CN116234441A - 用于器官保存的装置和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于长期冷冻保存生物样品的方法和装置，所述生物样品包括血管化组织、神经支配的组织或二者，诸如但不限于肢体。

Description

用于器官保存的装置和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求获得2020年8月18日提交的题为“DEVICE AND AMETHOD FOR ORGANPRESERVATION”的美国临时专利申请号63/066,925的优先权，其内容通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本发明涉及生物材料例如组织的受控冷冻，并且更具体地涉及适用于该目的的装置以及使用其的方法。
背景技术
指导现代医学重建的主要原则是以“同组织”替换“同组织”。因此，受伤或变形的身体部位被替换成类似的未受伤的对应部位。尽管近几十年来该领域取得了重大进展，但是重建仍受限于可用的自体(即“自我”)替代部件的数量和复杂性。在重大创伤期间，这种限制随着受伤组织的大小和复杂性而恶化，进一步限制了供体部位的可用性。影响由几种不同的组织组成的复合缺陷的损伤，比如肢体截肢或大规模面部损伤，不能用自体组织替代，并且需要使用异体(即“外来”)捐赠的组织，最近在快速发展的血管复合异体移植(VCA)领域证明了这一点。尽管在肢体和脸部移植方面取得了令人印象深刻的成功，但是VCA领域由于对移植的复合组织有强烈的免疫排斥反应(高于任何其他移植领域)而受到阻碍，需要大剂量的终身免疫抑制方案来确保异体移植的存活，这可能导致严重甚至危及生命的不良后果。
创伤后立即使用截肢组织(即神经、肌腱和血管化皮瓣和骨移植物)进行自体肢体再移植或显微外科重建将是非常有益的，并且甚至可能免除VCA的需要，消除强制使用免疫抑制的需要。然而，立即再移植自体肢体或组织是不可能的，因为根据“先生命后肢体(lifebefore limb)”的策略，急性抢救和救生程序优先，而且肢体缺血窗口短(4-6小时)。在战斗(combat)的手术条件下，时间的限制进一步加强，这使得复杂的显微外科再移植或显微外科重建(其需要特定的手术室设备和训练有素的显微外科团队的)实际上是不可能的。
一种允许使用自体组织进行重建的方法是保存其活力，直到患者情况允许进行重建手术。在大多数现代创伤和战斗损伤中，比如受污染的伤口，最初的12小时是专门用于损害控制和最紧急的血管和骨科干预。在受伤后的一两天内，一些选定的患者可以尝试一些重建工作，但大多数这些复杂的重建手术可能在受伤后几天到几周后才会尝试。技术改造，比如体外灌注和零度以下保存，可能有助于延长实体器官的收获和移植的时间。然而，使用这些技术延长移植物存活时间的乐观范围分别没有超过24小时，并且对于肝脏移植物来说延长到96小时。迄今为止，唯一被建议用于长期(数天至数月)器官或组织保存的方法是通过定向冷冻(DF)或玻璃化的低零下冷冻保存，两者都是基于在低于(-80℃)的温度下对活体组织进行冷冻保存。定向冷冻已经成功地用于冷冻各种组织，包括绵羊卵巢、人类卵巢、大鼠和猪全肝以及大鼠心脏。玻璃化已被用于成功地冷冻兔子的肾脏、血管、角膜和瓣膜。最近有报道称，在通过DF和玻璃化保存7天后，成功移植了完整的大鼠后肢，但是肢体的存活时间只有72小时。
冷冻保存的主要挑战在于防止由传统冷冻保存方法产生的细胞内和细胞外冰晶的形成所引起的损害。
玻璃化是将液体凝固成固体玻璃相。组织玻璃化是通过在高浓度的冷冻保护剂(CPA)存在下组织的快速冷却和快速加热实现的。玻璃化的概率＝CR或WR×μ×1/V；玻璃化的概率随着冷却/加热速度(CR或WR)的增加和粘度(μ)的增加以及体积(V)的减少而增加。这些条件使细胞和组织的冷冻保存在转化为玻璃状之前没有冰的形成，从而极大地减少了冷冻损伤。尽管玻璃化在冷冻保存方面有巨大的潜力，但它有3个主要的缺点，导致迄今为止不能将其用于大型组织/器官：(1)快速均匀的冷却和加热，这是最小的冰核和生长所需要的，对大的组织来说是非常具有挑战性的；(2)高浓度的CPA，这是成功的组织玻璃化所需要的，如果不迅速引入和移除，可能导致不可逆的组织毒性和渗透性损伤；和(3)快速冷却超过玻璃相转变温度(Tg')导致组织断裂。现有最快的冷却方法是通过液氮(LN)融浆(slush)(-204℃-(-210℃))。为了实现LN融浆，LN需要被冷却到接近其冰点(-210℃)。通过施加负压，从而将LN的温度降低到-205℃至-210℃之间，产生LN融浆。然后形成LN融浆，冷却速度急剧增加。当从室温冷却到0℃时，冷却速率在冷却的第一阶段特别增强。与骤降至LN(-196℃)相比，冷却速率提高2至6倍。
增加CR或WR和μ会增加玻璃化的概率，但是也会增加断裂的概率。这是因为粘度(μ)的增加也会增加Tg'，由于ΔT的增加，会使CR或WR增加。迄今为止，玻璃化仅在细胞和小组织、卵母细胞、精子、胚胎和卵巢切片、血管、角膜、瓣膜和兔肾的冷冻保存中获得成功。
仍然非常需要一种玻璃化的装置和/或方法，它将允许长期冷冻保存大的组织，比如复合血管化组织，例如，肢体和器官，这将使它们在同基因再移植后能够长期存活。
发明内容
在一些实施方式中，本发明涉及一种用于冷冻保存生物样品例如组织的两步方法，包括快速和短暂的深度冷冻步骤，然后是渐进的较长的冷冻步骤。
本发明部分基于令人惊讶的发现，即根据本文所公开的方法冷冻的组织在同基因再移植后提供长期存活率。
在一些实施方式中，本发明的方法包括第一秒长(例如，快速)的冷冻步骤，其使生物样品达到零度以下的温度，然后是第二分钟长(例如，渐进)的冷冻步骤，其使生物样品达到样品的玻璃转化点温度(Tg')。如本文所述，在同基因再移植后，生物样品的长期存活率增加，这表明为了最佳的长期保存，生物样品应保持在Tg'，而不是在液氮或其蒸汽的较低温度。
在一些实施方式中，本发明涉及一种装置，其包括适合容纳样品的第一容器；配置为通过沿冷却轴线的通道调整容器的位置的致动器；与容器接触的加热元件；以及与致动器和加热元件可操作地通信并配置为向样品提供预定温度的控制单元。
根据第一方面，提供了一种用于冷冻保存生物样品的方法，其包括以下步骤：(a)将生物样品与玻璃化溶液(VS)以范围从50:1至1:1的体积/体积(v/v)比接触；(b)使步骤(a)的生物样品第一次经受范围从-210℃至-197℃的温度，持续时间段为3-10秒；和(c)使步骤(b)的生物样品第二次经受等于或高于VS的玻璃化转变点温度(Tg)并且范围从-140℃至-100℃的温度，持续时间段为至少3分钟；从而冷冻保存生物样品。
根据另一方面，提供了一种制备用于移植给有需要的受试者的生物样品的方法，其包括以下步骤：(a)将生物样品与VS以范围从50:1至1:1的体积/体积(v/v)比接触；(b)使步骤(a)的生物样品第一次经受范围从-210℃至-197℃的温度，持续时间段为3-10秒；和(c)使步骤(b)的生物样品第二次经受等于或高于VS的Tg并且范围从-140℃至-100℃的温度，持续时间段为至少3分钟；从而制备用于移植给有需要的受试者的生物样品。
根据另一方面，提供了一种用于冷冻保存肢体、制备用于移植给有需要的受试者的肢体或二者的方法，其包括以下步骤：(a)将包括肢体的生物样品与VS以范围从50:1至1:1的体积/体积(v/v)比接触；(b)使步骤(a)中包括肢体的生物样品第一次经受范围从-210℃至-197℃的温度，持续时间段为3-10秒；和(c)使步骤(b)中包括肢体的生物样品第二次经受等于或高于所述VS的Tg’并且范围从-140℃至-100℃的温度，持续时间段为至少3分钟；从而冷冻保存肢体、制备用于移植给有需要的受试者的肢体或二者。
根据另一方面，提供了一种在有需要的受试者中移植生物样品的方法，包括以下步骤：(a)根据本发明的方法冷冻保存生物样品；和(b)解冻或加热并移植冷冻保存的生物样品至受试者。
根据另一方面，提供了一种装置，其包括：构造来容纳样品的第一容器；配置为通过沿冷却轴线的通道调整所述第一容器的位置的致动器；与第一容器接触的加热元件；和控制单元，其与致动器和加热元件可操作地通信，并且配置为通过命令：(a)致动器的配置，使得通过沿着冷却轴线的通道调整所述第一容器的位置；(b)加热元件向第一容器施加预定的热量；或(a)和(b)来控制样品的温度。
在一些实施方式中，生物样品包括被血管化的、神经支配的或二者的组织或器官。
在一些实施方式中，生物样品包括肢体。
在一些实施方式中，该方法进一步包括在第二次经受之后保存生物样品，其包括将生物样品以范围从-1℃/min至-10℃/min的速率进一步冷却至低于Tg或在-197℃至-150℃之间的温度。
在一些实施方式中，将在步骤(a)之后获得的生物样品浸没在所述VS中、由所述VS覆盖或二者。
在一些实施方式中，接触是在真空条件下。
在一些实施方式中，接触是在弹性袋中。
在一些实施方式中，在步骤(a)之后获得的生物样品基本上没有空气。
在一些实施方式中，在步骤(b)之后获得的生物样品包括与VS接触的外表面，其中外表面的特征在于具有范围从-20℃至0℃的温度。
在一些实施方式中，第一次经受以-330℃/min至-500℃/min的速率冷冻。
在一些实施方式中，第一次经受是在冷冻液体的融浆中或在-220℃至-150℃的冷冻条件下。
在一些实施方式中，第二次经受以-3℃/min至-10℃/min的速率冷冻。
在一些实施方式中，第二次经受是在：(a)冷冻液体的蒸汽中；或(b)提供范围从-85℃至-75℃的温度的冷却条件中，随后是冷冻液体的蒸汽。
在一些实施方式中，提供范围从-85℃至-75℃的温度的冷却条件包括具有范围从-85℃至-75℃的温度的冷却液体。
在一些实施方式中，步骤(c)中至少3分钟的时间段为至少30分钟。
在一些实施方式中，该方法进一步包括在步骤(a)之前的步骤，包括用VS灌注生物样品。
在一些实施方式中，灌注是在室温下，持续至多5分钟的时间段。
在一些实施方式中，VS包括至少一种：渗透性冷冻保护剂、非渗透性冷冻保护剂或其组合，并且任选地进一步包括：大分子、抗氧化剂、培养基或其任何组合。
在一些实施方式中，VS包括：15-25％(w/v)的乙二醇、15-25％(v/v)的二甲基亚砜、15-25(v/v)的胎牛血清和0.3-0.7M的海藻糖，所有这些都在威斯康辛静态保存溶液中。
在一些实施方式中，该方法进一步包括步骤(d)，其包括将冷冻保存的生物样品保存至少24小时的时间段。
在一些实施方式中，受试者需要器官替换。
在一些实施方式中，方法进一步包括清洗和灌注冷冻保存的生物样品的步骤，其中该步骤在将冷冻保存的生物样品移植到受试者之前。
在一些实施方式中，移植是自体移植或异体移植。
在一些实施方式中，轴线与通道的纵轴线平行。
在一些实施方式中，加热元件位于第一容器的顶部并至少部分地与之重叠。
在一些实施方式中，该装置进一步包括至少一个温度传感器。
在一些实施方式中，至少一个温度传感器与第一容器耦连，使得第一容器的温度通过该温度传感器是可测量的。
在一些实施方式中，控制单元与至少一个温度传感器可操作地通信。
在一些实施方式中，该装置进一步包括第二容器，其构造来容纳冷冻液体、其融浆、其蒸汽或其任何组合。
在一些实施方式中，冷冻液体包括液氮(LN2)。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明相关技术的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文描述的方法和材料相似或相当的方法和材料可用于本发明的实施方式的实践或测试，但是下文描述了示例性的方法和/或材料。如果发生冲突，将以专利说明书(包括定义)为准。此外，这些材料、方法和实例仅是说明性的，并不意味着一定是限制性的。
本发明的进一步实施方式和全部适用范围将从下文的详细描述中变得明显。然而，应该理解的是，详细描述和具体实例虽然表明了本发明的优选实施方式，但只是以说明的方式给出，因为本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域的技术人员来说将从该详细描述中变得显而易见。
附图说明
图1A-1F包括显示血管化腹股沟皮瓣在-80℃下长期冷冻保存后的长期存活的显微照片和图表。(1A)血管化腹股沟皮瓣在室温下用冷冻保护剂(CPA)灌注，浸入液氮(LN)融浆中指定的时间，转移到LN蒸汽中2分钟，加热，再移植到同基因受体中并拍照。(1B)血管化腹股沟皮瓣按照方案进行冷冻保存，并在-80℃下储存24小时(1C)或9天(1D)后以同基因方式移植，并在指定时间进行跟踪和拍照，或在手术后当天(POD12)取出进行组织学检查。用苏木精和伊红(H&E)对在-80℃下储存24小时(1Ea-1Ec)或9天(1Ed-1Ef)的皮瓣进行组织学切片染色并拍照。用CPA灌注血管化腹股沟皮瓣，在LN融浆中浸泡3秒，并且然后转移到LN蒸汽中，持续30分钟，并测量皮瓣内温度(1F)。
图2A-2C包括显示在Tg'下冷冻保存后的血管化腹股沟皮瓣的长期存活的图表、示意图和显微照片。(2AI)通过差示扫描量热法(DSC)分析确定玻璃化溶液(VS)的Tg'。(2AII)在室温下用CPA灌注血管化腹股沟皮瓣，并且然后转移到LN蒸汽中。测量皮瓣内的温度直到达到Tg'。(2B和2CI)在室温下用CPA灌注血管腹股沟皮瓣，在LN蒸汽中温育30分钟，加热，再移植，并在指定时间拍照。(2CII)按2B中描述的冷冻保存和移植的血管腹股沟皮瓣在POD12时被取出进行组织学分析。将玻片(slide)用H&E染色并拍照。
图3A-3C包括显示在冷冻保存后后肢的长期稳定性的示意图、图表。(3A)两阶段肢体冷冻保存方案的方案。(3BI)在室温下用冷冻保护剂(CPA)灌注肢体，浸入LN融浆，持续4秒，并且然后转移到LN蒸汽。(3BII)在室温下用CPA灌注肢体，浸入LN融浆，持续4秒，转移到LN蒸汽，持续10分钟，加热，再移植，并在指定时间拍照。在POD10和POD32时，通过针刺诱导出血来证明外周肢体的灌注。在POD32，取出肢体进行组织学分析；将切片用H&E染色(3C)。显示出正常的皮肤和肌肉结构。
图4A-4E包括显示后肢在Tg'下冷冻保存后的长期存活的示意图和显微照片。在室温下用冷冻保护剂(CPA)灌注肢体，浸入LN融浆，持续4秒，转移到LN蒸汽中，持续2小时，加热，再移植(4A)，并在指定时间拍照(4B)。(4C)在POD28时，通过针刺诱导出血证明了外周肢体的灌注。在POD32，取出肢体进行组织学分析，对收获的肢体的正面(4DI)和背面(4DII)进行拍照；将切片用H&E染色。显示出正常的皮肤、脂肪和肌肉结构(4E)。
图5A-5C包括显示再移植的冷冻保存肢体的神经再生和功能感觉的示意图和显微照片。(5AI)使用图3A所述的两阶段冷冻保存方案对肢体进行冷冻保存，并且然后作为第五个肢体移植在受体大鼠的腰部。(5AII)在POD12，受体肢体膝下截肢后，将移植的冷冻肢体从腰部位置移到膝下位置，不切断其与受体股血管的血液供应，并缝合。将受体的胫骨神经连接到冷冻保存的肢体上，以使神经再生并恢复感觉。(5B)膝下移植后22天，大鼠能够使用冷冻保存的肢体行走(5CI)。在膝下移植后23天，取出胫骨神经进行组织学分析，并对神经吻合处近侧和远侧的切片进行神经丝(NF(总轴突))和胆碱乙酰转移酶(ChAT(运动轴突))蛋白染色。还应用DAPI进行核染色。(5CII)显示使用数字系统进行的定量纤维计数的图表。
图6A-6C包括显示移植的冷冻保存肢体和新鲜肢体表现出类似的肌肉完整性的组织学显微照片和图表。用生理盐水或CPA灌注膝下肢体移植，清洗后并立即移植作为新鲜对照(分别为生理盐水和CPA对照)，并根据图3A和4A中显示的方案，分别与冷却到～-80℃或Tg的类似移植物进行比较。在≥12的手术后天数(POD)，取出肢体并固定，并从肢体的不同部分制备切片，用苏木精和伊红染色，并记录下来。肌肉质量由不知情的病理学家进行评分和比较。(6A)组织学显微照片显示不同对照组和实验组的肌肉切片的选定呈现。(6BI)显示对照组、实验组肢体的肌肉评分的比较统计分析图。(6BII)显示新鲜对照组和实验组肢体的肌肉质量之间没有明显差异的垂直条形图(P＝0.6)。(6C)显示使用定向冷冻(DF)冷冻的肢体、玻璃化至温度低于Tg的肢体和玻璃化至温度≥Tg的肢体组之间长期肢体存活的比较的垂直条形图。
图7包括根据本发明的一些实施方式的装置的第一容器的总视图简化示意图。
图8包括根据本发明的一些实施方式的装置的控制单元的后视简化示意图。
图9包括根据本发明的一些实施方式的装置的总视图简化示意图。
图10包括根据本发明的一些实施方式的装置的第一容器的全连接视图简化示意图。
图11包括根据本发明的一些实施方式的装置的第一容器的上部近景简化示意图。
图12包括根据本发明的一些实施方式的装置的控制单元面板的总视图简化示意图。
图13包括根据本发明的一些实施方式的装置的第二容器控件的总视图简化示意图。
图14包括根据本发明的一些实施方式的装置的致动器的总视图简化示意图。
图15包括根据本发明的一些实施方式的装置的第二容器的总视图简化示意图。
具体实施方式
在一些实施方式中，本发明涉及一种玻璃化的装置和方法，提供冷冻保存血管化的和/或神经支配的组织的长期存活。
方法
根据一些实施方式，提供了一种用于冷冻保存生物样品的方法。
根据一些实施方式，提供了一种制备用于移植给例如有需要的受试者的生物样品的方法。
根据一些实施方式，提供了一种用于冷冻保存肢体、用于制备用于移植给有需要的受试者的肢体或二者的方法。
在一些实施方式中，该方法包括以下步骤：(a)将生物样品与玻璃化溶液(VS)以范围从50:1至1:1的体积/体积(v/v)比接触；(b)使生物样品第一次经受范围从-210℃至-197℃的温度，持续时间段为3-10秒；和(b)使步骤(a)的生物样品第二次经受等于或高于VS的玻璃化转变温度(Tg)并且范围从-140℃至-100℃的温度，持续时间段为至少3分钟。
在一些实施方式中，该方法进一步包括在第二次经受之后保存生物样品，其包括将样品以范围从-1℃/min至-10℃/min的速率进一步冷却至低于VS的玻璃化转变点温度或在-197℃至-150℃之间的温度。
如本文中所使用的，术语“保存(preserving)”和“储存(storing)”可以互换。
在一些实施方式中，冷冻保存的生物样品被储存在为VS的Tg的温度下。在一些实施方式中，冷冻保存的生物样品被储存在低于VS的Tg的温度下。在一些实施方式中，冷冻保存的生物样品被储存在高于VS的Tg的温度下。
在一些实施方式中，生物样品包括组织或器官。
在一些实施方式中，该组织或器官包括脉管系统。在一些实施方式中，该组织或器官包括至少一种神经、神经元、轴突、树突、神经节或其任何组合。在一些实施方式中，该组织或器官是血管化的、神经支配的或二者。
在一些实施方式中，组织或器官选自：肢体、肾脏、心脏、肝脏、肺、胰腺、肠道、皮肤或由其衍生的组织片段。
在一些实施方式中，生物样品包括肢体。
在一些实施方式中，肢体包括上肢、下肢或包括上肢、下肢的多个肢体，或其组合。
如本文中所使用的，术语“经受(subjecting)”、“冷却(cooling)”、“冷冻(chilling)”和“冻结(freezing)”可以互换。
在一些实施方式中，生物样品和VS的(v/v)比的范围为50:1至1:1、100:1至1:1、250:1至1:1、40:1至10:1、25:1至5:1或45:1至6:1。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。
在一些实施方式中，在步骤(a)之后获得的生物样品被浸没在VS中，被VS覆盖，或二者。
在一些实施方式中，在步骤(a)之后获得的生物样品至少部分地浸没在VS中，至少部分被VS覆盖，或二者。
在一些实施方式中，接触是在真空条件下。
在一些实施方式中，该方法包括将生物样品置于弹性袋中。在一些实施方式中，该方法包括在弹性袋中提供生物样品的步骤。
在一些实施方式中，接触是在弹性袋中。在一些实施方式中，该弹性袋包括塑料袋。在一些实施方式中，该弹性袋包括可密封的弹性袋。在一些实施方式中，在生物样品位于弹性袋中的情况下施加真空。在一些实施方式中，在对与VS接触的生物样品施加真空后密封弹性袋。
在一些实施方式中，生物样品与弹性袋中的VS以50:1至1:1、100:1至1:1、250:1至1:1、40:1至10:1、25:1至5:1或45:1至6:1的(v/v)比接触。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。
在一些实施方式中，在包括生物样品和VS的弹性袋中没有空气或基本没有空气之后，暂停、停止或中断(或其任何组合和等同词)真空的施加。
如本文中所使用的，术语“真空”包括施加低于大气压的任何压力。
在一些实施方式中，在步骤(a)之后获得的生物样品没有空气。在一些实施方式中，在步骤(a)之后获得的生物样品基本上没有空气。
在一些实施方式中，在步骤(b)之后获得的生物样品，例如由施加真空产生的，包括与VS接触的外表面。在一些实施方式中，生物样品的外表面的特征在于具有在以下范围的温度：0℃至-20℃、-1℃至-15℃、-3℃至-19℃或0℃至-17℃。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。
在一些实施方式中，第一次经受是在任何适合在至多7分钟、至多6分钟、至多5分钟、至多4分钟、至多3分钟、至多2分钟或至多1分钟或其间的任何值和范围内将生物样品的温度降低到零摄氏度以下的条件下。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。
在一些实施方式中，适合将生物样品的温度降低到零摄氏度以下的条件包括任何等于或高于-5℃/分钟的冷却速率
在一些实施方式中，第一次经受包括以-10℃/min至-20℃/min、-5℃/min至-40℃/min、-30℃/min至-70℃/min、-60℃/min至-120℃/min、-130℃/min至-270℃/min、-230℃/min至-350℃/min、-330℃/min至-370℃/min、-310℃/min至-390℃/min、-300℃/min至-385℃/min、-295℃/min至-365℃/min、-280℃/min至-395℃/min或-315℃/min至-375℃/min的速率冷冻。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。
在一些实施方式中，第一次经受是在冷冻液体的融浆中。在一些实施方式中，第一次经受是在-220℃至-190℃的冷冻条件下。在一些实施方式中，第一次经受是在冷冻液体的蒸汽中。在一些实施方式中，第一次经受是在冷冻液体中，或在-150℃至-90℃的冷冻条件下。
在一些实施方式中，第二次经受以-6℃/min至-10℃/min、-3℃/min至-15℃/min、-2℃/min至-13℃/min、-4℃/min至-11℃/min、-5℃/min至-17℃/min、-6℃/min至-12℃/min、-6℃/min至-8℃/min的速率冷冻。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。
在一些实施方式中，第二次经受是在：(a)冷冻液体的蒸汽中；或(b)具有范围从-120℃至-40℃的温度的冷却液体中，然后是在冷冻液体的蒸汽中。在一些实施方式中，第二次经受是在：(a)冷冻液体的蒸汽中；或(b)提供范围从-85℃至-75℃的温度的冷却条件中，然后是在冷冻液体的蒸汽中。
在一些实施方式中，提供范围从-85℃至-75℃的温度的冷却条件包括具有范围从-85℃至-75℃的温度的冷却液体。
在一些实施方式中，至少3分钟的时间段包括：至少4分钟、至少5分钟、至少7分钟、至少10分钟、至少15分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少45分钟、至少60分钟、至少1小时、至少2小时、至少4小时、至少8小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少2天、至少7天、至少14天、至少1个月或至少3个月，或其间的任何值和范围。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，至少3分钟的时间段包括：3-10分钟、5-25分钟、5-40分钟、10-60分钟、15-90分钟、1-3小时、2-12小时、4-18小时、8-24小时、12-36小时、1-3天、2-7天、5-14天、2-5周或1-3个月。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。
在一些实施方式中，接触包括生物样品的灌注。
用于灌注生物样品例如包括血管的组织的方法是常见的，并且对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。
在一些实施方式中，灌注包括灌注生物样品的至少一条血管。在一些实施方式中，灌注包括灌注生物样品的至少一条动脉。在一些实施方式中，灌注包括使生物样品的至少一条血管与以下物质接触：(a)包括生理盐水、肝素或其组合的溶液；(b)平衡溶液；(c)玻璃化溶液；或(a)至(c)的任何组合。
在一些实施方式中，该方法进一步包括包含用冷冻保护剂灌注生物样品的步骤。在一些实施方式中，该方法进一步包括包含用包括生理盐水、肝素或其组合的溶液灌注生物样品的步骤。在一些实施方式中，该方法进一步包括包含用平衡溶液灌注生物样品的步骤。在一些实施方式中，该方法进一步包括包含用VS灌注生物样品的步骤。在一些实施方式中，包括灌注生物样品的步骤在使生物样品第一次经受范围从-210℃至-197℃的温度，持续3-10秒(例如，步骤(a))之前。
在一些实施方式中，术语“平衡溶液”包括适合制备或增强生物样品的冷冻耐力或稳定性的任何溶液。在一些实施方式中，平衡溶液是在用包括生理盐水、肝素或其组合的溶液灌注生物样品后提供给生物样品的。在一些实施方式中，平衡溶液是在用VS灌注生物样品之前提供给生物样品的。在一些实施方式中，平衡溶液增强或增加了VS的冷冻保护活性或效果。
如本文中所使用的，“冷冻耐力”或“冷冻稳定性”是指组织或器官承受冷冻保存的能力，而没有或只有最小的组织损伤，例如冷冻损伤、出血等，从而允许随后对冷冻保存的组织或器官进行操作或使用，例如其加热/解冻和/或移植。
在一个实施方式中，平衡溶液包括：5-10％(v/v)的乙二醇(EG)；2.5-10％(v/v)的DMSO；和5-25％(v/v)的胎牛血清(FCS)，全部都在威斯康辛静态保存溶液中。
如本文中所使用的，术语“冷冻保护剂(cryoprotecting agent)”和“冷冻保护剂(cryoprotectant)”可互换，并且包括可用于保护生物样品，例如细胞、组织、器官或其部分，或其任何组合免于冰的形成损害，例如冰晶的形成或任何其他与冷冻有关的损伤的任何化合物。
在一些实施方式中，灌注持续的时间段为至少10秒、至少20秒、至少30秒、至少40秒、至少50秒、至少60秒、至少2分钟、至少3分钟、至少4分钟或至多5分钟或其间的任何值和范围。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，灌注持续的时间段为5至60秒、1至3分钟、1至4分钟、1至5分钟、2至3分钟、2至4分钟、2至5分钟、3至4分钟、3至5分钟或4至5分钟。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。
在一些实施方式中，接触、灌注或二者都在室温下进行。在一些实施方式中，接触、灌注或二者都在环境温度下进行。在一些实施方式中，接触、灌注或二者都是在15℃至28℃的温度下进行的。
向生物样品和/或组织灌注补充冷冻保护剂是常见的，并且对本领域普通技术人员来说是显而易见的。冷冻保护剂的非限制性实例包括但不限于DMSO、甘油、乙二醇、丙二醇、蔗糖、海藻糖、2-甲基-2,4-戊二醇(MPD)和/或其他。
在一些实施方式中，VS包括渗透性冷冻保护剂、非渗透性冷冻保护剂或其组合。在一些实施方式中，VS进一步包括：大分子、抗氧化剂、培养基或其任何组合。在一些实施方式中，VS包括渗透性冷冻保护剂、非渗透性冷冻保护剂或其组合，并且任选地进一步包括：大分子、抗氧化剂、培养基或其任何组合。在一些实施方式中，VS包括渗透性冷冻保护剂、非渗透性冷冻保护剂、大分子、抗氧化剂、培养基或其组合。
在一些实施方式中，渗透性冷冻保护剂选自：DMSO、乙二醇、丙二醇(PG)、甘油(GLY)或其任何组合。
在一些实施方式中，非渗透性冷冻保护剂包括二糖、低聚糖、多糖或其任何组合。在一些实施方式中，非渗透性冷冻保护剂选自：蔗糖、海藻糖、葡聚糖或其任何组合。
如本文中所使用的，术语“大分子”包括胎牛血清、人血清白蛋白、聚蔗糖、其任何组合或其任何等同物。
在一些实施方式中，抗氧化剂包括表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate)(EGCG)、虾青素或其组合。
在一些实施方式中，培养基包括适合细胞和/或器官培养的任何生长培养基。在一些实施方式中，培养基包括PBS、HDMI或其组合。
在一些实施方式中，VS包括：15-25％(w/v)的乙二醇、15-25％(v/v)的二甲基亚砜、15-25(v/v)的胎牛血清和0.3-0.7M的海藻糖，所有这些都在威斯康辛静态保存溶液中。
在一些实施方式中，该方法进一步包括包含将冷冻保存的样品保存至少：1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、1个月或3个月或其间的任何值和范围的步骤。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，该方法进一步包括包含将冷冻保存的样品保存1至3天、2至5天、1至7天、3至12天、6至14天、1至3周、2至5周、3至6周或1至4个月、1至100年的步骤。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。
在一些实施方式中，保存期间包括任何时间段，只要再移植后的组织的存活时间维持在7-28天的范围内。在一些实施方式中，保存期间包括任何时间段，只要再移植后的组织的存活时间维持在至少：7天、14天、21天、28天或其间的任何数值和范围内。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。
在一些实施方式中，保存是在冷冻样品的玻璃转化温度(Tg)±1℃、±2℃、±3℃、±4℃、±5℃、±6℃、±7℃、±8℃、±9℃或±10℃，或其间的任何值和范围。每种可能性都代表本发明的一个单独实施方式。
在一些实施方式中，Tg包括VS的Tg或由其组成。
如本文中所使用的，术语“Tg”和“Tg初始(Tg')”可互换。
在一些实施方式中，生物样品包括组织或器官，其具有至少以下体积：1cm3、15cm3、50cm3、100cm3、150cm3、200cm3、300cm3、500cm3、1,000cm3、2,000cm3、3,000cm3、5,000cm3、7,000cm3、8,500cm3、10,000cm3或其间的任何值和范围。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，生物样品包括组织或器官，其体积为3-50cm3、30-250cm3、25-500cm3、55-650cm3、200-1,500cm3、300-5,000cm3、450-6,500cm3、300-7,500cm3、1,000-9,500cm3、2,000-8,500cm3、3,000-10,000cm3或1,000-12,000cm3。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。
在一些实施方式中，提供了一种在有需要的受试者中移植生物样品的方法，其包括以下步骤：(a)根据本文公开的方法冷冻保存生物样品；以及(b)解冻和/或加热并移植冷冻保存的样品给受试者。
术语“解冻(thawing)”和“加热(warming)”在本文中可互换使用。
在一些实施方式中，提供了一种在有需要的受试者中移植生物样品的方法，包括以下步骤：(a)根据本文中公开的方法冷冻保存生物样品；和(b)将冷冻保存的样品移植到受试者。
在一些实施方式中，该方法进一步包括在将冷冻保存的样品移植到受试者之前解冻和/或加热冷冻保存的样品的步骤。
在一些实施方式中，受试者是哺乳动物受试者，例如，但不限于人类受试者。
在一些实施方式中，受试者需要进行器官替换。
在一些实施方式中，器官替换是由于器官损伤或疾病。在一些实施方式中，器官损伤包括损伤诱发的或相关的器官损伤。
在一些实施方式中，损伤包括创伤。
在一些实施方式中，受试者正在或已经受到创伤的困扰。
在一些实施方式中，创伤包括截肢。
在一些实施方式中，该方法进一步包括在解冻冷冻保存的样品之后，洗出、消除、驱除、丢弃或其任何组合冷冻保护剂的步骤。在一些实施方式中，该方法进一步包括在移植冷冻保存的样品之前洗出、消除、驱逐、丢弃或其任何组合冷冻保护剂的步骤。
在一些实施方式中，该方法进一步包括灌注冷冻保存的生物样品的步骤。在一些实施方式中，该方法进一步包括在移植冷冻保存的生物样品之前灌注冷冻保存的生物样品的步骤。
在一些实施方式中，清洗和/或灌注包括使用包含蔗糖的溶液。在一些实施方式中，清洗和/或灌注包括使用本领域技术人员已知的、适合本文所述的当前程序的任何溶液。在一些实施方式中，清洗和/或灌注包括使用包含蔗糖的溶液。在一些实施方式中，该溶液包括蔗糖，其浓度为：至少100mM、至少125mM、至少250mM、至少500mM或至少1,000mM(1M)或其间的任何数值和范围。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，该溶液包括浓度为100mM至500mM、250mM至750mM或100mM至1,000mM的蔗糖。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。
在一些实施方式中，移植是自体移植。
在一些实施方式中，移植是异源移植。
装置
根据一些实施方式，提供了一种装置，其包括：第一容器102，其构造来容纳样品104；致动器300，其配置为通过沿冷却轴线的通道调整第一容器102的垂直位置；与第一容器102接触的加热元件152；以及控制单元200，其与致动器300和加热元件152可操作地通信并配置为控制样品104的温度。
在一些实施方式中，冷却轴线与通道的纵轴线平行。
在一些实施方式中，该装置进一步包括至少一个温度传感器。如本文中所使用的，术语“温度传感器”和“热电偶”可互换。
在一些实施方式中，至少一个温度传感器与第一容器102耦连，使得第一容器102的温度通过温度传感器是可测量的。
在一些实施方式中，控制单元200与至少一个温度传感器可操作地通信。
在一些实施方式中，控制单元200配置为控制加热元件或与加热元件通信，使得根据本文公开的方法冷冻保存生物样品。在一些实施方式中，控制单元激活或控制加热元件，使得本文公开的方法的步骤(a)的生物样品经受范围从-210℃至-197℃的温度，持续时间段为3-10秒。
在一些实施方式中，控制单元200激活或控制加热元件，使得本文公开的方法的步骤(b)的生物样品经受范围从-140℃到-100℃的温度，持续时间段为至少3分钟。
在一些实施方式中，该装置进一步包括第二容器126，其构造来容纳冷冻液体190、其融浆、其蒸汽或其任何组合。
在一些实施方式中，冷冻液体包括液氮(LN2)。在一些实施方式中，冷冻液体包括LN2融浆。在一些实施方式中，冷冻液体包括LN2蒸汽。
参考图5，这是根据本发明的一些实施方式的装置的一些部件的总视图简化示意图，包括：构造来容纳样品104的第一容器102；原位限位开关106；控制单元200；托盘204；第一容器电缆110；限位开关阻挡器112；第一容器支撑电缆(宽度侧)114；第一容器支撑电缆116；第一容器盖紧固螺钉(宽度侧)118；加热元件弹簧电缆120；热电偶弹簧电缆122；第一容器盖紧固螺钉(长度侧)124；构造来容纳冷冻液体126的第二容器；和热电偶128。
参考图6，其是根据本发明的一些实施方式的装置的控制单元200的后视简化示意图，其包括：真空泵电源插座402；以及主电源插座和熔断开关202。
参考图7，其是根据本发明的一些实施方式的装置的总视图简化示意图，包括：控制单元200；第一容器102；装置500的壳体；真空管道404；真空泵406；冷冻液体/融浆190；构造来容纳冷冻液体126的第二容器；和热电偶128。
参考图8，其是根据本发明的一些实施方式的装置的第一容器的全视图简化示意图，包括：热电偶128的热电偶插座132；热电偶插座134；热电偶128的热电偶插头130；热电偶弹簧电缆134；热电偶128的热电偶电缆136；热电偶插头138；加热元件插座140；限位开关支架142；加热元件弹簧电缆120；第一容器支撑电缆(宽度侧)114；第一容器盖紧固螺钉(长度侧)124；第一容器悬挂钩144；限位开关146；第一容器悬挂金属环148；第一容器支撑电缆114；加热元件盖板150；加热元件152；样品104；和第一容器盖紧固螺钉(宽度侧)118。
参考图9，它是根据本发明的一些实施方式的装置的顶部部分的上部近景简化示意图，包括：限位开关支架142；限位开关144；热电偶128的热电偶插头130；加热元件插座140；加热元件插头152；控制单元200；托盘204；第一容器电缆110；限位开关挡板112；第一容器悬挂钩144；和第一容器悬挂金属环148。
参考图10，其是根据本发明的一些实施方式的装置的控制单元200面板的总视图简化示意图，包括：控制单元前面板206；真空泵停止/启动开关208；启动过程开关210；可编程逻辑控制器(PLC)液晶显示器(LCD)212；警报红色指示灯214；真空泵开启绿色指示灯216；和冷却过程进行中绿色指示灯218。
参考图11，其是根据本发明的一些实施方式的装置的第二容器控件的总视图简化示意图，包括：真空阀歧管154；真空减压阀156；真空供应阀158；真空压力计160；第二容器盖O型环162；第二容器126；热电偶通孔164；第二容器盖166；和热电偶128。
参考图12，其是根据本发明的一些实施方式的装置的致动器300的全视图简化示意图，包括：热电偶128的热电偶插座130；加热元件电源插座140；热电偶插座134；真空泵电源插座402；电缆收集轮302；第一容器电缆110；步进电机支架面板304；带有集成驱动器的步进电机306；以及主电源插座和熔断开关202。
参考图13，其是根据本发明的一些实施方式的装置的第二容器的全视图简化示意图，包括：真空阀歧管154；真空减压阀156；真空供应阀158；真空压力计160；热电偶128；冷冻液体/融浆190；和第二容器126。
在一些实施方式中，第二容器具有纵轴线。在一些实施方式中，纵轴线与冷却轴线平行。在一些实施方式中，致动器300配置成通过沿冷却轴线的通道调整第一容器102的位置。
在一些实施方式中，加热元件152与第一容器102接触。在一些实施方式中，加热元件152位于第一容器102的顶部并且至少部分地与之重叠。在一些实施方式中，加热元件152配置为加热第一容器，从而提高样品的温度。
在一些实施方式中，控制单元200与致动器300和加热元件152可操作地通信。在一些实施方式中，控制单元200配置为通过命令：(a)致动器300的配置，使得第一容器102沿冷却轴线移动通过通道；(b)加热元件152向第一容器102施加预定量的热量；或(a)和(b)来控制样品104的温度。在一些实施方式中，致动器300配置为沿冷却轴线调整第一容器的位置。在一些实施方式中，致动器300将第一容器的位置调整到第二容器的下部，从而降低样品的温度。在一些实施方式中，致动器300将第一容器的位置调整到第二容器的顶部，从而提高样品的温度。在一些实施方式中，致动器300调整第一容器的位置，使第一容器的位置不超过：第二容器的顶部部分上方1cm、2cm、5cm、7cm、10cm、15cm、20cm或25cm，或其间的任何数值和范围。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。
在一些实施方式中，致动器300调整第一容器的位置，使得第一容器的位置不超过：第二容器内储存或包含的冷冻液体的表面上方1cm、2cm、5cm、7cm、10cm、15cm、20cm或25cm，或其间的任何值和范围。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。
在一些实施方式中，温度传感器可以是热电偶。在一些实施方式中，温度传感器可以是无线温度传感器。在一些实施方式中，温度传感器可以是红外传感器。在一些实施方式中，该装置包括位于第一容器的至少一个温度传感器，配置为测量样品的温度。在一些实施方式中，该装置包括位于第二容器的至少一个温度传感器，其配置为测量LN2融浆的温度。在一些实施方式中，温度传感器与控制单元可操作地通信。
在一些实施方式中，装置进一步包括非热传导部分，例如，绝缘部分。在一些实施方式中，非传导部分包括非热传导材料，例如，绝缘材料。
可以使用本领域中已知的任何非热传导材料。在一些实施方式中，非热传导材料选自丁烷、肼、氯仿、肼、1,1,2-三氯-三氟乙烷、1,2-二氯四氟乙烷、四氟乙烷、氩、二氧化碳、二乙醚、异丁烷、戊烷、全氟环丁烷、丙烷、四氟甲烷、CFC-11、HCFC-141b、甲醇、乙醇、甘油、乙醚、丙酮、乙二醇、含有玻璃(比如玻璃纤维或玻璃珠)的非热导电聚氧乙烯流体、丙二醇、丙烯酸玻璃、沥青、水泥、粘土、混凝土、陶瓷填充的可丽耐(Corian)、软木、棉絮绝缘体、硅藻土、环氧树脂、玻璃纤维、泡沫玻璃、玻璃珠或珠子、玻璃棉、石膏、菱镁矿、氧化镁绝缘体、矿物绝缘体、尼龙、珍珠岩、泡沫塑料绝缘体、膨胀聚苯乙烯、聚氨酯、瓷器、PTFE、PVC、Pyrex玻璃、沙、蛭石气凝胶、苯乙烯泡沫、聚氨酯泡沫、蛭石、乙烯基酯及其组合。
在一些实施方式中，非热传导部分包括多个顺序层。在一些实施方式中，非传导部分包括多个同心层。
如本文中所使用的，术语“多个”是指至少2、至少3、至少4、至少5、至少7或至少10的任何整数，或其间的任何值和范围。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，多个包括2-5、2-7、2-10、3-8或3-10。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。
在一些实施方式中，多个顺序层的每个层与至少另一个层接触。在一些实施方式中，多个顺序层的各层不相互接触。在一些实施方式中，将不相互接触的多个顺序层的各层之间的空隙用空气或惰性气体填充。在一些实施方式中，不相互接触的多个顺序层的各层之间的空隙没有任何液体或气体。在一些实施方式中，不相互接触的多个顺序层的各层之间的空隙没有空气。
通用术语
如本文所使用的，术语“约”是指±10％。
术语“包括(comprise)”、“包括(comprising)”、“包括(include)”、“包括(including)”、“具有(having)”及其同源词是指“包括但不限于(including but notlimited to)”。
术语“由……组成(consisting of)”意思是“包括且限于(including andlimited to)”。
术语“基本上由……组成(consisting essentially of)”是指该组合物、方法或结构可以包括额外的成分、步骤和/或部件，但是前提是额外的成分、步骤和/或部件不实质性地改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本和新颖特征。
本文中使用的“示例性”是指“作为实例、例子或示意”。描述为“示例性”的任何实施方式不一定被解释为比其他实施方式更优选或更有利，并且/或者排除并入其他实施方式的特征。
这里使用的“任选地(optionally)”一词是指“在一些实施方式中提供，而在其他实施方式中不提供”。本发明的任何具体实施方式可以包括多个“任选的”特征，除非这些特征发生冲突。
如本文所使用的，单数形式的“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括复数参考物，除非上下文另有明确规定。例如，术语“一种化合物(a compound)”或“至少一种化合物(atleast one compound)”可以包括多种化合物，包括其混合物。
贯穿本申请，本发明的各种实施方式可以以范围格式呈现。应当理解的是，以范围格式描述只是为了方便和简洁，并且不应理解为对本发明范围的僵化限制。因此，对某个范围的描述应被视为已具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，对范围比如从1到6的描述应被视为具体公开了子范围，比如1到3、1到4、1到5、2到4、2到6、3到6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。无论该范围的广度如何，这都适用。
每当本文指出一个数字范围时，其意思是包括所指出的范围内的任何引用的数字(小数或整数)。短语“范围在(ranging/ranges)”第一指示数字和第二指示数字“之间(between)”和“范围从(ranging/ranges)”第一指示数字“到(to)”第二指示数字在本文中可互换使用，并且意在包括第一和第二指示数字以及其间的所有小数和整数。
如本文所使用的术语“方法(method)”是指完成特定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物、生化和医学领域的从业人员已知的或从已知的方式、手段、技术和程序中容易开发的那些方式、手段、技术和程序。
可以理解的是，为了清楚起见，在单独的实施方式的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方式中组合提供。反之，为了简洁起见，在单个实施方式的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独提供，或以任何合适的子组合提供，或在本发明的任何其他描述的实施方式中合适地提供。在各种实施方式的上下文中描述的某些特征不应视为这些实施方式的必要特征，除非没有这些要素的实施方式是不起作用的。
对本发明各种实施方式的描述是为了说明的目的而提出的，但并不打算详尽地或限于所公开的实施方式。对于本领域普通技术人员来说，在不背离所描述的实施方式的范围和精神的情况下，许多修改和变化将是显而易见的。本文所使用的术语是为了最好地解释实施方式的原理、对市场上发现的技术的实际应用或技术改进，或使本领域普通技术人员能够理解本文公开的实施方式。
如上文所描述的和权利要求书中所要求保护的本发明的各种实施方式和方面在以下实施例中找到实验支持。
实施例
一般来说，本文使用的术语和本发明中使用的实验室程序包括分子、生化、微生物和重组DNA技术。此类技术在文献中得到了详尽的解释。参见，例如，“Molecular Cloning:Alaboratory Manual”Sambrook等人，(1989)；“Current Protocols in MolecularBiology”第I-III卷，Ausubel,R.M.,ed.(1994)；Ausubel等人，“Current Protocols inMolecular Biology”，John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,“APractical Guide to Molecular Cloning”，John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson等人，“Recombinant DNA”，Scientific American Books,New York；Birren等人(编)“Genome Analysis:ALaboratory Manual Series”，第1-4卷，Cold Spring HarborLaboratory Press,New York(1998)；美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中阐述的方法；“Cell Biology:ALaboratory Handbook”，第I-III卷，Cellis,J.E.编(1994)；“Culture of Animal Cells-AManual of Basic Technique”，Freshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994)，第三版；“Current Protocols in Immunology”，第I-III卷，Coligan J.E.编(1994)；Stites等人(编)，“Basic and Clinical Immunology”(第8版)，Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell and Shiigi(编)，“Selected Methodsin Cellular Immunology”，W.H.Freeman and Co.,New York(1980)；专利和科学文献中对可用免疫测定法有广泛的描述，参见例如，美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；“OligonucleotideSynthesis”，Gait,M.J.编(1984)；“Nucleic Acid Hybridization”Hames,B.D.和HigginsS.J.编(1985)；“Transcription and Translation”，Hames,B.D.和Higgins S.J.编(1984)；“Animal Cell Culture”Freshney,R.I.编(1986)；“Immobilized Cells andEnzymes”IRL Press,(1986)；“APractical Guide to Molecular Cloning”Perbal,B.,(1984)和“Methods in Enzymology”，第1-317卷，Academic Press；“PCR Protocols:AGuide To Methods And Applications”，Academic Press,San Diego,CA(1990)；Marshak等人，“Strategies for Protein Purification and Characterization-ALaboratoryCourse Manual”，CSHL Press(1996)；所有这些都是通过引用而并入。本文件中还提供了其他一般的参考文献。
材料和方法
动物
在常规条件下饲养12-16周的雄性棕色挪威大鼠，并用作肢体异体移植的供体和受体二者。Tel Aviv Sourasky医疗中心机构动物护理和使用委员会批准了所有的动物实验。
手术程序
肢体收获
在诱导笼中以5L/min的流速吸入2％的异氟烷和氧气来诱导麻醉。用1-2％的异氟烷吸入剂维持麻醉。准备好供体的手术部位，并且围绕右后肢的圆周做一个皮肤切口，高度在膝盖上方1cm处。首先，调动大腿上部的皮肤以暴露大腿内侧的股二头肌和内收肌群。所有来自大腿但跨越膝关节的浅层肌肉群都在膝关节周围被切断，以暴露膝关节。股四头肌的肌腱在髂韧带上方被横切。腓肠肌和比目鱼肌被切除，但保留了跟腱。在打开膝关节囊后，通过切断所有韧带将膝关节完全分离。这些肌肉和韧带为二次修复留下了足够的残留组织的边缘。其次，在跗关节后面找到坐骨神经，以暴露胫骨神经和腓总神经。在放置10-0尼龙的标签缝合后，胫骨神经在小腿中部被横切，腓神经在腓骨小头(fibulae capitulum)上方被分离。这些神经保留了中枢神经(mesoneural)组织。第三，从腹股沟韧带到上腹部取出(takeoff)的水平分离股骨血管。然后在先前放置的缝合标签上方夹住股骨血管并横切。使用22号留置针(angiocatheter)，通过股动脉手动灌注约5mL 0.9％的温盐水和50U肝素，直到静脉流出的液体澄清。一旦分离，供体肢体(移植物)被包裹在湿润的纱布中，直到它接受玻璃化处理。供体动物被安乐死。
肢体移植
冷冻和加热后，受体动物被麻醉并准备手术。在臀部做一个长约1.5cm的斜切口，略高于肢体，进一步向远端暴露和分割股骨血管，以保留与供体肢体相近的足够的长度。通过用10-0尼龙的简单间断缝合进行血管吻合来移植供体肢体。肌肉群与腹壁接近，并施用6-0prolene乳酸林格氏液(5mL，IP)。用间断的4-0尼龙线缝合使皮肤闭合。
肢体移植重新定位到膝盖以下位置
受体肢体的膝盖以下截肢
对接受肢体的大鼠进行麻醉，并剃除动物的右后肢和小背部。从腰部到大腿内侧区域做一个切口。在膝关节上方分离股动脉和股静脉进行吻合。玻璃化后的肢体首先被固定，以便在吻合期间保持稳定。吻合的血管保持适当的张力。
冷冻保存肢体的膝盖以下定位和连接
冷冻保存的肢体作为第五个肢体移植后10至14天，在皮肢肢体同侧的受体肢体的小腿胫骨前部做个切口，以暴露浅层肌肉。接下来对受体的肢体进行膝盖以下的截肢，同时保留受体的腓肠肌、比目鱼肌、跟腱和胫骨神经部分，终止于脚踝位置以上约1cm。沿着原来的切口切开冷冻肢体的疤痕，并分离皮下筋膜和纤维索，直到血管梗塞完全不存在。然后将冷冻保存的肢体移到截肢的膝关节下方。在膝盖以下的位置进行相应的冷冻保存：首先，对膝关节后囊进行缝合和连接。第二，修复膝盖韧带；1)膝盖的十字韧带；2)两侧的副韧带；3)膝关节的前囊和左、右囊。第三，缝合髌骨韧带和跟腱。第四，在脚踝上方1cm处对受体和供体的胫骨神经进行吻合。第五，修复浅层肌肉(大腿内侧肌(vastus medialis)、大腿外侧肌(vastus lateralis)、股二头肌(biceps femoris)、半腱肌(semitendinosus)、半膜肌(semimememus)和内收肌群(adductor group))。第六，将调整后的接受区的皮肤与冷冻的肢体的皮肤进行缝合。
血管化腹股沟皮瓣
皮瓣收获
在供体中，以股动脉和静脉为基础，从腹股沟处收获3×4cm的皮瓣，包括腹肌正上方的平面的底层角膜和腹股沟脂肪组织。收获后，用肝素化的林格乳酸盐溶液(50U肝素在10ml林格乳酸盐中)灌注皮瓣，直到静脉流出物变得澄清。
皮瓣移植
在受体大鼠的右侧创建相同大小的缺陷。在冷冻和解冻皮瓣的插片后，在手术显微镜的放大镜下，使用标准的显微外科技术，用10/0尼龙缝合线以端对端方式进行受体和供体的股动脉的动脉吻合。接下来，用4/0可吸收缝线(Vicryl，Ethicon，Inc.)将皮瓣缝合到缺陷处。
肢体玻璃化程序
将收获的肢体用各5ml的以下溶液手动灌注0.5分钟：
1.平衡溶液(E.S)：7.5％的乙二醇(EG)+7.5％的DMSO+20％的胎牛血清(FCS)的威斯康星静态保存溶液(SPS-1，器官保存系统)。
2.玻璃化溶液(V.S)：20％的EG+20％的DMSO+20％FCS+0.5M的海藻糖的SPS-1溶液。
在灌注结束后，将肢体插入空的冷冻袋(
Figure BDA0004130843430000181
冷冻袋，Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)中，加入5ml V.S，并将袋抽真空和热密封。然后使用VitMaster装置(IMT，Nes-Ziona，以色列)将袋子插入LN融浆(在-205至-210℃之间)，持续4秒，然后将其置于离LN表面1cm的LN蒸汽中，根据指示，持续2分钟或最长2小时。
肢体加热程序
将冷冻袋插入加热至38℃的水浴中，直到肢体解冻(约2-3分钟)。打开袋子，并将肢体取出并插入补充有1M蔗糖的SPS-1中，持续2分钟，并且然后插入生理盐水中，再持续2分钟。
然后用以下清洗液手动灌注肢体(每种溶液1ml/0.5min)。洗涤液1(WS1)：1M蔗糖和20％ FBS的SPS-1溶液，WS2：WSI在SPS-1中的1/1稀释液，WS3：WS2在SPS-1中的1/1稀释液，WS4：WS3在SPS-1中的1/1稀释液。在WS4之后，用10-20ml生理盐水清洗肢体。
血管化腹股沟皮瓣玻璃化程序
将收获的皮瓣用各1ml的以下溶液手动灌注0.5分钟：
1.平衡溶液(E.S)：7.5％的乙二醇(EG)+7.5％的DMSO+20％的胎牛血清(FCS)的威斯康辛静态保存溶液(SPS-1，器官保存系统)。
2.玻璃化溶液(V.S)：20％的EG+20％的DMSO+20％的FCS+0.5M的海藻糖的SPS-1溶液。
灌注结束后，将皮瓣插入一个空的冷冻袋(
Figure BDA0004130843430000191
冷冻袋，MiltenyiBiotec，Bergisch Gladbach，德国)，加入1ml V.S，并将袋抽真空和热密封。然后用VitMaster装置(IMT，Nes-Ziona，Israel)将袋子插入LN融浆中(在-205至-210℃之间)，持续3秒，然后将其放置在离LN表面1cm的LN蒸汽中，持续2分钟，并且然后转移到-80℃冷冻室中，储存24小时或7-9天。可选地，在加热之前，立即将带皮瓣的袋子放在LN蒸汽中，持续30分钟。
皮瓣加热程序
将冷冻袋插入加热到38℃的水浴中，直到肢体解冻(约30秒)。打开袋子，并将皮瓣取出并插入补充有1M蔗糖的SPS-1中，持续2分钟，并且然后插入生理盐水中，再持续2分钟。
然后用以下清洗液手动灌注肢体(每种溶液1ml/0.5min)。洗涤液1(WS1)：1M的蔗糖和20％ FBS的SPS-1溶液，WS2：WSI在SPS-1中的1/1稀释液，WS3：WS2在SPS-1中的1/1稀释液，WS4：WS3在SPS-1中的1/1稀释液。在WS4之后，用10-20ml生理盐水清洗肢体。
移植后处理
所有移植的大鼠从手术后第2天(POD2)到POD30都戴有伊丽莎白项圈，并每天进行腹腔注射Clexane(75IU/kg)和Baytril(5mg/kg)治疗，直到POD7。
组织学分析
动物牺牲后收获肢体和皮瓣样品，并制备石蜡切片。切片经苏木精和曙红(H&E)染色，并且图像由Philips图像管理系统3.3.1HF1采集。
神经再生的免疫组织化学染色
将包括近端和远端吻合部位的胫骨神经切除并固定在2.5％多聚甲醛(PFA)中。将神经样品解剖成神经吻合近端(受体部分)和与神经吻合处远端0.5cm(供体冷冻保存部分)的两段。然后将组织嵌入石蜡块中，并以大约5μm的厚度进行切片。用作为运动神经元纤维的标志物(山羊抗CHAT AB144 Millipore)的抗胆碱乙酰转移酶抗体(ChAT)和作为一般神经元纤维的标志物(CD-NB300-133 Novus)的抗神经纤维(NF)抗体进行切片染色。DAPI用于非特异性的细胞核染色。这两种染色(ChAT和NF)是单独进行的，以便评估与神经元纤维的总体数量相比完整的运动纤维的数量。使用配备与相机(DS-Qi1，NiKOn)连接的Plan Fluor物镜(6×，20×)的荧光OR显微镜(Eclipse Ni-U；日本东京Nikon公司)对染色切片进行检查和拍照。由病理学家进行盲法数字形态分析，并使用数字系统进行细胞定量计数。使用Image Pro软件收集和分析了数字图像。使用Adobe Photoshop(Adobe Systems，San Jose，CA)对图像进行组合。
实施例1
冷冻保存的血管化腹股沟皮瓣在移植后的长期存活
使用血管化腹股沟皮瓣大鼠模型校准了大型组织玻璃化方案的主要参数，该模型模拟了常规塑料整形外科实践中使用的血管化皮瓣。冷冻保护剂灌注时间的校准表明，长时间的灌注(>5分钟)会导致皮瓣在移植后的头3天内死亡，而灌注时间短于5分钟则允许腹股沟皮瓣长期存活(数据未显示)。为了进一步减少CPA暴露，使用LN融浆将腹股沟皮瓣迅速冷却到零下温度。为了尽量减少暴露于LN融浆的组织开裂/断裂，将腹股沟皮瓣在LN融浆中冷却越来越长的时间间隔，并对损伤进行评估。在长达7秒的融浆暴露和2分钟的LN蒸汽冷冻后，观察到血管化腹股沟皮瓣的血液再灌注，并且没有明显的出血或损伤迹象。相反，在暴露于LN融浆10秒，接着暴露于LN蒸汽2min的皮瓣中，注意到多个出血点，表明血管受损(图1A)。进一步延长皮瓣暴露于LN融浆的时间至20秒，导致血管完全断裂，排除了蠕变后的皮瓣移植(图1A)。按照在下一阶段，皮瓣被灌注，在LN融浆中短暂冷却(3秒)，在LN蒸汽中冷却到约-60℃，持续5分钟，并立即转移到-80℃冷冻室，长期冷却24小时(图1C)或9天(图1D)。在冷冻保存后，皮瓣被加热、清洗，重新转移到一个同基因受体上，并跟踪其存活。可以看出，冷冻24小时或9天的皮瓣表现出长期的生存能力，包括从POD21开始的毛发生长。有趣的是，所有的冷冻保存的皮瓣都显示出白色的“乳状(milky)”皮肤颜色，其有时还伴随着白色的毛发生长。不同皮肤层和皮下脂肪组织的完整性在POD12皮瓣冷冻保存24小时(图1Ea-1Ec)或9天(图1Ed-1Ef)的组织学分析中得到进一步证明。尽管存活良好，但是与冷冻保存24小时的皮瓣相比，冷冻保存9天的皮瓣显示出增加的临床症状，这表明，正如可以预期的那样，在高于冷冻保护剂的Tg'的温度下保存活体组织是不稳定的。
为了实现更可靠的长期冷冻保存技术，本发明人评估了将皮瓣冷却到更稳定的玻璃化溶液Tg'(其被确定为约-121℃)的效果(图2AI)。由于皮瓣相对薄的性质，且在LN蒸汽中快速冷却，我们去掉了LN融浆冷冻阶段，通过将皮瓣在LN蒸汽中温育30分钟，使其冷却速度为约80℃/分钟，将其整个冷冻到Tg'(图2AII)，这与其他成功的组织冷冻报告相当(图2B)。将皮瓣冷却到玻璃化溶液的Tg'是成功的，如从移植后其长期存活(图2CI)和手术后第12天(POD12)的组织学评估中所有皮肤层和皮下脂肪的正常外观(图2CII)所表明的。因此，快速冷却到Tg'并在Tg'下长期储存可以为LN融浆快速冷却和冷冻保存提供有效的替代方案。
实施例2
冷冻保存的血管化后肢在移植后的长期存活
接下来，将新型冷冻保存方案应用于更大、更复杂的后肢模型。由于与腹股沟皮瓣相比肢体的体积更大，在更渐进的LN汽化阶段之前，包括短暂(4秒)的LN融浆冷却阶段(图2A)。这种两阶段的冷却策略允许快速冷却到零度以下的温度(-4℃)，然后更渐进地冷却(7℃/分钟)到-70℃，而没有组织损伤或开裂，如从移植后肢体的长期存活(30天)、正常的毛发生长和外周血灌注(图2B-2C)所表明的。重要的是，除了正常的皮肤组织学，在冷冻、移植(POD 0)和移植后长达30天(图2BII)，很大一部分肢体肌肉显示出正常的结构，表明一旦应用神经再支配，肢体功能恢复的可行性。
实施例3
在Tg'下冷冻保存后的长期肢体存活
如同关于皮瓣所表明的，本发明人接下来研究了肢体在冷冻到更稳定的Tg'时的存活能力，该温度可以保证当其存储在LN蒸汽或任何其他可以保持这种温度的冷冻装置中时的长期存活。肢体经受玻璃化方案(图3A)，其中短暂的(4秒)LN融浆冷却阶段之后在LN蒸汽相中2小时，这足以使肢体温度降低到Tg'。在移植后，冷冻保存的肢体存活直到POD28实验结束，显示出毛发再生(图3B)和良好的外周血灌注(图3C)。从图3D中可以看出，在移植过程中被埋在皮下的大部分肢体显示出皮下肌肉区域正常的良好灌注外观。牺牲后的活检显示出正常的皮肤结构(图3E)。由于肌肉的存活对实现神经再支配后的肢体功能恢复至关重要，而且肌肉被认为是最敏感的肢体组织，因此对冷冻保存后的肌肉存活和恢复进行了评估，并与未冷冻的移植对照的肌肉进行比较。从9个肢体的不同肢体部分提取活体组织，并在H&E染色后评估组织学切片。如图6A和B所示，在约-80℃或Tg下冷冻保存后的肌肉状态与移植前用生理盐水或CPA灌注的新鲜肢体的肌肉状态没有明显区别(图6A-6B)。所有的样品都显示出正常的皮肤、皮下和筋膜方面。大多数肌肉筋膜显示出正常的结构和保留的肌纤维，伴有周边的细胞核。少数筋膜显示有坏死和再生的迹象，伴有中心细胞核。一些筋膜显示水肿和由巨噬细胞和淋巴细胞组成的肌周/肌内膜炎症浸润。一些筋膜显示出带状的(zonal)神经根萎缩。最终，一些筋膜被脂肪组织所取代。新鲜对照组和冷冻保存的肢体在移植后表现出类似的特征，并且没有发现明显的差异，这表明我们的冷冻保存方法在保存肌肉完整性方面的功效。与组织学发现一致，通过该方案冷冻保存的肢体的长期存活明显优于通过DF或冷却到低于玻璃化溶液Tg的温度冷冻保存的肢体(图6C)。
实施例4
冷冻保存的肢体的移植证明了神经再生和功能感觉
为了证明冷冻保存的肢体重新获得其功能的能力，开发了新的两阶段移植模型，其中冷冻保存的肢体首先作为第五个肢体进行移植，直到其从移植程序中恢复(～POD12)，并且然后转移以取代膝盖以下的截肢(图4A)。重要的是，在将肢体从大鼠的腰部(最初移植的地方)转移到膝盖以下的位置时，肢体仍然与血管相连，排除了血管吻合的需要和随之而来的肢体局部缺血。在重新定位并与受体膝盖连接后，在移植肢体脚踝附近对接受的供体胫骨神经进行了吻合。在肢体重新定位到膝盖以下位置后第21天，大鼠能够靠其移植的肢体自由行走，并且该肢体是可存活的(图4B)。虽然使用冷冻保存的肢体行走主要是由受体的肌肉支持，但是这表明了该肢体支撑大鼠体重和功能性行走的能力。此外，使用该肢体可能对改善神经再生很重要，类似于手部移植后患者的物理治疗。重要的是，在神经重新连接后第21天，神经在近端爪子区域恢复了痛觉(数据未显示)。免疫组织化学分析进一步证明了神经再生，这显示了神经丝和运动神经元在神经吻合处远端约0.5cm处染色(图4C)。
讨论
大型组织、肢体或器官的成功冷冻保存有可能彻底改变医学重建和器官移植领域。本发明人最近报道了通过定向冷冻或玻璃化冷冻保存后大鼠后肢的短期(3天)成功存活。目前的工作首次证明，在大鼠模型中，血管化腹股沟皮瓣和后肢在冷冻保存和移植后成功长期存活。这是使用新的冷冻保存方案实现的，该方案修改了现有的玻璃化方案的三个重要参数。首先，它涉及室温下的快速冷冻保护剂灌注。其次，冷冻分两个阶段进行，快速冷却到零下温度(约360℃/分钟)，然后更渐进地冷却(约-8℃/分钟)到Tg'(-121℃)。最后，长期保存的温度是在溶液的Tg'，而不是在较低的液氮(-180℃)或低的液氮蒸汽冷冻条件下(<-150℃)，这些条件存在于基于LN的干式运载器(dry shipper)容器中。在POD28-32时，通过毛发生长、外周血灌注和正常的皮肤、脂肪和肌肉组织学分析都证明了肢体的活力。此外，使用包括肢体的神经再支配的新型的膝下移植模型，证明了冷冻保存的肢体的神经再生和功能感觉的恢复。总的来说，这些发现为未来开发大型组织、肢体和器官的冷冻保存方案提供了坚实的基础。
血管化组织/肢体/器官的冷冻保存的优点之一是，与非血管化的组织相比，可以通过动脉灌注解决冷冻保护剂的质量转移限制，使其快速且有效地分布。由于高浓度冷冻保护剂(在这里公开的玻璃化溶液中为40％ V/V)的毒性，这项工作评估了冷冻保护剂在室温下灌注的有效性，灌注时间降至最低。这一决定是基于初步实验，该实验表明，只有经过快速灌注<5分钟的皮瓣才能在移植后保持其活力，这很可能是由于冷冻保护剂对其血管造成的损伤减少引起的。为了进一步减少冷冻保护剂的毒性和冷冻损伤，引入了涉及LN融浆的冷却步骤，并为肢体提供了超过200℃/分钟的热传导，在4秒内达到零下温度。
迄今为止，玻璃化的唯一实际用途是用于小型组织和细胞(即卵母细胞、精子、胚胎)的冷冻保存，这些组织和细胞受益于快速冷却和加热，几乎没有冰晶生长，并且使用相对低的冷冻保护剂浓度进行无损伤的冷冻保存。在这种情况下，在有冷冻保护剂的情况下，冰晶的生长被快速的热传递所抑制。然而，这种快速冷却和加热目前在大型组织中是不可能的。本发明提供了一种两阶段的冷却方案，短期的液氮融浆浸泡可以快速达到零度以下的温度，随后在液氮蒸汽中进行较慢的冷却(7℃/min)。事实上，与本文公开的成功的两阶段渐进式冷冻(～7℃/分钟)方案相比，本发明人试图通过LN融浆浸泡(～400℃/分钟)将肢体快速冷冻到约-80℃没有成功，导致肢体在POD2因血凝块形成而死亡(数据未显示)。
反复尝试将肢体或皮瓣在-186℃的MVE干式运载器中进行短期储存没有成功，导致其在移植后迅速死亡。呈现的结果表明，当组织保持在接近Tg'的温度时，冷冻保存是最成功的。为了使建议的两步玻璃化程序标准化，本发明人开发了一种新的玻璃化装置，它可以控制在LN融浆中快速冷却预定的时间段，并且然后将温度提高到Tg'进行长期储存(图6-14)。建议的方案和装置的简单性将使医院和战斗环境中的截肢和组织的即时冷冻保存成为一种简单的方法。
现代重建手术主要依靠来自供体部位的自体部分(例如，血管化皮瓣、骨骼和神经)，在那里收获它们不会导致残疾。尽管它取得了巨大的成功，但是当损伤很大时，重建仍然是有限的，并且甚至当它发生在复杂的结构，比如肢体或面部时，更是如此。最近出现的VCA通过利用来自外来大脑死亡供体的复合移植，扩大了重建的范围。然而，尽管其取得了成功，但由于受体对外来移植物产生了大量的免疫排斥反应，需要终身使用免疫抑制药物才能使移植物存活，通常导致严重的不良反应，并且有时甚至死亡，因此推迟了VCA的常规临床使用。本发明人提出，创伤后立即冷冻保存截肢和血管化组织将使自体重建/再移植推迟到患者稳定后或直到条件允许进行这种复杂的手术(熟练的显微外科团队+显微外科手术室和使用创伤期间污染的组织)。此外，与实体器官供应不足不同的是，需求量较小的肢体可以被储存/储库(bank)，以供将来使用。这样的储库将通过增加供体和受体之间的HLA匹配来推动VCA领域，这将减少异体移植排斥的风险。它还将消除收获后肢体活力有限(最长6小时)所带来的严格的时间限制，并允许有计划地进行移植手术。此外，与实体器官不同，肢体匹配还需要审美匹配，这可以通过肢体储库来改善。
根据这一方法，目前的研究在临床使用冷冻保存以加强创伤后的复杂组织重建方面又迈出了一步。使用本文公开的冷冻保存方案，在冷冻到约Tg'温度(<-100℃)和移植后，实现了肢体和血管化皮瓣的长期存活。这种首次实现的冷冻保存组织的长期存活，为大型活体组织的保存时间超过72小时奠定了基础，扩大了救生程序的窗口。重要的是，有益的重建不一定要依靠完整的肢体重植，而且还可以利用较小的组织部件(血管化皮瓣和骨移植物、神经、皮肤移植物等)进行重建，这些部件在大规模创伤后往往缺乏，并排除了供体部位的发病率。重要的是，除了仅肢体存活之外，组织学分析能够证明冷冻保存和长期移植后有活力的肌肉，表明功能性冷冻保存的肢体恢复是可行的，这取决于肌肉恢复。尽管整个肌肉束保存良好，但是>POD10组织学分析也显示了肌肉细胞的再生，这可能是对冷冻引起的损伤或截肢期间神经紊乱引起的肌肉去神经支配的反应。使用我们新颖的两阶段移植模型进一步实现了冷冻保存后的肢体功能恢复的可行性，该模型使我们能够显示膝下再移植和神经吻合后神经和肢体感觉的再生。综上所述，所提出的发现证明了我们的冷冻保存方法极大地改善创伤后的功能性肢体再移植或肢体异体移植的冷冻库的可行性。
尽管本发明已经结合其具体实施方式进行了描述，但是显然，对于本领域的技术人员来说，许多替代方案、修改和变化都是显而易见的。因此，本发明旨在包含所有落在所附权利要求的精神和广泛范围内的这种替代方案、修改和变型。
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请在此通过引用以其整体并入本说明书，其程度与每篇单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独指明通过引用并入本说明书相同。此外，本申请中对任何参考文献的引用或鉴定不应解释为承认该参考文献可作为本发明的现有技术。在使用章节标题的情况下，它们不应解释为一定是限制性的。

Claims (34)

1.一种用于冷冻保存生物样品的方法，包括以下步骤：
a.将生物样品与玻璃化溶液(VS)以范围从50:1至1:1的体积/体积(v/v)比接触；
b.使步骤(a)的所述生物样品第一次经受范围从-210℃至-197℃的温度，持续时间段为3-10秒；和
c.使步骤(b)的所述生物样品第二次经受等于或高于所述VS的玻璃化转变点温度(Tg)并且范围从-140℃至-100℃的温度，持续时间段为至少3分钟；
从而冷冻保存所述生物样品。
2.一种制备用于移植给有需要的受试者的生物样品的方法，包括以下步骤：
a.将生物样品与VS以范围从50:1至1:1的体积/体积(v/v)比接触；
b.使步骤(a)的所述生物样品第一次经受范围从-210℃至-197℃的温度，持续时间段为3-10秒；和
c.使步骤(b)的所述生物样品第二次经受等于或高于所述VS的Tg并且范围从-140℃至-100℃的温度，持续时间段为至少3分钟；
从而制备用于移植给有需要的受试者的生物样品。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述生物样品包括被血管化的、神经支配的或二者的组织或器官。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述生物样品包括肢体。
5.一种用于冷冻保存肢体、制备用于移植给有需要的受试者的肢体或二者的方法，包括以下步骤：
a.将包括所述肢体的生物样品与VS以范围从50:1至1:1的体积/体积(v/v)比接触；
b.使步骤(a)中包括所述肢体的所述生物样品第一次经受范围从-210℃至-197℃的温度，持续时间段为3-10秒；和
c.使步骤(b)中包括所述肢体的所述生物样品第二次经受等于或高于所述VS的Tg’并且范围从-140℃至-100℃的温度，持续时间段为至少3分钟；
从而冷冻保存肢体、制备用于移植给有需要的受试者的肢体或二者。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，进一步包括在所述第二次经受之后保存所述生物样品，其包括将所述生物样品以范围从-1℃/min至-10℃/min的速率进一步冷却至低于所述Tg或在-197℃至-150℃之间的温度。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中将在步骤(a)之后获得的所述生物样品浸没在所述VS中、由所述VS覆盖或二者。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述接触是在真空条件下。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述接触是在弹性袋中。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之后获得的所述生物样品基本上没有空气。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中在步骤(b)之后获得的所述生物样品包括与所述VS接触的外表面，其中所述外表面的特征在于具有范围从-20℃至0℃的温度。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述第一次经受以-330℃/min至-500℃/min的速率冷冻。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述第一次经受是在冷冻液体的融浆中或在-220℃至-150℃的冷冻条件下。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述第二次经受以-3℃/min至-10℃/min的速率冷冻。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述第二次经受是在：(a)冷冻液体的蒸汽中；或(b)提供范围从-85℃至-75℃的温度的冷却条件中，随后是冷冻液体的蒸汽。
16.根据权利要求15所述的方法，其中提供范围从-85℃至-75℃的温度的所述冷却条件包括具有范围从-85℃至-75℃的温度的冷却液体。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中步骤(c)中至少3分钟的所述时间段为至少30分钟。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，进一步包括在步骤(a)之前的步骤，其包括用所述VS灌注所述生物样品。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述灌注是在室温下，持续至多5分钟的时间段。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述VS包括以下至少一种：渗透性冷冻保护剂、非渗透性冷冻保护剂或其组合，并且任选地进一步包括：大分子、抗氧化剂、培养基或其任何组合。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述VS包括：15-25％(w/v)的乙二醇、15-25％(v/v)的二甲基亚砜、15-25(v/v)的胎牛血清和0.3-0.7M的海藻糖，所有这些都在威斯康辛静态保存溶液中。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，进一步包括步骤(d)，其包括将所述冷冻保存的生物样品保存至少24小时的时间段。
23.一种在有需要的受试者中移植生物样品的方法，包括以下步骤：(a)根据权利要求1至22中任一项所述的方法冷冻保存所述生物样品；和(b)解冻或加热并移植所述冷冻保存的生物样品至所述受试者。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述受试者需要器官替换。
25.根据权利要求23或24所述的方法，进一步包括清洗和灌注所述冷冻保存的生物样品的步骤，其中所述步骤在将所述冷冻保存的生物样品移植到所述受试者之前。
26.根据权利要求23至25中任一项所述的方法，其中所述移植是自体移植或异体移植。
27.一种装置，其包括：
第一容器，其构造来容纳样品；
致动器，其配置为通过沿冷却轴线的通道调整所述第一容器的位置；
加热元件，其与所述第一容器接触；和
控制单元，其与所述致动器和所述加热元件可操作地通信，并且配置为通过命令：(a)所述致动器的配置，使得通过沿着所述冷却轴的所述通道调整所述第一容器的位置；(b)所述加热元件向所述第一容器施加预定的热量；或(a)和(b)来控制所述样品的温度。
28.根据权利要求27所述的装置，其中所述轴线与所述通道的纵轴线平行。
29.根据权利要求27或28所述的装置，其中所述加热元件位于所述第一容器的顶部并至少部分地与之重叠。
30.根据权利要求27至29所述的装置，进一步包括至少一个温度传感器。
31.根据权利要求30所述的装置，其中所述至少一个温度传感器与所述第一容器耦连，使得所述第一容器的温度通过所述温度传感器是可测量的。
32.根据权利要求30或31所述的装置，其中所述控制单元与所述至少一个温度传感器可操作地通信。
33.根据权利要求27至32中任一项所述的装置，进一步包括第二容器，其构造来容纳冷冻液体、其融浆、其蒸汽或其任何组合。
34.根据权利要求33所述的装置，其中所述冷冻液体包括液氮(LN2)。
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