BR112019013403A2 - Método e matriz produzida por eletrofiação - Google Patents

Abstract

a presente divulgação refere-se a uma matriz de polímero biodegradável biocompatível que serve como modelo para o cultivo de tecido de pele diferenciado compreendendo uma derme e uma epiderme, a combinação da matriz e da pele diferenciada, o método de preparação da mesma e o tecido obtenível a partir do referido método. a revelação também se estende ao uso da pele diferenciada em tratamento. assim, é proporcionada uma matriz de fibras produzidas por eletrofiação para o cultivo de tecido de pele diferenciado preparado por solução de eletrofiação de um polímero biocompatível biodegradável, em que as fibras produzidas por eletrofiação têm de cerca de 0,3 µm a cerca de 5 µm de diâmetro por exemplo, 1 a 5 µm, tal como 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4 ou 4,5 µm.

Description

“MÉTODO E MATRIZ PRODUZIDA POR ELETROFIAÇÃO” [0001] A presente divulgação refere-se a uma matriz de polímero biodegradável biocompatível que serve como modelo para o cultivo de tecido de pele diferenciado compreendendo uma derme e uma epiderme, a combinação da matriz e da pele diferenciada, o método de preparação da mesma e o tecido obtenível a partir do referido método. A revelação também se estende ao uso da pele diferenciada em tratamento.

ANTECEDENTES [0002] O documento número WO2016/209089, de Dunbar et al. divulga um dispositivo para cultivar células de fibroblastos e queratinócitos, para formar tecido de pele diferenciado. Um arcabouço, molde ou matriz é tipicamente utilizado para suportar o cultivo e diferenciação das células da pele. Em Dunbar et al, o dispositivo de cultura de células compreende uma estrutura que contém uma matriz (também referida como substrato). A matriz pode ser movida entre duas orientações. Na primeira orientação, as células estão na superfície da matriz e não em contato com uma membrana permeável a gás no dispositivo. Uma vez que as células tenham tido tempo de se ligar, tipicamente após cerca de 24 a 48 horas, então o dispositivo é invertido para a segunda orientação de tal forma que as células na superfície da matriz estejam agora em contato com, ou muito próximas à, membrana permeável a gás. Essa proximidade é o que induz os queratinócitos a se diferenciarem e formarem uma epiderme estratificada. Antes do dispositivo de Dunbar et al, a estratificação epidérmica foi alcançada pelo cultivo das células em uma interface ar-líquido. Assim, o dispositivo Dunbar elimina a necessidade de uma interface ar-líquido usando uma interface permeável a gás.

[0003] Embora a capacidade de alterar a orientação da plataforma que segura as células, durante o cultivo, seja de vital importância para a diferenciação das células, os presentes inventores estabeleceram agora que a natureza do suporte de matriz empregada tem um impacto significativo no

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2/77 cultivo e diferenciação de células.

[0004] É importante que as células fibroblásticas sejam capazes de migrar para dentro e através da matriz para formar uma derme. No entanto, se os poros da matriz forem muito grandes, a matriz não suporta adequadamente uma “camada” de queratinócitos em contato/comunicação com a membrana permeável a gás, o que pode impedir que a epiderme se forme adequadamente.

[0005] Além disso, a pele humana naturalmente gerada possui cristas Rete, que são contornos na interface derme-epiderme que fornecem resistência à força de cisalhamento. Em contraste, a pele cultivada em matrizes atualmente disponíveis não possui cristas Rete, o que torna a pele vulnerável a danos por forças de cisalhamento durante o manuseio, aplicação do enxerto de pele ao paciente e durante procedimentos subsequentes, por exemplo, cobertura com curativos de feridas. Esta falta de robustez é uma desvantagem significativa dos produtos de pele sintética.

[0006] Assim, existe uma necessidade de um suporte ou matriz melhorada que possa suportar o cultivo de células da pele e alcançar uma estratificação epidérmica adequada.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0007] A invenção é resumida nos seguintes parágrafos:

[0008] 1. Uma matriz de fibras produzidas por eletrofiação para cultivar tecido de pele diferenciado preparado por solução de eletrofiação de um polímero biocompatível biodegradável em que as fibras produzidas por eletrofiação têm de cerca de 0,3 pm a cerca de 5 pm de diâmetro, como 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4 ou 4,5 pm.

[0009] 2. Uma matriz de acordo com o parágrafo 1, em que o polímero biodegradável biocompatível é selecionado do grupo PLGA, PLA, PCL, PHBV, PDO, PGA, PLCL, PLLA-DLA, PEUU, celulose-acetato, PEGb-PLA, EVOH, PVA, PEG, PVP, PLA/PCL misturado, gelatina-PVA,

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PCT/colágeno, aliginato de sódio/PEO, quitosana/PEO, quitosana/PVA, gelatina/elastina/PLGA, seda/PEO, fibroína/quitosana, PDO/elastina, PHBV/colágeno, ácido hialurônico/gelatina, colágeno/sulfato de condroitina, colágeno/quitosana, PDLA/HA, PLLA/HA, gelatina/HA, gelatina/siloxano, PLLA/MWNTs/HA, PLGA/HA, homopolímero linear de dioxanona (como homopolímero linear de dioxanona 100) e combinações de dois ou mais dos mesmos.

[0010] 3. Uma matriz de acordo com o parágrafo 1 ou

2, em que o polímero é o poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA).

[0011 ] 4. Uma matriz de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 3, em que a concentração de polímero biodegradável biocompatível é de 26% a 40% p/v, por exemplo, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 ou 39% p/v.

[0012] 5. Uma matriz de acordo com o parágrafo 4, em que a concentração de polímero biodegradável biocompatível é de 35% p/v.

[0013] 6. Uma matriz de acordo com qualquer um dos parágrafos 2 a 5, em que a proporção de ácido poliláctico para ácido poliglicólico no PLGA está na faixa de 90:10 a 50:50 respectivamente, como 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35 ou 60:40.

[0014] 7. Uma matriz de acordo com o parágrafo 6, em que a proporção de ácido poliláctico para ácido poliglicólico é de 75:25 a 65:35, respectivamente, tal como 65:35.

[0015] 8. Uma matriz de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 7, em que o solvente compreende um ou mais independentemente selecionados de clorofórmio, etanol, HFIP de ácido acético, propan-2-ol, ácido acético, tetra-hidrofurano, DMSO, DMF, acetato de etila. 1,4dioxano, ácido fórmico e água.

[0016] 9. Uma matriz de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 8, em que um solvente compreendendo tetra-hidrofurano é empregado com o polímero biodegradável biocompatível.

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4/77 [0017] 10. Uma matriz de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 9, em que um solvente compreendendo dimetilformamida é empregado com o polímero biodegradável biocompatível.

[0018] 11. Uma matriz de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 10, em que um solvente compreendendo DCM é empregado com o polímero biodegradável biocompatível.

[0019] 12. Uma matriz de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 10, em que se utiliza um solvente que é uma mistura 1:1 de tetra-hidrofurano e dimetilformamida com o polímero biodegradável biocompatível.

[0020] 13. Uma matriz de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 12, em que a eletrofiação foi realizada a uma temperatura na faixa de 25 a 35 °C, tal como 30 °C.

[0021] 14. Uma matriz de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 13, em que uma agulha empregada na eletrofiação foi posicionada com sua ponta a 10 cm de uma placa coletora (como uma placa coletora de aço inoxidável).

[0022] 15. Uma matriz de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 14, em que se utilizou uma placa texturizada, por exemplo, micropadronizada, tal como ondulada ou crimpada, para recolher as produzidas por eletrofiação.

[0023] 16. Uma matriz de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 15, em que a eletrofiação foi realizada a uma vazão de 0,4 ml por hora ou inferior, por exemplo, 0,1 a 0,4 ml, tal como 0,3, 0,25, 0,2, 0,15 ou 0,1 ml por hora.

[0024] 17. Uma matriz de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 16, em que a matriz tem uma espessura de 1OOpm ou menos, por exemplo, 10 a 10Ομηη, tal como 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 ou 100pm.

[0025] 18. Uma matriz de acordo com qualquer um

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5/77 dos parágrafos 1 a 17, em que a matriz é revestida com uma proteína da matriz extracelular ou um seu peptídeo, por exemplo, um peptídeo sintético (por exemplo, para promover a adesão e/ou diferenciação celular, tal como a sequência de aminoácidos de colágeno, laminina e outras proteínas da matriz extracelular ou um fragmento peptídico ou seus fragmentos).

[0026] 19. Uma matriz de acordo com o parágrafo 18, em que a proteína da matriz extracelular é selecionada do grupo que consiste em colágeno IV, colágeno I, laminina e fibronectina, ou uma combinação destes, tal como colágeno IV.

[0027] 20. Uma matriz de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 19, compreende poros adequado para permitir a migração de fibroblastos, por exemplo, os poros estão na faixa de 2 a 30 microns, tal como de 15 a 25 microns, em particular 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 microns.

[0028] 21. Uma seção de tecido de pele que compreende uma matriz definida em qualquer um dos parágrafos 1 a 20, em que: células capazes de formar uma derme migraram para a matriz.

[0029] 22. Uma seção de tecido de pele de acordo com o parágrafo 21, em que as células são fibroblastos.

[0030] 23. Uma seção do tecido de pele de acordo com o parágrafo 21 ou 22, em que células epidérmicas capazes de se diferenciar em uma epiderme são acumuladas em uma face externa (tal face “plana superior”) da matriz.

[0031] 24. Seção da pele de acordo com o parágrafo

23, em que a dita superfície externa da matriz foi pré-revestida com colágeno, tal como o colágeno IV, antes da adição das células epidérmicas, tais como queratinócitos e fibroblastos, à cultura.

[0032] 25. Uma seção de tecido de pele de acordo com o parágrafo 23 ou 25, em que as células epidérmicas capazes de se diferenciar em epiderme são os queratinócitos.

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6/77 [0033] 26. Uma seção do tecido de pele de acordo com qualquer um dos parágrafos 22 a 24, em que existe uma camada epidérmica diferenciada.

[0034] 27. Uma seção do tecido de pele de acordo com qualquer um dos parágrafos 22 a 26, em que existe uma camada de derme.

[0035] 28. Uma seção do tecido de pele de acordo com o parágrafo 27, em que a matriz está contida na camada da derme.

[0036] 29. Uma seção do tecido de pele de acordo com qualquer um dos parágrafos 21 a 28, em que o polímero biodegradável biocompatível que compõe a matriz começou a se degradar.

[0037] 30. Uma seção do tecido de pele de acordo com qualquer um dos parágrafos 21 a 29, onde o tecido de pele compreende as cristas Rete sintéticas.

[0038] 31. Uma seção de pele de acordo com qualquer um dos parágrafos 21 a 30, contida em um dispositivo para cultura e/ou transporte, por exemplo, o dito dispositivo compreendendo:

[0039] um recipiente compreendendo uma primeira parede de extremidade (inferior) e pelo menos uma parede lateral, [0040] uma segunda parede de extremidade removível (superior) adaptada para engatar com o recipiente para definir uma câmara, e [0041] um arcabouço adaptado para receber uma matriz para as células residirem, [0042] em que pelo menos uma parte de pelo menos uma primeira parede de extremidade (inferior), a pelo menos uma parede lateral ou a segunda parede de extremidade (superior) compreende um material permeável a gás ou está adaptada para engatar com um material permeável a gás e é perfurada para permitir troca gasosa; e [0043] em que o aparelho é configurável entre (a) um primeiro modo em que a matriz não está disposta em comunicação gasosa com

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7/77 um material permeável a gás, e (b) um segundo modo no qual o substrato está disposto em comunicação gasosa com um material permeável a gás.

[0044] 32. Uma seção de pele de acordo com qualquer um dos parágrafos 21 a 31, em que a pele é autóloga a um paciente.

[0045] 33. Um método ex vivo de gerar um produto para a pele diferenciado definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 32 compreendendo as etapas de:

[0046] i) obter uma matriz produzida por eletrofiação fiada de um polímero biodegradável biocompatível em um solvente orgânico, em que as fibras produzidas por eletrofiação da matriz têm cerca de 0,3 pm a cerca de 5 pm de diâmetro, por exemplo, 1 a 5 pm, tal como 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4 ou 4,5 pm e [0047] ii) adicionar uma cultura de células epidérmicas capazes de se diferenciar em epiderme (como queratinócitos) e fibroblastos, e [0048] iii) cultivar as referidas células e matriz em um dispositivo ou pote compreendendo uma camada permeável a gás durante um primeiro período (por exemplo, até um mês, por exemplo, 30 dias, 28 dias, 21 dias, 14 dias, 7 dias, 5 dias, 4 dias, 3 dias, 48 horas ou 24 horas), em que a face da matriz com células epidérmicas depositadas da mesma é orientada distalmente da camada permeável a gás, e [0049] iv) após o primeiro período de cultura, mudar a orientação da matriz, de tal modo que a face com as células epidérmicas nela depositadas seja proximal à camada permeável a gás.

[0050] 34. Um método de acordo com o parágrafo 33, em que a face da matriz na qual as células epidérmicas serão depositadas é prérevestida para estimular a aderência e/ou diferenciação das células epiteliais.

[0051 ] 35. Um método de acordo com o parágrafo 34, em que o revestimento é uma proteína da matriz extracelular ou um seu peptídeo, por exemplo, uma sequência peptídica sintética (tal como a sequência de aminoácidos de colágeno, laminina e outras proteínas de proteínas da matriz

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8/77 extracelular ou um fragmento peptídico ou seus fragmentos).

[0052] 36. Um método de acordo com o parágrafo 35, em que a proteína da matriz extracelular ou o seu peptideo é selecionado do grupo que consiste em: colágeno IV, colágeno I, laminina e fibronectina e uma combinação destes, tal colágeno IV.

[0053] 37. Um método de acordo com qualquer um dos parágrafos 33 a 36, em que o polímero biodegradável biocompatível é selecionado do grupo PLGA, PLA, PCL, PHBV, PDO, PGA, PLCL, PLLA-DLA, PEUU, celulose-acetato, PEG-b-PLA, EVOH, PVA, PEG, PVP, PLA/PCL misturado, gelatina-PVA, PCT/colágeno, aliginato de sódio/PEO, quitosana/PEO, quitosana/PVA, gelatina/elastina/PLGA, seda/PEO, fibroína/quitosana, PDO/elastina, PHBV/colágeno, ácido hialurônico/gelatina, colágeno/sulfato de condroitina, colágeno/quitosana, PDLA/HA, PLLA/HA, gelatina/HA, gelatina/siloxano, PLLA/MWNTs/HA, PLGA/HA, homopolímero linear de dioxanona 100 e combinações de dois ou mais dos mesmos.

[0054] 38. Um método de acordo com qualquer um dos parágrafos 33 a 37, em que o polímero é poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA).

[0055] 39. Um método de acordo com qualquer um dos parágrafos 33 a 38, que compreende a pré-etapa de eletrofiação da matriz.

[0056] 40. Um método de acordo com o parágrafo 39, em que a concentração de polímero biodegradável biocompatível é de 26% a 40% p/v, por exemplo, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 ou 39% p/v.

[0057] 41. Um método para o cultivo de tecido de pele diferenciado de acordo com o parágrafo 40, em que a concentração de polímero biodegradável biocompatível é de 35% p/v.

[0058] 42. Um método de acordo com qualquer um dos parágrafos 33 a 41, em que a proporção de ácido poliláctico para ácido poliglicólico no PLGA está na faixa de 90:10 a 50:50 respectivamente, como 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35 ou 60:40.

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9/77 [0059] 43. Um método de acordo com o parágrafo 42, em que a proporção de ácido poliláctico para ácido poliglicólico é de 75:25 a 65:35, respectivamente, tal como 65:35.

[0060] 44. Um método de acordo com qualquer um dos parágrafos 39 a 43, em que o solvente compreende um ou mais independentemente selecionados de clorofórmio, etanol, ácido acético, hexafluoroisopropanol, propan-2-ol, ácido acético, DMSO, DMF, acetato de etila, 1,4-dioxano, dimetilacetamida, metiletilcetona, ácido fórmico e água.

[0061] 45. Um método de acordo com qualquer um dos parágrafos 39 a 44, em que um solvente compreendendo tetra-hidrofurano é empregado com o polímero biodegradável biocompatível.

[0062] 46. Um método de acordo com qualquer um dos parágrafos 39 a 45, em que um solvente compreendendo dimetilformamida é empregado com o polímero biodegradável biocompatível.

[0063] 47. Um método de acordo com qualquer um dos parágrafos 39 a 46, em que um solvente compreendendo DCM é empregado com o polímero biodegradável biocompatível.

[0064] 48. Um método de acordo com qualquer um dos parágrafos 39 a 47, em que se utiliza um solvente que é uma mistura 1:1 de tetra-hidrofurano e dimetilformamida, com o polímero biodegradável biocompatível.

[0065] 49. Um método de acordo com qualquer um dos parágrafos 39 a 48, em que a eletrofiação é realizada a uma temperatura na faixa de 25 a 35 °C, tal como 30 °C.

[0066] 50. Um método de acordo com qualquer um dos parágrafos 39 a 49, em que uma agulha empregada na eletrofiação está localizada com sua ponta a 10 cm de uma placa coletora (como uma placa coletora de aço inoxidável).

[0067] 51. Um método de acordo com qualquer um dos parágrafos 39 a 50, em que uma chapa texturizada, por exemplo,

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10/77 micropadronizada, tal como ondulada ou crimpada, é empregada para coletar as fibras.

[0068] 52. Um método de acordo com qualquer um dos parágrafos 39 a 51, em que a eletrofiação é realizada a uma vazão de 0,4 ml por hora ou inferior, por exemplo, 0,1 a 0,4 ml, tal como 0,3, 0,25, 0,2, 0,15 ou 0,1 ml por hora.

[0069] 53. Um método de acordo com qualquer um dos parágrafos 33 a 52, em que a matriz tem uma espessura de 100 pm ou menos, por exemplo, 10 a 100 pm, tal como 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 ou 100 pm.

[0070] 54. Um método de acordo com qualquer um dos parágrafos 33 a 53, em que o tecido de pele é cultivado em um dispositivo para cultivar células ou tecido, compreendendo, por exemplo:

[0071] um recipiente compreendendo uma primeira parede de extremidade (inferior) e pelo menos uma parede lateral, [0072] uma segunda parede de extremidade removível (superior) adaptada para engatar com o recipiente para definir uma câmara, [0073] um arcabouço adaptado para receber uma matriz para as células residirem, [0074] em que pelo menos uma parte de pelo menos uma primeira parede de extremidade (inferior), a pelo menos uma parede lateral ou a segunda parede de extremidade (superior) compreende um material permeável a gás ou está adaptada para engatar com um material permeável a gás e é perfurada para permitir troca gasosa; e [0075] em que o aparelho é configurável entre (a) um primeiro modo em que a matriz não está disposta em comunicação gasosa com um material permeável a gás, e (b) um segundo modo no qual o substrato está disposto em comunicação gasosa com um material permeável a gás.

[0076] 55. Um método de acordo com qualquer um

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11/77 dos parágrafos 33 a 54, em que o tecido de pele é transportado para a localização do paciente, por exemplo, é transportado no dispositivo definido no parágrafo 54.

[0077] 56. Um método de acordo com os parágrafos

55, em que o tecido de pele é recuperado do dispositivo por um profissional de saúde, tal como um cirurgião, por exemplo, removendo o tecido de um arcabouço no dispositivo disposto para manter a matriz e o tecido.

[0078] 57. Um método ex vivo de cultivo de tecido de pele diferenciado compreendendo as cristas Rete, em que o método compreende a eletrofiação de uma matriz polimérica biodegradável biocompatível com poros adequados para apoiar o cultivo diferenciado do tecido de pele em uma placa micropadronizada.

[0079] 58. Um modo ex vivo de cultivo do tecido de pele que compreende cristas epiteliais diferenciadas, compreendendo o referido método a etapa de cultivo das células da pele de uma matriz com uma superfície ondulada ou crimpada (por exemplo, formada por eletroaspersão das fibras da matriz sobre uma placa de recolha texturizada).

[0080] 59. Uma seção de tecido de pele diferenciado obtido ou obtenível de qualquer um dos parágrafos 33 a 58.

[0081] 60. Uma seção da pele de acordo com qualquer um dos parágrafos 21 a 31 ou 59 para uso em tratamento.

[0082] 61. Uma seção da pele de acordo com o parágrafo 60, em que o tratamento é para uma condição ou doença selecionada do grupo que consiste em: lesão de tecido; regeneração de pele com nervos e organelas; cicatrização de feridas, por exemplo, promovendo/intensificando a cicatrização de feridas, incluindo úlceras tais como úlceras diabéticas; cura de queimaduras; regeneração e reparação de pele; epidermólise bulosa; para substituir o tecido canceroso da pele excisado por cirurgia (tal como sarcoma, melanoma ou semelhante), para substituir o tecido de pele extirpado para tentar conter a infeção com fasceíte necrosante; para melhorar a qualidade ou

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12/77 aparência da pele; prevenção ou remediação de distúrbios de pele; diminuição ou supressão de tecido cicatricial; regeneração da pele da mama (após cirurgia); aplicações cosméticas, por exemplo, antienvelhecimento; regeneração dérmica para rugas e outros defeitos de pele; promoção de crescimento de folículo piloso, regeneração de nervo e outras organelas; cura sem cicatrizes, ou recura para diminuir cicatrizes.

[0083] 62. Uma seção da pele de acordo com o parágrafo 61, para uso no tratamento de uma cicatriz cirúrgica, uma úlcera, dano causado por fasceíte necrosante, qualquer coisa que exija enxerto de pele, por exemplo, cirurgia de câncer de pele, remoção de verruga, corte ou facada, uma ferida causada por uma força de cisalhamento, um arranhão, uma abrasão, uma queimadura química, psoríase, infecções de pele, úlceras ou semelhantes.

[0084] 63. Um método de tratamento compreendendo suturar uma seção de pele de acordo com qualquer um dos parágrafos 21 a 31 ou 60 a um paciente em necessidade da mesma [0085] 64. Um método de tratamento de acordo com o parágrafo 63, em que o tratamento é para uma condição ou doença selecionada do grupo que consiste em: lesão de tecido; regeneração de pele com nervos e organelas; cicatrização de feridas, por exemplo, promovendo/intensificando a cicatrização de feridas, incluindo úlceras tais como úlceras diabéticas; cura de queimaduras; regeneração e reparação de pele; epidermólise bulosa; para melhorar a qualidade ou aparência da pele; prevenção ou remediação de distúrbios de pele; diminuição ou supressão de tecido cicatricial; regeneração da pele da mama (após cirurgia); aplicações cosméticas, por exemplo, antienvelhecimento; regeneração dérmica para rugas e outros defeitos de pele; promoção de crescimento de folículo piloso, regeneração de nervo e outras organelas; cura sem cicatrizes, ou recura para diminuir cicatrizes.

[0086] 65. Um método de tratamento de acordo com o parágrafo 63, para uso no tratamento de uma cicatriz cirúrgica, uma úlcera, dano causado por fasceíte necrosante, qualquer coisa que exija enxerto de pele,

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13/77 por exemplo, cirurgia de câncer de pele, remoção de verruga, corte ou facada, uma ferida causada por uma força de cisalhamento, um arranhão, uma abrasão, uma queimadura química, psoríase, infecções de pele, úlceras ou semelhantes.

[0087] 66. A utilização de uma seção da pele de acordo com qualquer um dos parágrafos 21 a 31 ou 60 para a fabricação de um medicamento para o tratamento é para uma condição ou doença selecionada do grupo que consiste em: lesão de tecido; regeneração de pele com nervos e organelas; cicatrização de feridas, por exemplo, promovendo/intensificando a cicatrização de feridas, incluindo úlceras tais como úlceras diabéticas; cura de queimaduras; regeneração e reparação de pele; epidermólise bulosa; para melhorar a qualidade ou aparência da pele; prevenção ou remediação de distúrbios de pele; diminuição ou supressão de tecido cicatricial; regeneração da pele da mama (após cirurgia); aplicações cosméticas, por exemplo, antienvelhecimento; regeneração dérmica para rugas e outros defeitos de pele; promoção de crescimento de folículo piloso, regeneração de nervo e outras organelas; cura sem cicatrizes, ou recura para diminuir cicatrizes.

[0088] 67. Uso de uma seção da pele de acordo com qualquer um dos parágrafos 21 a 31 ou 60, para a fabricação de um medicamento para uso no tratamento de uma cicatriz cirúrgica, uma úlcera, dano causado por fasceíte necrosante, qualquer coisa que exija enxerto de pele, por exemplo, cirurgia de câncer de pele, remoção de verruga, corte ou facada, uma ferida causada por uma força de cisalhamento, um arranhão, uma abrasão, uma queimadura química, psoríase, infecções de pele, úlceras ou semelhantes.

[0089] 68. Uma placa coletora, tal como uma placa coletora de aço inoxidável, para recolher fibras de matriz produzidas por eletrofiação para o tecido em cultivo, em que a placa coletora compreende uma superfície micropadronizada, por exemplo, um padrão ondulado, crimpado ou de ondas.

[0090] 69. Uma placa coletora de acordo com o parágrafo 68, em que a placa compreende furos, de tal modo que a folha de

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14/77 fibras produzidas por eletrofiação formadas dentro do orifício é de uma densidade mais baixa do que a folha de fibras produzidas por eletrofiação formadas na superfície da placa coletora.

[0091] 70. Uma matriz produzida por eletrofiação de fibras sobre uma placa coletora de acordo com os parágrafos 68 ou 69, por exemplo, em que pelo menos uma superfície plana da matriz tem uma superfície ondulada ou crimpada.

[0092] 71. Um método para melhorar a resistência de um tecido de pele cultivado à força de cisalhamento compreendendo o cultivo do tecido de pele em uma matriz, em que a matriz compreende uma superfície micropadronizada, por exemplo, de um padrão ondulante, crimpado ou de ondas.

[0093] 72. Um método de acordo com o parágrafo 71, em que a matriz é produzida por fibras produzidas por eletrofiação sobre uma placa coletora de acordo com qualquer uma das reivindicações 68 a 70.

[0094] 72. Um método de acordo com o parágrafo 71, em que a matriz é definida em qualquer um dos parágrafos 1 a 20.

[0095] Por conseguinte, em um aspecto é proporcionada matriz para o cultivo de tecido de pele diferenciado preparado por eletrofiação de uma solução de 26% para 40% p/v de um polímero biodegradável, tal como poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), homopolímero linear de dioxanona (tal como 100 homopolímero linear de dioxanona), ou uma sua combinação em um solvente orgânico. A matriz presentemente divulgada preparada por eletrofiação de uma solução de 26% a 40% p/v de PLGA em um solvente orgânico tem uma porosidade que permite a separação de células epidérmicas e dérmicas de modo que uma epiderme se forme em uma superfície da matriz, tal como “topo” da matriz (aqui referida como a “face plana superior “da matriz), e uma derme se forma na superfície oposta da matriz, como “abaixo “da matriz (aqui referida como a face plana inferior da matriz). Assim, por exemplo, os queratinócitos permanecem no topo da matriz para formar uma

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15/77 epiderme e os fibroblastos são capazes de migrar para a matriz para formar uma derme. O resultado é que a pele formada possui a matriz sintética integrada entre a derme e a epiderme formada pelos fibroblastos e queratinócitos, respectivamente.

[0096] Em uma modalidade, a concentração de PLGA é 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 ou 39% p/v.

[0097] Em uma modalidade, a concentração de PLGA é de 35% p/v. Vantajosamente, os presentes inventores descobriram que a eletrofiação com uma solução a 35% p/v resultou em um diâmetro de fibra e porosidade otimizados, mas era mais fácil de trabalhar do que concentrações mais elevadas de PLGA.

[0098] Em uma modalidade, a razão de ácido polilático para ácido poliglicólico no PLGA se situa na faixa de 90:10 a 60:40, respectivamente, como 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, ou 65:35. Uma vantagem do uso de PLGA é que a alteração da proporção de ácido poliglicólico para ácido poliláctico altera a taxa de degradação. Assim, a pessoa versada na técnica pode ajustar a taxa de degradação, conforme desejado, ajustando a proporção de ácido poliglicólico para ácido poliláctico.

[0099] Em uma modalidade, a proporção de ácido poliláctico para ácido poliglicólico é de 75:25 a 65:35, respectivamente, tal como 75:25. Vantajosamente, espera-se que o PLGA de 75:25 se degrade completamente em 3 a 12 meses, enquanto uma razão mais baixa como 63:35 se degradaria a um ritmo mais rápido.

[0100] Existem muitos polímeros, como o PLGA, que são biocompatíveis e biodegradáveis, que são adequados para a formação da matriz. Materiais que empregaram em suturas podem ser adequados para formar a matriz. A matriz fornece integridade estrutural para o tecido de pele manipulado enquanto está sendo cultivada e também por algum tempo após ter sido enxertada em um paciente. A matriz degradará durante um período de semanas a meses, sendo eventualmente completamente substituída pela matriz do

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16/77 próprio paciente (células). Isso elimina a necessidade de recuperar a matriz do paciente.

[0101 ] A matriz no contexto da presente divulgação é uma estrutura tridimensional, em particular tecido, fibra e/ou matriz fiada e sobre e na qual as células aderem e crescem. A matriz é um substrato ou modelo em torno do qual as células se juntam, aderem e/ou crescem.

[0102] Em uma modalidade, a matriz é fornecida como fatia. Fatia tal como utilizada aqui refere-se a uma forma tridimensional, por exemplo, que é um molde adequado para uma seção de pele crescer, por exemplo, cerca de 100 microns de profundidade e com duas faces substancialmente planas.

[0103] A face plana refere-se a uma superfície 2D aproximadamente plana, não precisa ser perfeitamente plana, mas simplesmente precisa suportar o cultivo ou as células, por exemplo, que se diferenciarão em uma epiderme. Em uma modalidade, a face plana superior é micropadronizada para proporcionar texturas que, no final, aumentam a resistência a forças de cisalhamento da epiderme diferenciada (isto é, reduzindoa a deslizar sobre a derme e, em vez disso, reter a epiderme no lugar). Esta textura é uma imagem espelhada da textura proporcionada na placa coletora quando as fibras da matriz são produzidas por eletrofiação. Essa textura é ondulada ou crimpada. Isso tem o objetivo de gerar cultivo celular em uma interface irregular entre a derme e a epiderme para simular as protuberâncias conhecidas como cristas Rete na pele normal.

[0104] A “face plana superior”, conforme aqui empregada, não é necessariamente uma referência a uma orientação da matriz, mas, em vez disso, refere-se a uma das duas faces planas nas quais os queratinócitos se depositam. Essas células finalmente se diferenciam na epiderme e se tornam a camada superior (mais externa) da pele. A face plana superior geralmente será pré-revestida para encorajar os queratinócitos a aderirem a ela. A superfície plana superior no início da cultura será geralmente

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17/77 afastada da camada permeável a gás. Por exemplo, quando o arcabouço que segura a matriz é horizontal e paralelo a uma camada permeável a gás na base do dispositivo, a superfície plana superior será a mais superior, isto é, dirigida para a tampa. Contudo, após um período adequado, por exemplo, 48 horas, quando os queratinócitos aderiram à face plana superior, o substrato (matriz) será rodado ou deslocado para colocar a face plana superior em contato com ou na proximidade da camada permeável a gás. Isso geralmente colocará a face plana superior na parte de baixo do substrato (matriz) e, assim, direcionará a face plana superior em direção à base do dispositivo. Assim, a orientação da face plana superior muda através do processo. No entanto, na face plana superior de designação se aplica à face, independentemente de sua orientação.

[0105] A face plana inferior, tal como empregada aqui, refere-se à face paralela correspondente à face plana superior. Inferior não é necessariamente uma referência à orientação da face do substrato.

[0106] Em uma modalidade, a placa coletora é texturizada, por exemplo, micropadronizada, tal como ondulada ou crimpada. A vantagem da micropadronização é que uma interface desigual é formada entre a derme e a epiderme quando a matriz é usada para cultivar o tecido de pele, replicando, assim, cristas Rete naturais entre a derme e a epiderme. A presença das cristas Rete ajuda a conferir resistência contra forças de cisalhamento para a epiderme, o que torna menos provável a deslocação da epiderme se for aplicada uma força de cisalhamento, por exemplo, a partir de um curativo de ferida ou do esfregaço de roupa no enxerto de pele. Deslocamento da epiderme provavelmente resultaria na falha do enxerto de pele.

[0107] As cadeias de Rete no contexto da presente divulgação são simplesmente uma interface desigual entre a derme e a epiderme, isto é, uma crista sintética Rete (cultivada ex vivo) de simulação de natural.

[0108] Em uma modalidade, a matriz tem uma espessura de 100 pm ou menos, por exemplo, 10 a 100 pm, tal como 20, 25, 30,

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35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 90 ou 95 pm. Os presentes inventores descobriram que o uso de uma matriz com uma espessura superior a 100 pm tende a aumentar a necessidade de vascularização do tecido de pele cultivado na matriz para que o enxerto sobreviva. Por outro lado, ao manter a matriz com 100 pm de espessura ou menos, os queratinócitos podem receber nutrientes e remover os resíduos apenas por difusão e não necessitam de um sistema de vasculatura para a sobrevivência.

[0109] Em uma modalidade, a matriz é formada em uma forma particular, por exemplo, um tubo, lóbulo ou semelhante, de tal modo que as células da pele cresçam para uma forma 3D predefinida, que é necessária para o paciente.

[0110] Em uma modalidade, o tamanho do poro (por exemplo, tamanho máximo e mínimo do poro) da matriz se situa na faixa de 2 a 30 microns, por exemplo, 15 a 25 microns, tal como 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 microns.

[0111] Os poros da matriz não serão todos de tamanho uniforme. Assim, o tamanho de poro tal como aqui utilizado será o tamanho médio de poro, que por exemplo, estão na faixa de 4 a 25 microns (4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 microns), por exemplo, 10 a 25 microns, tal como 10,11,12,13,14,15,16,17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24 ou 25 microns, em particular 15 a 25 microns. Em uma modalidade, a média é o tamanho médio do poro, por exemplo, o tamanho médio do poro do fluxo (também conhecido uma porometria do fluxo capilar). Em uma modalidade, a média é o tamanho médio do poro. Em uma modalidade, a média é o tamanho de poro modal.

[0112] O fator que mais influencia o tamanho dos poros é o diâmetro da fibra. Quanto maior o diâmetro da fibra [0113] Usando a porometria, um dos valores mais críticos no maior tamanho de poro, porque isso muitas vezes determina características importantes do material. Uma medida do maior tamanho de poro

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19/77 no primeiro valor de ponto de bolha (FBP). Em uma modalidade, o tamanho do poro aqui dado é o primeiro valor do ponto de bolha.

[0114] A porometria de fluxo capilar, também conhecida como porometria, é uma técnica de caracterização baseada no deslocamento de um líquido umectante dos poros da amostra pela aplicação de um gás sob pressão crescente. Isso é amplamente utilizado para medir os tamanhos mínimo, máximo (ou primeiro ponto de bolha) e médio dos poros, e a distribuição do tamanho dos poros em membranas, papel, filtração e meios de ultrafiltração, fibras ocas, cerâmicas, etc. A Figura 7 mostra uma curva típica para a análise.

[0115] Em porometria de fluxo capilar, um gás inerte é usado para deslocar um líquido, que está nos poros. A pressão necessária para esvaziar o poro corresponde à pressão necessária para evacuar o líquido da parte mais restrita do poro. Esta parte mais restrita é a mais desafiadora e oferece a maior resistência para remover o líquido molhante. Este parâmetro é muito relevante em aplicações de filtração e similares, uma vez que é importante conhecer os menores.

[0116] Essa pressão medida permite obter o diâmetro dos poros, o qual é calculado por meio da fórmula de Young-Laplace P= 4*y*cos 0*/D, em que D é o diâmetro de tamanho de poro, P é a pressão medida, γ é a tensão superficial do líquido molhante e Θ é o ângulo de contato do líquido molhante com a amostra. A tensão superficial γ é uma propriedade física mensurável e depende do líquido úmido utilizado. O ângulo de contato Θ depende da interação entre o material e o líquido úmido. Na porometria de fluxo capilar, em oposição à porosimetria por intrusão de mercúrio, o líquido molhante entra espontaneamente nos poros da amostra assegurando um molhamento total do material e, portanto, o ângulo de contato do líquido molhante com a amostra é 0 e o fórmula anterior pode ser simplificada como: P = 4 * γ/D.

[0117] Informações técnicas sobre como realizar a análise e o instrumento estão disponíveis em www.porometer.com. Ver também

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Agarwal et al., DNeck-size distribution of through-pores in polymer membranes, Journal of Membrane Science, 415 a 416 (2012) 608 a 615.

VARREDURA DE PRESSÃO [0118] Esta é a abordagem tradicional, na qual a pressão aumenta continuamente a uma taxa constante, que pode ser modificada dependendo do instrumento e das necessidades do usuário, e o fluxo de gás através da amostra é medido. Novamente, o número de pontos de dados adquiridos pode ser ajustado pelo usuário. Este é um método rápido e reprodutível, que é geralmente recomendado para trabalho de controle de qualidade e para amostras com todos os poros idênticos. No entanto, é importante ter em conta que, quando as amostras apresentam uma estrutura complexa e, com uma quantidade considerável de poros de diferentes tortuosidades, é possível que durante a verificação de pressão, poros com o mesmo diâmetro, mas mais longo caminho de poros não são esvaziados na pressão correspondente ao seu diâmetro (se a varredura for rápida, não há tempo para permitir que o fluxo de gás desloque o líquido molhante pelo comprimento do poro). Como consequência, os poros com maior comprimento de poro terão relatados tamanhos menores do que os reais.

ETAPA DE PRESSÀO/ESTABILIDADE [0119] Aumento da pressão com relação ao tempo em etapas, mantendo a pressão real por um certo tempo antes de aumentá-la para o próximo valor.

[0120] O método de etapa de pressão/estabilidade representa uma alternativa para o método de varredura de pressão que permite uma medição mais precisa dos tamanhos dos poros. O mesmo leva em consideração a diferente tortuosidade e o comprimento dos poros com o mesmo diâmetro. A aquisição de um ponto de dados é realizada somente depois de manter a pressão em um valor constante por um tempo definido pelo usuário e também somente depois que o fluxo de gás através da amostra é estável, o que também é definido pelo usuário. Isto permite tempo suficiente para que o fluxo

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21/77 de gás desloque o líquido molhante em poros longos e tortuosos com o mesmo diâmetro. Portanto, o método de etapa de pressão/estabilidade é o mais recomendado para aplicações de pesquisa e desenvolvimento. Além disso, o princípio de medição da etapa de pressão/estabilidade permite medir o verdadeiro primeiro ponto de bolha (FBP), em oposição ao método de varredura de pressão, que permite apenas o cálculo do FBP nas vazões selecionadas.

PRIMEIRO PONTO DE BOLHA MEDIDO (FBP) [0121] A FBP é definida pelo padrão F316-03 de ASTM como a pressão à qual as primeiras bolhas de gás contínuas são detectadas. Na prática, o FBP é associado como o maior ou máximo tamanho de poro. O cálculo do FBP requer a seleção de um determinado fluxo mínimo (por exemplo, 30, 50, 100 ml/min) e, quando atingido, registra a pressão. Então esta pressão é usada para calcular o tamanho do FBP. A questão é selecionar o fluxo mínimo através da amostra e a principal desvantagem é que esse fluxo mínimo é diferente para cada amostra e não é fácil determinar a priori. Se um determinado fluxo mínimo for selecionado para o cálculo, é possível que o maior poro da amostra já tenha sido aberto por um tempo antes de determinado fluxo específico. Com o método de etapa de pressão/estabilidade, é possível medir o verdadeiro FBP. Ao aplicar um fluxo de gás constante, antes da abertura do maior fluxo, a pressão aumenta de forma linear. No momento em que o fluxo de gás passa através da amostra através do poro maior, o aumento da pressão cai e é nessa pressão particular aquela que corresponde ao FBP da amostra.

[0122] Em uma modalidade, a matriz é revestida com uma proteína de matriz extracelular ou um seu peptídeo, tal como um peptídeo sintético.

[0123] Em uma modalidade, a proteína da matriz extracelular é selecionada do grupo consistindo em: colágeno IV, colágeno I, laminina e fibronectina, ou uma sua combinação. Vantajosamente, a presença do revestimento produz um segundo sinal celular (sendo o primeiro sinal a crescer o tecido de pele em uma interface ar-líquido ou permeável a gás), o que

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22/77 aumenta a estratificação adequada do tecido de pele.

[0124] Em uma modalidade, o revestimento proteico da matriz extracelular é o colágeno IV. A vantagem do colágeno IV é que se constatou que o mesmo produz consistentemente a melhor estratificação epidérmica em comparação ao colágeno I, laminina e fibronectina.

[0125] Em um aspecto, é proporcionada uma seção de tecido de pele compreendendo uma matriz como definida acima, em que células alimentadoras da derme, tais como fibroblastos, migraram para a matriz.

[0126] Em uma modalidade, os queratinócitos permanecem em uma face exterior da matriz, em particular na superfície prérevestida.

[0127] Em uma modalidade, os queratinócitos se diferenciaram em uma epiderme e os fibroblastos formaram uma derme.

[0128] Em uma modalidade, a epiderme diferenciada está localizada em uma superfície da matriz, em particular a “face plana superior” da matriz.

[0129] Em uma modalidade, a matriz é revestida com colágeno antes da adição das células epiteliais, tais como queratinócitos e fibroblastos, à cultura.

[0130] Em uma modalidade, o tecido de pele compreende cadeias Rete sintéticas, por exemplo, como aqui descrito noutro local.

[0131] Em uma modalidade, a pele é autóloga a um paciente. A vantagem disso é que o tecido de pele autólogo não correría risco de rejeição do tecido ao enxertar no paciente.

[0132] Em uma modalidade, o tecido de pele está contido em um dispositivo como aqui descrito, em particular, um dispositivo é descrito no documento número WO2016/209089, cujo conteúdo está aqui incorporado por referência. Vantajosamente, o dispositivo permite que o tecido de pele seja cultivado em solução quando no primeiro modo (permitindo

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23/77 migração, aderência e/ou expansão celular) e depois cultivado na interface permeável a gás no segundo modo, em que o tecido de pele pode diferenciar e alcançar a estratificação epidérmica.

[0133] Em uma modalidade, em que o tecido de pele é transportado para a localização de um paciente no dispositivo como definido acima. Vantajosamente, o dispositivo é vedado e estéril, adequado tanto para o cultivo do tecido de pele como também para o transporte do tecido de pele cultivado a partir de então. Por conseguinte, o manuseamento do tecido de pele é consideravelmente minimizado. Recuperado do tecido do dispositivo por um profissional de saúde, tal como um cirurgião, por exemplo, removendo o tecido da matriz utilizando um bisturi, em particular pelo cirurgião cortando um pedaço da pele da forma e tamanho desejados da matriz. Assim, não é necessário que todo o tecido de pele seja primeiro recuperado do dispositivo e depois cortado na forma e tamanho desejados. Em vez disso, a parte desejada da pele pode ser cortada diretamente da matriz. Isso minimiza ainda mais o manuseio e, portanto, reduz o risco de contaminação e/ou danos.

[0134] O tecido, tal como é aqui utilizado, refere-se a um grupo de células semelhantes ou associadas que trabalham em conjunto de uma forma adequada para desempenhar uma função, em particular quando incorporadas em um organismo. Exemplos de tecido incluem pele, tecido conjuntivo, músculo e semelhantes.

[0135] O tecido sintético, tal como aqui utilizado, refere-se a tecido cultivado ex vivo.

[0136] Sintético no contexto de peptídeos refere-se simplesmente a peptídeos que foram sintetizados usando técnicas químicas (em oposição a técnicas recombinantes).

[0137] Tecido sintético estruturado, tal como aqui utilizado, refere-se a tecido com componentes distintos/diferenciados, por exemplo, uma derme e uma epiderme.

[0138] A derme como empregada aqui refere-se ao

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24/77 interior das células da pele abaixo da epiderme. No corpo, a derme está localizada entre a epiderme e o tecido subcutâneo. A matriz da presente divulgação está localizada na derme após o cultivo do tecido de pele diferenciado. Na derme, tal como aqui empregado, refere-se aqui a onde pelo menos parte da matriz está dentro de pelo menos parte da derme.

[0139] Os fibroblastos são capazes de formar a derme. Eles também são células alimentadoras para as células epidérmicas, como os queratinócitos.

[0140] Epiderme é a camada externa de células no tecido de pele, que fornece uma barreira à infeção e regula a quantidade de água liberada pelo corpo. A epiderme é composta por 4 ou 5 camadas, dependendo da região da pele considerada. Essas camadas em ordem decrescente são: i) Camada Cornificada (stratum corneum). Composto de 10 a 30 camadas de poliédrica, corneócitos anucleados (etapa final de diferenciação de queratinócitos), com as palmas e solas tendo o maior número de camadas. Corneócitos estão rodeados por um envelope de proteína (proteínas do invólucro cornificado), encheu-se com proteínas de queratinade retenção de água, ligadas umas às outras através de corneodesmossomos e rodeadas no espaço extracelular por camadas empilhadas de lipídios. A maioria das funções de barreira da epiderme se localiza nessa camada, ii) Camada clara/translúcida (estrato córneo, apenas nas palmas das mãos e solas dos pés). A pele encontrada nas palmas das mãos e solas é conhecida como “pele espessa” porque tem 5 camadas epidérmicas em vez de 4. Camada granular (estrato granuloso) Os queratinócitos perdem seus núcleos e seu citoplasma parece granular. Lipídios, contidos dentro daqueles queratinócitos dentro de corpos lamelares, são liberadas para o espaço extracelular através de exocitose para formar uma barreira lipídica. Esses lipídeos polares são então convertidos em lipídeos não polares e dispostos paralelamente à superfície da célula. Por exemplo, glicoesfingolipídios se tornam ceramidas e fosfolipídios tornaram ácidos graxos livres, iii) Camada Espinhosa (estrato espinhoso).

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Queratinócitos se tornam ligados através de desmossomas e começam a produzir corpos lamelares, a partir de dentro do Golgi, enriquecida em lipídios polares, glicosfingolipídeos, esteróis livres, fosfolipídeos e enzimas catabólicas. As células de Langerhans, células imunologicamente ativas, estão localizadas no meio dessa camada, iv) Camada basal/germinal (estrato basal/germinativo). Composta principalmente de queratinócitos de proliferação e de não proliferação, ligado à membrana-base por hemidesmossomas. Os melanócitos estão presentes, conectados a numerosos queratinócitos neste e em outros estratos através de dendritos. Células de Merkel também são encontradas no estrato basal com um grande número de locais sensíveis ao toque, como as pontas dos dedos e lábios. Eles estão intimamente associados com nervos cutâneos e parecem estar envolvidos em sensação de toque leve, v) Camada de Malpighi (estrato Malpighi) é tanto o estrato basal quanto o estrato espinhoso. A epiderme é separada da derme, seu tecido subjacente, por uma membrana-base. A epiderme da presente divulgação pode compreender uma ou mais das referidas camadas.

[0141] As células epidérmicas, tal como aqui empregados, referem-se a células capazes de se diferenciarem em uma epiderme, tal como queratinócitos.

[0142] O primeiro período de cultura, tal como aqui utilizado, refere-se ao período de cultura quando os queratinócitos aderem à face plana superior. Um ou mais tipos de células podem ser adicionados à cultura uma ou mais vezes durante o primeiro período de cultura.

[0143] O segundo período de cultura, tal como aqui utilizado, refere-se ao período de cultura em que os queratinócitos aderidos à face plana superior são postos em contato com ou na proximidade da camada permeável a gás. Um ou mais tipos de células podem ser adicionados à cultura uma ou mais vezes durante o segundo período de cultura.

[0144] Na presente divulgação, “adicionar uma cultura de células epidérmicas capazes de se diferenciar em epiderme e fibroblastos”,

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26/77 como empregado aqui, inclui: fibroblastos são adicionados primeiro e cultivados por um período seguido pela adição de células epidérmicas (ou seguido por adição de uma combinação de células epidérmicas e fibroblastos); as células epidérmicas são adicionadas primeiro e cultivadas por um período seguido pela adição de fibroblastos (ou seguidos por uma combinação de células epidérmicas e fibroblastos); e uma combinação de células epidérmicas e fibroblastos são adicionados essencialmente ao mesmo.

[0145] Essencialmente ao mesmo tempo aqui empregado refere-se a onde não há período de cultura entre a adição das células relevantes.

[0146] As populações de células empregadas na presente divulgação, devem ser suficientemente puras para serem adequadas ao fim. Assim, outras populações de células também podem estar presentes.

[0147] Outras células podem ser adicionadas à cultura a qualquer momento, conforme necessário.

[0148] Fibroblastos podem ser cultivados em um préetapa, por exemplo, na ausência da matriz, em um dispositivo de cultura celular com ou sem uma membrana permeável a gás, para aumentar os números.

[0149] Em um aspecto, é fornecido um método de tratamento, compreendendo:

[0150] a) fornecer um tecido de pele de acordo com o descrito acima, [0151 ] b) recuperar sob condições estéreis o tecido da matriz, e [0152] c) aplicar o tecido a um paciente com necessidade de tratamento.

[0153] Em um aspecto, é proporcionada uma placa coletora, tal como uma placa coletora de aço inoxidável, para recolher uma folha de fibras produzidas por eletrofiação, em que a placa coletora compreende uma superfície micropadronizada, por exemplo, um padrão ondulado, crimpado ou de

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27/77 ondas, em particular para recolher fibras produzidas por eletrofiação de uma matriz, em particular um molde de matriz para utilização em cultura de pele diferenciada. A divulgação também se estende à utilização da referida placa para recolher fibras de matriz eletrolíticas para cultura de células.

[0154] Em uma modalidade, a placa compreende orifícios, de tal modo que a folha de fibras produzidas por eletrofiação formadas dentro do orifício seja de uma densidade mais baixa do que a folha de fibras produzidas por eletrofiação formadas na superfície da placa coletora. De um modo vantajoso, os presentes inventores descobriram que a folha de densidade baixa de fibras produzidas por eletrofiação forma uma matriz superior para o cultivo da espessura total da pele.

[0155] Em um aspecto, é proporcionada uma matriz sintética produzida por fibras produzidas por eletrofiação sobre uma placa coletora como definido acima. A divulgação também se estende à utilização de uma matriz de acordo com a divulgação como modelo para cultura ex vivo de tecido de pele, em particular tecido de pele diferenciado.

[0156] Em um aspecto, é proporcionado um método para aumentar a resistência do tecido de pele cultivado à força de cisalhamento compreendendo o cultivo do tecido de pele em uma matriz, em que a matriz compreende uma superfície micropadronizada, por exemplo, ondulada, crimpada ou padrão de onda.

[0157] Em uma modalidade, a matriz é produzida por fibras produzidas por eletrofiação em uma placa coletora como definido acima.

[0158] Em uma modalidade, a matriz é uma matriz como definida acima.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0159] Figura 1 mostra as imagens de eletromicroscopia do diâmetro da fibra de PLGA de uma faixa de concentrações de solução, a) 20% p/v, b) 25% p/v, c) 30% p/v, d) 35% p/v e e) 40% p/v.

[0160] Figura 2 mostra o efeito do diâmetro e

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28/77 porosidade da fibra na formação da pele. Seções transversais de células da pele humana cultivadas em PLGA produzido por eletrofiação são produzidas a partir de várias concentrações, a) 20% p/v, b) 25% p/v, c) 35% p/v, d) 40% p/v. Todas as seções são coradas com pan-citoqueratina (áreas cinza claro) para identificar queratinócitos e DAPI (pontos) para identificar os núcleos das células. 20% e 25% resultam em nenhuma derme formada. 35 e 40% têm uma derme formada abaixo da epiderme, como indicado pelas setas.

[0161] Figura 3 mostra o efeito do revestimento de proteína na estratificação epidérmica. Seções transversais de células da pele humana cultivadas em PLGA produzido por eletrofiação não revestidas e PLGA produzido por eletrofiação revestidas com colágeno humano IV. Todas as seções são coradas com pan-citoqueratina (áreas cinza claro) para identificar queratinócitos e DAPI (pontos) para identificar os núcleos das células. A adição do revestimento de colágeno IV induz a estratificação epidérmica.

[0162] Figura 4 mostra imagens de uma chapa de PLGA produzido por eletrofiação micropadronizada. A) micropadronizada, B) plana (não padronizada) [0163] Figura 5 mostra imagens de pele cultivada em PLGA produzido por eletrofiação micropadronizada vs. PLGA produzido por eletrofiação não padronizada. Seção transversal de células da pele humana cultivadas em PLGA produzido por eletrofiação micropadronizada (imagem da esquerda) e PLGA produzido por eletrofiação (plana) sem padrão (imagem da direita) coradas para vimentina (regiões cinzentas claras entre linhas tracejadas) para identificar a derme e DAPI (pontos) para identificar núcleos celulares. A linha tracejada indica a interface entre a camada superior da pele, a epiderme e a camada inferior da pele, a derme. Micropadronização do PLGA replicou a formação de cadeias de Rete.

[0164] Figura 6 mostra uma imagem de uma seção transversal da pele humana normal. Seção transversal da pele humana normal corada com pan citoqueratina (áreas cinza claro acima da linha tracejada) para

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29/77 identificar queratinócitos e DAPI (pontos cinzas) para identificar os núcleos das células. A linha tracejada indica a interface entre a camada superior da pele, a epiderme e a camada inferior da pele, a derme. Essa interface não é plana e é caracterizada por um padrão de onda chamado cristas Rete.

[0165] Figura 7 Mostra um exemplo de um gráfico obtido a partir de um porômetro

DESCRIÇÃO DETALHADA [0166] O termo “matriz”, “matriz de células”, “matriz celular”, “substrato” ou “substrato de células”, tal como aqui utilizados indiferentemente refere-se a qualquer estrutura física incluindo, mas não limitado a, a estrutura de um sólido ou semissólido, como uma malha de fibras com poros adequados para fornecer:

[0167] · suporte mecânico ou outro para a aderência e proliferação de células ou tecidos, e [0168] · permitição de migração dos tipos de uma célula durante o processo de cultura, [0169] por exemplo, para cultura de tecido de pele ex vivo.

[0170] Em contato com a camada/membrana permeável a gás, tal como aqui empregado, refere-se a células relevantes que se encontram na membrana/camada ou na proximidade da membrana/camada, de tal modo que o cultivo e/ou em particular diferenciação das células possa ocorrer. Assim, proximidade geralmente significará que não há nada que separa a camada/membrana permeável a gás e as células relevantes (o espaço entre as mesmas será preenchido, por exemplo, com meio de cultura, tampão ou CO2, em particular, meios de cultura celular). Em uma modalidade, a distância das células relevantes à camada permeável a gás é de 2 cm ou menos, tal como 1 cm ou menos, em particular 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1 ou 0,05 cm. Em uma modalidade, 0 exterior das células para diferenciação repousa sobre a camada/membrana permeável a gás.

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30/77 [0171] Geralmente, a matriz será tridimensional, com uma primeira 2D e segunda face 2D (com uma área superficial significativa) na qual as células podem se depositar e uma profundidade entre as duas faces dando a dimensão 3 (correspondente a uma seção transversal da pele final - em algum lugar na região de 100 pm como discutido acima).

[0172] As matrizes da presente divulgação podem ser construídas de materiais naturais ou sintéticos. Uma matriz pode estar em uma forma ou formato particular de modo a influenciar ou delimitar uma forma ou formato tridimensional por uma população de células em proliferação. Tais formas ou formatos incluem, mas não se limitam a, filmes (por exemplo, uma forma com duas dimensões substancialmente maior que a terceira dimensão), fitas, cordões, folhas, discos planos, cilindros, esferas, formas tridimensionais amorfas, etc.

[0173] Em uma modalidade, as matrizes compreendem apenas materiais sintéticos. Em outra modalidade, a matriz compreende uma mistura de materiais sintéticos e naturais.

[0174] Em uma modalidade, materiais sintéticos para fazer a matriz da presente invenção são tanto biocompatíveis quanto biodegradáveis (por exemplo, sujeito a degradação enzimática e hidrolítica), tais como polímeros biodegradáveis.

[0175] Como usado aqui, “biocompatível” refere-se a qualquer material que, quando implantado em um mamífero, não provoca uma resposta adversa no mamífero. Um material biocompatível, quando introduzido em um sujeito, não é tóxico ou prejudicial ao sujeito, nem induz a rejeição imunológica do material no mamífero.

[0176] O termo “biodegradável” ou “bioabsorvível”, como usado aqui, destina-se a descrever materiais que existem por um tempo limitado em um ambiente biológico e degradam sob condições fisiológicas para formar um produto que pode ser metabolizado ou excretado sem dano ao sujeito. Em certas modalidades, o produto é metabolizado ou excretado sem danos

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31/77 permanentes ao sujeito.

[0177] Em uma modalidade, a matriz é completamente reabsorvível pelo corpo de um sujeito.

[0178] Em uma modalidade, uma matriz bioabsorvível da presente divulgação podem existir por dias, semanas ou meses quando colocada no contexto de um ambiente biológico. Por exemplo, uma matriz bioabsorvível podem existir por 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8,9 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180 dias ou mais quando colocados no contexto do ambiente biológico.

[0179] Em uma modalidade, a camada de matriz é reabsorvida pelo corpo do referido sujeito a cerca de uma mesma taxa de cultivo de células de tecidos subjacentes à referida camada de matriz de membrana na referida área. Em certas modalidades, as células são células epiteliais. Em certas modalidades, a camada da matriz é substancialmente completamente reabsorvida pelo referido corpo dentro de cerca de 3 a 12 meses após a aplicação do enxerto de pele. Em certas modalidades, a matriz é substancialmente completamente reabsorvida dentro de cerca de 3 meses.

[0180] Materiais biodegradáveis tais como polímeros podem ser degradados hidroliticamente, podem requerer ação celular e/ou enzimática para degradar completamente, por exemplo, hidrólise, oxidação, processos enzimáticos, fagocitose, ou outros processos, incluindo uma combinação dos anteriores.

[0181 ] Polímeros biodegradáveis são conhecidos aos versados na técnica e incluem, mas não estão limitados a, polímeros sintéticos, polímeros naturais, misturas de polímeros sintéticos e naturais, materiais inorgânicos e semelhantes.

[0182] Em uma modalidade, a matriz incorpora um ou mais polímeros sintéticos na sua construção. A matriz pode ser feita a partir de heteropolímeros, monopolímeros, ou suas combinações. Exemplos de polímeros

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32/77 adequados para a fabricação de matrizes celulares incluem, mas não estão limitados a poliésteres alifáticos, copoli(éter-ésteres), polialquilenos oxalatos, poliamidas, poli(iminocarbonatos), poliortoésteres, polioxaésteres, poliamidoésteres, polioxaésteres contendo grupos amina, poli(anidridos), polifosfazenos, biomoléculas e suas misturas.

[0183] Os poliésteres alifáticos adequados incluem homopolímeros, copolímeros (blocos aleatórios, em bloco, segmentados, cônicos, enxertos, triblocos, etc.) tendo uma estrutura linear, ramificada em formato de estrela. Os monômeros adequados para produzir homopolímeros e copolímeros alifáticos podem ser selecionados a partir do grupo consistindo em, mas não se limitando, a ácido láctico, láctido (incluindo misturas L-, D-, meso e D, L), ácido glicólico, glicólido, ε-caprolactona, p-dioxanona (1,4-dioxan-2-ona), trimetilenocarbonato (1,3-dioxan-2-ona), delta-valerolactona, beta-butirolactona, épsilon-decalactona, 2, 5-dicetomorfolina pivalolactona, alfa, alfadietilpropiolactona, carbonato de etileno, oxalato de etileno, 3-metil-1,4-dioxano2,5-diona, 3,3-dietil-1,4-dioxan-2,5- diona, gama-butirolactona, 1,4-dioxepan-2ona, 1,5-dioxepan-2-ona, 6,6-dimetil-dioxepan-2-ona, 6,8-dioxabicicloctano-7ona e combinações dos mesmos.

[0184] Os copolímeros elastoméricos também são particularmente úteis nas matrizes presentemente divulgadas. Elastômeros biocompatíveis bioabsorvíveis adequados incluem, mas não se limitam, àqueles selecionados do grupo consistindo em copolímeros elastoméricos de épsiloncaprolactona e glicólido (por exemplo, tendo uma razão molar de épsiloncaprolactona para glicólido de cerca de 35:65 a cerca de 65:35, mais como de 45:55 a 35:65) copolímeros elastoméricos de ε-caprolactona e láctido, incluindo L-láctido, misturas de D- láctidos dos mesmos ou copolímeros de ácido tático (por exemplo, tendo uma razão molar de épsilon-caprolactona para láctido desde cerca de 35:65 até cerca de 65:35, tal como de 45:55 a 30:70 ou desde cerca de 95:5 a cerca de 85:15) copolímeros elastoméricos de p-dioxanona (1,4-dioxan2-ona) e láctido incluindo L-láctido, D-lactídeo e ácido láctico (por exemplo, tendo

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33/77 uma razão molar de p-dioxanona para lactídeo de cerca de 40:60 a cerca de 60:40) copolímeros elastoméricos de épsilon-caprolactona e p-dioxanona (por exemplo, com uma razão molar de épsilon-caprolactona para p-dioxanona desde cerca de 30:70 até cerca de 70:30) copolímeros elastoméricos de p-dioxanona e carbonato de trimetileno (por exemplo, tendo uma proporção molar de pdioxanona para trimetileno carbonato desde cerca de 30:70 a cerca de 70:30), copolímeros elastoméricos de trimetileno carbonato e glicólido (por exemplo, tendo uma proporção molar de trimetileno carbonato para glicólido desde cerca de 30:70 até cerca de 70:30), copolímero elastomérico de trimetileno carbonato e láctido incluindo L-láctido, D-láctido, misturas dos mesmos ou copolímeros de ácido láctico (por exemplo, tendo uma proporção molar de trimetileno carbonato para láctido desde cerca de 30:70 até cerca de 70:30) e suas misturas. Exemplos de elastômeros bioabsorvíveis adequados são descritos em US 4.045.418; US 4.057.537 e US 5.468.253 todas aqui incorporadas por referência. Estes polímeros elastoméricos terão uma viscosidade inerente desde cerca de 1,2 dl/g até cerca de 4 dl/g, de um modo preferido uma viscosidade inerente desde cerca de 1,2 dl/g até cerca de 2 dl/g e um modo muito preferido uma viscosidade inerente desde cerca de 1,4 dl/g a cerca de 2 dl/g como determinado a 25 °C em uma solução de polímero em hexafluoroisopropanol (HFIP) a 0,1 grama por decilitro (g/dl).

[0185] Outros materiais adequados para uso como uma matriz da presente divulgação incluem, mas não estão limitados a, ácido glicólico-ácido poliláctico (PLGA), poliortoésteres, polianidridos, polifosfazenos, e suas combinações. Polímeros não biodegradáveis incluem poliacrilatos, polimetacrilatos, acetato de vinil etileno, álcoois polivinílicos, polilactídeo, sulfato de condroitina (um componente proteoglicano), poliésteres, polietilenoglicóis, policarbonatos, álcoois polivinílicos, poliacrilamidas, poliamidas, poliacrilatos, poliésteres, poliésteres, polimetacrilatos, poliuretanos, policaprotactona, polifofazenas, poliortoésteres, poliglicólido, copolímeros de lisina e ácido láctico, copolímeros de lisina-RGD e ácido láctico, e semelhantes, e copolímeros dos

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34/77 mesmos. Os polímeros sintéticos podem ainda incluir os selecionados do grupo que consiste em poliésteres alifáticos, poli(aminoácidos), poli(propileno fumarato), copoli(ésteres éteres), polialquilenos oxalatos, poliamidas, policarbonatos derivados de tirosina, poli(iminocarbonatos), poliortoésteres, polioxaésteres, poliamidoésteres, polioxaésteres contendo grupos amina, poli(anidridos), polifosfazenos, e suas misturas.

[0186] Em uma modalidade, a matriz incorpora ácido poliláctico (PLA). O PLA é particularmente adequado para métodos de engenharia de tecidos utilizando a matriz celular como PLA degrada dentro do corpo humano para formar o ácido láctico, um produto químico que ocorre naturalmente, que é facilmente removido a partir do corpo. A matriz celular da invenção pode também incorporar o ácido poliglicólico (PGA) e/ou policaprolactona (PCL) como materiais de matriz. PGA e PCL têm vias de degradação semelhantes ao PLA, mas o PGA degrada no corpo mais rapidamente do que o PLA, enquanto o PCL tem uma taxa de degradação mais lenta do que o PLA.

[0187] PGA tem sido amplamente utilizado na engenharia de tecidos. Matrizes PGA podem ser facilmente manipuladas para várias estruturas tridimensionais, e oferecem um excelente meio de suporte e transporte para as células (Christenson L, Mikos AG, Gibbons DF, et al: Biomaterials for tissue engineering: summary. Tissue Eng. 3 (1): 71 a 73; discussão 73 a 76, 1997) matrizes fabricadas a partir de ácido poliglicólico sozinho, bem como combinações de PGA e outros materiais biocompatíveis naturais e / ou sintéticos, estão dentro do âmbito da presente revelação.

[0188] Em uma modalidade, a matriz compreende poli(ácido lático-co-glicólico) (PLGA), tal como microfibras ou nanofibras de PLGA.

[0189] Em outra modalidade, a matriz compreende homopolímero linear de dioxanona, tal como homopolímero linear de dioxanona 100 (por exemplo, Dioxaprene 100M).

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35/77 [0190] Em uma modalidade, a matriz compreende uma combinação de PLGA e Dioxanona 100.

[0191 ] O termo “fibra” é aqui utilizado para se referir a materiais que estão na forma de filamentos contínuos ou pedaços de material distintos alongados, tipicamente compreendendo ou compostos de polímeros biodegradáveis tais como os descritos acima. As fibras da presente divulgação têm tipicamente diâmetros na faixa micrométrica, tal como 0,5 a 5, por exemplo, 1 pm, 1,5 pm, 2 pm, 2,5 pm, 3 pm, 3,5 pm, 4 pm, 4,5 pm ou 5 pm, em particular na faixa de 1 a 3 pm.

[0192] Em uma modalidade, as fibras têm um diâmetro na faixa de 0,3 pm a 1,5 pm, tal como 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9,1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4 ou 1,5 pm.

[0193] O termo “matriz de fibras” é usado aqui para se referir ao arranjo de fibras em uma estrutura de suporte, como na forma de uma folha de fibras que pode então ser usada para suportar células ou outros materiais adicionais (ver também definição de “matriz” acima). Vários métodos são conhecidos pelo perito que podem ser utilizados para produzir fibras adequadas, que incluem mas não se limitam a polimerização interfacial e eletrofiação.

[0194] Em uma modalidade, uma matriz da presente divulgação é formada utilizando eletrofiação.

[0195] O termo “eletrofiação” geralmente se refere a técnicas que fazem uso de uma fonte de alimentação de alta voltagem, uma fieira (por exemplo, uma agulha hipodérmica) e uma placa coletora eletricamente condutiva (por exemplo, folha de alumínio ou aço inoxidável). Para realizar o processo de eletrofiação usando estes materiais, um líquido de eletrofiação (ou seja, uma fusão ou solução dos materiais desejados que serão utilizados para formar as fibras) é geralmente primeiro carregado em uma seringa e é então alimentado a uma taxa específica definida por uma bomba de seringa.

[0196] Como o líquido é alimentado pela bomba de

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36/77 seringa com uma voltagem suficientemente alta, a repulsão entre as cargas imobilizadas na superfície da gotícula líquida resultante supera o confinamento da tensão superficial e induz a ejeção de um jato líquido do orifício. O jato carregado passa então por um processo de chicoteamento e alongamento, e subsequentemente resulta na formação de nanofibras uniformes. Além disso, como o jato é esticado e o solvente é evaporado, os diâmetros das fibras podem ser continuamente reduzidos a uma escala desejada, por exemplo, microns, ou mesmo tão pequenos quanto nanômetros e, sob a influência de um campo elétrico, as fibras subsequentemente ser forçadas a viajar em direção a um coletor aterrado, no qual são normalmente depositadas como um tapete não tecido. No contexto da presente divulgação, devido à alta razão entre a área superficial e o volume e a morfologia unidimensional, as fibras produzidas por eletrofiação podem imitar a arquitetura da matriz extracelular.

[0197] Exemplos de materiais utilizados para produzir as nanofibras da presente divulgação são independentemente selecionados dos listados nas Tabelas 1 e 2 abaixo.

TABELA 1 - MATERIAIS EXEMPLIFICATIVOS PARA A PRODUÇÃO DE FIBRAS PRODUZIDAS POR ELETROFIAÇÃO (POLÍMEROS NATURAIS).

Materiais	Solvente	Materiais	Solvente
Quitosana	90% de ácido acético	Celulose	NMMO/água
Gelatina	Ácido fórmico	Fibroína de seda	Metanol
Gelatina	TFE	Fosfolipídios (lecitina)	Clorofórmio/DMF
Colágeno Tipo 1, II e III	HFIP	Fibrinogênio	HFIP/10 x meio essencial mínimo

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37/77

Colágeno Tipo 1, II e III	HFIP	Hemoglobina	TFE
Colágeno Tipo 1, II e III	HFIP	Timo de filhote fibroso Na-DNA	Água/etanol
Elastina	HFIP	Vírus M13	THF
Ácido hialurônico	DMF/água

TABELA 2 - MATERIAIS EXEMPLIFICATIVOS PARA A PRODUÇÃO DE FIBRAS PRODUZIDAS POR ELETROFIAÇÃO (POLÍMEROS SINTÉTICOS).

Materiais	Solvente	Materiais	Solvente
PLGA	THF/DMF	PHBV/colágeno	HFIP
PLA	FIP	Ácido hialurônico/gelatina	DMF/água
PLA	DCM	Colágeno/Sulfato de condroitina	TFE/água
PLA	DCM/DMF	Colágeno/quitosan a	HFIP/TFA
PLA	DCM/piridina	Compósitos
PCL	DCM/metanol	PDLA/HA	Clorofórmio
PHBV	Clorofórmio/DMF	PCL/CaCO3	Clorofórmio/metan ol
POP	HFIP	PCL/CaCO3	DCM/DMF

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PGA	HFIP	PCL/HA	DCM/DMF
PLCL	Acetona	PLLA/HA	Clorofórmio
PLCL	DCM	Gelatina/HA	HFIP
PLLA-DLA	Clorofórmio	PCL/colágeno/HA	HFIP
PEUU	HFIP	Colágeno/HA	HFIP
Celulose-acetato	Ácido acético/água	PDO/elastina	HFIP
PEG-b-PLA	Clorofórmio	PLLA/MWNTs/HA	1,4-dioxano/DCM
EVOH	70% de propan2-ol/água	Gelatina/siloxano	Ácido acético/acetato de etila/água
PVA	Água	PLGA/HA	DCM/água
PEG	Água	Aliginato de sódio/PEO	Água
PVP	Etanol/Água	Quitosana/PEO	Ácido acético/DMSO
PLA/PCL	Clorofórmio	Quitosana/PVA	Ácido acético
Gelatina/PVA	Ácido fórmico	Gelatina/elastina/P LGA	HFIP
PCL/colágeno	HFIP	Seda/PEO	Água
		Fibroína de seda/quitosana	Ácido fórmico

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39/77 [0198] Em uma modalidade, a matriz da presente descrição é composta de microfibras ou nanofibras sintéticas, por exemplo, usando os materiais listados na Tabela 2.

[0199] A seleção de um determinado polímero e seu uso em uma quantidade ou concentração especificada, ou faixa do mesmo, fornece a capacidade de controlar, personalizar e adaptar a taxa de degradação do polímero e, portanto, a taxa de degradação da matriz. Isto é útil porque é desejável que a matriz permaneça como parte do enxerto de pele a fim de fornecer suporte estrutural ao tecido de pele cultivado, mas eventualmente se degradar e ser bioabsorvido pelo corpo do paciente uma vez que as próprias células do paciente assimilarem o enxerto de pele, eliminando assim a necessidade de a matriz ser recuperada do corpo do paciente mais tarde.

[0200] Várias misturas de polímeros, por exemplo, selecionadas a partir dos materiais listados nas Tabelas 1 e 2, podem ser utilizadas para formar as fibras para melhorar a sua biocompatibilidade bem como as suas propriedades mecânicas, físicas e químicas.

[0201] Uma vez que as matrizes de microfibra ou nanofibra pretendidas tenham sido produzidas, em uma modalidade, duas ou mais matrizes de fibras da presente divulgação estão em camadas em conjunto. Ao formar em camadas múltiplas matrizes de fibra, as vantagens superiores e inesperadas de cada matriz de fibra podem ser combinadas e, em alguns casos, resultar em um efeito sinérgico.

[0202] Por exemplo, uma primeira matriz pode compreender micropoços para receber uma ou mais células relevantes e/ou tecido de pele, o qual é então depositado sobre uma segunda matriz tendo fibras alinhadas radialmente. Neste exemplo, a primeira matriz pode proporcionar o benefício de aumentar a reparação da pele danificada, proporcionando células relevantes e/ou tecido de pele, enquanto a segunda matriz pode proporcionar o benefício de direcionar e aumentar a migração celular da periferia para o centro da camada em matrizes em camadas. Camadas de duas ou mais matrizes

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40/77 também podem ajudar a melhorar as propriedades estanques de uma matriz. A pessoa versada na técnica é capaz de derivar várias combinações de duas ou mais matrizes diferentes para atingir as propriedades desejadas.

[0203] Em uma modalidade, a matriz da presente divulgação pode ser ainda tratada por meio de um único procedimento ou uma combinação de procedimentos que reduzam o número de micro-organismos capazes de crescer na matriz sob condições em que a matriz é armazenada e / ou distribuída.

[0204] Em uma modalidade, a matriz é esterilizada utilizando radiação gama. Em outra modalidade, a matriz é esterilizada utilizando óxido de etileno (EtO). Em outra modalidade, a matriz é esterilizada utilizando Revox que utiliza ácido percético.

[0205] Em uma modalidade, a matriz é esterilizada utilizando radiação ionizante, tal como irradiação de feixe de E. O processamento de feixe de elétrons tem o ciclo de processo mais curto de qualquer método de esterilização atualmente reconhecido. Irradiação de feixe de E, produtos são expostos a radiação por segundos, com a maior parte do tempo de processamento consumido no transporte de produtos para dentro e para fora da blindagem de radiação. O tempo total do processo, incluindo o tempo de transporte, é de 5 a 7 minutos. O processamento de feixes de elétrons envolve o uso de elétrons de alta energia, normalmente com energias que variam de 3 a 10 milhões de elétron-volts (MeV), para a radiação de produtos médicos descartáveis de uso unitário. Os elétrons são gerados por aceleradores que operam em um modo de feixe contínuo e de pulso. Esses altos níveis de energia são necessários para penetrar no produto que é empacotado em seu contêiner de embarque final. À medida que o feixe é varrido pelo produto, os elétrons interagem com os materiais e criam espécies energéticas secundárias, como elétrons, pares de íons, e radicais livres. Estas espécies energéticas secundárias são responsáveis pela inativação dos micro-organismos, pois interrompem a cadeia de DNA do micro-organismo, tornando o produto estéril. O destinatário

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41/77 habilitado está ciente de outros métodos possíveis para esterilizar as matrizes da presente divulgação.

CÉLULAS PARA SEMEAR AS MATRIZES DA PRESENTE DIVULGAÇÃO [0206] As matrizes da presente divulgação são adequadas para suportar o cultivo de vários tipos de células, por exemplo, células epiteliais e/ou células epidérmicas.

[0207] Os termos “epitélios” e “epitélio” referem-se à cobertura celular de superfícies externas e internas do corpo (cutânea, mucosa e serosa), incluindo as glândulas e outras estruturas derivados das mesmas, por exemplo, da córnea, do esôfago, da laringe, da epiderme, de folículo piloso e de células epiteliais da uretra.

[0208] Em uma modalidade, as células epiteliais utilizadas são células da pele, tais como células da pele humana, por exemplo, células que formam uma epiderme e derme, tais como fibroblastos e queratinócitos.

[0209] Outros tecidos epiteliais exemplificativos incluem: epitélio olfativo, que é o alinhamento de epitélio pseudoestratificado da região olfativa da cavidade nasal, e contendo os receptores para o sentido de cheiro; epitélio glandular, que se refere ao epitélio composto por células secretoras; epitélio escamoso, que se refere ao epitélio composto por células semelhantes a placas achatadas.

[0210] Como aqui utilizado, os fibroblastos são entendidos como sendo fibroblastos de ocorrência natural, mais particularmente fibroblastos que ocorrem na derme, fibroblastos geneticamente modificados ou fibroblastos provenientes de mutações espontâneas ou seus precursores.

[0211] Como aqui utilizado, queratinócitos são entendidos como células da epiderme que formam epitélio de placa queratinizante, queratinócitos geneticamente modificados ou queratinócitos que emanam de mutações espontâneas ou precursores de tais queratinócitos que

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42/77 podem ser de origem animal ou humana. Alternativamente, aos queratinócitos normais da pele, queratinócitos da membrana mucosa ou células epiteliais intestinais podem ser aplicados à matriz. Estas são, por exemplo, células précultivadas e, em uma modalidade, queratinócitos na primeira ou na segunda passagem celular, embora também possam ser utilizadas células de passagens superiores.

[0212] Os fibroblastos e queratinócitos são obtidos e cultivados por métodos conhecidos entre destinatários habilitados que podem ser adaptados às propriedades requeridas do tecido de pele a ser produzido.

[0213] Em uma modalidade, outros tipos de células e/ou outras células de outros tipos de tecidos de origem humana e animal, por exemplo, de mamíferos e/ou suas células precursoras, por exemplo, melanócitos, macrófagos, monócitos, leucócitos, células plasmáticas, células neurais, adipócitos, células precursoras induzidas e não induzidas de células de Langerhans, células de Langerhans e outras células imunes, células endoteliais, células de tumores da pele ou células associadas a pele, mais particularmente sebócitos ou tecido glandular sebáceo ou glândulas sebáceas explantes, células das glândulas sudoríparas ou do tecido das glândulas sudoríparas ou explantes de glândulas sudoríparas, células dos folículos capilares ou explantes de folículos capilares; e células de tumores de outros órgãos ou de metástases, podem ser semeadas na matriz antes, durante ou após a semeadura dos queratinócitos. As células mencionadas podem ser de origem humana e/ou animal (tal como origem humana). Células-tronco de várias origens, célulastronco específicas para tecidos, células-tronco embrionárias e/ou adultas também podem ser incorporadas ao modelo cutâneo.

[0214] Por conseguinte, o processo e a matriz de acordo com a presente descrição são capazes de gerar pele humana de espessura total, que é constituída por duas camadas específicas de tecido, nomeadamente um equivalente da derme e um equivalente da epiderme. O tecido de pele corresponde substancialmente à pele nativa histológica e

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43/77 funcionalmente.

[0215] O termo “tecido” é usado para se referir a uma agregação de células similarmente especializadas unidas no desempenho de uma função particular. Tecido se destina a englobar todos os tipos de tecido biológico, incluindo tecido duro e tecido mole. Um “tecido” é uma coleção ou agregação de células particulares incorporadas dentro da sua matriz natural, em que a matriz natural é produzida pelas células vivas particulares. O termo também pode se referir a agregações ex vivo de células similarmente especializadas que são expandidas in vitro, tal como em órgãos artificiais.

[0216] O termo “tecido de pele” ou “pele”, tal como aqui utilizado, refere-se a qualquer tecido, incluindo epiderme, derme e tecido da membrana basal, por exemplo, pele de espessura total.

[0217] Em uma modalidade, as células a serem semeadas são autólogas, que são derivadas do próprio corpo do sujeito. Em outra modalidade, as células alogênicas são derivadas de um membro geneticamente diferente da mesma espécie. Em alguns casos, podem ser utilizadas células xenogênicas derivadas de uma espécie diferente do destinatário pretendido.

[0218] Em uma modalidade, a semeadura das células da pele na matriz ocorre na presença de uma solução fisiológica.

[0219] O termo “solução fisiológica”, tal como aqui utilizado, refere-se a uma solução que é semelhante ou idêntica para uma ou mais condições fisiológicas ou que pode alterar o estado fisiológico de um determinado ambiente fisiológico. O termo “solução fisiológica”, tal como aqui utilizado refere-se também a uma solução que é capaz de suportar o cultivo de células (incluindo, mas não limitado a, de mamífero, vertebrado, e/ou outras células).

[0220] Em uma modalidade, uma solução fisiológica compreende um meio de cultura definido, no qual a concentração de cada um dos componentes do meio é conhecida e/ou controlada. Meios definidos

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44/77 tipicamente contêm todos os nutrientes necessários para o cultivo de células de suporte, incluindo, mas não limitados a, sais, aminoácidos, vitaminas, lipídios, elementos vestigiais, e fontes de energia como carboidratos. Exemplos não limitativos de meios definidos incluem DMEM, Basal Media Eagle (BME), Meio 199; F-12 (Ham) Mistura Nutritiva; Mistura de Nutrientes F-IO (Ham); Mídia Essencial Mínima (MEM), Mídia Williams E, e RPMI 1640.

[0221] Em outra modalidade, o meio de cultura é DMEM (Meio de Eagle Modificado por Dulbecco), M199, Meio F12 de Ham, ou uma sua combinação. Contudo, qualquer outro meio de cultura celular que permita o cultivo de fibroblastos pode também ser utilizado.

[0222] Em uma modalidade, é utilizado meio Greens, que é DMEM: Hams F12 (Life Technologies 31765-035) em uma proporção de 3:1.

[0223] O soro fetal de bezerro (FCS) é preferencialmente utilizado como soro, embora os produtos NCS e substitutos do soro sejam também adequados, enquanto o tampão Hepes, por exemplo, é utilizado como tampão. O valor do pH da solução de meio de cultura de células, tampão e soro está preferencialmente na faixa de 6,0 a 8,0, por exemplo, de 6,5 a 7,5 e, mais particularmente, 7,0.

[0224] Um versado na técnica estará ciente de outros meios definidos que podem ser usados de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade, uma mistura de um ou mais meios definidos é empregada.

[0225] Em uma modalidade, o meio pode conter outros fatores, por exemplo, hormônios, fatores de cultivo, proteínas de adesão, antibióticos, fatores de seleção, enzimas e inibidores de enzima e semelhantes. Fatores de cultivo, por exemplo, podem ajudar a aumentar a proliferação das células semeadas.

[0226] As densidades de semeadura da matriz celular podem variar e as camadas individuais da matriz celular podem ter as mesmas ou diferentes densidades de semeadura. Densidades de semeadura podem

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45/77 variar de acordo com a aplicação particular para a qual a matriz celular é aplicada. Densidades de semeadura também podem variar de acordo com o tipo de célula que é usado na fabricação da matriz celular.

[0227] O número e a concentração de células semeadas na ou sobre a matriz podem ser variados modificando a concentração de células em suspensão, ou modificando a quantidade de suspensão que é distribuída em uma determinada área ou volume da matriz.

[0228] Em uma modalidade, a densidade de semeadura é de cerca de 150.000 queratinócitos/cm² ou superior, tal como 200.000, 250.000, 300.000, 350.000, 400.000, 450.000, 500.000, 550.000 ou 600.000 queratinócitos/cm².

[0229] Em uma modalidade, a densidade de semeadura é de cerca de 50 mil fibroblastos/cm² ou superior, tal como 60.000, 70.000, 80.000, 90.000, 100.000, 110.000, 120.000, 130.000, 140.000, 150.000, 160.000, 170.000, 180.000, 190.000 ou 200.000 fibroblastos/cm².

[0230] Densidades de semeadura das camadas individuais da matriz dependerá do uso para o qual a matriz é pretendida. Embora um versado na técnica possa apreciar densidades de semeadura particulares, uma aplicação específica exigirá, camadas individuais da matriz podem ser semeadas em uma variedade de densidades de semeadura. Um versado na técnica apreciará que as densidades de semeadura para as camadas individuais da matriz podem variar de acordo com o uso para o qual a matriz é pretendida.

[0231] O espalhamento envolve o uso de um instrumento, como uma espátula, para espalhar o inóculo através da matriz espongiforme. Semear a matriz por pintura é feito mergulhando uma escova no inóculo, retirando-a e passando a escova carregada de inóculo pela matriz. Este método tem a desvantagem de que um número substancial de células pode se agarrar ao pincel e não ser aplicado à rede. No entanto, pode, no entanto, ser útil, especialmente em situações em que se deseja controlar cuidadosamente o

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46/77 padrão ou área de rede sobre a qual o inóculo é distribuído.

[0232] Semear a matriz por pulverização geralmente envolve forçar o inóculo através de qualquer tipo de bocal que transforma o líquido em pequenas gotículas no ar. Esta modalidade está sujeita a duas restrições. Primeiro, não deve submeter as células em solução a forças de cisalhamento ou pressões que danificariam ou matariam números substanciais de células. Em segundo lugar, não deve exigir que a suspensão celular seja misturada com um fluido propulsor que seja tóxico ou prejudicial para as células ou leitos de feridas. Uma variedade de bicos que estão normalmente disponíveis satisfaz ambas as restrições. Tais bicos podem ser conectados de qualquer maneira convencional a um reservatório que contém um inóculo de célulastronco epiteliais.

[0233] A semeadura da matriz por pipetagem é realizada usando pipetas, “conta-gotas” comuns ou outros dispositivos semelhantes capazes de colocar pequenas quantidades do inóculo na superfície da matriz da presente divulgação. O líquido aquoso permeará através da matriz porosa. As células em suspensão tendem a ficar enredadas na superfície da matriz e são assim retidas na superfície da matriz.

[0234] De acordo com outra modalidade da invenção, um inóculo de células pode ser semeado por meio de uma seringa hipodérmica equipada com uma agulha oca ou outro conduíte. Uma suspensão de células é administrada no cilindro da seringa e a agulha é inserida na matriz. O êmbolo da seringa é pressionado para ejetar uma quantidade de solução do cilindro, através da agulha e para dentro do arcabouço.

[0235] Uma vantagem importante da utilização de uma suspensão aquosa de células é que pode ser utilizada para expandir grandemente a área da matriz na qual um inóculo eficaz é distribuído. Isso fornece duas vantagens distintas. Primeiro, se uma quantidade muito limitada de tecido intacto estiver disponível para autoenxerto, então os vários métodos de suspensão podem ser usados para aumentar dramaticamente a área ou volume

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47/77 de uma matriz que pode ser semeada com o número limitado de células disponíveis. Segundo, se uma determinada área ou volume de uma matriz precisar ser semeada com células, então a quantidade de tecido intacto que precisa ser colhida de um local doador pode ser bastante reduzida. As densidades de semeadura ideais para aplicações específicas podem ser determinadas através de experimentação de rotina por versados na técnica.

[0236] Tipicamente, as dimensões da matriz devem ser substancialmente planas e de uma espessura que dê às células semeadas acesso suficiente a um meio nutriente. Quando implantada, a matriz celular deve ter acesso suficiente aos fluidos corporais para nutrição e remoção de resíduos. A espessura da matriz pode ser variada por alterações na porosidade da matriz. Assim, aumentos na porosidade da matriz podem permitir que as matrizes assumam uma maior espessura, uma vez que os tamanhos de poros maiores melhoram o acesso ao meio externo e aos fluidos corporais.

[0237] Consequentemente, em uma modalidade, a matriz tem uma espessura de 100 pm ou menos, por exemplo, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10 ou 5 pm. Ao manter a matriz com 100 pm ou menos de espessura, isso permite que os queratinócitos semeados recebam nutrientes e removam os resíduos apenas por difusão, sem a necessidade de um sistema de vasculatura para sobreviver.

[0238] A semeadura da matriz em camadas envolve a introdução de uma ou mais populações de células desejadas em um material de substrato selecionado e, subsequentemente, a junção dos materiais para criar uma matriz em camadas. Alternativamente, as matrizes podem ser pré-unidas e a(s) população(ões) selecionada(s) de células podem ser introduzidas em um local selecionado. A semeadura é distinta da infiltração espontânea e migração das células para a matriz a partir de um local da ferida quando a matriz é colocada no local da ferida.

[0239] Em uma modalidade, as matrizes são semeadas em pelo menos uma superfície, por exemplo, a chamada superfície

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48/77 superior da matriz é semeada com queratinócitos. Em uma modalidade, a chamada superfície inferior da matriz é semeada com fibroblastos. Em uma modalidade, a superfície superior da matriz é semeada com queratinócitos e a superfície inferior da matriz é semeada com fibroblastos. Em uma modalidade, a superfície superior da matriz é semeada com queratinócitos e a superfície inferior da matriz não é semeada com fibroblastos (os fibroblastos são simplesmente deixados migrar para a matriz a partir da cultura de células). Em uma modalidade, os fibroblastos migraram para a matriz (por exemplo, em uma etapa de pré-cultura) antes de os queratinócitos serem semeados na superfície superior da matriz.

VÁRIOS AGENTES A SER LIGADOS OU REVESTIDOS ÀS MATRIZES DA PRESENTE DIVULGAÇÃO [0240] Vários materiais adicionais e/ou moléculas biológicas podem ser ligados às matrizes da presente divulgação. O termo “anexado” inclui, mas não está limitado a, revestimento, embebição ou incorporação por qualquer meio dos materiais adicionais e/ou moléculas biológicas, e anexado pode se referir a incorporar tais componentes na matriz inteira ou apenas uma porção dela.

[0241 ] Em uma modalidade, os fatores de células são revestidos/anexados à matriz da presente revelação. Como aqui utilizado, o termo “fatores celulares” refere-se a substâncias que são sintetizadas por células vivas (por exemplo, células estaminais) e que produzem um efeito benéfico no corpo (por exemplo, mamífero ou corpo humano). Os fatores celulares incluem, mas não estão limitados a, fatores de cultivo, fatores regulatórios, hormônios, enzimas, linfocinas, peptideos e combinações dos mesmos. Os fatores celulares podem ter efeitos variados, incluindo, mas não se limitando a, influenciar o cultivo, a proliferação, o comprometimento e/ou a diferenciação de células (por exemplo, células-tronco) in vivo ou in vitro.

[0242] Alguns exemplos não limitantes de fatores celulares incluem, mas não estão limitados a, citocinas (por exemplo, cadeia beta

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49/77 comum, cadeia gama comum e famílias de citocinas IL-6), fator de cultivo endotelial vascular (por exemplo, VEGF-A, -B, -C, -D e -E), adrenomedulina, fator de cultivo semelhante à insulina, fator de cultivo epidérmico EGF, fator de cultivo de fibroblastos FGF, fator de motilidade autócrina, GDF, IGF, PDGF, fator de diferenciação de cultivo 9, eritropoietina, ativinas, TGF-a TGF-β, proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs), moléculas de Hedgehog, moléculas relacionadas a Wnt e suas combinações.

[0243] Em uma modalidade, um fator de cultivo tal como EGF (fator de cultivo epidérmico), IGF-I (fator de cultivo semelhante a insulina), um membro da família Fibroblast Growth Factor (FGF), fator de cultivo de queratinócitos (KGF), PDGF (fator de cultivo derivado de plaquetas AA, AB, BB), TGF-β (Família do Fator de Cultivo Transformador - β1, β2, β3), CIF (Fator Indutor de Cartilagem), pelo menos uma das BMPs 1-14 (Proteínas Morfogênicas Ósseas), fator de estimulação de colônia granulócito-macrófago (GM-CSF), ou combinações dos mesmos, o que pode promover a regeneração de tecido, pode ser ligado ou revestido às matrizes da presente divulgação.

[0244] Em uma modalidade, o fator de cultivo é VEGF.

Em outra modalidade, o fator de cultivo é PDGF. O destinatário habilitado estaria ciente de vários outros materiais e moléculas biológicas que podem ser ligados ou utilizados para revestir uma matriz da matéria presentemente divulgada, e podem ser selecionados para uma aplicação particular com base no tecido para o qual devem ser aplicados.

[0245] Em uma modalidade, uma proteína de matriz extracelular, tal como fibronectina, laminina e/ou colágeno, é adicionalmente ligada ou revestida na matriz. Assim, em uma modalidade, a matriz é revestida com colágeno IV, colágeno I, laminina e fibronectina, ou uma sua combinação. Os presentes inventores descobriram que estas proteínas ajudam a fornecer um sinal celular secundário que, em conjunção com o cultivo em uma interface de ar líquido (ou membrana permeável a gás), provoca a estratificação adequada das células da pele cultivadas utilizando a matriz.

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50/77 [0246] Em uma modalidade, o colágeno IV é usado. O colágeno IV se mostrou particularmente eficaz na produção de estratificação epidérmica adequada.

[0247] As proteínas da matriz extracelular podem estar na forma de proteínas inteiras ou seus peptídeos, por exemplo, peptídeos sintéticos.

[0248] Em outra modalidade, um agente terapêutico é ainda ligado à matriz. O termo “agente terapêutico”, tal como aqui utilizado, refere-se a qualquer um de uma variedade de agentes que exibem um ou mais efeitos terapêuticos benéficos quando utilizados em conjunto com métodos, matrizes e/ou tecidos da pele da presente divulgação. Exemplos de agentes terapêuticos que podem ser utilizados incluem, sem limitação, proteínas, peptídeos, drogas, citocinas, moléculas extracelulares de matriz e/ou fatores de cultivo. Um versado na técnica estará ciente de outros agentes terapêuticos adequados e/ou vantajosos que podem ser utilizados de acordo com a presente divulgação.

[0249] Em uma modalidade, o agente terapêutico é um agente anti-inflamatório ou um antibiótico. Exemplos de agentes antiinflamatórios que podem ser incorporados nas matrizes incluem, mas não se limitam a, agentes anti-inflamatórios esteroidais, tais como betametasona, triamcinolona, dexametasona, prednisona, mometasona, fluticasona, beclometasona, flunisolida e budesonida; e agentes anti-inflamatórios não esteroidais, tais como fenoprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, cetoprofeno, naproxeno, oxaprozina, diclofenac, etodolac, indometacina, cetorolac, nabumetona, meclofenamato de sulindac tolmetina, ácido mefenâmico, piroxicam e suprofen.

[0250] Vários antibióticos podem também ser empregados de acordo com o assunto presentemente divulgado. Exemplos não limitativos incluem aminoglicosídios, tais como amicacina, gentamicina, canamicina, neomicina, netilmicina, paromomicina, estreptomicina ou

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51/77 tobramicina; carbapenemes, tais como ertapenem, imipenem, meropenem; cloranfenicol; fluoroquinolonas, tais como ciprofloxacina, gatifloxacina, gemifloxacina, grepafloxacina, levofloxacina, lomefloxacina, moxifloxacina, norfloxacina, ofloxacina, esparfloxacina ou trovafloxacina; glicopeptídeos, tais como vancomicina; lincosamidas, tais como clindamicina; macridos/cetidos, tais como azitromicina, claritromicina, diritromicina, eritromicina ou telitromicina; cefalosporinas, tais como cefadroxil, cefazolina, cefalexina, cefalotina, cefapirina, cefhridina, ceforbil, cefamandole, cefonicid, cefotetan, cefoxitin, cefprozil, cefuroxima, loracarbef, cefdinir, cefditoren, cefixima, cefoperazona, cefotaxima, cefpodime, ceftazidima, ceftibuteno, ceftizoxima, ceftriaxona ou cefepima; monobactamas, tais como aztreonam; nitroimidazóis, tais como metronidazol; oxazolidinonas, tais como linezolida; penicilinas, como amoxicilina, amoxicilina/clavulanato, ampicilina, ampicilina/sulbactam, bacampicilina, carbenicilina, cloxacilina, dicloxacilina, meticilina, mezlocilina, nafcilina, oxacilina, penicilina G, penicilina V, piperacilina, piperacilina/tazobactam, ticarcilina ou ticarcilina/clavulanato; estreptograminas, tais como quinupristina/dalfopristina; antagonistas de sulfonamida/folato, tais como sulfametoxazol/trimetoprim; tetraciclinas, tais como demeclociclina, doxiciclina, minociclina ou tetraciclina; antifúngicos azólicos, tais como clotrimazol, fluconazol, itraconazol, cetoconazol, miconazol ou voriconazol; antifúngicos de polieno, tais como anfotericina B ou nistatina; antifúngicos equinocandos, tais como caspofungina ou micafungina, ou outros antifúngicos, tais como ciclopirox, flucitosina, griseofulvina ou terbinafina.

[0251] Em uma modalidade, vários analgésicos e/ou anestésicos são ligados ou incorporados nas matrizes da presente divulgação. Como aqui utilizado, o termo “analgésico” refere-se a agentes utilizados para aliviar a dor e, em algumas modalidades, pode ser utilizado indistintamente com o termo “agente anti-inflamatório” de tal modo que o termo analgésicos pode ser inclusivo dos agentes anti-inflamatórios exemplificativos descrito aqui. Os analgésicos exemplificativos incluem, mas não se limitam a: paracetamol e agentes anti-inflamatórios não esteroidais, inibidores de COX-2 e opiáceos, tais

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52/77 como morfina e morfinomiméticos.

[0252] Como aqui utilizado, o termo “anestésico” refere-se a agentes usados para causar uma perda reversível de sensibilidade no sujeito e pode assim ser usado para aliviar a dor. Anestésicos exemplificativos que podem ser utilizados de acordo com o assunto presentemente divulgado incluem, mas não estão limitados a, anestésicos locais, tais como procaína, ametocaína, cocaína, lidocaína, prilocaína, bupivicaína, levobupivicaína, ropivacaína, mepivacaína e dibucaína.

UTILIZAÇÕES DE MATRIZ E TECIDO DE PELE DA PRESENTE DIVULGAÇÃO [0253] A presente divulgação proporciona a utilização de tecido, tal como o epitélio, a epiderme, epitélio estratificado, epiderme estratificada e derme, pele de espessura dividida ou pele de espessura total, preparado por um método aqui descrito, por exemplo, utilizando uma matriz do presente divulgação, para o tratamento de danos nos tecidos em um sujeito em necessidade do mesmo.

[0254] O termo “sujeito” é aqui utilizado para se referir tanto a sujeitos humanos como animais, mas é geralmente destinado a se referir a um paciente humano que necessite de tratamento.

[0255] Os termos “tratamento” ou “tratar”, como usado aqui, incluem, mas não estão limitados a, inibir a progressão de dano a um tecido, inibir o desenvolvimento de dano a um tecido, reduzir a severidade de dano a um tecido, melhorar ou aliviar sintomas associados a danos em um tecido e reparar, regenerar e/ou causar uma regressão de tecido danificado ou um ou mais dos sintomas associados a um tecido danificado.

[0256] A presente divulgação proporciona um modo de tratamento de dano tecidual em um sujeito com necessidade do mesmo, compreendendo:

[0257] a) proporcionar um tecido de pele, tal como epitélio, epitélio estratificado, epiderme, epiderme estratificada, epiderme e

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53/77 derme estratificada, pele com espessura parcial ou pele de espessura total, que foi cultivada, por exemplo, em um método como aqui descrito, tal como um método empregando matriz da presente divulgação, [0258] b) recuperar sob condições estéreis o tecido da matriz, e [0259] c) aplicar o tecido ao paciente.

[0260] Em várias modalidades, o dano tecidual é uma ferida, uma ferida crônica, uma ferida cirúrgica, uma úlcera, uma ferida que não cicatriza, uma cicatriz, uma cicatriz cirúrgica, uma escaldadura ou uma queimadura. Em várias modalidades, a queimadura é uma queimadura de primeiro grau, uma queimadura de segundo grau, uma queimadura de terceiro grau, uma queimadura dérmica profunda ou uma queimadura de espessura total.

[0261] Em várias modalidades, o dano tecidual é o epitélio localizado em uma superfície da mucosa. Em várias modalidades, o epitélio está localizado na ou acima da pele, nos pulmões, no trato gastrointestinal (por exemplo, no esôfago ou boca), no trato reprodutivo ou no trato urinário (por exemplo, a uretra).

[0262] Outros exemplos de tratamentos incluem mas não estão limitados a: regeneração de pele com os nervos e organelas; cicatrização de feridas, por exemplo, promover/intensificar a cicatrização de feridas, incluindo úlceras tais como úlceras diabéticas; curar queimaduras; regeneração e reparação de pele; epidermólise bulosa; melhorar a qualidade ou aparência de pele; prevenção ou remediação de distúrbios pele; diminuição ou supressão de tecido cicatricial; regeneração da pele da mama (após cirurgia); aplicações cosméticas, por exemplo, antienvelhecimento; regeneração dérmica para rugas e outros defeitos de pele; promoção do cultivo do folículo piloso, regeneração de nervo e outras organelas; cura sem cicatrizes, ou recura para diminuir cicatrizes.

[0263] Em uma modalidade, a presente divulgação proporciona uma matriz, o tecido de pele e método útil para a regeneração de

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54/77 tecido danificado, perdido e/ou degenerado. Por exemplo, uma matriz, método ou pele do tecido da presente invenção podem ser empregados para iniciar, aumentar, apoiar, promover e/ou direcionar a regeneração de tecido danificado, perdido e/ou degenerado, em particular a regeneração da pele danificada.

[0264] “Regeneração”, “Regenerar”, “Regenerativo” como usado aqui referem-se a qualquer processo ou qualidade que inicie, aumente, module, promova, suporte e/ou direcione o cultivo, regeneração, reparo, funcionalidade, padronização, conectividade, fortalecimento, vitalidade e/ou o processo natural de cicatrização de tecidos fracos, danificados, perdidos e/ou degenerados. Estes termos podem também se referir a qualquer processo ou qualidade que inicie, aumente, module, promova, suporte e/ou direcione o cultivo, fortalecimento, funcionalidade, vitalidade, tenacidade, potência e/ou saúde do tecido fraco, cansado e/ou normal.

[0265] Tal como aqui utilizado, o termo “ferida” é utilizado para referir genericamente a lesões à pele e ao tecido subcutâneo iniciadas em maneiras diferentes (por exemplo, úlceras de pressão de repouso no leito prolongado e feridas induzidas por trauma) e com características variadas. As feridas são geralmente classificadas em um dos quatro graus, dependendo da profundidade da ferida: Grau I: feridas limitadas ao epitélio; Grau II: feridas que se estendem até a derme; Grau III: feridas que se estendem para o tecido subcutâneo; e Grau IV (ou feridas de espessura total), que são feridas em que os ossos são expostos (por exemplo, um ponto de pressão óssea, como o trocanter maior ou o sacro).

[0266] Como aqui utilizado, o termo “ferida de espessura parcial” refere-se a feridas que abrangem os Graus I a III; por exemplo, feridas de queimaduras, úlceras de pressão, úlceras de estase venosa, e úlceras diabéticas. Como usado aqui, o termo “ferida profunda” é usado para descrever tanto as feridas de Grau III quanto de Grau IV.

[0267] Em uma modalidade, é proporcionado um tecido de pele tal como epitélio, epiderme, epitélio estratifiçado, epiderme e

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55/77 derme estratificada, pele de espessura dividida ou pele de espessura total, preparado por um método aqui descrito para facilitar um enxerto de pele, cobrindo uma área de tecido de pele danificado, ferido, machucado, doente, removido ou ausente de um corpo de um sujeito.

[0268] Tal como aqui utilizado, um “enxerto” refere-se a uma célula, tecido ou órgão que é implantada em um sujeito, normalmente para substituir, corrigir ou solucionar de outro modo um defeito. Assim, um “enxerto de pele” é um tecido de pele que pode ser implantado em um sujeito, por exemplo, suturado ao sujeito. Um enxerto pode ainda compreender uma matriz da presente divulgação, por exemplo, em que a matriz está integrada no enxerto de pele. O tecido ou órgão pode consistir em células originárias do mesmo sujeito; este enxerto é aqui referido pelos seguintes termos intermutáveis: “autoenxerto”, “transplante autólogo”, “implante autólogo” e “enxerto autólogo”. Um enxerto que compreende células de um sujeito geneticamente diferente da mesma espécie é referido aqui pelos seguintes termos intermutáveis: “aloenxerto”, “transplantação alogênica”, “implante alogênico” e “enxerto alogênico”. Um “xenoenxerto”, “transplante xenogênico “ ou “implante xenogênico “ refere-se a um enxerto de um sujeito para outro de uma espécie diferente.

[0269] Em uma modalidade, o tecido é preparado utilizando células que são autólogas ao sujeito. Por exemplo, em várias modalidades, o tecido é preparado utilizando fibroblastos, queratinócitos ou fibroblastos e queratinócitos que são autólogos ao sujeito. Em uma modalidade alternativa, o tecido é preparado utilizando células que são heterólogas ao sujeito. Em uma outra modalidade, o tecido é preparado utilizando uma combinação de células, em que algumas das células são autólogas ao sujeito e algumas das células são heterólogas ao sujeito.

[0270] Será apreciado que as células autólogas ao sujeito possam ser isoladas utilizando qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, células autólogas podem ser isoladas a partir de uma amostra de

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56/77 pele ou biópsia de pele retirada do sujeito por digestão do tecido de amostra e separação de fibroblastos e/ou queratinócitos do tecido digerido.

[0271] Em uma modalidade, o tecido é um autoenxerto, por exemplo, um autoenxerto de pele. Em várias modalidades, o tecido é um autoenxerto epidérmico, um autoenxerto de pele com espessura parcial ou um autoenxerto de pele de espessura total. Em outra modalidade, o tecido é um enxerto alogênico.

[0272] Entende-se que a aplicação de tecido preparado utilizando células autólogas ao paciente, tal como um autoenxerto, altamente desejável para reduzir ou prevenir a rejeição imunitária do tecido e para reduzir a necessidade de imunoterapia em curso ou outros tratamentos auxiliares.

[0273] Em uma modalidade, o tecido compreende ainda a matriz. Em outra modalidade, o tecido é separado da matriz antes da aplicação ao paciente.

[0274] Geralmente, a aplicação de tecido ao paciente será por cirurgia. Em uma modalidade, a recuperação sob condições estéreis é durante ou imediatamente antes da cirurgia, por exemplo, na suíte cirúrgica.

[0275] Geralmente, a aplicação de tecido ao paciente será no local ou adjacente ao local do dano tecidual. Em várias modalidades, os tecidos são aplicados para cobrir, pelo menos parcialmente, o local do dano tecidual ou para cobrir completamente o local do dano tecidual.

[0276] Em uma modalidade, o tecido é aplicado para cobrir temporariamente o local do dano tecidual. Em uma modalidade alternativa, o tecido é aplicado para cobrir permanentemente o local do dano tecidual.

OUTROS USOS NÃO MÉDICOS [0277] A eficácia e segurança de produtos farmacêuticos, nutracêuticos ou cosméticos aplicados topicamente são tipicamente testados utilizando modelos de pele de animal ou animais vivos, pele de cadáver humano ou pele humana sintética.

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57/77 [0278] As diferenças morfológicas entre pele animal e humana significam que a pele de animal extirpada ou animais vivos para o teste de produtos não é ideal. Além disso, existe considerável preocupação ética com o uso de animais vivos ou peles de animais para testar produtos cosméticos, incluindo a proibição de tais testes em alguns países. Por estas razões, há um forte desejo de identificar alternativas aos modelos animais para o teste de tais produtos.

[0279] Resultados inconsistentes e altamente variáveis têm sido observados quando a pele de cadáveres humanos é usada para testes de produtos.

[0280] Consequentemente, células ou tecidos, tais como tecido de pele preparado utilizando o dispositivo ou métodos aqui descritos são úteis para testes in vitro de produtos farmacêuticos, nutracêuticos ou produtos cosméticos.

[0281] Em várias modalidades, células ou tecidos preparados utilizando o dispositivo ou métodos aqui descritos são utilizados para testar a penetração transdérmica de um composto, para testar a permeação de um composto através da epiderme, derme ou membrana basal, para testar a eficácia de um ingrediente ativo para tratamento, ou prevenir uma condição, por exemplo, uma condição da pele, ou testar a toxicidade de um composto.

[0282] Mais particularmente, o tecido de pele produzido de acordo com a presente divulgação adequado para testar produtos, por exemplo, para eficácia, efeitos secundários indesejáveis, por exemplo, irritação, toxicidade e inflamação ou efeitos alérgicos, ou a compatibilidade de substâncias. Estas substâncias podem ser substâncias destinadas a uma utilização potencial como medicamentos, por exemplo, como dermatológicos, ou substâncias que são constituintes de cosméticos ou mesmo bens de consumo que entram em contato com a pele, tais como detergentes para a roupa, etc.

[0283] O tecido de pele da presente divulgação também pode ser utilizado, por exemplo, para estudar a absorção, transporte

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58/77 e/ou penetração de substâncias. Também é adequado estudar outros agentes (quantidades físicas), como luz ou calor, radioatividade, som, radiação eletromagnética, campos elétricos, por exemplo, estudar a fototoxicidade, isto é, o efeito prejudicial da luz de diferentes comprimentos de onda nas estruturas celulares. O tecido de pele também pode ser usado para estudar a cicatrização de feridas e também é adequado para estudar os efeitos de gases, aerossóis, fumaça e poeira nas estruturas celulares ou no metabolismo ou expressão gênica.

[0284] Em uma modalidade, o tecido de pele da presente divulgação pode ser empregado para estudar os mecanismos de doença que afetam a pele, tais como o câncer de pele, psoríase, dermatite e semelhantes.

[0285] Em várias modalidades, as células ou tecido são utilizados para determinar se um composto de interesse é um irritante da pele, por exemplo, para determinar se um composto de interesse induz uma erupção cutânea, inflamação ou dermatite de contato.

[0286] Os efeitos de substâncias ou agentes na pele humana podem ser determinados, por exemplo, pela liberação de substâncias, por exemplo, citocinas ou mediadores, por células do sistema modelo de pele humana ou animal e os efeitos na expressão gênica, metabolismo, proliferação, diferenciação e reorganização dessas células. Utilizando processos para quantificar o dano celular, mais particularmente utilizando um corante vital, tal como um derivado de tetrazólio, é possível, por exemplo, detectar efeitos citotóxicos em células da pele. O teste de substâncias ou agentes que utilizam o tecido de pele pode compreender tanto processos histológicos como também processos imunológicos e/ou biológicos moleculares.

[0287] Um “agente de teste” como usado aqui é qualquer substância que é avaliada por sua capacidade de diagnosticar, curar, mitigar, tratar, ou prevenir a doença em um sujeito, ou é destinada a alterar a estrutura ou função do corpo de um sujeito. Os agentes de teste incluem, mas

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59/77 não estão limitados a, compostos químicos, agentes biológicos, proteínas, peptídeos, ácidos nucleicos, lipídeos, polissacáridos, suplementos, sinais, agentes de diagnóstico e moduladores imunes. Os agentes de teste podem ainda incluir forças mecânicas e/ou eletromagnéticas.

[0288] Em outra modalidade, o tecido de pele produzido de acordo com a divulgação pode ser utilizado como um sistema modelo para o estudo de doenças da pele e para o desenvolvimento de novos tratamentos para doenças da pele. Por exemplo, células de pacientes com uma certa doença de pele genética ou adquirida podem ser utilizadas para estabelecer sistemas modelo de pele específicos de pacientes que podem por sua vez ser usados para estudar e avaliar a eficácia de certas terapias e/ou medicamentos.

[0289] Em uma modalidade, o tecido de pele pode ser preenchido com micro-organismos, mais particularmente micro-organismos patogênicos. População com micro-organismos patogênicos ou parasitários, incluindo, em particular, micro-organismos patogênicos para humanos.

[0290] “Micro-organismos”, como usado aqui, geralmente se refere a fungos, bactérias e vírus. Os micro-organismos são preferencialmente selecionados de fungos ou bactérias patogênicas e/ou parasíticas conhecidas por infectar a pele. Estes incluem mas não estão limitados a espécies do gênero Candida albicans, Trichophyton mentagrophytes, Malassezia furfur e Staphylococcus aureus.

[0291] Utilizando um tecido de pele correspondentemente povoado, é possível estudar tanto o processo de uma população de micro-organismos, mais particularmente o processo de infeção, pelo próprio micro-organismo e a resposta da pele àquela população. Além disso, o efeito de substâncias aplicadas antes, durante ou depois da população sobre a própria população ou sobre os efeitos da população sobre o tecido de pele pode ser estudado.

[0292] Em várias modalidades as células

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60/77 compreendem fibroblastos, queratinitos ou células imunitárias, ou uma combinação de quaisquer dois ou mais dos mesmos. Em uma modalidade, as células compreendem fibroblastos e queratinócitos. Em várias modalidades o tecido é selecionado dentre o grupo que compreende a epiderme, epiderme e derme estratificadas, epiderme e derme estratificadas, pele de espessura dividida ou pele de espessura completa.

[0293] A espessura da pele rachada, tal como é aqui utilizada, refere-se à camada da epiderme ou da derme (tal como uma camada da derme).

[0294] Em várias modalidades, o composto é um composto farmacêutico, um composto cosmético ou um composto nutracêutico.

[0295] Em várias modalidades, o composto para teste é aplicado ao tecido sozinho ou em uma mistura com veículos, excipientes ou diluentes farmaceuticamente ou cosmeticamente aceitáveis.

[0296] Em várias modalidades, o composto para teste é aplicado topicamente ao tecido na forma de creme estéril, gel, formulação pouron ou spot-on, suspensão, loção, unguento, pó para polvilhar, um molho, aspersão, penso incorporado com medicamento, xampu, colarinho ou adesivo de pele.

[0297] “Compreendendo” no contexto da presente especificação pretende significar “incluindo”.

[0298] Quando tecnicamente apropriado, as modalidades da invenção podem ser combinadas.

[0299] As modalidades são aqui descritas como compreendendo certas características/elementos. A divulgação também se estende a modalidades separadas consistindo ou consistindo essencialmente nas referidas características/elementos.

[0300] Referências técnicas tais como patentes e aplicações são incorporadas ao presente documento a título de referência.

[0301] Quaisquer modalidades recitadas

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61/77 especificamente e explicitamente no presente documento podem formar a base de uma declaração de responsabilidade, isoladamente ou em combinação com uma ou mais modalidades adicionais.

[0302] A seção de antecedentes da presente divulgação inclui divulgação tecnicamente relevante, que pode ser empregado como base para emendas às reivindicações.

[0303] O presente pedido reivindica prioridade de G1622340.6, aqui incorporado na totalidade por referência. Correções à presente divulgação podem ser baseadas na divulgação prioritária.

[0304] A invenção será agora descrita com referência aos exemplos seguintes, que são meramente ilustrativos e não devem de modo algum ser interpretados como limitativos do âmbito da presente invenção.

EXEMPLOS [0305] Nos Exemplos 1 a 3, as células foram cultivadas nas matrizes da presente divulgação utilizando métodos descritos nos Exemplos 4 a 7.

EXEMPLO 1 - DETERMINAÇÃO DO DIÂMETRO E POROSIDADE ÓTIMOS DA FIBRA [0306] O diâmetro e a porosidade da fibra são importantes para conseguir a auto-organização de uma mistura de fibroblastos e queratinócitos em pele de espessura total contendo camadas epidérmicas e dérmicas. O diâmetro e a porosidade da fibra precisam ser ótimos, de modo que quando queratinócitos e fibroblastos são adicionados à superfície, os queratinócitos ficam no topo e formam uma epiderme e os fibroblastos são capazes de migrar para a matriz sintética para formar uma derme. O resultado é que a pele formada possui a matriz sintética integrada entre a derme e a epiderme formada pelos fibroblastos e queratinócitos, respectivamente.

[0307] Assim, os presentes inventores testaram primeiro uma faixa de diferentes concentrações de solução de PLGA (20% p/v, 25% p/v, 30% p/v, 35% p/v e 40% p/v para folhas de fibra produzidas por

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62/77 eletrofiação. A Figura 1 mostra imagens das fibras produzidas por eletrofiação do PLGA. 72:25 PLGA (razão de 72:25 de ácido polilático para ácido poliglicólico) foi utilizado para todas as diferentes concentrações de PLGA. Os parâmetros de eletrofiação foram os seguintes:

[0308] · PLGA dissolvido em 1:1 Dimetilformamida:

Tetraidrofurano.

[0309] · Umidade menor que 50%. Temperatura 30 °C.

[0310] · Ponta da agulha na ponta da seringa a 10 cm de distância da placa coletora de aço inoxidável.

[0311 ] · Taxa de fluxo de 0,4 ml por hora.

[0312] · Eletrofiação realizada por 5 horas. Tensão aplicada 8 kV.

[0313] · A placa coletora de aço inoxidável contém furos de tal forma que a esteira de PLGA do produzidas por eletrofiação que se forma sobre o “ar” seja de densidade mais baixa comparada com a esteira de PLGA produzido por eletrofiação que se forma no coletor de aço inoxidável. Os presentes inventores descobriram que o PLGA produzido por eletrofiação de baixa densidade era particularmente adequado como um suporte sintético para o cultivo da espessura total da pele.

[0314] Em seguida, as folhas de PLGA eletroespectrais foram utilizadas como suportes para o cultivo de células da pele humana. Usando 20% e 25% de soluções de PLGA resultou em folhas de PLGA produzidos por eletrofiação às quais os fibroblastos não conseguiram migrar, todos permaneceram na superfície (Figuras 2A e 2B). Usando soluções de 35% e 40% resultou em folhas de PLGA eletromagnéticas nas quais os fibroblastos foram capazes de migrar e os queratinócitos permaneceram no topo para formar uma epiderme (Figuras 2C e 2D). A solução a 35% foi escolhida como ótima porque 40% era tecnicamente mais difícil de se trabalhar, já que é extremamente viscosa.

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EXEMPLO 2 - MATRIZ PLGA DE REVESTIMENTO PROTEICO E SEU EFEITO NA ESTRATIFICAÇÃO EPIDÉRMICA [0315] Os queratinócitos cultivados em uma interface ar-líquido ou permeável a gás formam uma epiderme estratificada, que é crucial para a função de barreira da pele humana. Inversamente, os queratinócitos cultivados em PLGA produzido por eletrofiação não revestido em uma interface ar-líquido ou permeável a gás não se estratificam; em vez disso, uma epiderme desorganizada é formada sem estratificação. Ver o PLGA revestido da Figura 3. Um segundo sinal celular é, portanto, necessário em conjunto com a interface ar-líquido ou permeável a gás, a fim de alcançar uma adequada estratificação epidérmica.

[0316] Assim, os presentes inventores testaram uma variedade de diferentes coberturas de proteína no PLGA produzido por eletrofiação - O Colágeno IV (10 pg/cm²), Colágeno I (10 pg/cm²), Laminina (2 pg/cm²), Fibronectina (5 pg/cm²). Todos os revestimentos mostraram resultar em estratificação epidérmica adequada quando as células cresceram em uma interface ar-líquido ou permeável a gás e são todas alternativas viáveis. No entanto, o revestimento de colágeno IV consistentemente produziu a melhor estratificação epidérmica. Ver o PLGA revestido da Figura 3.

EXEMPLO 3 - PLGA MICROPADRONIZADO

PRODUZIDO POR ELETROFIAÇÃO [0317] A Figura 6 mostra uma seção transversal da pele humana normal. A linha tracejada indica a interface entre a camada superior da pele, a epiderme e a camada inferior da pele, a derme. Essa interface não é plana e é caracterizada por um padrão de onda chamado cristas Rete. As cristas Rete são contornos na interface dérmica-epidérmica que fornecem resistência à força de cisalhamento e, potencialmente, um nicho para as células-tronco dos queratinócitos.

[0318] Os presentes inventores determinaram que seria benéfico se o tecido de pele cultivada pudesse replicar estas cristas Rete,

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64/77 uma vez que os enxertos de pele são tipicamente submetidos a numerosas forças de cisalhamento, por exemplo, a partir de um curativo de ferida ou esfregaço de roupa no enxerto de pele.

[0319] Para replicar as cadeias de Rete, os presentes inventores desenvolveram folhas de PLGA produzido por eletrofiação micropadronizado. Ver a Figura 4. A micropadronização do PLGA foi obtida usando uma placa coletora micropadronizada, como uma placa de aço inoxidável.

[0320] Quando as placas micropadronizadas de PLGA foram usadas como matrizes para suportar o cultivo do tecido de pele, elas conseguiram com sucesso que as camadas da epiderme e da derme pudessem replicar a formação das cristas Rete. Ver a Figura 3.

EXEMPLO 4 - MÉTODO PARA O CULTIVO DE PELE DE ESPESSURA TOTAL UTILIZANDO UMA MATRIZ DA PRESENTE DIVULGAÇÃO [0321] O substrato esterilizado (PLGA produzido por eletrofiação ou qualquer outro substituto dérmico compatível com o cultivo de células da pele) está ligado a um arcabouço de aço inoxidável. O substrato é opcionalmente revestido com colágeno IV (colágeno IV Sigma-Aldrich C5533, usado em 10 ug/cm²) durante 2 horas e depois lavadas três vezes com salina tamponada com fosfato (PBS).

[0322] O arcabouço com substrato ligado é colocado em um aparelho de interface permeável a gás (GPI) de modo que o lado revestido com colágeno IV esteja voltado para a abertura.

[0323] 250 ml de meio de Greens (DMEM: Hams F12 (Life Technologies 31765-035) 3:1, FCS a 10%, 10 ng/ml de EGF (Sigma-Aldrich E9644), 0,4 pg/ml de hidrocortisona (Sigma-Aldrich H0396), coleratoxina 0,1 nM (Sigma-Aldrich C8052), adenina 180 (Sigma-Aldrich A2786), 5 ug/ml de insulina (Sigma-Aldrich I9278), 5pg/ml de apotransferrina (Sigma-Aldrich T2036), 2 nM 3,3,5,-tri-idotironina (Sigma-Aldrich T2752), 1x Penicilina/Estreptomicina, 0,625

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65/77 pg/ml de Anfotericina B (Sigma-Aldrich A2942)) são adicionados ao aparelho.

[0324] Os fibroblastos e queratinócitos são separados das placas de cultura e contados. 300.000 e 100.000 queratinócitos de fibroblastos por cm² são adicionados no aparelho de GPI. A tampa é colocada para selar o aparelho GPI. O aparelho é incubado a 37 °C, 5% de CO2 durante 48 horas.

[0325] O aparelho GPI é invertido, garantindo que 0 arcabouço se mova para a extremidade oposta do aparelho e que 0 substrato esteja em contato direto ou próximo à membrana permeável a gás. O aparelho é incubado a 37 °C, 5% de CO2 durante 14 dias.

[0326] O aparelho GPI é aberto, todo 0 líquido é descartado e 0 arcabouço é removido. Um bisturi cortado ao redor das bordas é usado para liberar a pele do arcabouço.

2. RESULTADO

O método produzirá pele com espessura total compreendendo uma derme e epiderme estratificada adequada para enxerto em um paciente.

EXEMPLO 5 - PREPARAÇÃO DE PELE COM ESPESSURA TOTAL UTILIZANDO UM APARELHO E MÉTODO DA PRESENTE DIVULGAÇÃO.

1.MÉTODO [0327] O substrato esterilizado está ligado como descrito para 0 Exemplo 1 ao arcabouço de aço inoxidável. O substrato é opcionalmente revestido com colágeno IV (colágeno IV Sigma-Aldrich C5533, usado em 10 ug/cm²) durante 2 horas e depois lavadas três vezes com salina tamponada com fosfato (PBS).

[0328] O arcabouço com substrato ligado é colocado em um aparelho de interface permeável a gás (GPI) de modo que 0 lado revestido com colágeno IV esteja virado para 0 lado oposto à abertura.

[0329] 250 ml de meio Greens são adicionados como

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66/77 descrito para o Exemplo 4.

[0330] 100.000 fibroblastos por cm² são adicionados no aparelho de GPI. A tampa é colocada no aparelho GPI e selada. O aparelho é incubado a 37 °C, 5% de CO2 durante pelo menos 48 horas.

[0331] O aparelho GPI é invertido, garantindo que 0 arcabouço se mova para a extremidade oposta do aparelho.

[0332] 300.000 queratinócitos por cm² são adicionados no aparelho de GPI através da porta de injeção de tal modo que os queratinócitos se depositem no lado do substrato não semeado. O aparelho é incubado a 37 °C, 5% de CO2 durante 48 horas.

[0333] O aparelho GPI é invertido uma segunda vez, garantindo que 0 arcabouço se mova para a extremidade oposta do aparelho e que 0 substrato esteja em contato direto com a membrana permeável a gás. O aparelho é incubado a 37 °C, 5% de CO2 durante 14 dias.

[0334] O aparelho GPI é aberto, todo 0 líquido é descartado e 0 arcabouço é removido. Um bisturi cortado ao redor das bordas é usado para liberar a pele do arcabouço.

2. RESULTADO [0335] O método produzirá pele com espessura total compreendendo uma derme e epiderme estratificada adequada para enxerto em um paciente.

EXEMPLO 6 - PREPARAÇÃO DE UMA EPIDERME ESTRATIFICADA UTILIZANDO UM APARELHO E MÉTODO DA PRESENTE DIVULGAÇÃO.

1.MÉTODO [0336] O substrato esterilizado está ligado como descrito para 0 Exemplo 4 ao arcabouço de aço inoxidável. O substrato é opcionalmente revestido com colágeno IV (colágeno IV Sigma-Aldrich C5533, usado em 10 ug/cm²) durante 2 horas e depois lavadas três vezes com salina tamponada com fosfato (PBS).

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67/77 [0337] O arcabouço com substrato ligado é colocado em um aparelho de interface permeável a gás (GPI) de modo que o lado revestido com colágeno IV esteja voltado para a abertura.

[0338] 250 ml de meio Greens são adicionados como descrito para o Exemplo 4.

[0339] 300.000 queratinócitos por cm² são adicionados no aparelho de GPI de tal modo que os queratinócitos se depositem no lado do substrato não semeada. A tampa é colocada no aparelho GPI e selada. O aparelho é incubado a 37 °C, 5% de CO2 durante 48 horas.

[0340] O aparelho GPI é invertido, garantindo que 0 arcabouço se mova para a extremidade oposta do aparelho e que 0 substrato esteja em contato com a membrana permeável a gás. O aparelho é incubado a 37 °C, 5% de CO2 durante 14 dias.

[0341] O aparelho GPI é aberto, todo 0 líquido é descartado e 0 arcabouço é removido. Um corte de bisturi ao redor das bordas é usado para liberar a epiderme estratificada do arcabouço.

2. RESULTADO [0342] O método produzirá uma epiderme estratificada adequada para enxertar em um paciente.

EXEMPLO 7 - COMPARAÇÃO DA PELE PREPARADA UTILIZANDO UM MÉTODO DA PRESENTE DIVULGAÇÃO UTILIZANDO UMA INTERFACE PERMEÁVEL A GÁS (GPI) COM PELE PREPARADA UTILIZANDO UM MÉTODO DA TÉCNICA ANTERIOR UTILIZANDO UMA INTERFACE AR-LÍQUIDO (ALI).

1. PREPARAÇÃO DA PELE DE ESPESSURA TOTAL PREPARAÇÃO DE CÉLULAS ADERIDAS

A derme acelular sem epiderme (DED) foi colocada em uma placa de cultura de tecido de poliestireno. Um anel de aço inoxidável com abertura de 10 mm de diâmetro e 10 mm de profundidade foi colocado no DED e preenchido com 0 meio de Green. 300.000 queratinócitos e 100.000

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68/77 fibroblastos foram adicionados ao centro do anel. A mídia foi alterada duas vezes em 24 horas.

PREPARAÇÃO DE PELE DE ESPESSURA TOTAL USANDO UMA INTERFACE AR-LÍQUIDO (ALI) [0343] A pele de espessura total foi preparada utilizando um método da técnica anterior utilizando uma interface ar-líquido como se segue.

[0344] Após 48 horas o anel foi removido do DED e o DED compreendendo fibroblastos e queratinócitos aderidos transferiu-se para um suporte de aço inoxidável em uma placa de cultura de tecidos compreendendo meio Greens. O rack consistia em uma grade de furos, levantada a 7 mm da base da placa de cultura, através da qual o meio pode entrar em contato com o DED. O nível de meio na placa de cultura foi mantido de tal forma que a base do DED, repousando sobre o suporte de metal, estava em contato com o meio, e a superfície superior do DED, sobre a qual os queratinócitos e fibroblastos haviam sido semeados, foi exposta ao ar criando uma interface ar-líquido.

[0345] As células foram cultivadas por 14 dias na interface ar-líquido com mudanças completas de meio a cada dois ou três dias.

PREPARAÇÃO DE PELE DE ESPESSURA TOTAL USANDO UMA INTERFACE PERMEÁVEL A GÁS [0346] A pele de espessura total foi preparada utilizando uma interface permeável a gás (GPI) como se segue.

[0347] Após 48 horas, o anel foi removido do DED e o DED foi transferido para um aparelho que compreende uma membrana permeável a gás. O DED foi colocado no dispositivo de modo que os fibroblastos e queratinócitos aderidos estivessem em contato com a membrana permeável a gás localizada no fundo do aparelho.

[0348] As células foram cultivadas durante 14 dias na interface permeável a gás.

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69/77 [0349] Após 14 dias o tecido foi colhido para análise para avaliar a qualidade da pele formada em contato com uma interface arlíquido ou com uma membrana permeável a gás.

2. COMPARAÇÃO DA ESPESSURA TOTAL DA PELE [0350] A pele produzida usando um GPI foi de uma espessura e aparência semelhante à da pele produzida usando o ALI.

[0351] Amostras de cada pele foram coradas com anticorpos para: citoqueratina 19, um marcador de células-tronco de queratinócitos; citoqueratina 14; um marcador de queratinócito basal; e citoqueratina 10, um marcador de queratinócitos suprabasais; e examinadas por microscopia fluorescente. Seções transversais de cinco pm de cada amostra de pele congelada foram fixadas com acetona e bloqueadas com uma solução de 0,25% de caseína. Os anticorpos primários contra citoqueratina 10, citoqueratina 14 ou citoqueratina 19 em solução salina tamponada com Tris (TBS) contendo 1% de soro fetal bovino (FBS) cobriram as seções da amostra. As amostras foram incubadas durante uma hora à temperatura ambiente. As amostras foram lavadas uma vez com TBS, depois três vezes com agitação durante cinco minutos de cada vez. Os anticorpos secundários específicos para cada anticorpo primário com o conjugado de corante Alexa 488, em TBS com 1% de FBS contendo a mancha nuclear 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI), cobriram as seções da amostra. As amostras foram incubadas durante 30 minutos à temperatura ambiente. As amostras foram lavadas uma vez com TBS, depois duas vezes com agitação durante 15 minutos de cada vez. As amostras foram cobertas com solução de montagem Prolong Gold e uma lamela colocada no topo. Imagens foram obtidas para todas as amostras de DAPI e cada Alexa 488 usando um microscópio de fluorescência.

[0352] A pele cultivada na interface ar-líquido (ALI) e a pele cultivada na interface permeável a gás (GPI) demonstraram a formação de uma epiderme estratificada.

[0353] Muitas camadas de queratinócitos estavam

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70/77 presentes em ambos os tipos de amostras. Mudanças na forma do núcleo dos queratinócitos na epiderme, do arredondamento na região basal, para aplanadas nas regiões superiores, indicaram que uma epiderme estratificada havia se formado na pele cultivada tanto no LPA quanto no GPI.

[0354] Pele cultivada em um ALI ou GPI demonstrou expressão de citoqueratina 10, um marcador suprabasal de queratinócitos, na camada superior da epiderme, indicando que uma camada de estrato córneo tinha sido formada com sucesso, que por sua vez indicou que a diferenciação de queratinócitos e processo de estratificação epidérmica tinha sido completado com sucesso.

[0355] A pele cultivada em um ALI ou GPI mostrou expressão de citoqueratina 14, um marcador basal de queratinócitos, nas camadas de queratinócitos abaixo do estrato córneo, indicando que esses queratinócitos estavam em um estado proliferative, o que é necessário para a formação de uma epiderme estratificada. A pele cultivada em um ALI e GPI continha queratinócitos que se mantiveram positivos para a citoqueratina 19, um marcador de células-tronco de queratinócitos. A presença de células-tronco de queratinócitos indica que todos os tipos de células de queratinócitos necessários para a renovação contínua da epiderme estavam presentes.

[0356] Uma comparação da pele produzida em um ALI com pele cultivada em um GPI indica que o GPI pode resultar em um maior número de células-tronco de queratinócitos presentes na epiderme, produzindo potencialmente uma melhor epiderme estratificada.

[0357] Este exemplo demonstra que o método da invenção proporciona a preparação de pele de espessura total com uma epiderme estratificada e características semelhantes à pele produzida utilizando um método da técnica anterior.

EXEMPLO 8 - PREPARAÇÃO DE TECIDO DE PELE UTILIZANDO UM MODO E APARELHO DA PRESENTE DIVULGAÇÃO [0358] O tecido de pele preparado utilizando (1) um

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71/77 aparelho aqui descrito e (2) um aparelho da técnica anterior, ambos utilizando um GPI, foi comparado com o tecido de pele preparado utilizando (3) um modo do estado da técnica anterior utilizando um ALI.

.MÉTODO [0359] PLGA produzido por eletrofiação foi revestido com uma solução de colágeno IV (10 ug/cm²) durante 2 horas a 37 °C para formar o substrato. O PLGA revestido foi lavado três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) antes da semeadura de fibroblastos e queratinócitos sobre a superfície revestida. Substrato de 100 cm² foi usado para o método (1), 6 cm² para o método (2) e 1 cm² para o método (3).

MÉTODO (1): PREPARAÇÃO DA PELE USANDO UM APARELHO GPI AQUI DESCRITO [0360] Colocou-se PLGA produzido por eletrofiação revestido com colágeno no suporte de um aparelho GPI da invenção de tal modo que o lado revestido estivesse nivelado com a superfície superior do suporte.

[0361 ] O arcabouço foi colocado no fundo do aparelho GPI de tal modo que o lado revestido do PLGA produzido por eletrofiação fosse voltado para cima.

[0362] O aparelho GPI foi preenchido com 300 ml de meio de Green. A composição do meio de Green é descrita no Exemplo 1.

[0363] 13.000.000 queratinócitos e 2.500.000 fibroblastos foram adicionados ao aparelho GPI para que os queratinócitos e fibroblastos pudessem se ligar ao PLGA produzido por eletrofiação revestido.

[0364] A tampa (compreendendo um GPI) foi colocada no aparelho GPI e o aparelho GPI foi selado.

[0365] Após 48 horas, o aparelho GPI foi invertido para mover o arcabouço para a extremidade oposta do aparelho (a tampa). Nesta posição, os fibroblastos e queratinócitos aderidos estavam em contato com o GPI na tampa.

[0366] As células foram cultivadas durante 14 dias e

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72/77 não requereram alterações no meio durante esse período de tempo.

[0367] Após 14 dias, o tecido de pele foi colhido para análise.

MODO (2): PREPARAÇÃO DA PELE UTILIZANDO UM APARELHO GPI DA TÉCNICA ANTERIOR [0368] Um anel de aço inoxidável com uma abertura de 25 mm de diâmetro e 10 mm de profundidade foi fixado em PLGA produzido por eletrofiação revestido dentro de uma placa de cultura de 5 cm de diâmetro e preenchido com meio de Green. 750.000 queratinócitos e 200.000 fibroblastos foram adicionados ao centro do anel. A mídia foi alterada duas vezes em 24 horas.

[0369] Após 48 horas, o anel foi removido do PLGA produzido por eletrofiação revestido e o PLGA produzido por eletrofiação revestido foi transferido da placa de cultura para um aparelho G-Rex10 (Wilson Wolf) com 20 ml de meio de Green, de tal forma que os fibroblastos e queratinócitos aderidos estivessem em contato com o GPI localizado na superfície inferior do G-Rex10.

[0370] As células foram cultivadas durante 14 dias e não requereram alterações no meio durante esse período de tempo.

[0371] Após 14 dias, o tecido de pele foi colhido para análise.

MÉTODO (3): PREPARAÇÃO DA PELE USANDO UM ALI [0372] Um anel de aço inoxidável com abertura de 10 mm de diâmetro e profundidade de 10 mm foi fixado em PLGA produzido por eletrofiação revestido dentro de uma placa de cultura de seis poços e preenchido com meio de Green.

[0373] 130.000 queratinócitos e 34.000 fibroblastos foram adicionados ao centro do anel. A mídia foi alterada duas vezes em 24 horas.

[0374] Após 48 horas, o anel foi removido do PLGA

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73/77 produzido por eletrofiação revestido e o PLGA produzido por eletrofiação revestido compreendendo fibroblastos e queratinócitos aderidos foi transferido para um suporte de aço inoxidável em uma placa de cultura de tecidos compreendendo meio de Green. O rack consistia em uma grade de furos, levantada a 7 mm da base da placa de cultura, através da qual o meio pode entrar em contato com o PLGA produzido por eletrofiação. O nível de meio na placa de cultura foi mantido de tal forma que a base do PLGA produzido por eletrofiação, repousando sobre o suporte de metal, estava em contato com o meio, e a superfície superior do PLGA produzido por eletrofiação, sobre a qual os queratinócitos e fibroblastos haviam sido semeados, foi exposta ao ar criando uma interface ar-líquido.

[0375] As células foram cultivadas por 14 dias na ALI com mudanças completas de meio a cada dois ou três dias.

[0376] Após 14 dias, o tecido de pele foi colhido para análise.

ANÁLISE [0377] Amostras de cada pele foram coradas com anticorpos para pan-citoqueratina, um marcador de todas as células de queratinócitos para avaliar a qualidade da epiderme, e vimentina, um marcador de fibroblastos, para avaliar a qualidade dérmica, e examinados por microscopia de fluorescência.

[0378] Seções transversais de cinco pm de cada amostra de pele congelada foram fixadas com acetona e bloqueadas com uma solução de 0,25% de caseína. Anticorpos primários contra pan-citoqueratina, ou vimentina em solução salina tamponada com Tris (TBS) contendo 1% de soro bovino fetal (FBS), cobriram as seções da amostra. As amostras foram incubadas durante uma hora à temperatura ambiente. As amostras foram lavadas uma vez com TBS, depois três vezes com agitação durante cinco minutos de cada vez. Os anticorpos secundários específicos para cada anticorpo primário com o conjugado de corante Alexa 488, em TBS com 1% de FBS

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74/77 contendo a mancha nuclear 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI), cobriram as seções da amostra. As amostras foram incubadas durante 30 minutos à temperatura ambiente. As amostras foram lavadas uma vez com TBS, depois duas vezes com agitação durante 15 minutos de cada vez. As amostras foram cobertas com solução de montagem Prolong Gold e uma lamela colocada no topo. Imagens foram obtidas para todas as amostras de DAPI e cada Alexa 488 usando um microscópio de fluorescência.

2. RESULTADO [0379] Todos dentre os métodos (1), (2) e (3) produziram pele de espessura total compreendendo uma camada dérmica com uma epiderme estratificada no topo da camada dérmica. A camada dérmica foi a camada inferior da pele produzida, como evidenciado pela coloração positiva para o marcador de fibroblasto Vimentina. A camada dérmica era uma única célula espessa para o tecido de pele produzida pelos três métodos.

[0380] Uma camada epidérmica estratificada se formou acima da camada dérmica do tecido de pele produzido pelos três métodos. A epiderme compreendia muitas camadas de queratinócitos, como evidenciado pela coloração positiva para o marcador de queratinócitos pancitoqueratina. A estratificação da epiderme foi observada na coloração com pancitoqueratina de amostras de pele da estratificação da citoqueratina. Queratinócitos na camada basal foram arredondados, tornando-se achatados nas camadas intervenientes até que um estrato córneo forme a camada superior.

[0381] A estratificação da epiderme também foi demonstrada pela morfologia dos núcleos de células de queratinócitos, mostrados pela coloração com DAPI, nas camadas da epiderme. Nas camadas basais da epiderme, os núcleos das células dos queratinócitos eram arredondados, indicando queratinócitos basais saudáveis capazes de proliferação. Subindo pelas camadas epidérmicas, os núcleos de células de queratinócitos se achatam, indicando que passaram pelo processo de diferenciação necessário para alcançar a estratificação. Na camada superior,

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75/77 onde as células de queratinócitos completaram o seu processo de diferenciação, os núcleos das células eram muito finos ou tinham desaparecido completamente, produzindo uma camada de estrato córneo consistindo em células de queratinócitos mortos.

EXEMPLO 9 ANÁLISE DE POROMETRIA [0382] A análise porométrica completa foi realizada por Porômetro (Bélgica), os resultados são mostrados na tabela abaixo. O fluido usado foi o Galpore 16. A tensão do fluido foi de 16 din/cm. Ângulo do fluido 0. O método de Primeiro Ponto de Bolha foi o primeiro fluxo. A pressão do ponto de bolha, em MPa (bar), foi 8,5 (0,08503) e 2 (0,02002). O fluxo do ponto de bolha em l/min foi 0,04977 e 0,004977. A pressão média do poro do fluxo, em MPa (bar), foi de 14,19 (0,1419) e 11,57 (0,1157). A pressão de menores poros, em MPa (bar), 21,81 (0,2181) e 19,62 (0,1962). A área da amostra foi de 298,6 mm². Gás era ar. A temperatura foi de 23 °C. O fator de forma foi 1. Pressão inicial, 0 Mpa (bar). Pressão final, 50 MPa (0,5 bar). Medições molhadas 100. Medições a seco 25%. Inclinação de pressão 360 s/bar.

Arcabouço	Espessura (um)	Diâmetro Médio da Fibra (nm)	Tamanho do poro do ponto de bolha (um) (maior poro)	Tamanho de Poro Médio de Fluxo (MFP) (um)	Tamanho de menor poro (um)
UoA 75:25 PLGA			7,53	4,51	2,94
UoA 75:25 PLGA			31,96	5,53	3,26
UoA 75:25 média do PLGA	10	465	19,74	5,02	3,10

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Fibras de Revolução 75:25 PLGA - área grossa			5,56	2,38	1,82
Fibras de Revolução 75:25 PLGA - área grossa			8,53	2,29	1,75
Fibras de Revolução 75:25 PLGA - área grossa			5,12	2,19	1,79
Fibras de Revolução 75:25 PLGA - média de área grossa	10 a 22	605	6,40	2,29	1,79
Fibras de Revolução 75:25 PLGA - área fina			7,11	2,13	1,73
Fibras de Revolução75 :25 PLGA área fina			11,85	2,15	1,70
Fibras de Revolução75 :25 PLGA área fina			6,67	2,15	1,78
Fibras de Revolução 75:25 PLGA - média de área fina	10 a 22	605	8,54	2,14	1,73
SNC 75:25 PLGA 1			17,05	6,65	3,76

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SNC 75:25 PLGA 1			15,99	6,74	3,74
SNC 75:25 média de PLGA1	23	1.141	16,52	6,69	3,75
SNC 75:25 PLGA 2			9,69	4,00	2,64
SNC 75:25 PLGA 2			9,69	4,25	2,69
SNC 75:25 PLGA 2			10,66	4,14	2,73
SNC 75:25 média de PLGA 2	21	618	10,02	4,13	2,69
SNC 75:25 PLGA 3			18,83	5,969	3,142
SNC 75:25 PLGA 3			11,85	6,081	3,19
SNC 75:25 PLGA 3			12,54	6,103	3,316
SNC 75:25 média de PLGA 3	56	1.453	14,41	6,05	3,22

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Claims (8)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Matriz de fibras produzidas por eletrofiação para cultivar tecido de pele diferenciado preparado por solução de eletrofiação de um polímero biocompatível biodegradável caracterizada pelo fato de que as fibras produzidas por eletrofiação têm de cerca de 0,3 pm a cerca de 5 pm de diâmetro, por exemplo, 1 a 5 pm, como 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4 ou 4,5 pm.
2. 2. Matriz, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polímero biodegradável biocompatível é selecionado do grupo PLGA, PLA, PCL, PHBV, PDO, PGA, PLCL, PLLA-DLA, PEUU, celuloseacetato, PEG-b-PLA, EVOH, PVA, PEG, PVP, PLA/PCL misturado, gelatinaPVA, PCT/colágeno, aliginato de sódio/PEO, quitosana/PEO, quitosana/PVA, gelatina/elastina/PLGA, seda/PEO, fibroína/quitosana, PDO/elastina, PHBV/colágeno, ácido hialurônico/gelatina, colágeno/sulfato de condroitina, colágeno/quitosana, PDLA/HA, PLLA/HA, gelatina/HA, gelatina/siloxano, PLLA/MWNTs/HA, PLGA/HA, homopolímero linear de dioxanona 100 e combinações de dois ou mais dos mesmos.
3. 3. Matriz, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o polímero é o poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA).
4. 4. Matriz, de acordo com qualquer uma das reivindicações

   1 a 3, caracterizada pelo fato de que a concentração de polímero biodegradável biocompatível é de 26% a 40% p/v, por exemplo, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 ou 39% p/v.
5. 5. Matriz, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a concentração de polímero biodegradável biocompatível é de 35% p/v.
6. 6. Matriz, de acordo com qualquer uma das reivindicações

   2 a 5, caracterizada pelo fato de que a proporção de ácido poliláctico para ácido poliglicólico no PLGA está na faixa de 90:10 a 50:50 respectivamente, como 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35 ou 60:40.

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   2/4
7. 7. Matriz, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a proporção de ácido poliláctico para ácido poliglicólico é de 75:25 a 65:35, respectivamente, tal como 65:35.
8. 8. Matriz, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que um solvente que compreende um ou mais independentemente selecionados a partir de clorofórmio, etanol, ácido acético HFIP, propan-2-ol, ácido acético, DMSO, DMF, acetato de etila, 1,4-dioxano, ácido fórmico e água, é empregado com o polímero biodegradável biocompatível.

   15. Matriz, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de que se utilizou uma placa texturizada, por exemplo, micropadronizada, tal como ondulada ou crimpada, para recolher as fibras produzidas por eletrofiação.

   16. Matriz, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que a eletrofiação foi realizada à vazão de 0,4 ml por hora, por exemplo, -,1 a 0,4 ml por hora, como 0,3 ml por hora.

   17. Matriz, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizada pelo fato de que a matriz tem uma espessura de 100 pm ou menos, por exemplo, 10 a 100 pm, tal como 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 ou 100 pm.

   18. Matriz, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo fato de que a matriz é revestida com uma proteína de matriz extracelular ou um seu peptideo, por exemplo, um peptideo sintético (por exemplo, para promover a adesão e/ou diferenciação celular).

   19. Matriz, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a proteína da matriz extracelular é selecionada do grupo que consiste em: colágeno IV, colágeno I, laminina e fibronectina e combinação de dois ou mais destes, em particular colágeno IV.

   20. Matriz, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizada pelo fato de que poros adequados para permitir a migração

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   3/4 de fibroblastos, por exemplo, os poros estão na faixa de 2 a 30 microns, tal como 15 a 25 microns, em particular 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 microns.

   21. Seção de tecido de pele caracterizada pelo fato de que compreende uma matriz, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

   20, em que células capazes de se diferenciar em uma derme migraram para a matriz.

   22. Seção de tecido de pele, de acordo com a reivindicação

   21, caracterizada pelo fato de que as células são fibroblastos.

   23. Seção de tecido de pele, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizada pelo fato de que células epidérmicas, capazes de se diferenciar em uma epiderme, são acumuladas em uma face externa da matriz.

   24. Seção de pele, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que a dita superfície externa da matriz foi pré-revestida com colágeno, tal como o colágeno IV, antes da adição das células epidérmicas, tais como queratinócitos e fibroblastos, à cultura.

   25. Seção de tecido de pele, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que as células epidérmicas capazes de se diferenciar em epiderme são os queratinócitos.

   26. Seção de tecido de pele, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 25, caracterizada pelo fato de que existe uma camada epidérmica diferenciada.

   27. Seção de tecido de pele, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 26, caracterizada pelo fato de que existe uma camada de derme.

   28. Seção de tecido de pele, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que a matriz está contida na camada da derme.

   29. Seção de tecido, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 28, caracterizada pelo fato de que o polímero biodegradável biocompatível que compõe a matriz começou a se degradar.

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   4/4

   30. Seção de tecido de pele, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 29, caracterizada pelo fato de que o tecido de pele compreende cristas Rete sintéticas.

   31. Seção de pele, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 30, caracterizada pelo fato de que está contida em um dispositivo para a cultura e/ou transporte, por exemplo, compreendendo:

   um recipiente compreendendo uma primeira parede de extremidade (inferior) e pelo menos uma parede lateral, uma segunda parede de extremidade removível (superior) adaptada para engatar com o recipiente para definir uma câmara, e um arcabouço adaptado para receber uma matriz para as células residirem, em que pelo menos uma parte de pelo menos uma primeira parede de extremidade (inferior), a pelo menos uma parede lateral ou a segunda parede de extremidade (superior) compreende um material permeável a gás ou está adaptada para engatar com um material permeável a gás e é perfurada para permitir troca gasosa; e em que o aparelho é configurável entre (a) um primeiro modo em que o substrato não está disposto em comunicação gasosa com um material permeável a gás, e (b) um segundo modo no qual a matriz é disposta em comunicação gasosa com um material permeável a gás.

   31. Seção de pele, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 32, caracterizada pelo fato de que a pele é autóloga a um paciente.