KR20140140204A

KR20140140204A - 골 이식재 조성물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20140140204A
Application number: KR20130060588A
Authority: KR
Inventors: 유현승; 민경단
Original assignee: 주식회사 바이오알파
Priority date: 2013-05-28
Filing date: 2013-05-28
Publication date: 2014-12-09
Also published as: KR101472046B1; WO2014193163A1

Abstract

본 발명은 골 이식재 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 일정 혼합 비율의 인산 칼슘 화합물 입자, 실크 피브로인 및 폴록사머를 포함하는 다공성 지지체 형태로서 젖은 상태에서 다양하게 형태 변경이 가능하며 복원력도 우수하여 이식이 간편하며 골 결손부에 치밀하게 충전이 가능한 골 이식재 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

골 이식재 조성물 및 이의 제조방법{An injectable composition for bone defects and a preparation method therof}

골 이식용 생체재료들은 개발 초기에는 생체 내에서 불활성을 갖는 특징에 의존하였으나, 시술 후 주위 조직의 감염 및 염증반응에 의해 사용에 많은 제약이 있었다. 이후 금속, 세라믹, 고분자를 이용한 생체재료 기술의 급속한 발달과 함께 생체불활성(bioinert)보다는 생체적합성(biocompatible)을 갖는 재료를 설계 및 개발하여 사용부위 및 목적에 따라 다양한 종류의 골조직 재생용 생체활성 지지체의 개발에 이르렀다. 이러한 골조직 재생용 생체활성 지지체는 이식되는 위치에 따라 사용되는 물리적 성질이 다르고 주위조직에 대한 독성반응이 없어야 하며 다른 인공장기에 비해 비교적 높은 기계적 물성이 요구된다. 이러한 골조직 재생용 생체활성 지지체는 그 원재료의 특성과 사용목적에 따라 다양한 생체재료로 시판 및 개발되고 있다.

인체에 이식되는 모든 재료들, 특히 골조직 재생을 위한 고분자 재료들은 가공성 및 성형성이 좋거나, 상처 위에 잘 맞도록 제자리 중합성(in-situ polymerization)이 좋아야 한다. 세포들의 접착과 성장 그리고 분화를 위한 적합한 환경을 제공해주어야 하며, 그들의 분해에 의한 부가적인 생성물도 생체적합성을 가져야 한다. 특히, 골 이식용 재료의 경우 신장율이 너무 낮으면 골 이식재의 주입 혹은 치밀 충진시 자유로운 형태 변형이 어려워 사용성이 떨어진다. 또한, 골 이식용 재료의 인장강도가 너무 떨어지면 골 이식재의 주입 혹은 치밀 충진 후 봉합이나 임플란트 식립 단계에서의 위치 고정능력과 외형 유지 특성을 유지하기 어렵다.

따라서, 골 결손부에 이식하기에 적합한 생체적합성 및 물성을 가지며 이식 후 일정 기간 동안 제형 유지성을 갖는 골 이식재 조성물의 개발이 요구된다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 일정 혼합 비율의 인산 칼슘 화합물 입자, 실크 피브로인 및 폴록사머를 포함하는 다공성 지지체 형태의 골 이식재 조성물을 제조하고 상기 조성물이 젖은 상태에서 다양하게 형태 변경이 가능하며 복원력도 우수함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 물성이 우수한 골 이식재 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 물성이 우수한 골 이식재 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 인산 칼슘 화합물 입자 35 내지 65 중량부, 실크 피브로인 25 내지 40 중량부, 및 폴록사머 10 내지 25 중량부를 포함하는 골 이식재 조성물을 제공한다.

본 발명은 인산 칼슘 화합물 입자, 실크 피브로인 및 폴록사머를 일정 혼합 비율로 포함하는 다공성 지지체 형태의 골 이식재 조성물로서 젖은 상태에서 다양하게 형태 변경이 가능하며 복원력도 우수한 골 이식재 조성물을 제공할 수 있다는 점을 특징으로 한다.

즉, 본 발명은 생분해성 고분자인 실크 피브로인과 폴록사머를 사용함으로써 골 이식 후 시간 경과에 따라 생분해될 수 있으며, 사용 직전에 물을 첨가하여 젖은 상태에서 자유로운 형태 변형이 가능하여 이식이 간편하며 부정형의 골 결손부에 치밀하게 충전이 가능하다. 또한, 인산 칼슘 화합물 입자, 실크 피브로인 및 폴록사머를 적정 배합 비율로 포함함으로써 젖은 상태에서 인산 칼슘 화합물 입자와 다공성 지지체 기제의 실크 피브로인과 폴록사머가 이루는 다공성 지지체 형태의 골 이식재 조성물이 더욱 자유롭게 형태 변형을 할 수 있으며, 물과 함께 골형성 단백질을 추가로 첨가하여 사용함으로써 골형성을 더욱 촉진시킬 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "골 이식재 조성물"은 골 결손부에 이식되어 이를 충진하는 재료, 즉 골 결손부 보충재로서 사용되는 조성물을 의미한다. 구체적으로, 본 발명에서, 골 이식재 조성물은 인산 칼슘 화합물을 기초로 한 합성 골 이식재(Alloplastic, Synthetic bone graft materials) 조성물을 의미한다.

본 발명의 골 이식재 조성물은 크게 인산 칼슘 화합물 입자, 실크 피브로인, 및 폴록사머의 3가지 구성요소로 이루어진다.

먼저, 인산 칼슘 화합물 입자는 천연 골과 유사한 성분으로 골이 전도되어 자랄 수 있도록 유도하는 성분이다.

본 발명에서 사용되는 용어 "인산 칼슘 화합물"은 인산과 칼슘을 포함하여 이루어지는 화합물을 의미한다.

본 발명에서, 상기 인산 칼슘 화합물은 하이드록시 아파타이트, 트리칼슘 포스페이트(TCP), 모노칼슘 포스페이트, 테트라칼슘 포스페이트, 디칼슘 포스페이트 또는 이의 조합일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 트리칼슘 포스페이트는 β-트리칼슘 포스페이트(β-TCP, Ca₃(PO₄)₂)일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 생체친화성 및 생체활성이 우수한 점을 고려하여 하이드록시 아파타이트를 사용하였다.

본 발명에서, 상기 하이드록시 아파타이트는 바람직하기로 다공성의 미립자 형태일 수 있다.

본 발명에서, 상기 하이드록시 아파타이트는 하이드록시 아파타이트 분말을 건조시킨 후 바람직하기로 1000 내지 1400℃, 가장 바람직하기로 1200℃에서 소성시켜 얻을 수 있다.

본 발명의 골 이식재 조성물의 나머지 두 구성요소인 실크 피브로인과 폴록사머는 물을 가할 경우 겔 형태를 이루는 하이드로겔 기제로서, 상기 인산 칼슘 화합물 입자를 물리적으로 결합시키는 동시에 자유로운 형태 변형도 가능한 지지체의 골격을 형성하여 골 이식에 적합한 제형을 이루기 위한 수단이다.

본 발명에서는, 생체적합적이며 이식 후 제형 유지성이 뛰어난 골 이식재 조성물을 제공하기 위하여, 생분해성을 가지고 아울러 체온보다 낮은 졸-겔 전이 온도를 갖고 체온 영역에서는 겔 형태를 잘 유지할 수 있는 고분자로서 실크 피브로인과 폴록사머를 사용하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "실크 피브로인(silk fibroin)"은 실크 내에 함유되어 있는 피브로인 성분을 의미한다. 본 발명에서, 실크 피브로인은 일정 인장강도와 신장율을 갖는 다공성 지지체의 골격을 형성하여 건조된 상태에서는 일정 형태를 유지할 수 있고 젖은 상태에서는 하이드로겔을 형성하여 인산 칼슘 화합물 입자를 물리적으로 결합시키는 동시에 자유로운 형태 변형도 가능한 지지체의 골격을 형성하여 골 이식에 적합한 다양한 형태로 변형될 수 있게 하는 역할을 한다. 이에 따라, 본 발명의 골 이식재 조성물은 유통 및 보관 중에는 다공성 지지체의 형태를 이룰 수 있으나, 사용 전에 물을 가하여 변형이 가능한 겔 형태로 골 결손부에 적용할 수 있다.

본 발명에서, 실크 피브로인은 시판되는 것을 구입하여 사용하거나, 실크 중에서 정련공정을 거쳐 직접 분리하여 사용할 수 있다. 실크 피브로인의 분자량은 300,000 내지 400.000 g/mole의 범위를 가질 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "폴록사머"는 폴리프로필렌 글리콜(PPG)의 중심 사슬에 2개의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 사슬이 결합되어 있는 형태의 삼원블록 공중합체(PEO-PPO-PEO)를 의미한다. 일반적으로, 폴록사머 내 PEG/PPG의 비율은 1:9 내지 8:2로 다양할 수 있다. 폴록사머의 분자량은 1,100 내지 14,000 g/mole까지 넓은 범위를 가질 수 있다. 폴록사머는 온도감응형 고분자이다. 본 발명에서, 폴록사머는 골 이식재의 주입성과 성형성을 부여해 주는 역할을 수행할 뿐 아니라 골 결손부에 충진된 이후 빠르게 분해되어 인산칼슘계 골 이식재 성분만 잔류하도록 한다. 상온 영역에서의 주입 용이성과 성형성 및 실온의 유통 과정에서의 제제 안정성을 유지하기 위해 졸-겔 전이 온도가 상대적으로 낮고 점도가 높은 고분자량의 폴록사머가 적당하다. 바람직하기로, 본 발명에서 폴록사머는 체온 영역인 37℃ 부근에서 겔 형태를 유지할 수 있도록 졸-겔 전이 온도가 4 내지 35℃인 것을 사용할 수 있다. 특히, 본 발명에서는, 체온 영역인 37℃ 부근에서 겔 형태 유지성이 뛰어난 폴록사머 407이 가장 바람직하다고 할 수 있다.

본 발명에서, 상기 다공성 지지체 형태의 골 이식재 조성물은 사용 전에 물을 첨가하여 변형이 가능한 겔 형태로 만들어 사용할 수 있다.

본 발명에서, 상기 골 이식재 조성물은 사용 전에 물과 함께 골형성 단백질(bone morphogenic protein, BMP)을 추가로 첨가하여 사용할 수 있다.

본 발명에서, 상기 골형성 단백질은 BMP-2, BMP-3, BMP-3b, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15, BMP-16, BMP-17, BMP-18, 또는 이의 조합일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 상기한 바와 같이 일정 함량의 실크 피브로인과 폴록사머의 조합을 사용함으로써 실크 피브로인 단독이나 상기 함량 범위 밖의 조합에 비해 신장율이 더욱 증가된 골 이식재 조성물을 제공할 수 있다. 신장율이 높을수록 지지체 변형이 가능하기 때문에 골 결손부에 적용시 사용성이 좋다.

특히, 본 발명의 골 이식재 조성물은 신장율이 35 내지 45% 범위일 수 있다. 본 발명은 상기 범위의 신장율을 가짐에 따라 젖은 상태에서 자유로운 형태 변형을 나타내어 이식 시 골 결손부에 용이하게 충진될 수 있어 이식재로 사용하기에 적합한 물성을 나타낸다.

본 발명에서 사용되는 용어 "신장율"은 골 이식재 조성물의 원래 길이에 대한 외압에 의해 끊어질 때까지 늘어난 길이와 원래 길이의 차이의 비율을 백분율로 나타낸 값으로 골 이식재 조성물의 신장 비율을 의미한다. 즉, 신장율은 하기 수학식 1로 나타낼 수 있다.

[수학식 1]

신장율 e = (L_f - L_o)/ L_o

상기 식에서, L_f는 끊어질 때까지의 길이이고, L_o는 원래 길이를 나타낸다.

신장율이 높을수록 형태 변형이 가능하기 때문에 젖은 상태에서 골 이식재의 주입 혹은 치밀 충진시 사용성이 좋다.

본 발명에서 사용되는 용어 "인장강도(tensile strength)"는 인장 하중에 의해서 시료편이 끊어질 때까지의 최대응력으로, 파단까지의 최대하중을 시험편의 원래의 단면적으로 나눈 값을 의미한다. 인장강도가 클수록 지지체의 파단까지 큰 힘이 필요함을 의미하며, 이는 골 이식재 조성물 제형이 골 결손부에 적용될 때는 물론 유통 및 보관 중에도 형태 유지가 잘 될 수 있음을 아울러 의미할 수 있다.

본 발명에서 측정하는 신장율 및 인장강도는 만능재료시험기(DTU-900MH200kN, Dae Kyung Tech, 한국)를 사용하여 측정될 수 있다. 구체적으로, 신장율 및 인장강도 측정 시 시편은 6mm, 길이 115mm의 아령 모양의 형태로 성형한 후 만능재료시험기를 사용하여 측정할 수 있다. 이때, 그립 간의 초기 거리는 80mm이고 50mm/min의 시험속도를 유지하여 10회 반복 시험 후 평균을 산출한다.

상기에서 설명한 바와 같은 본 발명의 골 이식재 조성물은 실크 피브로인 및 폴록사머가 형성하는 다공성 지지체 내에 인산 칼슘 화합물 입자들이 밀집되어 물리적으로 결합되어 있는 것으로, 골 결손부에 이식되기 직전에 물을 첨가하여 다공성 지지체 형태의 골 이식재 조성물을 하이드로겔화시킬 수 있고, 상기 하이드로겔화되어 자유로운 변형이 가능한 골 이식재 조성물은 골 결손부에 이식된 후 하이드로겔은 분해되어 나오고 인산 칼슘 화합물 입자들은 밀집된 형태 그대로 유지되며, 하이드로겔이 나온 뒤의 인산 칼슘 화합물 입자 사이의 공간으로 뼈가 자라 들어가게 된다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 골 이식재 조성물의 제조방법을 제공한다.

1) 실크 피브로인 수용액을 제조하는 단계(단계 1);

2) 폴록사머 수용액을 제조하는 단계(단계 2);

3) 인산 칼슘 화합물 입자를 상기 실크 피브로인 수용액과 폴록사머 수용액의 혼합 용액에 인산 칼슘 화합물 입자 35 내지 65 중량부, 실크 피브로인 25 내지 40 중량부, 및 폴록사머 10 내지 25 중량부가 되도록 혼합하는 단계(단계 3); 및

4) 상기 혼합물을 동결건조시키는 단계(단계 4).

상기 단계 1은, 실크 피브로인 수용액을 제조하는 단계로서, 실크 피브로인을 수(water) 중에 용해시켜 실크 피브로인 수용액을 얻는 단계이다.

먼저, 실크 피브로인은 실크로부터 정련 공정을 거쳐 분리하여 사용할 수 있다.

실크는 피브로인, 세리신, 왁스, 색소 및 무기물 등의 조성으로 이루어져 있다. 본 발명에서는 실크 중에서 피브로인만을 이용하는 것이므로 피브로인을 제외한 성분을 제거하기 위해 정련공정을 실시한다. 정련공정은 마르세유 비누(Marseilles soap), 중탄산나트륨(Sodium bicarbonate), 탄산나트륨(Sodium carbonate), 수산화나트륨(Sodium Hydroxide), 규산나트륨(Sodium silicate) 및 파파인효소 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 사용하여 90 내지 95℃에서 30분 내지 2시간 동안 가열 처리하고, 수세 후 건조시킴으로써 수행할 수 있다.

바람직하기로, 상기 단계 1)은 하기 단계 a) 내지 b)를 포함할 수 있다:

a) 실크 피브로인을 브롬화리튬(Lithium Bromide), 염화칼슘(Calcium Chloride), 염화리튬(Lithium Chloride), 염화아연(Zinc Chloride)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 염을 포함하는 수 중에 용해시켜 실크 피브로인 수용액을 얻는 단계; 및

b) 셀룰로오스 투석막을 사용하여 투석 공정을 실시하여 상기 실크 피브로인 수용액 내에 존재하는 염을 제거하는 단계.

바람직하기로, 상기 단계 a)에서 실크 피브로인 용해시, 80 내지 90℃에서 약 1 내지 4시간 동안 가온 조건으로 실시할 수 있다.

바람직하기로, 상기 단계 b)는 분자량(M. W.) 6,000-12,000의 셀룰로오스 투석막에 실크 피브로인 용액을 넣고 밀봉한 다음, 정제수 및 PEG(Polyethylene glycol) 수용액 내에 담가 마그네틱 바를 이용하여 약 3일간 교반하면서 1일 2회 정제수 및 PEG(Polyethylene glycol) 수용액을 교환하여 염을 제거함으로써 수행할 수 있다.

상기 단계 2는, 폴록사머 수용액을 제조하는 단계로서, 폴록사머를 수 중에 용해시켜 폴록사머 수용액을 제조하는 단계이다.

일 실시예로서, 상기 단계 2는 25g의 폴록사머를 75g 정제수에 넣은 후 4℃ 조건 하에서 100rpm의 속도로 균일 혼합하여 폴록사머 수용액을 제조함으로써 수행할 수 있다.

상기 폴록사머의 종류 및 특징 등은 상기 골 이식재 조성물에서 설명한 바와 동일하다.

상기 단계 3은, 인산 칼슘 화합물 입자를 상기 실크 피브로인 수용액과 폴록사머 수용액의 혼합 용액에 인산 칼슘 화합물 입자 35 내지 65 중량부, 실크 피브로인 25 내지 40 중량부, 및 폴록사머 10 내지 25 중량부가 되도록 혼합하는 단계로서, 단계 1) 및 단계 2)에서 각각 제조한 실크 피브로인 수용액과 폴록사머 수용액을 혼합하여 얻은 혼합 용액에 인산 칼슘 화합물 입자를 일정 비율의 양으로 혼합하는 단계이다.

상기 단계 3)은 상기한 바와 같이 먼저 실크 피브로인 수용액과 폴록사머 수용액을 혼합하여 혼합 용액을 얻은 다음, 인산 칼슘 화합물 입자를 첨가하여 혼합하는 방식으로 수행할 수 있다.

상기 인산 칼슘 화합물 입자의 특징 및 제법 등은 상기 골 이식재 조성물에서 설명한 바와 동일하다.

상기 단계 4는, 상기 혼합물을 동결건조시키는 단계로서, 상기 인산 칼슘 화합물 입자, 실크 피브로인 수용액 및 폴록사머 수용액의 혼합물을 동결건조시켜 골 이식재 조성물을 얻는 단계이다.

본 발명에서, 상기 단계 4)는 상기 인산 칼슘 화합물 입자, 실크 피브로인 수용액 및 폴록사머 수용액의 혼합물을 몰드에 부은 후 바람직하기로 -10℃ 내지 -40℃, 더욱 바람직하기로 -15℃ 내지 -30℃, 가장 바람직하기로 -20℃에서 동결시킨 다음 동결건조를 실시함으로써 수행할 수 있다.

본 발명에서, 상기와 같이 제조된 다공성 지지체 형태의 골 이식재 조성물은 사용 전에 물을 첨가하여 변형이 가능한 겔 형태로 만들어 사용할 수 있다. 또한, 상기 물과 함께 골형성 단백질을 추가로 첨가하여 사용할 수 있으며, 구체적인 골형성 단백질의 종류는 상기 골 이식재 조성물에서 설명한 바와 동일하다.

또한, 본 발명은 하기를 포함하는 골 이식용 키트를 제공한다.

A) 인산 칼슘 화합물 입자 35 내지 65 중량부, 실크 피브로인 25 내지 40 중량부, 및 폴록사머 10 내지 25 중량부를 포함하는 골 이식재 조성물; 및

주입 도구.

본 발명에서, 상기 주입 도구는 포셉, 주사기 및 주사 바늘 등일 수 있다.

본 발명은 일정 혼합 비율의 인산 칼슘 화합물 입자, 실크 피브로인 및 폴록사머를 포함하는 다공성 지지체 형태로서 젖은 상태에서 다양하게 형태 변경이 가능하며 복원력도 우수하여 이식이 간편하며 골 결손부에 치밀하게 충전이 가능한 골 이식재 조성물을 제공할 수 있다.

도 1은 실크 피브로인 용액의 농도에 따른 각 제조된 지지체를 주사전자현미경(SEM)으로 관찰한 결과를 보여주는 사진도이다.
도 2는 실크 피브로인 용액의 농도에 따른 각 제조된 지지체를 젖은 상태에서 지지체의 형태 및 복원력을 확인한 결과를 나타낸다. 이때 a)는 4 wt%, b)는 8 wt%, c는 12 wt%인 경우를 나타낸다.
도 3은 하이드록시아파타이트 미립자/실크 피브로인 혼합비에 따른 각 제조된 지지체를 젖은 상태에서 지지체의 형태 및 복원력을 확인한 결과를 나타낸다. 이때 a)는 75/25, b)는 50/50, c)는 25/75인 경우를 나타낸다.
도 4는 실크 피브로인/폴록사머 407 혼합비에 따른 각 제조된 지지체를 젖은 상태에서 지지체의 형태 및 복원력을 확인한 결과를 나타낸다. 이때 a)는 20/80, b)는 50/50, c)는 80/20인 경우를 나타낸다.
도 5는 하이드록시아파타이트 미립자/실크 피브로인/폴록사머 407 혼합비에 따른 각 제조된 지지체를 젖은 상태에서 지지체의 형태 및 복원력을 확인한 결과를 나타낸다. 이때 a)는 50/10/40, b)는 50/25/25, c)는 50/40/10인 경우를 나타낸다.
도 6은 본 발명 골 이식재 조성물의 외관 모습(A) 및 단면 형태(B)를 보여주는 사진도이다.
도 7은 비교예 1, 비교예 2 및 실시예 1, 실시예 2의 골 이식재 조성물의 세포독성시험 결과를 나타낸다.

이하, 실시예를 통해 본 발명의 구성 및 효과를 보다 더 구체적으로 설명하고자 하나, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일뿐 본 발명의 범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실험예 1: 실크 피브로인 용액의 농도 선정

4 wt%, 8 wt%, 12 wt% 농도의 실크 피브로인 용액을 제조 후 다공성 지지체를 제조한 다음 인장강도 및 신장율을 측정하였다.

그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

실크 피브로인 농도(wt %)	하중 (N)	인장강도(N/mm²)	신장율(%)
4	4.7072	0.0941	12.658
8	11.6895	0.2338	33.318
12	12.7585	0.2552	49.574

상기 표 1을 통해 알 수 있는 바와 같이, 4 wt% 실크 피브로인 용액으로 제조된 다공성 지지체는 8 wt%, 12 wt% 실크 피브로인 용액으로 제조된 다공성 지지체에 비해 인장강도와 신장율이 낮은 것을 확인할 수 있었다. 8 wt%, 12 wt% 실크 피브로인 용액으로 제조된 다공성 지지체의 높은 신장율로 인해 지지체의 복원력이 좋을 것으로 예측된다.

또한, 각 제조된 지지체를 주사전자현미경(SEM)으로 관찰하고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1을 통해, 4 wt% 실크 피브로인 용액으로 제조된 다공성 지지체가 8 wt%, 12 wt% 실크 피브로인 용액으로 제조된 다공성 지지체에 비해 기공이 커서 성긴 구조임을 확인할 수 있었다. 이에 따라, 4 wt% 실크 피브로인 용액으로 제조된 다공성 지지체가 8 wt%, 12 wt% 실크 피브로인 용액으로 제조된 다공성 지지체보다 결합이 약할 것으로 예측되며, 이는 상기 인장강도 결과와 일치함을 확인할 수 있었다.

한편, 본 발명에서는 골 결손부에 적용하기 수월하면서도 굴곡진 골 결손부에도 적용이 가능하도록 형태가 자유로우면서도 복원력이 좋은 지지체를 제공하는데, 젖은 상태에서 형태가 다양하게 변형 가능함으로 젖은 상태에서 지지체의 형태 및 복원력을 확인하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2를 통해, 4 wt% 실크 피브로인 용액으로 제조된 다공성 지지체는 젖은 상태에서 형태 변형 후 복원이 되지 않은 것을 확인할 수 있었고, 8 wt%, 12 wt% 실크 피브로인 용액으로 제조된 다공성 지지체는 젖은 상태에서 형태 변형 후 복원이 되는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 실크 피브로인 용액의 농도는 8 내지 12 농도 범위가 최적 범위임을 확인할 수 있다.

실험예 2: 하이드록시아파타이트 미립자 및 실크 피브로인의 혼합비 선정

하이드록시아파타이트 미립자/실크 피브로인의 혼합비를 75/25, 50/50, 25/75, 및 0/100으로 각각 혼합 후 다공성 지지체를 제조한 다음 인장강도 및 신장율을 측정하였다. 또한, 젖은 상태에서 각각의 지지체의 형태 및 복원력을 확인하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

그 결과를 하기 표 2 및 도 3에 나타내었다.

하이드록시아파타이트/ 실크 피브로인 혼합비	하중 (N)	인장강도(N/mm²)	신장율(%)
75/25	10.7285	0.2146	19.770
50/50	9.1300	0.1826	23.328
25/75	11.0200	0.2204	24.022
0/100	12.7585	0.2552	49.574

상기 표 2를 통해, 실크 피브로인 다공성 지지체와 비교하여 인장강도는 큰 차이가 없지만 신장율은 하이드록시아파타이트 미립자의 혼합으로 인하여 감소하는 것을 확인할 수 있다.

그러나, 도 3을 통해, 실크 피브로인의 존재로 인하여 하이드록시아파타이트가 존재하여도 지지체의 복원력과 사용성이 용이해짐을 확인할 수 있었다.

상기 결과를 통해, 하이드록시아파타이트 미립자와 실크 피브로인의 혼합비는 50/50 내지 25/75의 혼합비 범위가 최적 범위임을 확인할 수 있다.

실험예 3: 실크 피브로인 / 폴록사머 407 혼합비 선정

실크 피브로인/폴록사머 407 용액의 혼합비를 20/80, 50/50, 80/20으로 각각 혼합 후 다공성 지지체를 제조한 다음 인장강도 및 신장율을 측정하였다. 또한, 젖은 상태에서 각각의 지지체의 형태 및 복원력을 확인하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

그 결과를 하기 표 3 및 도 4에 나타내었다.

실크 피브로인/폴록사머 혼합비	하중 (N)	인장강도(N/mm²)	신장율(%)
50/50	13.2880	0.2658	71.454
80/20	13.3174	0.2663	53.008
100/0	12.7585	0.2552	49.574

상기 표 3을 통해, 폴록사머 407의 혼합으로 인하여 인장강도는 큰 차이는 없지만 신장율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 신장율이 높을수록 지지체 변형이 가능하기 때문에 골 결손부에 적용 시 사용성이 좋다.

한편, 도 4를 통해, 폴록사머 407이 실크에 비해 많은 함량을 차지하게 되면 지지체가 되어도 결합이 약하여 형태 유지가 되지 않으며 젖은 상태에서 폴록사머 407의 수용성 특성으로 인하여 형태가 유지되지 않음을 확인할 수 있다. 그러나, 실크와 폴록사머 407의 혼합비가 적절하면 단독 실크 지지체와 비교하여 인장강도의 차이가 없으면서 신장율이 개선됨을 확인할 수 있었다.

따라서, 실크 피브로인/폴록사머 용액의 혼합비는 50/50 내지 80/20 혼합비 범위가 최적 범위임을 확인할 수 있다.

실험예 4: 하이드록시아파타이트 미립자/ 실크 피브로인 / 폴록사머 407 혼합비 선정

하이드록시아파타이트 미립자/실크 피브로인/폴록사머 407 혼합비를 50/10/40, 50/25/25, 50/40/10으로 하여 각각 혼합 후 다공성 지지체를 제조한 다음 인장강도 및 신장율을 측정하였다.

그 결과를 하기 표 4 및 도 5에 나타내었다.

하이드록시아파타이트/실크 피브로인/폴록사머 혼합비	하중 (N)	인장강도(N/mm²)	신장율(%)
50/25/25	11.0031	0.2201	41.304
50/40/10	10.7383	0.2148	37.219
0/80/20	13.2880	0.2658	71.454
0/100/0	12.7585	0.2552	49.574

상기 표 4를 통해, 하이드록시아파타이트의 혼합으로 인하여 실크/폴록사머 407 다공성 지지체와 비교하여 인장강도 및 신장율이 감소함을 확인할 수 있었다. 그러나, 실크 다공성 지지체와 비교하여 인장강도 및 신장율의 차이가 크지 않는 것을 확인할 수 있다.

한편, 도 5를 통해, 실크에 비해 폴록사머 407의 함량이 높을수록 지지체의 결합이 약하며 젖은 상태가 되면 하이드록시아파타이트만 남게 됨을 확인할 수 있다. 그러나, 실크와 폴록사머의 적절한 혼합비로 제조된 지지체는 하이드록시아파타이트와 결합이 좋아 젖은 상태에서도 결합을 유지하면서 형태변형이 수월하고 변형 후 복원력이 좋은 것을 확인할 수 있다.

상기 결과를 통해, 하이드록시아파타이트 미립자/실크 피브로인/폴록사머407의 혼합비는 50/25/25 내지 50/40/10 범위가 최적 범위임을 확인할 수 있다.

실시예 1: 하이드록시아파타이트 미립자/ 실크 피브로인 다공성 지지체 제조

상기 실험예 1 내지 2의 결과를 토대로, 하기와 같은 골 재생용 지지체 조성물을 제조하였다.

먼저, 12 wt% 실크 피브로인 수용액을 제조하였다. 상기 제조한 12 wt% 실크 피브로인 수용액 417g(실크 피브로인 50g)과 하이드록시아파타이트 미립자 50g을 혼합한 후, 10×10×50 ㎜ 크기의 몰드에 부운 후 -20℃ 조건 하에서 동결한 다음 3일간 동결건조를 실시하였다. 제조된 다공성 지지체는 EO gas 멸균을 실시하여 골 재생용 지지체를 얻었다.

실시예 2: 하이드록시아파타이트 / 실크 피브로인 / 폴록사머 407 다공성 지지체 제조

상기 실험예 3 내지 4의 결과를 토대로, 하기와 같은 골 재생용 지지체 조성물을 제조하였다.

먼저, 12 wt% 실크 피브로인 수용액을 제조하였다. 이 후, 폴록사머 407 25g과 정제수 75g을 4℃에서 혼합하여 완전 용해시켜 25 wt% 폴록사머 407 수용액을 제조하였다. 그 다음, 하이드록시아파타이트 미립자 50g, 12 wt% 실크 피브로인 수용액 333g(실크 피브로인 40g)과 25 wt% 폴록사머 407 용액 40g(폴록사머 407 10g)을 혼합한 후, 10×10×50 ㎜ 크기의 몰드에 부운 후 -20℃ 조건 하에서 동결한 다음 3일간 동결건조를 실시하였다. 제조된 다공성 지지체는 EO gas 멸균을 실시하여 골 재생용 지지체를 얻었다.

비교예 1: 실크 피브로인 다공성 지지체 제조

먼저, 12 wt% 실크 피브로인 수용액을 제조하였다. 이를 10×10×50 ㎜ 크기의 몰드에 부운 후 -20℃ 조건 하에서 동결한 다음 3일간 동결건조를 실시하였다. 제조된 다공성 지지체는 EO gas 멸균을 실시하여 골 재생용 지지체를 얻었다.

비교예 2: 실크 피브로인 / 폴록사머 407 다공성 지지체 제조

먼저, 12 wt% 실크 피브로인 수용액을 제조하였다. 이 후, 폴록사머 407 25g과 정제수 75g을 4℃에서 혼합하여 완전 용해시켜 25 wt% 폴록사머 407 용액을 제조하였다. 제조된 12 wt% 실크 피브로인 수용액 667g(실크 피브로인 80g)과 25 wt% 폴록사머 407 용액 80g(폴록사머 407 20g)을 혼합한 후 10×10×50 ㎜ 크기의 몰드에 부운 후 -20℃ 조건 하에서 동결한 다음 3일간 동결건조를 실시하였다. 제조된 다공성 지지체는 EO gas 멸균을 실시하여 골 재생용 지지체를 얻었다.

실험예 5: 본 발명 골 이식재 조성물의 형태 조사

상기 실시예 2에서 제조한 본 발명 골 이식재 조성물의 외관 모습을 도 6(A)에 나타내었다.

또한, 상기 실시예 2에서 제조한 본 발명 골 이식재 조성물의 단면 형태를 주사전자현미경(SEM)으로 조사하고, 그 결과를 도 6(B)에 나타내었다.

도 6을 통해, 본 발명 골 이식재 조성물이 일정 지지체 형태를 나타냄을 알 수 있으며, 특히 실크 피브로인 및 폴록사머가 형성하는 다공성 지지체 내에 인산 칼슘 화합물 입자들이 밀집되어 물리적으로 결합되어 있는 것을 확인할 수 있다.

실험예 6: 세포독성시험

비교예 1, 비교예 2 및 실시예 1, 실시예 2의 세포독성시험 결과 모두 세포 생존율이 높은 것을 확인할 수 있었다.

비교예 1, 비교예 2, 실시예 1, 실시예 2의 세포 증식에 미치는 영향을 정량적으로 확인하고자 각 지지체를 용출한 용출액과 쥐 섬유아세포(L-929 mouse fibroblast cells)를 사용하여 MTT assay로 세포의 성장을 확인하였다. 용출조건은 ISO 10993-9에 따라 시험물질 4g당 용매(MEM) 20㎖의 비율로 37±2℃에서 24시간 혈청배지(MEM)에 용출하였다. 96-well plate의 각 well 당 1×10⁵cells/㎖이 되도록 세포를 접종하여 24시간 배양하여 세포의 confluency가 80%정도 되면 각 웰 기존의 배양액을 제거한 후 제품의 용출물, 음성대조군 및 양성대조군을 각 웰에 1㎖씩 처리하여 48시간 배양하였다. 음성대조군으로 HDPE 용출액을 처리하였으며 양성대조군으로는 10% DMSO를 처리한 배지를 사용하였다. 48시간 배양 후 5mg/㎖의 농도의 MTT(4,5-다이메틸치아졸-2-일)-2,5-다이페닐-2H-테트라졸리움 브로마이드) 용액을 첨가하고, 4시간 동안 5% CO₂하에 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 보라색 결정이 생성되면 디메틸설폭사이드(DMSO)용액을 1㎖씩 넣어 1시간 동안 교반하여 결정이 용해된 용액을 96 웰 플레이트에 100㎕씩 분주하고 ELISA 플레이트리더를 사용하여 570㎚에서 흡광도를 측정하였다.

측정 결과, 비교예 1, 비교예 2, 실시예 1, 실시예 2의 세포생존율은 각각 104.67±8.69%, 92.90±7.12%, 117.98±4.29%, 95.5±3.53%로 세포와의 친화력이 우수한 것을 확인할 수 있었다(도 7 참조).

Claims

인산 칼슘 화합물 입자 35 내지 65 중량부, 실크 피브로인 25 내지 40 중량부, 및 폴록사머 10 내지 25 중량부를 포함하는 골 이식재 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 다공성 지지체의 형태인, 골 이식재 조성물.
제1항에 있어서, 상기 인산 칼슘 화합물은 하이드록시 아파타이트, 트리칼슘 포스페이트(TCP), 모노칼슘 포스페이트, 테트라칼슘 포스페이트, 디칼슘 포스페이트 또는 이의 조합인, 골 이식재 조성물.
제3항에 있어서, 상기 하이드록시 아파타이트는 바람직하기로 다공성의 미립자 형태인, 골 이식재 조성물.
제1항에 있어서, 상기 폴록사머는 졸-겔 전이 온도가 4 내지 35℃인 것인, 골 이식재 조성물.
제5항에 있어서, 상기 폴록사머는 폴록사머 407인, 골 이식재 조성물.
제1항에 있어서, 상기 골 이식재 조성물은 사용 전에 물을 첨가하여 변형이 가능한 겔 형태로 만들어 사용하는 것인, 골 이식재 조성물.
제7항에 있어서, 상기 골 이식재 조성물은 사용 전에 물과 함께 골형성 단백질(bone morphogenic protein, BMP)을 추가로 첨가하여 사용하는 것인, 골 이식재 조성물.
제8항에 있어서, 상기 골형성 단백질은 BMP-2, BMP-3, BMP-3b, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15, BMP-16, BMP-17, BMP-18, 또는 이의 조합인, 골 이식재 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물의 신장율은 35 내지 45%인, 골 이식재 조성물.
하기 단계를 포함하는 골 이식재 조성물의 제조방법:
1) 실크 피브로인 수용액을 제조하는 단계(단계 1);
2) 폴록사머 수용액을 제조하는 단계(단계 2);
3) 인산 칼슘 화합물 입자를 상기 실크 피브로인 수용액과 폴록사머 수용액의 혼합 용액에 인산 칼슘 화합물 입자 35 내지 65 중량부, 실크 피브로인 25 내지 40 중량부, 및 폴록사머 10 내지 25 중량부가 되도록 혼합하는 단계(단계 3); 및
4) 상기 혼합물을 동결건조시키는 단계(단계 4).
제11항에 있어서, 상기 단계 1)은 하기 단계 a) 내지 b)를 포함하는 방법:
a) 실크 피브로인을 브롬화리튬(Lithium Bromide), 염화칼슘(Calcium Chloride), 염화리튬(Lithium Chloride), 염화아연(Zinc Chloride)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 염을 포함하는 수 중에 용해시켜 실크 피브로인 수용액을 얻는 단계; 및
b) 셀룰로오스 투석막을 사용하여 투석 공정을 실시하여 상기 실크 피브로인 수용액 내에 존재하는 염을 제거하는 단계.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 골 이식재 조성물, 및 주입 도구를 포함하는 골 이식용 키트.
제13항에 있어서, 상기 주입 도구는 포셉, 주사기 또는 주사 바늘인, 키트.