KR101905790B1

KR101905790B1 - 섬유질을 포함한 주입형 인산칼슘 골 이식재 조성물 키트 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101905790B1
Application number: KR1020160129336A
Authority: KR
Inventors: 이병택; 이현정; 김보람
Original assignee: 순천향대학교 산학협력단
Priority date: 2016-10-06
Filing date: 2016-10-06
Publication date: 2018-10-10
Also published as: KR20180038329A

Abstract

본 발명의 주입형 골 이식재 조성물 키트 및 이의 제조방법은, 1) 인산칼슘을 포함하는 고상성분; 및 2) 생체적합성 고분자 섬유질 성분을 함유하는 용액성분;을 포함한다. 주사기 등을 이용하여 주입식 형태로써 수술부위의 형태에 맞게 골 이식재를 제조 및 이식할 수 있고, 빠른 이식과 2차적으로 다른 부위로 유동되어 가는 것 없이 시술이 가능하기 때문에 시술의 편의성을 제공할 수 있다. 또한, 골이식재의 경화시간, 주입력, 거대기공률을 충분하게 가지며, 세포, 약물 등의 전달체 역할도 할 수 있어서 다양한 적용가능성을 갖는다.

Description

섬유질을 포함한 주입형 인산칼슘 골 이식재 조성물 키트 및 이의 제조방법{INJECTABLE BONE CEMENT COMPOSITION KIT CONTAINING CALCIUM PHOSPHATE WITH FIBER AND PREPARING METHOD OF THE SAME}

본 발명은 주입형 인산칼슘 골 이식재 조성물 키트 및 이의 제조방법에 대한 것으로, 구체적으로 섬유질을 포함한 주사형 인산칼슘 골 이식재(IBS, Injectable bone substitute)에 관한 것이다.

유 무기 복합체로 구성된 골 조직은 단단하면서도 유연성이 있는 기계적 특성을 가지며, 인체 내에서 발생하는 다양한 대사 작용에 관여하는 칼슘을 저장하거나 신속하게 제공하는 기능을 수행한다. 따라서 골 조직은 인체의 구조적 기능을 수행할 뿐만 아니라, 생물학적 기능에도 중요한 역할을 한다. 그럼에도 불구하고, 골 조직에 대한 연구는 다른 생체 조직들에 비해 미진한 상황이다.

손상된 골조직 대체 및 재생을 촉진하기 위한 다양한 형태의 골 이식 재료에 대한 연구가 진행되고 있다.

손상된 골조직을 대체하기 위한 골 이식재료는 기본적으로 형태학적으로나 기계적인 역할과 함께 골 조직이 수행하는 생물학적 기능을 촉진시킬 수 있도록 설계되어야 한다. 또한 생체적합성이 우수하여야 하며, 독성, 발암성, 알러지, 염증 및 이물반응 등을 유발시키지 않아야 한다. 동시에 골 유착성 및 골 전도성이 우수해야 한다.

인산칼슘 물질의 장점은 인체 골 성분과 유사한 조성을 가지고, 생활성, 골전도성을 가지는 것이다. 인산칼슘 물질은 치과 및 의료용 임플란트에서의 과립, 블록 및 시멘트로서 이용 가능하다. 시멘트로써의 이점은 결함부를 메우거나 성형시 인체 순응성에 있어 유리하다는 것이다. 이러한 시멘트로써의 이점과 전달성, 수술 시 시간 단축 등이 개선된 것이 주사형 인산칼슘 시멘트이다.

주사형 인산 칼슘 골 이식재 시스템은 고체상 및 액체상 성분으로 구성된다. 고체 성분은 추가적인 칼슘염을 포함하거나 포함하지 않으면서, 하나 이상의 인산칼슘 화합물로 구성된다. 액체 성분은 묽은 인산, 묽은 유기산(아세트산, 시트르산), 인산나트륨, 탄산나트륨 등 한가지의 용액이거나 이들의 배합물을 사용한다.

기존의 고체 성분과 액체 성분을 혼합한 벌크 형태의 시멘트는, 충분한 다공성을 갖지 못하거나, 강도가 우수하면 생분해속도가 늦거나, 생분해속도가 우수하면 강도가 떨어지는 등의 문제점이 있었다. 또한, 기존의 이식재는 수술 시 도구를 이용하여 모양에 맞게 잘라내어 적용하므로, 수술시간이 연장되고 삽입부위 주변 조직의 외상이 증가한다는 문제점이 있다.

국내등록특허 제10-0224473호, 1999년10월15일 공고, 골조직 친화성 골접합용 아크릴계 시멘트 국내등록특허 제10-1463412호, 2014년11월21일 공고, 골 재생을 위한 골 충진제 제조방법

본 발명의 목적은 섬유질을 포함한 주사형 인산칼슘 골 이식재로 활용될 수 있는, 주입형 인산칼슘 골 이식재 조성물 키트 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 주입형 골 이식재 조성물 키트는, 1) 인산칼슘을 포함하는 고상성분; 및 2) 생체적합성 고분자 섬유질 성분을 함유하는 용액성분;을 포함한다.

상기 고상성분과 상기 용액성분은 10: 3 내지 7의 중량비로 포함될 수 있다.

상기 용액성분은 상기 생체적합성 고분자 섬유질 성분을 0.1 내지 5 중량%로 포함할 수 있다.

상기 용액성분은 0.1 내지 0.5 M의 약산을 함유하는 산성용액일 수 있다.

상기 용액성분은 시트릭산을 0.1 내지 0.5 M 함유할 수 있다.

상기 고상성분은 베타인산삼칼슘(β-tricalcium phosphate, β-TCP) 및 MCPM(monocalcium phosphate monohydrate)을 포함할 수 있다.

상기 고상성분과 상기 용액성분은 혼합시 15분 이내에 경화될 수 있다.

상기 고상성분과 상기 용액성분이 혼합되어 진행되는 경화 1일 후 압축강도가 3.5 MPa이상일 수 있다.

상기 주입형 골 이식재는 브루사이트(Brushite)형 인산칼슘을 포함할 수 있다.

상기 용액성분은, 양이온성 작용기를 갖는 제1생체적합성 고분자 성분을 함유하는 제1용액과 음이온성 작용기를 갖는 제2생체적합성 고분자 성분을 함유하는 제2용액을 포함할 수 있다.

상기 양이온성 작용기를 갖는 제1생체적합성 고분자 성분은 키토산을 포함할 수 있다. 상기 제1용액은 0.1 내지 0.5 M의 약산이 함유된 수용액일 수 있다.

상기 음이온성 작용기를 갖는 제2생체적합성 고분자 성분은 알지네이트를 포함할 수 있다. 상기 제2용액은 용매로 물이 적용될 수 있다.

상기 제1생체적합성 고분자 성분과 상기 제2생체적합성 고분자 성분은 1: 0.7 내지 1.3 중량비로 적용될 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명의 발명자들은, 주사기와 같은 주입형으로 적용이 가능하여 최소침습치료 등이 활용될 수 있으면서도 빠른 경화 시간과 생체적합성을 가지며, 동시에 골 결손부위에 대한 수술 편이성과 생분해성, 다공성 등이 증가된 골 이식재를 개발하기 위하여 연구를 거듭하던 중, 인산칼슘계 골이식재에 섬유질 첨가하여 빠른 경화시간과 생체적합성을 갖는 주사형 골 이식재를 제조할 수 있으며 위에서 언급한 특성을 만족할 수 다는 점을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 실시예에 따른 주입형 골 이식재 조성물 키트는, 1) 인산칼슘을 포함하는 고상성분; 및 2) 생체적합성 고분자 섬유질 성분을 함유하는 용액성분;을 포함한다.

상기 고상성분에 포함하는 인산칼슘은, 인산과 칼슘의 염으로 골 시멘트, 골 이식재 등의 조성에 적용되는 것일 수 있고, 구체적으로 인산칼슘의 하이드록시 아파타이트(hydroxyapatite, Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂), 알파인산삼칼슘(α-Tricalcium phosphate, α-TCP), 베타인산삼칼슘(β-Tricalcium phosphate, β-TCP), 이상인산칼슘(Biphasic calcium phosphate, BCP), BCP(HA와β-TCP의 혼합물, 다양한 HA/β-TCP비의 혼합물로 이루어짐), 인산이수소칼슘(potassium dihydrogen phosphate), MCPM(monocalcium phosphate monohydrate), DCP(Dicalcium phosphate), CPC(calcium pyro phosphate), DCPA(dicalcium anhydrade), DCPD(dicalcium dehydrade), 비정형 인산칼슘(Amorphous caclium phosphate), 제4인산칼슘(Tetracalcium phosphate, TTCP), 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나가 적용될 수 있다. 더 구체적으로, 상기 고상성분에 포함되는 인산칼슘은, 하이드록시 아파타이트(HAp), 알파 또는 베타인산삼칼슘(α-TCP, β-TCP), BCP(Biphasic calcium phosphate), MCPM(Calcium phosphate monobasic), DCP(Dicalcium phosphate) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나가 적용될 수 있다.

상기 인산칼슘으로는, β-TCP 및 MCPM가 함께 포함될 수 있고, 이러한 경우 경화 과정에서 화학적인 반응에 의하여 브루사이트 인산칼슘 시멘트를 효과적으로 형성할 수 있으며, 우수한 생분해성과 생체적합성을 가지면서도 기계적 강도를 일정 수준 이상으로 유지하도록 할 수 있다,

상기 고상성분으로 상기 β-TCP와 상기 MCPM를 함께 포함하는 경우, 뼈의 석회화를 유도하면서 세포의 흡수 및 증식 능력을 갖는 골 이식재를 제조할 수 있으며, 삼인산칼슘과 모노칼슘 포스페이트 모노하이드레이트를 함께 적용하면, 생체 분해 속도가 비교적 빠른 브루샤이트 인산칼슘 시멘트를 제조할 수 있으며, 주사기 등으로 주입 가능한 형태의 골 이식재를 제공할 수 있다.

상기 β-TCP와 상기 MCPM는 각각 1: 0.4 내지 1.0, 구체적으로 1: 0.5 내지 0.8, 더 구체적으로 1: 0.6 내지 0.7의 중량비로 적용될 수 있다. 상기 중량비로 상기 β-TCP와 상기 MCPM를 혼합하여 적용하는 경우, 골 이식재로서 우수한 생분해성, 생체적합성과 함께 기계적 강도와 주사기 등 주입형으로 적용 가능한 작업성을 얻을 수 있다.

상기 용액성분은, 상기 고상성분과 혼합되어 자기경화과정을 유도하며, 주입형으로 적용가능한 정도의 적절한 점도와 이동성을 부여한다. 또한, 상기 용액성분은 생체적합성 고분자 섬유질 성분을 함유하여서, 골 이식재가 경화(setting)된 이후, 생체적합성을 더욱 향상시키는 역할을 하며, 독특한 관 구조를 형성하는 역할도 한다. 아울러, 경화시간, 주입력, 거대기공도 등을 특성을 향상시킬 수 있다.

상기 섬유질 성분은, 생체적합성 고분자로 형성되는 섬유질 성분으로, 강한 이온 결합으로 섬유질을 만드는 1종 또는 2종 이상의 섬유질 성분이 함께 적용될 수 있다. 구체적으로, 키토산 (Chitosan), 알지네이트 (Alginate), 콜라겐 (Collagen), 젤라틴 (Gelatin), 피브린 (Fibrin), 엘라스틴 (Elastin), 히알루론산 (hyaluronicacid), 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스 (Hydroxypropyl Methycellulose), 카르복시메틸 셀룰로오스 (Carboxymethyl cellulose, CMC) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 포함하고, 구체적으로 키토산 (Chitosan), 알지네이트 (Alginate), 또는 이들 모두를 포함하도록 적용될 수 있다.

특히 상기 생체 적합성 고분자 성분으로 상기 키토산과 상기 알지네이트를 함께 적용하면, 키토산에 포함된 양이온성 작용기를 갖는 나노섬유와 알지네이트에 포함된 음이온성 작용기를 갖는 나노섬유가 서로 상호작용하여 고분자 복합체를 형성할 수 있다.

상기 섬유질 성분은, 본 발명의 조성물의 다른 성분들과 상호작용하여 생체적합성 고분자 섬유질을 형성하며, 경화된 골 이식재 내에 생체적합성 고분자 섬유질에 의하여 형성되는 독특한 관(canal) 구조를 형성할 수 있고, 생초기세포부착과 증식능을 향상시킬 수 있다.

상기 용액성분은, 상기 생체적합성 고분자 섬유질 성분과 함께, i) 증류수, 또는 ii) 유기산, 인산, 탄산염, 아세트산염, 시트르산염, 인산염 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 용질이 용해된 용액 성분이 적용될 수 있다. 상기 ii)의 용액은 상기 용질을 0.1 내지 15 중량% 함유하는 저농도 용액으로 제조되어 적용될 수 있다.

상기 유기산으로는, 구체적으로 아세트산, 시트르산 또는 이들의 조합이 적용될 수 있고, 상기 아세트산염으로는 예를 들어 아세트산나트륨, 상기 인산염으로는 인산나트륨, 상기 탄산염으로는 탄산나트륨 등이 적용될 수 있다.

상기 용액성분에 위에서 설명하는 용질을 더 포함하는 경우, 상기 주입형 골 이식재 조성물의 경화를 촉진할 수 있다. 예를 들어, 시트르산을 적용하면 본 발명에서 의도하는 반응이 조금 더 잘 진행되며, 상기 경화제로 상기 시트르산을 적용하는 경우, 시트르산의 농도를 0.1M 내지 0.5M로 조절한 수용액의 형태로 적용하는 것이 경화반응 시간을 적절하게 조절할 수 있다는 면에서 좋다.

상기 용액성분은 상기 생체적합성 고분자 섬유질 성분을 0.1 내지 5 중량%로 포함할 수 있고, 0.75 내지 3 중량%로 포함할 수 있으며, 1.25 내지 2.25 중량%로 포함될 수 있다. 상기 용액성분 내에 포함되는 생체적합성 고분자 섬유질 성분의 함량이 너무 적을 경우에는, 섬유질을 함입에 따른 효과가 미미할 수 있고, 너무 많을 경우에는 골 이식재의 강도가 약해질 수 있다. 위에서 언급한 고분자 섬유질 성분의 함량을 포함하는 경우, 골 이식재로 적절한 강도를 가지면서 충분한 나노, 마이크로, 메조 기공을 갖도록 할 수 있다.

상기 주입형 골 이식재는 자기 경화형으로, 고상성분과 용액성분이 혼합되면서 진행되는 반응에 의하여 경화되게 되며, 이를 위해 상기 주입형 골 이식재 조성물 키트는, 상기 고상성분과 상기 용액성분은 일정한 중량비로 포함한다. 상기 고상성분과 상기 용액성분은 10: 3 내지 7의 중량비로 혼합되는 것이 좋고, 구체적으로 10: 4 내지 5의 중량비로, 더 구체적으로 10: 4.5 내지 5의 중량비로 포함되는 것이 좋다. 이러한 범위로 혼합되는 경우, 약 15분 이내라는 빠른 경화속도(setting time)과 함께 적절한 경도를 갖는 골 이식재를 형성할 수 있다. 특히 구체적으로 10: 4.5 내지 5의 중량비로 상기 고상성분과 상기 용액성분을 포함하는 경우, pH 거동 변화의 측면에서 유리한 효과를 가져올 수 있고, 초기 세포 부착능과 증식능을 더욱 향상시킨 골 이식재를 제조할 수 있다.

칼슘포스페이트계 골 이식재의 경우 주입 후 경화되는 시간(setting time)이 매우 중요한 요소 중 하나인데, 본 발명의 주입형 골 이식재 조성물은 3.5 내지 6분이라는 초기경화시간과 15 분 이내라는 최종 경화시간을 가져서 주사기, 실린지 등을 이용하는 주입형 골 이식재로써 적용이 적절한 경화시간을 갖는다.

상기 주입형 골 이식재 조성물 키트는, 주입도구(주사기, 실린지 등)를 이용하여 골결손부에 주입하기에 적절한 점도를 가질 수 있고, 구체적으로 상기 고상성분과 상기 용액성분은 혼합되어 5분 이내에 주사기를 이용한 용액 형태의 골 이식재의 주입이 100% 가능하다. 특히, 10: 4.5 내지 5의 중량비로 상기 고상성분과 용액성분이 혼합하는 경우 이러한 주입가능성(Injectability)이 가장 우수하며, 이로한 주입가능성을 갖는 주입형 골 이식재 조성물은 골결손부에 주사기 등의 도구를 이용하여 주입이 가능하여, 최소절개수술 등의 요법 적용이 가능하고, 골결손부에 적절하게 채워저 다른 부위로 유출이 발생하지 않거나 최소화할 수 있다.

이렇게 주입되어 경화과정이 진행된 주사형 인산칼슘계 골 이식재는, Brushite계 또는 Apatite계인 인산칼슘을 포함한다. 예를 들어 상기 고상성분으로 베타인산삼칼슘(β-tricalcium phosphate, β-TCP) 및 MCPM(monocalcium phosphate monohydrate)을 포함하는 경우, 고상성분과 용액성분이 혼합되어 아래 반응식과 같은 반응을 포함하는 화학반응이 진행되며 경화되어 골 이식재를 형성한다.

[반응식]

β-Ca₃(PO₄)₂ + Ca(H₂PO₄)₂.H₂ + 7H₂O 4CaHPO₄.2H₂O

이때 형성되는 인산칼슘은 브루사이트(Brushite) 형태로, 이러한 Brushite 형 골 이식재는 Apatite계의 경우보다 강도는 상대적으로 낮지만 생분해속도가 비교적 빠른 장점을 갖는다. 구체적으로 경화 진행 1일 후의 골 이식재를 기준으로, 3.5 MPa이상의 압축강도를 가질 수 있고, 3.5 내지 7 MPa의 압축강도를 가질 수 있다.

상기 키트는 또한 생물학적 단백질이나 약물을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 생물학적 단백질은 소혈청 알부민, 라이소자임 등이고 약물은 항생제, 항암제, 항염증제 등을 예로 들 수 있다.

본 발명에 의하면, 주입식 형태로써 수술부위의 형태에 맞게 이식 할 수 있는 골 이식재를 제공할 수 있다. 또한, 기존의 과립형 또는 블록형태를 갖춘 이식재는 수술 시 도구를 이용하여 모양에 맞게 잘라내는 상황과 수술시간 연장에 따른 주변 조직의 외상증가를 초래하는 반면에 본 발명에 따라 제조된 주사형 인산칼슘계 골 이식재는. 골이식재의 경화시간, 주입력, 거대기공률 등이 우수할 뿐만이 아니라 세포, 약물 등의 전달체 역할도 있어 다양한 치료 가능성을 제시하고 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 주입형 골 이식재의 제조방법은, 1) 생체적합성 고분자 섬유질 성분을 포함하는 용액성분을 준비하는 단계, 2) 인산칼슘을 포함하는 고상성분과 상기 용액성분을 혼합하여 액상 이식재를 제조하는 단계, 및 3) 상기 액상 이식제를 주입기구에 넣는 단계;를 포함한다.

상기 인산칼슘, 고상성분, 생체적합성 고분자 섬유질, 용액성분 등에 대한 설명은 위의 설명과 중복되므로 그 기재를 생략한다. 본 발명의 주입형 골 이식재는, 혼합에 의한 자가경화 특성을 가져서, 키트의 형태로 고상성분과 용액성분을 별도로 보관하고, 이식 직전에 혼합하여 적용하며, 상기 액상과 고체상을 혼합하면 경화 과정이 진행된다. 본 발명에 따른 뼈 이식재를 주입하기 위한 주입기구는 액상과 고체상을 혼합하여 제조되는 혼합물을 넣어 뼈 이식재를 주입할 수 있는 주사기를 사용으로 한다.

본 발명은 골 결손부위에 대한 수술 편의성과 섬유질 첨가에 따른 생분해성, 다공성 증가가 이루어지도록 하는 것이다. 본 발명에서는 상기 생체 적합성 고분자를 포함한 액상과 골충진제인 고체상을 혼합하여 주사형 골이식재를 제조한다.

본 발명의 주입형 인산칼슘 골 이식재 조성물 키트 및 이의 제조방법은 주사기 등을 이용하여 주입식 형태로써 수술부위의 형태에 맞게 골 이식재를 제조 및 이식할 수 있고, 빠른 이식과 2차적으로 다른 부위로 유동되어 가는 것 없이 시술이 가능하기 때문에 시술의 편의성을 제공할 수 있다. 또한, 골이식재의 경화시간, 주입력, 거대기공률을 충분하게 가지며, 세포, 약물 등의 전달체 역할도 할 수 있어서 다양한 적용가능성을 갖는다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 주입형 골 이식재의 주사가능성을 시험하는 과정을 촬영한 사진.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 골 이식재를 토끼의 대퇴부의 골결손부에 주사기를 이용하여 주입하는 과정을 보여주는 사진.
도 3은 본 발명의 실시예 1에서 제조한 용액성분과 고상성분의 적용비(L/S)를 0.4로 적용한 샘플들의 섬유질 성분 함량 차이에 따른 미세구조의 차이를 관찰한 주사전자현미경 사진.
도 4는 본 발명의 실시예 1에서 제조한 용액성분과 고상성분의 적용비(L/S)를 0.45로 적용한 샘플들의 섬유질 성분 함량 차이에 따른 미세구조의 차이를 관찰한 주사전자현미경 사진.
도 5는 본 발명의 실시예 1에서 제조한 용액성분과 고상성분의 적용비(L/S)를 0.5로 적용한 샘플들의 섬유질 성분 함량 차이에 따른 미세구조의 차이를 관찰한 주사전자현미경 사진.
도 6은 본 발명의 실시예 1에서 제조한 골 이식제의 L/S 비율에 따른 경화시간(setting time)을 평가한 결과.
도 7은 본 발명의 실시예 1에서 제조한 골 이식제의 L/S 비율에 따른 압축강도를 평가한 결과(경화 후 1인 경과 후 측정).
도 8은 본 발명의 실시예 1에서 제조한 골 이식제(L/S 비율 0.4)의 pH 거동 변화를 측정한 결과.
도 9는 본 발명의 실시예 1에서 제조한 골 이식제(L/S 비율 0.45)의 pH 거동 변화를 측정한 결과.
도 10은 본 발명의 실시예 1에서 제조한 골 이식제(L/S 비율 0.5)의 pH 거동 변화를 측정한 결과.
도 11은 본 발명의 실시예 1에서 제조한 골 이식제(L/S 비율 각각 0.4, 0.45, 0.5)의 혼합(경화반응) 후와 고상성분 원료인 beta-TCP와 MCPM의 XRD 측정 결과.
도 12는 본 발명의 실시예 1에서 제조한 최적 골 이식재(L/S 비율 0.45, IBS1, 비교예로 IBS0)을 적용한 MC3T3-E1 세포 배양 1, 3, 7일째 MTT assay 결과.
도 13은 본 발명의 실시예 1에서 제조한 최적 골 이식재(L/S 비율 0.45, IBS1, 비교예로 IBS0)을 적용한 MC3T3-E1 세포 배양 7일 째 면역형광염색(F-actin staining) 결과.
도 14는 본 발명의 실시예 5에서 본 발명의 실시예에 따른 골 이식재를 토끼 대퇴부 골결손부에 이식하는 과정을 보여주는 사진.
도 15는 본 발명의 실시예 6에서 섬유질 성분의 함량에 따른 골 이식재의 주입능 평가 결과를 보여주는 그래프.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 이하에서, 부피 기준인지 중량 기준인지의 명확한 설명 없이 기재된 %나 비율은 중량%와 중량비를 의미한다.

실험재료 및 측정기기

beta-TCP(β-tricalcium phosphate)은 주식회사 이노본(Inobone, Korea)에서, MCPM(monocalcium phosphate monohydrate)는 덕산 제품(DUCSAN, Korea)을 구입하여 적용하였다. 시트르산은 삼전약품(SAMCHUN, Korea)에서 입수해 적용했다.

경화시간 및 압축강도의 평가는, R&B사의 Unitech-M모델을 사용하여 측정하였다. XRD 분석은, Rigaku사의 MiniflexⅡ모델을 사용하였다.

실시예 1: 골 이식재의 제조

주사형 이식재로 고상성분 고체상 골충진재와 용액성분을 준비했다.

고상 성분으로는 beta-TCP(β-tricalcium phosphate)와 MCPM(monocalcium phosphate monohydrate)을 6:4의 중량비로 혼합하여 적용하였다. 액상성분으로는, 시트르산(citric acid)을 0.5 M로 포함하는 수용액을 제조한 후, 경화성 용액성분으로 적용하였다. 이때, 상기 액상성분은 키토산(chitosan)과 알지네이트(alginate)를 각각 0.5 중량%, 1 중량%, 1.5 중량%의 농도로 함유하도록 하였다. 구체적으로, 키토산 0.5 M을 상기 시트르산 수용액에 녹이고, 알지네이트는 물에 용해한 후, 두 용액을 1: 1로 혼합하여 용액성분을 제조하였다. 이 용액성분은, 최종적으로 0.25 M의 시트르산 수용액이며 키노산과 알지네이트가 섬유질을 형성하도록 하였다.

이후 실시예에서 상기 고상 성분과 용액성분은 혼합하여 적용한 골 이식재를 약칭할 때, chitosan/alginate 복합체의 농도에 따라 IBS0(chitosan/alginate를 포함하지 않음), IBS0.5, IBS1, IBS1.5로 표시하였다.

또한, 상기 용액성분(L)과 상기 고상성분(S)의 적용 비율(중량비)을 각각 0.4, 0.45, 0.5의 비율(L/S)로 달리 적용하여 혼합물을 제조하고 이하에서 그 물성을 평가했다.

주사기를 이용한 주입 가능성의 평가는, 도 1에서와 같이 주사기를 이용하여 평가하였고, 맨손의 악력을 이용하여 주사하는데 무리 없는 수준임을 확인하였다.

실시예 2: 골 이식재의 모폴로지 평가

실시예 1에서 제조한 골 이식재의 미세조직 특성을 평가하기 위하여 배율을 달리하며 주사전자현미경으로 모폴로지를 관찰했으며, 그 결과를 도 3 내지 도 5(각각, L/S를 0.4, 0.45, 0.5로 적용한 샘플의 사진)에 나타내었다.

도 3 내지 5를 참고하면, L/S의 비율에 따라 큰 차이 없이 비슷한 미세구조를 보인다는 점을 확인할 수 있었다. IBS0.5는 형성된 섬유의 양이 적어 IBS0과 크게 차이를 보이지는 않았으나, IBS1 및 IBS1.5의 경우 IBS0과 IBS0.5와 비교하여 기공 구조가 증가된 것을 관찰할 수 있었다.

고배율 이미지를 참고하면, 경화된 골 이식재 내에 다공성 특성과 함께 독특한 형태의 관(canal) 형태의 기공 구조가 형성된 것을 확인할 수 있으며, 이러한 관 형태의 구조는 주사전자현미경 촬영을 위해 샘플들을 건조시키는 과정에서 생체적합성 고분자 섬유질 성분들에 포함되어 있던 수분들이 소실되어 긴 관 구조의 기공이 형성된 것으로 생각된다. 이들 구조들을 참고하면, 상기 골 이식재는 기존의 골 충진재의 다공성 구조를 포함할 뿐만 아니라, chitosan/alginate 섬유질 성분들이 잔여 TCP 입자와 혼합되어 독특한 canal 구조를 띄는 특징을 갖는 것으로 생각된다.

실시예 3: 골 이식재의 물리적, 기계적 특성 평가

1) 경화시간 및 압축강도 평가

위의 샘플들의 물리적, 기계적 특성 평가를 위해 경화시간 및 압축강도를 측정하였고, 그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.

칼슘포스페이트계 골 이식제의 경우 주입 후 경화되는 시간(setting time)이 중요한 평가 요소로 취급되는데, 도 6을 참조하면, 측정 결과 초기경화시간은 약 5분이고, 최종 경화시간은 모두 15분 이내로 확인되었다. 고분자 섬유질 성분의 함량이 증가될수록, 용액성분의 비율이 높아질수록(L/S 비율 증가) 최종 경화시간이 증가되는 경향을 보였다.

압축강도를 측정한 도 7을 참조하면, 경화 1일 후 압축강도를 측정한 결과, L/S 비율이 낮을수록, 섬유질 농도가 증가될수록 압축강도가 낮아지는 것을 확인할 수 있었다(약 3.5 내지 7MPa). 이는 섬유질 고분자 도입에 따른 기공률 증가에 의한 것으로 생각된다.

2) pH 변화 평가

SBF(Simulated Body Fluid) 용액 담지 후 시간에 따른 샘플의 pH변화를 평가하여 도 8 내지 10(각각 L/S 비율이 0.4, 0.45, 및 0.5)에 나타내었다. IBS1 샘플을 기준으로, L/S비율에 따른 pH변화를 비교했을 때, L/S 비율이 0.4 및 0.45인 경우 pH 6.5 내지 7에서 시작하여 4시간째 급격히 감소하여 약 pH 5에 도달하였고, 7일 째 약 pH 7.5로 나타났다. 한편 L/S=0.5 비율의 경우 pH 6 내지 6.5에서 시작하여 4시간째 pH 5까지 감소했다가, 7일째 비슷한 pH값을 갖는 것으로 측정되어 이 경우 가장 pH 변화폭이 큰 것으로 나타났다. 고분자 섬유질 성분인 Chitosan/Alginate 농도별로 비교해 볼 때, IBS0(고분자 미포함)이 가장 많이 pH가 감소하는 것으로 보이며, 7일째 최종 pH는 거의 유사한 것으로 나타났다.

3) 혼합 전후의 XRD 분석

혼합 전 원재료의 고상성분인 beta-TCP와 MCPM, 그리고 혼합 후 골 이식재인 IBS의 XRD를 각각 측정하여 그 결과를 도 11에 나타냈다.

MCPM 및 beta-TCP에서 보였던 특정 피크들이 혼합 후 경화반응(β-Ca₃(PO₄)₂ + Ca(H₂PO₄)₂.H₂ + 7H₂O 4CaHPO₄.2H₂O)에 의해 cement로 바뀌면서 L/S=0.4, 0.45, 0.5 비율 모두 Brushite 피크가 관찰되었다. 이는 생체흡수성을 가지는 브루사이트(Brushite) 시멘트가 성공적으로 제조되었음을 확인할 수 있는 결과이다.

4) 종합

고분자 함유량 및 L/S 비율에 따른 여러 가지 조성 중 경화시간, 압축강도, 주사능, pH 등을 고려하면 L/S=0.45의 IBS1 샘플이 가장 우수한 결과를 나타내는 것으로 평가되었다. 이후, L/S=0.45의 IBS1 샘플을 이용하여 실험을 진행했다.

실시예 4: 생체적합성 평가

반응 후 골 이식재의 초기 생체적합성 평가를 위해 IBS0 및 IBS1의 MTT assay 및 면역형광염색(F-actin staining)을 실시하였다.

1) MTT assay 및 면역형광염색 (F-actin staining) 방법

세포 증식능을 평가하기 위한 MTT assay는, MC3T3-E1 세포를 배양하고 각각 1, 3, 7일째, 3-[4,5-dimethyl-2-thiazolyl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 용액을 100 μl씩 각 샘플군의 배지와 섞어준 뒤, 4시간 동안 37℃에서 추가 배양하였다. 4시간 경과 후 각 샘플들에서 배지를 모두 제거한 뒤, 디메틸술폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO, Samchun Pure Chemical Co.,Seoul, Korea) 1ml을 분주하고, 1시간 경과 후 O.D값을 595 nm에서 측정하여 평가하였다.

MC3T3-E1 세포의 성장을 관찰하기 위한 F-actin 염색 시험은, 이하 설명하는 방법으로 진행했다. MC3T3-E1 세포 배양 각각 1, 3, 7일 째, 세포를 배양시킨 샘플을 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정시켰다. 고정액을 수세한 뒤, TritonX-100 과 BSA를 처리하였다. 이후, FITC-conjugated phalloidin를 처리하여 세포의 F-atin을 염색시켰고, Heochst를 이용하여 세포핵을 염색한 후, 공초점현미경으로 관찰하였다.

2) MTT assay 결과

MC3T3-E1 세포 배양 1, 3, 7일 째 MTT assay 분석 결과를 도 12에 나타냈다.

생체적합성 고분자 섬유질을 함유한 IBS1의 세포 증식능이 점점 증가되는 것에 반해, IBS0는 초기 낮은 pH로 인해 3일째 세포 증식능이 감소하였다가 다시 증가하는 거동을 보였다.

3) 면역형광염색 (F-actin staining) 결과

공초점현미경 관찰 결과, IBS0 및 IBS1에서 모두 세포 부착이 잘 되는 것으로 보이며, 배양 7일째를 보여주는 도 13을 참조하면 골 이식재 표면에 세포가 고르게 분포하여 증식한 것을 확인하였다.

MTT assay와 마찬가지로 IBS1에서 더 높은 밀도의 세포들이 관찰되었고, 이를 토대로 생체적합성 고분자 섬유질 성분의 도입을 통해 초기 세포 부착 및 증식능이 향상되는 것을 확인하였다.

실시예 5: 토끼 대튀부 이식을 통한 in vivo test

토끼 대퇴부에 골결손부(직경6mm, 깊이10mm)를 형성한 뒤, 본 발명의 골 이식재(L/S 비율 0.45, IBS1)를 이식하였으며 대조군으로 IBS0를 이식하여 동물 실험을 진행했다.

구체적으로, 도 14에 제시된 것처럼, 멸균 처리된 고상성분 및 용액성분을 혼합한 뒤 주사기에 탑재 후 토기 대퇴부의 이식부위에 주입하였고, 주입 과정에서 IBS의 누출 없이 골결손부를 채울 수 있는 적합한 주입능을 가지는 것으로 평가되었다. 총 경화시간도 15분 이내로, 혼합에서 이식 및 봉합까지 적합한 시간을 가지는 것으로 판단되었다.

실시예 6: 섬유질 성분 함량에 따른 주입능 평가

위의 실시예 1과 동일하게 실험하되, 용액성분에 함유되는 키토산과 알지네이트 성분의 함량을 각각 0 중량%, 0.5 중량%, 1 중량%, 그리고 1.5 중량%로 적용하였을 때의 주사기를 이용한 골 이식재의 주입가능한 부피를 측정하였다. 실린지에 넣어진 부피를 모두 주입 가능했던 경우를 기준(100%로 그 상대적인 주입량을 평가했고, 그 결과를 도 15에 나타냈다.

도 15를 참고하면, 키토산과 알지네이트 성분의 함량을 각각 0.5 중량%를 적용한 경우까지 모두 90 부피% 이상의 용액이 모두 주사기를 이용해 주입 가능하다는 점을 확인할 수 있었으며, 이는 본 발명의 골 이식재가 우수한 주입가능성을 갖는다는 점을 보여주는 결과로 생각된다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims

1) 인산칼슘을 포함하는 고상성분; 및 2) 생체적합성 고분자 섬유질 성분을 함유하는 용액성분;을 포함하며,
상기 고상성분과 상기 용액성분은 10: 3 내지 7의 중량비로 포함하며,
상기 용액성분은, 양이온성 작용기를 갖는 제1생체적합성 고분자 섬유질 성분을 함유하는 제1용액과 음이온성 작용기를 갖는 제2생체적합성 고분자 섬유질 성분을 함유하는 제2용액을 포함하며,
상기 양이온성 작용기를 갖는 제1생체적합성 고분자 섬유질 성분은 키토산이며,
상기 음이온성 작용기를 갖는 제2생체적합성 고분자 섬유질 성분은 알지네이트이며,
상기 키토산에 포함된 양이온성 작용기를 갖는 나노섬유와 알지네이트에 포함된 음이온성 작용기를 갖는 나노섬유가 서로 상호작용하여 고분자 복합체를 형성하며,
상기 고분자 섬유질 성분과 고상성분의 상호 작용에 의해, 골 이식재 내에 관(canal) 구조를 형성하며,
상기 용액성분은 키토산과 알지네이트를 각각 0.1 내지 0.5 중량% 포함하는, 주사형 골 이식재 조성물 키트.

삭제

제1항에 있어서,
상기 용액성분은 0.1 내지 0.5 M의 약산을 함유하는 산성용액인, 골 이식재 조성물 키트.

제1항에 있어서,
상기 고상성분은 베타인산삼칼슘(β-tricalcium phosphate, β-TCP) 및 MCPM(monocalcium phosphate monohydrate)을 포함하는, 골 이식재 조성물 키트.

제1항에 있어서,
상기 고상성분과 상기 용액성분은 혼합시 15분 이내에 경화되는, 골 이식재 조성물 키트.

제1항에 있어서,
상기 고상성분과 상기 용액성분이 혼합되어 진행되는 경화 1일 후 압축강도가 3.5 MPa이상인, 골 이식재 조성물 키트.

제1항에 있어서,
상기 주입형 골 이식재는 브루사이트(Brushite)를 포함하는, 골 이식재 조성물 키트.

삭제