KR20090008208A - Ｐｌｇａ/하이드록시아파타이트 복합재 생체 적응 재료 및 그의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

조직 공학은 체내에 이식하기 위해 새로운 재료를 개발하는 생장하는 분야이다. 중요한 영역 중 한 가지로서, 외상이나 질병으로 손실된 골 부위를 대체하기 위한 골이식편 재료를 포함한다. 전통적으로, 이식편 재료는 이 이식편 재료를 이식받는 개체의 뼈로부터 얻을 수 있다. 그러나, 이를 위해서는 추가의 시술과 추가의 회복이 요구된다. 뼈는 타인이나 사체로부터도 역시 유래할 수 있지만, 이에 의하면 생적합성 문제점이나 질병이 전염될 위험이 존재한다. 이상적으로는, 적당한 기계적 강도를 갖춘 충전재로서 작용하고, 뼈의 회복을 촉진하며 질병의 전염 위험성이 없이 분해되어서 새로운 뼈가 생장되도록 하는 생적합성 재료가 추구된다. 본 발명은 가스 발포 입자 침출 (GF/PL)법을 사용하여, 생적합성 폴리(D,L-락틱-코-글리콜산) (PLGA) 및 그의 표면의 나노 크기의 하이드록시아파타이트 입자로 생성시킨, 신규의 복합재 골이식편 재료에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 실시 상태는, 상기 PLGA/하이드록시아파타이트 생체 적용 재료에 접착성의 신속하고 균질한 아파타이트 등의 무기질로 된 피막을 피복하는 것을 더 포함한다. 복합재의 PLGA 폴리머 부분은 뼈를 대체할 충분한 기계적 강도를 제공하고, 시간이 흐름에 따라 분해되어 새로운 골 조직 생장을 가능하게 한다. 배합된 하이드록시아파타이트 입자는 조직 접착 및 증식을 위한 부위를 제공함으로써 복합재 재료의 조골성을 향상시켜 준다. 즉, 신규의 생체 적응 재료 표면의 무기질 아파타이트로 된 균질한 피막으로 인해 그의 조골성을 더 향상시킨다.
골이식편, 가스 발포 입자 침출법, 하이드록시아파타이트, 폴리(D,L-락틱-코-글리콜산)

Description

ＰＬＧＡ/하이드록시아파타이트 복합재 생체 적응 재료 및 그의 제조 방법{PLGA/HYDROXYAPATITE COMPOSITE BIOMATERIAL AND METHOD OF MAKING THE SAME}
본 발명은 뼈를 포함한 조직 공학용 용도에 특히 유용한 신규의 생체 적응 재료에 관한 것이다. 즉, 이 재료는 폴리(D,L-락틱-코-글리콜산) (PLGA)과 생체 적용 재료 표면에 다량 노출되는 나노 크기의 하이드록시아파타이트 (hydroxyapatite)로 된 복합재이다. 본 발명의 또 다른 실시 상태는 생체 적응 재료 표면에 신속하고 다량으로 균질하게 피복되는 아파타이트 (apatite) 등의 세라믹을 포함한다. 이러한 신규의 생체 적응 재료는 기존의 재료보다 더 골세포 증식 및 생장을 촉진하기 때문에 유리하다.
이상적인 골이식편 (骨移植片)은 골의 결손부, 예컨대 질병이나 외상으로부터의 결손부를, 상처받은 부위에서 골 세포가 생장되도록 하는 재료로 대체하여, 원래 상태로 뼈를 회복되게 해 준다. 현재 자가 이식편이 골회복에 있어 최상의 재료인데, 왜냐하면 이들은 생적합성이고 질병 전염의 위험이 적기 때문이다. 그러나, 자가 이식편의 단점은 환자 자신의 뼈를 제거하기 위하여 별도로 수술을 해야만 한다는 점이다. 타인/사체로부터의 뼈로 이루어진 타가 이식편도 역시 사용 가능하지만, 면역 반응 및 질병 전염의 위험을 보유하고 있고, 이 때문에 궁극적으로 골이식이 실패로 끝날 수 있다.
골이식편과 관련된 문제점을 해결하기 위하여, 다수의 연구자들은 골이식편에 대한 인공 물질을 개발하고자 노력하여 왔다. 이들 인공적인 생체 적응 재료가 성공을 거두기 위해서는 몇 가지 품질을 보유할 필요가 있다. 첫째, 그 재료는 이식 부위에서 새로운 뼈가 생장할 공간을 허용하도록 분해될 수 있어야 한다. 둘째, 원래의 뼈와 유사한 기계적 강도를 보유하여야 한다. 마지막으로, 인공적인 생체 적응 재료는 골전도성일 필요가 있다. 다시 말해, 골세포가 이것의 표면에 붙어서 증식할 수 있어야 한다.
골이식편으로서의 가능성을 보여준 일부 재료에는 하이드록시아파타이트 및 인산삼칼슘 등의 인산칼슘 세라믹이 있다. 이들 특정의 세라믹은 원래의 골무기질과 유사한 특징이 있기 때문에 비교적 생적합성이다. 그러나, 이들은 성형이 어렵고 뼈와 동일한 기계적 특성을 보유하지 못한다. 하이드록시아파타이트는 특히 신속하게 분해되지도 못하므로, 새로운 뼈가 형성되는 것이 억제된다.
주목받는 다른 유형의 재료로는 분해성 폴리머가 있다. 이는 성형하기가 쉽고 예측 가능한 속도로 분해되어, 새로운 뼈가 생장하여 이를 대체할 수 있도록 해 준다. 일부의 분해성 폴리머의 예로서는, 폴리(글리콜산), 폴리(L-락트산) 및 폴리(D,L-락틱-코-글리콜산)이 있다. 이들은 용이하게 성형될 수 있고 우수한 기계적 강도를 보유함에도 불구하고, 분해성 폴리머 단독으로는 골이식편으로 이상적이지 못한데, 그 이유는 이들의 골전도성이 매우 낮기 때문이다. 새로운 뼈는 이들 재료에 잘 붙지 못하거나, 또는 새로운 뼈가 이 재료 내로 생장하지 못하게 되게 된다.
분해성 폴리머와 함께 인산염 세라믹을 사용하여 복합재를 만드는 것도 가능하다. 입자가 작은 세라믹은 폴리머 스캐폴드 (scaffold) 재료 내에 포함될 수 있다. 이들 입자는 부분적으로 생체 적응 재료 표면에 노출되게 되며, 이에 따라 재료를 더욱 골전도성으로 만들어 주게 된다.
대부분의 폴리머/세라믹 스캐폴드 생체 적응 재료의 제조 방법은 유기 용매를 사용한다. 이는 매우 불리할 수가 있는데, 그 이유는 잔여 용매가 재료 내에 잔류할 수 있기 때문이다. 거의 대부분의 유기 용매는 세포에 해롭고, 조직 생장에 유해하다. 또한, 이러한 과정은 표면에 노출될 것으로 기대되는 세라믹 입자를 피복해 버리는 폴리머막을 실질적으로 남길 수 있다는 점에도 주의하여야 한다. 이러한 의도하지 않은 폴리머막은 이들 생체 적응 재료 중의 세라믹 부분의 골전도성을 훼손시킨다.
본 발명에 기재된 발명은 생분해성 폴리머 및 생체 적응 재료 표면에 다량 노출되는 세라믹으로 이루어지며, 유기 용매를 사용하지 않고 제조되는 폴리머/세라믹 생체 적응 재료를 제시함으로써 이러한 문제점을 다루고 있다. 또한, 아파타이트 등의 추가의 무기질층이 접착력에 의하여 신속하고 균질한 방식으로 생체 적응 재료 표면에 피복될 수 있다. 결국, 세라믹 피막이 추가되어 있는 폴리머/세라믹 생체 적응 재료의 과립이 제조될 수 있는 것이다.
본 출원에 인용된 모든 참고 문헌은 그 전체가 본 명세서에 참고로서 포함되어 있다.
발명의 개요
본 발명의 양호한 실시 상태는 폴리(D,L-락틱-코-글리콜산) (PLGA), 하이드록시아파타이트 및 가능한 아파타이트 피막으로 이루어지는 생체 적응 재료에 관한 것이다. 이는 인공 골이식편 재료로서 적합하다. 상기 생체 적응 재료는 가스 발포 및 입자 침출 (GF/PL)법을 사용하여 형성된다. GF/PL법에서는 고압에서 폴리머를 가스로 포화시킨 후, 압력을 주변 조건으로 감소시킴으로써 폴리머 기질 내에 가스 기포가 도입된다. 이 경우, CO2 가스가 사용된다. 이어서, 상기 기질로부터 증류수를 사용하여 염 입자를 침출시킨다. 가스 발포와 입자 침출에 의하여 공극이 남게 되는데, 이로 인해 생체 적응 재료 기질 중에 세공이 형성되게 된다.
양호한 실시 상태는 PLGA, 하이드록시아파타이트 및 염화나트륨을 일정 비율로 혼합한 다음에 GF/PL법을 사용함으로써 수행된다. 각 입자의 입도와 양은 최종 생체 적응 재료의 상호 연결된 전면 (全面) 다공도를 결정하게 될 것이다. 먼저, PLGA, 하이드록시아파타이트 및 염화나트륨 입자를 체질하여 특정 입도의 입자를 얻는다. 그 다음에, 이들 입자를 일정한 비율로 혼합하고 디스크 몰드에 투입한다. 그 혼합물을 고압 (약 2000 psi)에서 약 1분간 압축한다. 최저 1000 psi 및 최고 4000 psi의 압력이 사용 가능하다고 생각된다. 이어서, 생성된 디스크를 고압의 CO2 가스 (약 800 psi)에 48 시간 노출시킨다. 최저 400 psi 및 최고 1600 psi의 압력이 사용 가능하다고 생각된다. 이 기간 중에, CO2가 디스크를 포화시킨다. 48 시간 후, CO2 가스 압력을 주변 압력까지 감소시킨다. 이 과정은 핵형성 (核形成)과, 생 체 적응 재료 디스크의 폴리머 스캐폴드 부분 내에 CO2 세공의 생장을 유도한다. 이어서, 증류수 중에 디스크를 장기간 침지 (浸漬)시키면, 염화나트륨 입자가 이미 차지하였던 공극을 남기면서 염화나트륨 입자가 재료로부터 침출되어 나온다. 최종 재료는 하이드록시아파타이트 입자가 폴리머 망상 구조의 표면에 노출되어 있는 고다공성으로 된다.
또한, 생체 모방법 (biomimetic process)을 사용하여 골유사성 (骨類似性) 아파타이트에 의하여 PLGA/하이드록시아파타이트 스캐폴드의 표면을 피복하면, 골생성 잠재성이 증가될 수 있다. 이러한 생체 모방법은, 용액 중에 용해된 적당한 농도의 이온을 함유한 인공 생체액 (SBF) 중에 생체 적응 재료를 침지시키는 것을 포함한다. 특정의 이온이 생체 적응 재료의 표면에 침전되어 아파타이트 무기질 피막을 형성하게 된다.
다른 실시 상태에 있어서, PLGA/하이드록시아파타이트 생체 적응 재료는 분쇄 후 체질에 의하여 특정한 입도의 과립으로 수집될 수 있다. 이어서, 이들 과립을 SBF 중에 침지시키고, 골생성 특성을 향상시키는 아파타이트로 피복한다.
본 발명의 교시에 따른 골이식편 재료는 골 페이스트, 성형 고체, 또는 그러한 페이스트 또는 고체를 성형하기에 유용한 건식 프리믹스 형태로 마련될 수 있다. 상기 "골 페이스트"라는 용어는 고화 (固化)하여 고체 구조를 형성하는 점도의 슬러리 또는 반고체 조성물을 말하며, 예를 들자면 골 플라스터, 퍼티, 접착제, 시멘트, 골공극 충전재 및 대용골 (代用骨)이 있다. 결국, 골 페이스트는 주사, 성 형, 채색 및 충전되거나 또는 생체내에서 골표면과 접촉하도록 배치시킬 수 있는 조성물일 수 있다. 상기 "성형 고체"는 생체내에서 골공극 또는 골표면과 접촉하도록 배치시킬 수 있는 펠릿 (pellet)을 비롯한 임의의 형태일 수 있다. 건식 프리믹스는 분말 및/또는 과립 형태로 제공될 수 있다.
도 1은 1x 및 5x SBF에서 5일간 인큐베이트한 아파타이트로 피복시킨 (A) PLGA 및 (B) PLGA/HA 스캐폴드의 XRD 패턴을 도시한 것이다.
도 2는 1x 및 5x SBF에서 5일간 인큐베이트한 아파타이트로 피복시킨 (A) PLGA 및 (B) PLGA/HA 스캐폴드의 FT-IR 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 3은 1x (흑색) 및 5x SBF (백색)에서 다양한 기간 동안 인큐베이트한 아파타이트로 피복시킨 PLGA (역삼각형) 및 PLGA/HA (원형) 스캐폴드의 질량 변화를 도시한 것이다. 질량 변화는 동일한 시간 동안에 트리스 완충액 중에서 인큐베이트한 스캐폴드의 질량에 비한 증가율 (%)로서 나타내었다. 초기 질량은 다른 군과 비교하여, *P<0.05로 두 가지 형식의 스캐폴드에 대해서 동일하였다.
도 4(A)~(C)는 (A,B) SC/PL법 및 (C,D) GF/PL법에 의하여 제조된 PLGA/HA 복합재 스캐폴드의 (A,C) 표면 및 (B,D) 횡단면의 주사 전자 현미경 사진도이다.
도 5(A)~(B)는 (A) SC/PL 및 (B) GF/PL 스캐폴드의 세공 크기 분포를 도시한 것이다.
도 6(A)는 세 가지 형식의 스캐폴드의 현미경 사진도이다.
도 6(B)는 염색된 GF/PL-무(無)HA 스캐폴드의 현미경 사진도이다.
도 6(C)는 염색된 SC/PL 스캐폴드의 현미경 사진도이다.
도 6(D)는 염색된 GF/PL 스캐폴드의 현미경 사진도이다.
도 6(E)는 SC/PL 스캐폴드의 XPS 분석을 도시한 것이다.
도 6(F)는 GF/PL 스캐폴드의 XPS 분석을 도시한 것이다.
도 6(G)는 GF/PL 및 SC/PL 스캐폴드에서 스캐폴드 표면에 노출된 칼슘의 원자 백분율을 도시한 것이다.
도 7(A)~(C)는 8주간 시험관내에서 GF/PL (사선 막대), SC/PL (백색 막대) 및 GF/PL-무HA (흑색 막대)에서 배양시킨 골모 세포의 (A) 생장 속도, (B) 알칼리성 포스파타아제 (ALP) 활성 및 (C) 칼슘 침착량을 도시한 것이다.
도 8(A)~(B)는 (A) 이식 전에 세포가 접종된 GF/PL 스캐폴드를 도시한 것이다. 단위는 센티미터이다. (B) 무흉선 (無胸腺)의 피하 공간에 이식 후 8주째에 회수된 세포/스캐폴드 구성체의 전체 사진도이다.
도 9(A)~(D)는 무흉선 마우스의 피하 공간에 이식 후 8주째에 회수된 세포/폴리머 구성체의 조직학적 평가를 도시한 것이다. (A,C)는 H&E 염색을, (B,D)는 매슨 트리크롬 (Masson's trichrome) 염색을 나타내고 있다.
도 10(A)~(F)는 무흉선 마우스의 피하 공간에 이식 후 8주째에 회수된 세포/폴리머 구성체의 조직학적 평가를 도시한 것이다. (A,C,E)는 H&E 염색을, (B,D,F)는 매슨 트리크롬 염색을 나타내고 있다.
도 11(A)~(B)는 이식 후 8주째에 F/PL (사선 막대), SC/PL (백색 막대) 및 GF/PL-무HA (흑색 막대) 스캐폴드에서 (A) 골형성 면적 및 (B) 칼슘 침착량을 나타 내고 있다.
도 12(A)는 GF/PL법 및 SC/PL법에 의하여 제조된 스캐폴드의 표면에 대한 HA 나노 입자의 노출을 개략적으로 도시한 것이다.
도 12(B)는 GF/PL법으로 PLGA/HA 복합재 스캐폴드를 제조하는 것을 개략적으로 도시한 것이다.
도 13(A)~(B)는 (A) SC/PL법 및 (B) GF/PL법으로 제조된 PLGA/HA 복합재 스캐폴드의 주사 전자 현미경 사진도이다.
도 14(A)~(C)는 SC/PL 및 GF/PL 스캐폴드의 압축 탄성률 (A) 및 인장 탄성률 (C)을 도시하고 있다. (B)는 SC/PL 및 GF/PL 스캐폴드의 전형적인 인장 응력 변형률 곡선을 나타내고 있다.
도 15(A)~(E)는 세 가지 형식의 스캐폴드의 확대 사진도이다.
도 16(A)~(C)는 세 가지 형식의 스캐폴드의 습윤성을 나타내는 사진도이다.
도 17(A)는 래트 두개골에 발생시킨 결손부를 나타내는 사진도이다.
도 17(B)는 이식된 스캐폴드를 나타내는 사진도이다.
도 17(C)는 GF/PL HA 스캐폴드를 함유하는 두개골의 전체 사진도이다.
도 17(D)는 GF/PL-무HA 스캐폴드를 함유하는 두개골의 전체 사진도이다.
도 18(A)~(F)는 이식 후 8주째에 회수된 검체의 조직학적 평가를 도시한 도면으로서, 헤마톡실린 에오신 (H&E) 염색된 것으로, (A,D) GF/PL-무HA 스캐폴드, (B,E) SC/PL 스캐폴드 및 (C,F) GF/PL 스캐폴드를 나타내고 있다. (A, B, C)는 결손부 연부를 나타내고 (D, E, F)는 스캐폴드의 중간 절편을 나타내고 있다.
도 19(A)~(F)는 이식 후 8주째에 회수된 검체의 조직학적 평가를 도시한 도면이다. 매슨 트리크롬 염색. 8주째의 (A,D) GF/PL-무HA 스캐폴드, (B,E) SC/PL 스캐폴드 및 (C,F) GF/PL 스캐폴드를 나타내고 있다. (A, B, C)는 결손부 연부를 나타내고, (D, E, F)는 스캐폴드의 중간 절편을 나타내고 있다 (백색 화살표는 원래의 뼈를, 흑색 화살표는 새로운 뼈를 나타낸다).
도 20은 SC/PL 및 GF/PL-무HA 스캐폴드에 비하여, GF/PL 스캐폴드에서 더 높은 골형성률을 나타내는 그래프도이다.
도 21(A)~(C)는 이식 후 8주째에 회수된 검체의 마이크로 CT 분석 영상도이다. A-GF/PL-무HA; B-SC/PL 및 C-GF/PL 스캐폴드.
본 발명은 골이식편 재료로서 양호하게 수행할 수 있도록 해 주는 특유의 특징이 있는 신규의 생체 적응 재료에 관한 것이다. 상기 재료는 가스 발포 및 입자 침출 (GF/PL)법에 의하여 형성된 나노 크기의 하이드록시아파타이트 배합 입자와 스캐폴드를 이루는 분해성 폴리(D,L락틱-코-글리콜산) 폴리머로 구성된다. 본 발명의 또 다른 실시 상태는 동일한 생체 적응 재료에 접착성의 매우 균질한 아파타이트 피막이 추가된 생체 적응 재료에 대하여 설명하고 있다.
GF/PL을 사용하여 PLGA 폴리머 스캐폴드를 작제하는 방법은 문헌에 게재된 "Open pore biodegradable matrices formed with gas foaming" (Harris LD, Kim BS, and Mooney DJ; J Biomed Mater Res, 42, 396-402, 1998)라는 명칭의 논문에 상세히 기재되어 있다. 이 논문 전체는 본 명세서에 참고로 포함시킨다. 이 논문에 보고된 연구는 PLGA 스캐폴드의 다공성 및 세공 크기는 염/PLGA 비율 및 각각의 입도에 의하여 제어될 수 있다는 것을 발견하였다. 또한, 기질 세공은 상호 연결되어 있고 매우 균질하다. 이러한 방식으로, 유기 용매 또는 고온을 사용하는 일이 없이 유용한 스캐폴드를 생성시킬 수 있는 것이다.
GF/PL을 사용하여 폴리머 스캐폴드를 작제하는 방법은 이미 알려져 있으나, 이 특정한 폴리머 스캐폴드에 나노 크기의 하이드록시아파타이트 입자를 첨가하는 것은 선행 기술에서 교시된 바가 없다. 최근에 본 출원의 발명자에 의한 논문이 발표된 바 있다. 이 논문은 PLGA 스캐폴드에 하이드록시아파타이트 입자를 첨가하는 것에 대하여 기재하고 있다. 이는 골조직 공학용 폴리(락타이드-코-글리코라이드)/하이드록시아파타이트 복합재 스캐폴드라고 부른다 (Kim SS, Park MS, Jeon O, Choi CY, and Kim BS; Biomaterial, 27, 1399-1409, available online Oct. 5, 2005). 이 논문도 역시 본 명세서에 참고로 포함시킨다. 이 논문은 본 발명의 단독 발명자인 김병수 박사의 제자가 그 논문 연구를 행하였으나, 본 발명의 아이디어는 김병수 박사의 독특한 아이디어였다는 사실에 유의하여야 하는 것이 중요하다.
상기 연구는 다공성 PLGA/HA 복합재 스캐폴드가 전술한 GF/PL법을 변형시킴으로써 제조될 수 있는 방법을 기재하고 있다 (Harris LD, Kim BS, and Mooney DJ; J Biomed Mater Res, 42, 396-402, 1998). 기존의 방법의 가장 중요한 변형은 나노 크기의 하이드록시아파타이트 입자를 첨가하는 것인데, 이는 결국에 폴리머 표면 에 상기 입자가 다량 노출되는 것을 유도하는 것으로서 자명한 것이 아니다. 나노 크기의 하이드록시아파타이트 입자를 폴리머 기질에 첨가하는 것과, 폴리머 표면 에 하이드록시아파타이트 입자를 노출시키는 것은 이 기술 분야의 숙련자들에게 자명한 것이 아니다.
PLGA/HA 복합재를 75:25 PLGA 입자 (직경=100 내지 200 Pm, 분자량=100,000 Da, Birmingham Polymers, Birmingham, AL), HA 나노 입자 (직경=약 100 nm, Berkeley Advanced Biomaterials Inc., Berkeley, CA) 및 염화나트륨 입자 (직경=100 내지 200 Pm, Sigma, St. Louis, MO)로 제조하였다. PLGA 펠릿을 테크마르 (Tekmar) 분쇄기 (Bel-Art Products, Pequannock, NJ)를 사용하여 분쇄하고, 체질하여 100 내지 200 Pm 범위의 입자를 얻었다. 상기 염 입자를 체질하여 100 내지 200 Pm 범위의 입도를 생성시켰다. 상기 폴리머 입자를 HA 및 NaCl 입자와 혼합하였다. PLGA/HA/NaCl 질량비는 1:1:9이었다. 상기 혼합물을 디스크 몰드 (직경=1.35 cm; Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI)에 투입하고, 프레스 (Carver Laboratory Press (Fred S. Carver, Inc., Menominee Falls, WI))를 사용하여 1분간 2000 psi에서 압축하여, 두께가 약 1.7 mm인 고체 디스크를 생성시켰다. 그 다음, 시료를 고압 CO2 가스 (800 psi)에 48 시간 노출시켜서 폴리머를 그 가스로 포화시켰다. 이어서, 가스 압력을 주변 압력까지 낮추어서 열역학적 불안정성을 형성시켰다. 이와 같이 하여 핵형성과, 폴리머 스캐폴드 내의 CO2 세공의 생장을 유도하였다. 이어서, 상기 스캐폴드를 증류수 중에서 48 시간 침출시킴으로써 그 스캐폴드로부터 염화나트륨 입자를 제거하였다.
상기 재료가 양호하기는 하지만, 본 발명은 입경 50 내지 400 Pm의 폴리머와 입경 50 내지 200 Pm의 HA 입자, 그리고 입경 50 내지 300 Pm의 염 입자로 이루어질 것으로 생각된다. 본 발명의 정신을 벗어나는 일이 없이 폴리머 대 하이드록시 아파타이트 대 NaCl의 비율은 최대한 50%까지 변경이 가능하다.
이들 PLGA/HA 복합재 생체 적응 재료를 생성시키는 방법은 다음의 단계들, 즉 (1) PLGA를 분쇄하여 작은 입자를 얻는 단계, (2) PLGA 및 염화나트륨 입자를 체질하여 입경이 100 내지 200 Pm 범위인 입자를 생성하는 단계, (3) PLGA/HA/NaCl 입자를 1:1:9의 질량 비율로 혼합하는 단계, (4) 상기 입자 혼합물을 디스크 몰드에 투입하는 단계, (5) 초고압에서 상기 혼합물을 소정의 시간 동안에 압축시키는 단계, (6) 새로이 형성된 디스크를 이 디스크를 포화시키기에 충분히 장시간 고압의 CO2 가스에 노출시키는 단계, (7) 디스크 표면의 압력을 감소시켜 주변 압력으로 복귀시키는 단계, (8) 상기 디스크를 증류수 중에 침지시켜 염화나트륨 입자를 용해 및 침출시키는 단계로 요약될 수 있다.
본 발명의 또 한가지 실시 상태는 PLGA/하이드록시아파타이트 생체 적응 재료의 표면에 균질한 아파타이트 무기질 피막을 형성하는 것을 포함한다. 이 아파타이트층은 생체 적응 재료 스캐폴드의 골형성능을 향상시킨다.
상기 아파타이트층은 이온이 풍부한 인공 체액 (SBF)에서 스캐폴드를 인큐베이트함으로써 생성된다. 이 용액은 반응 시약급의 NaCl, NaHCO3, Na2SO4, KCl, K2HPO4, MgCl2·6H2O, 및 CaCl2·2H2O를 탈이온 증류수에 용해시킴으로써 제조된다. 1x SBF는 혈장과 이온 농도가 동일하지만, 5x SBF는 혈장보다 이온 농도가 5배 더 높다. pH는 트리스(하이드록시메틸) 아미노메탄을 사용하여 6.4로 조정한다.
전술한 PLGA/하이드록시아파타이트 생체 적응 재료는 비교적 신속하게 아파타이트에 의하여 피복될 수 있다. 그 이유는, 하이드록시아파타이트의 노출된 입자가 SBF 용액 중에서 무기질 아파타이트층을 생장시키기 위한 핵형성 부위로서 작용하기 때문이다. SBF 용액 중에서 생체 적응 재료를 인큐베이트함으로써 아파타이트로 폴리머 생체 적응 재료를 피복하는 방법은 이미 알려져 있으나, 생체 적응 재료 표면에 노출된 나노-하이드록시아파타이트와 함께 폴리머 생체 적응 재료를 인큐베이트함으로써 촉진되는 피복법은 이 기술 분야에 교시된 바가 없다. GF/PL법에 의하여 형성시킨 PLGA 및 PLGA/나노-하이드록시아파타이트 양자의 스캐폴드 표면의 아파타이트층의 형성을 비교하기 위한 연구를 수행하였다. 각각을 5일 이하의 기간에 1x 및 5x SBF 중에서 인큐베이트하였다. 일련의 간단한 진공-재가압 사이클을 수행하여 스캐폴드의 세공 내에 용액을 강제 도입 하였다. SBF는 매일 갈아주었다. 각 인큐베이션 기간이 지난 후, 시료를 꺼내어 세정하여 진공 건조시킨 다음에 특징 분석하였다.
PLGA 및 PLGA/나노-하이드록시아파타이트 검체의 특징을 분석하였다. 스캐폴드의 형태학은 백금 피복한 후에 주사 전자 현미경 (SEM; JSM6330F, JEOL, Tokyo, Japan)으로 검사하였다. X선 회절 (XRD) 스펙트럼은 10 내지 60°범위에서 스캐닝 속도가 2.5°/분이고, 혼합 입사각이 1° 및 2θ인 X선 회절 측정기 (D/MAX-2500, Rigaku Co., Tokyo, Japan)를 사용하여 구하였다. 상기 회절에는 전압이 40 kV 및 전류가 100 mA인 Cu Kα 복사선을 사용하였다. XRD 결과는 도 1에 나타나 있다. PLGA/하이드록시아파타이트 결과들은 PLGA/하이드록시아파타이트 복합재 생체 적응 재료 위에 형성된 다량의 아파타이트로부터 추정되는 고강도 피크를 보여주고 있다는 것이 분명하다.
해상도가 8 cm-1인 FT-IR 스펙트로미터 (Avatar 360, Nicolet Instrument Corp., Madison, WI, USA)를 사용하여 퓨리에 전환 적외선 분광기 (FT-IR) 스펙트럼을 구하였다. FT-IR 분석을 행하기 위하여, 스캐폴드를 절단하여 미립자로 만들고, 브롬화칼륨과 함께 분쇄한 다음에, 얇고 투명한 디스크 내에 압입하였다. SBF 중에서의 아파타이트 형성 도중 스캐폴드의 질량 증가를 정확도 10-4 g의 분석용 저울 (EPG214C, Ohaus Corp., Pine Brook, NJ, USA)을 사용하여 측정하고, 그 데이터를 도 2에 나타낸다.
마지막으로, 스캐폴드를 공기 건조시킨 다음 진공 건조시켰다. 아파타이트의 형성으로 인한 질량 증가분은, 동일한 시간 간격으로 동일한 온도에서 동일한 pH의 트리스 완충액 중에서 인큐베이트하였을 때의 스캐폴드 질량과 비교하여, 증가 백분율로서 표현하였다. 도 3의 데이터는 PLGA/하이드록시아파타이트 스캐폴드 (원형)가 아파타이트 형성 때문에 가장 큰 질량을 얻었음을 보여주고 있다. 또한, 이온 농도가 더 높은 SBF 용액은 아파타이트를 더 다량 침착시킨다는 사실도 역시 분명하다.
아파타이트로 피복된 PLGA 시료의 SEM 현미경 사진에 의하면, 아파타이트층은 균질하지 않다는 사실이 밝혀지게 되었다. PLGA가 없는 영역이 있었는데, 이는 아파타이트 침착이 불량하다는 사실을 보여주는 것이다. 그러나, PLGA/하이드록시아파타이트 스캐폴드는 더욱 바람직하고, 균질한 아파타이트층을 보여주었다.
더욱 중요한 것은, 아파타이트로 피복된 PLGA/하이드록시아파타이트 스캐폴드에 골모 세포를 접종하였을 때, 시험관내의 아파타이트로 피복된 PLGA 스캐폴드에 비하여, 현저하게 개선된 세포 생장 및 무기질화를 나타내었다는 것이다. 이러한 결과는 균질한 아파타이트층이 골생성 특성에 유리하다는 가설을 뒷받침해주는 것이다.
생체 모방 아파타이트 피복법은 나노 크기의 하이드록시아파타이트 핵형성 부위를 도입하고, 진한 SBF 용액을 사용함으로써 향상된다. 이 피막은 PLGA/하이드록시아파타이트 생체 적응 재료에 더욱 나은 골형성 특성을 부여하기 때문에 유리하다.
본 발명의 또 하나의 실시 상태는 아파타이트 피막이 생체 모방성 및 접착성이 있고 균질한 (스캐폴드보다 오히려) PLGA/나노-하이드록시아파타이트 입자의 피막을 포함한다. 상기 입자는 반응 공정의 생성물일 수도 있고, 벌크형 PLGA/나노-하이드록시아파타이트 복합재로부터 입도 30 내지 2000 Pm까지 분쇄될 수도 있다. 입자들은 체질한 후에 소정의 용도에 따라 입도 분포가 더 좁은 입자로 분리될 수 있다. 이 때, 이들 입자를 SBF 용액 중에 침지시키면, 이들은 생체 모방성 아파타이트의 균질한 층에 의하여 피복되게 된다.
폴리머/바이오세라믹 복합재 스캐폴드를 제조하기 위한 기존의 방법, 예컨대 용매 캐스팅 및 입자 침출 (SC/PL)법 또는 상분리법 등의 대부분은 유기 용매를 사용한다. 그러나, 스캐폴드 중의 잔류 용매는 이식된 세포 또는 수용자 조직에 유해할 수 있다. 더욱이, 폴리머 용액에 의하여 생성된 세라믹 표면의 폴리머 피막은 스캐폴드 표면에 세라믹이 노출되는 것을 방지할 수 있는데 (도 4A), 이는 골생성 세포가 생활성 세라믹과 접촉되는 기회를 감소시킬 수 있다.
본 발명의 양호한 실시 상태는 골조직 공학용 PLGA/HA 복합재 스캐폴드를 제조하기 위한 가스 발포 및 입자 침출 (GF/PL)법에 의존하고 있다. 이 방법은 스캐폴드 표면에 바이오세라믹을 효율적으로 노출시키고 유기 용매의 사용을 회피한다. HA (이는 생체내에서 극히 느리게 분해된다)의 요구량을 감소시키고, 또한 스캐폴드 표면에 대한 HA 노출을 증가시키려면, 마이크론 입도의 입자보다도 입도가 약 100 nm인 HA 입자를 사용하여 복합재 스캐폴드를 제조한다. GF/PL 스캐폴드에서의 스캐폴드 표면의 HA 노출량을 SC/PL 스캐폴드에서의 노출량과 비교하였다. 도 4 A~C 참조.
실시예 1
다공성 PLGA/HA 복합재 스캐폴드는 전술한 GF/PL법 [참고 문헌 24. Harris LD, Kim BS, Mooney DJ. Open pore biodegradable matrices formed with gas foaming. J Biomed Mater Res 1998;42: 396-402]을 변형시켜 제조하였다. PLGA/HA 복합재는 75:25 PLGA 입자 (직경=100 내지 200 mm, 분자량=100,000 Da, Birmingham Polymers, Birmingham, AL), HA 나노입자 (직경=약 100 nm, Berkeley Advanced Biomaterials Inc., Berkeley, CA) 및 염화나트륨 입자 (직경=100 내지 200 mm, Sigma, St. Louis, MO)를 사용하여 제조하였다. PLGA 펠릿은 테크마르 분쇄기 (Bel-Art Products, Pequannock, NJ)를 사용하여 분쇄하고 체질하여 100 내지 200 mm 범위의 입자를 얻었다. 염 입자를 체질하여 100 내지 200 mm 입도 범위를 얻었다. 상기 폴리머 입자를 HA와 NaCl 입자와 혼합하였다. PLGA/HA/NaCl 질량비는 1:1:9이었다. 상기 혼합물을 디스크 몰드 (직경=1.35 cm; Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI)에 투입하고, 프레스 (Carver Laboratory Press (Fred S. Carver, Inc., Menominee Falls, WI))를 사용하여 1분간 2000 psi로 압축하여, 두께가 1.7 mm인 고체 디스크를 생성시켰다. 그 다음, 이 시료를 고압의 CO2 가스 (800 psi)에 48 시간 노출시켜 상기 폴리머를 가스로 포화시켰다. 이어서, 가스 기압을 주변 기압으로 감압시켜 열역학적 불안정성을 형성시켰다. 이와 같이 하여, 핵형성과 폴리머 스캐폴드 내의 CO2 세공의 생장도 유도하였다. 이어서, 상기 스캐폴드를 증류수 중에서 48 시간 침출시킴으로써, 그 스캐폴드로부터 NaCl 입자를 제거하였다. HA 무함유 PLGA 스캐폴드도 역시 GF/PL법으로 제조하여, 대조군 (GF/PL-무HA)으로서 사용하였다.
다공성 PLGA/HA 스캐폴드도 역시 전술한 SC/PL법의 변형법 [Wei G, Ma PX. Structure and properties of nano-hydroxyapatite/ polymer composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials 2004;25:4749-57; Cho SW, Kim IK, Lim SH, Kim DI, Kang SW, Kim SH, et al. Smooth muscle-like tissues engineered with bone marrow stromal cells. Biomaterials 2004;25:2979-86; Cho SW, Kim SS, Rhie JW, Cho HM, Choi CY, Kim BS. Engineering of volume-stable adipose tissues. Biomaterials 2005;26: 3577-85; Kim BS, Jeong SI, Cho SW, Nikolovski J, Mooney DJ, Lee SH, et al. Tissue engineering of smooth muscle under a mechanically dynamic condition. J Microbiol Biotech 2003;13:841-5]에 의하여 제조하여, 또 다른 대조군으로 사용하였다. 이 방법에서는, PLGA를 염화메틸렌 (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) 중에 10% (w/v) 농도로 용해시키고, HA 및 NaCl을 GF/PL 스캐폴드에 대한 것과 동일한 크기 및 비율로 PLGA 용액에 첨가하였다. 이 혼합물을 테플론 실린더 (직경=21.5 mm, 높이=25 mm; Cole-Parmer Instrument Company, Vernon Hills, IL)에 투입하였다. 용매를 증발시킨 후에, 염 입자들이 매립되어 있는 폴리머 디스크를 상기 몰드에서 꺼내었다. 상기 디스크를 증류수에 48 시간 침지시켜 상기 염 입자들을 제거하였다.
제조된 스캐폴드의 다공성은 수은 침투 기공률 측정 장치 (mercury intrusion porosimetry; Autopore IV 9500, Micromeritics Instrument Corporation, Norcross, GA)를 사용하여 측정하였다. 이 분석에서는, 스캐폴드 표면에서의 수은 접촉각 1301을 사용하였다. 스캐폴드의 다공 구조는 주사 전자 현미경 (SEM, JEOL, Tokyo, Japan)을 사용하여 검사하였다. 압축 및 인장 시험은 인스트론 (Instron) 기계 시험기 (Instron 4201, Instrons, Canton, MA)를 사용하여 수행하였다. 스캐폴드 시료는 압축 시험용으로 1x1 cm2로 절단하였다. 인장 시험을 행하기 위하여, 에폭시 접착제를 사용하여 상기 시료 (1x1 cm2)를 카드보드에 접합시 켰다. 상기 시료를 카드보드의 중앙에 있는 7 mm 슬롯의 중심에 맞춘 다음에, 접착제로 접합하여 게이지 길이를 표준화하였다. 압축 및 인장 시험은 1 mm/분의 일정한 변형률로 수행하였다. 응력-변형률 곡선의 초기 탄성부에서의 기울기로부터 탄성률을 측정하였다. 스캐폴드 중의 HA의 표면 노출 분포도와 노출도를 검사하기 위하여, 스캐폴드 표면에 노출된 HA를 친수성 염료 (트립판 블루, Sigma) 염색으로 가시화처리하였다. 잔류 염료는 100% 에탄올 중에서 초음파 처리하여 제거하였다. 그 다음에, PLGA/HA 스캐폴드의 표면을 현미경 (Camscope, Samtech, Seoul, Korea)으로 검사하였다. 스캐폴드 표면의 화학적 조성을 검사하기 위하여, 본 발명자는 X선 광전자 분광기 (XPS; Sigma Probe, ThermoVG Scientific, West Sussex, UK) 분석을 수행하여, O 1s, C 1s, Ca 2p, 및 P 2p 피크를 평가하였다. 분광기 내의 잔류압은 1.1 x 10-8 Pa이고, 250 W로 전력이 공급된 Mg 애노드 (1.25 keV)를 X선 광원으로서 사용하였다. 일정한 통과 에너지는 23 eV이었다. 모든 XPS 데이터는 공칭 광전자 이륙각 (takeoff angle) 551에서 구하였다. 배경을 감한 후에 XPS 피크의 면적을 측정하고, 모든 원소의 전체 피크 면적에 의하여 각 원소의 피크 면적을 정규화함으로써 원자 백분율을 측정하였다.
신생 (1일이 채 되지 않은 것) 스프라그-다울리 (Sprague-Dawley)종 래트 (SLC, Tokyo, Japan)의 두개관으로부터 효소 분해법에 의하여 골모 세포를 분리하였다. 두개관을 분리하고, 모든 연결 조직을 조심스럽게 제거하였다. 두정골을 멸균 수술용 가위를 사용하여 잘게 썰어서, 약 1 x 1 mm2로 측정되는 조각들을 얻었 다. 1.37 mg/ml 콜라게나아제 타입 I (Sigma) 및 0.5 mg/ml 트립신 (Sigma)을 함유하는 효소 용액에 의하여 골모 세포를 분리하였다. 30분 인큐베이션 후에, 떨어져 나온 세포는 폐기하여 다른 세포 타입으로 오염되는 것을 방지하였다. 잘게 썬 뼈를 효소 용액으로 30분간 재분해시키고, 상징액 (上澄液)을 10% (v/v) 소 태아 혈청 (Gibco BRL), 1% (v/v) 페니실린-스트렙토마이신 (Gibco BRL), 10 mM b-글리세로포스페이트 (Sigma), 50 mg/ml L-아스코르브산 (Sigma) 및 100 nM 덱사메타손 (Sigma)을 함유하는 배양 배지 (Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM, Gibco BRL, Gaithersburg, MD))에 옮겼다. 이러한 과정을 3회 반복한 다음, 마지막으로 수집된 용액을 10분간 1500 rpm으로 원심 분리하였다. 세포를 조직 배양 플라스크에 플레이팅하여, 가습 인큐베이터에서 37℃에서 5% (v/v) CO2 로 배양하였다.
제조된 스캐폴드는 산화에틸렌 가스로 멸균 처리하고 12 시간 동안 배양 배지 중에서 예비 습윤시켰다. 세포 현탁액 중의 분취액 50 ml (4.0x107 세포/ml, 2.0 106 세포/스캐폴드)를 예비 습윤시킨 상기 스캐폴드의 상부에 접종하였다. 스캐폴드를 인큐베이터에서 3 시간 동안 방해받지 않은 채로 유지하여 세포가 스캐폴드에 부착되도록 하였다. 배양 배지 1 ml 및 10 ml를 6 및 8 시간째에 각 스캐폴드에 첨가하였다. 세포/스캐폴드 구성체를 가습 인큐베이터에서 37℃에서 5% (v/v) CO2로 8주간 배양하였다. 배지는 매일 갈아주었다. 분석은 7, 14, 28, 및 56 일째에 수행하였다.
스캐폴드 표면에서의 접종 효율 및 세포 생장률을 측정하기 위하여, 세포 수를 정량 DNA 분석법 (n=3)으로 측정하였다. DNA를 DNA 정제용 키트 (Wizard Genomic DNA Purification kit (Promega, Madison, WI))를 사용하여 분리하였다. DNA를 분리하기 위하여, 세포/스캐폴드 구성체는 인산염 완충 염수로 2회 세척하였다. 검체를 1.5 ml 들이 튜브에 넣고 호모게나이저 (PowerGen 125, Fisher Scientific, Germany)로 분쇄하였다. DNA를 상기 키트 프로토콜에 따라 분리하고, DNA 함량을 자외선 흡수 분광기 (JASCO V-530, Tokyo, Japan)로 260 nm에서 측정하였다. 세포 수를 동일한 세포의 DNA 표준 곡선으로부터 산출하였다.
스캐폴드 표면에서 배양된 골모 세포의 알칼리성 포스파타아제 (ALP) 생성량은 문헌 (Ekholm M, Hietanen J, Tulamo RM, Muhonen J, Lindqvist C, Kellomaki M, et al. Tissue reactions of subcutaneously implanted mixture of epsilon-caprolactone-lactide copolymer and tricalcium phosphate. An electron microscopic evaluation in sheep. J Mater Sci Mater Med 2003;14:913-8)에 기재되어 있는 방법을 사용하여 분광법 (n=3)으로 측정하였다. 골모 세포/스캐폴드 구성체를 PBS로 세척하고, 1 ml Tris 완충액 (1 M, pH 8.0, Sigma)으로 균질화한 다음에, 얼음 위에서 4분간 초음파처리하였다. 분취액 20 ml를 인산 p-니트로페닐 용액 1 ml (16 mM, Sigma)와 함께 30 ℃에서 최대 5분간 인큐베이트하였다. ALP의 존재하에서의 p-니트로페놀의 생성량은 405 nm에서의 흡광도를 관찰하여 측정하였다.
세포-스캐폴드 구성체 중의 칼슘 침착량은 이미 보고되어 있는 방법 (n=3) (Jaiswal N, Haynesworth SE, Caplan AI, Bruder SP. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. J Cell Biochem 1997;64:295-312)을 사용하여 측정하였다. 세포-스캐폴드 구성체를 PBS로 2회 세정한 후에, 0.6 N HCl로 균질화한 후, 4℃에서 4 시간 진탕시켜 칼슘을 추출하였다. 이어서, 용균물을 1000 g에서 5분간 원심 분리하고, 상징액을 칼슘 함량의 측정에 사용하였다. 접종된 골모 세포에 의한 칼슘 생성량을 측정하기 위하여, PLGA/HA 스캐폴드 자체의 칼슘 함량을 측정한 다음, 용균물 중의 총칼슘 함량으로부터 스캐폴드 자체의 칼슘 함량을 감하였다. 세포 용균물 중의 칼슘 농도는 크레졸프탈레인 컴플렉손 (Sigma)을 사용하여 분광법에 따라 정량하였다. 반응 시약 첨가 3분 후에, 시료의 흡광도를 마이클로플레이트 리더 (Multiskan Spectrum, Thermo Electron Co., Vantaa, Finland)를 사용하여 575 nm에서 판독하였다. 칼슘 농도는 칼슘 표준 용액 (Sigma)을 순차 희석하여 얻은 표준 곡선으로부터 산출하였다.
스캐폴드 및 세포-스캐폴드 구성체의 표면 및 횡단면의 형태학은 SEM을 사용하여 검사하였다. PBS를 사용하여 시료를 2회 세척하고, 1% (v/v) 완충 글루타르알데하이드 중에서 1 시간 예비 고정시킨 다음에, 0.1% (v/v) 완충 포름알데하이드 중에서 24 시간 고정시켰다. 고정시킨 시료를 상향 구배의 에탄올 중에서 탈수 및 건조시킨 다음에, 양면 탄소 테이프를 사용하여 알루미늄 스텁 (stub) 위에 올려 놓았다. 검체를 스퍼터 코터 (Sputter Coater (Cressington 108, Cressington Scientific Instruments, Cranberry, PA))를 사용하여 금으로 피복하고, 10 kV의 가속 전압에서 SEM으로 검사하였다.
세포-스캐폴드 구성체의 시험관내에서의 배양 이외에, 세포-스캐폴드 구성체를 무흉선 마우스 (BALB/c-nu, 7주령, 암컷, SLC, Tokyo, Japan)의 피하 공간 내에 이식하였다. 마우스를 케타민 염산염 (50 mg/kg, Yuhan Co., Seoul, Korea) 및 자일라진 염산염 (5 mg/kg, Bayer Korea Ltd., Seoul, Korea)을 근육내 투여하여 마취시킨 후, 6 마리의 마우스의 배피 (背皮)에 작은 절개부를 만들었다. 피하 부위에 블런트 절개를 행하여, 동물 1 마리당 4개의 파우치를 만들고, 세포가 접종된 스캐폴드를 즉시 이들 파우치에 이식하였다 (n=4). 이어서, 피부를 5-0 비크릴 (Vicryl®) 봉합사 (Ethicon, Lenneke Marelaan, Belgium)로 봉합하였다. 수술 후에 마우스를 한 마리씩 가두고, 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 한양대학교 가이드라인에 따라서 사람이 관리하도록 하였다. 분석용 이식체는 이식 후 5주 및 8주째에 회수하였다.
세포-스캐폴드 구성체를 이식 후 5주 및 8주째에 무흉선 마우스로부터 회수하여 (도 8B), 10% (v/v) 완충 포름알데하이드 중에서 고정하고, 상향 구배의 에탄올 중에서 탈수시켜서 파라핀 중에 매립시켰다. 조직 블록을 4 mm 두께로 절편하고, 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)과 매슨 트리크롬 (Masson's trichrome)으로 염색하였다. 매슨 트리크롬으로 염색한 중간부 절편을 현미경으로 검사하여 조직 형태학적 분석을 행하였다. 상기 구성체 중에 뼈가 차지하는 공간의 백분율은 광학 현미경이 장착된 이미지 분석기 (KS400, Zeiss, Munich, Germany)를 사용하여 측정하였다. 골형성 면적은 사용 가능한 세공 공간 중의 골면적 (골면적/세공 면적 x 100%)으로 나타내었다.
정량적 데이터는 평균±표준 편차로서 나타내었다. 통계학적인 비교는 분산 분석법 (ANOVA, SAS Institute Inc., Cary, NC)을 사용하여 수행하였다. p<0:05의 값이 통계학적으로 유의한 것으로 간주되었다.
가스 발포와 그에 이어 다량 (90%)의 NaCl 입자 (직경 범위 100 내지 200 mm)를 함유하는 스캐폴드를 염 침출시켜, 외부의 비세공성 피층 (皮層)의 증거가 없는 매우 다공성의 개방형 세공 구조를 형성시켰다 (도 4C 및 D). GF/PL 스캐폴드의 횡단면에서 관찰된 세공 구조는 SC/PL법에 의하여 제조된 스캐폴드의 것과 유사하였다 (도 4A 및 B). SC/PL법에 의하여, 세공 크기가 약 100 내지 200 mm인 스캐폴드를 제조하였다 (도 5A). 반대로, GF/PL법에 의하여는, 두 가지 다공도의 스캐폴드가 제조되었다. 즉, 상호 연결된 거대 세공 (100 내지 200 mm)은 NaCl 입자를 침출시킴으로써 형성되고, 더 작은 밀폐형 세공 (10 내지 45 mm)은 폴리머 입자 내에서의 핵형성과 가스 세공의 생장에 의하여 형성되었다 (도 5B). GF/PL와 SC/PL 스캐폴드의 평균 다공도는 91±3% 및 85±3%였다.
스캐폴드의 기계적 특성은 압축 및 인장 기계 시험을 사용하여 측정하였다. GF/PL 스캐폴드는 SC/PL 스캐폴드에 비하여 기계적 특성의 향상을 나타내었다. SC/PL 및 GF/PL 스캐폴드에 대한 평균 압축 탄성률은 각각 2.3±0.4 및 4.5±0.3 MPa (p<0:05)이었다. SC/PL 및 GF/PL 스캐폴드에 대한 평균 인장 탄성률은 각각 2.0±0.1 및 26.9±0.2 MPa (p<0:05)이었다. 이들 데이터는 입축 탄성률의 면에서는 99%의 증가를 나타내고, 인장 탄성률의 면에서는 1331%의 증가를 나타내었는데, 이는 스캐폴드의 기계적 특성을 향상시킴에 있어서의 GF/PL 제조법의 긍정적인 효과를 나타내는 것이다.
스캐폴드 제조법이 스캐폴드 표면에서의 HA의 노출도에 영향을 미치는 지의 여부를 측정하기 위하여, 노출된 HA를 친수성 염료로 염색하였다. HA는 SC/PL 스캐폴드에서보다도 GF/PL 스캐폴드에서 더 풍부하게 염색되었다 (도 6A, C 및 D). PLGA/HA 복합재 스캐폴드의 표면 조성을 XPS로 분석하였다. GF/PL 스캐폴드 표면에서의 Ca의 양은 SC/PL 스캐폴드 표면에서보다 더 다량이었다 (도 6E 및 F). 스캐폴드 표면 에 노출된 Ca의 원자비는 SC/PL 스캐폴드 표면에 비하여 GF/PL 스캐폴드 표면에서 156% 더 높았다 (도 6G).
상기 두 가지 형식의 PLGA/HA 복합재 스캐폴드를 56일간의 시험관내 배양 기간에 걸쳐, 접종된 래트의 두개골 골모 세포를 접착하여 증식시켰다 (도 7A). 2.00x106 세포/스캐폴드의 초기 세포 접종 밀도는 배양 1일 후에, GF/PL 스캐폴드에 1.33x 106 세포/스캐폴드가 접착된 채 잔류하는 결과로 되었는데, 이는 접착률이 66.5%임을 나타낸다. SC/PL 스캐폴드에 대하여, 세포 접착 효율은 62.0%이었다. 골모 세포는 SC/PL 스캐폴드보다는 GF/PL 스캐폴드 중에서 더욱 신속하게 생장하였다 (도 7A). GF/PL 스캐폴드의 평균 세포 밀도는 배양 4주 후에 2.48x106 세포/스캐폴드이었고, SC/PL 스캐폴드에 대해서는 2.19 x 106 세포/스캐폴드이었는데, 이는 GF/PL 및 SC/PL 스캐폴드에 대한 세포 밀도의 86.5% 및 69.7% 증가율에 각각 해당 한다 (도 8).
상기 두 가지 형식의 PLGA/HA 복합재 스캐폴드에서 배양된 골모 세포의 ALP 활성은 4주간의 배양 기간 중에는 증가되었고, 8주째에는 감소되었다 (도 7B). 반대로, PLGA 스캐폴드 표면에서 HA 없이 생장한 골모 세포의 ALP 활성은 낮고, 배양 기간 중에 어떤 유의한 변화도 보이지 않았다. 배양 4주 기간 중에 GF/PL 스캐폴드 표면의 골모 세포는 SC/PL 스캐폴드 표면의 골모 세포에 비해 유의하게 더 높은 수준 (p<0:05)의 ALP 활성을 보였으나, 8주째에는 유의한 차이를 보이지 않았다.
배양된 골모 세포에 의한 칼슘 침착량은 8주간의 배양 기간 중에 SC/PL 스캐폴드보다 GF/PL 스캐폴드에서 유의하게 더 높았다 (p<0:05) (도 7C). 상기 두 가지 형식의 PLGA/HA 스캐폴드에 대한 침착량은 배양 기간 중에 점진적으로 증가하였다. HA가 없는 PLGA 스캐폴드에서의, 칼슘 침착량은 상기 두 가지 형식의 PLGA/HA 스캐폴드보다 유의적으로 더 낮았다. PLGA 스캐폴드에서 칼슘 침착량은 처음 4주간에는 낮은 수준으로 유지되었지만, 8주째에는 약간 증가하였다.
골모 세포가 접종된 상기 두 가지 형식의 PLGA/HA 복합재 스캐폴드를 이식한 결과, 이식 5주 및 8주째에 이소(異所) 부위의 생체내에서 새로운 뼈가 형성되었다. 이식 5주 후, 소량의 무층골 (無層骨)이 SC/PL (도 9A 및 B) 및 GF/PL (도 9C 및 D) 스캐폴드의 양쪽에서 검출되었다. 이식 8주 후, 조골 작용이 진행되었으며, 라멜라 구조의 뼈가 더 많이 나타났다 (도 10 C~F). 재생 조직의 중간부 절편의 조직 형태학적 분석 결과, 이식 5주 및 8주째에, SC/PL 스캐폴드 및 HA 무함유 PLGA 스캐폴드에 비하여 GF/PL 스캐폴드에서 골형성이 증대된 것이 나타났다 (도 11A). 대조적으로, HA 무함유 세포가 접종된 PLGA에서는 8주 동안 생체내에서 거의 새로 뼈가 생성되지 않았다. HA 무함유 PLGA 스캐폴드의 세공의 대부분은 이식 후 5주 및 8주 째에 골형성의 증거 없이 느슨한 섬유질의 연결 조직으로 채워져 있었다 (도 10A 및 B).
재생 조직 중의 칼슘 침착량은 이식 후 5주 및 8주째에 SC/PL 스캐폴드 군에서보다 GF/PL 스캐폴드 군에서 더 집중되었으나 (도 11B), 이들 두 가지 스캐폴드군 중의 칼슘 침착량은 이식 기간 중에 증가하였다. HA 무함유 PLGA 스캐폴드군 중의 칼슘 침착량은 HA 함유 스캐폴드군 중에서보다 훨씬 더 적었다.
GF/PL법에 의하여 제조된 PLGA/HA 스캐폴드는 스캐폴드 표면에서의 HA의 더 많은 노출량을 나타내고, 통상의 SC/PL법에 의해 제조된 것보다 시험관내 및 생체내에서 더 많은 뼈를 형성시켰다. 다른 생분해성 폴리머/세라믹 복합재 스캐폴드 제조 방법에 비하여, GF/PL법은 여러 가지의 장점이 있다.
첫째, GF/PL법은 유기 용매를 사용하지 않는다. 스캐폴드 내에 남아 있는 잔류 유기 용매는 이식된 세포와 이를 둘러싼 조직에 손상을 줄 수 있다. 더욱이, 유기 용매에 노출시키면 생물학적 활성 인자를 불활성화시킬 수도 있다. 그러므로, GF/PL법은 스캐폴드 내에 배합되는 생장 인자를 덜 변성시킬 수 있다.
둘째, GF/PL법은 폴리머/바이오세라믹 복합재 스캐폴드의 표면에 바이오세라믹을 효율적으로 노출시킬 수 있다. 친수성 염료로 염색하고 XPS 분석한 결과, 이 연구에 있어서 GF/PL법은 통상의 SC/PL법의 결과보다 스캐폴드 표면에서의 HA의 양을 유의적으로 더 다량 노출시키고 있음을 보여주었다 (도 6). SC/PL법은 폴리머 용액에 의하여 바이오세라믹 표면에 스캐폴드 표면에서의 바이오세라믹의 노출을 방해하는 폴리머 피막을 형성시켰으나, 폴리머 용액을 사용하지 않는 GF/PL법은 5주 및 8주째에 스캐폴드 표면에 바이오세라믹을 효율적으로 노출시킨다. 그러므로, GF/PL 스캐폴드는 골모 세포가 생활성 세라믹과 접촉될 가능성을 증가시켜서, 골모 세포의 분화 및 생장을 향상시킬 수가 있다.
셋째, GF/PL 스캐폴드는 SC/PL 스캐폴드에 비하여 향상된 기계적 특성을 나타낸다. GF/PL 스캐폴드는 SC/PL 스캐폴드보다 압축 및 인장 탄성률이 유의적으로 더 높다. 이는 GF/PL법에서 고압하의 폴리머 사슬의 채워짐 (packing)이 더 조밀하고, 발포 중에 발생하는 폴리머 신장에 의한 폴리머 사슬의 긴장 정렬에 기인하기 때문일 것이다. 그 밖에, SC/PL 스캐폴드 중의 잔류 용매는 가소제로서 작용할 수 있고, 폴리머를 더욱 연성 (延性)으로 만들 수 있다. GF/PL 복합재 스캐폴드는 SC/PL 복합재 스캐폴드에 비하여 훨씬 더 향상된 기계적 특성을 나타내었지만, 제조된 스캐폴드의 측정된 압축 인장력은 인간의 뼈의 압축 인장력보다 더 낮았다. 이는 제조된 스캐폴드의 고다공성 구조 때문이고, 불량한 기계적 특성에 기인하는 것일 것이다.
GF/PL 스캐폴드를 사용하면 시험관내 및 생체내 실험에서 조골 효과를 향상시킬 수 있다. SC/PL 및 GF/PL 스캐폴드는 다공성, 세공 크기 및 상호 연결성 등의 물리학적 성질이 비슷하기 때문에, 이들 두 가지 종류의 스캐폴드간의 골모 세포능의 차이는 이들의 상이한 표면의 화학적 특징에 기인하는 것일 것이다. GF/PL 스캐폴드 표면에서의 시험관내 및 생체내 골형성의 증가는, 그 스캐폴드 표면에 노출된 세포 증식 및 골모 세포 분화를 자극하는 HA 입자와 접종된 세포의 직접 접촉에 기인할 수 있다. 반대로, HA 입자는 폴리머로 피복되게 되는데, 이는 SC/PL 스캐폴드 중의 세포와의 상호 작용을 방지한다. SC/PL 스캐폴드의 대부분의 HA 입자는 PLGA 폴리머 내에 매립되어 있기 때문에, PLGA가 분해되면 그의 표면 위에 HA 입자를 노출시키게 된다. 그러나, PLGA 분해는 장시간을 요하며, 이 기간 동안에 HA에 의한 골형성의 가속화는 일어나지 않게 된다.
HA 무함유 PLGA 스캐폴드에 대한 ALP 활성은 시험관내에서의 배양 기간 중에 유의적인 변화를 보이지 않았지만, 이 군 중에서는 56일째에 칼슘 농도가 증가하였다. 이러한 불일치는 ALP가 조골 분화에 대한 초기 마커이며 보통 초기에 정점에 도달하지만, 무기질화는 시험관내 배양 기간에 걸쳐 연속적으로 발생한다는 사실 때문일 수 있다.
이 연구에서, 본 발명자들은 PLGA/HA 복합재 스캐폴드를 제조하는 데 나노 크기의 HA 입자를 사용하였다. 매우 결정질인 HA는 생체내에서 장기간에 걸쳐 분해되기 때문에, 불완전하게 분해하는 잔류 HA는 완전한 골회복을 방해하거나 또는 둔화시킬 수 있다. 그러므로, 스캐폴드 표면에 대한 HA의 분포를 향상시키는 한편, HA의 총량을 감소시키기 위하여, 본 발명자들은 마이크론 크기의 HA 입자 대신에 표면적이 큰 나노 크기의 HA 입자를 사용하여, 복합재 스캐폴드를 제조하였다. 더욱이, 이들 나노 크기의 HA 입자는 마이크론 크기의 HA 입자에 비하여, 골결손부에 이식시 개선된 생활성과 조골성을 나타내었다. 마이크론 크기의 HA 입자 대신에 나노 크기의 HA 입자를 사용함으로써 단백질 흡수 및 세포 접착이 향상될 수 있다는 사실도 역시 보고되어 있다.
실시예 2
증대되는 관심은 최근에 대용골 재료로서의 폴리머/세라믹 복합재 재료에 촛점을 두고 있는데, 그 이유는 이들 재료는 골 조직 공학용 세라믹 스캐폴드 및 폴리머 스캐폴드에 비하여 장점이 있기 때문이다. 하이드록시아파타이트 (HA) 및 인산삼칼슘 등의 인산칼슘계 세라믹류가 대용골 재료로서 사용되어 왔으나, 이들 재료는 기계적 특성이 불량하다. 대부분의 합성 폴리머 생체 적응 재료들은 전하를 띠지 않는 성분으로 된 이들의 조성 때문에 표면 습윤성이 낮다. 이러한 소수성 표면은, 골모 세포가 친수성 표면보다도 소수성 표면에서 증식률이 더 낮고 세포 사멸률이 더 높기 때문에 골모 세포에 바람직하지 않다. 그 밖에 이들 폴리머 생체 적응 재료의 표면은 골형성을 위한 생활성 기능이 부족한 불활성 표면이므로, 최소한의 조직 반응을 일으킨다. 골이식편에 대한 필수적인 요건은, 골이식편의 표면 의 생물학적으로 활성인 골유사성 아파타이트층의 형성을 통하여 살아 있는 수용자의 뼈와의 결합을 생성할 수 있는 능력이다. 생물학적으로 불활성인 대용 재료는 종종 섬유질 조직에 의하여 캡슐 내에 싸이게 되므로, 그 결과 골형성이 방해를 받게 된다. 그러므로, 인산칼슘 세라믹을 생분해성 폴리머, 예컨대 폴리(글리콜산), 폴리(L-락트산) 및 폴리(D,L-락틱-코-글리콜산) (PLGA) 등의 생분해성 폴리머에 첨가하면 표면 습윤성이 더 높아질 뿐만 아니라, 골전도성이 향상되게 된다.
기존의 사용 가능한 대부분의 폴리머/세라믹 복합재 스캐폴드의 제조 방법, 예컨대 용매 캐스팅 및 입자 침출 (SC/PL)법과 상분리법 등은 유기 용매를 사용한다. 그러나, 스캐폴드 중의 잔류 용매는 이식된 세포나 수용자의 세포에 유해할 수 있다. 또한, 폴리머 용액에 의하여 세라믹 입자가 폴리머로 피복되면, 스캐폴드 표면에 세라믹이 노출되는 것을 방지할 수 있는데 (도 12A 참조), 이는 골모 세포와 생활성 세라믹간의 접촉 기회를 감소시킨다. 본 발명자들은 가스 발포 및 입자 침출 (GF/PL)법은 스캐폴드 표면에 생활성 세라믹을 효율적으로 노출시키게 되며, 따라서 이들 효율적으로 노출된 세라믹은 스캐폴드의 골전도성과 습윤성을 향상시킬 수 있을 것으로 생각한다. 이 연구에서, 본 발명자들은 래트 두개골 임계 크기 결손부에 스캐폴드를 이식하고 골형성을 관찰함으로써 이 가설을 검증하였다. 스캐폴드 표면에 대한 HA의 노출을 GF/PL 스캐폴드 및 SC/PL 스캐폴드간에 비교하였다. GF/PL 스캐폴드를 사용하는 골재생을 생체내에서 평가하고, 이를 SC/PL 스캐폴드를 사용하는 것과 비교하였다.
전술한 GF/PL법을 변형시켜 다공성 PLGA/HA 복합재 스캐폴드를 제조하였는데 (도 10B) [Harris LD, Kim BS, Mooney DJ. Open pore biodegradable matrices formed with gas foaming, J Biomed Mater Res 1998;42: 396-402], 상기 PLGA/HA 복합재는 75:25 PLGA 입자 (직경 = 100 내지 200 mm, 분자량 = 100,000 Da; Birmingham Polymers, Birmingham, AL), HA 나노 입자 (직경 = 대략 100 nm; Berkeley Advanced Biomaterials, Berkeley, CA), 염화나트륨 입자 (직경 = 100 내지 200 mm; Sigma, St. Louis, MO)를 사용하여 제조하였다. 상기 PLGA/HA/NaCl 혼합물의 질량비는 1:1:9이었다. 이 혼합물을 디스크 몰드 (직경 = 13.5 mm; Aldrich Chemical, Milwaukee, WI)에 투입하고, 프레스 (Carver Laboratory Press (Fred S. Carver, Menominee Falls, WI))를 사용하여 1분간 2000 psi로 압축하여, 두께 1 mm의 고체 디스크를 만들었다. 이 시료를 고압 CO2 기체 (800 psi)에 48 시간 노출시켜 폴리머를 기체로 포화시켰다. 이어서, 기체 압력을 주변 압력으로 감압시킴으로써 열역학적 불안정성을 생성시켰다. 이어서, 스캐폴드를 증류수에 48 시간 침출시켜서 스캐폴드로부터 NaCl 입자를 제거하였다. HA 무함유 PLGA 스캐폴드도 GF/PL법으로 제조하였다 (GF/PL-무HA).
다공성 PLGA/HA 스캐폴드는 문헌에 기재되어 있는 전술한 SC/PL법의 변형법 (Lu HH, El-Amin SF, Scott KD, Laurencin CT, Three-dimensional, bioactive, biodegradable, polymer-bioactive glass composite scaffolds with improved mechanical properties support collagen synthesis and mineralization of human osteoblast-like cells in vitro, J Biomed Mater Res A 2003;64: 465-474; Cho SW, Kim IK, Lim SH, Kim DI, Kang SW, Kim SH, et al. Smooth muscle-like tissues engineered with bone marrow stromal cells, Biomaterials 2004;25:2979-86; and Kim BS, Jeong SI, Cho SW, Nikolovski J, Mooney DJ, Lee SH, et al., Tissue engineering of smooth muscle under a mechanically dynamic condition, J Microbiol Biotech 2003;13:841-5)을 사용하여 제조하고, 이를 또 하나의 대조군으로 사용하였다. 이 방법에서는, PLGA를 10% (w/v) 농도로 염화메틸렌 (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ)에 용해하고, HA 및 NaCl을 GF/PL 스캐폴드와 동일한 크 기와 비율로 PLGA 용액에 첨가하였다. 이 혼합물을 테플론 실린더 (직경=21.5 mm, 높이=25 mm; Cole-Parmer Instrument Company, Vernon Hills, IL)에 투입하였다. 용매를 증발시킨 후, 상기 몰드로부터 염 입자가 매립되어 있는 폴리머 디스크를 꺼내었다. 상기 디스크를 증류수에 48 시간 침지시켜 염을 제거하였다. 제조된 SC/PL 스캐폴드의 크기는 GF/PL 스캐폴드의 크기와 동일하였다.
스캐폴드의 형태학은 주사 전자 현미경 (SEM; JSM-6330F, JEOL, Tokyo, Japan)을 사용하여 검사하였다. 시료를 상향 구배의 에탄올 중에서 탈수시켜 건조한 다음에 양면 탄소 테이프를 사용하여 알루미늄 스텁 위에 올려 놓았다. 검체는 스퍼터 코터 (Sputter Coater (Cressington 108, Cressington Scientific Instruments, Cranberry, PA))를 사용하여 백금으로 피복하고, 10 kV의 가속 전압에서 SEM으로 검사하였다. 제조된 스캐폴드의 다공성은 수은 침투 기공률 측정 장치 (Autopore IV 9500, Micromeritics Instrument Corporation, Norcross, GA)를 사용하여 측정하였다. 이 분석에서는 스캐폴드 표면에서의 수은 접촉각 1308을 사용하였다. 압축 및 인장 시험은 인스트론 (Instron) 기계 시험기 (Instron 4201, Instron®, Canton, MA)를 사용하여 수행하였다. 스캐폴드 시료는 압축 시험용으로 1x1 ㎠으로 절단하였다. 인장 시험을 행하기 위하여, 에폭시 접착제를 사용하여 상기 시료 (1x1 ㎠)를 카드보드에 접합시켰다. 상기 시료를 카드보드의 중앙에 있는 7 mm 슬롯의 중심에 맞춘 다음, 접착제로 접합하여 게이지 길이를 표준화하였다. 압축 및 인장 시험은 1 mm/분의 일정한 변형률로 수행하였다. 응력-변형률 곡선의 초기의 탄성부에서의 기울기로부터 탄성률을 측정하였다. 스캐폴드 중의 HA의 표면 노출 분포도와 노출도를 검사하기 위하여, 스캐폴드 표면에 노출된 HA를 친수성 염료 (트립판 블루) 염색 또는 본 코사 (von Kossa's) 은(銀) 염색을 사용하여 가시화처리하였다. 트립판 블루 (Sigma) 염색을 위해서, 잔류 염료는 100% 에탄올중에서 초음파 처리하여 제거하였다. 본 코사 은 염색을 위해서, 스캐폴드를 2% (w/v) 질산은 (Sigma) 용액에 침지시킨 직후, 30분간 밝은 조명등 앞에 두었다. 이어서, 스캐폴드를 증류수로 세정하였다. PLGA/HA 스캐폴드의 표면을 현미경 (Camscope, Samtech, Seoul, South Korea)으로 검사하였다. 이어서, 스캐폴드의 습윤성에 대한 시험을 행하였다.
이를 위하여, 트립판 블루 용액을 스캐폴드 표면에 점적하고, 용액이 스캐폴드에 완전히 흡수되는 데 필요한 시간을 측정하였다.
스프라그-다울리 (Sprague-Dawley)종 래트 (8주령 수컷, n = 24; SLC, Tokyo, Japan)를 케타민 염산염 (Ketara , Yuhan, Seoul, South Korea) 및 자일라진 염산염 (Rompun, Bayer Korea, Seoul, South Korea)의 4:1 용액을 복강내 주사 (5 mg/kg 체중)하여 마취시켰다. 두피에 있는 털을 제거한 뒤, 콧뼈에서부터 뒷쪽 목선까지 두개골을 세로로 정중 절개하고, 골막을 들어올려 두정골 표면으로 노출시켰다. 수술용 원형 절제기 (Ace Surgical Supply, Brockton, MA)와 저속 마이크로 모터를 사용하여, 환상의 골통과 (transosseous) 결손부 (직경 8 mm)를 두정골에 생성시켰다. 구멍 부위를 식염수로 채우고 출혈 지점을 전기 소작하였다. 결손부를 제조된 스캐폴드로 채웠다. 골막 및 피부를 흡수성 (吸水性) 봉합사 4-0 Vicryl®(Ethicon, Edinburgh, UK)를 사용하여 층 내부에 봉합하였다. 수술 후에 래트는 한 마리씩 가두고, 실험실 동물의 관리 및 사용에 관한 서울대학교 가이드라인에 따라 사람이 돌보도록 하였다. 분석을 위해 이식편은 이식 후 8주째에 회수하였다.
마취 후에, 이식된 스캐폴드를 함유하는 두개골을 수술 8주 후에 회수하였다. 시료를 10% (v/v) 중성 완충 포르말린액으로 즉시 고정시켰다. 각 조건으로부터 하나의 검체를 데스크탑 X선 3차원 컴퓨터 단층 촬영법 (desktop X-ray 3D micro computed tomography) (CT; Skyscan 1072®, SkyScan bvba, Aartselaar, Belgium)을 사용하여 스캐닝함으로써 골형성 정도를 분석하였다. 광원으로는 초점 (focal spot)이 8 mm인 마이크로튜브 X선 튜브를 사용하였고 1024x1024 12 비트 디지털 CCD X선 검출기를 사용하였다. 8 mm 슬라이스에서 왕관 모양 이미지가 관찰되었다. 각 왕관 모양의 CT 이미지를 V-worksTM (CyberMed, Seoul, South Korea)로 재작성하여 새로운 뼈의 3차원 이미지를 가시화함으로써 재생골 조직의 미세 구조를 검사하였다.
마이크로 CT 스캔을 수집한 후에, 모든 시료 (n=24)를 EDTA (pH 6.0) 중에서 7일간 탈석회화한 다음에 파라핀 중에 매립하였다. 조직 블록을 4 mm 두께로 절편하고, 헤마톡실린과 에오신 (H&E) 및 매슨 트리크롬으로 염색하였다. 매슨 트리크롬으로 염색한 중간부의 절편을 조직학적 형태 분석을 위하여 현미경으로 관찰하였다. 구성체 중에 뼈가 차지하는 백분율을 광학 현미경이 장착된 이미지 분석 시스 템 (KS400, Zeiss, Munich, Germany)을 사용하여 측정하였다. 골형성 면적은, 사용 가능한 세공 공간 중의 골면적의 백분율로 나타내었다 (골면적/세공 면적 = 100%).
정량적 데이터는 평균±표준 편차로 나타내었다. 통계학적 분석은 분산 분석법 (ANOVA, SAS Institute, Cary, NC)을 사용하여 수행하였다. p < 0.05의 값은 통계학적으로 유의한 것으로 간주되었다.
다량의 NaCl 입자를 함유하는 스캐폴드에 가스 발포 및 후속되는 염 침출 처리에 의하여, 외부의 비다공성 피층의 증거 없이 매우 다공성 구조를 형성시킨다 (도 13(B)). GF/PL 스캐폴드는 매우 높은 다공성을 나타내고, 개방형 세공 구조를 나타내었다. GF/PL 스캐폴드의 횡단면에서 관찰되는 세공 구조는 SC/PL 스캐폴드 (도 13 A)에서 관찰되는 것과 유사하였다. GF/PL 및 SC/PL 스캐폴드의 평균 다공도는 각각 (91±3)% 및 (86±3)%이었다.
스캐폴드의 기계적 특성은 압축 및 인장 기계 시험을 사용하여 측정하였다. GF/PL 스캐폴드는 SC/PL 스캐폴드에 비하여 향상된 기계적 특성을 나타내었다. 평균 압축 탄성률은 SC/PL 및 GF/PL 스캐폴드, F3에 대하여 각각 2.3±0.4 및 4.5±0.3 MPa (p<0.05)이었다 (도 14(A)). 평균 인장 탄성률은 각각 SC/PL 및 GF/PL 스캐폴드에 대하여 각각 2.0±0.1 및 26.9±0.2 MPa (p < 0.05)이었다 (도 14(B,C)). 이들 데이터는 압축 탄성률에서 99% 증가, 인장 탄성률에서 1331% 증가를 나타내고 있다.
스캐폴드 제조 방법이 스캐폴드 표면에 대한 HA 노출도에 영향을 미치는 여부를 측정하기 위하여, 노출된 HA를 본 코사 질산은으로 염색하고(도 15(A)), 친수 성 트립판 블루 염료 (도 4(B))로 염색하였다. 두 가지 염색 방법으로, HA는 SC/PL 스캐폴드보다 GF/PL 스캐폴드에서 더욱 잘 염색되었다 (도 15). 대조적으로, HA 무함유 GF/PL 스캐폴드 (GF/PL-무HA 스캐폴드)는 두 가지 염색법 중 어느 것으로도 염색이 되지 않았다 (도 15 (A-C)).
PLGA 스캐폴드 및 PLGA/HA 복합재 스캐폴드의 소수성이 각각 HA의 첨가 및 상이한 제조 방법의 적용에 의해 개선될 수 있는지의 여부를 평가하기 위하여, GF/PL, SC/PL 및 GF/PL-무HA 스캐폴드의 습윤성을 평가하였다. 트립판 블루 염료 용액을 스캐폴드에 점적하고, 용액이 5초 이내에 GF/PL 스캐폴드에 완전히 흡수되도록 하였다 (도 16(C)). 그러나, 60초 후에도 GF/PL-무HA 스캐폴드가 F5내에 전혀 흡수되지 않았는데, 이는 스캐폴드의 소수성 특징 때문이다 (도 16(A)). SC/PL 스캐폴드는 15분 이내에 서서히 염료 용액을 흡수하였다 (도 16(B)). SC/PL 스캐폴드에 비하여 GF/PL 스캐폴드가 더욱 신속하게 흡수하는 것은 스캐폴드 표면에 노출된 HA의 양과 관련이 있었다.
래트 두개골 내의 임계적 크기의 결손부에 두 가지 형식의 PLGA/HA 복합재 스캐폴드를 이식한 결과, PLGA 스캐폴드에 비하여 생체내에서의 골형성이 향상되었다 (도 17). 이식 8주 후에, 라멜라 구조를 가진 새로운 뼈 및 유골 (類骨) 형성이 결손부 연부와 이식편의 중앙 부위인 F8의 SC/PL [도 18(B,E) 및 도 19(B,E)] 및 GF/PL [도 18(C,F) 및 19(C,F)] 스캐폴드에서 감지되었다. 이식 후 8주째에 GF/PL 스캐폴드 내의 골형성 면적은 SC/PL 스캐폴드 및 GF/PL-무HA 스캐폴드에서 더 넓었다 (도 20). HA 무함유 PLGA 폴리머는 이식 후 8주째에 생체내에서 새로운 뼈를 거 의 형성시키지 않았다 [도 18(A,D) 및 19(A,D)]. PLGA 스캐폴드의 세공의 대부분은 느슨한 섬유질 조직으로 채워져 있었고, 골형성 흔적은 보이지 않았다 (도 18(D) 및 19 (D)). 시간의 경과에 따라, PLGA는 역반응을 일으키는 일이 없이 연속적으로 분해되고, 이식 후 8주 중에 완전히 재흡수되지 않았다.
마이크로 CT 측정 결과, 결손부 내부에 존재하는 잔류 연조직과 무기질화 조직이 구분된다 (도 21). 재작성된 3차원 이미지는, 두 가지 형식의 PLGA/HA 복합재 스캐폴드 내부에서 새로운 뼈의 형성을 보여준다. 스캐폴드 내에서, 이식편 전체에 걸쳐 분산된 불규칙한 모양의 무기질화 조직이 발견되었다. 무기질화 조직의 면적은 SC/PL 및 GF/PL-무HA 스캐폴드에서보다 GF/PL 스캐폴드에서 더욱 유의하게 넓었다.
통상의 생분해성 폴리머/세라믹 복합재 스캐폴드의 제조 방법에 비하여, GF/PL법은 여러 가지 장점이 있다. 첫째, GF/PL법은 유기 용매를 사용하지 않는다. 스캐폴드 내의 잔류 유기 용매는 이식된 세포와 이를 둘러싼 조직에 손상을 줄 수 있다. 또한, 유기 용매에 노출시키면 생물학적 활성 인자를 불활성화시킬 수도 있다. 그러므로, GF/PL법은 스캐폴드 내에 들어 있는 생장 인자를 덜 변성시킬 수 있다. 둘째, GF/PL법은 SC/PL 스캐폴드보다, 스캐폴드 표면에 HA를 더 다량 노출시킨다. SC/PL법은 폴리머 용액에 의한 HA의 피복을 일으키는데, 이는 스캐폴드 표면에 대한 HA의 노출을 방해한다. 반면에 GF/PL법은 폴리머 용액이 필요하지 않다는 점 때문에, 스캐폴드 표면에 HA를 더욱 효율적으로 노출시켰다. 그러므로, GF/PL 스캐폴드는 골모 세포가 스캐폴드 표면에 노출되는 생활성 세라믹과 접촉되는 기회를 증가시킬 수 있다.
그 밖에, 스캐폴드 표면에 친수성 HA 나노 입자가 더 다량 노출되면, 스캐폴드의 친수성에 영향을 미친다. 대부분의 합성 폴리머 생체 적응 재료의 소수성 표면은 골모 세포에 불리한데, 이는 친수성 표면보다 소수성 표면에서 증식률이 더 낮고 세포 사멸률이 높기 때문이다. 그러므로, HA를 PLGA 스캐폴드에 첨가하는 것은 스캐폴드의 친수성을 증가시킬 뿐만 아니라, 그의 골전도성을 증가시킬 수가 있는 것이다. 스캐폴드 제조 방법은 PLGA/HA 스캐폴드의 친수성에도 역시 영향을 미친다. GF/PL 스캐폴드가 SC/PL 스캐폴드에 비하여 더 신속하게 습윤되는 것은 GF/PL 스캐폴드의 표면에 노출된 HA의 양이 많기 때문이다.
SC/PL 스캐폴드에 비하여 GF/PL 스캐폴드는 생체내에서 뼈 재생능을 향상시켰다. PLGA/HA 스캐폴드 중의 PLGA는 골형성에 대하여 생체 불활성이다. 그러나, 스캐폴드 표면에 노출된 HA는 골형성을 자극한다. GF/PL 스캐폴드 표면의 향상된 골형성능은 스캐폴드 표면에 노출된 HA 입자와 주변 조직으로부터 이동하는 골모 세포가 직접 접촉하여, 세포 증식 및 골모 세포 분화를 자극하는 것으로부터 기인할 수 있다. 반대로, SC/PL 스캐폴드는 폴리머로 피복된 HA 입자를 함유하는데, 이는 골모 세포와 HA의 상호 작용을 방해하며, 이에 따라서 골형성 과정을 방해하게 되는 것이다.
이 연구에서, 본 발명자들은 PLGA/HA 복합재 스캐폴드를 제조하기 위하여 나노 크기의 HA 입자를 사용하였다. 고도로 결정성이 높은 HA는 생체내에서 장기간에 걸쳐 분해되기 때문에 불완전하게 분해된 잔류 HA는 완전한 골치유를 방해하거나 둔화시킬 수 있다. 그러므로, HA의 총량을 감소시키는 동시에 스캐폴드 표면에 HA가 노출되는 것을 향상시키기 위하여, 나노 크기의 HA 입자, 즉 표면적이 넓은 HA 입자를 마이크론 크기의 HA 입자 대신에 복합재 스캐폴드를 제조하는 데 사용하였다. 또한, 나노 크기의 HA 입자는 마이크론 크기의 HA 입자에 비하여 골결손부에 이식시 개선된 생활성 및 골성 결합 (osteointegration)을 나타내었다. 마이크론 크기의 HA 입자의 사용에 비하여 나노 크기의 HA 입자를 사용함으로써, 단백질 흡수 및 세포 접착력도 역시 향상된 것으로 보고된 바 있다.
본 발명의 PLGA/HA 복합재 스캐폴드는 SC/PL 스캐폴드에 비하여 친수성 및 골전도성에 있어서의 향상을 나타내었다. 이러한 향상은 스캐폴드 표면에 HA 입자가 더 다량 노출되는 때문일 것으로 생각된다. GF/PL법에 의하여 제조된 생분해성 폴리머/바이오세라믹 복합재 스캐폴드는 통상의 복합재 스캐폴드에 비하여 골결손부의 치료시 골재생능을 향상시킬 수 있었다.
이 기술 분야의 숙련자들은 폴리글리콜산 폴리머가 이들의 골전도성 및 골유도성 때문에 가장 양호하지만, 본 발명에 유사한 결과를 달성하기 위하여 기타의 폴리머도 사용될 수 있다는 사실을 쉽게 알게 될 것이다. 그러한 기타의 폴리머로서는, 생흡수성, 또는 생분해성 합성 폴리머, 예컨대 다가 무수물, 폴리오르토에스테르, 폴리락트산 및 이들의 공중합체 또는 블렌드 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 비분해성 재료도 기질을 형성하는 데에 사용될 수 있다. 적당한 재료의 예로서는, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리비닐 알콜의 유도체, 테플론 및 나일론이 있다. 양호한 비분해성 재료로서는, 폴리비닐 알콜 스폰지, 또는 알킬화 및 이의 아실화 유도체 (에스테르 포함)가 있다. 콜라겐을 사용할 수 있으나, 조절이 불가능하므로 좋지 않다. 이들 재료는 시판되고 있다. 폴리메타크릴레이트 및 실리콘 폴리머를 비롯한 비분해성 폴리머 재료도 생장하는 세포의 최종 위치에 따라서 사용될 수 있다.
이 기술 분야의 숙련자들은 골이식편 재료의 사용에 익숙하다. 본 발명은 기타의 골이식편 재료와 동일한 방식으로 사용될 수 있다. 양호한 전달계에 있어서, 골이식편 재료는 폴리에틸렌 글리콜과 혼합되어 페이스트를 형성한다. 재료는 미리 혼합하여 사용하기 쉽도록 시린지 형태로 판매될 수 있고, 또는 사용시에 혼합하여 편리한 수단을 통하여 전달시킬 수 있다. 상기 재료가 건식 상태로 제공되는 경우에, 적당한 생적합성 액체를 사용하여 그 재료를 습윤시키고 환자에게 투여하기 위한 페이스트를 만들 수 있다. 이러한 생적합성 액체 습윤제의 예로서는, 덱스트로스, 글루코스, 말토스 또는 염화나트륨 용액, 혈액, 혈청, 혈소판 농축물, 골수 채취물 및 윤활액이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 생체액은 생물학적 소스로부터 채취된 형태일 수 있고, 또는 한 가지 이상의 소정의 유용한 기술을 사용하여 처리할 수 있는데, 이러한 기술의 예를 들자면 분리 기술, 예컨대 여과 (마크로 여과, 마이크로 여과 또는 한외 여과), 정제 기술, 예컨대 투석, 농축술 및 멸균술 등이 있다.
이 기술 분야의 숙련자들은 단백질, 생장 인자, 세포, 줄기 세포, 골모 세포 또는 기타의 골생장 또는 골이식편의 성숙을 촉진하는 기타의 생물학적 성분들을 인식하게 될 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 설명은 성격상 단지 예시적인 것으로서, 본 발명의 요지를 벗어나지 않는 변형들도 본 발명의 범위 내에 속하는 것이다. 이들 변형은 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 아니하는 것으로 이해하여야 한다.
참고 문헌:
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Figure 112008069797853-PCT00002
Figure 112008069797853-PCT00003
Figure 112008069797853-PCT00004
Figure 112008069797853-PCT00005

Claims (34)

  1. 생적합성 폴리머와 하이드록시아파타이트 입자의 직경이 1.0 ㎛ 이하인 하이드록시아파타이트로 된 복합재로 이루어진 것을 특징으로 하는 골이식편 생체 적응 재료.
  2. 제1항에 있어서, 용매 캐스팅 입자 침출법 또는 가스 발포 입자 침출법에 의하여 스캐폴드 (scaffold)가 제조되는 것인 골이식편 생체 적응 재료.
  3. 제1항에 있어서, 상기 생체 적응 재료는 크기가 200 ㎛ 이하인 세공을 함유하는 것인 골이식편 생체 적응 재료.
  4. 제1항에 있어서, 생체 적응 재료의 표면에 아파타이트로 된 접착성의 균질한 피막을 더 포함하는 것인 PLGA/하이드록시아파타이트로 된 골이식편 생체 적응 재료.
  5. 제1항에 있어서, 생체 적응 재료의 표면에 아파타이트로 된 접착성의 균질한 피막을 더 포함하는 것인 PLGA/하이드록시아파타이트로 된 골이식편 생체 적응 재료.
  6. 제1항에 있어서, 생적합성 폴리머 대 하이드록시아파타이트의 비율은 약 1:2 내지 약 2:1인 것인 골이식편 생체 적응 재료.
  7. 제1항에 있어서, 상기 생적합성 폴리머 대 하이드록시아파타이트의 비율은 약 1:1인 것인 골이식편 생체 적응 재료.
  8. 제1항에 있어서, 상기 생적합성 폴리머 대 NaCl의 비율은 1:4 내지 1:18 범위인 것인 골이식편 생체 적응 재료.
  9. 제1항에 있어서, 상기 생적합성 폴리머 대 NaCl의 비율은 약 1:9인 것인 골이식편 생체 적응 재료.
  10. 제3항에 있어서, 상기 세공은 염을 세척함으로써 생성되는 것인 골이식편 생체 적응 재료.
  11. 제3항에 있어서, 세공의 직경은 대략 100 ㎛ 내지 200 ㎛인 것인 골이식편 생체 적응 재료.
  12. 제1항에 있어서, 상기 생적합성 폴리머는 폴리 글리콜산, 폴리 락트산, 폴리 락틱 코 글리콜산 중 1종 이상으로 이루어지는 것인 골이식편 생체 적응 재료.
  13. 제1항에 있어서, 상기 생적합성 폴리머는 폴리 락틱 코 글리콜산인 것인 골이식편 생체 적응 재료.
  14. 폴리락틱 코 글리콜산 폴리머와 입자의 직경이 1.0 ㎛ 이하인 하이드록시아파타이트로 된 복합재로 이루어진 것을 특징으로 하는 골이식편 생체 적응 재료.
  15. 제1항에 있어서, 용매 캐스팅 입자 침출법 또는 가스 발포 입자 침출법에 의하여 스캐폴드가 제조되는 것인 골이식편 생체 적응 재료.
  16. 제1항에 있어서, 상기 생체 적응 재료는 크기가 200 ㎛ 이하인 세공을 함유하는 것인 골이식편 생체 적응 재료.
  17. 제1항에 있어서, 생체 적응 재료의 표면에 아파타이트로 된 접착성의 균질한 피막을 더 포함하는 것인 골이식편 생체 적응 재료.
  18. 제1항에 있어서, 생체 적응 재료 표면에 아파타이트로 된 접착성의 균질한 피막을 더 포함하는 것인 골이식편 생체 적응 재료.
  19. 제1항에 있어서, 상기 생적합성 폴리머 대 하이드록시아파타이트 비율은 약 1:1인 것인 골이식편 생체 적응 재료.
  20. 제3항에 있어서, 상기 세공은 염을 세척함으로써 생성되는 것인 골이식편 생체 적응 재료.
  21. 제3항에 있어서, 상기 세공의 직경은 대략 100 ㎛ 내지 200 ㎛인 것인 골이식편 생체 적응 재료.
  22. 제1항에 있어서, 상기 생적합성 폴리머는 폴리 글리콜산, 폴리 락트산, 폴리 락틱 코 글리콜산 중 1종 이상으로 이루어지는 것인 골이식편 생체 적응 재료.
  23. 제1항에 있어서, 상기 생적합성 폴리머는 폴리 락틱 코 글리콜산인 것인 골이식편 생체 적응 재료.
  24. 입경이 약 100 내지 200 ㎛인 입자로부터 생적합성 폴리머 및 염 입자들을 선택하는 단계와,
    입경이 약 1 ㎛ 이하인 하이드록시아파타이트 입자들을 선택하는 단계와,
    생적합성 폴리머와 하이드록시 아파타이트 및 NaCl 입자들을 혼합하는 단계와,
    상기 입자 혼합물을 몰드에 투입하는 단계와,
    상기 입자 혼합물을 매우 고압에서 압축하는 단계와,
    새로이 형성된 복합재 스캐폴드를 고압 가스에 노출시키는 단계와,
    복합재 스캐폴드 표면의 가스 압력을 감소시켜 압력을 주변 압력으로 복귀시키는 단계와,
    상기 복합재 스캐폴드를 수용액 중에 침지시켜 상기 염 입자들을 용해 및 침출시키는 단계와,
    새로운 복합재 생체 적응 재료를 세정하고 건조시키는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 골이식편 재료의 제조 방법.
    제1항에 있어서, 생적합성 폴리머 대 하이드록시아파타이트의 비율은 약 1:2 내지 약 2:1인 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 생적합성 폴리머 대 하이드록시아파타이트의 비율은 약 1:1인 것인 방법.
  26. 제24항에 있어서, 상기 생적합성 폴리머 대 NaCl의 비율은 1:4 내지 1:18인 것인 방법.
  27. 제24항에 있어서, 상기 생적합성 폴리머 대 NaCl의 비율은 약 1:9인 것인 방법.
  28. 제24항에 있어서, 상기 생적합성 폴리머는 폴리 글리콜산, 폴리 락트산, 폴리 락틱 코 글리콜산 중 1종 이상으로부터 선택되는 것인 방법.
  29. 제24항에 있어서, 상기 염은 NaCl인 것인 방법.
  30. 제24항에 있어서, 상기 압축 압력은 1000 내지 4000 psi인 것인 방법.
  31. 제24항에 있어서, 상기 압축 압력은 2000 psi인 것인 방법.
  32. 제24항에 있어서, 상기 고압 가스는 압력이 400 내지 1600 psi인 것인 방법.
  33. 제24항에 있어서, 상기 고압 가스는 압력이 800 psi인 것인 방법.
  34. 제24항에 있어서, 상기 방법은 수중에 NaCl, NaHCO3, Na2SO4, KCl, K2HPO4, MgCl2·6H2O, 및 CaCl2·2H2O를 함유하는 인공 체액 (SBF) 중에 상기 생체 적응 재료를 침지시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
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