呼吸异常为特征的传染病，是一种免疫抑制病，常常继发其他病原感染。我国高致病性蓝耳病的预防采用弱毒疫苗或者灭活疫苗进行预防。在高致病性蓝耳病病毒的灭活疫苗或者活疫苗生产过程需要培养Marc-145细胞。
现有的Marc-145细胞培养过程中，通常需要加入8-10％的牛血清进行培养，加入的牛血清较少，则会使得Marc-145细胞的生长繁殖速度过慢。如公开号为CN102002482A的发明专利申请文件，公开了一种猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒的生产方法，其中公开了细胞生长液的配方：体积百分含量为90-92％的DMEM溶液、8-10％的牛血清、1％的双抗、1％的谷氨酰胺；公开号为CN101748101A的发明专利申请文件，公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的生产方法，其中公开了生长液为添加10％新生牛血清的DMEM培养液。胎牛血清价格较贵，在Marc-145细胞培养基中须要加入较多的量，使得疫苗生产成本变高，给生产企业和消费者增加了负担。
发明内容
本发明的目的在于提供一种牛血清用量少、Marc-145细胞生长繁殖速度快的培养Marc-145细胞用的培养基及其制备方法。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种培养Marc-145细胞用的培养基，其由如下成分组成：DMEM、酶解明胶溶液、氨基酸DMEM溶液和胎牛血清；所述DMEM、酶解明胶溶液、氨基酸DMEM溶液和胎牛血清的体积比为：酶解明胶溶液：氨基酸DMEM溶液：胎牛血清：DMEM＝1-2:1-5:2-5:100；
所述酶解明胶溶液中的蛋白质浓度为20-80mg/ml，所述酶解明胶溶液中的溶剂为PBS溶液；
所述氨基酸DMEM溶液中的溶剂为DMEM，溶质由按照质量体积比计(此处的质量体积比是指溶质的组分质量与氨基酸DMEM溶液体积之比)的如下组分组成：丙氨酸5-35mg/L、精氨酸10-60mg/L、天门冬酰胺5-25mg/L、天冬氨酸15-80mg/L、胱氨酸5-30mg/L、谷氨酸50-100mg/L、谷氨酰胺40-80mg/L、甘氨酸5-20mg/L、组氨酸5-10mg/L、异亮氨酸5-15mg/L、亮氨酸10-20mg/L、赖氨酸10-25mg/L、甲硫氨酸10-30mg/L、苯丙氨酸5-20mg/L、脯氨酸10-40mg/L、丝氨酸10-30mg/L、苏氨酸10-40mg/L、色氨酸5-80mg/L、酪氨酸10-50mg/L、缬氨酸10-20mg/L、羟基脯氨酸5-10mg/L、高半胱氨酸2-10mg/L和牛磺酸5-15mg/L。
本发明中，优选的方案为所述酶解明胶溶液为胰酶酶解明胶溶液，所述PBS溶液用超纯水配制而成。
本发明中，优选的方案为所述DMEM、酶解明胶溶液、氨基酸DMEM溶液和胎牛血清的体积比为：酶解明胶溶液：氨基酸DMEM溶液：胎牛血清：DMEM＝1-2:1-5:2-3:100。
本发明中，优选的方案为所述DMEM、酶解明胶溶液、氨基酸DMEM溶液和胎牛血清的体积比为：酶解明胶溶液：氨基酸DMEM溶液：胎牛血清：DMEM＝1:2:2-5:100；
所述氨基酸DMEM溶液中的溶质由按照质量体积比计的如下组分：丙氨酸5mg/L、精氨酸10mg/L、天门冬酰胺5mg/L、天冬氨酸15mg/L、胱氨酸5mg/L、谷氨酸50mg/L、谷氨酰胺40mg/L、甘氨酸5mg/L、组氨酸5mg/L、异亮氨酸5mg/L、亮氨酸10mg/L、赖氨酸10mg/L、甲硫氨酸10mg/L、苯丙氨酸5mg/L、脯氨酸10mg/L、丝氨酸10mg/L、苏氨酸10mg/L、色氨酸5mg/L、酪氨酸10mg/L、缬氨酸10mg/L、羟基脯氨酸5mg/L、高半胱氨酸2mg/L和牛磺酸5mg/L。
本发明中，优选的方案为所述DMEM、酶解明胶溶液、氨基酸DMEM溶液和胎牛血清的体积比为：酶解明胶溶液：氨基酸DMEM溶液：胎牛血清：DMEM＝1:2:2-5:100；
所述氨基酸DMEM溶液中的溶质由按照质量体积比计的如下组分：丙氨酸8mg/L、精氨酸12mg/L、天门冬酰胺9mg/L、天冬氨酸20mg/L、胱氨酸7mg/L、谷氨酸60mg/L、谷氨酰胺50mg/L、甘氨酸10mg/L、组氨酸8mg/L、异亮氨酸8mg/L、亮氨酸12mg/L、赖氨酸12mg/L、甲硫氨酸15mg/L、苯丙氨酸6mg/L、脯氨酸10mg/L、丝氨酸10mg/L、苏氨酸10mg/L、色氨酸5mg/L、酪氨酸13mg/L、缬氨酸10mg/L、羟基脯氨酸6mg/L、高半胱氨酸5mg/L和牛磺酸6mg/L。
本发明还提供该培养Marc-145细胞用的培养基的制备方法：根据配方的体积比分别量取DMEM、酶解明胶溶液、氨基酸DMEM溶液和胎牛血清，混合，得到培养基。
本发明中，优选的方案为所述氨基酸DMEM溶液由如下方法制成：取配方量的丙氨酸、精氨酸、天门冬酰胺、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、羟基脯氨酸、高半胱氨酸、牛磺酸，然后溶解在配方量的DMEM溶液中，得到氨基酸DMEM溶液。
本发明中，优选的方案为所述酶解明胶溶液由如下步骤制备：
a：将明胶溶解在PBS溶液中，得到明胶PBS溶液，所述明胶PBS溶液的质量体积浓度为25-600mg/ml；
b：将a步骤得到的明胶PBS溶液进行湿热高压灭菌处理，所述湿热高压灭菌处理的温度为121℃、压力为103.4KPa、时间为20min；
c：将经过b步骤处理的明胶PBS溶液冷却至常温，加入质量百分浓度为0.25％的胰酶溶液(本发明中的胰酶溶液，是指胰酶加入无Ca2+、Mg2+的D-Hanks’平衡盐溶液中配制而成的溶液)，在37℃温度下酶解8-24h，重复该操作1-3次；
d：将经过c步骤处理明胶PBS溶液冷却至2-8℃，如出现凝固现象，则重复c步骤，直至在2-8℃时无凝固现象出现，得到酶解明胶溶液。
本发明中，优选的方案为所述c步骤中每次加入的胰酶溶液与明胶PBS溶液的体积比为1:9-10。
本发明中，优选的方案为所述c步骤中酶解的时间为24h，所述c步骤中重复操作的次数为2-3次。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明的培养Marc-145细胞用的DMEM中通过加入酶解明胶溶液和氨基酸DMEM溶液，使得培养Marc-145细胞用的牛血清用量降至2-5％，大幅减少了牛血清的用量，降低了生产成本；牛血清用量的减少，降低了后续病毒的纯化带来分离难度；此外，本发明的制备方法简单、易操作，便于实现大规模生产的需要。
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
具体实施方式
实施例1
一种培养Marc-145细胞用的培养基，其由如下成分组成：DMEM、酶解明胶溶液、氨基酸DMEM溶液和胎牛血清；所述DMEM、酶解明胶溶液、氨基酸DMEM溶液和胎牛血清的体积比为：酶解明胶溶液：氨基酸DMEM溶液：胎牛血清：DMEM＝1:2:X:100；
所述酶解明胶溶液为胰酶酶解明胶溶液，所述PBS溶液用超纯水配制而成；所述酶解明胶溶液中的蛋白质浓度为50mg/ml，所述酶解明胶溶液中的溶剂为PBS溶液；
所述氨基酸DMEM溶液中的溶剂为DMEM，溶质由按照质量体积比计的如下组分组成：丙氨酸5mg/L、精氨酸10mg/L、天门冬酰胺5mg/L、天冬氨酸15mg/L、胱氨酸5mg/L、谷氨酸50mg/L、谷氨酰胺40mg/L、甘氨酸5mg/L、组氨酸5mg/L、异亮氨酸5mg/L、亮氨酸10mg/L、赖氨酸10mg/L、甲硫氨酸10mg/L、苯丙氨酸5mg/L、脯氨酸10mg/L、丝氨酸10mg/L、苏氨酸10mg/L、色氨酸5mg/L、酪氨酸10mg/L、缬氨酸10mg/L、羟基脯氨酸5mg/L、高半胱氨酸2mg/L和牛磺酸5mg/L。
该培养Marc-145细胞用的培养基由如下方法制备：根据配方的体积比分别量取DMEM、酶解明胶溶液、氨基酸DMEM溶液和胎牛血清，混合，得到培养基；
所述氨基酸DMEM溶液由如下方法制成：取配方量的丙氨酸、精氨酸、天门冬酰胺、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、羟基脯氨酸、高半胱氨酸、牛磺酸，然后溶解在配方量的DMEM溶液中，得到氨基酸DMEM溶液；
所述酶解明胶溶液由如下步骤制备：
a：将5g明胶溶解在90ml的PBS溶液中，得到明胶PBS溶液；
b：将a步骤得到的明胶PBS溶液进行湿热高压灭菌处理，所述湿热高压灭菌处理的温度为121℃、压力为103.4KPa、时间为20min；
c：将经过b步骤处理的明胶PBS溶液冷却至常温，加入10ml质量百分浓度为0.25％的胰酶溶液，在37℃温度下酶解24h，重复该操作2次；
d：将经过c步骤处理明胶PBS溶液冷却至2℃(无凝固现象出现)，得到酶解明胶溶液。
本实施例中，分别对DMEM、酶解明胶溶液、氨基酸DMEM溶液和胎牛血清的体积比为：酶解明胶溶液：氨基酸DMEM溶液：胎牛血清：DMEM＝1:2:X:100中的X取0.5、1、2、3、4、5，分别编为第二组至第七组，然后取不加胎牛血清，其余成分均匀本申请相同的，编为第一组；取不添加本实施例中的酶解明胶溶液和氨基酸DMEM溶液的培养基，其中加入的胎牛血清与DMEM溶液的比例分别为10:100、8:100、5:100、7:100，分别编为对照组一至对照组四；Marc-145细胞按照1：3的比例进行传代，分别在培养过程中的3h、1d、2d、3d进行观察细胞生长状况，具体情况详见表1：
表1：Marc-145细胞生长状况表
表1中，“-”表示：Marc-145细胞不贴壁，不生长；“+”表示：Marc-145细胞95％以上的细胞已经贴壁，但是不生长；“++”表示：Marc-145细胞出现生长分裂的情况，分裂的细胞较少，细胞瓶中约50-60％面积没有细胞；“+++”表示：Marc-145细胞生长分裂状况良好，细胞瓶中约20-30％面积没有细胞；“++++”表示：Marc-145细胞生长分裂状况良好，细胞瓶中约1-3％面积没有细胞，且细胞已经生长致密。
实施例2
一种培养Marc-145细胞用的培养基，其由如下成分组成：DMEM、酶解明胶溶液、氨基酸DMEM溶液和胎牛血清；所述DMEM、酶解明胶溶液、氨基酸DMEM溶液和胎牛血清的体积比为：酶解明胶溶液：氨基酸DMEM溶液：胎牛血清：DMEM＝1:2:Y:100；所述酶解明胶溶液为胰酶酶解明胶溶液，所述PBS溶液用超纯水配制而成；所述酶解明胶溶液中的蛋白质浓度为70mg/ml，所述酶解明胶溶液中的溶剂为PBS溶液；
所述氨基酸DMEM溶液中的溶剂为DMEM，溶质由按照质量体积比计的如下组分组成：丙氨酸8mg/L、精氨酸12mg/L、天门冬酰胺9mg/L、天冬氨酸20mg/L、胱氨酸7mg/L、谷氨酸60mg/L、谷氨酰胺50mg/L、甘氨酸10mg/L、组氨酸8mg/L、异亮氨酸8mg/L、亮氨酸12mg/L、赖氨酸12mg/L、甲硫氨酸15mg/L、苯丙氨酸6mg/L、脯氨酸10mg/L、丝氨酸10mg/L、苏氨酸10mg/L、色氨酸5mg/L、酪氨酸13mg/L、缬氨酸10mg/L、羟基脯氨酸6mg/L、高半胱氨酸5mg/L和牛磺酸6mg/L。
本发明还提供该培养Marc-145细胞用的培养基的制备方法：根据配方的体积比分别量取DMEM、酶解明胶溶液、氨基酸DMEM溶液和胎牛血清，混合，得到培养基；
所述氨基酸DMEM溶液由如下方法制成：取配方量的丙氨酸、精氨酸、天门冬酰胺、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、羟基脯氨酸、高半胱氨酸、牛磺酸，然后溶解在配方量的DMEM溶液中，得到氨基酸DMEM溶液；
所述酶解明胶溶液由如下步骤制备：
a：将10g明胶溶解在100ml的PBS溶液中，得到明胶PBS溶液；
b：将a步骤得到的明胶PBS溶液进行湿热高压灭菌处理，所述湿热高压灭菌处理的温度为121℃、压力为103.4KPa、时间为20min；
c：将经过b步骤处理的明胶PBS溶液冷却至常温，加入10ml质量百分浓度为0.25％的胰酶溶液，在37℃温度下酶解24h，重复该操作3次；
d：将经过c步骤处理明胶PBS溶液冷却至5℃(未出现凝固现象)，得到酶解明胶溶液。
本实施例中，分别对DMEM、酶解明胶溶液、氨基酸DMEM溶液和胎牛血清的体积比为：酶解明胶溶液：氨基酸DMEM溶液：胎牛血清：DMEM＝1:2:Y:100中的Y分别取0.5、1、2、3、4、5，分别编为第二组至第七组，然后取不加胎牛血清，其余成分均匀本申请相同的，编为第一组；取不添加本实施例中的酶解明胶溶液和氨基酸DMEM溶液的培养基，其中加入的胎牛血清与DMEM溶液的比例分别为10:100、8:100、5:100、6:100，分别编为对照组一至对照组四；Marc-145细胞按照1：3的比例进行传代，分别在培养过程中的3h、1d、2d、3d进行观察细胞生长状况，具体情况详见表2：
表2：Marc-145细胞生长状况表
表1中，“-”表示：Marc-145细胞不贴壁，不生长；“+”表示：Marc-145细胞95％以上的细胞已经贴壁，但是不生长；“++”表示：Marc-145细胞出现生长分裂的情况，分裂的细胞较少，细胞瓶中约50-60％面积没有细胞；“+++”表示：Marc-145细胞生长分裂状况良好，细胞瓶中约20-30％面积没有细胞；“++++”表示：Marc-145细胞生长分裂状况良好，细胞瓶中约1-3％面积没有细胞，且细胞已经生长致密。
实施例3
一种培养Marc-145细胞用的培养基，其由如下成分组成：DMEM、酶解明胶溶液、氨基酸DMEM溶液和胎牛血清；所述DMEM、酶解明胶溶液、氨基酸DMEM溶液和胎牛血清的体积比为：酶解明胶溶液：氨基酸DMEM溶液：胎牛血清：DMEM＝2:5:Z:100；所述酶解明胶溶液中的蛋白质浓度为20mg/ml，所述酶解明胶溶液中的溶剂为PBS溶液；所述酶解明胶溶液为胰酶酶解明胶溶液，所述PBS溶液用超纯水配制而成；
所述氨基酸DMEM溶液中的溶剂为DMEM，溶质由按照质量体积比计的如下组分组成：丙氨酸35mg/L、精氨酸60mg/L、天门冬酰胺25mg/L、天冬氨酸80mg/L、胱氨酸30mg/L、谷氨酸100mg/L、谷氨酰胺80mg/L、甘氨酸20mg/L、组氨酸10mg/L、异亮氨酸15mg/L、亮氨酸20mg/L、赖氨酸25mg/L、甲硫氨酸30mg/L、苯丙氨酸20mg/L、脯氨酸40mg/L、丝氨酸30mg/L、苏氨酸40mg/L、色氨酸80mg/L、酪氨酸50mg/L、缬氨酸20mg/L、羟基脯氨酸10mg/L、高半胱氨酸10mg/L和牛磺酸15mg/L。
本发明还提供该培养Marc-145细胞用的培养基的制备方法：根据配方的体积比分别量取DMEM、酶解明胶溶液、氨基酸DMEM溶液和胎牛血清，混合，得到培养基；
所述氨基酸DMEM溶液由如下方法制成：取配方量的丙氨酸、精氨酸、天门冬酰胺、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、羟基脯氨酸、高半胱氨酸、牛磺酸，然后溶解在配方量的DMEM溶液中，得到氨基酸DMEM溶液；
所述酶解明胶溶液由如下步骤制备：
a：将5g明胶溶解在200ml的PBS溶液中，得到明胶PBS溶液；
b：将a步骤得到的明胶PBS溶液进行湿热高压灭菌处理，所述湿热高压灭菌处理的温度为121℃、压力为103.4KPa、时间为20min；
c：将经过b步骤处理的明胶PBS溶液冷却至常温，加入质量百分浓度为0.25％的胰酶溶液，在37℃温度下酶解8h，重复该操作3次；
d：将经过c步骤处理明胶PBS溶液冷却至2℃，出现凝固现象，则重复c步骤1次，冷却至2℃时无凝固现象出现，得到酶解明胶溶液。
本实施例中，分别对DMEM、酶解明胶溶液、氨基酸DMEM溶液和胎牛血清的体积比为：酶解明胶溶液：氨基酸DMEM溶液：胎牛血清：DMEM＝2:5:Z:100中的Z分别取0.5、1、2、3、4、5，分别编为第二组至第七组，然后取不加胎牛血清，其余成分均匀本申请相同的，编为第一组；取不添加本实施例中的酶解明胶溶液和氨基酸DMEM溶液的培养基，其中加入的胎牛血清与DMEM溶液的比例分别为10:100、8:100、5:100、6:100，分别编为对照组一至对照组四；Marc-145细胞按照1：3的比例进行传代，分别在培养过程中的3h、1d、2d、3d进行观察细胞生长状况，具体情况详见表3：
表3：Marc-145细胞生长状况表
表1中，“-”表示：Marc-145细胞不贴壁，不生长；“+”表示：Marc-145细胞95％以上的细胞已经贴壁，但是不生长；“++”表示：Marc-145细胞出现生长分裂的情况，分裂的细胞较少，细胞瓶中约50-60％面积没有细胞；“+++”表示：Marc-145细胞生长分裂状况良好，细胞瓶中约20-30％面积没有细胞；“++++”表示：Marc-145细胞生长分裂状况良好，细胞瓶中约1-3％面积没有细胞，且细胞已经生长致密。
实施例4
一种培养Marc-145细胞用的培养基，其由如下成分组成：DMEM、酶解明胶溶液、氨基酸DMEM溶液和胎牛血清；所述DMEM、酶解明胶溶液、氨基酸DMEM溶液和胎牛血清的体积比为：酶解明胶溶液：氨基酸DMEM溶液：胎牛血清：DMEM＝1.5:3:M:100；所述酶解明胶溶液中的蛋白质浓度为80mg/ml，所述酶解明胶溶液中的溶剂为PBS溶液；所述酶解明胶溶液为胰酶酶解明胶溶液，所述PBS溶液用超纯水配制而成；
所述氨基酸DMEM溶液中的溶剂为DMEM，溶质由按照质量体积比计的如下组分组成：丙氨酸20mg/L、精氨酸35mg/L、天门冬酰胺20mg/L、天冬氨酸45mg/L、胱氨酸20mg/L、谷氨酸75mg/L、谷氨酰胺65mg/L、甘氨酸13mg/L、组氨酸8mg/L、异亮氨酸12mg/L、亮氨酸15mg/L、赖氨酸18mg/L、甲硫氨酸23mg/L、苯丙氨酸16mg/L、脯氨酸25mg/L、丝氨酸15mg/L、苏氨酸30mg/L、色氨酸70mg/L、酪氨酸40mg/L、缬氨酸13mg/L、羟基脯氨酸9mg/L、高半胱氨酸7mg/L和牛磺酸10mg/L。
本发明还提供该培养Marc-145细胞用的培养基的制备方法：根据配方的体积比分别量取DMEM、酶解明胶溶液、氨基酸DMEM溶液和胎牛血清，混合，得到培养基；
所述氨基酸DMEM溶液由如下方法制成：取配方量的丙氨酸、精氨酸、天门冬酰胺、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、羟基脯氨酸、高半胱氨酸、牛磺酸，然后溶解在配方量的DMEM溶液中，得到氨基酸DMEM溶液；
所述酶解明胶溶液由如下步骤制备：
a：将30g明胶溶解在200ml的PBS溶液中，得到明胶PBS溶液；
b：将a步骤得到的明胶PBS溶液进行湿热高压灭菌处理，所述湿热高压灭菌处理的温度为121℃、压力为103.4KPa、时间为20min；
c：将经过b步骤处理的明胶PBS溶液冷却至常温，加入质量百分浓度为0.25％的胰酶溶液，在37℃温度下酶解16h，重复该操作3次；
d：将经过c步骤处理明胶PBS溶液冷却至5℃(无凝固现象出现)，得到酶解明胶溶液。
本实施例中，分别对DMEM、酶解明胶溶液、氨基酸DMEM溶液和胎牛血清的体积比为：酶解明胶溶液：氨基酸DMEM溶液：胎牛血清：DMEM＝1.5:3:M:100中的M分别取0.5、1、2、3、4、5，分别编为第二组至第七组，然后取不加胎牛血清，其余成分均匀本申请相同的，编为第一组；取不添加本实施例中的酶解明胶溶液和氨基酸DMEM溶液的培养基，其中加入的胎牛血清与DMEM溶液的比例分别为10:100、8:100、5:100、7:100，分别编为对照组一至对照组四；Marc-145细胞按照1：3的比例进行传代，分别在培养过程中的3h、1d、2d、3d进行观察细胞生长状况，具体情况详见表4：
表4：Marc-145细胞生长状况表
表1中，“-”表示：Marc-145细胞不贴壁，不生长；“+”表示：Marc-145细胞95％以上的细胞已经贴壁，但是不生长；“++”表示：Marc-145细胞出现生长分裂的情况，分裂的细胞较少，细胞瓶中约50-60％面积没有细胞；“+++”表示：Marc-145细胞生长分裂状况良好，细胞瓶中约20-30％面积没有细胞；“++++”表示：Marc-145细胞生长分裂状况良好，细胞瓶中约1-3％面积没有细胞，且细胞已经生长致密。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种培养Marc-145细胞用的培养基，其特征在于由如下成分组成：DMEM、酶解明胶溶液、氨基酸DMEM溶液和胎牛血清；
所述DMEM、酶解明胶溶液、氨基酸DMEM溶液和胎牛血清的体积比为：酶解明胶溶液：氨基酸DMEM溶液：胎牛血清：DMEM=1-2:1-5:2-5:100；
所述酶解明胶溶液中的蛋白质浓度为20-80mg/ml，所述酶解明胶溶液中的溶剂为PBS溶液；
所述氨基酸DMEM溶液中的溶剂为DMEM，溶质由按照质量体积比计的如下组分组成：丙氨酸5-35mg/L、精氨酸10-60 mg/L、天门冬酰胺5-25 mg/L、天冬氨酸15-80 mg/L、胱氨酸5-30 mg/L、谷氨酸50-100 mg/L、谷氨酰胺40-80 mg/L、甘氨酸5-20 mg/L、组氨酸5-10 mg/L、异亮氨酸5-15 mg/L、亮氨酸10-20 mg/L、赖氨酸10-25 mg/L、甲硫氨酸10-30 mg/L、苯丙氨酸5-20 mg/L、脯氨酸10-40 mg/L、丝氨酸10-30 mg/L、苏氨酸10-40 mg/L、色氨酸5-80mg/L、酪氨酸10-50 mg/L、缬氨酸10-20 mg/L、羟基脯氨酸5-10 mg/L、高半胱氨酸2-10 mg/L、牛磺酸5-15 mg/L；
所述酶解明胶溶液为胰酶酶解明胶溶液，所述PBS溶液用超纯水配制而成。
2.根据权利要求1所述的培养Marc-145细胞用的培养基，其特征在于：所述DMEM、酶解明胶溶液、氨基酸DMEM溶液和胎牛血清的体积比为：酶解明胶溶液：氨基酸DMEM溶液：胎牛血清：DMEM=1-2:1-5:2-3:100。
3.根据权利要求1所述的培养Marc-145细胞用的培养基，其特征在于：所述DMEM、酶解明胶溶液、氨基酸DMEM溶液和胎牛血清的体积比为：酶解明胶溶液：氨基酸DMEM溶液：胎牛血清：DMEM=1:2:2-5:100；
所述氨基酸DMEM溶液中的溶质按照质量体积比计的如下组分：丙氨酸5mg/L、精氨酸10mg/L、天门冬酰胺5mg/L、天冬氨酸15 mg/L、胱氨酸5 mg/L、谷氨酸50mg/L、谷氨酰胺40mg/L、甘氨酸5 mg/L、组氨酸5 mg/L、异亮氨酸5 mg/L、亮氨酸10 mg/L、赖氨酸10 mg/L、甲硫氨酸10mg/L、苯丙氨酸5mg/L、脯氨酸10 mg/L、丝氨酸10 mg/L、苏氨酸10 mg/L、色氨酸5mg/L、酪氨酸10mg/L、缬氨酸10 mg/L、羟基脯氨酸5 mg/L、高半胱氨酸2 mg/L和牛磺酸5mg/L。
4.根据权利要求1所述的培养Marc-145细胞用的培养基，其特征在于：所述DMEM、酶解明胶溶液、氨基酸DMEM溶液和胎牛血清的体积比为：酶解明胶溶液：氨基酸DMEM溶液：胎牛血清：DMEM=1:2:2-5:100；
所述氨基酸DMEM溶液中的溶质由按照质量体积比计的如下组分：丙氨酸8mg/L、精氨酸12 mg/L、天门冬酰胺9 mg/L、天冬氨酸20 mg/L、胱氨酸7mg/L、谷氨酸60 mg/L、谷氨酰胺50mg/L、甘氨酸10mg/L、组氨酸8 mg/L、异亮氨酸8 mg/L、亮氨酸12 mg/L、赖氨酸12mg/L、甲硫氨酸15 mg/L、苯丙氨酸6mg/L、脯氨酸10mg/L、丝氨酸10mg/L、苏氨酸10mg/L、色氨酸5mg/L、酪氨酸13 mg/L、缬氨酸10mg/L、羟基脯氨酸6 mg/L、高半胱氨酸5 mg/L和牛磺酸6mg/L。
5.一种根据权利要求1所述的培养Marc-145细胞用的培养基的制备方法，其特征在于：根据配方的体积比分别量取DMEM、酶解明胶溶液、氨基酸DMEM溶液和胎牛血清，混合，得到培养基。
6.根据权利要求5所述的培养Marc-145细胞用的培养基的制备方法，其特征在于所述氨基酸DMEM溶液由如下方法制成：取配方量的丙氨酸、精氨酸、天门冬酰胺、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、羟基脯氨酸、高半胱氨酸、牛磺酸，然后溶解在配方量的DMEM溶液中，得到氨基酸DMEM溶液。
7.根据权利要求5或6所述的培养Marc-145细胞用的培养基的制备方法，其特征在于所述酶解明胶溶液由如下步骤制备：
a：将明胶溶解在PBS溶液中，得到明胶PBS溶液，所述明胶PBS溶液的质量体积浓度为25-600mg/ml；
b：将a步骤得到的明胶PBS溶液进行湿热高压灭菌处理，所述湿热高压灭菌处理的温度为121℃、压力为103.4KPa、时间为20min；
c：将经过b步骤处理的明胶PBS溶液冷却至常温，加入质量百分浓度为0.25%的胰酶溶液，在37℃温度下酶解8-24h，重复该操作1-3次；
d：将经过c步骤处理明胶PBS溶液冷却至2-8℃，如出现凝固现象，则重复c步骤，直至在2-8℃时无凝固现象出现，得到酶解明胶溶液。
8.根据权利要求7所述的培养Marc-145细胞用的培养基的制备方法，其特征在于：所述c步骤中每次加入的胰酶溶液与明胶PBS溶液的体积比为1:9-10。
9.根据权利要求7所述的培养Marc-145细胞用的培养基的制备方法，其特征在于：所述c步骤中酶解的时间为24h，所述c步骤中重复操作的次数为2-3次。
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