CN114870074B - 一种基于淫羊藿苷功能化聚乳酸仿生骨质材料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于淫羊藿苷功能化聚乳酸的仿生骨基质材料及其制备方法，其通过化学接枝方式将聚乳酸‑羟基乙酸共聚物引入到棒状羟基磷灰石表面，并且通过化学接枝法，将骨质疏松治疗作用的淫羊藿苷接入到前述接枝材料中，进而得到具有优异的稳定性，且从表面形态分析具有三维互通孔状结构的ICA‑MPLGA‑g‑HAP材料。该ICA‑MPLGA‑g‑HAP材料可作为仿生骨质材料得到应用，有望成为生物医学应用潜力的功能化聚乳酸材料。

Description

一种基于淫羊藿苷功能化聚乳酸仿生骨质材料及其制备方法

技术领域

本发明属于骨组织工程支架材料技术领域，具体涉及一种基于淫羊藿苷功能化聚乳酸仿生骨质材料及其制备方法。

背景技术

近年来，随着人口寿命的延长和人口老龄化的加剧，骨质疏松症已经成为影响人类健康的重要疾病之一。目前，药物治疗骨质疏松主要分为全身给药和局部药物缓释，应用的药物包括抗骨吸收类如双膦酸盐和降钙素，促骨形成类如甲状旁腺激素类，和兼有抗吸收及促形成作用的药物。尽管这些药物在临床上得到广泛应用，但无法避免在治疗中产生的副作用；因而，对于大尺寸骨缺损的治疗和修复，组织工程化支架的兴起为解决临床难题带来了新的希望。

骨质疏松性骨折的本质特征在于软骨内成骨延缓、骨痴改建加速且质量下降、胶原结构疏松、应力传导不理想。通过手术内固定将骨修复植入体置于骨折处，以其提供良好的愈合环境并增强愈合能力，是骨质疏松性骨折的一种重要治疗方法。骨性结合理论奠定了骨修复种植学的生物学基础。骨性结合就是钛基植入体(纯钛或钛合金)表面与骨组织形成化学结合的能力；这种结合使得植入体表面与骨组织直接产生牢固的骨性结合，而不是被纤维组织所隔离，即植入体与骨组织产生骨融合。

骨折手术内固术的成功与植入体的早期骨整合密切相关。排除外科操作技术和患者个体差异等因素的影响，植入体表面形貌和表面化学性质对于植入体与周围骨融合能力具有决定性的影响。然而，在骨质疏松状态下，由于骨组织显微结构受损，骨矿成分和骨基质等比例不断减少，骨质变薄及骨脆性增加等原因，导致植入体与其周围骨的融合度往往不够理想，极大地影响了骨折部位的治疗效果。

淫羊藿,作为中医治疗骨质疏松方剂中使用频率最高的中草药之一，可用于抗骨质疏松以及骨组织修复。淫羊藿水提液和总黄酮提取物均具有抗骨质疏松活性。淫羊藿苷(Icariin，ICA)是淫羊藿中含量最为丰富的黄酮苷类化合物，可以改善心脑血管系统功能、增强机体免疫力及调节内分泌，同时还具有抗肿瘤、抗肝毒、抗缺氧等作用。淫羊藿苷单体能增强去卵巢骨质疏松大鼠抗外力冲击的能力，可有效抑制骨量丢失，改善骨质疏松。

纳米级棒状羟基磷灰石(Hydroxyapatite，HP)表面带有羟基特性，是人体骨骼组织的主要成分。一般棒状羟基磷灰石植入体内后，钙和磷会游离出材料表面被身体组织吸收，并有利于促进新的骨组织生长；引入棒状羟基磷灰石修饰聚乳酸，可增强产物的拉伸机械强度、生物学活性。

聚乳酸(Polylactic acid,PLA)具有良好的生物相容性、生物可降解性且其降解产物可参加体内三羧酸循环等优点，广泛用于骨组织修复、手术缝合线等生物医学方面。然而，聚乳酸疏水性较强、降解过程中的酸性累积易引起肿胀和炎症反应。特别是在进一步改善骨质疏松临床问题下，没有发挥生物学活性的基团，以及细胞特异性识别信号位点，本身机械性能不足等，限制其在骨修复生物医学领域的应用。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的主要目的在于提供一种具有良好的生物可降解性、生物相容性、机械强度和骨质疏松改善活性的基于淫羊藿苷功能化聚乳酸的仿生骨基质材料。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面：一种基于淫羊藿苷功能化聚乳酸的仿生骨基质材料，

其中X、Y的取值范围为1-1500。

值得说明的是：上述基于淫羊藿苷功能化聚乳酸的仿生骨基质材料是以淫羊藿苷(Icariin，ICA)、纳米级棒状羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HAP)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Poly(L-lactide-co-glycolide),PLGA)、马来酸酐(Maleic anhydride,MA)为原料，以棒状羟基磷灰石表面羟基为引发基团，通过聚合法将羟基封端的聚乳酸以共价化学键的方式接枝到棒状羟基磷灰石表面表面，获得材料PLGA-g-HAP；再引入具有良好细胞相容性的马来酸酐，获得具有可开环活性基团的MPLGA-g-HAP；最后引入具有良好骨质疏松改性性能的淫羊藿苷，开环马来酸酐并共价接枝ICA，获得ICA-MPLGA-g-HAP仿生骨基质材料。

本发明的目的在于还提供了一种上述基于淫羊藿苷功能化聚乳酸的仿生骨基质材料的制备方法，包括如下步骤：

1)将聚乳酸-羟基乙酸共聚物与预处理好的棒状羟基磷灰石加入反应容器中，再向该反应容器中加入甲苯、辛酸亚锡和六亚甲基二异氰酸酯，室温下搅拌均匀后，加热反应，随后分离干燥，得PLGA-g-HAP；

2)将步骤1)制备所得的PLGA-g-HAP溶于二甲基甲酰胺有机溶剂中，在加入过氧化二苯甲酰和马来酸酐，充分搅拌均匀后，于室温下真空干燥至恒重，得到反应混合物；

3)在氮气的保护下，将步骤3)所得的反应混合物加热至熔融状态，在搅拌下持续反应4-6h，反应产物用三氯甲烷纯化，得MPLGA-g-HAP；

4)将步骤4)制备所得的MPLGA-g-HAP分散到二甲基甲酰胺中，再加入六亚甲基二异氰酸酯和辛酸亚锡，在氮气保护下，在60℃下持续搅拌反应3h，然后再加入淫羊藿苷，并在60℃下再持续搅拌反应3h，反应结束后产物真空干燥，再用异丙醇萃取48h，倒出萃取液，冷冻干燥，即得ICA-MPLGA-g-HAP。

进一步，步骤1)中的所述预处理为：将棒状羟基磷灰石和磷酸，分散在蒸馏水中，超声搅拌30分钟，再在机械搅拌下，于97℃下回流3h，静置后分层，将上清的蒸馏水倒出，然后用蒸馏水反复洗涤3次，直至pH值为6.5-7.5，真空干燥备用。

进一步，步骤1)中的加热反应，随后分离干燥具体为：在120℃的温度下，磁力搅拌反应6h，反应完成后产物离心分离，用氯仿洗涤后真空干燥，经初步干燥后，再次溶解提纯，重复3-4次，最终产物在常温条件下，真空干燥48h。

进一步，所述棒状羟基磷灰石的粒径为20-60nm，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为8-10万。

进一步，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物与棒状羟基磷灰石的质量比为2:1。

进一步，所述PLGA-g-HAP与马来酸酐的质量比为10:1。

进一步，所述辛酸亚锡的质量浓度为0.01％。

进一步，所述MPLGA-g-HAP与淫羊藿苷的质量比为50-100:1。

本发明所提供的基于淫羊藿苷功能化聚乳酸的仿生骨基质材料的制备方法，其反应过程及涉及到的主要反应方程式为：

与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：

本发明所提供的基于淫羊藿苷功能化聚乳酸的仿生骨基质材料，其通过化学接枝方式将羟基封端的聚乳酸引入到棒状羟基磷灰石表面，并且通过化学接枝法，将骨质疏松治疗作用的淫羊藿苷接入到前述接枝材料中，制备得到稳定性好且从表面形态分析具有三维互通孔状结构的ICA-MPLGA-g-HAP材料，可作为仿生骨质材料得到应用，是一种具有生物医学应用潜力的功能化聚乳酸材料。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例2中制备所得的基于淫羊藿苷功能化聚乳酸的仿生骨基质材料的C13-NMR图谱；

图2为本发明实施例2中制备所得的基于淫羊藿苷功能化聚乳酸的仿生骨基质材料的扫描电镜图(1000倍)；

图3为本发明实施例2中制备所得的基于淫羊藿苷功能化聚乳酸的仿生骨基质材料的扫描电镜图(10000倍)；

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

【实施例1】仿生骨基质材料的制备

实施方式1：

1)将60nm的棒状羟基磷灰石和6g磷酸，分散在120mL蒸馏水中，超声搅拌30分钟，再在机械搅拌下，于97℃下回流3h，静置后分层，将上清的蒸馏水倒出，然后用蒸馏水反复洗涤3次，直至pH值为6.8，真空干燥备用；

2)将10g聚乳酸-羟基乙酸共聚物(分子量为8万)与预处理好的5g棒状羟基磷灰石加入反应容器中，再向该反应容器中加入15mL甲苯、0.005g浓度为0.01％的辛酸亚锡和0.1g的六亚甲基二异氰酸酯，室温下搅拌均匀后，在120℃的温度下，磁力搅拌反应6h，反应完成后产物离心分离，用氯仿洗涤后真空干燥，经初步干燥后，再次溶解提纯，重复3-4次，最终产物在常温条件下，真空干燥48h，得PLGA-g-HAP；

3)将步骤1)制备所得的PLGA-g-HAP 5g溶于10ml二甲基甲酰胺有机溶剂中，再加入0.005g过氧化二苯甲酰和0.5g马来酸酐，充分搅拌均匀后，于室温下真空干燥至恒重，得到反应混合物；

4)在氮气的保护下，将步骤3)所得的反应混合物加热至熔融状态，在搅拌下持续反应4-6h，反应产物用三氯甲烷纯化，得MPLGA-g-HAP；

5)将步骤4)制备所得的MPLGA-g-HAP 5g分散到50mL二甲基甲酰胺中，再加入0.1g六亚甲基二异氰酸酯和0.005g质量浓度为0.01％的辛酸亚锡，在氮气保护下，在60℃下持续搅拌反应3h，然后再加入0.05g淫羊藿苷，并在60℃下再持续搅拌反应3h，反应结束后产物真空干燥，再用异丙醇萃取48h，倒出萃取液，冷冻干燥，即得ICA-MPLGA-g-HAP。

实施方式2：

1)将5g棒状羟基磷灰石(粒径为20nm)和6g磷酸，分散在120mL蒸馏水中，超声搅拌30分钟，再在机械搅拌下，于97℃下回流3h，静置后分层，将上清的蒸馏水倒出，然后用蒸馏水反复洗涤3次，直至pH值为7，真空干燥备用；

2)将10g聚乳酸-羟基乙酸共聚物(分子量为9万)与预处理好的5g棒状羟基磷灰石加入反应容器中，再向该反应容器中加入经除水处理后的15ml甲苯、0.005g质量浓度为0.01％的辛酸亚锡和0.1g的六亚甲基二异氰酸酯，室温下搅拌均匀后，在120℃的温度下，磁力搅拌反应6h，反应完成后产物离心分离，用氯仿洗涤后真空干燥，经初步干燥后，再次溶解提纯，重复3-4次，最终产物在常温条件下，真空干燥48h，得PLGA-g-HAP；

3)取步骤2)制备所得的PLGA-g-HAP 5g溶于10ml二甲基甲酰胺有机溶剂中，再加入0.005g过氧化二苯甲酰和0.5g马来酸酐，充分搅拌均匀后，于室温下真空干燥至恒重，得到反应混合物；

4)在氮气的保护下，将步骤3)所得的反应混合物加热至熔融状态，在搅拌下持续反应4-6h，反应产物用三氯甲烷纯化，得MPLGA-g-HAP；

5)取步骤4)制备所得的MPLGA-g-HAP 5g分散到50mL二甲基甲酰胺中，再加入0.1g六亚甲基二异氰酸酯和0.005g质量浓度为0.01％辛酸亚锡，在氮气保护下，在60℃下持续搅拌反应3h，然后再加入1mg淫羊藿苷，并在60℃下再持续搅拌反应3h，反应结束后产物真空干燥，再用异丙醇萃取48h，倒出萃取液，冷冻干燥，即得ICA-MPLGA-g-HAP。

实施方式3：

1)将5g棒状羟基磷灰石(粒径为40nm)和6g磷酸，分散在120mL蒸馏水中，超声搅拌30分钟，再在机械搅拌下，于97℃下回流3h，静置后分层，将上清的蒸馏水倒出，然后用蒸馏水反复洗涤3次，直至pH值为7.2，真空干燥备用；

2)将10g聚乳酸-羟基乙酸共聚物(分子量为10万)与预处理好的5g棒状羟基磷灰石加入反应容器中，再向该反应容器中加入经除水处理后的15ml甲苯、0.005g质量浓度为0.01％的辛酸亚锡和0.1g的六亚甲基二异氰酸酯，室温下搅拌均匀后，在120℃的温度下，磁力搅拌反应6h，反应完成后产物离心分离，用氯仿洗涤后真空干燥，经初步干燥后，再次溶解提纯，重复3-4次，最终产物在常温条件下，真空干燥48h，得PLGA-g-HAP；

3)取步骤2)制备所得的PLGA-g-HAP 5g溶于10ml二甲基甲酰胺有机溶剂中，再加入0.005g过氧化二苯甲酰和0.5g马来酸酐，充分搅拌均匀后，于室温下真空干燥至恒重，得到反应混合物；

4)在氮气的保护下，将步骤3)所得的反应混合物加热至熔融状态，在搅拌下持续反应4-6h，反应产物用三氯甲烷纯化，得MPLGA-g-HAP；

5)取步骤4)制备所得的MPLGA-g-HAP 5g分散到50mL二甲基甲酰胺中，再加入0.1g六亚甲基二异氰酸酯和0.005g质量浓度为0.01％辛酸亚锡，在氮气保护下，在60℃下持续搅拌反应3h，然后再加入0.1g淫羊藿苷，并在60℃下再持续搅拌反应3h，反应结束后产物真空干燥，再用异丙醇萃取48h，倒出萃取液，冷冻干燥，即得ICA-MPLGA-g-HAP。

【实施例2】仿生骨基质材料的检测

本实施例2以实施例1中实施方式2制备所得的基于淫羊藿苷功能化聚乳酸的仿生骨基质材料为例，进行相关的测试。

1)对基于淫羊藿苷功能化聚乳酸的仿生骨基质材料的进行C13-NMR检测，其结果如图1所示，从图中可以看出，其中δ69.20ppm归属于聚乳酸主链上次甲基碳；δ16.89ppm归属于聚乳酸主链上甲基碳；δ169.69ppm归属于聚乳酸主链上羰基碳；δ162.89ppm归属于马来酸酐开环接枝ICA后形成的羰基碳；δ22.48ppm和δ22.16ppm归属于HDI上的亚甲基碳；δ175.10ppm归属于氨基甲酸酯上的羰基碳，说明成功的制备出了基于淫羊藿苷功能化聚乳酸的仿生骨基质材料。

2)对基于淫羊藿苷功能化聚乳酸的仿生骨基质材料的进行电镜扫描，如图2和图3所示；

将ICA-MPLGA-g-HAP材料经过液氮快速冻干处理，再通过扫描电镜(SEM)分析该材料的表面形态，实验结果如图2和图3所示，从图中可以看出，从放大倍数为1000情况分析，ICA-MPLGA-g-HAP材料呈现颗粒或棒状分散，且形成带有空隙的三维结构；从放大倍数为10000情况分析，终产物具备良好的空间结构，且已形成大孔小孔连续贯通形态；说明该基于淫羊藿苷功能化聚乳酸的仿生骨基质材料可作为仿生骨质材料得到应用，是一种具有生物医学应用潜力的功能化聚乳酸材料。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

Claims (5)

1.一种基于淫羊藿苷功能化聚乳酸的仿生骨基质材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将聚乳酸-羟基乙酸共聚物与预处理好的棒状羟基磷灰石加入反应容器中，再向反应容器中加入甲苯、辛酸亚锡和六亚甲基二异氰酸酯，室温下搅拌均匀后，加热反应，随后分离干燥，得PLGA-g-HAP；

2)将步骤1)制备所得的PLGA-g-HAP溶于二甲基甲酰胺有机溶剂中，在加入过氧化二苯甲酰和马来酸酐，充分搅拌均匀后，于室温下真空干燥至恒重，得到反应混合物；

3)在氮气的保护下，将步骤3)所得的反应混合物加热至熔融状态，在搅拌下持续反应4-6h，反应产物用三氯甲烷纯化，得MPLGA-g-HAP；

4)将步骤4)制备所得的MPLGA-g-HAP分散到二甲基甲酰胺中，再加入六亚甲基二异氰酸酯和辛酸亚锡，在氮气保护下，在60℃下持续搅拌反应3h，然后再加入淫羊藿苷，并在60℃下再持续搅拌反应3h，反应结束后产物真空干燥，再用异丙醇萃取48h，倒出萃取液，冷冻干燥，即得ICA-MPLGA-g-HAP；

其中所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物与棒状羟基磷灰石的质量比为2:1；所述PLGA-g-HAP与马来酸酐的质量比为10:1；所述MPLGA-g-HAP与淫羊藿苷的质量比为50-100:1。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中的所述预处理为：将棒状羟基磷灰石和磷酸，分散在蒸馏水中，超声搅拌30分钟，再在机械搅拌下，于97℃下回流3h，静置后分层，将上清的蒸馏水倒出，然后用蒸馏水反复洗涤3次，直至pH值为6.5-7.5，真空干燥备用。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中的加热反应，随后分离干燥具体为：在120℃的温度下，磁力搅拌反应6h，反应完成后产物离心分离，用氯仿洗涤后真空干燥，经初步干燥后，再次溶解提纯，重复3-4次，最终产物在常温条件下，真空干燥48h。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述棒状羟基磷灰石的粒径为20-60nm，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为8-10万。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述辛酸亚锡的质量浓度为0.01％。

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